CN109477076A

CN109477076A - 针对主要猪病毒疾病的多价疫苗

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Publication number: CN109477076A
Application number: CN201780044617.5A
Authority: CN
Inventors: M·普拉巴卡恩; T·Y·鲁伊
Original assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 2016-05-19
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2019-03-15
Also published as: TW201817444A; KR102524544B1; WO2017200484A1; SG11201810299SA; PH12018502436A1; KR20190007056A; TWI808940B

Abstract

本发明涉及疫苗领域。更具体地，本发明涉及针对主要猪病毒疾病的多价疫苗。在一个实施方案中，多价疫苗是重组伪狂犬病病毒载体，其含有衍生自猪圆环病毒、经典猪瘟病毒、和任选地猪生殖和呼吸综合征病毒的抗原。

Description

针对主要猪病毒疾病的多价疫苗

序列表

本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表的名称为2577254PCTSequenceListing.txt，于2017年5月4日创建，大小为23kb。序列表的电子格式的信息通过引用整体并入本文。

背景技术

本发明涉及疫苗领域。更具体地，本发明涉及针对主要猪病毒疾病的多价疫苗。在一个实施方案中，多价疫苗是重组伪狂犬病病毒载体。

用于说明本发明的背景或提供关于实践的附加细节的本文所使用的出版物和其他材料，通过引用并入，并且为方便起见分别归类于参考文献。

伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疹病毒科的甲型疱疹病毒亚科，是Aujeszky病的病原体。PRV在发展中国家普遍存在，并在养猪业造成重大经济损失。减毒活PRV疫苗在预防和根除PRV方面发挥了关键作用(Pomeranz et al.,2005)。PRV Bartha-K61是具有gE的减毒PRV疫苗株，并且部分gI基因已被缺失(Klupp et al.,2012；Dong et al.,2014)。此外，之前的几篇报道描述了减毒活PRV Bartha-K61是一种出色的表达异源抗原基因的疫苗载体(Nieet al.,2011；Li et al.,2008；Song et al.,2007；Xu et al.,2004；Jiang et al.,2007)。因此，我们利用减毒活PRV Bartha-K61疫苗株作为载体来表达主要猪病毒疾病的多种抗原基因。

猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒科的成员，是单链环状DNA基因组。PCV2是在感染猪中发展的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要原因。感染的特征在于腹泻、减少的体重增加、猝死、淋巴结肿大、呼吸窘迫和多核巨细胞形成(Liu et al.2005)。ORF2是PCV2基因组中的主要开放阅读框之一。它编码衣壳蛋白(Cap)，这是免疫显性病毒蛋白，可作为猪疫苗开发的理想靶标。

经典猪瘟(CSF)病毒是一种高度传染性和经济上重要的病毒性疾病，其影响家猪和野猪。CSF病毒(CSFV)是正义单链RNA病毒，并且是黄病毒科内的瘟病毒属的成员。包膜糖蛋白E2含有四个抗原结构域，并可以在猪群中诱导针对CSFV的保护性免疫。因此，E2糖蛋白是CSFV疫苗设计的潜在候选者(Zhang et al.,2014)。基于C-毒株的市售全灭活疫苗是有效的并且提供针对三组CSFV的完全保护，但不能提供感染的动物与接种的动物的可区分性(Zhang et al.,2014)。

猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分类为网巢病毒目(Nidovirales)的Arterviridae。它是一种包膜的正链RNA病毒，可导致猪生殖与呼吸综合症(PRRS)的发展。PRRSV的感染可导致母猪的晚期流产，大规模的生殖障碍和仔猪的呼吸系统疾病。PRRSV基因组由9个开放阅读框组成，编码7种结构蛋白和14种非结构蛋白。其中，糖蛋白(GP)5是由ORF5编码的主要包膜蛋白。它是PRRSV的关键免疫原性蛋白之一，其对于病毒组装、感染性和中和抗体的诱导是必需的。ORF5是PRRSV基因组中变异最大的区域之一，它已被广泛用于研究PRRSV的分子流行病学。GP5也是针对PRRSV感染的疫苗开发的主要靶标(Li et al.,2012)。

目前可用的疫苗和疫苗接种程序是复杂的并且难以分别针对所有四种疾病免疫，导致多次注射和多次加强。因此，开发用于四种疾病的多价疫苗将是耗时且成本有效的，并且还可以导致更有效的疫苗。

发明内容

本发明描述了利用已建立的减毒活伪狂犬病(PRV)疫苗株，例如Bartha-K61毒株，作为疫苗载体，以表达来自PCV2、CSF和PRRSV的主要猪病毒疾病的多种免疫原。PRV基因组大约为140kb，由独特的长(UL)区域、独特的短(US)区域、大的反向重复序列序列、内部重复序列(IR)和末端重复序列(TR)组成。一半的基因组被认为是非必需区域，例如蛋白激酶(PK)、胸苷激酶(TK)、gE、gG和gI，因此允许修饰或插入外源基因而不影响病毒复制。此外，PRV Bartha-K61疫苗株的良好记录的安全性和保护功效概况，已经使其使用了数十年，以成功控制Aujeszky病。根据本发明，已经产生了针对PRRSV、PCV2、CSF和PRV的四价PRV疫苗和针对PCV2、CSF和PRV的三价PRV疫苗。

因此，一方面，本发明提供了针对PRRSV、PCV2、CSF和PRV的四价PRV疫苗。根据该方面，制备核酸构建体，其包含PRRSV基因、PCV2基因和CSF基因。在一些实施方案中，PRRSV基因是PRRSV ORF5基因。在一些实施方案中，PRRSV ORF5基因衍生自高致病性PRRSV中国毒株(HP-HRRSV-JXA1)。在一些实施方案中，PCV2基因是PCV2 ORF2基因。在一些实施方案中，PCV2基因衍生自PCV2印度尼西亚毒株(基因型2B)(PCV2 TLL-Indo，GenBank登录号KX130941)。在一些实施方案中，CFS基因是CFS基因是CFS E2基因。在一些实施方案中，CFSE2基因衍生自新出现的CSF印度尼西亚毒株的亚基因型2.1(CSF TLL-Indo，GenBank登录号KX130940)。

在一些实施方案中，每个基因与在哺乳动物细胞中有活性的启动子可操作地连接。根据本发明，可以使用在哺乳动物细胞中有活性的任何合适的启动子。在一些实施方案中，启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施方案中，CMV启动子是CMV立即早期(CMVie)启动子。在一些实施方案中，启动子是延伸因子1α(EF1α)启动子。

在一些实施方案中，每个基因与在哺乳动物细胞中有效的终止子序列可操作地连接。根据本发明，可以使用在哺乳动物细胞中有活性的任何合适的终止子。在一些实施方案中，终止子序列是牛生长激素多腺苷酸化(BGH polyA)序列。在一些实施方案中，终止子序列是SV40病毒多腺苷酸化(SV40polyA)序列。

在一些实施方案中，提供了核酸构建体，其包含本文所述的PRRSV基因、PCV2基因和CSF基因。在一些实施方案中，核酸构建体还包含本文所述的启动子和/或终止子。在一些实施方案中，核酸构建体还包含PRV的gG序列。在一些实施方案中，PRV是PRV Bartha-K61毒株。在一些实施方案中，核酸构建体包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在一些实施方案中，提供了PRV毒株，其中PRV毒株被修饰为含有本文所述的核酸构建体。在一些实施方案中，修饰的PRV是修饰的PRV Bartha-K61毒株。在一些实施方案中，修饰的PRV毒株中的核酸构建体是稳定的，在猪肾15(PK-15)细胞中传代5次后没有突变或缺失。在一些实施方案中，PK-15细胞是从美国典型培养物保藏中心获得的PK-15细胞CCL-33^TM细胞。

在一些实施方案中，提供了细胞系，其以适于产生可用于四价疫苗的病毒的方式，用本文所述的核酸构建体转染。在一些实施方案中，通过在转染的细胞系中同源重组，将本文所述的核酸构建体插入本文所述的PRV毒株中。在一些实施方案中，细胞系是本文所述的PK-15细胞。

在第二方面，本发明提供了针对PCV2、CSF和PRV的三价PRV疫苗。根据该方面，制备核酸构建体，其包含PCV2基因和CSF基因。在一些实施方案中，PCV2基因和CSF基因如本文所述。

在一些实施方案中，每个基因与在哺乳动物细胞中有活性的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，启动子如本文所述。

在一些实施方案中，每个基因与在哺乳动物细胞中有效的终止子序列可操作地连接。在一些实施方案中，终止子序列如本文所述。

在一些实施方案中，提供了核酸构建体，其包含本文所述的PCV2基因和CSF基因。在一些实施方案中，核酸构建体还包含本文所述的启动子和/或终止子。在一些实施方案中，核酸构建体还包含PRV的gG序列。在一些实施方案中，PRV是PRV Bartha-K61毒株。在一些实施方案中，核酸构建体包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

在一些实施方案中，提供了PRV毒株，其中PRV毒株被修饰为含有本文所述的核酸构建体。在一些实施方案中，修饰的PRV毒株如本文所述。在一些实施方案中，修饰的PRV毒株中的核酸构建体是稳定的，在猪肾15(PK-15)细胞中传代5次后没有突变或缺失。在一些实施方案中，PK-15细胞如本文所述。

在一些实施方案中，提供了细胞系，其以适于产生可用于三价疫苗的病毒的方式，用本文所述的核酸构建体转染。在一些实施方案中，通过在转染的细胞系中同源重组，将本文所述的核酸构建体插入本文所述的PRV毒株中。在一些实施方案中，细胞系是本文所述的PK-15细胞。

本发明还提供了用本文所述的重组PRV免疫对象的试剂盒。该试剂盒包含本文所述的重组PRV、药学上可接受的载剂、涂药器及其使用的说明材料。

本发明还提供了使用方法。在一个实施方案中，本发明提供了在对象(例如猪)中引发保护性免疫应答的方法，其包含向对象施用预防、治疗或免疫学有效量的本文所述的重组PRV。在另一个实施方案中，本发明提供了预防对象患有PRV、PRRSV、PCV和CSF或患有PRV、PCV和CSF的方法，其包含向对象施用预防、治疗或免疫学有效量的本文所述的重组PRV。

附图说明

图1显示了根据本发明的一个实施方案构建rPRV的策略。伪狂犬病病毒(PRV)基因组：独特的长区域(U_L)，内部重复序列(IR)，独特的短区域(U_S)和末端重复序列(TR)。表达PRRSV-ORF5、PCV2-ORF2、CSF-E2的四价PRV；表达PCV2-ORF2、CSF-E2的三价PRV。缩写：N-gG＝糖蛋白G的N(氨基)末端；C-gG＝糖蛋白的羧基末端；PK＝蛋白激酶；CMV ie＝人巨细胞病毒的立即早期启动子；EF1α启动子＝延伸因子1α启动子；终止子SV40polyA，牛生长激素聚腺苷酸化(BGH polyA)。

图2A和2B显示用多价疫苗感染的PK15细胞的免疫荧光测定。图2A：用二价PRV(ORF2-PRV)或三价PRV(ORF2-E2-PRV)或四价PRV(ORF5-ORF2-E2-PRV)感染的PK15细胞在37℃，5％CO₂下36小时的免疫荧光测定。在所有构建体中均观察到抗ORF2(小鼠超免疫血清)信号。图2B：用三价PRV(ORF2-E2-PRV)或四价PRV(ORF5-ORF2-E2-PRV)感染的PK15细胞在37℃，5％CO₂下36小时的免疫荧光测定。在所有构建体中均观察到抗E2(小鼠超免疫血清)信号。

图3显示在第0天和第21天用三价或四价PRV疫苗免疫的小鼠组(n＝8/组)。在第20天和第42天收集血清。通过间接ELISA进行的第20天和第42天血清PRV/CSF/PCV2/PRRSV特异性IgG抗体水平。

图4显示在第0天和第21天用三价或四价PRV疫苗免疫的小鼠组(n＝8/组)。在第20天和第42天收集血清。结果显示第42天(第二次免疫后21天)血清PCV2-ORF2或CSF-E2特异性抗体滴度

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。

关于基因序列的术语“表达”是指基因的转录，并且适当时，所得mRNA转录物翻译成蛋白质。因此，从上下文中可以清楚地看出，蛋白质编码序列的表达是由编码序列的转录和翻译产生的。

如本文所用，“基因”是指包含基因产物的编码区的核酸序列。

在将核酸片段(例如，重组DNA构建体)插入细胞中的上下文中，“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提及核酸片段的掺入酵母或真菌细胞，其中核酸片段可以掺入细胞的基因组(例如，染色体、质粒或线粒体DNA)，转化成自主复制子，或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

如本文所用，“可操作的连接”或“操作地连接”或“可操作地连接”应理解为例如指启动子和待表达的核酸的顺序排列，并且如果合适的话，还有其他调节元件，例如终止子，使得每个调节元件可以在核酸的重组表达中发挥其功能以制备所需产物。这不一定需要化学意义上的直接连接。遗传控制序列，例如增强子序列，也可以从稍微远离的位置或实际上从其他DNA分子(顺式或反式定位)的位置对靶序列发挥其功能。优选的排列是其中待重组表达的核酸序列位于作为启动子的序列的下游，使得两个序列彼此共价键合的排列。如本领域所熟知的，调节或控制序列可位于核苷酸序列的5'侧或核苷酸序列的3'侧。

术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，是指核苷酸的聚合物，其可以是天然或合成的线性和顺序的核苷酸和/或核苷的阵列，包括脱氧核糖核酸、核糖核酸及其衍生物。它包括染色体DNA、自我复制质粒、DNA或RNA的感染性聚合物以及主要发挥结构作用的DNA或RNA。除非另有说明，否则核酸或多核苷酸以5'至3'方向从左向右书写。核苷酸通过其通常接受的单字母代码来指代。数字范围包括定义范围的数字。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸可以通过它们通常已知的三字母或单字母符号来表示。氨基酸序列分别以氨基至羧基取向从左至右书写。数字范围包括定义范围的数字。

“启动子”是指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

“在哺乳动物细胞中有活性的启动子”是能够在哺乳动物细胞中控制转录的启动子，无论其来源是否来自哺乳动物细胞。

“重组”是指两个以其他方式分开的序列区段的人工组合，例如通过化学合成或通过基因工程技术操纵分离的核酸区段。“重组”还包括指通过引入异源核酸而修饰的细胞或载体，或衍生自如此修饰的细胞的细胞，但不包括通过天然存在的事件(例如，自发突变、自然转化/转导/转座)改变细胞或载体，例如在没有经过人工干预的情况下发生的那些。

“重组DNA构建体”是指通常在自然界中不天然存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可以包含衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或衍生自相同来源但以不同于自然界中天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。术语“重组DNA构建体”和“重组构建体”在本文中可互换使用。在本文所述的几个实施方案中，重组DNA构建体也可以被认为是“过表达DNA构建体”。术语“核酸构建体”也可以与“重组DNA构建体”互换使用。

“调节序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，其影响转录、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译。调节序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调节序列”和“调节元件”在本文中可互换使用。

可以使用各种设计用于检测同源序列的比较方法来确定序列比对和百分比相同性计算，包括但不限于生物信息学计算套件(Inc.,Madison,WI)的程序。除非另有说明，否则本文提供的序列的多重比对使用Clustal V比对法(Higgins and Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)进行，具有默认参数(GAPPENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)。使用Clustal V方法的成对比对和蛋白质序列的百分比相同性计算的默认参数是KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALSSAVED＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4和DIAGONALSSAVED＝4。在序列比对后，使用Clustal V程序，通过查看同一程序上的“序列距离”表，可以获得“百分比相同性”和“趋异”值。除非另有说明，否则本文提供和要求保护的百分比相同性和趋异是以这种方式计算的。

或者，可以使用Clustal W比对方法。Clustal W比对方法(由Higgins and Sharp,CABIOS.5:151-153(1989)；Higgins,D.G.et al.,Comput.Appl.Biosci.8:189-191(1992)描述)可以在生物信息学计算套件(Inc.,Madison,Wis.)的MegAlign^TMv6.1程序中找到。多重比对的默认参数对应于GAP PENALTY＝10，GAP LENGTHPENALTY＝0.2，Delay Divergent Sequences＝30％，DNA Transition Weight＝0.5，Protein Weight Matrix＝Gonnet Series，DNAWeight Matrix＝IUB。对于成对比对，默认参数是Alignment＝Slow-Accurate，Gap Penalty＝10.0，Gap Length＝0.10，ProteinWeight Matrix＝Gonnet 250和DNA Weight Matrix＝IUB。在使用Clustal W程序比对序列后，通过查看同一程序中的“序列距离”表，可以获得“百分比相同性”和“趋异”值。

术语“在严格条件下”是指两个序列在中等或高度严格条件下杂交。更具体地，本领域普通技术人员可以容易地确定中等严格条件，例如，取决于DNA的长度。基本条件由Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,third edition,chapters6and 7,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001提出，并包括使用硝酸纤维素滤膜的预洗溶液5xSSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)，约40-50℃的约50％甲酰胺、2xSSC至6xSSC的杂交条件(或其他类似的杂交溶液，例如Stark溶液，约42℃的约50％甲酰胺)，和例如，约40-60℃、0.5-6×SSC，0.1％SDS的洗涤条件。优选地，中等严格条件包括在约50℃和6×SSC杂交(和洗涤)。本领域技术人员也可以容易地确定高度严格条件，例如，取决于DNA的长度。

通常，相较于中等严格条件，这样的条件包括在较高温度和/或较低盐浓度的杂交和/或洗涤(例如在约65℃，6xSSC至0.2xSSC，优选6xSSC，更优选2xSSC，最优选0.2xSSC的杂交)。例如，高度严格条件可包括如上定义的杂交，并在约65-68℃、0.2×SSC、0.1％SDS洗涤。在杂交和洗涤缓冲剂中，SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl、10mM NaH₂PO₄和1.25mM EDTA，pH7.4)可以代替SSC(1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后，洗涤进行15分钟。

还可以使用市售的杂交试剂盒，其不使用放射性物质作为探针。具体实例包括与ECL直接标记和检测系统(Amersham)的杂交。严格条件包括，例如，使用试剂盒中包含的杂交缓冲剂在42℃杂交4小时，其中补充有5％(w/v)封闭试剂和0.5M NaCl，并在0.4％SDS、0.5xSSC，在55℃中洗涤两次达20分钟，并在2xSSC，在室温洗涤一次5分钟。

如本文所用，关于核酸序列，术语“基本上同源的”或“基本同源性”包括在严格条件下与参考的SEQ ID NO：或其部分或互补序列杂交的核苷酸序列，是允许在两个序列之间发生反平行比对的那些，然后这两个序列能够在严格条件下与相反链上的相应碱基形成氢键，以在适当的严格性(包括高严格性)条件下形成足够稳定的双链体分子，可以使用本领域熟知的方法检测。基本上同源的序列可与序列表所示的参考核苷酸序列或其互补序列具有约70％至约80％的序列相同性，或更优选约80％至约85％的序列相同性，或最优选约90％至约95％的序列相同性，至约99％的序列相同性。或者，基本上同源的序列包括那些在严格条件下与植物基因内含子的靶区域杂交的序列。对于严格性条件，参见本文的描述并参见美国专利号8,455,716和8,536,403。

“PRRSV ORF5基因”或“ORF5基因”是指衍生自高致病性PRRSV中国毒株(HP-HRRSV-JXA1)的ORF5基因。在一些实施方案中，ORF5基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸1041-1643所示的序列。在其他实施方案中，当与SEQ ID NO：1的核苷酸1041-1643比较时，基于Clustal V或Clustal W比对方法，ORF5基因具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性。

“PCV ORF2基因”或“ORF2基因”是指衍生自PCV2印度尼西亚毒株(基因型2B)(PCV2TLL-Indo，GenBank登录号KX130941)的ORF2基因。在一些实施方案中，ORF2基因具有SEQ IDNO：1的核苷酸3063-3767所示的序列。在其他实施方案中，当与SEQ ID NO：1的核苷酸3063-3767比较时，基于Clustal V或Clustal W比对方法，ORF2基因具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性。

“CSF E2基因”或“E2基因”是指衍生自新出现的CSF印度尼西亚毒株的亚基因型2.1(CSF TLL-Indo，GenBank登录号KX130940)的E2基因。在一些实施方案中，E2基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸4729-5916所示的序列。在其他实施方案中，当与SEQ ID NO：1的核苷酸4729-5916比较时，基于Clustal V或Clustal W比对方法，E2基因具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性。

在一方面，本发明提供针对PRRSV、PCV2、CSF和PRV的四价PRV疫苗。根据该方面，制备核酸构建体，其包含PRRSV基因、PCV2基因和CSF基因。在一些实施方案中，PRRSV基因是PRRSV ORF5基因。在一些实施方案中，PRRSV ORF5基因衍生自高致病性PRRSV中国毒株(HP-HRRSV-JXA1)。在一些实施方案中，ORF5基因具有本文所述的核苷酸序列。在一些实施方案中，PCV2基因是PCV2 ORF2基因。在一些实施方案中，PCV2基因衍生自PCV2印度尼西亚毒株(基因型2B)。在一些实施方案中，ORF2基因具有本文所述的核苷酸序列。在一些实施方案中，CFS基因是CFS E2基因。在一些实施方案中，CFS E2基因衍生自新出现的CSF印度尼西亚毒株的亚基因型2.1。在一些实施方案中，E2基因具有本文所述的核苷酸序列。

在一些实施方案中，每个基因与在哺乳动物细胞中有活性的启动子可操作地连接。根据本发明，可以使用在哺乳动物细胞中有活性的任何合适的启动子。在一些实施方案中，启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施方案中，CMV启动子是CMV立即早期(CMVie)启动子。在一些实施方案中，CMV ie启动子具有SEQ ID NO：1的核苷酸445-1034所示的序列。在一些实施方案中，当与SEQ ID NO：1的核苷酸445-1034比较时，基于Clustal V或Clustal W比对方法，CMV启动子具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性。在一些实施方案中，启动子是延伸因子1α(EF1α)启动子。在一些实施方案中，EF1α启动子具有SEQ ID NO：1的核苷酸1869-3056所示的序列。在一些实施方案中，当与SEQ ID NO：1的核苷酸1869-3056比较时，基于Clustal V或Clustal W比对方法，EF1α启动子具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性。

在一些实施方案中，每个基因与在哺乳动物细胞中有效的终止子序列可操作地连接。根据本发明，可以使用在哺乳动物细胞中有活性的任何合适的终止子。在一些实施方案中，终止子序列是牛生长激素多腺苷酸化(BGH polyA)序列。在一些实施方案中，BGH polyA序列具有SEQ ID NO：1的核苷酸1644-1868所示的序列。在一些实施方案中，当与SEQ IDNO：1的核苷酸1644-1868比较时，基于Clustal V或Clustal W比对方法，BGH polyA序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。在一些实施方案中，终止子序列是SV40病毒多腺苷酸化(SV40polyA)序列。在一些实施方案中，SV40polyA序列具有SEQ ID NO：1的核苷酸5925-6192所示的序列。在一些实施方案中，当与SEQ ID NO：1的核苷酸5925-6192比较时，基于Clustal V或Clustal W比对方法，SV40polyA序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。。

在一些实施方案中，提供了核酸构建体，其包含本文所述的PRRSV基因，PCV2基因和CSF基因。在一些实施方案中，核酸构建体还包含本文所述的启动子和/或终止子。在一些实施方案中，核酸构建体还包含PRV的gG序列。在一些实施方案中，PRV是PRV Bartha-K61毒株。在一些实施方案中，核酸构建体包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在制备核酸构建体时，可以操纵各种DNA片段，以便以适当的方向提供DNA序列，并且在适当的情况下，在适当的阅读框中提供DNA序列。为此，可以使用衔接子或接头连接DNA片段，或者可以涉及其他操纵以提供方便的限制性位点、除去多余的DNA、除去限制性位点等。为此目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、重新取代，例如，转换和颠换。

本发明的核酸也可以完全或部分地合成，特别是在需要通过本领域已知的方法提供植物优选序列的情况下。因此，可以使用所选宿主优选的密码子合成本发明的全部或部分核酸。物种优选的密码子可以例如从在特定宿主物种中表达的蛋白质中最常使用的密码子确定。核苷酸序列的其他修饰可导致具有轻微改变的活性的突变体。

通过转染合适的细胞系，例如本文所述的PK-15细胞系细胞系，制备四价重组PRV或三价重组TRV。在一些实施方案中，用本文所述的核酸构建体和PRV核衣壳DNA转染细胞系。在一些实施方案中，将PRV核衣壳DNA修饰为含有用于表达红色荧光蛋白(RFP)的核酸构建体。将四价重组PRV或三价重组TRV在PK-15细胞中传代多代，以确保稳定的重组病毒，其中病毒核酸中没有突变或缺失。在一些实施方案中，五次传代足以产生稳定的重组病毒。

一旦制备，重组TRV病毒可以在合适的细胞系中复制。在一些实施方案中，细胞系是如本文所述的PK-15细胞系(细胞)。在一些实施方案中，细胞系(细胞)是幼仓鼠肾21(BHK21)细胞系。在一些实施方案中，BHK21细胞系是BHK21(克隆13)。在一些实施方案中，BHK21(克隆13)细胞系是CCL-10^TM并且可从美国典型培养物保藏中心获得。

猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和伪狂犬病病毒(PRV)是猪感染性生殖障碍的主要原因，并对全世界的养猪业造成重大损失。此外，PCV2和经典猪瘟导致毁灭性疾病，并对动物福利和许多亚洲国家的经济产生严重影响。多价疫苗方法的开发可以潜在地减少疫苗的施用至一剂量方案，以覆盖所有四种病毒，从而大大有助于现有状况以保护猪免受这四种疾病。我们选择减毒活PRV Bartha-K61作为多价疫苗开发的载体。PRV Bartha-K61毒株的基因组结构和遗传背景相对明确，并且报道外源基因的增殖和稳定表达不影响病毒本身的稳定性(Boldogkoi，Nogradi，2003)。

如本文所述，通过同源重组进入PRV Bartha K-61疫苗株的gG基因座，产生表达PCV2-ORF2、CSF-E2和PRRSV-ORF5的四价PRV和表达PCV2-ORF2和CSF-E2的三价PRV。复制试验和稳定性测试表明重组PRV，无论三价或四价PRV，在体外与PRV Bartha K-61一样稳定并在体外复制，证明外源基因在PRV的PK和gG基因座中的插入不影响PRV复制。此外，小鼠实验中的免疫原性研究表明，四价PRV诱导针对PCV2-ORF2、CSF-E2和PRRSV-ORF5抗原的高水平血清特异性体液抗体，类似地，三价PRV诱导针对PCV2-ORF2和CSF-E2的血清特异性体液抗体。这些结果表明在PRV Bartha K-61中表达来自主要猪病毒的多价免疫基因是开发针对PCV2、CSF或PRRSV并包括伪狂犬病的多价疫苗的新方法。

包含PCV2的ORF2、CSF的E2和PRRSV的ORF5的本发明的重组伪狂犬病病毒载体有效地诱导针对所有四种疾病的抗体，其允许在单次制造的产品中成本有效地大量生产。

根据本发明，发现三价和四价重组疫苗在PK15/BHK21细胞系中连续传代5次后是稳定的。在单个插入位点插入两个或三个基因是非常稳定的，并且既不显示遗传不稳定性，也不在所插入的基因转录中显示修饰。

根据本发明，发现在PRV-Bartha的gG基因座的单个插入位点插入多个基因不影响病毒滴度。

如本文所用，“施用”意指使用本领域技术人员已知的任何各种方法和递送系统来递送。施用可以例如以腹膜内、脑内、静脉内、口服、经粘膜、皮下、透皮、皮内、肌肉内、局部、肠胃外、通过植入、鞘内、淋巴内、病灶内、心包或硬膜外进行。药剂或组合物也可以以气溶胶施用，例如用于肺部和/或鼻内递送。施用可以进行例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时段上进行。

在对象中引发保护性免疫应答可以例如通过向对象施用初次剂量的疫苗，然后在合适的时间段后通过疫苗的一次或多次后续施用来实现。本领域技术人员可以容易地确定疫苗施用之间的合适时间段，并且通常为大约数周至数月。然而，本发明不限于任何特定的施用方法、途径或频率。

“预防有效剂量”或“免疫有效剂量”是疫苗的任何量，当向易于感染病毒或容易患病毒相关病症的对象施用时，在对象中诱导免疫应答保护对象免受病毒感染或患有病症。“保护”对象意味着降低对象感染病毒的可能性，或者减少对象中病症发作的可能性至少两倍，优选至少十倍。例如，如果对象有1％的机会感染病毒，对象感染病毒的可能性降低两倍会导致对象有0.5％的机会感染病毒。最优选地，“预防有效剂量”在对象中诱导免疫应答，其完全防止对象被病毒感染或完全防止对象中病症的发作。

任何本发明免疫和治疗方法的某些实施方案可以进一步包含向对象施用至少一种佐剂。“佐剂”是指适于增强抗原的免疫原性和加强对象的免疫应答的任何试剂。许多佐剂，包括适用于与基于蛋白质和基于核酸的疫苗使用的颗粒佐剂，以及将佐剂与抗原结合的方法，是本领域技术人员熟知的。适用于与蛋白质免疫使用的佐剂包括但不限于明矾、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、明矾佐剂、基于皂苷的佐剂，例如Quil A和QS-21等。

应当理解，本文所述的病毒株，当其用于在对象中引发保护性免疫应答或预防对象患有病毒相关疾病时，其以额外包含一种或多种生理学或药学上可接受的载剂的组合物形式施用给对象。药学上可接受的载剂是本领域技术人员熟知的，包括但不限于0.01M-0.1M，优选0.05M磷酸盐缓冲剂，磷酸盐缓冲盐水(PBS)或0.9％盐水中的一种或多种。这些载剂还包括水性或非水性溶液，悬浮液和乳液。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液、盐水和缓冲介质。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射的有机酯如油酸乙酯。肠胃外媒剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液和固定油。静脉内媒剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏右旋糖的那些等。固体组合物可包含无毒固体载剂，例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素或纤维素衍生物、碳酸钠和碳酸镁。对于在气溶胶中施用，例如用于肺部和/或鼻内递送，药剂或组合物优选与无毒表面活性剂一起配制，例如，C6至C22脂肪酸或天然甘油酯的酯或偏酯，和推进剂。可以包括额外的载剂如卵磷脂以促进鼻内递送。药学上可接受的载剂可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂和螯合剂，其增强活性成分的保质期和/或有效性。如本领域所熟知的，本组合物可以配制成在施用给对象后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。

本发明还提供了用本文所述的重组PRV免疫对象的试剂盒。该试剂盒包含本文所述的重组PRV、药学上可接受的载剂、涂药器及其使用的说明材料。本发明包括技术人员已知的试剂盒的其他实施方案。说明书可提供任何对指导本文所述的稳定的冷适应温度敏感性病毒株或其灭活形式的施用有用的信息。

本发明提供了与本文所述病毒株相关的疫苗技术。在一个实施方案中，本文所述的病毒株用于制备疫苗的方法中。在另一个实施方案中，本文所述的核酸构建体用于制备疫苗的方法中。在另外的实施方案中，本文所述的病毒株用于疫苗开发。在进一步的实施方案中，本文所述的核酸构建体用于疫苗开发。

除非另有说明，本发明的实践采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。参见，例如，Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York)；Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,2nd Ed.(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Sambrook andRussell,2001,Molecular Cloning,3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Ausubel et al.,1992),Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons,including periodic updates)；Glover,1985,DNACloning(IRL Press,Oxford)；Russell,1984,Molecular biology of plants:alaboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(AcademicPress,New York,1992)；Guthrie and Fink,Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology(Academic Press,New York,1991)；Harlow and Lane,1988,Antibodies,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Methods In Enzymology,Vols.154and 155(Wu etal.eds.),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；Riott,EssentialImmunology,6th Edition,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988；Fire etal.,RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development,Cambridge University Press,Cambridge,2005；Schepers,RNA Interference inPractice,Wiley–VCH,2005；Engelke,RNA Interference(RNAi):The Nuts&Bolts ofsiRNA Technology,DNA Press,2003；Gott,RNA Interference,Editing,andModification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Human Press,Totowa,NJ,2004；Sohail,Gene Silencing by RNA Interference:Technology andApplication,CRC,2004.

实施例

通过参考以下实施例描述本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并不意图以任何方式限制本发明。使用本领域熟知的标准技术或下面具体描述的技术。

实施例1

方法

免疫原的选择：基于对流行毒株的系统发育分析，选择来自PCV2印度尼西亚毒株(基因型2B)(PCV2 TLL-Indo，GenBank登录号KX130941)的ORF2基因。此外，PCV2基因型2B在猪群中是高度优势的基因型(Opriessnig et al.，2013)。E2基因选自新出现的CSF印度尼西亚毒株的亚基因型2.1(CSF TLL-Indo，GenBank登录号KX130940)。ORF5基因选自HP-PRRSV(高致病性PRRSV-JXA1)中国毒株，其与目前流行的PRRSV毒株具有高度相似性(Yinet al.，2012；Jantafong et al.，2015))。

构建重组转移质粒和合成基因：扩增来自PCV2毒株的ORF2基因和来自CSF毒株的E2，并分别克隆到中间pcDNA3.1+载体(Invitrogen)的XhoI/ApaI和HindIII/BamHI限制性位点中。

合成由PRRSV毒株的ORF5、牛生长激素(BGH)序列和延伸因子1α启动子(EF1α)序列的组合(ORF5-BGH-EF1α)组成的合成基因(Genscript，USA)。一种这样的合成基因具有SEQID NO：3所示的序列。包括BglII和AgeI限制性位点。

为了构建四价rPRV疫苗，将ORF5-BGH-EF1片段克隆到转移质粒pUC-gG-MCS的BglII/AgeI限制性位点中(图1)(由Enquist教授，Princeton University，USA友情提供)。pUC-gG-MCS是pUC57质粒，具有插入合成构建体，其由PRV Bartha的gG基因座组成。使用引物AgeI-ORF2 F：5'-CTGACCGGTATGACGTATCCAAGGAGGCG-3'(SEQ ID NO：4；AgeI位点加下划线)和ORF2-R-XhoI：5'-CGGCTCGAGCCATAGAGCCCACCGCATC-3'(SEQ ID NO：5；XhoI位点加下划线)扩增来自pcDNA3.1+的ORF2-BGH片段，并克隆到转移质粒pUC-gG-MCS的AgeI/XhoI限制性位点中(图1)。类似地，使用引物SalI-CMV+E2-F：5'-CGCGTCGACGTTGACATTGATTATTGAC-3'(SEQ ID NO：6；SalI位点加下划线)和NotI-E2-R：5'-TAAAGCGGCCGCACCAGCGGCGAGTGTTCTG-3'(SEQ ID NO：7；NotI位点加下划线)扩增来自pcDNA3.1+的CMV-E2片段，并克隆到转移质粒pUC-gG-MCS的SalI/NotI限制性位点中(图1)。通过PCR和测序验证重组转移质粒pUC-gG-ORF5-ORF2-E2。包含gG-CMV-ORF5-BGH-EF1-orf2-BGH-CMV-E2-SV40-gG的核酸序列示于SEQ ID NO：1中。

为构建三价rPRV疫苗，使用引物AgeI-ORF2F：5'-CTGACCGGTATGACGTATCCAAGGAGGCG-3'(SEQ ID NO：4；AgeI位点加下划线)和ORF2-R-XhoI：5'-CGGCTCGAGCCATAGAGCCCACCGCATC-3'(SEQ ID NO：5；XhoI位点加下划线)扩增来自pcDNA3.1+的ORF2-BGH片段，并克隆到转移质粒pUC-gG-MCS的AgeI/XhoI限制性位点中(图1)。使用引物SalI-EF1 F PCR：5'-GCGTCGACCGTGAGGCTCCGGT 3'(SEQ ID NO：8；SalI位点加下划线)和NotI-E2-R：5'-TAAAGCGGCCGCACCAGCGGCGAGTTGTTCTG 3'(SEQ ID NO：7；NotI位点加下划线)将合成的EF1α启动子和扩增的E2片段分别克隆到转移质粒pUC-gG-MCS的SalI/NotI限制性位点中(图1)。通过PCR和测序验证重组转移质粒pUC-gG-ORF2-E2。包含gG-CMV-ORF2-BGH-EF1-E2-SV40-gG的核酸序列示于SEQ ID NO：2中。

四价和三价重组PRV的产生：表达红色荧光蛋白(RFP)的PRV Bartha的核衣壳DNA(由Enquist教授，Princeton University，USA友情提供)通过EcoRI酶线性化以进行重组。用HindIII消化转移质粒pUC-gG-ORF5-ORF2-E2或pUC-gG-ORF2-E2以释放构建体用于组合。简而言之，将PK-15细胞以每孔1x10⁶个细胞接种在6孔板中。使用Lipofectamine 2000将3ug消化的构建体DNA gG-ORF5-ORF2-E2(四价PRV疫苗)或gG-ORF2-E2(三价PRV疫苗)与5ug线性化的PRV-RFP核衣壳DNA共转染到PK-15细胞中。在发生致细胞病变效应后，将转染后代接种到PK-15细胞中以进行噬斑纯化。

噬斑测定：将含有重组病毒的转染上清液(冻融后)从稀释度10^-1滴定至10^-6，并与PK-15细胞培养物在37℃并提供有5％CO₂孵育1小时。取出上清液，换上1％琼脂糖覆盖层。48小时后选择未显示荧光信号的病毒噬斑。在3至4轮噬斑纯化后，将选择的噬斑在PK-15细胞上传代，并对重组病毒进行测序以确认引入的基因(ORF2、E2和ORF5)的存在和不存在突变。

通过间接免疫荧光测定的表达分析：使用CSF-E2特异性多克隆抗体或PCV2-ORF2特异性单克隆抗体，通过免疫荧光染色分析三价或四价rPRV感染的细胞。简言之，将PK15细胞用三价或四价rPRV在37℃、5％CO₂感染36小时。固定后，将细胞用0.1％Triton X-100渗透，并与抗E2或抗ORF2多克隆抗体在37℃孵育1小时。然后将细胞与FITC-缀合的兔抗小鼠抗体(DAKO Cytomation，Copenhagen，Denmark)孵育。用倒置荧光显微镜(Olympus，Essex，UK)检测荧光信号，并通过数字成像系统(Nikon，Tokyo，Japan)捕获图像。

重组PRV疫苗在PK15和BHK21细胞系中的复制动力学：为了研究不同细胞系中的病毒复制，PK15或BHK21细胞用MOI为5的PRV-Bartha或三价rPRV或四价rPRV感染。在37℃1小时后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，并加入1mL含有2％FBS的培养基。将培养板在37℃孵育24小时和48小时。在这些时间点，通过三次冷冻和融化循环裂解细胞，并将含有病毒的上清液储存在-80℃。在PK15细胞上一式三份进行病毒滴定，每种细胞类型和时间点重复三次。计算病毒滴度并使用Reed和Muench方法(Reed and Muench，1938)表示为50％组织培养-感染剂量每体积(TCID₅₀/mL)。

重组PRV疫苗构建体的遗传稳定性：重组PRV疫苗构建体在PK15细胞中连续传代多达5次。在连续5次传代后，通过PCR和测序验证三价rPRV或四价rPRV疫苗构建体，以确认不存在突变或缺失。

小鼠模型中的免疫原性研究：对6至7周龄雌性BALB/c小鼠(n＝8/组)用10⁶TCID₅₀减毒PRV Bartha(阴性对照)、二价rPRV(PRV和ORF2)、三价rPRV(PRV、ORF2和E2)、四价(PRV、ORF2、E2和ORF5)和PBS对照在第0天和第21天肌内接种疫苗。在第20天和第42天收集血清。通过间接ELISA在第20天和第42天通过血清PRV特异性抗体滴度、PCV2-ORF2、CSF-E2和PRRSV-ORF5特异性抗体滴度评估重组疫苗构建体的免疫原性。

通过间接ELISA测量特异性抗体滴度：通过间接ELISA测试针对PRV、PCV2-ORF2、CSF-E2和PRRSV-ORF5抗原的血清特异性抗体滴度。简而言之，微量滴定孔ELISA板用纯化的PRV病毒抗原或PCV2-ORF2或CSF-E2或PRRSV-ORF5抗原包被在包被缓冲剂(0.1mol/升碳酸盐-碳酸氢盐，pH9.6)中。将血清样品(1:10稀释)用含有0.05％Tween 20和3％脱脂奶粉的PBS连续2倍稀释，并加入到板中，一式三份。用PBS-T洗涤三次后，向每个孔中加入1000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(DAKO)。通过100ml TMB底物(3,39,5,59-四甲基联苯胺)使反应显色，然后用50ml 2M H₂SO₄终止反应。使用微孔板吸光度读数器(Tecan，Switzerland)测定450nm处的光密度。

实施例2

重组PRV疫苗的构建和表征

表达PCV2-ORF2和CSF-E2的重组三价PRV载体(三价PRV-ORF2-E2)和表达PCV2-ORF2、CSF-E2和PRRSV-ORF5的四价PRV载体(四价PRV-ORF5-ORF2-E2)是通过同源重组将线性转移质粒(pUC-gG-四价/pUC-gG-三价)盒整合到PRV Bartha DNA中产生的(图1)。转染后，通过选择非红色荧光噬斑，在PK15细胞上对得到的重组体进行噬斑纯化。重新筛选阳性重组体。在3-4次噬斑纯化后，通过测序分析阳性重组体并在PK15细胞中滴定。此外，针对个体ORF2或E2特异性抗体的免疫荧光测定证明了单个PRV载体有效表达ORF2或E2蛋白(图2A和2B)。相反，没有观察到PRV阴性对照的荧光细胞。此外，稳定性测试显示重组疫苗(四价rPRV或三价rPRV)在PK15细胞中连续传代五次后是稳定的并且不存在突变或缺失。

实施例3

PK15和BHK21细胞中的复制

为了研究外源转基因在gG基因座处的插入或表达是否对复制特性有影响，在PK15和BHK21细胞中比较重组PRV疫苗构建体三价、四价rPRV和亲本PRV Bartha毒株的一步生长动力学。三价和四价PRV疫苗构建体的病毒滴度分别在PK15和BHK21细胞中显示10⁸TCID₅₀和10^8.3TCID₅₀，并且复制滴度与PRV-Bartha(TCID₅₀ 10^8.5-8.7)亲本毒株相当。

实施例4

小鼠模型中的免疫原性研究

结果显示用四价PRV疫苗免疫的小鼠显示针对PRV、E2、ORF2和PRRSV的血清特异性抗体水平。另外，用三价PRV疫苗接种的小鼠诱导针对PRV、ORF2和E2抗原的血清特异性抗体水平(图3)。抗体滴度结果显示用二价rPRV(ORF2)免疫的小鼠显示针对PCV2-ORF2抗原的抗体滴度>260。另外，用三价PRV和四价PRV疫苗免疫的小鼠分别显示针对ORF2抗原的抗体滴度为240和180。此外，三价和四价PRV疫苗均显示出针对经典猪瘟E2糖蛋白的抗体滴度>256(图4)。

在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一种”和“一个”和“该”以及类似的指代应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的引用仅为旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

本文描述了本发明的实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读前面的描述后，这些实施方案的变化对于本领域普通技术人员而言将变得明显。发明人期望本领域技术人员适当地采用这些变化，并且发明人希望本发明以不同于本文具体描述的方式实施。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等价物。此外，除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素的所有可能变化的任何组合。

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序列表

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<150> US 62/338,939

<151> 2016-05-19

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6619

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nucleic acid comprising swine viral disease sequences

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> HindIII restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(438)

<223> PRV gG sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (439)..(444)

<223> PstI restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (445)..(1034)

<223> CMV ie promoter sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1035)..(1040)

<223> BglI restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (1041)..(1643)

<223> PRRSV ORF5 sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1644)..(1868)

<223> BGH polyA sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1869)..(3056)

<223> EF1-1alpha promoter sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (3057)..(3062)

<223> AgeI restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (3063)..(3767)

<223> PCV ORF2 sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (3799)..(4023)

<223> BGH polyA sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (4024)..(4029)

<223> XhoI restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (4038)..(4043)

<223> SalI restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (4044)..(4631)

<223> CMV ie promoter sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (4729)..(5916)

<223> CSF E2 sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (5917)..(5924)

<223> NotI restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (5925)..(6192)

<223> SV40 polyA sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (6193)..(6613)

<223> PRV gG sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (6614)..(6619)

<223> HindIII restriction site

<400> 1

aagctttggg caacgtggat cctcgccctc gggctcctcg tggtccgcac cgtcgtggcc 60

agagaggccc ctcgggagct ctgctacggc caccccgtcc acgacgaccg gcggcccgtc 120

gggcccgcga ccgacgccca gcccgtgaac ccgctcgccc ccgccaacgc caccgggacg 180

gactactctc gcggctgcga gatgcgcctc ctggatccgc ctctcgacgt atcgtcccgc 240

tcctcggacc ccgtcaacgt gaccgtcgcc tggttctttg acggcggcca ctgcaaggtg 300

cccctcgtcc accgcgagta ctacggctgc cccggggacg ccatgccctc cgtcgagacg 360

tgcaccggcg ggtactcgta cacccgcacg cgcatcgaca ccctgatgga gtacgccctc 420

gtgaacgcca gcctcgtgct gcagtagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt 480

tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg 540

accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc 600

aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc 660

agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg 720

gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat 780

ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg 840

tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag 900

tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt 960

gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctggtttagt 1020

gaaccgtcag atccagatct atgttgggga agtgcttgac cgcgtgctgt tgctcgcgat 1080

tgcttttttt gtggtgtatc gtgccgttct atcttgctgt gctcgtcaac gccagcaaca 1140

acaacagctc tcatattcag ttgatttata acttaacgct atgtgagctg aatggcacag 1200

attggctggc acaaaaattt gactgggcag tggagacttt tgtcatcttc cccgtgttga 1260

ctcacattgt ttcctatggg gcactcacca ccagccattt ccttgacaca gttggtctgg 1320

ccactgtgtc caccgccgga tattatcacg ggcggtatgt cttgagtagc atttacgcag 1380

tctgtgctct ggctgcgctg atttgctttg tcattaggct tgcgaagaac tgcatgtcct 1440

ggcgctactc ttgtaccaga tataccaact tccttctgga cactaagggc agactctatc 1500

gttggcggtc gcccgtcatt gtggagaaag ggggtaaggt tgaggtcgaa ggtcacctga 1560

tcgacctcaa gagagttgtg cttgatggtt ccgcggcaac ccctttaacc agagtttcag 1620

cggaactatg gggtcgtctc tagctgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 1680

ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 1740

tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 1800

gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 1860

ctctatggcg tgaggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 1920

cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg agccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 1980

aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 2040

gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 2100

acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg 2160

cgtgccttga attacttcca cgcccctggc tgcagtacgt gattcttgat cccgagcttc 2220

gggttggaag tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct tcgcctcgtg 2280

cttgagttga ggcctggctt gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc 2340

gcgcctgtct cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg 2400

cgacgctttt tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaggatctg cacactggta 2460

tttcggtttt tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc acatgttcgg 2520

cgaggcgggg cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc 2580

ggcctgctct ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc 2640

tggcccggtc ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctgcag 2700

ggagctcaaa atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa 2760

ggaaaagggc ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc 2820

cgtccaggca cctcgattag ttctcgagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg 2880

aggggtttta tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag 2940

cttggcactt gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca 3000

ttctcaagcc tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgaaccg 3060

gtatgacgta tccaaggagg cgtttccgca gacgaagaca ccgcccccgc agccatcttg 3120

gccagatcct ccgccgccgc ccctggctcg tccacccccg ccaccgttac cgctggagaa 3180

ggaaaaatgg catcttcaac acccgcctct cccgcacctt cggatatact gtcaagaaaa 3240

ccacagtcag aacgccctcc tgggcggtgg acatgatgag atttaatatt aacgatttcc 3300

ttcccccagg agggggctca aaccccctca ctgtgccctt tgaatactac agaataagaa 3360

aggttaaggt tgaattctgg ccctgctccc caatcaccca gggtgacagg ggagttggat 3420

ccactgctgt tattctagat gataactttg taacaaaggc cacagccctg acttatgatc 3480

cctatgtaaa ctactcctcc cgccatacca taacccagcc cttctcctac cactcccggt 3540

actttacccc caaacctgtt cttgattcca ctattgatta cttccaacca aataacaaaa 3600

ggaatcagct ttggctgagg ctacaaacca ctgcaaatgt ggaccacgta ggcctcggca 3660

ctgcgttcga aaacagtata tacgaccagg actacaatat ccgtgtaacc atgtatgtac 3720

aattcagaga atttaatctt aaagaccccc cacttcaccc taagtgaggg cccgtttaaa 3780

cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 3840

ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 3900

aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 3960

acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 4020

tggctcgagc ttctccagtc gacgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc 4080

aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 4140

aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta 4200

tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 4260

gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 4320

cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 4380

tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg 4440

gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 4500

cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg 4560

taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 4620

aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac 4680

gactcactat agggagaccc aagctggcta gcgtttaaac ttaaacttat aaaagtatta 4740

agaggacaga tcgtgcaagg tgtggtatgg ctgttactag taactggggc acaaggccgg 4800

ctagcctgca aggaagatta caggtacgca atatcgtcaa ccgatgagat agggctactt 4860

ggggccggag gtctcaccac cacctggaag gaatacaacc acgatttgca actgaatgac 4920

gggaccgtta aggccagttg cgtggcaggt tcctttaaag tcacagcact taatgtggtc 4980

agtaggaggt atttggcatc attgcataag aaggctttac ccacttccgt gacattcgag 5040

ctcctgttcg acgggaccaa cccatcaact gagggaatgg gagatgactt caggtccggg 5100

ctgtgcccgt ttgatacgag tcctgttgtt aagggaaagt acaatacgac cttgttgaac 5160

ggtagtgctt tctatcttgt ctgcccaata gggtggacgg gtgtcataga gtgcacagca 5220

gtgagcccaa caactctgag aacagaagtg gtaaagacct tcaggagaga caagcccttt 5280

ccgcacagaa tggattgtgt gaccaccaca gtggaaaatg aagatttatt ctattgtaag 5340

ttggggggca actggacatg tgtgaaaggc gagccagtgg tctacacagg ggggctagta 5400

aaacaatgta gatggtgtgg cttcgacttc gatgggcctg acggactccc gcattacccc 5460

ataggtaagt gcattttggc aaatgagaca ggttacagaa tagtagattc aacggactgt 5520

aacagagatg gcgttgtaat cagcacagag gggagtcatg agtgcttgat cggtaacacg 5580

actgtcaagg tgcatgcatc agatgaaaga ctgggcccta tgccatgcag acctaaagag 5640

attgtctcta gtgctggacc tgtaatgaaa acctcctgta cattcaacta cacaaaaact 5700

ttgaagaaca ggtactatga gcccagggac agctacttcc agcaatatat gcttaagggt 5760

gagtatcagt actggtttga cctggatgcg actgaccgcc actcagatta cttcgcagaa 5820

tttgttgtct tggtggtggt agcactgtta ggaggaagat atgtcctgtg gctgatagtg 5880

acctacgtag ttctaacaga acaactcgcc gctggtgcgg ccgcctagct agctagaatt 5940

ctagctagct aggactctag aagactctag atcataatca gccataccac atttgtagag 6000

gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat 6060

gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 6120

atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 6180

ctcatcacta gtcccgggtt gtacgacgcc ggcctctaca tcgtcgtgct cgtctttggc 6240

gacgacgcct acctcggcac cgtctccctg tcggtggagg ccaacctgga ctacccctgc 6300

ggcatgaagc acgggctcac gatcacccgc cccggggcca ccctcccacc catcgccccc 6360

acggccggcg accaccagcg ctggcgcggg tgcttcccct cgaccgacga gggcgcctgg 6420

gagaacgtga ccgccgccga gaagggcctg tccgacgact acgccgacta ctacgacgtg 6480

cacatcttcc gctcggagtc tgacgacgag gtcgtccacg gcgatgcccc cgaggccccc 6540

gagggcgagg aggtgaccga ggaggaggcc gagctgacct ccagcgacct cgacaacatc 6600

gagatcgagg tcgaagctt 6619

<210> 2

<211> 5119

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nucleic acid comprising swine viral disease sequences

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> HindIII restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(438)

<223> PRV gG sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (439)..(444)

<223> PstI restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (445)..(1047)

<223> CMV ie promoter sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1048)..(1053)

<223> AgeI restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (1054)..(1764)

<223> PCV ORF2 sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1790)..(2014)

<223> BGH polyA sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (2015)..(2020)

<223> XhoI restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (2029)..(2034)

<223> SalI restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (2035)..(3222)

<223> EF1-1alpha promoter sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (3229)..(4416)

<223> CSF E2 sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (4417)..(4424)

<223> NotI restriction sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (4425)..(4692)

<223> SV40 polyA sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (4693)..(5113)

<223> PRV gG sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (5114)..(5119)

<223> HindIII restriction site

<400> 2

aagctttggg caacgtggat cctcgccctc gggctcctcg tggtccgcac cgtcgtggcc 60

agagaggccc ctcgggagct ctgctacggc caccccgtcc acgacgaccg gcggcccgtc 120

gggcccgcga ccgacgccca gcccgtgaac ccgctcgccc ccgccaacgc caccgggacg 180

gactactctc gcggctgcga gatgcgcctc ctggatccgc ctctcgacgt atcgtcccgc 240

tcctcggacc ccgtcaacgt gaccgtcgcc tggttctttg acggcggcca ctgcaaggtg 300

cccctcgtcc accgcgagta ctacggctgc cccggggacg ccatgccctc cgtcgagacg 360

tgcaccggcg ggtactcgta cacccgcacg cgcatcgaca ccctgatgga gtacgccctc 420

gtgaacgcca gcctcgtgct gcagtagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt 480

tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg 540

accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc 600

aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc 660

agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg 720

gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat 780

ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg 840

tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag 900

tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt 960

gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctggtttagt 1020

gaaccgtcag atccagatct gctagcgacc ggtatgacgt atccaaggag gcgtttccgc 1080

agacgaagac accgcccccg cagccatctt ggccagatcc tccgccgccg cccctggctc 1140

gtccaccccc gccaccgtta ccgctggaga aggaaaaatg gcatcttcaa cacccgcctc 1200

tcccgcacct tcggatatac tgtcaagaaa accacagtca gaacgccctc ctgggcggtg 1260

gacatgatga gatttaatat taacgatttc cttcccccag gagggggctc aaaccccctc 1320

actgtgccct ttgaatacta cagaataaga aaggttaagg ttgaattctg gccctgctcc 1380

ccaatcaccc agggtgacag gggagttgga tccactgctg ttattctaga tgataacttt 1440

gtaacaaagg ccacagccct gacttatgat ccctatgtaa actactcctc ccgccatacc 1500

ataacccagc ccttctccta ccactcccgg tactttaccc ccaaacctgt tcttgattcc 1560

actattgatt acttccaacc aaataacaaa aggaatcagc tttggctgag gctacaaacc 1620

actgcaaatg tggaccacgt aggcctcggc actgcgttcg aaaacagtat atacgaccag 1680

gactacaata tccgtgtaac catgtatgta caattcagag aatttaatct taaagacccc 1740

ccacttcacc ctaagtgagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct 1800

agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc 1860

actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt 1920

cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat 1980

agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggctcgag cttctccagt cgaccgtgag 2040

gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 2100

gaggggtcgg caattgagcc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 2160

atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 2220

tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 2280

tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 2340

cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg 2400

tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc 2460

tggcttgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct 2520

gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc 2580

tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccag gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg 2640

gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg 2700

cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg 2760

cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca 2820

ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg 2880

aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt 2940

ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc 3000

gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg 3060

atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg 3120

taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag 3180

acagtggttc aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt gaaaacttat aaaagtatta 3240

agaggacaga tcgtgcaagg tgtggtatgg ctgttactag taactggggc acaaggccgg 3300

ctagcctgca aggaagatta caggtacgca atatcgtcaa ccgatgagat agggctactt 3360

ggggccggag gtctcaccac cacctggaag gaatacaacc acgatttgca actgaatgac 3420

gggaccgtta aggccagttg cgtggcaggt tcctttaaag tcacagcact taatgtggtc 3480

agtaggaggt atttggcatc attgcataag aaggctttac ccacttccgt gacattcgag 3540

ctcctgttcg acgggaccaa cccatcaact gagggaatgg gagatgactt caggtccggg 3600

ctgtgcccgt ttgatacgag tcctgttgtt aagggaaagt acaatacgac cttgttgaac 3660

ggtagtgctt tctatcttgt ctgcccaata gggtggacgg gtgtcataga gtgcacagca 3720

gtgagcccaa caactctgag aacagaagtg gtaaagacct tcaggagaga caagcccttt 3780

ccgcacagaa tggattgtgt gaccaccaca gtggaaaatg aagatttatt ctattgtaag 3840

ttggggggca actggacatg tgtgaaaggc gagccagtgg tctacacagg ggggctagta 3900

aaacaatgta gatggtgtgg cttcgacttc gatgggcctg acggactccc gcattacccc 3960

ataggtaagt gcattttggc aaatgagaca ggttacagaa tagtagattc aacggactgt 4020

aacagagatg gcgttgtaat cagcacagag gggagtcatg agtgcttgat cggtaacacg 4080

actgtcaagg tgcatgcatc agatgaaaga ctgggcccta tgccatgcag acctaaagag 4140

attgtctcta gtgctggacc tgtaatgaaa acctcctgta cattcaacta cacaaaaact 4200

ttgaagaaca ggtactatga gcccagggac agctacttcc agcaatatat gcttaagggt 4260

gagtatcagt actggtttga cctggatgcg actgaccgcc actcagatta cttcgcagaa 4320

tttgttgtct tggtggtggt agcactgtta ggaggaagat atgtcctgtg gctgatagtg 4380

acctacgtag ttctaacaga acaactcgcc gctggtgcgg ccgcctagct agctagaatt 4440

ctagctagct aggactctag aagactctag atcataatca gccataccac atttgtagag 4500

gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat 4560

gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 4620

atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 4680

ctcatcacta gtcccgggtt gtacgacgcc ggcctctaca tcgtcgtgct cgtctttggc 4740

gacgacgcct acctcggcac cgtctccctg tcggtggagg ccaacctgga ctacccctgc 4800

ggcatgaagc acgggctcac gatcacccgc cccggggcca ccctcccacc catcgccccc 4860

acggccggcg accaccagcg ctggcgcggg tgcttcccct cgaccgacga gggcgcctgg 4920

gagaacgtga ccgccgccga gaagggcctg tccgacgact acgccgacta ctacgacgtg 4980

cacatcttcc gctcggagtc tgacgacgag gtcgtccacg gcgatgcccc cgaggccccc 5040

gagggcgagg aggtgaccga ggaggaggcc gagctgacct ccagcgacct cgacaacatc 5100

gagatcgagg tcgaagctt 5119

<210> 3

<211> 2028

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nucleic acid comprising synthetic swine viral disease sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> BglII restriction site

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(609)

<223> PRRSV ORF5 sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (610)..(834)

<223> BGH poly A sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (835)..(2022)

<223> EF1-1alpha promoter

<220>

<221> misc_feature

<222> (2023)..(2028)

<223> AgeI restriction site

<400> 3

agatctatgt tggggaagtg cttgaccgcg tgctgttgct cgcgattgct ttttttgtgg 60

tgtatcgtgc cgttctatct tgctgtgctc gtcaacgcca gcaacaacaa cagctctcat 120

attcagttga tttataactt aacgctatgt gagctgaatg gcacagattg gctggcacaa 180

aaatttgact gggcagtgga gacttttgtc atcttccccg tgttgactca cattgtttcc 240

tatggggcac tcaccaccag ccatttcctt gacacagttg gtctggccac tgtgtccacc 300

gccggatatt atcacgggcg gtatgtcttg agtagcattt acgcagtctg tgctctggct 360

gcgctgattt gctttgtcat taggcttgcg aagaactgca tgtcctggcg ctactcttgt 420

accagatata ccaacttcct tctggacact aagggcagac tctatcgttg gcggtcgccc 480

gtcattgtgg agaaaggggg taaggttgag gtcgaaggtc acctgatcga cctcaagaga 540

gttgtgcttg atggttccgc ggcaacccct ttaaccagag tttcagcgga actatggggt 600

cgtctctagc tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt 660

ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 720

cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg 780

gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcgtgag 840

gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 900

gaggggtcgg caattgagcc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 960

atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 1020

tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 1080

tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 1140

cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg 1200

tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc 1260

tggcttgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct 1320

gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc 1380

tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccag gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg 1440

gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg 1500

cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg 1560

cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca 1620

ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg 1680

aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt 1740

ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc 1800

gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg 1860

atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg 1920

taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag 1980

acagtggttc aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt gaaccggt 2028

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligonucleotide primer

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(9)

<223> AgeI restriction site

<400> 4

ctgaccggta tgacgtatcc aaggaggcg 29

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligonucleotide primer

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(9)

<223> XhoI restriction site

<400> 5

cggctcgagc catagagccc accgcatc 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligonucleotide primer

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(9)

<223> SalI restriction site

<400> 6

cgcgtcgacg ttgacattga ttattgac 28

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligonucleotide primer

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(12)

<223> NotI restriction site

<400> 7

taaagcggcc gcaccagcgg cgagttgttc tg 32

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligonucleotide primer

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(8)

<223> SaII restriction site

<400> 8

gcgtcgaccg tgaggctccg gt 22

Claims

1.一种核酸构建体，其包含：

伪狂犬病病毒(PRV)gG基因，所述基因含有插入其中的：

(a)在哺乳动物细胞中有活性的启动子，其与猪圆环病毒(PCV2)ORF2基因可操作地连接，所述ORF2基因与在哺乳动物细胞中有活性的终止子可操作地连接；以及

(b)在哺乳动物细胞中有活性的启动子，其与经典猪瘟(CSF)病毒E2基因可操作地连接，所述E2基因与在哺乳动物细胞中有活性的终止子可操作地连接。

2.权利要求1的核酸构建体，其中在哺乳动物细胞中有活性的每个启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期(ie)启动子或延伸因子1α(EF1α)启动子。

3.权利要求1或2的核酸构建体，其中在哺乳动物细胞中有活性的每个终止子是牛生长激素(BGH)多腺苷酸化序列(polyA)或猿猴病毒40(SV40)polyA。

4.权利要求1-3中任一项的核酸构建体，其中所述PCV2 ORF2基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸3063-3767所示的序列，并且CSF E2基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸4729-5916所示的序列。

5.权利要求1-4中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

6.一种载体，其包含权利要求1-5中任一项的核酸构建体。

7.一种哺乳动物细胞系，其用权利要求1-5中任一项的核酸构建体和线性化的PRV核衣壳核酸转染。

8.权利要求7的哺乳动物细胞系，其是PK-15细胞系。

9.权利要求7或8的哺乳动物细胞系，其中所述PRV是PRV Bartha-K61。

10.一种三价重组PRV，其包含权利要求1-5中任一项的核酸构建体。

11.权利要求10的重组PRV，其中所述PRV是PRV Bartha-K61。

12.一种疫苗，其包含权利要求10或11的重组PRV和生理学上可接受的载剂。

13.权利要求10或11的重组PRV在制备用于在对象中引发保护性免疫应答的药物中的用途。

14.权利要求10或11的重组PRV在制备用于预防对象患有PRV、PCV和CSF的药物中的用途。

15.权利要求10或11的重组PRV用于在对象中引发保护性免疫应答的用途。

16.权利要求10或11的重组PRV用于预防对象患有PRV、PCV和CSF的用途。

17.一种在对象中引发保护性免疫应答的方法，其包含向对象施用预防、治疗或免疫学有效量的权利要求10或11的重组PRV。

18.一种预防对象患有PRV、PCV2和CSF的方法，其包含向对象施用预防、治疗或免疫学有效量的权利要求10或11的重组PRV。

19.权利要求10或11的重组PRV用于疫苗开发的用途。

20.权利要求10或11的重组PRV，用于疫苗开发。

21.一种核酸，其包含：

伪狂犬病病毒(PRV)gG基因，所述基因含有插入其中的：

(a)在哺乳动物细胞中有活性的启动子，其与猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因可操作地连接，所述ORF5基因与在哺乳动物细胞中有活性的终止子可操作地连接；

(b)在哺乳动物细胞中有活性的启动子，其与猪圆环病毒(PCV2)ORF2基因可操作地连接，所述ORF2基因与在哺乳动物细胞中有活性的终止子可操作地连接；以及

(c)在哺乳动物细胞中有活性的启动子，其与经典猪瘟(CSF)病毒E2基因可操作地连接，所述E2基因与在哺乳动物细胞中有活性的终止子可操作地连接。

22.权利要求21的核酸构建体，其中在哺乳动物细胞中有活性的每个启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期(ie)启动子或延伸因子1α(EF1α)启动子。

23.权利要求21或22的核酸构建体，其中在哺乳动物细胞中有活性的每个终止子是牛生长激素(BGH)多腺苷酸化序列(polyA)或猿猴病毒40(SV40)polyA。

24.权利要求21-23中任一项的核酸构建体，其中所述PCV2 ORF2基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸3063-3767所示的序列，所述CSF E2基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸4729-5916所示的序列，并且PRRSV ORF5具有SEQ ID NO：1的核苷酸1041-1643所示的序列。

25.权利要求21-24中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

26.一种载体，其包含权利要求21-25中任一项的核酸构建体。

27.一种哺乳动物细胞系，其用权利要求21-25中任一项的核酸构建体和线性化的PRV核衣壳核酸转染。

28.权利要求27的哺乳动物细胞系，其是PK-15细胞系。

29.权利要求27或28的哺乳动物细胞系，其中所述PRV是PRV Bartha-K61。

30.一种四价重组PRV，其包含权利要求21-25中任一项的核酸构建体。

31.权利要求30的重组PRV，其中所述PRV是PRV Bartha-K61。

32.一种疫苗，其包含权利要求30或31的重组PRV和生理学上可接受的载剂。

33.权利要求30或31的重组PRV在制备用于在对象中引发保护性免疫应答的药物中的用途。

34.权利要求30或31的重组PRV在制备用于预防对象患有PRV、PRRSV、PCV和CSF的药物中的用途。

35.权利要求30或31的重组PRV用于在对象中引发保护性免疫应答的用途。

36.权利要求30或31的重组PRV用于预防对象患有PRV、PRRSV、PCV和CSF的用途。

37.一种在对象中引发保护性免疫应答的方法，其包含向对象施用预防、治疗或免疫学有效量的权利要求30或31的重组PRV。

38.一种预防对象患有PRV、PRRSV、PCV2和CSF的方法，其包含向对象施用预防、治疗或免疫学有效量的权利要求30或30的重组PRV。

39.权利要求30或31的重组PRV用于疫苗开发的用途。

40.权利要求30或31的重组PRV，其用于疫苗开发。