KR20150014015A - 구제역 o형 팬아시아-2 유전형의 방어항원이 발현되는 재조합 바이러스 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 구제역 O형 PanAsia-2 유전형 계열 바이러스의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법을 제공한다.

Description

구제역 O형 팬아시아-2 유전형의 방어항원이 발현되는 재조합 바이러스 및 그의 제조방법{Foot-and-mouth disease virus expressing P1-protective antigen of O-PanAsia-2 strain and the manufacturing methods}

본 발명은 구제역 O형의 ME-SA (Middle East-South Asia, 중동-남아시아) 지역형중 팬이시아-2(PanAsia-2) 유전형 계통 바이러스의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 구제역 O형 PanAsia-2 유전형 계열 바이러스의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

구제역(Foot-and-mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 국가간 전파가 가능한 매우 중요한 동물질병으로 분류되어 있으며, 이러한 특성 때문에 축산물의 국가간 교역에 있어 발생유무는 가장 중요한 점검요소로 작용하고 있다.

상기 구제역 병원체는 단일가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과, 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다.

구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus) O형 중에서도 약 8가지 이상의 여러 지역형이 있다. 엄격하게 개발한다면 이러한 지역형에 대한 백신을 모두 개발하여 백신주로 사용하여야 하지만, 모든 백신주 개발을 위해서는 야외주를 지속적으로 세포에 배양하여 적절한 증식력을 지녀야 한다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되고 결과가 좋으리라는 보장도 없다.

또한, 구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus)는 대부분 동물에 병원성을 나타내는 병원체이다. 여러번의 계대 등 여러 연구자들의 시도에서도 병원성이 유지되기 때문에 현재까지 구제역바이러스에 대한 병원성이 줄어든 약독화 백신으로 사용되는 것은 국제적으로는 금기시된 일이다.

구제역에 대해 약독화 바이러스를 사용하는 것은 병원성의 회복에 대한 문제점을 안고 있으며 또한 생독백신을 사용하면 야외 감염된 구제역 바이러스와 구분이 어려운 단점이 있어 구제역 발생시 효과적으로 접종하여 방역하는 체계를 구축하기 어렵다.

따라서, 기존의 백신 바이러스를 이용하여 필요로 하는 백신주를 신속하게 개발하여 사용할 수 있도록 적절한 시기에 제작 가능한 형태로 만들어져야 할 것이다.

O 혈청형은 서로 다른 특성을 지닌 8개의 지역형이 존재한다. 현장에서 사용되도록 개발한다면 이러한 지역형 또는 유전형 등에 대한 백신을 모두 개발하여 백신 주로 사용하여야 하고 모든 백신주 개발을 위해서는 야외주를 지속적으로 세포에 배양하여 적절한 증식력을 지녀야 한다. 그러나 이러한 방법은 시간이 많이 소요되고 결과가 좋으리라는 보장도 없다. 따라서 기존의 백신 바이러스를 이용하여 필요로 하는 백신주를 신속하게 개발하여 사용할 수 있도록 적절한 시기에 제작 가능한 형태로 만들어져야 할 것이다.

구제역 바이러스 O형 Manisa 주는 O형 백신에서 가장 널리 쓰이는 백신 바이러스로 알려져 있고, ME-SA (Middle East-South Asia, 중동-남아시아형, PanAsia 지역형을 포함) 바이러스에 대한 방어가 가능하다.

O형의 ME-SA 지역형 중에서도 최근에는 PanAsia 계열의 바이러스와 서로 방어가 어려운 PanAsia-2 계통의 바이러스가 분리되었고, 상기 PanAsia-2 계통의 바이러스는 최근 중동지역에서 많이 발생하여 유행되고 있는 구제역 바이러스로서, 상기 계통형에 알맞은 백신 개발이 필요한 실정이다.

본 발명자들은 O형 ME-SA 지역형 PanAsia-2 계통에 대해 적절하게 방어하기 위하여 구제역 바이러스 O manisa 백신주의 유전자 전체 게놈을 플라스미드에 클로닝한 바이러스 벡터를 기초로 PanAsia-2 바이러스에 대해 방어할 수 있는 방어 단백질을 발현하는 새로운 재조합 구제역 바이러스를 제공할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 PanAsia-2 바이러스에 구제역 바이러스의 P1 유전자가 삽입됨으로써, 중동지역에 널리 유행하고 있는 구제역 O형 PanAsia-2형 에 대한 방어능에 대해 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 재조합 구제역 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 아시아(중동) 지역에 널리 유행하고 있는 구제역 O형 PanAsia-2형 에 대한 방어능을 구비하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 적어도 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버 GU384682의 염기서열을 갖는 구제역 O형 PanAsia-2 주의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계,(2) 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드의 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 GU384682의 염기서열을 갖는 구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하는 단계, 및 (3) 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 구제역 바이러스 O Manisa의 유전자 일부를 조작하여 동물에 병원성을 약화시킴으로써, 소독제 실험 또는 항바이러스 실험 등 실험실 내에서 다루기에 병원성 바이러스보다 더욱 안전하게 사용할 수 있는 장점을 지니고 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 바이러스 역가가 원래의 바이러스와 크게 차이를 보이지 않으면서, 중동지역에 발생되는 바이러스를 효과적으로 방어할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pO-Manisa)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 구제역 O PanAsia-2형의 방어 항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 구제역 O형 PanAsia-2형의 방어 항원 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드(pOm-PanAs2-P1)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 구제역 O형 PanAsia-2형의 방어 단백질 유전자가 삽입된 플라스미드로부터 회복된 바이러스의 소 신장세포 (LF-BK)에서 플라크가 형성된 사진이다.
도 5는 간이 항원 킷트를 이용하여 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스에서 발현된 단백질이 구제역 항원 양성 반응을 보임을 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스가 어린 햄스터 신장세포(BHK21), 흑염소 신장세포 (BGK), 돼지 신장세포(IBRS-2), 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 소 신장세포(LF-BK)에서 자라서 바이러스 역가를 형성함을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 적어도 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3, VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버(GenBank Accession No.) GU384682의 염기서열을 갖는 구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3, VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스에 관한 것이다.

상기 PanAsia-2주(O/PAK/44/2008)는 파키스탄에서 2008년에 소에서 발생한 바이러스로서, 진뱅크 억세션 넘버 GU384682의 염기서열을 갖는다.

본 발명은 O1 manisa 백신 바이러스의 유전자 전체게놈을 플라스미드에 클로닝한 바이러스 벡터를 기초로 ME-SA 지역형 PanAsia-2에 대한 구조단백질 유전자를 삽입하였으며, 상기 단백질을 전체 유전자가 삽입된 벡터 내에서 구조단백질만을 교체·삽입시켜 O ME-SA지역형의 PanAsia-2 유전형 계열 바이러스를 방어할 수 있는 방어 단백질을 발현하는 새로운 재조합 바이러스를 제작한 것이다.

본 발명의 상기 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 (1) 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계, (2) 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드의 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 GU384682의 염기서열을 갖는 구제역 O형 표준 백신주의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하는 단계, 및 (3) 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에 관한 것이다.

상기에서 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계는 통상적으로 유전자를 플라스미드에 삽입하는 방법을 이용할 수 있으면 족하므로, 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

본 발명의 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하는 상기 (3) 단계에서의 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 어린 햄스터 신장 세포(BHK21) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 포함하는 구제역 예방용 백신에 관한 것이다.

본 발명의 상기 백신은 약독 생백신이거나 불활화된 백신일 수 있고, 상기 백신을 제조하는 방법은 통상적인 백신의 제조방법을 이용할 수 있으면 족하므로, 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

이하 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재조합 플라스미드 pO-Manisa의 제작

구제역 O-Manisa 바이러스 전체 유전자(GenBank Accession No. AY593823.1)를 PCR에 의하여 증폭하고, 플라스미드(pBluescript SK II)에 O-Manisa 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pO-Manisa를 제작하였다.

상기에서, PCR 증폭은 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

일반적으로 cDNA 합성시 사용되는 랜덤 프라이머를 이용하여 O-Manisa 바이러스에 대한 cDNA 작성후 이것을 이용하여 O-Manisa 바이러스 유전자 정보를 기초로 증폭이 가능한 특이 프라이머들(GenBank Accession No. AY593823.1를 기초로 5' 및 3' 유전자의 각 20 mers씩에 해당)를 작성하여 PCR을 실시하였으며, PCR를 위한 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), 퓨전엔자임(Phusion enzym; 2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25사이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

도 1은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pO-Manisa)의 모식도를 나타낸 것이다.

<실시예 2> P1 부위가 치환된 재조합 구제역 바이러스의 제조

상기 실시예 1에서 제작한 재조합 플라스미드(pO-Manisa) 중에서, 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자를 구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 항원인 P1 단백질(진뱅크 억세션 넘버 GU384682)을 코딩하는 유전자로 치환하여 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드(pO1m-PanAs2-P1)를 제작하였다.

상기 P1 단백질을 코딩하는 유전자는 다음과 같이 실시하여 치환시켰다.

서열번호 2의 정방향 프라이머(5'-GGCGCCGGGCAATCCAGCCC-3') 및 서열번호 3의 역방향 프라이머(5'-CTGTTTCACAGGTGCCACTATCTTTTG-3')를 이용하여, 구제역 O형 PanAsia-2주(GenBank Accession No. GU384682)의 P1 유전자를 PCR에 의하여 증폭시켰다.

이때, 상기 PCR 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10ul), 10mM dNTPs (1ul), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 60초간 25사이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

서열번호 4의 정방향 프라이머(5'-CTTCTAAATTTTGACCTGCTCAAATTGGCG-3') 및 서열번호 5의 역방향 프라이머(5'-CTTGAGCCTTTTCTGGACCTTTGTTTTCCA-3')를 이용하여, Omanisa 유전자에서 P1 유전자가 제거된 벡터를 PCR에 의하여 증폭시켰다.

이때, 상기 PCR 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균 증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25사이클, 최종 72℃ 10분으로 반응시켰다.

그 후, 증폭된 P1 유전자와의 결찰반응 (TAKARA Long Ligation kit)을 수행하였으며, 최종적으로 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝(pO1m-PanAs2-P1)된 것을 확인하였다.

재조합 구제역 바이러스의 회복은 확보된 상기 재조합 플라스미드(pO1m-PanAs2-P1)를 제한효소로 반응시킨 뒤, BHKT7-9 세포(T7 RNA 폴리머라제가 발현되는 세포주)에서 바이러스를 확보한 후, ZZ-R(염소 태아 혀) 세포 및 BHK21(어린 햄스터 신장) 세포에서 증식시키고, BHK21 세포 및 IBRS-2(돼지 신장) 세포에서 세포 변성 효과를 확인하였다.

도 2는 구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도로서, pO1m-PanAs2-P1은 구제역 바이러스 O형 Manisa 전체 유전자에서 방어 항원 P1 부위가 구제역 O형 PanAsia-2주(O/PAK/44/2008)의 P1 부위로 치환된 모식도를 나타낸 것이다.

도 3은 구제역 구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 단백질 유전자가 삽입된 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.

도 4는 구제역 O형 PanAsia-2형의 방어 단백질 유전자가 삽입된 플라스미드로부터 회복된 바이러스의 소 신장세포 (LF-BK)에서 플라크가 형성된 사진이다.

도 5는 간이 항원 킷트를 이용하여 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스에서 발현된 단백질이 구제역 항원 양성 반응을 보임을 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스가 어린 햄스터 신장세포(BHK21), 흑염소 신장세포 (BGK), 돼지 신장세포(IBRS-2), 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 소 신장세포(LF-BK)에서 자라서 바이러스 역가를 형성함을 보여주는 그래프이다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 항원 발현능을 보유하는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 이용한 구제역 백신을 제공함으로써, 구제역의 치료 및/또는 예방에 기여할 수 있다.

<110> Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency <120> Foot-and-mouth disease virus expressing P1-protective antigen of O-PanAsia-2 strain and the manufacturing methods <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11097 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pO1m-PanAs2-P1 <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt 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tacaaggtac acaagccttg gaccctcgtg gtcatggtcg tggccccgct gactgtcaac 3180 actgaaggtg ctccacagat caaggtttat gccaacatcg cccctaccaa cgtgcacgtc 3240 gcgggtgagt tcccttccaa ggaagggatc ttccccgtgg catgtagcga cggttatggc 3300 ggtcttgtga ccactgaccc aaagacggct gaccccgcct acgggaaagt tttcaatccc 3360 cctcgcaaca tgttgccagg gcggttcacc aacttccttg acgtggctga ggcgtgccct 3420 acgtttctgc actttgaggg tgacgtgcca tacgtgacca caaagacgga ttcggacagg 3480 gttcttgctc agtttgactt gtctttggca gcgaagcaca tgtcgaacac ctttctggca 3540 ggtctcgccc agtactacac acagtacagc ggcaccatca acctgcactt catgttcaca 3600 gggcccactg acgcgaaagc gcgttacatg attgcatacg ccccccctgg catggaaccg 3660 cccagaacac ctgaggcggc cgctcactgc attcatgcgg agtgggacac tgggttgaat 3720 tcaaaattca cattttcaat cccttacctt tcggcggctg actacgcgta caccgcgtct 3780 gacactgctg agaccacaaa tgtacaggga tgggtttgcc tgtttcagat cacacacggg 3840 aaggctgacg gtgacgcact tgtcgttctg gctagcgccg gtaaggactt cgagctgcgg 3900 ttgccagttg acgctcgcac gcagaccacc tccacaggtg agtcagctga ccccgtgact 3960 gccactgttg agaactacgg tggcgagacg caggtccaga gacgccagca cacggacgtc 4020 tcgttcatac tggacagatt tgtgaaagtg acaccaaaag accaaattaa tgtgttggac 4080 ctgatgcaga cccccgccca cactttggta ggtgcgcttc tccgcaccgc cacctactac 4140 ttcgcagacc tagaggtggc agtgaaacac gaggggaacc ttacctgggt cccgaatggg 4200 gcgcccgaga cagcgttgga taacaccacc aatccaacgg cttaccacaa ggcacctctc 4260 acccggcttg cgctgcctta cacggcacca caccgtgtct tggctactgt ttacaacggg 4320 aactgcaagt atggcgagag ctccacaacc aacgtgagag gtgacctgca agtgttggcc 4380 cagaaagcgg cgagagcgct gcctacctcc tttaactacg gtgccattaa ggccactcgg 4440 gtgactgaac tgctttaccg catgaagagg gctgaaacat actgcccccg gcctcttttg 4500 gctattcacc cgagcgaagc aagacacaaa caaaagatag tggcacctgt gaaacagctt 4560 ctaaattttg acctgctcaa attggcggga gatgtggagt ccaaccctgg gcccttcttc 4620 ttctccgacg tcaggtcaaa tttctcaaaa ctggtagaaa ccatcaatca gatgcaggag 4680 gacatgtcaa caaaacacgg gcctgacttt aaccggttgg tgtccgcatt tgaggaattg 4740 gccactggag tgaaggctat cagggccggt ctcgacgagg ccaaaccctg gtacaaactc 4800 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cttgaggaca aaggcaagcc tttcaacagc aaagtcatca ttgctaccac caacctgtac 5700 tcgggtttca ccccgagaac aatggtgtgt cctgacgcgc tgaaccggag gttccacttt 5760 gacatcgacg tgagtgccaa ggacgggtac aaagttaaca acaaattgga cataatcaaa 5820 gctcttgaag acacccacac caacccagtg gcgatgttcc aatacgactg tgcccttcta 5880 aacggtatgg cagttgaaat gaagagaatg caacaggata tgttcaagcc tcaaccaccc 5940 ctccagaacg tgtaccaact cgttcacgag gtgattgaac gggtcgagct ccacgagaag 6000 gtgtcgagcc acccgatttt caaacagata tcaattcctt cccaaaagtc tgtgttgtac 6060 ttcctcattg agaaaggcca acacgaagca gcaattgaat tctttgaggg aatggtgcat 6120 gactccatca aggaagagct ccggcccctc atccaacaga cctcatttgt gaaacgcgct 6180 tttaagcgcc tgaaggaaaa ctttgagact gttgccctgt gtttgactct tttggcaaac 6240 atagtgatca tgatccgcga gactcgcaag agacaacaga tggtggacga tgcagtgaat 6300 gactacattg agaaggcaaa catcaccaca gatgacaaga ctcttgacga ggcggaaaag 6360 aaccctctag agaccagcgg tgccagcact attggtttca gagagagaac tctcccgggg 6420 cacaaggcga gcgatgacgt gagctccgag cccgccaaac ccgtggagga ccgaccacaa 6480 gctgaagggc cctacgccgg accacttgag cgtcagaaac ctctgagagt gaaaaccaag 6540 ttgccacaac aggagggacc ctacgctggc ccgatggata gacagaaacc gttgaaagtg 6600 agagcaagag ccccggtcgt gaaggaggga ccctacgagg gaccggtgaa gaagcctgtc 6660 gctttgaaag tgaaagccaa gaacttgatt gtcactgaga gtggtgcccc accgaccgac 6720 ttgcagaaga tggtcatggg caacactaag cctgttgagc tcatcctcga cgggaagacg 6780 gtagccatct gctgtgctac cggagtgttt ggcactgcct acctcgtacc tcgtcacctc 6840 ttcgcggaga agtacgacaa gataatgttg gacggtagag ccatgacaga cagtgactac 6900 agagtgtttg agtttgagat taaagtaaaa ggacaggaca tgctctcaga cgctgcactc 6960 atggtgcttc accgtgggaa ccgcgtgaga gacatcacga aacattttcg tgacacagca 7020 agaatgaaga aaggcacccc cgttgtcggt gtgatcaaca acgccgacgt tgggagactg 7080 attttctctg gagaggccct tacctacaaa gacattgtag tgtgcatgga tggagacacc 7140 atgccgggcc tgtttgccta cagagccgcc accaaggctg gttactgcgg gggagccgtt 7200 ctcgccaagg acggagccga cacattcatc gttggcaccc actccgcagg tggtaacgga 7260 gttggatact gctcgtgcgt gtccaggtcc atgctcctga aaatgaaggc acacattgac 7320 cctgaaccac accacgaggg gttgattgtt gataccagag atgtggaaga gcgcgtgcat 7380 gtcatgcgta aaaccaagct tgcacccacc gtggcacacg gtgtgtttaa ccctgaattt 7440 ggtcccgctg ccttgtccaa caaggacccg cggctgaacg aaggggttgt cctcgatgaa 7500 gtcatcttct ccaaacacaa gggagacacg aaaatgtctg aggaggacaa agcgctgttc 7560 cgccgctgcg ctgccgacta cgcgtcgcac ttgcacagcg tgctggggac ggcaaatgcc 7620 ccattgagca tctatgaggc catcaaaggc gtcgacgggc tcgatgccat ggagccggac 7680 accgcgcccg gcctcccctg ggccctccag gggaaacgcc gtggtgcgtt gattgacttc 7740 gagaacggca cggtcggacc cgaagtcgag gctgccctaa agctcatgga gaaaagagag 7800 tacaaatttg cttgccagac cttcctgaaa gacgagattc gtccgatgga aaaagtacgt 7860 gctggcaaga ctcgcattgt cgacgttttg cccgtggaac acattcttta caccaggatg 7920 atgattggca gattctgtgc tcaaatgcac acaaacaatg gaccgcagat tggctcagcg 7980 gtcggttgca atcctgatgt tgattggcaa agatttggca cacattttgc tcagtacaga 8040 aacgtgtggg atgtggacta ttcggccttt gatgctaacc actgcagtga cgcaatgaac 8100 atcatgtttg aggaggtatt tcgcacagac ttcggtttcc acccaaatgc tgagtggatt 8160 ctgaagactc ttgtgaacac ggagcacgcc tatgagaaca aacgtatcac tgttgagggc 8220 gggatgccgt ctggctgttc cgcgacaagc atcatcaaca caattttgaa caacatttat 8280 gtgctctacg ctcttcgtag acactatgag ggagttgagc tggacaccta caccatgatc 8340 tcctacggag atgacatcgt ggttgcaagt gactacgatc tggattttga ggctctcaaa 8400 ccccacttca aatctcttgg tcaaaccatc actccagctg acaaaagcga caaaggtttt 8460 gttcttggtc actccattac cgatgtcact ttcctcaaaa gacacttcca catggactat 8520 ggaactgggt tttacaaacc tgtgatggcc tcaaagaccc tcgaggccat tctctccttt 8580 gcacgccgtg ggaccataca ggagaagttg atctccgtgg caggactcgc cgtccactca 8640 ggacctgacg agtaccggcg tctctttgag cccttccagg gtctcttcga gattccaagc 8700 tacagatcac tttacctgcg ttgggtgaac gccgtgtgcg gtgacgcata atccctcaga 8760 tgtcacaatt ggcagaaaga ctctgaggcg agcgacgccg taggagtgaa aagcccgaaa 8820 gggcttttcc cgcttcctat tccaaaaaaa aaaaaaaaaa actagttcta gagcggccgc 8880 caccgcggtg gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg cgcttggcgt 8940 aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 9000 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gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 9900 gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 9960 cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 10020 caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 10080 gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 10140 cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 10200 cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 10260 caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 10320 gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 10380 gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 10440 cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 10500 catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 10560 gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 10620 ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 10680 gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 10740 cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 10800 tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 10860 gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 10920 atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 10980 ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 11040 gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccac 11097 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 ggcgccgggc aatccagccc 20 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 ctgtttcaca ggtgccacta tcttttg 27 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 4 cttctaaatt ttgacctgct caaattggcg 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 5 cttgagcctt ttctggacct ttgttttcca 30

Claims (9)

1. 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 적어도 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버 GU384682의 염기서열을 갖는 구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스.
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
5. (1). 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계;
   (2). 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드의 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 GU384682의 염기서열을 갖는 구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 항원으로서 VP1, VP2, VP3 및 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하는 단계; 및
   (3). 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 어린 햄스터 신장 세포(BHK21) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 O형 PanAsia-2주의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 재조합 구제역 바이러스를 포함하는 구제역 예방용 백신.

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