CN113337476B

CN113337476B - 一种口蹄疫O型PanAsia-2谱系储备疫苗毒株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN113337476B
Application number: CN202110589782.7A
Authority: CN
Inventors: 李平花; 刘在新; 卢曾军; 黄书伦; 孙普; 查晶晶; 李冬; 白兴文; 曹轶梅; 马雪青; 李坤; 袁红; 付元芳
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2041-05-28
Also published as: CN113337476A

Abstract

本发明提供了一种口蹄疫O型PanAsia‑2谱系储备疫苗毒株及其构建方法和应用，属于兽药生物制品技术领域。口蹄疫重组病毒rHN/TUR09/VP1以O/HN/CHA/93病毒株为骨架，嵌合O/TUR/5/2009的VP1基因所得。rHN/TUR09/VP1不仅与遗传关系较近的口蹄疫O型PanAsia谱系和Ind‑2001谱系毒株的抗原高度匹配，而且与遗传关系较远的口蹄疫O型Cathay谱系和Mya‑98谱系毒株的抗原匹配，表明rHN/TUR09/VP1不仅能很好的免疫防控我国当前O型多谱系FMD病毒株的流行，而且可作为战略储备疫苗毒株用于我国边境地区O/Panasia‑2谱系口蹄疫的有效防控。

Description

一种口蹄疫O型PanAsia-2谱系储备疫苗毒株及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于兽药生物制品技术领域，具体涉及一种口蹄疫O型PanAsia-2谱系储备疫苗毒株及其构建方法和应用。

背景技术

FMD(Foot-and-mouth disease,FMD)是口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus,FMDV)牛、羊和猪等主要家畜的烈性传染病。该病的爆发和流行严重危害畜群的生产力和畜产品质量，给发病地区的畜牧业及其相关产业造成巨大的经济损失。因此，该病是我国重点防控的动物疫病之一。

我国是口蹄疫流行比较严重的国家，尤其是O型口蹄疫对我国畜牧养殖业的危害最严重。国家口蹄疫参考实验室分子流行病学调查显示，除了历史存留的O型Cathay谱系毒株外，我国当前流行的O型Panasia，O型Mya-98谱系毒株以及这几年广泛引发疫情的O型Ind-2001谱系毒株均为境外流行毒株传入。而且每传入一个新毒株，都会引起新一轮疫情的暴发。如2017年新传入我国的Ind-2001谱系毒株，先在新疆引起2起疫情，2018年在湖北、安徽和贵州等多地引起9起疫情，而且该毒株仍在我国的许多省份流行和传播，对我国畜牧养殖业造成了巨大的影响。我国边境线较长，且周边国家和地区FMD疫情常年不断，尤其是近年来流行于中东，西亚等地区的O型Panasia-2系(O型Panasia的另一分支)毒株，具有较强的流行潜力，给我国口蹄疫的防控构成了新的威胁。因此，为了有效防范O/PanAsia-2病毒株传入我国的风险，必须针对性地开展相关研究，做好疫苗战略储备。

FMDV衣壳(P1基因)由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60分子构成，它们是病毒感染和疫苗免疫诱导机体产生保护性抗体的主要免疫基因，其中VP1、VP2、VP3结构蛋白上包含许多的线性或构象性的抗原表位或抗原决定簇，它们在诱导保护性抗体的产生方面发挥着非常重要的作用。但FMDV是小RNA病毒，在免疫压力下，暴露于衣壳外部的VP1基因高度易变，常导致病毒抗原性发生改变，直接影响了型内不同谱系病毒株之间交叉免疫保护，给疫病的预防控制造成一定的阻碍。

大量的研究表明，利用FMDV反向遗传操作技术替换流行毒株的结构蛋白P1或VP1基因可以快速发展FMDV疫苗候选株。然而现有技术不恰当的基因重组会影响重组后病毒的复制能力，或者导致重组病毒无法拯救成功，给FMDV疫苗的研发带来了较大的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗毒株及其构建方法和应用，所述口蹄疫病毒株不仅能够同时对近些年我国流行的O型PanAsia谱系、Ind-2001谱系、Mya98谱系和Cathay谱系口蹄疫病毒株具有较好的交叉反应性，大大拓展了病毒疫苗的抗原谱，有利于提高我国当前O型口蹄疫的有效防控，而且可以作为战略储备疫苗毒株，有效防范未来随时可能传入我国的O/PanAsia-2口蹄疫的流行。

本发明提供了一种口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗毒株rHN/TUR09/VP1，以口蹄疫病毒O/HN/CHA/93为骨架，嵌合了口蹄疫O型O/PanAsia-2谱系疫苗株O/TUR/5/2009的VP1基因所得。

优选的，所述口蹄疫疫苗株O/TUR/5/2009的VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了所述口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗毒株的构建方法，包括以下步骤：

1)以半长质粒pSK-Z123为骨架，人工合成含FMDV O/TUR/5/2009VP1基因的重组质粒，记为重组质粒pSK-Z123/TUR09VP1；

2)将步骤1)中所述重组质粒pSK-Z123/TUR09VP1用Spe I/Bgl II双酶切，将得到的5400bp的目标条带插入质粒pOFS中，得到重组质粒pOFS-TUR09/VP1；

3)将步骤2)中所述重组质粒pOFS-TUR09/VP1转染细胞，拯救病毒，得到rHN/TUR09/VP1。

优选的，步骤1)中FMDV O/TUR/5/2009VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，步骤2)中Spe I/Bgl II双酶切的体系如下：

10×Buffer H 10μL、BglⅡ4μL、SpeⅠ4μL、质粒4μg、ddH₂O补充至100μL；

酶切条件为在37℃条件下孵育1h～2h。

优选的，步骤3)中在所述转染细胞前，对所述重组质粒pOFS-TUR09/VP1进行鉴定。

优选的，所述鉴定的方法采用Bgl II和Not I酶对所述重组质粒pOFS-TUR09/VP1进行酶切，酶切出8400bp和3000bp两个条带，说明重组质粒pOFS-TUR09/VP1包含了FMDV O/TUR/5/2009毒株的VP1基因。

本发明提供了所述口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗毒株rHN/TUR09/VP1或所述构建方法构建得到的O型口蹄疫病毒株rHN/TUR09/VP1在制备口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗中的应用。

优选的，所述抗原广谱O型口蹄疫疫苗的防控对象为PanAsia谱系、Ind-2001谱系、Mya98谱系和Cathay谱系病毒株。

本发明提供了一种口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗，包括所述口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗毒株rHN/TUR09/VP1或所述构建方法构建得到的O型口蹄疫病毒株rHN/TUR09/VP1。

本发明提供了一种口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗毒株rHN/TUR09/VP1，以口蹄疫病毒O/HN/CHA/93为骨架，嵌合了PanAsia-2谱系口蹄疫疫苗株O/TUR/5/2009的VP1基因所得。本发明利用反向遗传操作技术，以O/HN/CHA/93为骨架，构建了含口蹄疫疫苗株O/TUR/5/2009的VP1基因的重组病毒株。实验表明，本发明构建的rHN/TUR09/VP1病毒株与亲本病毒病rHN复制特性相似，VP1基因的重构没有明显影响重组FMDV的生长特性，且能够稳定遗传，而O/TUR/5/2009病毒株P1基因的插入造成重组病毒株无法成功拯救；rHN/TUR09/VP1与遗传关系较远的O/GXCX/CHA/2018(Cathay谱系)和O/NXYCh/CHA/2018(Mya-98谱系)毒株的抗原均匹配，r1值分别为0.52和0.75(均大于0.3)，与遗传关系较近的O/HB/HK/99(PanAsia谱系)和O/XJ/CHA/2017(Ind-2001谱系)毒株的抗原高度匹配，r1值分别为0.84和0.87(见图8)。因此，可以预见我们构建的重组病毒与O/Panasia-2谱系病毒株也高度匹配。我们的结果表明我们构建的重组FMDV rHN/TUR09/VP1不仅能很好的免疫防控我国当前O型多谱系FMD病毒株的流行，而且可以作为战略储备疫苗毒株用于未来我国边境地区O/Panasia-2谱系FMD的有效防控。

附图说明

图1为FMDV全长重组质粒的基因示意图，其中灰色代表FMDV O/TUR/09的VP1基因；

图2为重组质粒的酶切鉴定图，M：DL12000 DNA marker，泳道1为pOFS质粒用BglII/Not I酶切，泳道2为pOFS-TUR09/VP1质粒用Bgl II/Not I酶切鉴定；

图3为重组质粒pOFS/TUR09/VP1转染BSR/T7细胞70h后引起的CPE，其中左图：正常的BSR/T7细胞，右图：出现CPE的BSR/T7细胞；

图4为rHN和rHN/TUR09/VP1重组病毒株的间接免疫荧光结果；

图5为rHN和rHN/TUR09/VP1病毒结构蛋白VP1序列的比对结果；

图6为rHN和rHN/TUR09/VP1重组病毒株的电镜观察结果，其中左图：rHN，右图：rHN/TUR09/VP1；

图7为rHN和rHN/TUR09/VP1重组病毒株的一步生长曲线；

图8为FMDV rHN和rHN/TUR09/VP1与不同谱系FMD流行毒株的抗原匹配性(r1)；

图9为FMDV全长重组质粒的基因示意图；其中灰色代表FMDV O/TUR/5/2009的P1基因；

图10为重组质粒pOFS-TUR09/P1的酶切鉴定图，M：DL12000 DNA marker，泳道1为pOFS质粒用Bgl II/NotI酶切，泳道2为pOFS-TUR09/P1质粒用BglII/NotI酶切鉴定；

图11为rHN和rHN/TUR09/P1重组病毒株的间接免疫荧光结果。

具体实施方式

本发明提供了一种口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗毒株rHN/TUR09/VP1，以O/HN/CHA/93为骨架，嵌合了口蹄疫疫苗株O/TUR/5/2009VP1基因所得。

在本发明中，FMDV rHN/TUR09/VP1为重组病毒株，将原有O/HN/CHA/93的VP1基因替换为O/TUR/5/2009毒株的VP1基因。所述O/TUR/5/2009毒株VP1基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。所述VP1基因编码的蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。

本发明以半长质粒pSK-Z123为骨架，人工合成含FMDV O/TUR/5/2009VP1基因的重组质粒，记为重组质粒pSK-Z123/TUR09VP1。

在本发明中，所述半长质粒pSK-Z123包含FMDV O/HN/CHA/93疫苗株的所有结构蛋白基因。所述半长质粒pSK-Z123在现有技术(Pinghua li等，2012)公开。人工合成重组质粒的方法优选将嵌合有FMDV疫苗株O/TUR/5/2009VP1基因插入pSK-Z123基因中。FMDV O/TUR/5/2009毒株的VP1基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。在本发明实施例中，所述人工合成重组质粒委托南京金唯智生物科技有限公司合成。

得到重组质粒pSK-Z123/TUR09VP1，本发明将所述重组质粒pSK-Z123/TUR09VP1用Spe I/BglII双酶切，将得到的5400bp的目标条带插入质粒pOFS中，得到重组质粒pOFS-TUR09/VP1。

在本发明中，Spe I/Bgl II双酶切的体系优选如下：

10×Buffer H 10μL、BglⅡ4μL、SpeⅠ4μL、质粒4μg、ddH₂O补充至100μL；酶切条件优选在37℃条件下孵育1h～2h。

本发明对所述Spe I/BglII酶的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的Spe I/BglII酶的来源即可。在本发明实施例中，所述Spe I/BglII分别购自宝生物科技有限公司。

双酶切后，本发明优选将所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶，回收5400bp的目标条带。本发明对所述琼脂糖凝胶电泳，切胶的方没有特殊限制，采用本领域所熟知的电泳、切胶方法即可。

在本发明中，所述质粒pOFS在插入外源基因前，优选采用Spe I/Bgl II进行双酶切。所述双酶切的条件同上，在此不做赘述。

得到重组质粒pOFS-TUR09/VP1后，本发明将所述重组质粒pOFS-TUR09/VP1转染细胞，拯救病毒，得到rHN/TUR09/VP1。

在本发明中，在所述转染细胞前，优选对所述重组质粒pOFS-TUR09/VP1进行鉴定。所述鉴定的方法采用Bgl II和Not I对所述重组质粒pOFS-TUR09/VP1进行初步酶切，酶切切出8400bp和3000bp两个条带，与预期长度一致。将初步酶切鉴定正确的重组质粒pOFS-TUR09/VP1进行序列测定，结果表明重组质粒pOFS-TUR09/VP1包含了FMDV O/TUR/5/2009毒株的VP1基因。

在本发明中，所述重组质粒pOFS-TUR09/VP1经鉴定后，还优选进行线性化处理。所述线性化用酶的种类优选为Not I酶。线性化处理后进行片段回收。所述回收的方法优选采用DNA片段回收试剂盒进行。本发明对所述转染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转染方法即可，例如脂质体Lipofectamine^TM2000介导转染。转染后的细胞进行培养至细胞出现病变情况，收集细胞，冻融后收集病毒株。

在本发明中，将构建的病毒株优选采用RT-PCR手段扩增VP1基因，扩增产物测序，测序结果与预期相同，表明本发明构建的病毒株为成功嵌合有VP1基因的重组病毒株。扩增VP1基因的引物优选为OZ3136(+)和OZ3980(-)；所述引物OZ3136(+)的核苷酸序列如SEQ IDNO:5(AGATAACACACGGGAAAGCC)所示，所述引物OZ3980(-)的核苷酸序列如SEQ ID NO:6(TGCATCTGGTTGATGGTGTC)所示。扩增VP1基因的反应条件为：94℃变性2min；98℃20s，68℃3mins，30个循环；72℃延伸8min。扩增VP1基因的反应体系如下：10×反应Buffer H 10μL、2.5mmol/lNTPs8μL、OZ3136(+)引物1μL、OZ3980(-)1μL、LAtaq酶1μL、cDNA 6μL、ddH₂O补充至100μL。本发明提供了所述口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗毒株rHN/TUR09/VP1或所述构建方法构建得到的O型口蹄疫病毒株rHN/TUR09/VP1在制备口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗中的应用。

在本发明中，所述抗原广谱O型口蹄疫疫苗的防控对象优选为O型FMDVPanAsia谱系、Ind-2001谱系、Mya98谱系和Cathay谱系病毒株以及未来可能传入我国的O/PanAsia-2谱系病毒株。本发明实施例中，选用FMDV O/NXYCh/CHA/2018作为Mya98谱系的病毒株代表，以FMDV O/GXCX/CHA/2018株作为Cathay谱系的病毒株代表，以FMDV O/XJ/CHA/2017株作为Ind-2001谱系的病毒株代表，以FMDV O/HB/HK/99作为PanAsia谱系的病毒株代表，分别测定了重组FMDV rHN/TUR09/VP1作为疫苗候选毒株与各谱系病毒株的抗原匹配性，评价该疫苗候选毒株适不适合制备O型口蹄疫疫苗；结果表明重组FMDV rHN/TUR09/VP1与遗传关系较远的O/GXCX/CHA/2018(Cathay谱系)和O/NXYCh/CHA/2018(Mya-98谱系)毒株的抗原均匹配，r1值分别为0.52和0.75(均大于0.3)，与遗传关系较近的O/HB/HK/99(PanAsia谱系)和O/XJ/CHA/2017(Ind-2001谱系)毒株的抗原高度匹配，r1值分别为0.84和0.87(见图8)，因此，可以预见构建的重组病毒与O/Panasia-2谱系病毒株也高度匹配。表明：构建的基因工程FMDV rHN/TUR09/VP1不仅能很好的免疫防控我国当前O型多谱系FMD病毒株的流行，而且可以作为战略储备疫苗毒株用于未来我国边境地区O/Panasia-2谱系FMD的有效防控。

在本发明中，所述疫苗优选为灭活疫苗。所述疫苗优选还包括佐剂。所述口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗毒株rHN/TUR09/VP1和佐剂的体积比为46:54。所述rHN/TUR09/VP1的抗原浓度优选为16μg/mL。本发明对所述口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗毒株的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的疫苗制备方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗毒株及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

材料来源说明

FMDV O/TUR/5/2009疫苗毒株于2009年分离于土耳其，属O/Panasia-2谱系毒株，在Genebank中公开，公开的序列号为KP202878.1。

O型FMDV株O/HN/CHA/93(Cathay谱系)、O/GXCX/CHA/2018(Cathay谱系)、O/HB/HK/99(PanAsia谱系)、O/XJ/CHA/2017(Ind-2001谱系)、O/NXYCh/CHA/2018(Mya-98)为我国公开菌株，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得。

O/HN/CHA/93毒株在文章Evaluation of a genetically modified foot-and-mouth disease virus vaccine candidate generated by reverse genetics(Li etal.BMC Veterinary Research 2012,8:57)中公开过，O/HB/HK/99在口蹄疫编著(刘湘涛等主编)P29页公开；O/XJ/CHA/2017(MF461724.1)、O/NXYCh/CHA/2018(MH791315.1)和O/GXCX/CHA/2018(MH791316.1)在Genebank中公开过。rHN是FMDV疫苗毒株O/HN/CHA/93的全长感染性克隆pOFS拯救获得的基因工程病毒(病毒和质粒见Pinghua li等，2012发表的文章中公开过)为本发明的亲本病毒。

实施例1

FMDV重组全长克隆的构建方法

以FMDV O/HN/CHA/93疫苗株半长质粒pSK-Z123(该质粒在文章Evaluation of agenetically modified foot-and-mouth disease virus vaccine candidate generatedby reverse genetics中公开过，Li et al.BMC Veterinary Research 2012,8:57)为骨架，分别设计合成含FMDV O/TUR/5/2009毒株VP1基因的质粒pSK-Z123/TUR09VP1。上述重组质粒分别用Spe I和BglII酶消化，分别回收约5400bp的目的带，并将其插入用同样酶消化的质粒pOFS(该质粒在文章Evaluation of a genetically modified foot-and-mouthdisease virus vaccine candidate generated by reverse genetics中公开过，Li etal.BMC Veterinary Research 2012,8:57)中，得到阳性质粒pOFS-TUR09/VP1。FMDV全长重组质粒的全基因组结构示意图见图1。

将重组质粒pOFS-TUR09/VP1用Bgl II和Not I酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒送金唯智生物技术有限公司进行序列测定。

结果表明，两个重组质粒用Bgl II和NotI酶切出与预期大小相符的基因片段(见图2)，测序结果也表明2个重组质粒含预期的基因替换。其中pOFS和pOFS-TUR09/VP1质粒的VP1核苷酸序列分别见SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，其对应的氨基酸序列见SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

实施例2

重组病毒的拯救

用Not I酶线化质粒pOFS-TUR09/VP1，然后用DNA片段回收试剂盒纯化回收作为转染模板。常规培养的单层BSR/T7细胞生长至70％～80％时用脂质体Lipofectamine^TM2000介导转染(具体操作方法见按照操作说明书)。转染后5h加入完全培养基，置37℃5％CO₂培养箱继续培养，每日观察转染细胞出现致细胞病变的情况。转染72h后收获细胞，反复冻融2～3次后，在BHK21上连续传代，-70℃保存各代病毒备用。

结果表明：线化的质粒pOFS-TUR09/VP1转染BSR/T7细胞70h后，细胞出现典型的致细胞病变，即细胞变大、变圆，成葡萄状分布(见图3)，而对照细胞形态完好，呈纤维状分布。拯救的基因工程病毒命名为rHN/TUR09/VP1。

实施例3

重组病毒的鉴定

3.1、间接免疫荧光

将收集的转染上清和亲本病毒rHN接种生长至70％～80％满的单层BHK-21细胞，孵育6h后用PBS缓冲液漂洗3次，3.7％多聚甲醛室温固定20min，PBS缓冲液洗涤3次，50mmol/L氯化铵室温通透10min，PBS缓冲液洗涤3次后加抗FMDV非结构蛋白3A的单抗3A24(3A24在文献《口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定》，中国兽医科学2010,40(04):331-336中公开过)37℃分别孵育1h，PBS漂洗3次，然后加FITC标记的山羊抗小鼠的抗体37℃孵育1h，PBS漂洗3次后每孔加入0.5μg/ml DAPI(PBS配制)染色10分钟，PBS洗三遍，去除多余的DAPI，置于共聚焦荧光显微镜下拍照。

结果表明：接种rHN和转染上清的BHK-21细胞与FMDV特异的3A单抗作用，均能看到可见的绿色荧光，而对照细胞用3A单抗作用看不到可见荧光。说明本发明拯救的重组病毒能够表达FMDV 3A蛋白(见图4)。

3.2、RT-PCR和遗传稳定性分析

将重组病毒rHN/TUR09/VP1按10％接种量接种BHK-21细胞，连续传代，观察出现95％细胞出现典型致细胞病变的时间，并对5、10代病毒进行RT-PCR以及序列测定，检测结构蛋白VP1氨基酸的变化以及遗传稳定性。其中rHN和rHN/TUR09/VP1病毒结构蛋白VP1的氨基酸差异见图5。

3.3、电镜观察

BHK-21细胞分别增殖FMDVrHN和rHN/TUR09/VP1各200mL，冻融2～3次后，加BEI灭活，12000rpm/min离心1h，收集病毒上清，4℃条件下35000rpm离心3h。离心后的沉淀用200μL10×TNE溶液重悬，磷钨酸常规负染后电镜观察FMDV粒子的形态。

电镜结果表明：基因工程病毒rHN/TUR09/VP1/和亲本病毒rHN经磷钨酸常规负染后，在电镜下均可观察到形态完整的球形粒子，直径约25nm(图6)，这与FMDV特有的形态结构一致，说明转染拯救的病毒为FMDV。

实施例4

重组FMDV的一步生长曲线

将第6代重组病毒和亲本病毒以2×10⁶PFU/mL病毒感染量，接种长满的单层BHK-21细胞(25mL培养瓶)，吸附1h后弃接种的病毒液，用MEM洗2次后，加5mLMEM培养基置于培养箱继续培养。接种后4、8、12、16h收取病毒样品，测定病毒效价(PFU/mL)，绘制一步生长曲线。

结果表明：重组FMDV和亲本FMDV具有相似的生长曲线，说明FMDV疫苗毒株O/TUR/5/2009VP1基因的替换没有明显影响重组FMDV在BHK-21细胞上的复制能力(图7)。

实施例5

FMDV灭活疫苗的制备方法

FMDV的增殖，灭活和纯化

100％长满的单层贴壁BHK-21细胞(175mL细胞瓶)，分别接种亲本病毒rHN和重组病毒rHN/TUR09/VP1(27ml接毒液+3ml病毒液)，置37℃温箱继续培养，待100％细胞出现典型的致细胞病变时，分别收获病毒。将收获的约1000mL病毒液中加入Triton X-100(10mL/L)，室温摇震10min，4℃6000rpm/min离心30min，去除细胞碎片。收集的病毒上清用5mmolBEI 28℃灭活30h。灭活后的病毒抗原用乳鼠和BHK-21细胞进行灭活安全检验。检验合格的病毒抗原用PEG 6000浓缩，浓缩的病毒抗原用适量PBS(pH＝7.6)重悬，然后用蔗糖梯度离心法纯化病毒。浓缩纯化后的病毒抗原用液相色谱仪检测其146S含量。

5.2、疫苗配制

将佐剂ISA201置于37℃恒温水浴锅预热，按抗原:佐剂体积比＝46:54的比例将适量的抗原缓慢加入佐剂中，缓慢摇振，直至抗原和佐剂不分层，将配好的疫苗制品(146S抗原浓度为6μg/mL)置于4～8℃保存备用。

实施例6

重组FMDV与流行毒株的抗原匹配性分析

口蹄疫病毒的抗原匹配性是保障疫苗效力的一个最为重要的技术指标。目前因我国未出现FMDV O型PanAsia-2(O型Panasia谱系的另一分支)的跨境入侵，没有PanAsia-2毒株用于疫苗毒株的抗原匹配性分析，但可以通过检测重组FMDV rHN/TUR09/VP1与我国遗传关系较远的Cathay和Mya-98谱系FMDV和遗传关系较近PanAsia和Ind-2001谱系FMDV的抗原匹配性，评估重组FMDV疫苗做为战略储备疫苗的免疫保护效果。其中FMDV之间的遗传关系是根据病毒的VP1基因序列的差异来划分的。其中我国目前流行的O型口蹄疫病毒属3个拓扑型(中东-南亚拓扑型(ME-SA)、东南亚拓扑型(SEA)和古典中国(Cathay)拓扑型)中的四个谱系病毒株，分别为Mya-98谱系(SEA拓扑型)、Cathay谱系(Cathay拓扑型)、PanAsia谱系(ME-SA拓扑型)和Ind-2001谱系(ME-SA拓扑型)，其中PanAsia-2属于ME-SA拓扑型中的PanAsia谱系的另一分支。

选取90日龄健康易感的猪12头(O型口蹄疫液相阻断ELISA抗体效价＜1:6，3ABC抗体阴性)，分别免疫接种rHN和rHN/TUR09/VP1病毒疫苗，接种剂量为2mL/每头。免疫28天后采血，收集血清，用微量中和实验检测每个病毒的抗血清中和当前流行的不同谱系FMDV株(O/NXYCh/CHA/2018(Mya-98)和O/GXCX/CHA/2018(Cathay)O/HB/HK/99(PanAsia)，O/XJ/CHA/2017(Ind-2001)的交叉中和抗体效价，评价制疫苗毒株与流行毒株的抗原匹配性(抗原匹配性关系常用r1值判定，r1＝中和异源病毒的抗体效价/中和同源病毒的抗体效价，r1值愈接近1，毒株间抗原关系愈靠近；反之，抗原关系疏远，毒株差异较大。其中当r1值≥0.3时，说明制备参考血清的抗原和另一抗原相似，该疫苗可有效抵御另一毒株的攻击，适用于制造疫苗；当r值＜0.3时，则说明制备参考血清的抗原和另一抗原差异显著，该疫苗不能有效抵御另一毒株的攻击，不适用于制造疫苗)。

结果显示：FMDV疫苗毒rHN与O/HB/HK/99(PanAsia谱系)、O/XJ/CHA/2017(Ind-2001谱系)和O/NXYCh/CHA/2018(Mya98谱系)有良好的抗原匹配性(r1值均≥0.74)(见图8)，但与近年流行的FMDV O/GXCX/CHA/2018株(Cathay谱系)抗原不匹配(r1值＜0.3)(见图8)。而重组FMDV rHN/TUR09/VP1与遗传关系较远的O/GXCX/CHA/2018(Cathay谱系)和O/NXYCh/CHA/2018(Mya-98谱系)毒株的抗原均匹配，r1值分别为0.52和0.75(均大于0.3)，与遗传关系较近的O/HB/HK/99(PanAsia谱系)和O/XJ/CHA/2017(Ind-2001谱系)毒株的抗原高度匹配，r1值分别为0.84和0.87(见图8)，因此可以预见本发明构建的重组病毒与O/Panasia-2谱系病毒株也高度匹配。因此，本发明构建的重组FMDV rHN/TUR09/VP1不仅能很好的免疫防控我国当前O型多谱系FMD病毒株的流行，而且可以作为战略储备疫苗毒株，用于未来我国边境地区O/Panasia-2谱系FMD的有效防控。

对比例1

1.FMDV重组全长克隆的构建方法

以FMDV O/HN/CHA/93疫苗株半长质粒pSK-Z123(该质粒来源同上)为骨架，分别设计合成含FMDV疫苗毒株O/TUR/5/2009P1基因(核苷酸序列见SEQ ID NO:7)的质粒pSK-Z123/TUR09P1。合成的重组质粒分别用Spe I和Bgl II酶消化，回收约5400bp的目的带，并将其插入用同样酶消化的质粒pOFS(该质粒来源同上)中，得到阳性质粒pOFS-TUR09/P1。将重组质粒pOFS-TUR09/P1用Bgl II/Not I酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒送金唯智生物技术有限公司进行序列测定。含FMDV O/TUR/5/2009P1基因的全长重组质粒的全基因组结构示意图见图9。

结果表明，重组质粒pOFS和pOFS-TUR09/P1用BglII和Not I酶切出与预期大小相符的基因片段(见图10)，测序结果也表明重组质粒含预期的基因替换。其中pOFS和pOFS-TUR09P1质粒的P1核苷酸序列分别见SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，其对应的氨基酸序列见SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

2.重组病毒的拯救

用Not I酶线化质粒pOFS-TUR09/P1，然后用DNA片段回收试剂盒纯化回收作为转染模板。常规培养的单层BSR/T7细胞生长至70％～80％时用脂质体LipofectamineTM2000介导转染(具体操作方法见按照操作说明书)。转染后5h加入完全培养基，置37℃5％CO₂培养箱继续培养，每日观察转染细胞出现致细胞病变的情况。转染72h后收获细胞，反复冻融2～3次后，在BHK21上连续传代，-70℃保存各代病毒备用。

结果表明：线化的质粒pOFS-TUR09/P1转染BSR/T7细胞72h后，细胞未出现FMDV典型的致细胞病变，即细胞变大、变圆，成葡萄状分布。将转染72h后收集的细胞上清连续在BHK-21细胞上盲传4代，仍未见FMDV的致细胞病变出现。另外，用线化的质粒pOFS-TUR09/P1重复3次转染BSR/T7细胞，72h收集上清并继续盲传4代，仍拯救不到具有感染性的重组FMDV。表明FMDV疫苗毒株O/TUR/5/2009P1基因的替换影响了具有感染性的重组FMDV的拯救。

3.间接免疫荧光

将收集的转染上清和亲本病毒rHN接种生长至70％～80％满的单层BHK-21细胞，孵育6h后用PBS缓冲液漂洗3次，3.7％多聚甲醛室温固定20min，PBS缓冲液洗涤3次，50mmol/L氯化铵室温通透10min，PBS缓冲液洗涤3次后加抗FMDV非结构蛋白3A的单抗3A24，37℃分别孵育1h，PBS漂洗3次，然后加FITC标记的山羊抗小鼠的抗体37℃孵育1h，PBS漂洗3次后每孔加入0.5μg/ml DAPI(PBS配制)染色10分钟，PBS洗三遍，去除多余的DAPI，置于共聚焦荧光显微镜下拍照。

结果表明：接种rHN的BHK-21细胞与FMDV特异的3A单抗作用，均能看到可见的绿色荧光，而接种转染上清的细胞和对照细胞用3A单抗作用看不到可见荧光(见图11)。说明本发明未能拯救到嵌合O/TUR/5/2009P1基因的重组FMDV。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种口蹄疫O型PanAsia-2谱系储备疫苗毒株及其构建方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accacttctg caggtgagtc agctgacccc gtgactgcca ctgttgagaa ctacggtggc 60

gagacacagg tccagagacg ccagcacacg gatgtctcgt ttatattgga cagatttgtg 120

aaagtgacac caaaagacca aattaatgtg ttggacctga tgcaaacccc cgcccacact 180

ttggtaggcg cgctcctccg caccgccacc tactacttcg cagatctaga ggtggcagtg 240

aaacacgagg ggaaccttac ctgggtcccg aatggggcgc ccgagacagc gttggataac 300

accactaatc caacggctta ccacaaagca ccgctcaccc gacttgcact gccttacacg 360

gcaccgcacc gtgtcttggc taccgcgtac aacgggaact gcaagtatgg cgagagccac 420

acaaccaatg tgagaggtga cctgcaagtg ttggctcaga aggcggcgag aacgttgcct 480

acttccttta actacggtgc catcaaagct acccgggtga ccgagttgct ttaccgcatg 540

aagagggctg aaacatactg cccccggcct cttttggcta ttcacccgag cgaagcaaga 600

cacaaacaga agatagtggc acctgtgaag cagcttttg 639

<210> 2

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accacctctg cgggcgagtc cgcggacccc gttaccgcca ccgttgagaa ttacggtggt 60

gagacacagg tccagagacg ccagcacacg gatatctcgt ttatactaga cagatttgtg 120

aaagtcacac caaaagacca aatcaatgtg ctggacctga tgcagatccc tgcccacact 180

ttagtagggg ccctcctgcg gacggccacc tactacttct ccgacttgga gttggctgtc 240

aaacacaagg gtgatctcac ctgggttccg aacggggccc ctgagacagc tttggacaac 300

accaccaacc caacagctta ccacaaagca ccactcacgc gactggcctt gccttacacg 360

gccccacacc gcgtcttagc gaccgtctac aacggaagtt gtaagtacag tggcgcccgc 420

gtgagcaacg tgaggggtga ccttcaagtg ttggctcaga aggcagaaag agctctgccc 480

acctccttta actatggtgc cattaaggca acccgggtga ctgagttact ctaccgaatg 540

aagagagccg agacatactg ccccaggccc cttcttgcca ttcaaccgag tgacgctaga 600

cacaagcaga agatcgtggc acccgcaaaa cagcttctg 639

<210> 3

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Thr Ser Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu

1 5 10 15

Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val

20 25 30

Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile

35 40 45

Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala

50 55 60

Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val

65 70 75 80

Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr

85 90 95

Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu

100 105 110

Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr

115 120 125

Ala Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser His Thr Thr Asn Val

130 135 140

Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Asp Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro

145 150 155 160

Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu

165 170 175

Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu

180 185 190

Ala Ile His Pro Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro

195 200 205

Val Lys Gln Leu Leu

210

<210> 4

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Thr Ser Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu

1 5 10 15

Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ile

20 25 30

Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile

35 40 45

Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala

50 55 60

Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Leu Ala Val

65 70 75 80

Lys His Lys Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr

85 90 95

Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu

100 105 110

Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr

115 120 125

Val Tyr Asn Gly Ser Cys Lys Tyr Ser Gly Ala Arg Val Ser Asn Val

130 135 140

Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro

145 150 155 160

Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu

165 170 175

Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu

180 185 190

Ala Ile Gln Pro Ser Asp Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro

195 200 205

Ala Lys Gln Leu Leu

210

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agataacaca cgggaaagcc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcatctggt tgatggtgtc 20

<210> 7

<211> 2208

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcgccgggc aatccagccc ggcgactggg tcacagaacc agtcaggcaa cactggaagc 60

atcatcaaca actactacat gcaacagtac cagaactcca tggacacaca acttggtgat 120

aacgctatta gcggaggctc caacgaaggg tccacagaca ccacttccaa ccacacaacc 180

aacacccaga acaacgactg gttttcaaag ctagccagtt ccgctttcag cggtcttttc 240

ggcgctcttc tcgccgacaa gaaaaccgag gagactactc ttctcgagga ccgcatcctt 300

actacccgta acggacacac aacctcgaca acccagtcga gcgtcggagt cacttacggg 360

tatgcaacaa ccgaggactt tgtgagcggg ccaaacacat ccggtcttga gactagggtt 420

gtgcaagcag agcggttttt caaaacccac ttgttcgact gggtcaccag tgactcgttc 480

ggacggtgcc acctgctgga acttccgact gaccacaaag gtgtctacgg cagcctgact 540

gattcttatg cttacatgag aaatggttgg gacgttgaag tcaccgcagt gggaaatcag 600

ttcaacggag gatgcctgtt ggtagccatg gtgccagaac tctgttctat taacaaaaga 660

gagctgtacc agctcacgct ctttccccac caattcatca acccccggac gaacatgacg 720

gcacacatca ccgtgccctt tgtcggcgtt aatcgctacg accagtacaa ggtacacaaa 780

ccttggaccc tcgtggtcat ggtcgtggcc ccgctgactg tcaacactga aggtgctcca 840

cagatcaagg tttatgccaa catcgcccct accaacgtgc acgtcgcggg tgagttccct 900

tccaaggaag ggatcttccc cgtggcatgt agtgacggtt acggcggtct tgtgaccact 960

gacccaaaga cggctgaccc cgcctacggg aaagttttca accccccccg caacatgttg 1020

ccagggcggt tcaccaactt ccttgatgtg gctgaggcgt gtcctacgtt tctgcacttt 1080

gagggtgacg tgccatacgt gaccacaaag acggactcgg acaggattct tgctcagttt 1140

gacttgtctt tggcagcgaa gcacatgtca aacacctttc tggcaggtct cgcccagtac 1200

tacacacagt acagcggcac catcaaccta cacttcatgt tcacaggacc cactgacgcg 1260

aaagcgcgtt acatgattgc atatgccccc cctggcatgg agccgcccaa aacacctgag 1320

gcagctgctc attgcattca tgcggagtgg gatactgggt tgaattcaaa attcacattc 1380

tcaatccctt acctttcggc ggctgactac gcgtataccg cgtctgatac tgctgagacc 1440

acaaatgtac agggatgggt ttgcctgttt caaatcacac acgggaaggc cgatggtgac 1500

gcacttgtcg ttctggctag cgccggtaag gacttcgagc tgcggttgcc agttgacgct 1560

cgcacgcaga ccacttctgc aggtgagtca gctgaccccg tgactgccac tgttgagaac 1620

tacggtggcg agacacaggt ccagagacgc cagcacacgg atgtctcgtt tatattggac 1680

agatttgtga aagtgacacc aaaagaccaa attaatgtgt tggacctgat gcaaaccccc 1740

gcccacactt tggtaggcgc gctcctccgc accgccacct actacttcgc agatctagag 1800

gtggcagtga aacacgaggg gaaccttacc tgggtcccga atggggcgcc cgagacagcg 1860

ttggataaca ccactaatcc aacggcttac cacaaagcac cgctcacccg acttgcactg 1920

ccttacacgg caccgcaccg tgtcttggct accgcgtaca acgggaactg caagtatggc 1980

gagagccaca caaccaatgt gagaggtgac ctgcaagtgt tggctcagaa ggcggcgaga 2040

acgttgccta cttcctttaa ctacggtgcc atcaaagcta cccgggtgac cgagttgctt 2100

taccgcatga agagggctga aacatactgc ccccggcctc ttttggctat tcacccgagc 2160

gaagcaagac acaaacagaa gatagtggca cctgtgaagc agcttttg 2208

<210> 8

<211> 2208

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcgccgggc aatccagccc gacgaccggg tcacagaacc aatcaggcaa cactggaagc 60

atcattaaca actactacat gcagcaatac cagaactcca tggacacaca gcttggtgac 120

aacgccatta gcggaggctc caacgagggt tctacggata ccacctccac ccacacgaac 180

aacacccaga acaacgactg gttttcaaaa ctggccaact ccgctctcag cggtctcttc 240

ggtgctcttc tcgccgacaa aaagacagag gaaactaccc tcctcgagga ccgcattctc 300

accacccgca acggacacac gacctcgaca acccagtcga gcgtcggggt gacgtacggg 360

tatgcaacag ctgaggactt cgtgagcggg cccaacacct ctggtcttga gaccagggtt 420

gtccaggccg aacggttctt caaaacccac ttgttcgact gggtcaccag tgacccgttt 480

ggacggtgcc acatgttgga gctcccgact gaccacaaag gcgtctacgg cagcctaacc 540

gactcgtacg cgtatatgag gaacggttgg gacgttgaag tcaccgcggt gggaaaccag 600

ttcaacggag gctgcttgtt ggtggcaatg gtaccagagc tttgttccat caacaagaga 660

gagctgtacc agctcacact tttcccccac cagttcatta acccacggac gaacatgacg 720

gcacacatca ctgtgcccta cgttggcgtc aacaggtacg accaatacaa ggtgcataaa 780

ccctggaccc ttgttgtcat ggtcgtggcc cccttgacgg tcaacaatga gggtgctccg 840

caaatcaagg tgtatgccaa catcgccccc accaacgttt acgttgcggg tgaattccct 900

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ccagggcggt ttacaaacct ccttgatgtg gccgaggcgt gtcccacgtt cctacacttc 1080

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tacggtggtg agacacaggt ccagagacgc cagcacacgg atatctcgtt tatactagac 1680

agatttgtga aagtcacacc aaaagaccaa atcaatgtgc tggacctgat gcagatccct 1740

gcccacactt tagtaggggc cctcctgcgg acggccacct actacttctc cgacttggag 1800

ttggctgtca aacacaaggg tgatctcacc tgggttccga acggggcccc tgagacagct 1860

ttggacaaca ccaccaaccc aacagcttac cacaaagcac cactcacgcg actggccttg 1920

ccttacacgg ccccacaccg cgtcttagcg accgtctaca acggaagttg taagtacagt 1980

ggcgcccgcg tgagcaacgt gaggggtgac cttcaagtgt tggctcagaa ggcagaaaga 2040

gctctgccca cctcctttaa ctatggtgcc attaaggcaa cccgggtgac tgagttactc 2100

taccgaatga agagagccga gacatactgc cccaggcccc ttcttgccat tcaaccgagt 2160

gacgctagac acaagcagaa gatcgtggca cccgcaaaac agcttctg 2208

<210> 9

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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20 25 30

Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn

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Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe

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100 105 110

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Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu

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Arg Phe Phe Lys Thr His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Ser Phe

145 150 155 160

Gly Arg Cys His Leu Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val Tyr

165 170 175

Gly Ser Leu Thr Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val

180 185 190

Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val

195 200 205

Ala Met Val Pro Glu Leu Cys Ser Ile Asn Lys Arg Glu Leu Tyr Gln

210 215 220

Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr

225 230 235 240

Ala His Ile Thr Val Pro Phe Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr

245 250 255

Lys Val His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu

260 265 270

Thr Val Asn Thr Glu Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile

275 280 285

Ala Pro Thr Asn Val His Val Ala Gly Glu Phe Pro Ser Lys Glu Gly

290 295 300

Ile Phe Pro Val Ala Cys Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr Thr

305 310 315 320

Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro Pro

325 330 335

Arg Asn Met Leu Pro Gly Arg Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val Ala Glu

340 345 350

Ala Cys Pro Thr Phe Leu His Phe Glu Gly Asp Val Pro Tyr Val Thr

355 360 365

Thr Lys Thr Asp Ser Asp Arg Ile Leu Ala Gln Phe Asp Leu Ser Leu

370 375 380

Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Phe Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr

385 390 395 400

Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr Gly

405 410 415

Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Ile Ala Tyr Ala Pro Pro Gly

420 425 430

Met Glu Pro Pro Lys Thr Pro Glu Ala Ala Ala His Cys Ile His Ala

435 440 445

Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr

450 455 460

Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu Thr

465 470 475 480

Thr Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Leu Phe Gln Ile Thr His Gly Lys

485 490 495

Ala Asp Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Ala Ser Ala Gly Lys Asp Phe

500 505 510

Glu Leu Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Thr Gln Thr Thr Ser Ala Gly

515 520 525

Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu

530 535 540

Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp

545 550 555 560

Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp Leu

565 570 575

Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala

580 585 590

Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn

595 600 605

Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp Asn Thr

610 615 620

Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu

625 630 635 640

Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Ala Tyr Asn Gly Asn

645 650 655

Cys Lys Tyr Gly Glu Ser His Thr Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln

660 665 670

Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr

675 680 685

Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys

690 695 700

Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Ser

705 710 715 720

Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu

725 730 735

<210> 10

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Thr Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn

20 25 30

Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn

35 40 45

Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Asn Thr Gln Asn

50 55 60

Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Asn Ser Ala Leu Ser Gly Leu Phe

65 70 75 80

Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu

85 90 95

Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln

100 105 110

Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val

115 120 125

Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu

130 135 140

Arg Phe Phe Lys Thr His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro Phe

145 150 155 160

Gly Arg Cys His Met Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val Tyr

165 170 175

Gly Ser Leu Thr Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val

180 185 190

Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val

195 200 205

Ala Met Val Pro Glu Leu Cys Ser Ile Asn Lys Arg Glu Leu Tyr Gln

210 215 220

Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr

225 230 235 240

Ala His Ile Thr Val Pro Tyr Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr

245 250 255

Lys Val His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu

260 265 270

Thr Val Asn Asn Glu Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile

275 280 285

Ala Pro Thr Asn Val Tyr Val Ala Gly Glu Phe Pro Ser Lys Glu Gly

290 295 300

Ile Phe Pro Val Ala Cys Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr Thr

305 310 315 320

Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Val Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro Pro

325 330 335

Arg Asn Leu Leu Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala Glu

340 345 350

Ala Cys Pro Thr Phe Leu His Phe Glu Gly Asp Val Pro Tyr Val Thr

355 360 365

Thr Lys Thr Asp Ser Asp Arg Val Leu Ala Gln Phe Asp Leu Ser Leu

370 375 380

Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Phe Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr

385 390 395 400

Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr Gly

405 410 415

Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Ile Ala Tyr Ala Pro Pro Gly

420 425 430

Met Glu Pro Pro Lys Thr Pro Glu Ala Ala Ala His Cys Ile His Ala

435 440 445

Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr

450 455 460

Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Val Ala Glu Thr

465 470 475 480

Thr Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Leu Phe Gln Ile Thr His Gly Lys

485 490 495

Ala Asp Gly Asp Ala Leu Ile Val Leu Ala Ser Ala Gly Lys Asp Phe

500 505 510

Asp Leu Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Thr Gln Thr Thr Ser Ala Gly

515 520 525

Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu

530 535 540

Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ile Ser Phe Ile Leu Asp

545 550 555 560

Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp Leu

565 570 575

Met Gln Ile Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala

580 585 590

Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Leu Ala Val Lys His Lys Gly Asp

595 600 605

Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp Asn Thr

610 615 620

Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu

625 630 635 640

Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Ser

645 650 655

Cys Lys Tyr Ser Gly Ala Arg Val Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln

660 665 670

Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr

675 680 685

Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys

690 695 700

Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile Gln Pro Ser

705 710 715 720

Asp Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu

725 730 735

Claims

1.一种口蹄疫O型PanAsia-2谱系储备疫苗毒株rHN/TUR09/VP1，其特征在于，以口蹄疫病毒O/HN/CHA/93为骨架，嵌合了口蹄疫疫苗株O/TUR/5/2009的VP1基因所得；

所述口蹄疫疫苗株O/TUR/5/2009的VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述口蹄疫O型PanAsia-2谱系储备疫苗毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以半长质粒pSK-Z123为骨架，人工合成含FMDV O/TUR/5/2009 VP1基因的重组质粒，记为重组质粒pSK-Z123/TUR09VP1；

2）将步骤1）中所述重组质粒pSK-Z123/TUR09VP1用Spe I/Bgl II酶切，将得到的5400bp的目标条带插入质粒pOFS中，得到重组质粒pOFS-TUR09/VP1；

3）将步骤2）中所述重组质粒pOFS-TUR09/VP1转染细胞，拯救病毒，得到rHN/TUR09/VP1；

步骤1）中FMDV O/TUR/5/2009 VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤2）中Spe I/Bgl II双酶切的体系如下：

10× Buffer H 10 μL、BglⅡ4 μL、Spe Ⅰ4 μL、质粒 4 μg、ddH₂O补充至100 μL；

酶切条件为在37 ℃条件下孵育1h~2 h。

4.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤3）中在所述转染细胞前，对所述重组质粒pOFS-TUR09/VP1进行鉴定。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述鉴定的方法采用Bgl II和Not I酶对所述重组质粒pOFS-TUR09/VP1进行酶切，酶切出8400bp和3000bp两个条带，说明重组质粒pOFS-TUR09/VP1包含了FMDV O/TUR/5/2009毒株的VP1基因。

6.权利要求1所述口蹄疫O型PanAsia-2谱系储备疫苗毒株rHN/TUR09/VP1或权利要求2~5中任意一项所述构建方法构建得到的O型口蹄疫病毒株rHN/TUR09/VP1在制备口蹄疫O型PanAsia-2谱系储备疫苗中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述口蹄疫O型PanAsia-2系储备疫苗的防控对象为PanAsia谱系、Ind-2001谱系、Mya98谱系和Cathay谱系病毒株。

8.一种口蹄疫O型PanAsia-2谱系储备疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述口蹄疫O型PanAsia-2谱系储备疫苗毒株rHN/TUR09/VP1或权利要求2~5中任意一项所述构建方法构建得到的O型口蹄疫病毒株rHN/TUR09/VP1。