CN114874311A - 防御肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种防御肽及其制备方法和应用。本发明涉及医药领域包括人用和兽用药的制备以及预防以及治疗的应用，涉及特异防御肽以及其衍生物的制备以及用于治疗或预防各种疾病的应用。采用多种给药方法，具有特异结构多多肽或其衍生物能够调控肠道细菌群体感应系统,能够调控细菌自诱导信号‑2以平衡肠道微生态。该多肽能够抑制小肠细菌异位上升、抑制细菌内毒素以及其它病原体相关分子模式物进入肝脏以及循环系统，以此能够预防以及治疗多种代谢疾病，包括2型糖尿病、肥胖、非酒精脂肪肝炎、酒精性肝炎、肝衰竭、肝硬化、多种癌症、囊性纤维化、炎症性肠病、肠易激综合征。

Description

防御肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种防御肽及其制备方法和应用。
背景技术
肠道微生态紊乱是多种疾病的共同原因。肠道微生物群(gut microbiota)是生活在动物消化道中的多种微生物，包括细菌和古菌(archaea)以及真菌和肠道病毒。肠道微生态也可以叫做肠道菌群(gut flora)或者肠道微生物组(microbiome)。胃肠道宏基因组(gastrointestinal metagenome)是肠道微生物群所有基因组的集合体。在人类中，肠道是微生物群的主要位置及场所。肠道微生物群具有广泛的生理功能，包括对微生物定植的影响，对病原体的抵抗力，也能够维持肠道上皮生理平衡，能够帮助代谢膳食和药物的分解，帮助建立以及维持机体的免疫功能。健康的成年人通常都有500至1000种细菌(species)，它们隶属于相对较少的已知细菌门(phyla)，包括拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)，变性杆菌门(Proteobacteria)等。微生物群与宿主免疫系统之间的相互作用是众多、复杂的以及双向的。免疫系统必须学会容忍共生微生物群的存在，并对病原体做出适当反应。反过来，微生物群也帮助塑造机体的免疫系统。肠道微生物的生物功能包括：(1)帮助机体建立免疫平衡机制,(2)合成多种维生素B，而后者是机体细胞生物化学代谢关键酶的辅酶(Co-enzymes),(3)基于其巨大的数量肠道微生物能够抵御外来的侵入细菌的定殖,(4)通过分解在小肠没有被消化的食物残余产生短链脂肪酸(short chain fattyacids)，后者不但是机体的重要热卡来源，也能够调控机体的代谢以及平衡免疫系统。例如短链脂肪酸能够帮助肠道建立免疫调节T-细胞(regulatory T cells,Treg),以维持免疫系统的平衡，避免过度的炎症反应。
相反，肠道菌群紊乱(gut dysbiosis)与多种疾病密切相关。肠道菌群紊乱可以表现为三个方面。第一，肠道菌群组成的改变，包括微生物组分丰度的改变，往往是群体的丰度降低，微生态多样性性降低；它们可以用香农-威纳指数(Shannon's Diversity Index)，alpha-多样性，beta-多样性等等参数来描述。第二，肠道菌群紊乱也表现为大肠中的细菌出现在小肠中，即细菌道小肠异位上升。而异位细菌在小肠中产生的内毒素(endotoxin)能够随着食物乳糜进入门静脉或者进入淋巴系统，产生系统炎症，而后者是导致胰岛素抵抗的重要原因。在生理状态，除了回肠隔膜的机械作用阻止大肠细菌上扬，在小肠末端(回肠段)的潘氏细胞(Paneth cells)所外分泌于肠腔的防御肽，包括alpha-densin-5/6，能够抑制细菌在小肠中升位上升。这些防御肽能够直接抑制多种细菌/真菌/肠道病毒，阻止它们异位上升。多种亚健康状态，例如缺乏阳光或者维生素D缺乏能够导致潘氏细胞防御肽基因表达能力降低，然后再导致细菌在小肠中异位上移。第三，菌群紊乱也表现为条件致病菌的增加，以及菌体的死亡增加。例如我们发现在维生素D以及高脂肪饲养条件下，条件致病菌Helicobacter hepaticus出现在小肠段。在小鼠模型中该细菌能够产生肝炎，而在肝癌病人以及肝硬化病人中该细菌也发现于肝脏中增加。例如炎症性肠病(inflammatory boweldiseases,IBD)是由环境和遗传风险因素共同导致的肠道不适当炎症疾病。炎症反应的原因包括共生菌群的紊乱。临床研究发现克罗恩病(Crohn’s disease)患者的微生物组多样性较低，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、脉内尔菌科(Veillonellaceae)和宝石科(Gemellaceae)的丰度增加，双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、丹毒杆菌科(Erysipelotrichaceae)、梭状芽胞杆菌科(Clostridiales)和类杆菌科(Bacteroidales)的丰度减少。利用这些微生物组与疾病的关联，制定了微生物失调指数，该指数与临床疾病活动(PDCAI)呈强正相关，与物种丰富度呈负相关。
人体肠道大约具有1.0-1.5公斤微生物。肠道微生物失调/紊乱与几乎所有的疾病都有关系，例如2型糖尿病(T2D)、肥胖、脂肪肝(非酒精性脂肪性肝炎,NASH)、各种癌症、器官功能衰竭、败血症、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病病人中都发生肠道菌紊乱。肠道中的微生物包括细菌、病毒和真菌在内的共生微生物对宿主是有益的，但是其死亡所释放的多种成分病源相关分子模式物(PAMPs)是导致多种疾病的共同根源。尤其是革兰氏阴性菌细胞壁的内毒素或脂多糖(lipopolysaccharides,LPS,or endotoxin)是一种极其重要的炎症因子,一旦通过门静脉流入体内，即使少量的内毒素也可引起败血症和休克、加重烧伤引起的器官衰竭、肝损伤和暴发性肝衰竭、心肌功能障碍、酒精性肝炎、肾衰竭、多器官衰竭、脂肪肝、多种癌症包括肺癌以及胰腺癌，以及严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS COV-2)诱导的炎性风暴和器官衰竭。更重要的是使用抗生素会加剧微生物失调,因此开发其它方法来干预平衡肠道菌群是治疗肠道菌群紊乱导致的多种疾病的希望。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于平衡肠道微生态或治疗肠道菌群紊乱相关疾病的防御肽。
本发明提供了一种防御肽，所述防御肽为：
氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的多肽；
或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的多肽具有同源性，且具有相同生物活性的多肽；
或由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的多肽经化学修饰、保护、首尾连接成环或多个氨基酸的缺失、替代或增加得到，且具有相同生物活性的多肽。
在一些实施例中，化学修饰包括糖基化、乙酰化、磷酸化、羧基化长链脂肪酸化或者其他长烃链修饰，交联的脂肪酸包括棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、α亚麻酸(C18∶3)、花生四烯酸(C20∶4)、二十碳五烯酸，以及多种饱和脂肪酸以及不饱和脂肪酸；它们可以掺入到上述多肽链包括N-端以及C-端氨基酸残基上。多肽链上的谷氨酸(glutamate，E)残基通过与长链的醇进行酰基化反应产生的修饰能够增加防御肽的稳定性，或者在结构中引入带正电的系列化学基团如胺基或胍基等以提升中和内毒素以及肠道微生物核酸的能力，提升拮抗细菌的功能，提升干预细菌群体感应系统的能量。
本发明提供了一种DNA片段，所述DNA片段编码权利要求1所述的防御肽。
在一些实施例中，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有编码所述的防御肽的核苷酸序列。
本发明提供了一种宿主细胞，其基因组中含有所述的DNA片段。
本发明提供了一种所述的防御肽、所述的DNA片段、所述的重组表达载体或所述的宿主细胞在制备用于平衡肠道微生态或治疗肠道菌群紊乱相关疾病的产品中的应用。
在一些实施例中，所述防御肽通过干预细菌群体感应系统以平衡肠道微生态，且能够促进肠道内源益生菌的丰度，也能够抑制多种肠道条件致病菌，可以用于治疗肠道菌群紊乱以及病源相关分子模式物导致的组织损伤以及器官衰竭和因肠道菌群紊乱导致的代谢疾病。例如2型糖尿病，各种脂肪肝病，肥胖，代谢综合征、炎症性肠病、肿瘤以及癌症等。
本发明提供了一种权利要求1所述的防御肽的制备方法，包括以下步骤：
通过固相合成方法制备所述防御肽；或
通过所述的宿主细胞进行基因表达制备所述潘氏细胞防御肽。
本发明提供了一种药物，包括所述的防御肽和药学上可接受的辅料。
在一些实施例中，所述辅料包括肠道缓释剂以及稳定剂。
在一些实施例中，还包括维生素D和25-羟基维生素D3中的一种或多种。维生素D或25-羟基维生素D(25-hydroxyl-vitamin D)能够维持及提升小肠固有免疫系统稳态，维生素D信号也能够促进防御肽在潘氏细胞中的基因表达，以此维持肠道微生态平衡，提升以上所述疾病的疗效。
在一些实施例中，所述药物的剂型为口服制剂、喷雾制剂或注射制剂。口服制剂例如包括采用pH敏感型定点释药给药系统、pH敏感与微生物降解复合释药给药系统。该给药系统可以是片剂、丸剂、微型片剂、微型丸剂、薄膜包衣型颗粒剂、硬胶囊剂、薄膜包衣粉剂、多层片剂，或者以上几种剂型中的一种或多种剂型组合制备的给药形式。喷雾制剂包括溶液型、混悬性、干粉型雾化给药剂型，经给药装置进行雾化或者分散后，通过鼻腔或者口腔吸入人体进行给药，以调节呼吸道微生态，降低呼吸道内毒素(endotoxin)入血以及其它病源相关模式物(PAMPs)例如CpG-DNA短链以及细菌鞭毛进入循环系统。
本发明提供了一种潘氏细胞的防御肽及其制备方法，以及用于预防或治疗多种疾病的应用。通过多种给药方法并且基于上述防御肽(DEFA5/HD5或者DEFA6/HD6)分子及其衍生物多肽的制备和相关的制剂，可以用于平衡肠道微生态，能够抑制肠道细菌AI-2信号，干预细菌生物膜的形成，能够抑制肠道厚壁杆菌门并增加拟杆菌门的丰度。服用这些多肽也能够增加肠道益生菌Akkermansia muciniphila,能够抑制细菌在小肠中异位上升。以此应用可以降低内毒素以及其它PAMP毒素由门静脉入血，以此应用可以降低肝脏炎症反应，能够缓解系统炎症、缓解其它器官的局部炎症。进一步能够用于缓解肝衰竭以及肝损伤、缓解胰岛素耐受、缓解脂肪肝病、缓解肺功能衰竭、缓解肾功能衰竭、缓解肝性脑病、缓解败血症、缓解炎症性肠病(IBD)、缓解新型冠状病毒感染导致的炎症风暴以及重症等，还可以用于ICU病人的救治、恢复器官功能、提高生存率，也可以用于预防或者治疗因肠道细菌毒素导致的慢性炎症以及多种代谢疾病，预防及治疗脂肪肝病、缓解胰岛素耐受、缓解糖尿病、缓解肥胖症、2型糖尿病、肥胖、非酒精脂肪肝炎(NASH)、酒精性肝炎(ASH)、肝衰竭、肝硬化、多种癌症、囊性纤维化(cystic fibrosis)、炎症性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)。而且因为抑制肠道细菌AI-2信号，该方法能够用于拮抗耐药菌，能够增加抗生素的敏感性，提高其疗效；能够用于治疗细菌感染导致的器官衰竭和损伤。
附图说明
图1为服用潘氏细胞防御肽能够改善肝硬化小鼠肠道通透性以降低内毒素入血的实验数据；
图2为自诱信号-2(Autoinduer-2，AI-2)的生物分析方法；
图3为非酒精脂肪肝(NAFLD)的生物发生过程中肠道细菌产生大量的自诱导因子-2(AI-2)与厚壁杆菌门的增加相关的实验数据；
图4为潘氏细胞外分泌的防御素-5(HD5)能够抑制AI-2信号的实验结果；
图5为肝硬化伴随着降低肝脏生物合成25-OH-维生素D的实验数据；
图6为肝硬化伴随着小肠防御肽表达的降低以及肠道固有免疫能力降低的实验数据；
图7为肝硬化与小肠黏膜损伤以及固有免疫能力降低的实验数据；
图8为服用潘氏细胞防御肽能够缓解小鼠肝脏炎症细胞浸润以拮抗肝硬化的实验数据；
图9为服用潘氏细胞防御肽能够改善肝脏损伤/肝硬化小鼠的肠道微生态的实验数据；
图10为小肠末端表达大量的维生素D受体(Vdr)以控制潘氏细胞防御肽表达的实验数据；
图11为维生素D受体(Vdr)缺失导致小肠潘氏细胞溶酶体应激反应，导致防御肽表达降低，促进肝硬化的发生的实验数据；
图12为维生素D缺乏或者高脂肪饮食导致脂肪肝的生物发生的实验数据；
图13为长期缺乏维生素D的高脂肪饮食会导致胰岛素抵抗以及糖不耐受的实验数据；
图14为维生素D能够抑制高脂肪饮食导致的内毒素入血的实验数据；
图15为维生素D受体(Vdr)大量表达于小肠末端组织的实验数据；
图16我维生素D信号促进小肠固有免疫系统，以此来抑制内毒素入血，平衡机体免疫的实验数据；
图17为维生素D信号促进小肠末端组织表达潘氏细胞外分泌防御肽(Defa5)的实验数据；
图18为维生素D信号促进小肠末端组织表达MMP-7以激活潘氏细胞防御肽的实验数据；
图19为维生素D信号促进小肠末端组织表达潘氏细胞的内分泌防御肽(Defa1)的实验数据；
图20为服用合成的人源潘氏细胞防御肽(HD5)能够降低小鼠的内毒素血症以及系统炎症的实验数据；
图21为服用合成的人源潘氏细胞防御肽(HD5)能够降低肥胖小鼠的体重的实验数据；
图22为服用合成的人源潘氏细胞防御肽(HD5)能够缓解非酒精脂肪肝以及改善代谢综合征的实验数据；
图23为服用合成的人源潘氏细胞防御肽(HD5)能够促进益生菌Akkermansiamuciniphila的实验数据；
图24为服用合成的人源潘氏细胞防御肽(HD5)能够抑制肝脏螺旋杆菌(Helicobacter hepaticus)在小肠中异位上升的实验数据。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。可以理解，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中，所述的CpG寡核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides)是短小的单链DNA分子，包含一个“三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(cytosine)”，然后是一个鸟嘌呤三磷酸脱氧核苷酸(guanine)。“P”是指连续核苷酸之间的磷酸二酯链。所述细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的磷酸脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)。PAMP是指细菌或者肠道病毒产生的模式分子，进入血液后能够激活机体细胞的TLR受体，从而激活细胞的应答反应，包括炎症反应。本发明研究表明，以服用人工合成的多肽药物例如潘氏细胞外分泌的HD5或者HD6或者其衍生物。我们发现HD5能够调控肠道细菌群体感应(quorum sense)，能够抑制autoinducer-2(AI-2)信号，能够抑制细菌在小肠中异位上升，能够通过结合肠道微生物产生的内毒素及其它衍生物，能够将肠道细菌毒素通过大便排除体外，以此来降低肠道微生物酸性毒素入血。该发明可以应用于预防、缓解、改善因肠道细菌毒素所导致的多种疾病，包括肝衰竭以及其它重症，多种因肠道毒素入血造成的代谢疾病，包括脂肪肝、糖尿病、肥胖症。另一方面，细菌群体感应AI-2能够诱导细菌耐药基因的表达，促进生物膜的形成。我们发现在高脂肪喂养条件下AI-2增加，导致厚壁杆菌增加，导致细菌在小肠中异位上升，细菌内毒素入血增加，产生系统炎症反应，导致胰岛素抵抗，高血糖，后者进入肝脏产生脂肪肝以及肝脏炎症。
在本发明中，我们提供了制备缓解或治疗多种重症以及代谢疾病的新疗法。其原理是通过阳离子防御素例如HD5或者衍生物来抑制群体感应信号；同时，HD5也能够直接抑制肠道中的肝脏螺旋杆菌(Helicobacterhepaticus)，能够清除肠毒中多种毒素，以降低系统炎症，降低炎症风暴。该应用涉及(1)缓解因肠道菌我紊乱以及内毒素入血造成的肝衰竭，包括急需肝衰竭，慢性肝衰竭，包括病毒感染导致的肝衰竭，药物造成的肝损伤，酒精造成的肝衰竭；(2)抑制败血症，包括因烧伤导致的败血症，败血症导致的多器官衰竭；(3)抑制/缓解癌症导致的器官衰竭，内毒素入血导致的并发症，例如黄疸症；(4)抑制肝硬化，胰腺纤维化以及肝脏纤维化；(5)降低多种疾病症患者血液中内毒素含量、降低内毒素血症、降低血液中转氨酶升高、改善肝功能；(6)缓解脂肪肝炎，恢复肝脏功能；(7)减肥，降低胰岛素抵抗、降低系统炎症、降低病灶组织中的局部炎症；(8)促进肠道菌群平衡(eubiosis)。以上所述的治疗是以口服的给药方式，给于患者一定剂量的高分子防御肽以改善上述任意或全部症状。
大量的研究表明，肠道微生物产生的多种内毒素是导致机体系统炎症的重要来源。而慢性的系统炎症可能促进多种疾病，包括肝衰竭，糖尿病、脂肪肝、肿瘤及癌症。因此，该应用能够缓解内毒素导致的系统炎症以及各种重症的局部炎症，以促进组织修复再生。此外，通过本发明的应用，包括降低血液中内毒素，以此改善系统炎症，改善癌症病人的病理-生理整体状态，改善患者的精神状态，改善其生活质量，可能延长生命。因其为其高分子聚合物特质以及，具有不被肠道降解的特质，故不被人体吸收，能够能由从大便排出，具有高度的安全性以及耐受性。
本发明的防御肽能够调控肠道细菌群体感应系统(quorum sense)，抑制自诱导信号-2(autoinducer-2,AI-2)，能够平衡肠道菌群微生态(eubiosis)，能够抑制小肠细菌异位上升，能够降低内毒素(endotoxin,lipopolysaccharides,LPS)以及其它病源相关分子模式物(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)由门静脉进入肝脏以及循环系统。因此，HD5或者HD6以及其衍生物可用于预防以及治疗多种相关疾病，包括人用药以及兽医用药的制备以及新应用。
所述防御肽能够中和以及清除肠道微生物产生的致病因子包括清除新型冠状病毒(Sars-Cov-2)、清除肠道中的其它病毒释放的RNA以及DNA、清除细菌死亡释放的CpG-DNA片段等等。以此应用能够缓解新型冠状病毒(Covid-19)或者其它肠道病毒产生的炎症风暴导致的组织损伤以及器官衰竭，用于多种病毒感染导致的疾病以及并发症。
所述防御肽能够直接抑制消化道条件致病菌的生长，例如能够抑制肠道中肝脏螺旋杆菌(H.hepaticus)的生长，能够阻止细菌在小肠中异位上升，能够抑制肠道病源细菌进入肝脏或者循环系统，用于预防以及治疗相关的多种肝脏疾病，包括人用药以及兽医用药的制备以及应用。
所述防御肽能调控制肠道群体感应系统，能够抑制细菌群体自诱导信号-2(Autoinducer-2)，以平衡肠道微生态(eubiosis)例如抑制肠道厚壁杆菌门，以此通过平衡肠道微生态来用于预防以及治疗多种因肠道菌群紊乱导致的代谢疾病例如2型糖尿病以及肥胖以及糖尿病的并发症；包括人用药以及兽医用药的制备以及应用。
所述防御肽能够促进肠道益生菌多丰度以及群体多样性(biodiversity)。HD5或者HD6及其衍生物阳离子多肽能够提升肠道多种拟杆菌门的细菌(Bacteroidetes)的丰度,能够抑制厚壁杆菌门的细菌(Firmicutes)生长,防御多肽HD5能够提升肠道粘质阿克曼菌(A.muciniphila)的丰度，后者是一种主要的肠道益生菌。以此方法来提升肠道粘质阿克曼菌能够用于预防以及治疗多种相关的代谢疾病，包括人用药以及兽医用药的制备以及应用。
所述防御肽能够抑制AI-2信号，能够抑制细菌在小肠中异位上升，降低内毒素由门静脉入血。以此应用可能用于缓解机体的系统炎症，从而缓解胰岛素抵抗(insulinresistance)，降低血糖,降低糖基化血红蛋白(HbA1c)。通过降低循环系统的内毒素能够促进细胞的自噬-溶酶体的清除系统，促进细胞的分解代谢，降低中心肥胖，用于超重或者肥胖病人的安全减肥，降低体重，或者健康患者预防超重或者保持适当的体重。
所述防御肽可用于平衡肠道微生态并降低内毒素入血以及其它PAMPs进入肝脏，以此减轻肝脏的溶酶体应激以及氧化应激，可以促进肝脏细胞的自噬-溶酶体介导的分解代谢，促进肝脏细胞的自我修护，降低肝脏异常升高的转氨酶，清除肝脏脂肪沉积，消融各种脂肪肝，通过自噬-溶酶体来清除循环系统的炎症因子例如IL-6等，用于缓解非酒精脂肪性肝炎(NASH)以及酒精性脂肪肝炎(ASH)以及肝脏纤维化。通过服用所述防御肽平衡肠道微生态并降低内毒素(endotoxin)入血以及其它PAMPs例如CpG-DNA短链以及细菌鞭毛进入循环系统，降低炎症风暴以及组织损伤。以此应用可以预防、治疗多种急性器官衰竭(multi-organ failure)、例如败血症(sepsis)，创伤/烧伤导致的器官衰竭、肝损伤以及肝衰竭(liver failure)、爆发性肝炎(fulminant hepatitis)、慢性肝衰竭(chronic liverfailure)、以及肝病导致的并发症例如肝性脑病，颅内高压及脑水肿，也能够用于缓解肾功能衰竭、肺功能衰竭、以此来缓解多种疾病导致的多器官重症。以此应用也可以提高体外循环系统的治疗效果，提高器官衰竭病人的生存率。
所述防御肽能够调控肠道群体感应，以此来缓解及治疗炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(CD，Crohn’s disease)，细菌性痢疾，幽门螺旋杆菌导致的慢性胃炎，肠易激综合征(IBS)。
通过服用所述防御肽平衡肠道微生态，抑制肠道多种毒素入血，促进肿瘤细胞多自噬-溶酶体分解代谢，促进肿瘤蛋白例如YAP1等的降解，抑制癌症发生以及转移，包括多种消化道肿瘤例如肝癌，胰腺癌，直肠癌，胃癌，食管癌等等。
通过服所述防御肽还可以平衡肠道微生态并降低内毒素入血，以此缓解囊性纤维化(cystic fibrosis)基因突变造成的组织损伤以及纤维化，改善其并发症包括体重降低、肠阻塞、腹泻、肝门静脉高压等。此外，还能够抑制细菌耐药基因的表达，能够抑制细菌生物膜(biofilm)的形成，以此帮助清除耐药菌。以此应用可以增强细菌对抗菌素的敏感性，能够降低抗生素的用量。防御肽以及其衍生物能够用于拮抗多重耐药细菌，用于治疗细菌感染导致的多种疾病，例如细菌感染导致的败血症、细菌性肺炎、细菌感染导致的肾脏疾病、细菌感染导致的泌尿系统炎症、细菌性肠炎等等。
以下为具体实施例。
实施例1
服用潘氏细胞防御肽(HD5)能够改善肝硬化小鼠的肠道生理屏障以及平衡肠道微生态以降低通透性以抵御内毒素入血。
如图1所示，反复给予小鼠注射四氯化碳能够造成肝脏损伤导致肝硬化。在小鼠形成肝脏损伤以及纤维化4周后，通过罐胃给予合成HD5小鼠10毫克/只，或者生理盐水为对照，每周给予2次，联系持续4周。通过FITC-葡聚糖入血试验，我们发现肝硬化小鼠的肠道通透性增加约3倍(图1A)，提示在肝硬化状态下肠道损伤，固有免疫能力降低；同时内毒素入血增加约2倍量(图1B)。而服用HD5多肽能够降低肠道通透性，从而能够彻底降低内毒素入血。
实施例2
群体感应(quorum sense)的自诱导信号(autoinduer-2，AI-2)的生物分析方法。
自诱导因子-2(AI-2)是一种细菌细胞间信号分子，被认为可用于多种原核物种的群体感应方式。这种分子通常使用所谓的自诱导生物测定法进行检测，该方法依赖于哈维氏弧菌报告菌株对AI-2产生光的能力。哈维氏弧菌Vibrio harveyiBB170具有感受AI-2信号而产生荧光的细菌，广泛用于测定AI-2信号。如图2A所示，AI-2由1-脱氧-3-脱氢-D-核酮糖的反应产生，该反应由硼酸酶促产生，并被弧菌科中的双组分传感器激酶LuxPQ识别。图2B示AI-2浓度与荧光发生的效应关系，以及图2C示用于测定BB170的稀释倍数与发光量的关系。
实施例3
非酒精脂肪肝(NAFLD)的生物发生过程中肠道细菌产生大量的自诱导因子-2(AI-2)。
如图3所示，C57/B6遗传背景的小鼠给予高脂肪饮食(65％热卡来自于动物油脂)。在第4，12，15，20周采集粪便样品，通过哈维氏弧菌Vibrio harveyi BB170测定其发生生物荧光量。在高脂肪饲养的第4周，小鼠肠道中AI-2含量开始增加；在第12周时，AI-2明显增加，在第20周时AI-2含量约达到对照饲料喂养的2.5倍(图3A、图3B)。与此同时，AI-2的增加与粪便中厚壁杆菌(Firmicutes)门的增加有关(图3C)，而后者是产生大量短链脂肪酸(SCFA)的主要细菌，提示其潜在的因果关系，以及给予的原理与方法。
实施例4
潘氏细胞外分泌的防御素-5(HD5)能够抑制AI-2信号(体外实验)。
如图4所示，HD5与AI-2在体外保温后通过通过哈维氏弧菌Vibrio harveyi BB170测定其发生生物荧光量。结果表明，在0.25微摩尔浓度具有明显的抑制AI-2的功能。
实施例5
慢性肝损伤导致的肝硬化伴随着降低维生素D生物合成能力降低，导致25-OH-维生素D降低，机体缺乏维生素D生物信号。
来自于饮食或者皮肤经阳光合成的维生素D3在肝脏中进一步被羟基化(25-hydroxylation)，然后在肾脏中发生1-位羟基化反应。血液中25-OH-VD水平是维生素D生理水平的指标。如图5A所示，反复给予小鼠CCl4打击，能够导致肝脏纤维化(SiriusStaining)，如图5B所示，肝脏1型胶原mRNA表达增加，如图5C所示，TGF-beta1表达增加，都表明肝脏纤维化的程度。同时，如图5D所示，血浆中25-OH-VD3也降低，由生理状态的60为摩尔/L降低到20微摩尔/L。
实施例6
慢性肝损伤导致的肝硬化伴随着小肠防御肽表达的降低以及肠道固有免疫能力降低。
如图6所示，反复给予小鼠注射四氯化碳能够造成肝脏损伤导致肝硬化。8周后收集回肠段组织，测定防御肽基因的表达。如图6A所示，两个防御肽基因，Defa2以及Defa5基因表达降低。这与维生素D羟基化的降低相一致，提示其因果关系。Mmp-7是潘氏细胞中剪切防御肽使之成熟然后外分泌的关键酶。如图6B所示，Mmp-7在回肠段肠道绒毛隐潘氏细胞中表达降低，再一次显示防御肽降低与肝脏损伤以及肝脏纤维化的关系，也说明以HD5治疗肝脏疾病包括肝硬化的病理基础。
实施例7
慢性肝损伤导致的肝硬化与肠道固有免疫能力降低。
如图7所示，反复给予小鼠注射四氯化碳能够造成肝脏损伤导致肝硬化。10周后收集回肠段组织，测定防御肽基因的表达。如图7B所示，PAS组织染色显示小肠糖蛋白黏膜降低，与肝脏损伤以及肝硬化密切相关。溶菌酶(lysosozyme)是细胞溶酶体的关键酶。如图所示，在肝脏损伤以及肝硬化小鼠的小肠细胞中溶菌酶降低，提示其溶酶体活性降低，溶酶体应激，可能导致进一步的氧化应激，组织损伤。ZO-1是小肠紧密连接蛋白，是维持小肠完整性，防止肠道通透性的关键分子。如图7A所示，ZO-1在肝硬化小鼠的小肠绒毛组织中表达降低，以此能够解释肠道通透性增加的原因。
实施例8
服用潘氏细胞防御肽(HD5)能够缓解肝硬化。如图8所示，反复给予小鼠注射四氯化碳能够造成肝脏损伤导致肝硬化。在小鼠形成肝脏损伤以及纤维化4周后，通过灌胃给予合成的人源HD5小鼠10毫克/只，或者生理盐水为对照，每周给予2次，联系持续4周。如图8A所示，给予HD5能够有效地缓解肝硬化，降低胶原蛋白形成的纤维桥。肝脏持续的炎症是促进肝脏纤维化的动力，如图8B和8C所示，给予HD5能够降低肝脏中淋巴细胞(CD3+)的浸入，以及抑制肝脏纤维化。联系到以上多个数据，我们发现肝脏损伤以及肝脏纤维化的发生与肠道固有免疫系统的损伤包括防御肽表达的降低，以及内毒素入血造成的慢性炎症密切相关。于是，通过给予肠道防御肽HD5能够帮助重建肠道固有免疫，从而降低肝脏溶酶体应激，促进肝脏细胞的修护，清除损伤以及纤维化组织。
实施例9
服用潘氏细胞防御肽(HD5)能够改善肝脏损伤/肝硬化小鼠的肠道微生态。
如图9所示，反复给予小鼠注射四氯化碳能够造成肝脏损伤导致肝硬化，在小鼠形成肝脏损伤以及纤维化4周后，通过灌胃给予合成的人源HD5小鼠10毫克/只，或者生理盐水为对照，每周给予2次，联系持续4周。如图9所示，给予HD5能够有效地平衡肠道菌群。如图9所示，长期的肝脏损伤导致拟杆菌门(Baceteriodates)降低，而厚壁杆菌门(Fimicutes)升高。给予服用HD5能够促进拟杆菌门回升，同时降低厚壁杆菌的丰度。而拟杆菌是肠道的主要Gram-阴性细菌，它们的回升与内毒素的降低呈现相关性，提示给予HD5可能帮助拟杆菌门回升，从而降低内毒素入血，以此来缓解肝硬化。
实施例10
小肠末端表达大量的维生素D受体(Vdr)以控制潘氏细胞防御肽的表达。
维生素D信号是维持机体固有免疫系统的重要机制。如图10所示，为了证实维生素D信号对肠道固有免疫系统的调控以及对肠道微生态的调控，我们测定了在小肠表皮细胞中敲除Vdr以及其生理效应。如图10A和图10B所示，P-villin-Vdr+/-小鼠的Vdr表达部分降低。如我们的期待，Vdr敲除小鼠的小肠先天免疫系统异常，紧密连接损伤(图10C)；更重要的是Defa5基因表达(mRNA水平)降低(图10C)。以此实验我们证明维生素D在小肠细胞中调控潘氏细胞的防御肽表达。于此，也可以说明肝脏损伤以及25-OH-VD降低所导致的小肠固有免疫的缺失与损伤，导致防御肽表达降低的原因。
实施例11
维生素D受体(Vdr)缺失导致小肠潘氏细胞溶酶体应激，防御肽表达降低，促进肝硬化的发生。
维生素D信号是维持机体固有免疫系统的重要机制。如图11所示，为了证实维生素D信号对肠道固有免疫系统的调控以及对肠道微生态的调控，我们测定了在小肠表皮细胞中敲除Vdr以及其生理效应。如图11A所示，P-villin-Vdr+/-小鼠小肠隐窝溶酶体染色降低，提示维生素D信号能够促进细胞溶酶体发生，而缺乏Vdr导致溶酶体应激；这也能够解释小肠的组织损伤。此外，在Vdr敲除小鼠的小肠小肠隐窝细胞中Defa1表达也有所降低。如我们的期待，如图11B和11C所示，Vdr敲除小鼠的小肠先天免疫系统异常，紧密连接损伤；更重要的是Defa5基因表达(mRNA水平)降低，导致了肝脏纤维化的增加。
实施例12
饮食缺乏维生素D或者高脂肪饮食导致脂肪肝的生物发生。
如图12所示，以缺乏维生素D的合成饲料长期喂养(VDD)小鼠产生低度的脂肪肝(NAS＝1)。同样，给予含有维生素D(1000IU/kg)的高脂肪喂养(HFD)也仅仅产生低度的脂肪肝(NAS＝1.5)，说明维生素D信号能够抑制脂肪肝的发生。与我们预期一致，在维生素D缺乏的高脂肪饮食的双重打击下，在20周饲养后肝脏脂肪肝明显增加(NAS＝4)。这些结果与Vdr基因敲除小鼠的结果相一致。
实施例13
缺乏维生素D的高脂肪饮食会导致胰岛素抵抗以及糖不耐受。
如图13所示，给予小鼠四种饲养方法，对照(含维生素D，1000IU/kg)，剔除维生素D的合成饲料产期喂养(VDD)，含维生素D的高脂肪饲料，以及缺乏维生素D的高脂肪饮食(VDD+HFD)。VDD或者HFD试验仅仅产生低度的糖不耐受(IPGTT)。而维生素D缺乏的高脂肪饮食的双重打击下，在20周饲养后产生明显的糖不耐受以及胰岛素抵抗(IPITT)。HOMA-IR包含了血糖量以及血液胰岛素含量指标也表明在双重打击下小鼠呈现2型糖尿病的状态。2型糖尿病导致的高血糖将在肝脏中转化为甘油三酯，以形成脂肪肝。
实施例14
维生素D能够抑制高脂肪饮食导致的内毒素入血。
如图14所示，给予小鼠四种饲养方法，对照(含维生素D，1000IU/kg)，剔除维生素D的合成饲料产期喂养(VDD)，含维生素D的高脂肪饲料，以及缺乏维生素D的高脂肪饮食(VDD+HFD)。VDD或者HFD试验仅仅产生低度的糖不耐受(IPGTT)。在20周饲养后我们测定了血液内毒素水平。结果发现食品添加维生素D能够拮抗高脂肪饮食导致的内毒素入血(图14A)。这与维生素D信号能够上调潘氏细胞防御肽以及维持小肠表皮细胞紧密链接相关(图14B)。
实施例15
维生素D受体(Vdr)大量表达于小肠末端能够维持潘氏细胞防御肽的表达，抑制细菌异位上升。
如图15所示，我们测定了多个器官中维生素D受体(Vdr)的表达量。通过定量RT-qPCR分析，我们注意到维生素D受体(Vdr)大量表达与小肠末端，大约是在肝脏中表达的1000倍，提示维生素D信号维持生理平衡在比较大的层面上是通过调控小肠中的基因表达，包括钙/磷转运体以及防御肽，肠道黏膜基因Muc2，表皮细胞的紧密连接蛋白的基因。该结果也能够解释我们提出的肠道-肝脏相互作用是通过肝脏25-羟基化VD，后者经过进一步羟基化(calcitriol)，然后作用于小肠末端细胞，促进固有免疫基因的表达。
实施例16
维生素D信号促进小肠固有免疫系统，以此来抑制内毒素入血，平衡机体免疫。
如图16所示，给予小鼠四种饲养方法，对照(含维生素D，1000IU/kg)，剔除维生素D的合成饲料产期喂养(VDD)，含维生素D的高脂肪饲料，以及缺乏维生素D的高脂肪饮食(VDD+HFD)。在20周饲养后我们测定了小肠中多个与固有免疫相关的基因表达水平。结果发现食品添加维生素D能够拮抗高脂肪饮食导致紧密连接基因表达的降低。例如，高脂肪饮食中的维生素D3添加量能够部分上调ZO-1基因以及Occludin基因的表达(图16A)。反之，缺乏维生素D的高脂肪饮食降低多个紧密链接基因的表达，小肠绒毛黏膜的损伤(图16B)。
实施例17
维生素D信号促进小肠末端组织表达潘氏细胞外分泌防御肽(Defa5)。
如图17所示，给予小鼠四种饲养方法，对照(含维生素D，1000IU/kg)，剔除维生素D的合成饲料产期喂养(VDD)，含维生素D的高脂肪饲料，以及缺乏维生素D的高脂肪饮食(VDD+HFD)。在20周饲养后我们测定了小肠中多个与固有免疫相关的基因表达水平。结果发现食品添加维生素D能够拮抗高脂肪饮食导致潘氏细胞防御肽(Defa5)的表达。添加维生素D也能够抑制高脂肪饮食也能够部分地维持潘氏细胞防御肽的表达。
实施例18
维生素D信号促进小肠末端组织表达MMP-7以激活潘氏细胞防御肽。
潘氏细胞防御肽原(pro-polypeptide)需要其细胞中的MMP-7蛋白酶来处理剪切，成熟为短肽后再分泌于细胞外。如图18所示，给予小鼠四种饲养方法，对照(含维生素D，1000IU/kg)，剔除维生素D的合成饲料产期喂养(VDD)，含维生素D的高脂肪饲料，以及缺乏维生素D的高脂肪饮食(VDD+HFD)。在20周饲养后我们测定了小肠末端潘氏细胞防御肽的表达以及Mmp-7的表达。通过免疫组织化学染色(图18A)以及免疫荧光染色(图18B)方法，我们结果发现维生素D能够维持潘氏细胞中Mmp-7的表达，以产生具有生物活性的防御肽。该实验再次证明维生素D在维持肠道生理平衡，包括潘氏细胞的生理调控。
实施例19
维生素D信号促进小肠末端组织表达潘氏细胞的内分泌防御肽。
除了分泌于肠腔中的两个防御肽Defa5以及Defa6，潘氏细胞也向血液/组织中分泌其它类似的抗菌肽。如图19所示，给予小鼠四种饲养方法，对照(含维生素D，1000IU/kg)，剔除维生素D的合成饲料产期喂养(VDD)，含维生素D的高脂肪饲料，以及缺乏维生素D的高脂肪饮食(VDD+HFD)。在20周饲养后我们测定了小肠中多个与固有免疫相关的基因表达水平。结果发现食品添加维生素D能够拮抗高脂肪饮食导致潘氏细胞的内分泌防御肽(Defa1)的表达(图19A、19B)。添加维生素D也能够抑制高脂肪饮食也能够部分地维持潘氏细胞内分泌的防御肽的表达。
实施例20
服用合成的人源潘氏细胞防御肽(HD5)能够降低小鼠的内毒素血症以及系统炎症。
如图20A，BalB/C6小鼠给予维生素D缺乏的高脂肪饲养18周，然后通过灌胃给予合成的DEFA5/HD5，在25天内给予4次，每次10微克/0.1毫升；对照为生理盐水。小鼠在10天后处死以收集标本。我们发现经过维生素D缺乏的高脂肪喂养导致小鼠血液内毒素升高约4倍，后者与前面所示的胰岛素抵抗以及脂肪肝的形成密切相关。给予4次DEFA5治疗处理能够明显地降低血压内毒素水平(图20B)。我们采用LAL分析方法来测定血浆中的内毒素含量。基于从鲎血液中分离出的成釉细胞(LAL)提取物。已经被广泛地证明，内毒素(LPS)通过激活细胞表面的TLR4受体是导致机体炎症的重要原因，而后者是产生胰岛素抵抗以及糖尿病和脂肪肝的重要根源。通过ELISA方法我们测定了血液中TNF-alpha含量，如图20C所示，维生素D缺乏的高脂肪喂养导致血浆中TNF-alpha含量增加3倍，而给予4次DEFA5治疗后血液中TNF-alpha含量降低了50％，与LPS下降密切相关，提示其因果关系。而TNF-alpha的降低能够解释大多数的治疗结果，包括恢复胰岛素敏感性，降低血糖，以及缓解脂肪肝。
实施例21
服用合成的人源潘氏细胞防御肽(HD5)能够降低肥胖/糖尿病/脂肪肝小鼠的体重。
如图21，BalB/C6小鼠给予维生素D缺乏的高脂肪饲养18周，然后通过灌胃给予合成的DEFA5/HD5，在25天内给予4次，每次10微克/0.1毫升；对照为生理盐水。小鼠在10天后处死以收集标本。我们发现经过维生素D缺乏的高脂肪喂养导致体重明显增加。给予4次DEFA5治疗处理能够明显地降低体重。
实施例22
服用合成的人源潘氏细胞防御肽(HD5)能够降低肥胖/糖尿病/脂肪肝小鼠的代谢综合征指标也能够缓解脂肪肝。
如图22，BalB/C6小鼠给予维生素D缺乏的高脂肪饲养18周，然后通过灌胃给予合成的DEFA5/HD5，在25天内给予4次，每次10微克/0.1毫升；对照为生理盐水。小鼠在10天后处死以收集标本。我们发现经过维生素D缺乏的高脂肪喂养导致体重明显增加。给予4次DEFA5治疗处理能够明显地降低血液中甘油三酯(triglycerides，TG)水平，降低低密度胆固醇(LDL-C)水平(图22A、图22B)。肝脏炎症是导致肝脏纤维化/肝硬化的主要原因。我们发现给予DEFA5治疗能够降低肝脏中IL-1beta的表达水平(图22C)，提示降低肝脏炎症水平。与预期相符，给予DEFA5(HD5)能够有效地改善脂肪肝(图22D)。其原因可能是HD5多肽能够以多种方式来平衡肠道菌群，抑制内毒素入血，缓解肝脏氧化应激压力。
实施例23
服用合成的人源潘氏细胞防御肽(HD5)能够促进益生菌Akkermansiamuciniphila，缓解代谢综合征指标。
如图23，BalB/C6小鼠给予维生素D缺乏的高脂肪饲养18周，然后通过灌胃给予合成的DEFA5/HD5，在25天内给予4次，每次10微克/0.1毫升；对照为生理盐水。小鼠在10天后处死以收集标本。我们发现经过维生素D缺乏的高脂肪喂养导致体重明显增加。如图所示，每次给予DEFA5后我们收集小鼠粪便，测定A.muciniphila细菌。我们发现给予DEFA5(HD5)提升A.muciniphila近1000倍的水平。益生菌A.muciniphila是人类肠道的主要细菌，约占4％的总菌量。在糖尿病、脂肪肝病人中A.muciniphila丰降低，而给予服用A.muciniphila后能够明显地改善糖尿病以及脂肪肝。于是我们在此提出一种简易而安全的方法，通过服用HD5多肽能够有效地增加内源性益生菌来获得生理平衡。
实施例24
服用合成的人源潘氏细胞防御肽(HD5)能够抑制肝脏螺旋杆菌(Helicobacterhepaticus)在小肠中异位上升。
BalB/C6小鼠给予维生素D缺乏的高脂肪饲养18周，然后通过灌胃给予合成的DEFA5/HD5，在25天内给予4次，每次10微克/0.1毫升；对照为生理盐水。小鼠在10天后处死以收集标本。如图24A所示，给予防御肽HD5能够降低在小肠中的致病菌能够抑制肝脏螺旋杆菌(Helicobacter hepaticus)。然后在体外实验中我们测定了DEFA5对能够直接抑制肝脏螺旋杆菌(Helicobacter hepaticus)的生长(图24B)。于此，我们认为给予HD5多肽能够抑制肠道细菌异位上升，从而降低内毒素入血，降低系统炎症，恢复胰岛素敏感性。
实施例25
潘氏细胞外分泌的防御肽的制备。
Alpha-defensin 5(DEFA5):ATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR(SEQ ID NO：1),其3位与31位，5位与20位，10位与30位的半胱氨酸之间有3对二硫键；Alpha-defensin 6(DEFA6):
AFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL(SEQ ID NO：2)，所述的结构关键的氨基酸序列通式如下：xxCxCRxxRCxxxExxxGxCxx(x)GxxxxxCCx。
其结构中的精氨酸(R)残基以及多个疏水氨基酸残基以及二硫键对其活性至关重要。可以理解，本发明的方案也包含对上述防御素结构的各种衍生物的改建，例如对N-末端以及C-末端氨基酸残基的化学修饰及保护，包括以D-型氨基酸来替代L-型氨基酸，以及将HD5或者HD6多肽其N-端与其C-端连接以形成环形多肽，以此化学修饰来获得对细菌毒素包括细菌脂多糖内毒素以及其它病原体的亲和结合能力，也能够增加对细菌以及病毒核酸的结合与抑制，同时增加多肽的稳定性，这是治疗应用的核心。
实施例26
潘氏细胞外分泌的防御肽的制备。
通过固相合成方法制备DEFA5或者DEFA6链；然后通过3部分控制氧化反应以形成3对特异二硫键桥。作为示例所述肠道防御肽例如肠道防御肽5(DEFA5)以及肠道防御肽6(DEFA6)能够与其它药物制剂配合使用，例如可以与维生素D联合使用，例如与25-羟基VD3配伍；维生素D衍生物能够提升肠道固有免疫系统；维生素D信号也能够促进HD5以及HD6在潘氏细胞中的表达，以此维持肠道微生态平衡，提升以上所述疾病的疗效。
实施例27
潘氏细胞外分泌的防御肽(HD5/HD6)的基因工程制备方法。
人源HD5多肽可以通过基因工程的方法来表达。将以下序列的DNA片段转载在真核生物表达系统质粒，可以在酵母或者来自于动物细胞的系统中来生产，其产品的特征为具有正确空间结构以及三对二硫键的成熟多肽，具有天然防御肽的结构以及生物功能和治疗功能。
编码HD5序列如下(SEQ ID NO：3):
acatatccactcctgctctccctcctgcaggtgaccccagccatgaggaccatcgccatccttgctgccattctcctggtggccctgcaggcccaggctgagtcactccaggaaagagctgatgaggctacaacccagaagcagtctggggaagacaaccaggaccttgctatctcctttgcaggaaatggactctctgctcttagaacctcaggttctcaggcaagagccacctgctattgccgaaccggccgttgtgctacccgtgagtccctctccggggtgtgtgaaatcagtggccgcctctacagactctgctgtcgctgagcttcctagatagaaaccaaagcagtgcaagattcagttcaaggtcctgaaaaaagaaaaacattttactctgtgtaccttgtgtctttctaaatttctctctccaaaataaagttcaagcattaaa
同样，人源HD6多肽可以通过基因工程的方法来表达。将以下序列的DNA片段转载在真核生物表达系统质粒，可以在酵母或者来自于动物细胞的系统中来生产，其产品的特征为具有正确空间结构以及三对二硫键的成熟多肽，具有天然防御肽的结构以及生物功能和治疗功能。
编码HD5序列如下(SEQ ID NO：4)：
acacatctgctcctgctctctctcctccagcgaccctagccatgagaaccctcaccatcctcactgctgttctcctcgtggccctccaggccaaggctgagccactccaagctgaggatgatccactgcaggcaaaagcttatgaggctgatgcccaggagcagcgtggggcaaatgaccaggactttgccgtctcctttgcagaggatgcaagctcaagtcttagagctttgggctcaacaagggctttcacttgccattgcagaaggtcctgttattcaacagaatattcctatgggacctgcactgtcatgggtattaaccacagattctgctgcctctgagggatgagaacagagagaaatatattcataatttactttatgacctagaaggaaactgtcgtgtgtcctatacattgccatcaactttgtttcctcatctcaaataaagtcctttcagcaa
实施例28
潘氏细胞外分泌的防御肽HD5以及HD6的应用方法。
作为示例上述肠道防御肽例如HD5以及HD6能够采用口服给药，以及鼻腔喷雾给药，其它药物制剂配合使用，包括肠道缓释剂，稳定剂，以及多种剂型的联合应用。
实施例29
防御肽HD5以及HD6或者衍生物的应用剂量。
HD5也发现在人乳中，在人的初乳中HD5含量高达2.4mg/L。此外，通过动物实验我们发现小鼠的治疗剂量。于此，我们有理由地推测作为疾病预防以及治疗的安全剂量为2mg/天到100mg/天。当然也包括其中的各种安全剂量。具体的剂量需要通过大动物以及临床试验来确定。
实施例30
潘氏细胞外分泌的防御肽的制备。
alpha防御素5(hDEFA5):ATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR，3位和31位，5位和20位，10位和30位半肮氨酸之间有3个二硫键；
alpha防御素6序列结构为：
alpha防御素6(hDEFA6):AFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL，4位和31位，6位和20位，10位和30位半肮氨酸之间有3个二硫键。
alpha防御素5或alpha防御素6的衍生物为：
对alpha防御素5或alpha防御素6的一级结构进行数个氨基酸缺失、增加；或数个结构或性质类似的氨基酸的替换；或alpha防御素5或alpha防御素6的一级结构进行糖基化，乙酰化，磷酸化，羧基化等修饰，所述衍生物在功能上能够保持或提高天然多肽生理活性，并且具有极低毒理及生理副作用。
HD5(DEFA5)以及HD6(DEFA6)制备的第一阶段的具体步骤为：
(1)掺入氨基酸残基的序列依照人源序列设计，
DEFA5的序列为：ATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR；
DEFA6的序列为：AFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL；
(2)制备的侧链残基(side chains)的保护方法：
对于谷氨酸，苏氨酸和酪氨酸，色氨酸，应用o-tbutyl，tBoc(叔丁氧羰基)；
对于精氨酸，应用n-2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulphonyl；
对于N和C端的半胱氨酸，应用三苯甲基；
对于cys-3和cys-20，我们应用s-tbutyl；
对于cys-10和cys-30，我们应用乙酰氨基(ACM)；
(3)受保护的肽基树脂，经过90％TFA含有二氯甲烷，硫醚和二硫化物处理；
(4)按照HD5或者HD6的序列依次连接当氨基酸，并将合成完毕的肽段从树脂上裂解，获得线性肽粗品，经过TFA处理，N-和C-末端的半胱氨酸残基的S-三苯甲基保护组保护在同时被剪除，而肽链从树脂上裂解下来，而ACM和s-tbutyl保护的cys-3、cys-20、cys-10及cys-30的保护不变；
(5)用反相高效液相色谱法，对线性肽进行分离，用含TFA的乙腈水进行线性梯度洗脱，将高峰汇集，冻干并进行氨基酸序列分析，确定合成完毕的肽序列；
第二阶段的具体步骤为：
(1)Cys3与Cys31半胱氨酸残基之间的二硫键形成：
上述含游离巯基的Cys3和Cys31的线性DEFA5悬浮于在水中；
加入乙酸铵溶液调整pH至6.8，然后加入过量的铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])以确保氧化，将溶液的pH通过0.2M的乙酸铵和乙酸保持在6.8-7.0；
将溶液浓缩至小体积，然后用活化的硫醇-琼脂糖4B树脂柱除去含有游离硫醇基的肽段；
用乙酸铵缓冲液(pH6.8)对柱中的肽进行洗脱，将肽水溶液合并，冻干；
将干燥的物质应用反相HPLC纯化，将主峰合并，冷冻干燥，进行氨基酸和序列分析，通过测序，质谱分析证实正确的序列；
(2)Cys-3与Cys-20半胱氨酸残基之间的二硫键：
将上述纯化的线性DEFA5溶于三氟乙醇(trifluoroethanol)，通过还原反应，以三丁基膦(tri-butylphosphine)脱去S-叔丁基团上Cys3以及Cys20残基上的保护基团(方案如图6)；
反应混合物浓缩至小体积，通过加入乙醚使产物沉淀；
将分离的固体过滤并用乙醚洗涤，并干燥；
将干燥的制备物悬浮于水中，然后使用铁氰化钾，在pH6.8进行氧化，经过分离，干燥后，对所得的材料以反相HPLC进行分离；
对主要峰的级分合并，分析氨基酸的组成及序列，用质谱分析鉴定；
(3)Cys10与Cys30半胱氨酸残基之间的二硫键：
以上述肽溶于水/甲醇的混合物(5:1)中，然后滴加碘/甲醇中的溶液，至红色溶液产生，并冷却至0℃；
用1M硫代硫酸钠处理，直到红色消失，将甲醇通过旋转蒸发除去，然后将获得的材料冻干；
将粗物质溶解在水中，并通过硫醇-琼脂糖柱进行分离：将柱用0.1M乙酸铵缓冲液，pH6.5洗涤，将水溶液冷冻干燥，将干燥的物质用反相HPLC纯化，所有馏分被汇集，并冻干；
通过测定序列，光谱和氨基酸分析。合成肽的质量可以通过比较其HPLC保留时间，CD谱和质谱进行评估。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 成都施桂行医药科技有限责任公司
<120> 防御肽及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg
20 25 30
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu
20 25 30
<210> 3
<211> 454
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acatatccac tcctgctctc cctcctgcag gtgaccccag ccatgaggac catcgccatc 60
cttgctgcca ttctcctggt ggccctgcag gcccaggctg agtcactcca ggaaagagct 120
gatgaggcta caacccagaa gcagtctggg gaagacaacc aggaccttgc tatctccttt 180
gcaggaaatg gactctctgc tcttagaacc tcaggttctc aggcaagagc cacctgctat 240
tgccgaaccg gccgttgtgc tacccgtgag tccctctccg gggtgtgtga aatcagtggc 300
cgcctctaca gactctgctg tcgctgagct tcctagatag aaaccaaagc agtgcaagat 360
tcagttcaag gtcctgaaaa aagaaaaaca ttttactctg tgtaccttgt gtctttctaa 420
atttctctct ccaaaataaa gttcaagcat taaa 454
<210> 4
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acacatctgc tcctgctctc tctcctccag cgaccctagc catgagaacc ctcaccatcc 60
tcactgctgt tctcctcgtg gccctccagg ccaaggctga gccactccaa gctgaggatg 120
atccactgca ggcaaaagct tatgaggctg atgcccagga gcagcgtggg gcaaatgacc 180
aggactttgc cgtctccttt gcagaggatg caagctcaag tcttagagct ttgggctcaa 240
caagggcttt cacttgccat tgcagaaggt cctgttattc aacagaatat tcctatggga 300
cctgcactgt catgggtatt aaccacagat tctgctgcct ctgagggatg agaacagaga 360
gaaatatatt cataatttac tttatgacct agaaggaaac tgtcgtgtgt cctatacatt 420
gccatcaact ttgtttcctc atctcaaata aagtcctttc agcaa 465

Claims (13)

1.一种防御肽，其特征在于，所述防御肽为：
氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的多肽；
或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的多肽具有同源性，且具有相同生物活性的多肽；
或由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的多肽经化学修饰、保护、首尾连接成环或多个氨基酸的缺失、替代或增加得到，且具有相同生物活性的多肽。
2.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段编码权利要求1所述的防御肽。
3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有编码权利要求1所述的防御肽的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于，其基因组中含有权利要求2或3所述的DNA片段。
6.权利要求1所述的防御肽、权利要求2或3所述的DNA片段、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备用于平衡肠道微生态或治疗肠道菌群紊乱相关疾病的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述防御肽通过干预细菌群体感应系统以平衡肠道微生态，且能够促进肠道内源益生菌的丰度，也能够抑制多种肠道条件致病菌，可以用于治疗肠道菌群紊乱以及病源相关分子模式物导致的组织损伤以及器官衰竭和因肠道菌群紊乱导致的代谢疾病。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肠道菌群紊乱相关疾病包括2型糖尿病、肥胖、脂肪肝病、代谢综合征、肝衰竭和肝损伤。
9.一种权利要求1所述的防御肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过固相合成方法制备所述防御肽；或
通过权利要求5所述的宿主细胞进行基因表达制备所述防御肽。
10.一种药物，其特征在于，包括权利要求1所述的防御肽和药学上可接受的辅料。
11.根据权利要求10所述的药物，其特征在于，所述辅料包括肠道缓释剂以及稳定剂。
12.根据权利要求10所述的药物，其特征在于，还包括维生素D和25-羟基维生素D3中的一种或多种。
13.根据权利要求10所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为口服制剂、喷雾制剂或注射制剂。
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