CN117186243A - 猪白细胞介素15，21和23共表达生物制剂材料及应用 - Google Patents
猪白细胞介素15，21和23共表达生物制剂材料及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及猪白细胞介素15，21和23共表达生物制剂材料及应用，涉及生物技术领域，本发明提供了一种融合蛋白，包括猪白细胞介素15，猪白细胞介素21和猪白细胞介素23，由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。编码融合蛋白的核酸分子。具有所述核酸分子的表达盒、重组载体、转染细胞、重组微生物、所述转基因细胞系的培养产物或所述重组微生物的发酵产物的生物制剂材料。本发明通过基因重组、融合猪白细胞介素15，21和23基因，将其连接到真核表达平台获得融合蛋白，发现融合表达的IL‑15，21和23具有显著的增强动物的粘膜免疫屏障机能，增强其全身免疫水平和抗细菌感染能力，促进动物生长发育的良好生物学效应。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及猪白细胞介素15，21和23共表达生物制剂材料及应用。
背景技术
大量的抗生素在生猪的养殖过程中作为饲料添加剂促进动物生长和提高抗病力而广泛使用，我国每年生产约20多万吨抗生素，其中52％以上用于动物养殖业抗病促生长；多年的使用造成耐药菌大量产生，极大威胁人类健康。其中，具有多重耐药特性的沙门氏菌(Salmonella)及具有甲氧西林耐药特性的金黄色葡萄球菌(Methicilin-resistantStaphylococus aureus，MRSA)、具有超广谱β-内酰胺抗性的细菌、具有碳青霉烯抗性的肠杆菌科细菌及铜绿假单胞菌受到人们的关注。《2021年全国细菌耐药监测报告》发布的数据显示，全国范围内MRSA的平均检出率为29.4％，大肠杆菌对碳青霉烯类药物的平均耐药率为1.6％，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的平均耐药率为17.7％。这表明动物疾病的防治已经越来越接近无药可用的境地。
采用生物防控技术替代抗生素的疗法，对于牲畜和人类疾病的防治，遏制抗生素耐药菌的流行趋势至关重要。
牲畜疫病亦可以通过提升牲畜的免疫力得到防治。而细胞因子在调控动物免疫力方面具有极为重要的作用。因此，采用细胞因子治疗有望替代抗生素提高动物疫病的防治效果。鉴于此，本发明提供猪白细胞介素15，21和23共表达生物制剂及应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供猪白细胞介素15，21和23共表达生物制剂材料及应用。目的是替代抗生素提高动物疫病的防治效果。
本发明为了解决上述技术问题，第一方面提供一种融合蛋白，包括猪白细胞介素15、猪白细胞介素21和猪白细胞介素23，所述融合蛋白为下述的(a1)至(a4)中的任一项：
(a1)由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成蛋白质；在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中，第1-329位猪白细胞介素IL-23p40亚基，第330-332位为连接肽(GSG)，第333-350位为T2A自剪接肽，第351-365位为分泌信号肽，第366-564位为猪白细胞介素IL-23p19，第565-567位为连接肽(GSG)，第568-585位为T2A自剪接肽，第586-600位为分泌信号肽，第601-758位为猪白细胞介素IL-21，第659-761位为连接肽(GSG)，第762-779位为T2A自剪接肽，第780-794位为分泌信号肽，第781-962位为猪白细胞介素IL-15。
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质；
(a3)与(a1)具有80％以上，85％以上，90％以上，95％以上，98％以上，或99％以上同一性且具有提高动物免疫力功能的蛋白质；
(a4)将(a1)所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代，和/或缺失，和/或添加且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
第二方面提供一种核酸分子，所述核酸分子编码如上述所述融合蛋白。
进一步，所述核酸分子为下述的(b1)至(b3)中的任一项：
(b1)由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组核酸分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的核酸分子杂交且编码上述融合蛋白的核酸分子；
(b3)与(b1)限定的核酸分子至少具有80％以上，85％以上，90％以上，95％以上，98％以上，或99％以上同源性且编码上述融合蛋白的核酸分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
第三方面提供一种生物制剂材料，所述生物制剂材料为下述(c1)至(c6)中的任一种：
(c1)含有上述所述核酸分子的表达盒；所述表达盒，是指能够在宿主细胞中表达如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
(c2)含有上述所述核酸分子的重组载体；所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体，具体可以为pINA1297载体。
(c3)含有上述所述核酸分子的转基因细胞系；所述转基因细胞系具体可为将所述重组载体转染哺乳动物得到的转基因细胞系。
(c4)含有上述所述核酸分子的重组微生物；所述重组微生物具体可为将所述重组载体或所述重组载体的线性化片段导入微生物得到的重组微生物。所述微生物可为为酵母、细菌、藻类或真菌。所述酵母具体可为解脂耶氏酵母Po1h株。
(c5)所述转基因细胞系的培养产物；
(c6)所述重组微生物的发酵产物。
所述转基因细胞系的培养产物或所述重组微生物的发酵产物，可按照包括如下步骤的方法制备：培养所述转基因细胞系或所述重组微生物，使编码基因表达，得到所述转基因细胞系的培养产物或所述重组微生物的发酵产物。例如所述转基因细胞系的培养产物为其表达的上清液；所述重组微生物的发酵产物可为其发酵液的上清液。
第四方面提供如上述所述融合蛋白，如上述所述核酸分子或如上述所述生物材料在制备提高动物免疫能力的产品中的应用。
进一步，所述提高动物免疫能力为下述(d1)至(d8)中的至少一种：
(d1)促进效应靶动物的细胞免疫和/或体液免疫；
(d2)促进效应靶动物免疫屏障的建立；
(d3)促进动物发育和生长；
(d4)促进动物免疫细胞的增加；
(d5)促进动物细胞免疫和体液免疫；
(d6)促进动物粘膜免疫屏障的建立；
(d7)抗致病微生物感染；
(d8)促进疫苗诱导的免疫应答。
进一步，所述免疫细胞为淋巴细胞(如T淋巴细胞或B淋巴细胞)、红细胞或白细胞；所述致病微生物具体为鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。上述免疫之后产生的抗体为IgG和sIgA。
进一步，所述动物为猪或小鼠。
第五方面提供一种产品，包括如上述所述融合蛋白，如上述所述核酸分子，或如上述所述生物制剂材料。
所述产品，可以融合蛋白，核酸分子，生物制剂材料为活性成分，还可以将它们与其他可以提高动物免疫能力的物质组合在一起的组合物为活性成分；另外还可以添加产品上可接受的载体和/或辅料。
进一步，所述产品为疫苗或生物制剂。所述疫苗具体可为针对上述致病微生物的疫苗。所述生物制剂材料为提高动物的免疫能力，治疗上述致病微生物导致的疾病的生物药物。
第六方面提供一种提高动物免疫能力的方法，包括如下步骤：对动物施用所述产品，提高所述动物的免疫能力；所述产品包括如上述所述融合蛋白，如上述所述核酸分子，或如上述所述生物材料。
实验证明，本发明的融合蛋白IL-15/21/23分子及含有IL-15/21/23基因的重组酵母的发酵产品具有以下作用：(1)施用重组酵母(Po1h-pINA1297-IL-15/21/23)培养液，显著提高淋巴母细胞增殖；(2)在沙门氏菌攻毒组中，重组酵母培养液处理后的隐窝深度相对对照组及空白对照组均有极显著提高，说明重组酵母培养液可能会提高肠道隐窝的生长速率以应对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)对肠道组织的破坏；(3)在面临金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)急性感染时，结果显示重组酵母培养液处理后组小鼠的IFN-γ及IL-15在mRNA水平上的表达量相较于空白对照组无显著改变，IL-7、IL-22、IL-23、TNF-α表达水平均较空白对照组显著提高；(4)T淋巴细胞分化情况，与空白组和对照组相比，第7天时，重组酵母培养液处理后小鼠中细胞毒性T细胞、初始T细胞、中央记忆T细胞(Central Memory T cell,TCM)的比例明显升高；辅助性T细胞(Helper T cell，TH)、初始T细胞、TCM在第14天的比例有明显升高，调节性T细胞(Regulatory cell,Treg)在7-28天显著降低，外周血的效应记忆T细胞(EffectorMemory T cell,TEM)和效应T细胞(Effector T cell，Teff)比例无显著差异。(4)B淋巴细胞分化情况，显示重组酵母处理组的小鼠相较于对照组在第14天具有更高的浆细胞、转换记忆B细胞(Class-switched memory B cell,BSM)、非转换记忆B细胞(Non-switched memoryB cell,BNM)比例；(5)重组酵母处理组的小鼠能更显著地提高小鼠血浆IgG及肠道sIgA分泌水平。
本发明通过基因重组、融合猪白细胞介素15，21和23基因，将其连接到真核表达平台获得融合蛋白，进一步研究融合蛋白的免疫调节效应和其诱导小鼠抗感染活性的生物学效应研究。发现融合表达的IL-15，21和23具有显著的增强动物免疫屏障机能，增强其全身免疫水平和抗细菌感染能力。
附图说明
图1为本发明实施例1中的电泳进行验证图；
图2为本发明实施例2猪淋巴细胞的增殖活性检测图；
图3为本发明实施例3小鼠体重变化图；
图4为本发明实施例3攻毒14天后各组小鼠小肠组织切片统计图；
图5为本发明实施例3攻毒后小鼠小肠组织中免疫相关基因表达水平的变化图；
图6为本发明实施例3小鼠外周血中T淋巴细胞分化情况图；
图7为本发明实施例3小鼠外周血中B淋巴细胞分化情况图；
图8为本发明实施例3攻毒前后小鼠血浆中IgG，及粪便中sIgA含量变化图；
图9为本发明实施例3小鼠攻毒后生存曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。重组质粒均已进行测序验证。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的昆明小鼠：四川大学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(川)2018-026。川藏黑猪：四川省畜牧科学院养猪研究所产品。100×青链霉素混合液：HyClone公司。pINA1297载体(vector pINA1297)和解脂耶氏酵母Po1h株均为法国农业科学院Madzak教授惠赠，均记载于如下文献：Madzak C,Gaillardin C,BeckerichJM.Heterologous protein expression and secretion in the non-conventionalyeast Yarrowia lipolytica:a review.J Biotechnol.2004Apr8；109(1-2):63-81.doi:10.1016/j.jbiotec.2003.10.027.PMID:15063615。
实施例1：融合蛋白IL--15/21/23编码基因的设计和重组解脂耶氏酵母的构建及体外活性研究一、融合蛋白IL-15/21/23编码基因设计和重组载体的构建
从GenBank中获取猪(Sus scrofa)的IL-15(Sequence ID：NM_214390.1)、IL-21(Sequence ID：NM_214415.1)、IL-23p40(Sequence ID：NM_214013.1)、IL-23p19(SequenceID：NM_001130236.1)基因序列。
选择柔性肽序列GSG、口蹄疫病毒自剪接2A短肽序列(P2A)、酵母分泌型信号肽序列(XRP2Pre)作为融合基因元件，将去掉原有信号肽和终止密码子的猪IL-23p40、IL-23p19、IL-21和IL-15基因使用各元件进行连接，融合序列两端分别设计BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点，以连接穿梭载体质粒pINA1297。参考毕赤酵母的密码子偏好优化上述融合基因，使得重组基因能在Y.lipolytica细胞内正常表达。重组基因各元件序列见表1。
得到的融合基因结构如下：
BamH Ⅰ-IL23p40-6×His-GSG-P2A-XPR2 pre-IL23p19-6×His-GSG-P2A-XPR2pre-IL21-4GSG-IL15-6×His-Kpn Ⅰ。
表1重组基因元件序列
融合基因命名为IL-15/21/23，序列如SEQ ID NO：2所示，其长度为2889bp，其中IL-15的蛋白分子量为18.44kDa；IL-21的蛋白分子量为17.58kDa；IL-23p40亚基的蛋白大小为336.83kDa，IL-23p19的蛋白大小为21.14kDa。在SEQ ID NO：2所示的核苷酸的序列中，第1-987位为猪白细胞介素IL-23p40亚基，第988-996位为连接肽(GSG)，第997-1050位为T2A自剪接肽，第1051-1095位为分泌信号肽，第1096-1692位为猪白细胞介素IL-23p19，第1693-1701位为连接肽(GSG)，第1702-1755位为T2A自剪接肽，第1756-1800位为分泌信号肽，第1801-2274位为猪白细胞介素IL-21，第2275-2283位为连接肽(GSG)，第2284-2337位为T2A自剪接肽，第2338-2382位为分泌信号肽，第2383-2889位为猪白细胞介素IL-15。
将融合基因IL-15/21/23构建到自克隆穿梭载体pINA1297上，得到Po1h-pINA1297-IL-15/21/23。融合基因IL-15/21/23的合成及自克隆穿梭载体的构建均委托南京金斯瑞生物技术有限公司完成。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果见图1。泳道1-8：经BamH I and Kpn I酶切后的pINA1297质粒；泳道M：DL 5000DNA marker。可见插入的IL-15/21/23基因大小约为2900bp，与设计相符。
融合蛋白IL-15/21/23的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中，第1-329位猪白细胞介素IL-23p40亚基，第330-332位为连接肽(GSG)，第333-350位为T2A自剪接肽，第351-365位为分泌信号肽，第366-564位为猪白细胞介素IL-23p19，第565-567位为连接肽(GSG)，第568-585位为T2A自剪接肽，第586-600位为分泌信号肽，第601-758位为猪白细胞介素IL-21，第659-761位为连接肽(GSG)，第762-779位为T2A自剪接肽，第780-794位为分泌信号肽，第781-962位为猪白细胞介素IL-15。
二、重组穿梭载体转化大肠杆菌及鉴定
1、重组穿梭载体转化大肠杆菌
(1)取大肠杆菌(E.coli)感受态细胞Top10(购于上海唯地生物)，冰上解冻，每100μL解冻的感受态细胞加入1μL(10-100ng)重组穿梭载体Po1h-pINA1297-IL-15/21/23，混匀后冰浴30min；
(2)42℃热激60s，立即冰浴5min，感受态细胞和重组穿梭载体混合物中加入0.8mL的Luria-Bertani(LB)培养基，37℃摇床中培养1h，随后6000r/min离心3min，去掉上清(留约200μL的液体)，悬浮菌体沉淀；
(3)用一次性涂布棒将菌液均匀涂布在含20μg/mL卡那霉素(Kana)的LB固体培养基上，正置培养30min后，37℃倒置过夜培养，第二天观察结果。
2、阳性克隆的筛选和鉴定
(1)从Kana抗性阳性转化子中通过菌落PCR和测序鉴定出带有融合基因IL-15/21/23插入片段的克隆菌落；
(2)菌落PCR鉴定阳性克隆，用无菌吸头随机挑取Kana抗性平板中长出的阳性转化子于PCR管，管内配制25μL PCR反应体系，按照表2加入PCR体系(引物序列见表3)，瞬离混匀，再按照表4设置PCR仪循环程序进行PCR。
表2菌落PCR体系
| 反应物 | 体积(μL) |
| ddH2O | 18.5 |
| Buffer | 2.5 |
| MgCl2 | 1.5 |
| 4×dNTP | 1 |
| 引物1 | 0.5 |
| 引物2 | 0.5 |
| Taq酶 | 0.5 |
| 菌落 | 1个单菌落 |
| 总计 | 25 |
表3 PCR引物
| 编号 | 引物名-大小 | 序列 |
| 引物1 | Q-F-4420bp | ATCCATGCATCTTCAACAGCTAGTA |
| 引物2 | Q-R-4420bp | GGTACCTCAATGGTGGTGGTG |
表4 PCR程序
PCR反应结束后，取9μL扩增产物混合1μL 10×Load ing Buffer进行1％琼脂糖凝胶电泳。经菌落PCR鉴定为阳性的重组子委托北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序结果采用DNAMAN软件(version 6.0)进行比对。
三、重组解脂耶氏酵母的构建
1、重组质粒Po1h-pINA1297-IL-15/21/23的制备及线性化
(1)将上述中获得的阳性重组大肠杆菌接种于5mL含3μg/L Kana的LB液体培养基中，37℃摇床培养12-16h；
(2)取1.0-5.0mL的菌液，室温下10000×g离心1min收集菌体；
(3)参照Plasmid DNA Mini Kit I(Omega Bio-Tek,U.S.)试剂盒说明书提取Po1h-pINA1297-IL-15/21/23重组质粒；
(4)将提取的质粒保存在-20℃条件备用；
(5)将得到的重组质粒Po1h-pINA1297-IL-15/21/23使用Not Ⅰ限制性内切酶进行线性化处理，按照表5配置单酶切体系，离心管内添加各试剂后，瞬时离心混匀，37℃恒温条件下反应3h。
表5酶切体系
| 成分 | 体积(μL) |
| Not Ⅰ | 2.5 |
| 10×Quick Buffer | 5 |
| 线性化重组质粒 | 1(μg) |
| ddH2O | 42.5-V质粒 |
| 总体积 | 50 |
2、解脂耶氏酵母Po1h感受态细胞的制备及转化
参照Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit(Zymo Research,Germany)试剂盒说明书制备解脂耶氏酵母Po1h感受态细胞并转化pINA1297-IL-15/21/23重组质粒。
(1)酵母细胞的制备
使用10mL YPD液体培养基在30℃下培养重组酵母细胞直到OD600＝0.8-1.0。下面的步骤在室温下完成。
①将培养液在500×g下离心4min，弃去上清液；
②加入10mL Frozen-EZ Yeast Solution 1来清洗细胞，洗净细胞并弃去上清液；
③加入1mL Frozen-EZ Yeast Solution 2来重新悬浮细胞。
(2)转化
①将50μL上述悬浮细胞与0.2-1μg pINA1297-IL-15/21/23重组质粒混合。加入500μL Frozen-EZ Yeast Solution 3并充分混合；
②在30℃下孵育45min，用手指轻弹或涡旋的方式大力混合。在孵育过程中，用手指轻弹或涡旋2次；
③将50-150μL的上述转化混合物涂布于尿嘧啶缺陷型SD平板(北京宝日医生物有限公司)；
④将涂布好的尿嘧啶缺陷型SD平板在30℃下倒置培养5-7天。
3、阳性克隆的筛选与鉴定
(1)重组子通过在尿嘧啶缺陷型SD平板上进行筛选，挑取平板上阳性单菌落得到转化成功的阳性重组子；
(2)按照表2中描述的体系及表3中的PCR程序进行菌落PCR和1％琼脂糖凝胶电泳，以鉴定阳性克隆。得到Po1h-pINA1297-IL-15/21/23菌株；
(3)经菌落PCR鉴定为阳性的重组菌送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序结果采用DNAMAN软件(version 6.0)进行比对；
(4)按照相同方法可将空载体pINA1297转化至解脂耶氏酵母Po1h细胞中，得到空载体解脂耶氏酵母Po1h-pINA1297菌株。
四、融合蛋白IL-15/21/23基因在解脂耶氏酵母中的表达及体外活性研究
1、ELISA检测Po1h-pINA1297-IL-15/21/23蛋白质水平的表达
使用武汉华美生物工程有限公司购买的猪IL-15、IL-23 ELISA试剂盒使用直接法对Po1h-pINA1297-IL-15/21/23蛋白质水平的表达进行检测，然后通过测量样品OD450与标准曲线对照得出融合细胞因子蛋白质表达水平。使用竞争抑制法对Po1h-pINA1297-IL-15/21/23培养液中组氨酸标签蛋白含量进行检测。
结果见表6。重组酵母Po1h-pINA1297-IL-15/21/23的培养上清中检测到目的蛋白的表达。其中猪IL-15，IL-23和组氨酸标签含量分别为14923.5pg/ml,14392.5pg/ml,56.94ng/ml空载酵母Po1h-pINA1297的培养上清中没有检测到相应目的蛋白表达。
表6 ELISA检测融合蛋白表达水平结果
实施例2：重组酵母分泌表达的目的蛋白对靶细胞的效应
1、猪淋巴细胞的分离
无菌条件下采集猪前腔静脉外周血5mL，加入EDTA-2K抗凝，按照天津灏洋华科生物科技有限公司淋巴细胞分离液说明书分离猪淋巴细胞。
将分离到的细胞用完全1640培养液(含10％小牛血清，100μg/mL氨卞青霉素，100μg/mL链霉素)稀释至细胞终浓度2×106个/mL，分至直径为10cm的细胞培养皿中，每皿10mL，最后再加入终浓度为10μg/mL的刀豆蛋白A(Concanavalin A，Con A)进行刺激，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。
2、Po1h-pINA1297-IL-15/21/23对猪淋巴细胞的增殖活性检测-CCK-8法
使用北京聚合美生物科技有限公司提供的CCK-8细胞增殖与活性检测试剂盒对重组蛋白调控淋巴细胞增殖活性进行检测。
(1)将分离到的猪淋巴细胞培养24h后，将培养皿中细胞收集至干净的离心管中，500×g离心15min收集细胞；用1640完全培养基(含双抗与血清)洗细胞2次，500×g离心15min；用含20mg/mLα-MM的1640培养基调整细胞至约6×106个/mL；
(2)向培养板加入10μL Po1h-pINA1297-IL-15/21/23培养上清液及Po1h-pINA1297上清液；
(3)将培养板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育48h；
(4)每孔加入10μL的CCK-8溶液；
(5)在细胞培养箱内继续孵育4h；
(6)用Bio-Reader680酶标仪测定在450nm处的吸光度。
结果见图2。使用CCK-8试剂盒(购于翌圣生物)对重组酵母Po1h-pINA1297-IL-15/21/23培养液上清促进猪淋巴母细胞增殖的能力进行检测，发现Po1h-pINA1297-IL-15/21/23培养液较空载组PBS和空白对照组Po1h-pINA1297显著提高淋巴母细胞增殖(P<0.05)，说明重组蛋白具有生物学活性。
实施例3：融合蛋白IL-15/21/23在小鼠体内的生物学活性研究
一、重组酵母发酵液的制备
将Po1h-pINA1297和Po1h-pINA1297-IL-15/21/23划线接种于YPD平板(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖和15g/L琼脂)上，置于恒温培养箱中28℃静置培养48小时。然后挑取单个菌落接种到1L YPD液体培养基(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨和20g/L葡萄糖)，置于空气浴振荡培养箱中28℃，200rpm振荡培养24小时。将过夜培养物(100mL)以1％(v/v)比例接种到含有1L YPD液体培养基的2L摇瓶中，置于振荡培养箱中28℃，200rpm振荡培养48小时。
二、小鼠实验处理方案
1、小鼠分组
将30只4-5周龄、体重约为18克的健康雌性昆明鼠随机分成编号为C、R、Q的3组，每组10只。C组为PBS处理对照组，R为空白质粒对照组，Q组为实验组。
2、小鼠接种处理
在保证小鼠充足食物、水源等基础生活条件的情况下，C组小鼠每3天1次使用0.1mL PBS经灌胃饲喂，R组小鼠每3天1次使用0.1mL Po1h-pINA1297空载酵母培养液经灌胃饲喂(4×108CFU/只/次)，Q组小鼠每3天1次使用0.1mL Po1h-pINA1297-IL-15/21/23培养液经灌胃饲喂(4×108CFU/只/次)。第一次灌胃记为第0天，免疫28天共灌胃10次。第28天进行攻毒实验。
三、小鼠攻毒实验
小鼠免疫程序第28天时，取0.3mL 1×109CFU/ml的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC25923)和0.3mL 1×109CFU/ml鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(ATCC14028)LB培养液灌胃小鼠。每组中10只小鼠，各随机选取5只灌胃不同攻毒菌株。
四、样品及数据采集
连续4周每周一次对小鼠体重进行测量，在整个实验进程中每天观察并记录小鼠存活情况。分别于免疫后的第28天以及攻毒后第3天，收集1g粪便用ELISA检测sIgA。
分别于免疫后的第7、14、21、28天以及攻毒后第3天，从小鼠尾静脉割尾采集外周血，每只采集100μL外周血并与10μL抗凝剂(SolarBio，IH1440)混合。攻毒处理第14天时，处死剩余小鼠，收集小肠组织，置于液氮中保存备用。采集血液样本，用于免疫细胞的流式细胞术及血常规分析；离心后采集血浆，在-80℃保存备用。
1、流式细胞术分析小鼠外周血中免疫细胞的变化
(1)将采集的150μL小鼠尾静脉抗凝血转移至流式管中，每150μL血加入3ml红细胞裂解液(SolarBio，R1010)，室温孵育20min；
(2)孵育后的血细胞溶液500g，升降速设置为第9档，4℃离心10min，弃红色上清，细胞沉淀用3ml PBS溶液重悬洗涤一次，相同条件继续离心一次，弃上清，细胞沉淀用100μLPBS溶液重悬；
(3)在100μL样品中加入每种流式抗体1μL，4℃避光孵育30min(抗体选择方案见表7)；
(4)孵育完成的细胞样品中加入3ml PBS溶液洗涤一次，500g，升降速设置为第9档，4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀用100μL PBS溶液重悬；
(5)B细胞组重悬为200μL细胞悬液后可以直接上机分析；
(6)T细胞组需进行固定破膜程序对胞内标记蛋白Foxp3进行染色。每管100μL细胞样品充分重悬混匀后加入1ml 1×Fix/Perm固定液4℃避光孵育40min(BD，Pharmingen转录因子缓冲液套装，562574)；
(7)孵育完成后，每管加入1ml 1×Perm/Wash洗涤液洗涤一次，500g，升降速设置为第9档，4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀用100μL PBS溶液重悬。
(8)每管100μL细胞样品中加入1μL FOXP3流式抗体4℃避光孵育30min。
孵育完成后，每管加入2ml 1×Perm/Wash洗涤液洗涤一次，500g，升降速设置为第9档，4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀用200μL PBS溶液重悬后便可上机分析(圈门逻辑见表8为)。
表7流式抗体配色方案
表8流式细胞术划门逻辑
2、荧光定量PCR分析小鼠PBC及攻毒前后小肠组织免疫相关基因的变化
(1)小鼠外周血细胞(peripheral blood cell,PBC)及小肠组织总RNA的提取
①血液样品：在第7、14、28天及攻毒后第3天采集C组、R组、Q组每只小鼠尾静脉血200μL，加入EDTA抗凝；
②小肠样品：将第42天处死后的小鼠新鲜小肠组织经液氮速冻后，迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显可见颗粒)。
(2)RNA的提取
使用诺唯赞生物科技有限公司提供的RNA-easy Isolation Reagent试剂盒对小鼠外周血细胞(peripheral blood cell,PBC)及小肠组织总RNA进行提取；
使用超微量分光光度计NanoDrop2000直接检测提取得到的RNA产物浓度与纯度，记录每组浓度数值(可根据后续配置反转录体系所需进行稀释)，记录OD260/280，OD260/230比值，以评价该次外周血RNA提取实验情况。
(3)总RNA反转录为cDNA
使用One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(，AT311)试剂盒(One-Step gDNA Removal)(Transgen,Beijing,China)，根据表9配置反转录反应体系，在42℃下对总RNA进行逆转录15min。
表9 RNA反转录体系
①RT-PCR程序42℃孵育30min；
②85℃加热5s使RT/RI Enzyme失活，将样品4℃低温保存。
(4)荧光定量PCR检测PBC和小肠组织中免疫相关基因的变化
根据GenBank中的相关基因序列，设计并合成了23对用于免疫相关基因qPCR的引物(表10)。
表10qPCR使用引物序列
3、小鼠血浆中总IgG和攻毒前后粪便中sIgA的变化
(1)待测样品的处理与收集
①血浆：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，2400×g条件下离心20min，小心地分离出血浆，保存在-20℃以下，避免反复冻融；
②粪便：取采集的第28天以及攻毒后第3天小鼠的新鲜粪便，以4mL/g加0.01MPBS、0.05MEDTA缓冲液悬浮，冰上震荡15min，4℃10000×g离心5min，上清液-80℃冻存待用。
(2)血浆IgG及粪便sIgA的含量检测
使用睿信生物科技有限公司的酶联免疫吸附剂测定(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)试剂盒进行小鼠血浆IgG及粪便sIgA的含量检测，并与标准曲线进行对照得到IgG和sIgA含量。
4、小鼠攻毒前后小肠组织形态学变化
扑杀小鼠后采集的小肠组织用4％福尔马林溶液浸泡，委托成都里来生物科技有限公司进行石蜡标本制作及苏木精伊红染色(H&E)，并测量绒毛高度、隐窝深度和肠壁厚度三个指标。
5、小鼠攻毒后存活数
在攻毒后每天记录小鼠的存活情况。
图3为小鼠体重变化。结果显示，Po1h-pINA1297-IL-15/21/23组小鼠的体重在整个观察期内与空白对照组(PBS)和Po1h-pINA1297空载对照组差异不显著(P＞0.05)，说明该重组酵母具有可靠的生物安全性。
图4为攻毒14天后各组小鼠小肠组织切片。结果显示，在两种攻毒模型中，Po1h-pINA1297-IL-15/21/23重组酵母处理组小鼠绒毛高度与空白对照组(PBS)及Po1h-pINA1297对照组相比均有极显著差异(P＜0.01)。在沙门氏菌攻毒组中，Po1h-pINA1297-IL-15/21/23重组酵母处理后的隐窝深度相对Po1h-pINA1297对照组及空白对照组(PBS)均有极显著提高(P＜0.01)，说明Po1h-pINA1297-IL-15/21/23重组酵母可能会提高肠道隐窝的生长速率以应对S.typhimurium对肠道组织的破坏。
图5为攻毒后小鼠小肠组织中免疫相关基因表达水平的变化。结果显示，在面临S.aureus和S.typhimurium急性感染时，与对照组相比，Po1h-pINA1297-IL-15/21/23重组酵母组小鼠肠内防御素Bd2、抗菌蛋白Reg3和S100a8的表达均极显著提高(P＜0.01)；同时，相比于对照组，Po1h-pINA1297-IL-15/21/23组显著上调小鼠小肠组织内细胞因子TNF-α以及下游通路蛋白JAK1的表达水平(P＜0.05)。但在S.aureus感染中，和对照组相比，Po1h-pINA1297-IL-15/21/23组的STAT1表达显著下调(P＜0.05)；在S.typhimurium感染中，Po1h-pINA1297-IL-15/21/23组的TGF-β表达显著下调(P＜0.01)。我们同时使用qPCR对PBC细胞因子的表达水平进行了检测(图6)。结果显示Po1h-pINA1297-IL-15/21/23组小鼠的IFN-γ及IL-15在mRNA水平上的表达量相较于PBS空白对照组无显著改变(P＞0.05)，IL-7、IL-22、IL-23、TNF-α表达水平均较空白对照组显著提高(P＜0.05)。
图6为小鼠外周血中T淋巴细胞亚群变化情况。结果显示，与空白组和Po1h-pINA1297对照组相比，第7天时，Po1h-pINA1297-IL-15/21/23组中TC、和TCM(图6)的比例有明显升高；第14天时，TH、初始T细胞和TCM的比例明显升高。此外，Po1h-pINA1297及Po1h-pINA1297-IL-15/21/23处理组小鼠的Treg在7-28天显著降低(图6)。但是与空白对照组相比，Po1h-pINA1297对照组及Po1h-pINA1297-IL-15/21/23组小鼠外周血的TEM和Teff比例无显著差异。
图7为小鼠外周血中B淋巴细胞分化情况。结果显示Po1h-pINA1297-IL-15/21/23重组酵母处理组的小鼠相较于对照组在第14天具有更高的浆细胞、BSM、BNM比例(图7)(P＜0.05)。
图8为攻毒前后小鼠血浆中IgG，及粪便中sIgA含量变化。结果显示，在未进行攻毒试验前，与空白对照组相比，Po1h-pINA1297-IL-15/21/23组小鼠血浆IgG极显著上调(P＜0.01)；在应对S.typhimurium和S.aureus感染的情况下，与Po1h-pINA1297对照组相比，Po1h-pINA1297-IL-15/21/23组能更显著地提高小鼠血浆IgG(P＜0.01)及肠道sIgA分泌水平(P＜0.01)。
图9为小鼠攻毒后生存曲线。结果显示Po1h-pINA1297-IL-15/21/23灌胃组的小鼠对于S.aureus和S.typhimurium的感染有更强的抵抗作用，其存活率达到80％，远高于对照小鼠20％的存活率与空酵母组40％的存活率。
实施例4、猪白细胞介素15、21和23融合蛋白在仔猪体内的生物学活性研究
一、重组酵母Po1h-pINA1297-IL-15/21/23发酵产物的制备
1、将重组酵母Po1h-pINA1297-IL-15/21/23接种于2.5mL液体YPD培养基，28℃、200rpm空气浴振荡培养过夜；
2、取步骤1得到的菌液，接种于装有1L液体YPD培养基的2L摇瓶中，28℃、220rpm空气浴震荡培养至OD600为20(约24h)；
3、取步骤2得到的菌液，以10％的接种量接种至装有10L BSM发酵培养基的15L发酵罐中，28℃、400rpm搅拌培养至OD600为80(约48h)，得到的整个发酵体系命名为Po1h-pINA1297-15/21/23发酵产物。其中BSM发酵培养基1L：磷酸,85％(26.7ml)，硫酸钙0.93g，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g，氢氧化钾4.13g，甘油40.0g，蒸馏水补加至1L；PTM1 1L：无水硫酸铜6.0g，碘化钠0.08g，一水硫酸锰3.0g，二水钼酸钠0.2g，硼酸0.02g，氯化钴0.5g，氯化锌20.0g，七水硫酸亚铁65.0g，生物素0.2g，浓硫酸5.0ml，室温下0.22μm微孔过滤除菌；1L BSM培养基加入40mL PTM1。
二、分组处理试验动物
1、试验选择平均断奶体重为9kg左右，体质健康，同批次断奶川乡黑猪的仔猪4个栏，按体重分组将试验猪分为对照组(PBS)和实验组(Po1h-pINA1297-IL-15/21/23)。每个处理2个重复，每个重复50头仔猪，制剂按40ml/头/两天，早晨1次性添加入仔猪保育料，拌匀饲喂，进行为期35天的饲养试验；
2、试验料根据猪场使用的商品料，额外添加发酵产物。对照组仔猪饲喂基础日粮+等量PBS，实验组饲喂基础日粮+酵母菌发酵液，添加量为40ml/头/2天，进行饲喂。商品料是由嘉吉饲料(重庆)有限公司生产的仔猪配合饲料(620)，原料组成为膨化玉米、玉米、豆粕、白糖、乳清粉、石粉、磷酸二氢钙、氯化钠、维生素及类维生素、矿物元素及其络(螯)合物、氯化锌、L-赖氨酸、DL-蛋氨酸、苏氨酸和防霉剂(丙酸钙)等，商品料的营养成分见表11所示。
表11商品料的日粮组成及营养成分表
| 饲料 | 620 |
| 水分 | ≤13.0 |
| 粗蛋白 | ≥17 |
| 粗纤维 | ≤6 |
| 粗灰分 | ≤7 |
| 钙 | 0.50-0.90 |
| 总磷 | ≥0.45 |
| 赖氨酸 | ≥1.20 |
| 氯化钠 | 0.30-1.00 |
三、生产性能检测
试验仔猪管理由专人管理，各组在相同的饲养管理和环境条件下进行。试验开始后，每两天饲喂1次，保持饲料新鲜，保持猪舍环境舒适，每天观察试验猪采食、健康及活动情况，发现病猪后为该猪作标记，跟踪记录发病日期、持续时间、治疗方案、康复情况，严重发病要剔除试验栏，并称取病猪的体重，做好日期和体重的记录。
表12为试验猪只的生产性能。由表12可知：(1)在平均日采食量(ADFI)方面：对照组为715.06±30.81g，实验组为638.66±25.92g，实验组比对照组降低了10.68％(P<0.05)；(2)在平均日增重(ADG)方面：对照组为380.65±33.48g，实验组为426.91±44.05g，实验组比对照组增加12.15％(P<0.05)；(3)在料肉比(FCR)方面：对照组为1.89±0.08，实验组为1.51±0.09，实验组比对照组降低了20.11％(P<0.05)；综合以上各项生产性能指标来看，重组酵母菌发酵液有助于提升断奶仔猪的生产性能，明显促进了仔猪的生长发育。
表12试验猪只生产性能
综上可知，本发明通过基因重组、融合猪白细胞介素15，21和23基因，将其连接到真核表达平台获得融合蛋白，进一步研究融合蛋白的免疫调节效应和其诱导小鼠抗感染活性及其在猪体内提高免疫和生长发育的生物学效应研究。发现融合表达的IL-15，21和23具有显著的增强动物免疫屏障机能，增强其全身免疫水平和抗细菌感染能力，促进动物生长发育的良好生物学效应。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括猪白细胞介素15，猪白细胞介素21和猪白细胞介素23，所述融合蛋白由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述融合蛋白。
3.根据权利要求2所述一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。
4.一种生物制剂材料，其特征在于，所述生物制剂材料为下述(c1)至(c6)中的任一种：
(c1)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；
(c2)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体；
(c3)含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系；
(c4)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物；
(c5)所述转基因细胞系的培养产物；
(c6)所述重组微生物的发酵产物。
5.一种应用，其特征在于，将如权利要求1所述融合蛋白，如权利要求2或3所述核酸分子，或如权利要求4所述生物制剂材料用于制备提高动物免疫能力的产品中。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提高动物免疫能力为下述(d1)至(d8)中的至少一种：
(d1)促进效应靶动物的细胞免疫和/或体液免疫；
(d2)促进效应靶动物免疫屏障的建立；
(d3)促进动物发育和生长；
(d4)促进动物免疫细胞的增加；
(d5)促进动物细胞免疫和体液免疫；
(d6)促进动物粘膜免疫屏障的建立；
(d7)抗致病微生物感染；
(d8)促进疫苗诱导的免疫应答。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞为淋巴细胞、红细胞或白细胞；所述致病微生物具体为鼠伤寒沙门氏菌和标准金黄色葡萄球菌ATCC14028。
8.根据权利要求5至7任一项所述的应用，其特征在于，所述动物为猪或小鼠。
9.一种产品，其特征在于，包括如权利要求1所述融合蛋白，如权利要求2或3所述核酸分子，或如权利要求4所述生物制剂材料。
10.根据权利9所述产品，其特征在于，所述产品为疫苗或生物制剂材料。
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