CN101525629A - 人α防御素5活性肽的基因工程制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人α防御素5活性肽的基因工程制备方法。本发明公开了含人α－防御素5活性肽基因的表达载体构建及其转化酵母克隆株的筛选、高密度发酵的方法和从发酵上清中分离纯化活性多肽的方法。本发明还公开了由上述方法获得的人α防御素5活性肽在多肽药物制备中的应用。本发明适用于工业化生产规模中经过简单的操作实现高效发酵表达和低成本、高效率地纯化制备具有高效杀灭多种病原细菌和抗HPV等病毒的人α防御素5活性肽。

Description

人α防御素5活性肽的基因工程制备方法

技术领域

本发明属于生物工程制药领域，具体涉及一种具有杀灭细菌和抗病毒生物活性多肽-人α防御素5活性肽的基因工程制备方法。

背景技术

当前细菌和病毒感染仍然是人类生命和健康的主要威胁。自上世纪早期青霉素和磺胺药问世以来，人类已发明了近百种主要以干扰细菌的核酸或蛋白质的代谢与合成或抑制细菌胞壁合成的机理达到抗细菌目的的抗菌素，然而由于这些传统抗生素的作用机制容易诱导细菌发生突变而产生耐药性。临床实践中已发现针对传统抗生素的多种耐药菌株，使得人类再次面临致病细菌的挑战。因此，人们一直在努力寻求与开发新型的抗菌素。另一方面，自从首例艾滋病病例的出现以来，又有SARS病毒、流感病毒、肝炎病毒、登革热病毒等病毒所致疾病的暴发与流行，使得人类的生命时常面临危机。由于病毒的基因很容易发生突变，病毒所致的损伤往往有宿主免疫系统的功能失误参与，至今人们尚未寻找到可长期使用且具有特效抗病毒的药物。因此除应用目前通过抑制病毒核酸或蛋白酶，或利用免疫因子杀伤病毒，或利用病毒疫苗免疫人体等机理生产的药物外，还必须寻找其他更为高效低毒的抗病毒药物。

经过近二十年的研究，发现在植物、昆虫和包括人在内的高等动物机体内存在近千种内源性阳离子肽------防御素(Defensin)(Shalin Seebah et al，Nucleic Acids Research，2007，35：262-268)。具有活性的防御素分子一般为3-6kD的非糖基化多肽，多数分子内存在6～8个保守半胱氨酸残基形成的3～4对链内二硫键外，还富含精氨酸、脯氨酸等特殊残基，整个分子在中性溶液中带正电荷；晶体衍射揭示防御素分子具有α螺旋、β折叠、二硫键桥、无规卷曲等单种或多种二级结构所形成的单体或多聚体空间结构。根据二硫键等结构的组成方式，防御素被分为α、β和θ等类型。研究已证实，有805种防御素具有快速、强效地杀灭多种细菌的活性；有261种防御素具有抗白色念珠菌等真菌和螺旋体的作用；有48种防御素具有抗HIV、HPV和或HSV等病毒的效果；有54种防御素可产生抗癌细胞的生物效应。此外，防御素作为机体免疫系统的重要组成部分，参与了免疫调节等多种生物学功能。研究显示防御素的抗微生物活性与其结构相关，通过其所具有的净电荷、疏水性与亲水性、空间构象与极向角等因素构成的特征性机理杀伤细菌(Michiael R.et al，Pharmacol Rev，2003，55：27-55)，因此防御素直接扰乱细菌胞膜的结构进而破坏胞膜的通透性和细胞能量状态，导致细胞膜去极化、呼吸作用受抑制，以及细胞ATP含量下降，最终致靶细菌死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒衣壳中的靶分子结合而导致病毒失去感染宿主细胞的生物活性(E Hazrati et al，J Immunol，2006，177：8659-8666)。由于这些特殊的作用机理，使防御素具备两个特点：一是抗微生物谱广，二是靶微生物难以对其产生抗性突变。因此，生物学家认为防御素可能成为一种新型的抗生素，在作为抗感染制剂、食品防腐剂等方面具有广阔的应用前景。

迄今为止，相继发现了6种人α-防御素(HNP1-4，HD5，HD6)和6种人β-防御素(HBD1-6)。人α防御素5活性肽是分子量为3.58KD的阳离子短肽，含保守的6个半胱氨酸残基，构成3个分子内二硫键，形成由3条稳定的β-折叠片构成的两歧性分子。研究发现，HD5除在人肠道潘氏细胞中大量分泌表达外；在生殖道上皮细胞、鼻粘膜和部分正常支气管粘膜等细胞中存在固有表达，还可因炎症、感染和细胞恶性转变等因素的刺激而表达、分泌上调。研究表明，化学合成、从粘膜组织中提取和转基因小鼠表达的HD5不仅具有高效而广谱的抑菌和参与免疫保护调节的活性，而且具有阻止HIV、HSV等病毒粘附进入细胞和抑制病毒颗粒复制的抗病毒作用(N.H.Salzman et al，Nature，2003，422：522-526；Bryan Ericksen et al，Antimicrobial Agent andChemotherapy，2005：269-275；C.B.Buck et al，Proc Natl Acad Sci，2006，103：1516-1521)。由此可见，HD5在消化道、生殖道等粘膜内源性感染预防和免疫保护调节中发挥着重要作用。另一方面，HD5是机体与病原微生物相互作用过程的进化产物，其具有特异识别与杀伤病原微生物的活性，理论上对人体不会产生免疫抗体等毒副效应，因此HD5是具有良好开发前景的新型抗病原微生物的药物候选分子。

科学家们发现并证实了人α防御素及其生物活性，并进一步地认识了HIV、HPV等病毒和细菌感染的发病机制(Zhang et al，Science，2002，298：995)，为传染病的防治提供了新的思路。但要将防御素真正应用于艾滋病等感染性疾病的治疗和预防，尚有很多工作要做。从人体内提纯的天然α防御素5具有很强的抗菌活性，但提取材料稀缺，成本极昂贵。化学合成法可方便地获得高纯度的人α防御素5活性肽，但合成产品仅呈线性需经过低效率的复性后才具有活性，故成本很高，且产量较低。因此，通过基因和蛋白质工程技术来改善生产效率和产物活性，已成为防御素研究和应用的关键。

国外有数家制药公司在进行防御素的开发研究，但现有公开的文献表明因防御素分子太小、含特殊氨基酸较多及具有抗微生物活性等原因，目前制约防御素产品走上市场的主要瓶颈依然是尚未建立成本低廉、高效稳定的制备工艺。

毕赤酵母表达系统是近年来兴起的一种真核高效表达系统，具备独特的优点：菌体自身分泌蛋白较少，外源目的基因通过整合进入酵母细胞基因组中，结构比较稳定，特别是可对表达的外源蛋白进行翻译后修饰和加工，如二硫键的形成、糖基化等，在表达外源基因方面应用越来越广泛，并且已经建立了操作简单的合适培养方法。研究者也尝试过用植物表达系统和酵母表达系统等真核细胞制备抗菌肽。李元广等成功地将兔α防御素基因导入小球藻并获得了有生物活性的NP1(专利申请号03142195.4，公开号cn1473846)。王兴权等利用毕赤酵母成功地实现了CecA-mag抗菌肽的分泌表达(王兴权等，微生物学报，2007，47：75-78)。基于毕赤酵母表达系统的优点和人α防御素5的生物活性需要空间结构(分子内3对二硫键稳定的β-折叠构象)的要求(E.de Leeuw et al，FEBSLett，2007，581：515-520)，理论上将采用特殊的技术构建人α防御素5重组表达载体并筛选出基因组中整合有高拷贝目的基因的酵母细胞转化克隆，进而建立起高效表达和纯化HD5活性肽的工艺，应该是一种理想的人防御素开发方向。

发明内容

本发明针对未见有利用酵母菌株生产人α防御素5活性肽的报道和现有技术重组制备小分子多肽的不足，提供一种适用于工业化生产规模的高效表达含天然N-端序列人α防御素5活性肽和低成本、高效率纯化制备活性多肽的方法，包括用于该方法的适宜DNA序列、重组表达载体及其构建方法、酵母菌的高密度发酵与目的基因的诱导表达、发酵上清中目的肽的分离纯化方法和工艺主要技术路线。

本发明所述的人α防御素5活性肽的制备方法，主要包括以下步骤：

1)目的基因的获取：克隆人α防御素5的cDNA编码序列，序列如SEQ IDNO：1所示；

2)将步骤1)所得目的基因插入穿梭质粒中，构建重组表达质粒；

3)将步骤2)所得重组表达质粒转化入酵母细胞中，筛选出基因组中整合有多拷贝目的基因的酵母克隆株；

4)高密度培养步骤3)所筛选的酵母克隆株，并用甲醇诱导目的基因的高效表达；

5)从步骤4)获得的发酵上清中分离纯化人α防御素5活性肽。

本发明的优选实施例中，步骤1)目的基因的获取还包括：设计合成寡核苷酸引物SEQ ID NO：7-9并克隆含SEQ ID NO：2所示序列的DNA。

本发明的优选实施例中，步骤1)所述克隆人α防御素5的cDNA编码序列时使用克隆引物，该克隆引物如SEQ ID NO：3-4所示。

本发明的优选实施例中，步骤2)所述穿梭质粒为pPIC9K。

本发明的优选实施例中，步骤2)中重组表达质粒为pPIC9K-HD5和/或pPIC9K-mHD5。

本发明的优选实施例中，步骤3)包括采用限制性内切酶SacI将步骤2)所得重组表达质粒酶切获得具有可发生多次单交换同源重组以致于多拷贝目的基因整合入酵母细胞基因组的游离AOX₁5’端的线型化重组表达质粒。

本发明的优选实施例中，步骤3)包括采用两次电击转化方法将线型化重组表达质粒转化入酵母细胞中，然后利用G418抗性表型和组氨酸合成能力与甲醇利用能力表型筛选获得基因组中整合有多拷贝目的基因的酵母克隆株，。

本发明的优选实施例中，步骤3)所述酵母为毕赤巴斯德酵母菌株GS115。

本发明的优选实施例中，步骤4)包括采用生物发酵罐高密度培养步骤3)所筛选的酵母克隆株，并用甲醇诱导目的基因的表达，采用高效液相色谱层析法连续监测目的肽的含量，以获得高效表达目的肽的发酵上清。

本发明的优选实施例中，步骤4)中采用生物发酵罐时，发酵温度控制在28～30℃，溶解氧含量控制在30％～40％之间，pH值控制在3.5～5.0。

本发明的优选实施例中，步骤5)包括采用捕获纯化、组分分离纯化和精纯化3个步骤从步骤4)所获发酵上清中分离纯化人α防御素5活性肽。

本发明的优选实施例中，捕获纯化步骤包括应用超速离心沉淀分离法、连续超滤更换缓冲溶液(脱盐)法和大孔树脂吸附层析(脱盐、除色素)法；组分分离步骤包括应用离子交换层析和疏水层析法；精纯化步骤包括应用反相层析和分子筛层析法。

本发明所克隆的HD5序列(SEQ ID NO：1)与NCBI基因库中DEFA5(GeneID 1670)同源。经生物信息学分析，发现HD5的活性肽碱基序列中含有多个毕赤酵母使用的稀有密码子(表1)，为提高目的基因在酵母细胞中的表达效率，经基因优化设计改造获得可翻译出正确人α防御素5活性肽的DNA序列mHD5(SEQ ID NO：2)。

人α防御素5基因(GeneID 1670)在粘膜细胞中先翻译成前原防御素5(preprodefensin 5，NP 066290.1)，再裂解、加工并分泌出胞外变成具有生物活性的活性肽(表1)。人体内防御素的这种生成方式是机体随环境变化而作出适应性反应的进化机制(D.Elphick et al，Am J Pathol，2008，172：702-713)

表1人α防御素5及其活性肽编码序列和活性肽氨基酸序列

种类      碱基序列                        氨基酸序列

人α防ATG AGG ACC ATC GCC ATC CTT GCT MRTIAILAAILLVALQA

御素5  GCC ATT CTC CTG GTG GCC CTG CAG

                                       QAESLQERADEATTQKQ

CDs    GCC CAG GCT GAG TCA CTC CAG GAA

                                       SGEDNQDLAISFAGNGL

       AGA GCT GAT GAG GCT ACA ACC CAG

                                       SALTRSGSQATATCYCR

       AAG CAG TCT GGG GAA GAC AAC CAG

                                       TGRCATRESLSGVCEIS

       GAC CTT GCT ATC TCC TTT GCA GGA

       AAT GGA CTC TCT GCT CTT AGA ACC GRLYRLCCR

       TCA GGT TCT CAG GCA AGA GCC ACC

       TGC TAT TGC CGA ACC GGC CGT TGT

       GCT ACC CGT GAG TCC CTC TCC GGG

       GTG TGT GAA ATC AGT GGC CGC CTC

       TAC AGA CTC TGC TGT CGC TGA

       GCC ACC TGC TAT TGC CGA ACC GGC A T C Y C R T G R C A T

人α防 CGT TGT GCT ACC CGT GAG TCC CTC R E S L S G V C E I S G

御素5  TCC GGG GTG TGT GAA ATC AGT GGC R L Y R L C C R

活性肽 CGC CTC TAC AGA CTC TGC TGT CGC

       TGA

注：划底线部分字符标识人α防御素5活性肽编码序列中的毕赤酵母使用稀有密码子。

为了提高目的基因在酵母细胞中的表达量，本发明选用可将多拷贝目的基因整合入宿主细胞基因组中的表达载体pPIC9K。另一方面，本发明选用具有很强分泌功能的酿酒酵母α因子(α-factor)作为目的基因的信号肽，以确保表达的目的肽成功地被分泌到培养基中，为其翻译后的正确修饰(空间结构形成)和分离纯化创造了条件。酿酒酵母分泌信号肽(α-factor)与HD5活性肽组成融合蛋白的优化编码子序列阅读框，其中α-factor DNA序列位于融合蛋白的N-端，HD5活性肽DNA序列位于融合蛋白的C-端，序列如SEQ ID NO：10所示；酿酒酵母分泌信号肽(α-factor)与HD5活性肽组成融合蛋白的氨基酸序列，其中α-factor位于融合蛋白的N-端，HD5活性肽位于融合蛋白的C-端(C-端含信号肽酶KEX2切割位点)，序列如SEQ ID NO：11所示；HD5的氨基酸序列如SEQ IDNO：12所示；HD5活性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。因此，本发明构建了2种优选表达载体pPIC9K-HD5(图1)和pPIC9K-mHD5(图2)。

基于体内人α防御素5活性肽是由潘氏细胞内胰蛋白酶裂解前原防御素5后分泌出具有活性的活性肽之机制(D.Ghosh et al，Nat Immunol，2002，3：583-590)，优选载体pPIC9K-HD5首先表达出具有94个氨基酸残基的蛋白，该蛋白因分子量约为10.0kDa有利于将其从发酵上清中分离纯化，然后应用价格低廉的胰蛋白商品酶切割出具有活性的活性肽，最后经阳离子交换层析即可获得高纯度的人α防御素5活性肽。

根据目前公认的密码子数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon)对靶基因进行分析，发现人α防御素5天然活性肽中含有13个毕赤酵母细胞使用频率小于8.2％的稀有密码子，比例高达40.6％。为确保目的基因在宿主细胞中成功地高效表达，本发明利用Leto vl.0软件对目的肽碱基进行了同义密码子替换的多次优化，获得了酵母细胞使用频率均大于13.7％的优化序列mHD5(SEQ IDNO：2)。优化序列中还含有包括TAA在内的双终止子，并配置了有利于翻译正常终止的侧翼序列，TAAG的序列格式将最大限度地防止不良终止效应的发生。针对现有公开文献中所用的技术只能表达含多个额外氨基酸的多肽之不足，本发明应用改进的Red/ET技术成功将mHD5序列重组入pPIC9K中被信号肽酶切割导肽位点的下游阅读框，构建可表达含天然N-端氨基酸序列的活性肽之表达载体pPIC9K-mHD5。因此，本发明的设计为高效表达具有强生物活性的目的肽奠定了首要基础。

针对游离质粒在甲基营养型酵母中不能存活，载体必须和宿主细胞基因组中的同源区发生重组整合后才能实现外源蛋白稳定表达的特点和现有公开文献中真核表达系统效率低的不足，本发明选用限制性内切酶Sac I切割重组表达载体，使之线型化后产生可发生多次单交换同源重组以致于多拷贝目的基因整合入宿主细胞基因组的游离AOX₁5’端。该种重组方式同时将His4基因带入宿主菌GS115(His^-，Mut⁺)的染色体中，有利于筛选出具有His⁺/Mut⁺表型和对G418高浓度抗性的阳性重组克隆。本发明应用改进的真核细胞电击转化法和采用“两次电击转化”策略(即重复电击一次)，确保了重组表达载体至少有两次同源重组的机会整合到宿主细胞基因组中，为确保获得高拷贝目的基因整合宿主细胞克隆和目的蛋白的高效表达奠定了良好基础。

本发明还提供了含目的基因(HD5和或mHD5)的酵母克隆在生物发酵罐中高密度发酵和利用甲醇诱导目的蛋白高效表达的方法。将冻存的种子工程菌复苏后传代扩增，再接种到生物发酵罐，应用溶解氧循环连动控制发酵罐的技术和发酵液中甲醇含量实时监测的方法，联合采用高效液相色谱层析法连续监测目的肽含量的策略，确保了获得高效表达目的肽的发酵上清。

本发明首次提供了用毕赤酵母菌重组表达、制备人α防御素5活性肽的方法。本发明具有如下优点：

(1)核苷酸序列的优异性。与人α防御素5活性肽的天然编码序列相比，本申请要求保护的碱基序列是经过生物信息学分析并进行大幅度修饰优化后获得的(改变了近80％的核苷酸序列，优化了终止密码子及侧翼序列)，具有更高的转录和翻译效率，更适合基因工程系统的表达。

(2)本申请中要求保护的重组质粒的构建、表达载体的转化与基因组中整合有多拷贝目的基因的工程酵母菌株克隆的筛选及其在生物发酵罐中的高密度发酵与目的肽的高效诱导表达体系，弥补了现有技术仅能低效表达N-端含多个额外氨基酸多肽之不足，实现了具有较强生物活性的人α防御素5活性肽的高效表达，具有新颖性和创造性。

(3)本发明提供的从酵母发酵上清中分离纯化多肽的方法，解决了已公开文献中所用技术不能消除色素和高盐离子强度的干扰纯化获得高纯度活性多肽的难题，实现了人α防御素5活性肽的大规模、低成本、高效率的纯化制备，可满足制药需求量的生产。

(4)本发明提供的技术产品为人源性活性多肽，应用于医学领域时比动物源性的防御素更安全，不易发生人体免疫应答反应等副作用，因此保证了更好的疾病预防和治疗效果。

本发明首次解决了利用真核细胞表达、制备具有较强生物活性人α防御素5活性肽的技术难题。通过毕赤酵母菌分泌性高效表达和创新的分离纯化工艺，为人α防御素5活性肽的生产提供了新途径，将在一定程度上解决该多肽来源不足的现状。本发明成果不仅可满足对人α防御素5的生化性质、结构与功能关系及其与疾病发生和作用机制的研究需要，还使人α防御素5的药用开发和规模化生产成为可能。新型抗微生物制剂的生产，将为目前临床中发生的针对传统抗生素之耐药菌株和突变病毒株感染所致疾病的预防和治疗提供新思路和新方法。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明。

附图说明

图1为pPIC9K-HD5重组表达质粒的构建示意图。

图2为pPIC9K-mHD5重组表达质粒的构建及其整合入酵母菌细胞基因组后的表达框示意图。

图3为人α防御素5活性肽在高密度发酵过程中诱导表达量的Tricine-SDS-PAGE分析结果。

图4为纯化制备的重组人α防御素5活性肽Tricine-SDS-PAGE分析结果。

图5为重组人α防御素5活性肽产品抑制HPV16感染HeLa细胞效果的分析结果。

具体实施方式

材料：

1.RNAiso Reagent(总RNA提取试剂)、One Step RNA PCR Kit(RT-PCR试剂盒)、Pyrobest^TM DNA Polymerase试剂盒(TaKara公司产品，中国大连)

2.pMD18-T载体克隆试剂盒、T4 DNA连接酶(TaKara公司产品，中国大连)

3.SnaB I、Not I、EcoR I、Sac I等内切酶(New England BioLabs公司产品，美国)

4.质粒载体pPIC9K、毕赤酵母菌株GS115(Invitrogen公司产品，美国)

5.Red/ET重组酶redγ/redβ/redα/redA质粒pSC101-BAD-gbaA、大肠杆菌HS996、p16L1-L2、pFWB质粒(Gene Bridges公司产品，德国)

6.大肠杆菌DH5α等其它实验用细菌株(本室保存)

7.HeLa细胞株、293FT细胞株(本室保存)

8.G418、卡那霉素、氨苄青霉素(Roche公司产品，德国)

9.SP Sepharose Fast Flow、CM Sepharose Fast Flow、Source 30 RPC、G10等层析介质(GE Healthcare Bio-Sciences公司产品，美国)

10.FINELINE PILOT 35层析柱(GE Healthcare Bio-Sciences公司产品，美国)

11.酵母提取物、胰蛋白胨、无氨基酸酵母氮源(Oxford公司产品，美国)

12.LB培养基

酵母提取物   5g

胰蛋白胨     10g

NaCl         10g

溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸气灭菌。

13.YPD液体培养基

酵母提取物   2g

胰蛋白胨     4g

溶于180ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml经滤器除菌后的20％的右旋糖和0.2ml浓度为100mg/ml氨苄青霉素。

14.BMGY液体培养基

酵母提取物          10g

胰蛋白胨            20g

无氨基酸酵母氮源    13.4g

甘油              10g

磷酸钾            26.63g

溶于1000ml双蒸水中高压灭菌，冷至室温后补加生物素至终浓度为4×10^-5/L，氨苄青霉素终浓度为100μg/ml，调节pH至6.0，4℃保存备用。

15.BMMY液体培养基

酵母提取物        10g

胰蛋白胨          20g

无氨基酸酵母氮源  13.4g

磷酸钾            26.63g

溶于950ml双蒸水中高压灭菌，冷至室温后补加甲醇12.66ml，补加生物素至终浓度为4×10^-5/L、氨苄青霉素终浓度为100μg/ml，调节pH至6.0，补双蒸水至1000ml。

16.磷酸盐缓冲液

NaCl              8g

KCl               0.2g

Na₂HPO₄           1.44g

KH₂PO₄            0.24g

溶于1000ml去离子水中，并用浓HCl调节pH值至7.4，高压蒸气灭菌。

16.发酵罐发酵培养基

基础盐培养基配方                    微量盐PTM₁配方

实施例1人α防御素5基因(HD5)的克隆

从普通肠炎患者回肠粘膜样本中(本实施例样本来自中国人民解放军第三军医大学第一附属医院)通过RT-PCR方法获得HD5基因的cDNA序列，扩增所用的PCR上、下游引物分别为HD-sense01和HD-antisense01。引物的碱基序列如下(依次为SEQ ID NO：3-4)：

HD-sense01：5’-CGT AAG CTT ATA TCC ACT CCT GCT CTC CCT-3’

HD-antisense01：5’-ATC GCG GCC GCA ATG CTT GAA CTT TAT TTT G-3’

参照RT-PCR试剂盒(One Step RNA PCR Kit)说明书建立RT-PCR反应体系如下：5.0μl 10mM dNTP，10.0μl 25mM MgCl₂，1.0μl RNase Inhibitor(40U/μl)，引物(20mmol/L)各2.0μl，2.0μl RNA，1.0μl AMV RtaseXL(5U/μl)，1.0μl Taq酶，5.0μl 10×缓冲液，21.0μl ddH₂O。随后按下列程序进行反应：①逆转录：50℃，30分钟；②变性：94℃，2分钟；③变性：94℃，30秒；④复性：55℃，30秒；⑤延伸：72℃，45秒；⑥返回步骤“③”，34循环；⑦延伸：72℃，7分钟；⑧4℃保存，总循环次数为32次。将所获得的RT-PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(80V，电泳30分钟)，结果显示扩增出约450bp大小的DNA条带。将PCR产物纯化回收后与pMD18-T载体进行连接。连接产物通过电击转化法转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素、IPTG和X-gal筛选后，挑选LB平板上的白色菌落于LB液体培养基中37℃振荡过夜，次次提取质粒DNA，用EocR I和BamH I进行双酶切鉴定，对于有约450bp大小的DNA片段出现的重组质料进行测序。测序结果表明所挑选出的阳性质粒的多克隆位点中插入的DNA片段即是完整的HD5 cDNA，该重组质粒命名为pMD-HD5。实施例2HD5蛋白和mHD5多肽表达质粒的构建及其转化酵母阳性克隆株的筛选

为构建表达载体pPIC9K-HD5(图1)，首先设计合成下列2条PCR引物(依次为SEQ ID NO：5-6)：

HD-sense02：5’-ACC TACGTA ATG AGG ACC ATC GCC ATC CTT G-3’

(划线部分为内切酶SnaB I识别位点)

HD-antisense02：5’-AAGGAAAAAA GCGGCCGC C TTA TTA GCG ACA GCA GAGTCT GTA G-3’

(划线部分为内切酶Not I识别位点)

以pMD-HD5为模板，建立如下PCR反应体系获得HD5编码序列：1.0μlpMD-HD5质粒，2.0μl 10mM dNTP，2.5μl 10×缓冲液，2.0μl 25mM MgCl₂，1.0μl Taq酶(5U/μl)，引物(20mmol/L)各1.0μl，，16.5μl ddH₂O。PCR反应条件：①变性：94℃，2分钟；②变性：94℃，30秒；③复性：55℃，30秒；④延伸：72℃，25秒；⑤返回步骤“②”，32循环；⑥延伸：72℃，5分钟；⑦4℃保存，总循环次数为32次。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出约300bp大小的DNA条带。

用SnaB I和Not I分别对空载体pPIC9K和HD5 PCR产物进行37℃过夜酶切，分别进行胶回收。回收的片段按照pPIC9K∶HD5＝1∶5的方法、在T₄ DNA连接酶的作用下进行16℃过夜连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α。从转化后的LB筛选平板上挑取数个克隆，接种于3.0ml含Amp LB液体培养中37℃振荡(200rpm)培养过夜。取1.5ml菌液离心收集菌体，进行小量质粒抽提，并对所抽提的质粒进行SnaB I和Not I双酶切鉴定。经测序证实所获质粒中已插入目的基因，并且碱基序列和阅读框方向均正确。

为获得高效表达且含天然N-端序列的人α防御素5活性肽，本发明构建了另一优选表达载体pPIC9K-mHD5。如图2所示，首先设计合成3条PCR引物(应用Leto v1.0软件优化并采用同义密码子替换了人α防御素5活性肽天然序列中含有的毕赤酵母稀有密码子)并扩增出经优化的目的肽DNA片段(命名为mHD5)，再进行Red/ET同源重组筛选获得重组表达载体。

3条PCR引物的序列如下(依次为SEQ ID NO：7-9)：

mHD5-01：5’-CTA TTG CCA GCA TTG CTG CTA AAG AAG AAG GGG TAT CTCTCG AGA AAA GAG CTA CTT GTT ACT GTA GAA CTG GTA GAT-3’(斜体部分为pPIC9K中同源的序列，命名为同源臂HA)

mHD5-02：5’-ACA CAA TCT GTA CAA TCT ACC AGA AAT TTC ACA AAC ACCGGA CAA AGA TTC TCT AGT AGC ACA TCT ACC AGT TCT AC-3’

(划线部分与mHD-01中划线部分序列互补)

mHD5-03：5’-TTG TAC AGA TTG TGT TGT AGA TAA TAA

-3’

(方框内序列为pPIC9K中同源的序列，命名为同源臂HB；斜体部分与mHD-02中斜体部分序列互补)

扩增mHD5的PCR反应体系：2.0μl 10mM dNTP，2.5μl 10×缓冲液，2.0μl 25mM MgCl₂，1.0μl Taq酶(5U/μl)，3种上述引物(20mM/L)各1.0μl，，16.5μl ddH₂O。PCR反应条件：①变性：94℃，2分钟；②变性：94℃，30秒；③复性：55℃，30秒；④延伸：72℃，30秒；⑤返回步骤“②”，32循环；⑥延伸：72℃，5分钟；⑦4℃保存，总循环次数为32次。将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳后纯化回收获得约200bp的片段，其间含有优化密码子的人α防御素5活性肽序列(表2)。

表2人α防御素5活性肽天然与优化合成DNA和氨基酸序列

N：天然；S：合成；aa：氨基酸

然后将EcoR I和SnaB I双酶切的空载体pPIC9K纯化回收。线型化的pPIC9K片段和mHD5片段按相等浓度共电击转化已用0.1％L-阿拉伯糖诱导表达redγ/redβ/redα/redA重组酶的HS996感受态细胞，然后接种于LB平板，37℃培养过夜，挑取经卡那霉素筛选的阳性克隆再培养，并提取质粒进行酶切和测序鉴定，结果显示获得的质粒序列正确。

将测序正确的pPIC9K-HD5和pPIC9K-mHD5质粒DNA用Sac I酶切回收后，分别转化GS115感受态细胞。电击转化参数为：1500V，200Ω，25μF。然后将转化菌液接种于YPD平板，对经基因组PCR鉴定整合有目的基因的克隆株进行培养，制备感受态细胞，按前述方法再次进行电击转化和鉴定。接着应用甲醇利用能力、组氨酸合成能力表型和G418抗性表型进行筛选，最终挑选出具有His⁺/Mut⁺表型且耐受5.0mg/ml G418的克隆株接种培养，并标识冻存于-70℃保种。

实施例3酵母工程菌株的发酵和重组人α防御素5活性肽的纯化

取-70℃冻存的整合有pPIC9K-mHD5的酵母工程菌种接种于YPD平板30℃过夜培养活化，挑选外观优良的单个菌落接种于BMGY培养基，28℃30℃恒温摇床220rpm振荡培养16～18h至OD₆₀₀≈3～5，然后按1∶10转种1次培养至OD₆₀₀约为4，以此菌液为种子液。然后将种子液移种于装有基础盐培养基(添加微量盐PTM₁)的15L发酵罐(B.Braun公司，德国)进行高密度培养发酵。发酵温度控制在30℃(开始甲醇诱导后控制为28℃)，溶解氧含量控制在30％～40％之间，pH值控制在5.0(开始甲醇诱导后控制为3.5)，细胞培养至OD₆₀₀≈150时开始流加甲醇诱导，甲醇流加速率控制在1％左右。诱导表达过程中采用Tricine-SDS-PAGE、RP-HPLC监测目的肽的表达量，结果显示流加甲醇12小时后即有特异的目的多肽(3.6kDa)条带出现，随着诱导时间的延长，发酵上清中靶多肽的含量越高，表达至48～60小时时目的多肽的浓度最高(图3)。因此诱导表达60小时后停止发酵，低温离心取上清，随后进行纯化。首先将上清进行超滤层析，以去除部分色素和降低高强度的盐离子浓度，并将目的多肽浓缩约100倍，同时用20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.2)更换缓冲体系。接着过SPSepharose Fast Flow柱(2.6×40cm)进行阳离子交换层析，去除绝大部分残留色素和杂蛋白，收集含有目的多肽的组分，再上FINELINE柱(Source RPC 15填料，柱高5cm)进行反相层析，将收集分离组分于-80℃冻干机内分步冻存即获得纯化的产品。将上述产品经15％Tricine-SDS-PAGE电泳检测可见大小约3.6kDa的单一条带(图4)。HPLC显示为单一的蛋白峰，纯度大于98％。经质谱测定纯化产品的分子量为3582.7，免疫印迹检测出单一的阳性条带，N-端氨基酸测序结果显示所获得的多肽与理论设计产物一致，表明纯化产品是重组人α防御素5活性肽。

实施例4重组人α防御素5活性肽抗细菌的活性测定

将冻干的产品用灭菌去离子水溶解配制成浓度为128～0.5μM范围的溶液。用常规的LB液体倍比稀释培养法和LB平板培养法，测定重组人α防御素5活性肽抑制/杀灭13种菌株的生物活性。结果如表3所示，重组肽产品对所测定的13种来源于人体消化道和泌尿生殖道的主要病原细菌株均具有较强的杀灭活性，对G^-菌株的作用强于G⁺菌株，其MIC范围在1.4～9.0μM之间。

表3重组人α防御素5活性肽对13种细菌株的MIC

实施例5：重组人α防御素5活性肽抗HPV16的活性测定

利用转染试剂FuGene 6将HPV16重组包装质粒p16L1-L2和标记有绿色荧光蛋白基因的核基因组质粒pFWB共转染传代培养融合度约50～60％的293FT细胞，继续培养48h后按常规方法裂解细胞制备感染滴度(CFU/ml)＞90％的HPV16病毒液。

将冻干的产品用灭菌去离子水溶解配制成浓度为0.1～20μM范围的溶液。将50μl多肽溶液和5μl病毒液(感染复数约0.05)同时接种经传代培养融合度约25％的含50μl无血清培养的HeLa细胞培养孔(96孔细胞培养板)中(对照孔用等体积的培养基代替)。继续培养24h后更换200μl新鲜培养基，接种病毒后培养48～53h，然后将细胞消化后用PBS洗3次，立即进行流式细胞分析。采用SPSS 11.0软件统计分析多肽抑制HPV16感染细胞的效率。病毒抑制率％＝100×(1-测试孔GFP⁺细胞数/阳性对照孔GFP⁺细胞数)％。图5结果表明重组人α防御素5活性肽具有很强的抑制HPV16感染细胞的活性，抑制率与多肽浓度呈正相关，ID₅₀约为0.3μM。当重组mHD5浓度达到1.0μM时，可保护＞90％的细胞不受病毒感染。

结论：

由于实施例中选用的靶细菌株来源于临床中的消化道或泌尿生殖道感染的病人，HPV16是人类性病传播和生殖系统感染的主要病毒，均是人类感染性病原微生物的典型代表，因此实施例4和5的结果可以表明，重组人α防御素5活性肽产品用于预防和治疗消化道、泌尿生殖道系统的细菌性和病毒性感染的效果良好。同样，重组人α防御素5活性肽产品用于针对其它组织系统中的病原菌或病毒感染的防治或作为食品添加剂和防腐剂均可以达到本发明同样的效果。

本发明为采用重组人α防御素5活性肽预防和治疗临床中针对传统抗生素耐药的细菌感染性疾病和性传播疾病的防治提供了新的途径，也为人防御素的医药应用开辟了方向。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>人α防御素5活性肽的制备方法

<130>

<160>13

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>285

<212>DNA

<213>HD5cDNA编码序列

<400>1

atgaggacca tcgccatcct tgctgccatt ctcctggtgg ccctgcaggc ccaggctgag     60

tcactccagg aaagagctga tgaggctaca acccagaagc agtctgggga agacaaccag    120

ccttgctatc tcctttgcag gaaatggact ctctgctctt agaacctcag gttctcaggc    180

aagagccacc tgctattgcc gaaccggccg ttgtgctacc cgtgagtccc tctccggggt    240

gtgaaatcag tggccgcctc tacagactct gctgtcgcta ataag                    285

<210>2

<211>103

<212>DNA

<213>HD5活性肽的毕赤酵母菌偏好使用编码子序列

<400>2

gctacttgtt actgtagaac tggtagatgt gctactagag aatctttgtc cggtgtttgt     60

gaaatttctg gtagattgta cagattgtgt tgtagataat aag                      103

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>扩增HD5基因的cDNA序列的上游引物

<400>3

cgtaagctta tatccactcc tgctctccct                                      30

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>扩增HD5基因的cDNA序列的下游引物

<400>4

atcgcggccg caatgcttga actttatttt g                                    31

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>构建表达载体pPIC9K-HD5时使用的上游引物

<400>5

acctacgtaa tgaggaccat cgccatcctt g                                    31

<210>6

<211>44

<212>DNA

<213>构建表达载体pPIC9K-HD5时使用的下游引物

<400>6

aaggaaaaaa gcggccgcct tattagcgac agcagagtct gtag                     44

<210>7

<211>78

<212>DNA

<213>扩增mHD5基因的引物

<400>7

ctattgccag cattgctgct aaagaagaag gggtatctct cgagaaaaga gctacttgtt    60

actgtagaac tggtagat                                                  78

<210>8

<211>77

<212>DNA

<213>扩增mHD5基因的引物

<400>8

acacaatctg tacaatctac cagaaatttc acaaacaccg gacaaagatt ctctagtagc    60

acatctacca gttctac                                                   77

<210>9

<211>77

<212>DNA

<213>扩增mHD5基因的引物

<400>9

ttgtacagat tgtgttgtag ataataagaa ttaattcgcc ttagacatga ctgttcctca    60

gttcaagttg ggcactt                                                   77

<210>10

<211>357

<212>DNA

<213>酿酒酵母分泌信号肽(α-factor)与HD5活性肽组成融合蛋白的优化编码子序列阅读框序列

<400>10

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct     60

cagtcaacac tacaacagaa gatgaaacgg cacaaattcc ggctgaagct gtcatcggtt    120

actcagattt agaaggggat ttcgatgttg ctgttttgcc attttccaac agcacaaata    180

acgggttatt gtttataaat actactattg ccagcattgc tgctaaagaa gaaggggtat    240

ctctcgagaa aagagctact tgttactgta gaactggtag atgtgctact agagaatctt    300

tgtccggtgt ttgtgaaatt tctggtagat tgtacagatt gtgttgtaga taataag       357

<210>11

<211>114

<212>PRT

<213>酿酒酵母分泌信号肽(α-factor)与HD5活性肽组成融合蛋白的氨基酸序列

<400>11

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1               5                   10                  15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

            20                  25                  30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

        35                  40                  45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

    50                  55                  60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65                  70                  75                  80

Ser Leu Glu Lys Arg Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala

                85                  90                  95

Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr

            100                 105                 110

Arg Leu

<210>12

<211>93

<212>PRT

<213>HD5的氨基酸序列

<400>12

Met Arg Thr Ile Ala Ile Leu Ala Ala Ile Leu Leu Val Ala Leu Gln

1               5                   10                  15

Ala Gln Ala Glu Ser Leu Gln Glu Arg Ala Asp Glu Ala Thr Gln Lys

            20                  25                  30

Gln Ser Gly Glu Asp Asn Gln Asp Leu Ala Ile Ser Phe Ala Gly Asn

        35                  40                  45

Gly Leu Ser Ala Leu Arg Thr Ser Gly Ser Gln Ala Arg Ala Thr Cys

    50                  55                  60

Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val

65                  70                  75                  80

Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg

                85                  90

<210>13

<211>32

<212>PRT

<213>HD5活性肽的氨基酸序列

<400>13

Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu

1               5                   10                  15

Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg

            20                  25                  30

Claims (10)

1.一种人α防御素5活性肽的基因工程制备方法，其特征在于包括步骤：

1)目的基因的获取：克隆人α防御素5的cDNA编码序列，序列如SEQ IDNO：1所示；

2)将步骤1)所得目的基因插入穿梭质粒中，构建重组表达质粒；

3)将步骤2)所得重组表达质粒转化入酵母细胞中，筛选出基因组中整合有多拷贝目的基因的酵母克隆株；

4)高密度培养步骤3)所筛选的酵母克隆株，并用甲醇诱导目的基因的高效表达；

5)从步骤4)所获得的发酵上清中分离纯化人α防御素5活性肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)目的基因的获取还包括：设计合成寡核苷酸引物SEQ ID NO：7-9并克隆含SEQ ID NO：2所示序列的DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)所述克隆人α防御素5cDNA编码序列时使用的克隆引物，该克隆引物如SEQ ID NO：3-4所示。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤2)所述穿梭质粒为pPIC9K。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤2)中重组表达质粒为pPIC9K-HD5和/或pPIC9K-mHD5。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤3)包括采用限制性内切酶Sac I酶切步骤2)所述重组表达质粒，获得具有可发生多次单交换同源重组以致于多拷贝目的基因整合入酵母细胞基因组的游离AOX₁5’端的线型化重组表达质粒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤3)包括采用两次电击转化方法将线型化重组表达质粒转化入酵母细胞中，再利用G418抗性表型和组氨酸合成能力与甲醇利用能力表型筛选获得基因组中整合有多拷贝目的基因的酵母克隆株，所述酵母为毕赤巴斯德酵母菌株GS115。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤4)包括采用生物发酵罐高密度培养权利要求7所述的酵母克隆株和用甲醇诱导目的肽的表达，采用高效液相色谱层析法连续监测目的肽的含量，以获得高效表达目的肽的发酵上清。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于步骤4)中采用生物发酵罐时，发酵温度控制在28～30℃，溶解氧含量控制在30％～40％之间，pH值控制在3.5～5.0。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤5)包括采用捕获纯化、组分分离纯化和精纯化3个步骤从权利要求8所述的发酵上清中纯化获得人α防御素5活性肽；所述捕获纯化步骤包括应用超速离心沉淀分离法、连续超滤更换缓冲溶液法和大孔树脂吸附层析法；所述组分分离纯化步骤包括应用离子交换层析和疏水层析法；所述精纯化步骤包括应用反相层析和分子筛层析法。

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