CN116903755B - 一种猪白细胞介素3,7和15共表达的融合蛋白、核酸分子、替抗生物材料及应用 - Google Patents
一种猪白细胞介素3,7和15共表达的融合蛋白、核酸分子、替抗生物材料及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种猪白细胞介素3,7和15共表达的融合蛋白、核酸分子、替抗生物材料及应用,涉及生物技术领域,本发明提供了一种猪白细胞介素3,7和15共表达的融合蛋白,包括猪白细胞介素3,猪白细胞介素7和猪白细胞介素15。编码融合蛋白的核酸分子。具有所述核酸分子的表达盒、重组载体、转染细胞、重组微生物、所述转基因细胞系的培养产物或所述重组微生物的发酵产物的替抗生物材料。本发明通过基因重组、融合猪白细胞介素3,7和15基因,将其连接到真核表达平台获得融合蛋白,发现融合表达的IL‑3,7和15能显著增强动物消化道粘膜的免疫屏障机能,并提高其全身免疫水平和抗细菌感染能力,具有促进动物生长发育的良好生物学效应。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种猪白细胞介素3,7和15共表达的融合蛋白、核酸分子、替抗生物材料及应用。
背景技术
中国拥有全球最大的生猪养殖规模,每年猪肉产量和消耗量都位居世界第一。然而,养猪业迅速发展的同时,畜禽传染性疾病是制约我国养猪业发展的主要因素,每年都会因这些传染病造成巨大的经济损失。为了控制畜禽传染性疾病的扩散和治疗患病猪,一些养殖场会大规模使用抗生素和抗菌剂,但是这些常用措施也存在一些问题,包括需要长期给药、产生耐药性以及停止治疗后症状重新出现等。因此高效防治动物传染性疾病、降低抗生素药物残留和促进动物安全生长成为我国养殖业可持续发展的首要目标。
近年来,我国已出台法规全面禁止在饲料中添加抗生素,以减少滥用抗生素造成的危害,保证动物源食品安全和公共卫生安全。因此现代养殖业急需开发取代传统抗生素的无残留、无抗性诱导、经济安全无污染的新型生物饲料及其添加剂。鉴于此,本发明提供一种猪白细胞介素3,7和15共表达的融合蛋白、核酸分子、生物材料及应用和产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种猪白细胞介素3,7和15共表达的融合蛋白、核酸分子、替抗生物材料及应用。目的是开发取代传统抗生素的无残留、无抗性诱导、安全无污染的生物防控添加剂。
本发明为了解决上述技术问题,第一方面是提供一种融合蛋白,包括猪白细胞介素3,猪白细胞介素7和猪白细胞介素15,所述蛋白质如下(a1)至(a4)中的任意一项:
(a1)由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成蛋白质;在SEQ ID NO:1中,第1-152位为猪白细胞介素3,第153-158位为组氨酸标签,第159-161位为连接肽(GSG),第162-179位为T2A自剪接肽,第180-194位为分泌信号肽(XPR2Pre),第195-370位为猪白细胞介素7,第371-376位为组氨酸标签,第377-379位为连接肽(GSG),第380-397位为T2A自剪接肽,第398-412位为分泌信号肽(XPR2Pre),第413-574位为猪白细胞介素15,第575-580位为组氨酸标签。
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质;
(a3)与(a1)具有80%以上,85%以上,90%以上,95%以上,98%以上,99%以上具有同一性且具有提高动物免疫力功能的蛋白质;
(a4)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代,和/或缺失,和/或添加,且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质。
在上述技术方案的基础上,本发明还可以做如下改进。
第二方面是提供一种核酸分子,所述核酸分子编码如上述(a1)至(a4)中的任意一项所述融合蛋白。
进一步,所述核酸分子为下述的(b1)至(b3)中的任一项:
(b1)由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组核酸分子;
(b2)在严格条件下与(b1)限定的核酸分子杂交且编码上述融合蛋白的核酸分子;
(b3)与(b1)限定的核酸分子至少具有80%以上,85%以上,90%以上,95%以上,98%以上,或99%以上同源性且编码上述融合蛋白的核酸分子。
其中,所述核酸分子可以是DNA,如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。上述使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
第三方面是提供一种替抗生物材料,所述替抗生物材料为下述(c1)至(c6)中的任一种:
(c1)含有上述所述核酸分子的表达盒;所述表达盒,是指能够在宿主细胞中表达(b1)至(b3)中的任一项的核酸分子,该核酸分子不但可包括启动基因转录的启动子,还可包括终止基因转录的终止子。进一步,所述表达盒还可包括增强子序列。
(c2)含有上述所述核酸分子的重组载体;所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体,具体可以为pINA1297载体。
(c3)含有上述所述核酸分子的转基因细胞系;所述转基因细胞系具体可为将所述重组载体转染哺乳动物得到的转基因细胞系。
(c4)含有上述所述核酸分子的重组微生物;所述重组微生物具体可为将所述重组载体或所述重组载体的线性化片段导入微生物得到的重组微生物。所述微生物可为为酵母、细菌、藻类或真菌。所述酵母具体可为解脂耶氏酵母Po1h。
(c5)所述转基因细胞系的培养产物;
(c6)所述重组微生物的发酵产物。
所述转基因细胞系的培养产物或所述重组微生物的发酵产物,可按照包括如下步骤的方法制备:培养所述转基因细胞系或所述重组微生物,使编码基因表达,得到所述转基因细胞系的培养产物或所述重组微生物的发酵产物。例如所述转基因细胞系的培养产物为其表达的上清液;所述重组微生物的发酵产物可为其发酵液的上清液。
第四方面是提供一种应用,将如上述所述融合蛋白,如上述所述核酸分子,或如上述所述替抗生物材料用于制备提高动物免疫能力的产品中。
进一步,所述提高动物免疫能力为下述(d1)至(d8)中的至少一种:
(d1)促进效应靶动物的细胞免疫和/或体液免疫;
(d2)促进效应靶动物粘膜免疫屏障的建立;
(d3)促进动物发育和生长;
(d4)促进动物免疫细胞的增加;
(d5)促进动物细胞免疫和体液免疫;
(d6)促进动物粘膜免疫屏障的建立;
(d7)抗致病微生物感染;
(d8)促进疫苗诱导的免疫应答。
进一步,所述效应靶细胞为猪小肠黏膜上皮细胞;所述免疫细胞为淋巴细胞(如T淋巴细胞)、红细胞或白细胞;所述致病微生物具体为鼠伤寒沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌。
进一步,所述动物为猪或小鼠。
第五方面是提供一种产品,包括如上述所述融合蛋白,如上述所述核酸分子,或如上述所述替抗生物材料。所述产品,可以融合蛋白,核酸分子,替抗生物材料为活性成分,还可以将它们与其他可以提高动物免疫能力的物质组合在一起的组合物为活性成分;另外还可以添加产品上可接受的载体和/或辅料。
进一步,所述产品为疫苗或生物制剂。所述疫苗具体可为针对上述致病微生物的疫苗。所述生物制剂为提高动物的免疫能力,治疗上述致病微生物导致的疾病的生物药物。
第六方面提供一种提高动物免疫能力的方法,包括如下步骤:对动物施用所述产品,提高所述动物的免疫能力;所述产品包括如上述所述融合蛋白,如上述所述核酸分子,或如上述所述替抗生物材料。
实验证明,本发明的融合蛋白IL-3/7/15分子及含有IL-3/7/15基因的重组酵母的发酵产品具有以下作用:(1)通过淋巴细胞增殖实验-CCK8,说明本发明合成的融合蛋白IL-3/7/15具有免疫生物学活性;(2)通过小鼠实验证明了:(a)重组酵母菌(Po1h-pINA1297-IL-3/7/15)具有可靠的生物安全性,(b)促进T淋巴细胞亚群随时间推移数量先增后减的趋势,并在第14天时达到最大值;(c)促进免疫相关基因(IL-7,IL-15,IL-22,IL-23,IFN-γ和TNF-α)表达在第14天和28天时极显著高于对照组;(d)刺激小鼠产生更多的非特异性抗体IgG,有效地增强小鼠的体液免疫能力;较高的增强sIgA表达水平的作用;(e)促进小鼠小肠组织中Jak-1,STAT1,IL-1β,IL-8,BD1,S100A8,RegⅢ,TGF-β和TNF-α基因的表达;小肠绒毛高度显著高于对照组;(f)在金黄色葡萄球菌攻毒和鼠伤寒沙门氏菌攻毒时提高小鼠攻毒后存活率;(3)在猪体内的生物学活性研究表明:(a)能有效地促进了猪生长发育和体重的增长;(b)猪外周血中白细胞和淋巴细胞数量均要显著或极显著高于空白对照组;(c)猪PBMC中IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-23和CD62L的表达量极显著高于空白对照组,猪PBMC中TLR1,TLR2,TLR5,TLR8和TLR9的表达量均要显著或极显著高于空白对照组,提高猪的先天免疫和获得性特异性免疫。
细胞因子是目前最高效的免疫调节分子,在各类免疫活性细胞的分化、发育、成熟和活化中均起着不可或缺的关键调节作用。此外,细胞因子还全面参与控制调节免疫防御炎性反应、其它组织细胞增殖和生长代谢、组织修复和造血等过程。因此在畜禽传染性疾病防治和保证动物正常生长发育过程中,细胞因子是一种极具潜力的,能代替抗生素的抗感染制剂。本发明通过构建猪白细胞介素3、7和15融合基因,并将其整合到解脂耶氏酵母真核表达体系中获得融合蛋白,然后进一步探究融合蛋白在体外的免疫调节效应和重组酵母在小鼠体内的抗感染活性及其在猪体内提高免疫调节和促进生长发育的生物学效应。发现融合表达的猪IL-3、IL-7和IL-15能显著增强动物消化道粘膜的免疫屏障机能,并提高其全身免疫水平和抗细菌感染能力,具有促进动物生长发育的良好生物学效应。
附图说明
图1为本发明蛋白的标准曲线结果图;
图2为本发明猪淋巴母细胞增殖的能力检测图;
图3为本发明小鼠体重的动态变化图;
图4为本发明小鼠第14天外周血中T淋巴细胞亚群免疫分型图;
图5为本发明T淋巴细胞细胞亚群在不同时间点下所占比例变化情况图,其中a为细胞毒性T细胞,b为辅助T细胞,c为初始T细胞,d为中心记忆T细胞,e为效应记忆T细胞,f为效应T细胞,g为调节T细胞;
图6为本发明小鼠第14天外周血中B淋巴细胞亚群免疫分型图;
图7为本发明B淋巴细胞亚群在不同时间点所占比例变化情况图;其中,a为浆细胞,b为初始B细胞,c为Non-switched记忆B细胞,d为Switched记忆B细胞;
图8为本发明小鼠外周血中免疫相关基因变化情况图;其中,a为IFN-γ基因表达水平,b为IL-7基因表达水平,c为IL-15基因表达水平,d为IL-22基因表达水平,e为IL-23基因表达水平,f为TNF-α基因表达水平;
图9为本发明小鼠血浆中总IgG的变化图;
图10为本发明金黄色葡萄球菌攻毒后小鼠小肠组织免疫相关基因变化情况图;
图11为本发明为小鼠粪便sIgA水平图;
图12为本发明小鼠攻毒结束后小肠组织形态学变化图;其中,(a)为组织染色图,(b)为统计结果图;
图13为本发明小鼠攻毒后存活率图;(a)为金黄色葡萄球菌攻毒后的存活率;(b)为鼠伤寒沙门氏菌攻毒后的存活率;
图14为本发明仔猪在不同处理下哺乳期体重的变化图;
图15为本发明仔猪在不同处理下保育期体重的变化图;
图16为本发明仔猪外周血中白细胞数量的动态变化图;
图17为本发明仔猪外周血中淋巴细胞数量的动态变化图;
图18为本发明仔猪外周血中中性粒细胞数量的动态变化图;
图19为本发明仔猪外周血中红细胞数量的动态变化图;
图20为本发明仔猪外周血中血红蛋白浓度的动态变化图;
图21为本发明仔猪外周血血小板数量的动态变化图;
图22为本发明Th1型细胞因子IL-2在猪PBMC中表达量的动态变化图;
图23为本发明Th2型细胞因子IL-4和IL-6在猪PBMC中表达量的动态变化图;
图24为本发明免疫记忆相关细胞因子IL-15、IL-23和CD62L在猪PBMC中表达量的动态变化图;
图25为本发明TLRs在猪PBMC中表达量的动态变化图;
图26为本发明免疫记忆相关细胞因子IL-3、IL-7和IL-15在猪外周血血浆中含量的动态变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。重组质粒均已进行测序验证。如无特殊说明,以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
下述实施例中的昆明小鼠:四川大学实验动物中心,生产许可证号为SCXK(川)2018-026。川乡黑猪:四川省畜牧科学院养猪研究所产品。100×青链霉素混合液:HyClone公司。pINA1297载体(vector pINA1297)和解脂耶氏酵母Po1h(Po1h strain)均为法国农业科学院Madzak教授惠赠,均记载于如下文献:Madzak C,Gaillardin C,BeckerichJM.Heterologous protein expression and secretion in the non-conventionalyeast Yarrowia lipolytica:a review.J Biotechnol.2004Apr 8;109(1-2):63-81.doi:10.1016/j.jbiotec.2003.10.027.PMID:15063615。
实施例1:融合蛋白IL-3/7/15、编码基因的设计和解脂耶氏酵母共表达体系的构建及体外活性研究
一、融合蛋白IL-3/7/15及其编码基因的设计
融合蛋白IL-3/7/15如序列表的SEQ ID NO:1所示。在SEQ ID NO:1中,第1-152位为猪白细胞介素3,第153-158位为组氨酸标签,第159-161位为连接肽(GSG),第162-179位为T2A自剪接肽,第180-194位为分泌信号肽(XPR2Pre),第195-370位为猪白细胞介素7,第371-376位为组氨酸标签,第377-379位为连接肽(GSG),第380-397位为T2A自剪接肽,第398-412位为分泌信号肽(XPR2Pre),第413-574位为猪白细胞介素15,第575-580位为组氨酸标签。
序列表的SEQ ID NO:2所示的DNA分子编码融合蛋白IL-3/7/15,将该DNA分子命名为IL-3/7/15基因。在SEQ ID NO:2中,第1-456位核苷酸编码猪白细胞介素3,第457-474位核苷酸编码组氨酸标签,第475-483位氨基酸编码连接肽,第484-537位核苷酸编码T2A自剪接肽,第538-582位核苷酸编码分泌信号肽XPR2Pre,第583-1110位核苷酸编码猪白细胞介素7,第1111-1128位核苷酸编码组氨酸标签,第1129-1137位核苷酸编码连接肽,第1138-1191位核苷酸编码T2A自剪接肽,第1192-1236位核苷酸编码信号肽XPR2Pre,第1237-1722位核苷酸编码猪白细胞介素15,第1723-1740位核苷酸编码组氨酸标签,第1741-1743位核苷酸位为终止密码子。
IL-3/7/15融合基因片段由南京金斯瑞生物技术有限公司全基因合成获得,并构建到自克隆穿梭载体pINA1297上,重组穿梭载体命名为pINA1297-IL-3/7/15。
二、重组穿梭载体转化大肠杆菌及大提质粒
1、重组穿梭载体转化大肠杆菌
(1)将构建好的重组穿梭载体pINA1297-IL-3/7/15转化至大肠杆菌(E.coli)感受态细胞(购于上海唯地生物)Top10,将菌液涂布到含卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基平板上,正面放置培养30min,后置于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。
(2)挑取LB平板上的单菌落于1mL LB含50mg/ml卡那霉素的液体培养基中,摇床培养2h,随后将菌液转移到5mL新鲜LB液体培养基中,过夜培养12-16h,保存菌液以进行下一步实验。
2、阳性克隆的筛选和鉴定
将上述阳性转化子中通过菌落PCR和测序进行鉴定。
3、重组自克隆载体pINA1297-IL-3/7/15的提取
根据OMEGA公司质粒小量提取试剂盒的操作步骤说明书对步骤1对(2)的菌液进行重组自克隆载体pINA1297-IL-3/7/15的提取,提取产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
三、重组解脂耶氏酵母Po1h-pINA1297-IL-3/7/15的构建
1、重组质粒pINA1297-IL-3/7/15线性化及转化
(1)将pINA1297-IL-3/7/15重组质粒用限制性内切酶Not I进行线性化处理,将回收的线性化片段转化至解脂耶氏酵母Po1h感受态细胞,得到重组酵母,命名为Po1h-pINA1297-IL-3/7/15。
(2)取pINA1297空载质粒,同样用限制性内切酶NotⅠ进行线性化处理,将得到的线性化片段转化至解脂耶氏酵母Po1h感受态细胞,得到重组酵母,命名为Po1h-pINA1297。
四、融合基因IL-3/7/15在解脂耶氏酵母中的表达及体外活性研究
1、蛋白水平检测
将Po1h-pINA1297-IL-3/7/15和重组酵母Po1h-pINA1297分别接种至装有100mlYPD液体培养基(10g/L酵母提取物,20g/L胰蛋白胨,20g/L葡萄糖和15g/L琼脂)的250ml摇瓶,28℃、200rpm空气浴振荡培养48h,取发酵液超声波裂解处理(功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次),4℃、10000rpm离心收集上清液进行重组蛋白表达水平的测定,参照Porcine Interleukin3(IL-3)ELISA Kit(CUSABIO,China)、Porcine Interleukin 7(IL-7)ELISA Kit(CUSABIO,China)和Porcine Interleukin 15(IL-15)ELISA Kit(CUSABIO,China)试剂盒说明书检测重组酵母破碎上清液中重组蛋白表达情况。
各蛋白的标准曲线结果见图1。重组酵母Po1h-pINA1297-IL-3/7/15的破碎上清中检测到目的蛋白的表达,通过图1中的标准曲线计算出:猪IL-3,IL-7和IL-15含量分别为7.811ng/mL,11.313ng/mL和0.440ng/mL。重组酵母Po1h-pINA1297的破碎上清中未检测到相应目的蛋白表达。
2、淋巴细胞增殖实验-CCK8
(1)淋巴母细胞的制备
无菌条件下采取猪前腔静脉外周血5mL,EDTA-2K抗凝,按照猪外周血淋巴细胞分离液KIT(天津灏洋华科生物科技有限公司,中国)说明书分离猪淋巴细胞。将分离到的细胞用完全1640培养液(含10%小牛血清,100μg/mL氨卞青霉素,100μg/mL链霉素)稀释至细胞终浓度2×106个/mL,分至直径为10cm的细胞培养皿中,每皿10mL,最后再加入终浓度为10μg/mL的Sigma-Con A(L7647,Merck KGaA,Germany)进行刺激,置于37℃,5% CO2细胞培养箱中培养24h。
(2)生物学活性检测
培养24h后,将培养皿中的猪淋巴母细胞收集至干净的离心管中,1500rpm离心15min收集细胞;用1640完全培养基(含双抗与血清)洗细胞2次,1500rpm离心15min。
用含20mg/mLα-MM的1640培养基调整细胞至约6×106个/mL,分别向96孔板实验孔中加入100μL靶细胞(猪淋巴母细胞)和同体积的Po1h-pINA1297-IL-3/7/15破碎上清液及Po1h-pINA1297破碎上清液;每个样品设3个重复孔,并设有对照孔,置于37℃,5% CO2细胞培养箱中培养48h;48h后,取出96孔板,每孔加入10μL CCK8轻轻吹匀继续培养2h;取出96孔板,用Bio-Reader680检测每孔OD450。
结果见图2。使用CCK-8试剂盒对重组酵母Po1h-pINA1297-IL-3/7/15破碎上清促进猪淋巴母细胞增殖的能力进行检测,发现Po1h-pINA1297-IL-3/7/15破碎上清液较空载组PBS和空白对照组Po1h-pINA1297显著提高淋巴母细胞增殖(P<0.05),说明重组蛋白具有生物学活性。
实施例2:重组解脂耶氏酵母Po1h-pINA1297-IL-3/7/15在小鼠体内生物活性研究
一、重组酵母发酵液的制备
1、将Po1h-pINA1297经YPD平板划线接种复苏活化后,挑取单菌落接种于含30mLYPD培养基的100mL摇瓶中,在28℃,220rpm空气浴振荡培养48h,使OD600约为10,得到Po1h-pINA1297发酵液。
2、按照上述方法,将Po1h-pINA1297替换为Po1h-pINA1297-IL-3/7/15其他步骤均不变,得到Po1h-pINA1297-IL-3/7/15重组酵母发酵液。
二、小鼠实验方案
1、小鼠分组及实验处理
(1)将30只4-5周龄SPF级健康雌性昆明小鼠,体重约18克,随机分成3组,每组10只。
(2)空白对照组:
磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline,PBS)灌胃小鼠,灌胃量为100μL/只/次,每3天灌胃一次,共灌胃10次。
(3)空载对照组:
Po1h-pINA1297重组酵母发酵液灌胃小鼠,灌胃量为4×108CFU/只/次(100μL),每3天灌胃一次,共灌胃10次。
(4)实验组:
Po1h-pINA1297-IL-3/7/15重组酵母发酵液灌胃小鼠,灌胃量为4×108CFU/只/次,每3天灌胃一次,共灌胃10次。
(5)攻毒
灌胃处理28天后开始进行攻毒。攻毒过程:浓缩鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028),用新鲜的液体LB培养基重悬,得到1.0×1010CFU/mL的菌悬液,即为攻毒液;每间隔一天灌胃一次,共灌胃3次,每次每只小鼠灌胃300μL菌悬液(每组5只),每次灌胃前小鼠禁食不禁水2h。灌胃当天即为攻毒后第0天。每24h观察一次小鼠的发病情况,并统计小鼠存活率,解剖观察死亡的小鼠内部器官的变化。用同样的方法进行金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)攻毒实验。
2、样品及数据采集
(1)体重指标
连续四周每周称重一次,记录各组小鼠体重的动态变化。
结果见图3。各组小鼠体重在4个时间点的差异不显著(P>0.05),说明该重组酵母具有可靠的生物安全性。
(2)血液免疫指标
分别于第一次灌胃前,灌胃后的第7、14、21、28天以及攻毒后第三天,从小鼠尾静脉割尾采集外周血。
(3)粪便/肠道免疫指标
分别于灌胃后的第28天以及攻毒后第三天,收集小鼠新鲜粪便;攻毒结束小鼠处死后采集小肠组织,进行形态学分析以及转录水平分析。
3、流式细胞术分析小鼠外周血中免疫细胞的变化
对灌胃后第7、14和28天采集的抗凝血进行流式细胞术分析。小鼠各时间点外周血经荧光抗体标记后,流式细胞术分析PBS组、Po1h-pINA1297组、Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组淋巴细胞数量变化情况,T淋巴细胞免疫分型可得Th、Tc、Naive T Cell、Tcm、Tem、Teff、Treg等,B淋巴细胞免疫分型可得Plasma Cell、Naive B Cell、Switched Memory B Cell、Non-switched Memory B Cell等。淋巴细胞分型的标志物如表1所示。
表1淋巴细胞分型的标志物
图4为小鼠第14天外周血中T淋巴细胞亚群免疫分型;图5(a-g)为各细胞亚群在不同时间点下所占比例变化情况:(a)细胞毒性T细胞、(b)辅助T细胞、(c)初始T细胞、(d)中心记忆T细胞、(e)效应记忆T细胞、(f)效应T细胞、(g)调节T细胞。(c)中PBS组、Po1h-pINA1297组的Naive T Cell数量在第7天时几乎为零,随着时间推移有一定的增加,但总体是一个数量较少的状态,Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组的Naive T Cell数量呈现出先增后减的趋势,在第14天时达到数值高峰随后逐渐降低,最高值时Naive T Cell数量是另外两组的2-3倍;(d)中Tcm细胞数量在第7天和第14天时Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组均高于PBS组和Po1h-pINA1297组,但在第28天时PBS组和Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组的Tcm细胞数量差异不显著而Po1h-pINA1297组比例上升,在Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组中则先增后减;(g)中在各个时间点下PBS组的Treg数量均高于Po1h-pINA1297组和Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组,三组均表现出随时间推移数量先增后减的趋势,并在第14天时达到最大值。
图6为小鼠第14天外周血中B淋巴细胞亚群免疫分型;图7(a-d)为各细胞亚群在不同时间点所占比例变化情况:(a)浆细胞、(b)初始B细胞、(c)Non-switched记忆B细胞、(d)Switched记忆B细胞。(c)可见Non-switched记忆B细胞在Po1h-pINA1297组和Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组中一直保持比例增加的趋势,在PBS组中第28天比例降低,并与另外两组相比较所占比例有较大回落;(a)、(b)、(d)所示在各时间点下浆细胞、初始B细胞、Switched记忆B细胞三组所占比例变化趋势基本一致,差异不显著(P>0.05)。
4、小鼠外周血免疫相关基因变化情况
提取灌胃后第14和28天以及攻毒后第三天小鼠外周抗凝血的总RNA,反转录得到cDNA,采用荧光定量PCR检测外周血中免疫相关基因(IL-7,IL-15,IL-22,IL-23,IFN-γ和TNF-α)的表达情况。用于检测小鼠中目标基因的引物见表2。
表2检测小鼠中目标基因的引物
图8为小鼠外周血中免疫相关基因变化情况。图8(a)IFN-γ基因表达水平在第14天时Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组极显著高于PBS组(P<0.01)。图8(b)IL-7基因表达水平在第14天和第28天时Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组极显著高于PBS组(P<0.01)。图8(c)IL-15基因表达水平在第14和第28天时Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组均极显著高于PBS组(P<0.01)。图8(d)IL-22基因表达水平在全部时间点和不同攻毒条件下Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组均极显著高于PBS组(P<0.01),并且在Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组中IL-22基因随时间推移表达水平不断升高。图8(e)IL-23基因表达水平在第28天和鼠伤寒沙门氏菌攻毒后Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组中表达水平极显著高于PBS组(P<0.01)。图8(f)TNF-α基因表达水平在Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组中鼠伤寒沙门氏菌攻毒条件下达到峰值并且极显著高于PBS组(P<0.01),在第14天时同样显著高于PBS组(P<0.05)。
5、小鼠血浆中总IgG的变化
取灌胃后第7、14、28天以及攻毒后第3天小鼠尾静脉EDTA抗凝外周血200μL(在4000rpm条件下,离心20min取上清得到血浆,按照小鼠免疫球蛋白G(IgG)试剂盒(ELISA)使用说明书(RX202736M,睿信生物)测定小鼠血浆中总IgG的变化。
结果见图9。在4个时间点中Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组小鼠外周血血浆中IgG的含量均要极显著高于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组(PBS)小鼠IgG的含量(P<0.01)。结果表明,重组酵母Po1h-pINA1297-IL-3/7/15发酵产物可以刺激小鼠产生更多的非特异性抗体IgG,有效地增强小鼠的体液免疫能力。
6、小鼠小肠组织免疫相关基因变化情况
(1)小鼠小肠组织样本处理
采集攻毒结束后小鼠小肠组织25mg,用液氮研磨,提取总RNA并反转录成cDNA,采用荧光定量PCR检测肠道组织中Jak-1,STAT1,IL-1β,IL-8,BD1,S100A8,RegⅢ,TGF-β和TNF-α基因的表达情况。用于检测小鼠小肠组织中免疫相关基因的引物见表3。
表3小鼠小肠组织中免疫相关基因的引物
图10为金黄色葡萄球菌攻毒后小鼠小肠组织免疫相关基因变化情况,除TGF-β基因外,Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组小鼠小肠中免疫相关基因的表达量均要极显著高于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组(PBS)(P<0.01)。
7、小鼠粪便sIgA水平
采集灌胃后第28天以及攻毒后第3天小鼠的新鲜粪便,以4mL/g加0.01M PBS、0.05M EDTA缓冲液悬浮,冰上震荡15min,4℃10000g离心5min,上清液-80℃冻存待检测用。按照小鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)定量检测试剂盒(ELISA)使用说明书(RX-G202950M,睿信生物)检测粪便sIgA的含量。
图11为小鼠粪便sIgA水平,Po1h-pINA1297组与PBS组相比较,粪便sIgA含量在各时间点和不同攻毒条件下差异均不显著(P>0.05),且两组粪便sIgA含量均较低。
Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组粪便中sIgA含量极显著高于PBS组和空载组Po1h-pINA1297(P<0.01),其含量是PBS组和Po1h-pINA1297组的4-5倍,说明融合分子IL-3/7/15具有较高的增强sIgA表达水平的作用。
8、小鼠攻毒后小肠组织形态学变化
攻毒结束后各组小鼠取小肠组织经苏木精伊红(H&E)染色观察并测量绒毛高度、隐窝深度、肠壁厚度,以评估小肠结构与功能。
图12(a)-(b)为小鼠攻毒结束后小肠组织形态学变化和微观结构尺度变化。金黄色葡萄球菌攻毒条件下,Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组小肠绒毛高度显著高于PBS组和空白对照组Po1h-pINA1297(P<0.05)。
9、小鼠攻毒后存活率
小鼠灌胃第28天后,每组中5只金黄色葡萄球菌攻毒,另外5只鼠伤寒沙门氏菌攻毒,观察两周后处死,记录攻毒后每天小鼠数量变化,统计小鼠存活天数,计算存活率,绘制小鼠攻毒后生存曲线。
图13(a)-(b)为小鼠攻毒后存活率。两种攻毒条件下,PBS组与Po1h-pINA1297组生存曲线差异不显著(P>0.05),说明空载组Po1h-pINA1297发酵液没有提高小鼠免疫保护力的作用。两种攻毒条件下,Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组与PBS组和空载组Po1h-pINA1297小鼠存活率差异显著(P<0.05),说明小鼠灌胃Po1h-pINA1297-IL-3/7/15发酵液免疫28天后显著增加了其攻毒后存活天数,显著改善并提高了小鼠攻毒后存活率,金黄色葡萄球菌攻毒两周后,PBS组仅有20%的小鼠存活,而Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组存活率100%;鼠伤寒沙门氏菌攻毒两周后,PBS组小鼠存活率为40%,Po1h-pINA1297-IL-3/7/15组存活率为100%。
实施例3:猪白细胞介素3、7和15融合蛋白在猪体内的生物学活性研究
一、重组酵母Po1h-pINA1297-IL-3/7/15发酵产物的制备
1、将重组酵母Po1h-pINA1297-IL-3/7/15接种于2.5mL液体YPD培养基,28℃、200rpm空气浴振荡培养过夜。
2、取步骤1得到的菌液,接种于装有1L液体YPD培养基的2L摇瓶中,28℃、220rpm空气浴震荡培养至OD600为20(约24h)。
3、取步骤2得到的菌液,以10%的接种量接种至装有10L BSM发酵培养基(BSM发酵培养基1L:磷酸,85%(26.7ml),硫酸钙0.93g,硫酸钾18.2g,七水硫酸镁14.9g,氢氧化钾4.13g,甘油40.0g,蒸馏水补加至1L;PTM1 1L:无水硫酸铜6.0g,碘化钠0.08g,一水硫酸锰3.0g,二水钼酸钠0.2g,硼酸0.02g,氯化钴0.5g,氯化锌20.0g,七水硫酸亚铁65.0g,生物素0.2g,浓硫酸5.0ml,室温下0.22μm微孔过滤除菌;1L BSM培养基加入40mL PTM1。)的15L发酵罐中,28℃、400rpm搅拌培养至OD600为80(约48h),得到的整个发酵体系命名为Po1h-pINA1297-IL-3/7/15发酵产物。
二、分组处理试验动物
1、39头健康川乡黑猪,出生体重约为2.4kg左右,随机分成2组(实验组20头,对照组19头);
2、实验组(Po1h-pINA1297-IL-3/7/15-组):从10日龄开始,Po1h-pINA1297-IL-3/7/15酵母液分别按每头仔猪20ml添加于教槽料中,每两天添加一次直至28天哺乳期结束;28日龄后按照30ml/头将酵母液添加于保育料中,每两天一次饲喂至56天保育期结束;对照组用等量PBS加入常规教槽料和保育料饲料饲喂,不添加其它原料;
3、分别在出生后第14天、第28天,第42天和第56天采集每头猪颈静脉血,进行如下实验内容:2.5mL抗凝血分别用于血常规检测和PBMC中免疫相关基因表达情况,剩余抗凝血分离血浆检测相关细胞因子含量变化;在出生时、哺乳期结束时和保育期结束时称取各组实验猪的体重。
三、各个指标的检测
1、在出生后第28天和第56天称取各实验组猪的增重
图14和图15为仔猪在不同处理下哺乳期和保育期体重的变化。哺乳期,Po1h-IL-3/7/15实验组与空白对照组体重变化没有显著性差异(P>0.05);而在保育期结束时,Po1h-IL-3/7/15组猪体重净增重显著高于空白对照组(PBS)中猪体重净增重(P<0.05)其净增重幅度均大14%。结果表明:重组酵母Po1h-IL-3/7/15发酵产物能有效地促进了猪生长发育和体重的增长。
2、血常规
图16和图17为仔猪外周血中白细胞和淋巴细胞数量的动态变化。在拌喂第28天和第42天时,Po1h-IL-3/7/15组猪外周血中白细胞和淋巴细胞数量均要显著或极显著高于空白对照组(PBS)中的数量(D28,P<0.05)(D42,P<0.01)。
图18为仔猪外周血中性粒细胞数量的动态变化。在整个饲喂周期中,Po1h-IL-3/7/15实验组与空白对照组(PBS)外周血中性粒细胞数量没有显著性差异(P>0.05)。
图19和图20为仔猪外周血中红细胞数量和血红蛋白浓度的动态变化。在拌喂第14天时,Po1h-IL-3/7/15组猪外周血中红细胞数量和血红蛋白浓度均要显著高于空白对照组(PBS)(P<0.05);而其余三个时间点,实验组和对照组外周血中红细胞数量和血红蛋白浓度没有显著性差异(P>0.05);
图21为仔猪外周血血小板数量的动态变化。在拌喂第42天时,Po1h-IL-3/7/15组猪外周血中血小板数量要显著高于空白对照组(PBS)(P<0.05);而其余三个时间点,实验组和对照组外周血中血小板数量没有显著性差异(P>0.05)。
3、荧光定量PCR检测PBMC中免疫相关基因的表达情况
图22为Th1型细胞因子IL-2在猪PBMC中表达量的动态变化。Th1型细胞因子主要介导细胞毒和局部炎症有关的免疫应答,辅助抗体产生,参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的发生。在拌喂后第56天,Po1h-IL-3/7/15组猪PBMC中IL-2的表达量要极显著高于空白对照组(PBS)(P<0.05)。结果证明:重组酵母Po1h-IL-3/7/15发酵产物可以增强猪的细胞免疫。
图23为Th2型细胞因子IL-4和IL-6在猪PBMC中表达量的动态变化,Th2型细胞因子主要功能为刺激B细胞增殖并产生免疫球蛋白G,参与体液免疫。在拌喂后第56天,Po1h-IL-3/7/15组猪PBMC中IL-4和IL-6的表达量均要显著高于空白对照组(PBS)(P<0.05)。结果说明:重组酵母Po1h-IL-3/7/15发酵产物可以增强猪的体液免疫。
图24为免疫记忆相关细胞因子IL-15、IL-23和CD62L在猪PBMC中表达量的动态变化。免疫记忆相关因子能够促进免疫记忆相关细胞的分化发育,促进机体特异免疫记忆的形成,增强机体的免疫反应。在拌喂后第56天,Po1h-IL-3/7/15组猪PBMC中IL-15、IL-23和CD62L的表达量均要极显著高于空白对照组(PBS)的表达量(P<0.01)。结果表明:重组酵母Po1h-IL-3/7/15发酵产物可以促进免疫记忆相关因子的生成从而提高猪的获得性特异免疫力。
图25为TLRs在猪PBMC中表达量的动态变化。模式识别受体是介导自然免疫和特异性免疫的桥梁。TLR9可识别病毒CpG DNA,TLR1、TLR2和TLR5等主要识别细菌,TLR8是Toll样受体家族中唯一能够逆转Treg细胞引起的免疫抑制的蛋白。在拌喂后第56天,Po1h-IL-3/7/15组猪PBMC中TLR1,TLR2,TLR5,TLR8和TLR9的表达量均要显著或极显著高于空白对照组(PBS)的表达量(P<0.05,TLR2)(P<0.01,TLR2,TLR5,TLR8和TLR9)。结果表明:重组酵母Po1h-IL-3/7/15发酵产物可以增强机体抗原识别功能从而提高猪的特异性免疫。
4、ELISA检测猪外周血血浆中细胞因子含量
图26为免疫记忆相关细胞因子IL-3、IL-7和IL-15在猪外周血血浆中含量的动态变化。免疫记忆相关因子能够促进免疫记忆相关细胞的分化发育促进机体免疫记忆的形成,增强机体的免疫反应。在拌喂后第28天、第42天和第56天,Po1h-IL-3/7/15组猪外周血血浆中IL-3的含量均要极显著高于空白对照组(PBS)(P<0.01);在拌喂后第14天、第42天和第56天,Po1h-IL-3/7/15组猪外周血血浆中IL-7的含量均要极显著高于空白对照组(PBS)(P<0.01);在拌喂后第14天和第28天,Po1h-IL-3/7/15组猪外周血血浆中IL-15的含量均要极显著高于空白对照组(PBS)(P<0.01)。结果表明:重组酵母Po1h-IL-3/7/15发酵产物可以促进免疫记忆相关因子的生成从而提高猪的免疫力。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种猪白细胞介素3,7和15共表达的融合蛋白,其特征在于,包括猪白细胞介素3,猪白细胞介素7和猪白细胞介素15,所述融合蛋白为如下(a1)或(a2):
(a1)由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成;
(a2)在(a1)所述氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到。
2.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码如权利要求1所述融合蛋白。
3.根据权利要求2所述一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子为如下(b1):
(b1)由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。
4.一种替抗生物材料,其特征在于,所述替抗生物材料为下述(c1)至(c6)中的任一种:
(c1)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒;
(c2)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体;
(c3)含有权利要求2或3所述核酸分子的转染/转基因细胞系;
(c4)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物;
(c5)所述转染/转基因细胞系的培养产物;
(c6)所述重组微生物的发酵产物。
5.一种应用,其特征在于,将如权利要求1所述融合蛋白,如权利要求2或3所述核酸分子,或如权利要求4所述替抗生物材料用于制备提高动物免疫能力的产品和制备疫苗。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述提高动物免疫能力为下述(d1)至(d8)中的至少一种:
(d1)促进效应靶动物的细胞免疫和/或体液免疫;
(d2)促进效应靶动物粘膜免疫屏障的建立;
(d3)促进动物发育和生长;
(d4)促进动物免疫细胞的增加;
(d5)促进动物细胞免疫和体液免疫;
(d6)促进动物粘膜免疫屏障的建立;
(d7)抗致病微生物感染;
(d8)促进疫苗诱导的免疫应答;
所述促进效应靶动物粘膜免疫屏障为猪小肠黏膜上皮细胞;所述免疫细胞为淋巴细胞或白细胞;所述致病微生物为鼠伤寒沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌;
所述动物为猪或小鼠。
7.一种产品,其特征在于,包括如权利要求1所述融合蛋白,如权利要求2或3所述核酸分子,或如权利要求4所述替抗生物材料。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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