CN117430713A - 一种猪EGF，Ghrelin和IGF-1共表达的融合蛋白、核酸分子、生物材料及应用和产品 - Google Patents
一种猪EGF，Ghrelin和IGF-1共表达的融合蛋白、核酸分子、生物材料及应用和产品 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种猪EGF，Ghrelin和IGF‑1共表达的融合蛋白、核酸分子、生物材料及应用和产品，涉及生物技术领域，包括猪EGF，Ghrelin和IGF‑1，所述融合蛋白为如下：(a1)由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成；(a2)在所述氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到；(a3)与(a1)或(a2)具有80‑99％以上同一性；(a4)将(a1)或(a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加。本发明构建了猪EGF、Ghrelin和IGF‑1融合基因，并将其整合到表达体系中获得融合蛋白，且探究了融合蛋白在体外的免疫生物调节效应、在小鼠体内的抗感染活性及在猪体内的免疫调节等生物学效应；发现融合蛋白能显著增强动物消化道粘膜的免疫屏障机能，并提高其全身免疫水平和抗细菌感染能力，具有促进动物生长发育的良好生物学效应。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪EGF，Ghrelin和IGF-1共表达的融合蛋白、核酸分子、生物材料及应用和产品。
背景技术
建立高效的预防和治疗相结合的现代动物传染性疾病防治体系，开发促进动物健康生长和增强动物机体免疫能力的食品或饲料添加剂，对保障我国养殖业可持续发展具有重要意义。鉴于此，本发明提供一种猪EGF，Ghrelin和IGF-1共表达的融合蛋白、核酸分子、生物材料及应用和产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种猪EGF，Ghrelin和IGF-1共表达的融合蛋白、核酸分子、生物材料及应用和产品。目的是提供促进动物健康生长和增强动物机体免疫能力的饲料添加剂。
本发明为了解决上述技术问题，第一个方面是提供一种猪EGF，Ghrelin和IGF-1共表达的融合蛋白，包括猪EGF，Ghrelin和IGF-1，所述融合蛋白为如下(a1)，(a2)，(a3)或(a4)：
(a1)由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成；
(a2)在(a1)所述氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到；
(a3)与(a1)或(a2)具有80-99％以上同一性且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；
(a4)将(a1)或(a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代，和/或缺失，和/或添加且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质。
在(a1)中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第1-53位为猪EGF，第54-59位为组氨酸标签，第60-62位为连接肽(GSG)，第63-81位为P2A自剪接肽，第82-96位为分泌信号肽(XPR2Pre)，第97-124位为猪Ghrelin，第125-131位为连接肽，第132-201位为猪IGF-1，第202-207位为组氨酸标签；在(a3)中优选的，与(a1)或(a2)具有80％以上，85％以上，90％以上，95％以上，98％以上，99％以上具有同一性且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
本发明第二个方面是提供一种核酸分子，所述核酸分子编码如上述所述融合蛋白。
进一步，所述核酸分子为如下(b1)，(b2)或(b3)：
(b1)由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述融合蛋白；
(b3)与(b1)或(b2)限定的所述核酸分子具有80-99％以上同源性且编码所述融合蛋白。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等；在(b1)中，SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中第1-159位核苷酸编码猪EGF，第160-177位核苷酸编码组氨酸标签，第178-186位氨基酸编码连接肽，第187-243位核苷酸编码P2A自剪接肽，第244-288位核苷酸编码分泌信号肽XPR2Pre，第289-372位核苷酸编码猪Ghrelin，第373-393位核苷酸编码Linker，第394-603位核苷酸编码猪IGF-1，第604-621位核苷酸编码组氨酸标签，第622-624位核苷酸位为终止密码子。
本发明上述使用的术语“同一性”指与天然核酸或氨基酸序列的序列相似性；同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。同源序列是指从某一共同祖先经过趋异进化而形成的不同序列。
本发明第三个方面是提供一种生物材料，所述生物材料为下述(c1)至(c6)中的任一种：
(c1)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；
(c2)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体；
(c3)含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系；
(c4)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物；
(c5)所述转基因细胞系的培养产物；
(c6)所述重组微生物的发酵产物。
所述转基因细胞系的培养产物或所述重组微生物的发酵产物，可按照包括如下步骤的方法制备：培养所述转基因细胞系或所述重组微生物，使编码基因表达，得到所述转基因细胞系的培养产物或所述重组微生物的发酵产物。例如所述转基因细胞系的培养产物为其表达的上清液；所述重组微生物的发酵产物可为其发酵液的上清液。
本发明第四个方面是提供一种应用，将如上述所述融合蛋白，如上述所述核酸分子，或如上述所述生物材料用于制备提高动物免疫能力的产品中。
进一步，所述提高动物免疫能力为下述(d1)至(d6)中的至少一种：
(d1)促进效应靶细胞免疫和/或体液免疫；
(d2)促进效应靶动物免疫屏障的建立；
(d3)促进动物发育和生长；
(d4)促进动物免疫细胞的增加；
(d5)促进动物细胞免疫和体液免疫；
(d6)抗致病微生物感染。
进一步，所述效应靶动物为猪和小鼠，所述靶细胞为小肠黏膜上皮细胞；所述免疫细胞为淋巴细胞(如T淋巴细胞)；所述致病微生物为鼠伤寒沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌。上述免疫之后产生的抗体为IgG和sIgA。
进一步，所述动物为猪或小鼠。
本发明第五个方面是提供一种产品，包括如上述所述融合蛋白，如上述所述核酸分子，或如上述所述生物材料。所述产品，可以融合蛋白，核酸分子，生物材料为活性成分，还可以将它们与其他可以提高动物免疫能力的物质组合在一起的组合物为活性成分；另外还可以添加产品上可接受的载体和/或辅料。
进一步，所述产品为疫苗或生物制剂材料。所述疫苗具体可为针对上述致病微生物的疫苗。所述生物制剂为提高动物的免疫能力，治疗上述致病微生物导致的疾病的生物药物。
本发明第六个方面是提供一种提高动物免疫能力的方法，包括如下步骤：对动物施用产品，提高所述动物的免疫能力；所述产品包括如上述所述融合蛋白，如上述所述核酸分子，或如上述所述生物材料。
实验证明，本发明的猪EGF，Ghrelin和IGF-1共表达的融合蛋白及重组酵母的发酵产品具有以下作用：(1)通过淋巴细胞增殖实验-CCK8，表明本发明合成的融合蛋白EGF/Ghrelin-IGF具有免疫生物学活性；(2)通过重组解脂耶氏酵母Po1h-EGF/Ghrelin-IGF在小鼠体内生物活性研究证明了：(a)重组酵母菌具有可靠的生物安全性；(b)调整小鼠外周血中T淋巴细胞和B淋巴细胞中各细胞亚群所占比例；(c)重组酵母Po1h-EGF/Ghrelin-IGF发酵产物调整小鼠小肠组织免疫相关基因变化(Jak-1，STAT1，IL-1β，IL-8，BD1，S100A8，Reg3，TGF-β和TNF-α基因)，可以刺激小鼠产生更多的非特异性抗体IgG，显著提高小鼠对金黄色葡萄球菌或鼠伤寒沙门氏菌免疫力；(d)在金黄色葡萄球菌或鼠伤寒沙门氏菌攻毒条件下，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组小肠绒毛高度显著高于PBS组(P<0.01)，且Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组隐窝深度显著高于PBS组(P<0.001)，提高小鼠攻毒后存活率；(3)在猪体内的生物学活性研究表明：(a)能有效地促进了猪生长发育、体重的增长，显著提高了仔猪对饲料的消化利用率，并降低了料肉比率；(b)猪外周血中白细胞、中性粒细胞，淋巴细胞和血小板数量均要显著或极显著高于空白对照组，表明重组酵母Po1h-EGF/Ghrelin-IGF具有较高的生物安全性；(c)可以增强猪的细胞免疫、体液免疫，促进免疫记忆相关因子的生成从而提高猪的免疫力。
细胞因子是具有协同高效调节免疫系统的重要分子，在各类动物组织活性细胞的分化、发育、成熟和活化中均起着不可或缺的关键调节作用。此外，多细胞因子共表达的协同效应在免疫生物学中具有更大的生物学活性调节作用和抗感染防御应用价值。因此在畜禽传染性疾病防治和保证动物正常生长发育过程中，多细胞因子共表达制剂是一种极具潜力的，能代替抗生素促进动物生长发育和增强动物免疫水平的新生物分子制剂。本发明通过构建猪EGF、Ghrelin和IGF-1融合基因，并将其整合到解脂耶氏酵母真核表达体系中获得融合蛋白，然后进一步探究融合蛋白在体外的免疫生物调节效应和重组酵母在小鼠体内的抗感染活性及其在猪体内提高免疫水平和促进生长发育的生物学效应。发现融合表达的猪EGF、Ghrelin和IGF-1能显著增强动物消化道粘膜的免疫屏障机能，并提高其全身免疫水平和抗细菌感染能力，具有促进动物生长发育的良好生物学效应。
附图说明
图1为本发明重组酵母的重组蛋白的表达量对照图；其中，a为EGF标准曲线，b为Ghrelin-IGF标准曲线，c为EGF的表达量，d为Ghrelin-IGF的表达量；
图2为本发明CCK-8细胞增殖实验图；
图3为本发明小鼠体重的动态变化对照图；
图4为本发明小鼠外周血中T淋巴细胞各细胞亚群在不同时间点下所占比例变化情况图；其中，a为细胞毒性T细胞，b为辅助T细胞，c为初始T细胞，d为中心记忆T细胞，e为效应记忆T细胞，f为调节T细胞；
图5为本发明小鼠外周血中B淋巴细胞各细胞亚群在不同时间点所占比例变化情况；其中，a为浆细胞，b为初始B细胞，c为Non-switched记忆B细胞，d为Switched记忆B细胞；
图6为本发明小鼠血浆中总IgG的变化对照图；
图7为本发明攻毒后小鼠小肠组织免疫相关基因变化情况；其中，a为金黄色葡萄球菌攻毒；b为鼠伤寒沙门氏菌攻毒；
图8为本发明小鼠粪便sIgA水平对照图；
图9为本发明小鼠攻毒结束后小肠组织形态学变化对照图；
图10为本发明小肠组织形态变化统计图；其中，a为在金黄色葡萄球菌攻毒条件下，b为在鼠伤寒沙门氏菌攻毒条件下；
图11为本发明小鼠攻毒后存活率图；其中，a为金黄色葡萄球菌攻毒条件下，b为鼠伤寒沙门氏菌攻毒条件下；
图12为本发明仔猪在不同处理下保育期生长性能的变化；其中，a为仔猪平均总增重变化，b为仔猪平均日增重变化，c为仔猪平均日采食量，d为仔猪饲料报酬；
图13为本发明仔猪外周血中白细胞数量，中性粒细胞数量，淋巴细胞数量，红细胞数量，血红蛋白浓度和血小板数量的动态变化图；其中a为白细胞，b为中性粒细胞，c为淋巴细胞，d为红细胞，e为血红蛋白，f为血小板；
图14为本发明Th1型细胞因子IL-2在猪PBMC中表达量的动态变化图；
图15为本发明Th2型细胞因子IL-4和IL-6在猪PBMC中表达量的动态变化图；其中，a为Th2型细胞因子IL-4中表达量的动态变化，b为Th2型细胞因子IL-6中表达量的动态变化；
图16为本发明免疫记忆相关细胞因子IL-15和IL-23在猪PBMC中表达量的动态变化图；其中，a为免疫记忆相关细胞因子IL-15在猪PBMC中表达量的动态变化，b为免疫记忆相关细胞因子IL-23在猪PBMC中表达量的动态变化；
图17为本发明EGF和IGF-1在猪外周血血浆中含量的动态变化图；其中，a为EGF在猪外周血血浆中含量的动态变化，b为IGF-1在猪外周血血浆中含量的动态变化图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。重组质粒均已进行测序验证。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的昆明小鼠：四川大学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(川)2018-026。下述实施例中的川乡黑猪：四川省畜牧科学院养猪研究所培育提供的新品系猪种。100×青链霉素混合液：HyClone公司。pINA1297载体(vector pINA1297)和解脂耶氏酵母Po1h(Po1h strain)均为法国农业科学院Madzak教授惠赠，均记载于如下文献：MadzakC,Gaillardin C,Beckerich JM.Heterologous protein expression and secretion inthe non-conventional yeast Yarrowia lipolytica:a review.J Biotechnol.2004Apr8；109(1-2):63-81.doi:10.1016/j.jbiotec.2003.10.027.PMID:15063615。
实施例1：猪EGF、Ghrelin和IGF-1融合基因解脂耶氏酵母共表达体系的构建及体外活性研究
一、融合蛋白EGF/Ghrelin-IGF-1及其编码基因的设计
猪EGF，Ghrelin和IGF-1共表达的融合蛋白(记为融合蛋白EGF/Ghrelin-IGF-1)如序列表的序列1(SEQ ID NO:1)所示。在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，第1-53位为猪EGF，第54-59位为组氨酸标签，第60-62位为连接肽(GSG)，第63-81位为P2A自剪接肽，第82-96位为分泌信号肽(XPR2Pre)，第97-124位为猪Ghrelin，第125-131位为连接肽，第132-201位为猪IGF-1，第202-207位为组氨酸标签。
序列表的序列2(SEQ ID NO:2)所示的DNA分子编码融合蛋白EGF/Ghrelin-IGF-1，将该DNA分子命名为EGF/Ghrelin-IGF-1融合基因。SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中，第1-159位核苷酸编码猪EGF，第160-177位核苷酸编码组氨酸标签，第178-186位氨基酸编码连接肽，第187-243位核苷酸编码P2A自剪接肽，第244-288位核苷酸编码分泌信号肽XPR2Pre，第289-372位核苷酸编码猪Ghrelin，第373-393位核苷酸编码Linker，第394-603位核苷酸编码猪IGF-1，第604-621位核苷酸编码组氨酸标签，第622-624位核苷酸位为终止密码子。
其中，EGF/Ghrelin-IGF-1融合基因片段由南京金斯瑞生物技术有限公司全基因合成获得，并构建到自克隆穿梭载体pINA1297上，重组穿梭载体命名为pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1。
二、重组穿梭载体转化大肠杆菌及大提质粒
1、重组穿梭载体转化大肠杆菌
(1)将构建好的重组穿梭载体pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1转化至大肠杆菌感受态细胞(购于天根生化科技(北京)有限公司)Top10，将菌液涂布到含卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基平板上，正面放置培养30min，后置于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。
(2)挑取LB平板上的单菌落于1mL LB含50mg/ml卡那霉素的液体培养基中，摇床培养2h，随后将菌液转移到5mL新鲜LB液体培养基中，过夜培养12-16h，保存菌液以进行下一步实验。
2、阳性克隆的筛选和鉴定
将上述阳性转化子通过菌落PCR和测序进行鉴定。
3、重组自克隆载体pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1的提取
根据OMEGA公司质粒小量提取试剂盒的操作步骤说明书对步骤1对(2)的菌液进行重组自克隆载体pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1的提取，提取产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
三、重组解脂耶氏酵母Po1h-pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1的构建
1、重组质粒pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1线性化及转化
(1)将pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1重组质粒用限制性内切酶Not I进行线性化处理，将回收的线性化片段转化至解脂耶氏酵母Po1h感受态细胞，得到重组酵母，命名为Po1h-EGF/Ghrelin-IGF-1(又称为Po1h-EGF/Ghrelin-IGF)。
(2)取pINA1297空载质粒，同样用限制性内切酶NotⅠ进行线性化处理，将得到的线性化片段转化至解脂耶氏酵母Po1h感受态细胞，得到重组酵母，命名为Po1h-pINA1297。
四、EGF/Ghrelin-IGF-1融合基因在解脂耶氏酵母中的表达及体外活性研究
1、蛋白水平检测
将Po1h-EGF/Ghrelin-IGF和重组酵母Po1h-pINA1297分别接种至装有100ml YPD液体培养基(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨和20g/L葡萄糖)的250ml摇瓶，28℃、200rpm空气浴振荡培养48h，取发酵液超声波裂解处理(功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次)，4℃、10000rpm离心收集上清液进行重组蛋白表达水平的测定，参照猪EGF ELISAKit(武汉华美生物工程有限公司，CSB-E06788p)和IGF-1ELISA Kit(武汉华美生物工程有限公司，CSB-E06829p)试剂盒说明书检测重组酵母破碎上清液中重组蛋白表达情况。
结果见图1，其中，a为EGF标准曲线，b为Ghrelin-IGF标准曲线，c为EGF的表达量，d为Ghrelin-IGF的表达量。重组酵母Po1h-EGF/Ghrelin-IGF的破碎上清中检测到目的蛋白的表达，猪EGF和Ghrelin-IGF含量分别为2.851ng/mL和206.147ng/mL。重组酵母Po1h-pINA1297的破碎上清中仅检测到微量的相应目的蛋白表达。
2、淋巴细胞增殖实验-CCK8
(1)淋巴母细胞的制备
无菌条件下采取猪前腔静脉外周血5mL，EDTA-2K(EDTA-2K分子式是C10H14K2N2O8·2H2O)抗凝，按照猪外周血淋巴细胞分离液KIT(天津灏洋华科生物科技有限公司，中国)说明书分离猪淋巴细胞。将分离到的细胞用完全1640培养液(含10％小牛血清，100μg/mL氨卞青霉素，100μg/mL链霉素)稀释至细胞终浓度2×106个/mL，分至直径为10cm的细胞培养皿中，每皿10mL，最后再加入终浓度为10μg/mL的Con A(L7647,Merck KGaA,Germany)进行刺激，置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养24h。
(2)生物学活性检测
培养24h后，将培养皿中的猪淋巴母细胞收集至干净的离心管中，1500rpm离心15min收集细胞；用1640完全培养基(含双抗与血清)洗细胞2次，1500rpm离心15min。
用含20mg/mLα-MM的1640培养基调整细胞至约6×106个/mL，分别向96孔板实验孔中加入100μL靶细胞(猪淋巴母细胞)和同体积的Po1h-EGF/Ghrelin-IGF破碎上清液及Po1h-pINA1297破碎上清液；每个样品设3个重复孔，并设有对照孔，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养48h；48h后，取出96孔板，每孔加入10μL CCK8轻轻吹匀继续培养2h；取出96孔板，用Bio-Reader680检测每孔OD450。
结果见图2。使用CCK-8试剂盒对重组酵母Po1h-EGF/Ghrelin-IGF破碎上清促进猪淋巴母细胞增殖的能力进行检测，发现Po1h-EGF/Ghrelin-IGF破碎上清液较空载组PBS和空白对照组Po1h-pINA1297显著提高淋巴母细胞增殖(P<0.05)，说明重组蛋白具有生物学活性。
实施例2：重组解脂耶氏酵母Po1h-EGF/Ghrelin-IGF在小鼠体内生物活性研究一、重组酵母发酵液的制备
1、将Po1h-pINA1297经YPD平板划线接种复苏活化后，挑取单菌落接种于含30mLYPD培养基的100mL摇瓶中，在28℃，220rpm空气浴振荡培养48h，使OD600约为10，得到Po1h-pINA1297发酵液。
2、按照上述方法，将Po1h-pINA1297替换为Po1h-EGF/Ghrelin-IGF，其他步骤均不变，得到Po1h-EGF/Ghrelin-IGF重组酵母发酵液。
二、小鼠实验方案
1、小鼠分组及实验处理
(1)将30只4-5周龄SPF级健康雌性昆明小鼠，体重约18克，随机分成3组，分别为空白对照组、空载对照组和实验组，每组10只。
(2)空白对照组：
磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline，PBS)灌胃小鼠，灌胃量为100μL/只/次，每3天灌胃一次，共灌胃10次。
(3)空载对照组：
Po1h-pINA1297重组酵母发酵液灌胃小鼠，灌胃量为4×108CFU/只/次(100μL)，每3天灌胃一次，共灌胃10次。
(4)实验组：
Po1h-EGF/Ghrelin-IGF重组酵母发酵液灌胃小鼠，灌胃量为4×108CFU/只/次，每3天灌胃一次，共灌胃10次。
(5)攻毒
灌胃处理28天后开始进行攻毒。攻毒过程：浓缩鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)，用新鲜的液体LB培养基重悬，得到1.0×1010CFU/mL的菌悬液，即为攻毒液；每间隔一天灌胃一次，共灌胃3次，每次每只小鼠灌胃300μL菌悬液(每组5只)，每次灌胃前小鼠禁食不禁水2h。灌胃当天即为攻毒后第0天。每24h观察一次小鼠的发病情况，并统计小鼠存活率，解剖观察死亡的小鼠内部器官的变化。用同样的方法进行金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)攻毒实验。
2、样品及数据采集
(1)体重指标
连续四周每周称重一次，记录各组小鼠体重的动态变化。
结果见图3。各组小鼠体重在Day7至Day28的差异均不显著(P>0.05)，说明该重组酵母具有可靠的生物安全性。
(2)血液免疫指标
分别于第一次灌胃前，灌胃后的第7、14、21、28天以及攻毒后第三天，从小鼠尾静脉割尾采集外周血。
(3)粪便/肠道免疫指标
分别于灌胃后的第28天以及攻毒后第三天，收集小鼠新鲜粪便；攻毒结束小鼠处死后采集小肠组织，进行形态学分析以及转录水平分析。
3、流式细胞术分析小鼠外周血中免疫细胞的变化
对灌胃后第7、14和28天采集的抗凝血进行流式细胞术分析。小鼠各时间点外周血经荧光抗体标记后，流式细胞术分析PBS组、Po1h-pINA1297组、Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组淋巴细胞数量变化情况，T淋巴细胞免疫分型可得Th、Tc、Naive T Cell、Tcm、Tem、Teff、Treg等，B淋巴细胞免疫分型可得Plasma Cell、Naive B Cell、Switched Memory BCell、Non-switched Memory B Cell等。淋巴细胞分型的标志物如表1所示。
表1淋巴细胞分型的标志物
| 淋巴细胞亚群 | 免疫细胞标志物 |
| T Cells | CD3+ |
| Cytotoxic T Cells(Tc) | CD3+/CD8+ |
| Helper T Cells(Th) | CD3+/CD4+ |
| Th Central Memory(TCM) | CD3+/CD4+/CD44+/CD62L+ |
| Th Effector Memory(TEM) | CD3+/CD4+/CD44+/CD62L2- |
| Naive T Cells | CD3+/CD4+/CD44-/CD62L+ |
| Regulatory T Cells(Treg) | CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+ |
| B Cells | CD19+ |
| B Unswitched Memory(BUSM) | CD19+/CD27+/IgD+ |
| B Switched Memory(BSM) | CD19+/CD27+/IgD- |
| Naive B Cells | CD19+/CD27-/IgD+ |
| Plasma Cells | CD27+/CD38+ |
图4为小鼠外周血中T淋巴细胞各细胞亚群在不同时间点下所占比例变化情况：(a)细胞毒性T细胞、(b)辅助T细胞、(c)初始T细胞、(d)中心记忆T细胞、(e)效应记忆T细胞、(f)调节T细胞。图4(a)中PBS组、Po1h-pINA1297组和Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组的细胞毒性T细胞数量差异不显著(P>0.05)；图4(b)中Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组的辅助T细胞数量在7-14天时明显多于PBS组和Po1h-pINA1297组(P<0.05)；28天时它们的差异不显著。图4(c)中3组的初始T细胞数量均上升，其中Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组的初始T细胞数量在D14和D28显著多于其余两组；图4(d)中三组的中心记忆T细胞数量差异不明显(P>0.05)；图4(e)中PBS组和Po1h-pINA1297组的效应记忆T细胞数量呈现先减后增的趋势，而Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组的TEM细胞数量则不断降低；但D28的TEM细胞比例明显低于D14，图4(f)中PBS组和Po1h-pINA1297组的Treg数量在7-14天时显著高于Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组(P<0.05)；28天时Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组的调节T细胞数量超过其它两组(P>0.05)。
图5为小鼠外周血中B淋巴细胞各细胞亚群在不同时间点所占比例变化情况：(a)浆细胞、(b)初始B细胞、(c)Non-switched记忆B细胞、(d)Switched记忆B细胞。图5(a)中三组浆细胞数量均先增后减，且在D14时间点，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组的浆细胞数量最多，明显多于对照组(P<0.05)；图5(b)中3组初始B细胞保持比例增加的趋势，差异不显著(P>0.05)；图5(c)中PBS组和Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组的Non-switched记忆B细胞数量先增后减，14天时其差异显著(P<0.05)；而Po1h-pINA1297组的Non-switched记忆B细胞数量则逐渐增加；28天时与其他组差异显著(P<0.05)；图5(d)中3组的Switched记忆B细胞数量变化趋势基本一致，均逐渐降低，相互差异不显著(P>0.05)。
4、小鼠血浆中总IgG的变化
取灌胃后第7、14、28天以及攻毒后第3天小鼠尾静脉EDTA抗凝外周血200μL(在4000rpm条件下，离心20min取上清得到血浆，按照小鼠免疫球蛋白G(IgG)试剂盒(ELISA)使用说明书(RX202736M，睿信生物)测定小鼠血浆中总IgG的变化。
结果见图6。在攻毒后前的3个时间点中Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组小鼠外周血血浆中IgG的含量均要极显著高于空白对照组(PBS)小鼠IgG的含量(P<0.01)；在D28和金黄色葡萄球菌攻毒后Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组小鼠血浆中IgG含量分别极显著和显著高于Po1h-pINA1297组(P<0.01,P<0.05)；结果表明，重组酵母Po1h-EGF/Ghrelin-IGF发酵产物可以刺激小鼠产生更多的非特异性抗体IgG，且有效地增强小鼠抵抗金黄色葡萄球菌的能力。
5、小鼠小肠组织免疫相关基因变化情况
(1)小鼠小肠组织样本处理
采集攻毒结束后小鼠小肠组织25mg，用液氮研磨，提取总RNA并反转录成cDNA，采用荧光定量PCR检测肠道组织中Jak-1，STAT1，IL-1β，IL-8，BD1，S100A8，Reg3，TGF-β和TNF-α基因的表达情况。用于检测小鼠小肠组织中免疫相关基因的引物见表2。
表2检测小鼠小肠组织中免疫相关基因的引物
图7为攻毒后小鼠小肠组织免疫相关基因变化情况，(a)中为金黄色葡萄球菌攻毒条件下，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组小鼠小肠中各种免疫相关基因(包括Jak-1，STAT1，IL-1β，IL-8，BD1，S100A8，Reg3，TGF-β和TNF-α基因)的表达量均要极显著高于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组(PBS)(P<0.01)，说明重组酵母Po1h-pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1发酵产物能显著提高小鼠对金黄色葡萄球菌的免疫力；(b)中为鼠伤寒沙门氏菌攻毒条件下，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组小鼠小肠免疫相关基因中，仅有S100A8基因表达水平显著高于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组(PBS)(P<0.01)，而TGF-β基因表达水平则极显著低于空载组(Po1h-pINA1297)和空白对照组(PBS)(P<0.001)。
6、小鼠粪便sIgA水平
采集灌胃后第28天以及攻毒后第3天小鼠的新鲜粪便，以4mL/g加0.01M PBS、0.05M EDTA缓冲液悬浮，冰上震荡15min，4℃10000g离心5min，上清液-80℃冻存待检测用。按照小鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)定量检测试剂盒(ELISA)使用说明书(RX-G202950M，睿信生物)检测粪便sIgA的含量。
图8为小鼠粪便sIgA水平，在D28和不同攻毒条件下，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组小鼠粪便中sIgA含量极显著高于PBS组和空载组Po1h-pINA1297(P<0.001)，且Po1h-pINA1297组与PBS组两组粪便sIgA含量均较低，说明融合蛋白EGF/Ghrelin-IGF-1具有较高的增强sIgA表达水平的作用。
7、小鼠攻毒后小肠组织形态学变化
攻毒结束后各组小鼠取小肠组织经苏木精伊红(H&E)染色观察并测量绒毛高度、隐窝深度、肠壁厚度，以评估小肠结构与功能。
图9为小鼠攻毒结束后小肠组织形态学变化。图10为小肠组织形态变化统计图。(a)在金黄色葡萄球菌攻毒条件下，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组小肠绒毛高度显著高于PBS组(P<0.01)；(b)在鼠伤寒沙门氏菌攻毒条件下，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组小肠绒毛高度显著高于PBS组和空白对照组Po1h-pINA1297(P<0.001)，且Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组隐窝深度显著高于PBS组(P<0.001)。
8、小鼠攻毒后存活率
小鼠灌胃第28天后，每组中5只金黄色葡萄球菌攻毒，另外5只鼠伤寒沙门氏菌攻毒，观察两周后处死，记录攻毒后每天小鼠数量变化，统计小鼠存活天数，计算存活率，绘制小鼠攻毒后生存曲线。
图11为小鼠攻毒后存活率。(a)为金黄色葡萄球菌攻毒条件下；(b)为鼠伤寒沙门氏菌攻毒条件下。在两种攻毒条件下，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组与PBS组和空载组Po1h-pINA1297小鼠存活率差异显著(P<0.05)，说明小鼠灌胃Po1h-EGF/Ghrelin-IGF发酵液免疫28天后显著增加了其攻毒后存活天数，显著改善并提高了小鼠攻毒后存活率。两种条件下攻毒两周后，PBS组仅有40％的小鼠存活，Po1h-pINA1297组为60％，而Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组存活率100％。
实施例3：猪EGF、Ghrelin和IGF-1融合蛋白在猪体内的生物学活性研究
一、重组酵母Po1h-pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1发酵产物的制备
1、将重组酵母Po1h-pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1接种于2.5mL液体YPD培养基，28℃、200rpm空气浴振荡培养过夜；
2、取步骤1得到的菌液，接种于装有1L液体YPD培养基的2L摇瓶中，28℃、220rpm空气浴震荡培养至OD600为20(约24h)；
3、取步骤2得到的菌液，以10％的接种量接种至装有10L BSM发酵培养基(BSM发酵培养基1L：磷酸,85％(26.7ml)，硫酸钙0.93g，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g，氢氧化钾4.13g，甘油40.0g，蒸馏水补加至1L；PTM1 1L：无水硫酸铜6.0g，碘化钠0.08g，一水硫酸锰3.0g，二水钼酸钠0.2g，硼酸0.02g，氯化钴0.5g，氯化锌20.0g，七水硫酸亚铁65.0g，生物素0.2g，浓硫酸5.0ml，室温下0.22μm微孔过滤除菌；1L BSM培养基加入40mL PTM1)的15L发酵罐中，28℃、400rpm搅拌培养至OD600为80(约48h)，得到的整个发酵体系命名为Po1h-pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1发酵产物。
二、试验动物分组及处理
1、38头健康川乡黑猪，出生体重约为2.4kg左右，随机分成2组(实验组20头，对照组19头)；
2、实验组(Po1h-pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1-组)：从10日龄开始，Po1h-pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1酵母液分别按每头仔猪20ml添加于教槽料中，每两天添加一次直至28天哺乳期结束；28日龄后按照30ml/头将酵母液添加于保育饲料中(商品料是由嘉吉饲料(重庆)有限公司生产的仔猪配合饲料(620)，原料组成为膨化玉米、玉米、豆粕、白糖、乳清粉、石粉、磷酸二氢钙、氯化钠、维生素及类维生素、矿物元素及其络(螯)合物、氯化锌、L-赖氨酸、DL-蛋氨酸、苏氨酸和防霉剂(丙酸钙)等)，每两天一次饲喂至56天保育期结束；对照组用等量PBS加入常规教槽料和保育料饲料饲喂，不添加其它原料；
3、分别在出生后第14天、第28天，第42天和第56天采集每头猪颈静脉血，进行如下实验内容：2.5mL抗凝血分别用于血常规检测和PBMC中免疫相关基因表达情况，剩余抗凝血分离血浆检测相关细胞因子含量变化；在出生时和保育期结束时称取各组实验猪的体重。
三、各个指标的检测
1、仔猪生长性能指标
图12为仔猪在不同处理下保育期生长性能的变化，其中，a为仔猪平均总增重变化，b为仔猪均日增重变化，c为仔猪平均日采食量，d为仔猪饲料报酬。Po1h-pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1实验组平均总增重和平均日增重均要极显著高于对照组(PBS)(P<0.01)；而Po1h-pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1实验组平均日采食和饲料报酬均要极显著低于对照组(PBS)(P<0.01)，结果表明：重组酵母Po1h-pINA1297-EGF/Ghrelin-IGF-1发酵产物能有效地促进了仔猪体重的增长，显著提高了仔猪对饲料的消化利用率，并降低了料肉比率。
2、血常规
图13(a，b，c，f)分为仔猪外周血中白细胞，中性粒细胞，淋巴细胞和血小板数量的动态变化。在整个拌喂饲喂周期中，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组猪外周血中白细胞，中性粒细胞，淋巴细胞和血小板数量均与空白对照组(PBS)中的数量差异不显著(P>0.05)。结果说明，重组酵母Po1h-EGF/Ghrelin-IGF具有较高的生物安全性；图13(d和e)为仔猪外周血中红细胞数量和血红蛋白浓度的动态变化。在拌喂第14天时，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组猪外周血中红细胞数量和血红蛋白浓度均显著高于空白对照组(PBS)(P<0.05)；而其余三个时间点，实验组和对照组外周血中红细胞数量和血红蛋白浓度没有显著性差异(P>0.05)。
3、荧光定量PCR检测PBMC中免疫相关基因的表达情况
图14为Th1型细胞因子IL-2在猪PBMC中表达量的动态变化。Th1型细胞因子主要介导细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，辅助抗体产生，参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的发生。在拌喂后第56天，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组猪PBMC中IL-2的表达量要极显著高于空白对照组(PBS)(P<0.01)。结果证明：重组酵母Po1h-EGF/Ghrelin-IGF发酵产物可以增强猪的细胞免疫。
图15为Th2型细胞因子IL-4和IL-6在猪PBMC中表达量的动态变化，其中，a为Th2型细胞因子IL-4中表达量的动态变化，b为Th2型细胞因子IL-6中表达量的动态变化；Th2型细胞因子主要功能为刺激B细胞增殖并产生IgG，参与体液免疫。在拌喂后第56天，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组猪PBMC中IL-4和IL-6的表达量均要显著高于空白对照组(PBS)(P<0.05)。结果说明：重组酵母Po1h-EGF/Ghrelin-IGF发酵产物可以增强猪的体液免疫。
图16为免疫记忆相关细胞因子IL-15和IL-23在猪PBMC中表达量的动态变化；其中，a为免疫记忆相关细胞因子IL-15在猪PBMC中表达量的动态变化，b为免疫记忆相关细胞因子IL-23在猪PBMC中表达量的动态变化。免疫记忆相关因子能够促进免疫记忆相关细胞的分化发育促进机体免疫记忆的形成，增强机体的免疫反应。在拌喂后第56天，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组猪PBMC中IL-15和IL-23的表达量均要极显著高于空白对照组(PBS)的表达量(P<0.01)。结果表明：重组酵母Po1h-EGF/Ghrelin-IGF发酵产物可以促进免疫记忆相关因子的生成从而提高猪的免疫力。
4、ELISA检测猪外周血血浆中EGF和IGF-1含量
图17为EGF和IGF-1在猪外周血血浆中含量的动态变化；其中，a为EGF在猪外周血血浆中含量的动态变化，b为IGF-1在猪外周血血浆中含量的动态变化图。在拌喂后第42天和第56天，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组猪外周血血浆中EGF的含量均要显著高于空白对照组(PBS)(P<0.05)；在拌喂后第28天和第42天，Po1h-EGF/Ghrelin-IGF组猪外周血血浆中IGF-1的含量均极显著高于空白对照组(PBS)(P<0.01)。
综上可知，本发明通过构建猪EGF、Ghrelin和IGF-1融合基因，并将其整合到解脂耶氏酵母真核表达体系中获得融合蛋白，然后进一步探究融合蛋白在体外的免疫生物调节效应和重组酵母在小鼠体内的抗感染活性及其在猪体内提高免疫水平和促进生长发育的生物学效应。发现融合表达的猪EGF、Ghrelin和IGF-1能显著增强动物消化道粘膜的免疫屏障机能，并提高其全身免疫水平和抗细菌感染能力，具有促进动物生长发育的良好生物学效应。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种猪EGF，Ghrelin和IGF-1共表达的融合蛋白，其特征在于，包括猪EGF，Ghrelin和IGF-1，所述融合蛋白为如下(a1)，(a2)，(a3)或(a4)：
(a1)由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成；
(a2)在(a1)所述氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到；
(a3)与(a1)或(a2)具有80-99％以上同一性且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；
(a4)将(a1)或(a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代，和/或缺失，和/或添加且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述融合蛋白。
3.根据权利要求2所述一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为如下(b1)，(b2)或(b3)：
(b1)由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述融合蛋白；
(b3)与(b1)或(b2)限定的所述核酸分子具有80-99％以上同源性且编码所述融合蛋白。
4.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述(c1)至(c6)中的任一种：
(c1)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；
(c2)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体；
(c3)含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系；
(c4)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物；
(c5)所述转基因细胞系的培养产物；
(c6)所述重组微生物的发酵产物。
5.一种应用，其特征在于，将如权利要求1所述融合蛋白，如权利要求2或3所述核酸分子，或如权利要求4所述生物材料用于制备提高动物免疫能力的产品中。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提高动物免疫能力为下述(d1)至(d6)中的至少一种：
(d1)促进效应靶细胞免疫和/或体液免疫；
(d2)促进效应靶动物免疫屏障的建立；
(d3)促进动物发育和生长；
(d4)促进动物免疫细胞的增加；
(d5)促进动物细胞免疫和体液免疫；
(d6)抗致病微生物感染。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述效应靶动物为猪和小鼠，所述靶细胞为小肠黏膜上皮细胞；所述免疫细胞为淋巴细胞；所述致病微生物为鼠伤寒沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌。
8.根据权利要求5至7任一项所述的应用，其特征在于，所述动物为猪或小鼠。
9.一种产品，其特征在于，包括如权利要求1所述融合蛋白，如权利要求2或3所述核酸分子，或如权利要求4所述生物材料。
10.根据权利要求9所述产品，其特征在于，所述产品为疫苗或生物制剂材料。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |