CN108822202A - 一种草鱼白细胞介素21重组蛋白及其制备方法 - Google Patents

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CN108822202A CN201810124904.3A CN201810124904A CN108822202A CN 108822202 A CN108822202 A CN 108822202A CN 201810124904 A CN201810124904 A CN 201810124904A CN 108822202 A CN108822202 A CN 108822202A
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Abstract

本发明涉及一种草鱼白细胞介素21重组蛋白及其制备方法，本发明包括：同源克隆技术从草鱼鳃组织中克隆获得草鱼白细胞介素21蛋白的编码序列；构造蛋白成熟肽重组表达质粒，将其转化到细菌中，克隆得到工程菌株；对得到的工程菌株，通过诱导剂进行诱导表达后，经分离纯化变复性处理获得有活性的重组草鱼白介素21蛋白。本发明在获得高纯度的重组蛋白时减少了亲和层析步骤，极大地简化了获取目的蛋白的流程和成本，且纯度高达95%；具有较高的活性蛋白获得率；操作简便易行，生产成本低。

Description

一种草鱼白细胞介素21重组蛋白及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种草鱼白细胞介素21重组蛋白及其制备方法。
背景技术
白细胞介素21（interleukin-21，IL-21）是由 Parrish-Novak 等于 2000 年从活化的 CD3 + T 细胞中克隆出的四螺旋簇Ⅰ型细胞因子γ 链（γc）家族中的新型细胞因子，主要由活化的CD4+T细胞和自然杀伤（NKT）产生，它能够调控免疫和非免疫细胞功能从而参与各种组织损害过程，IL-21控制T细胞、B细胞和NK细胞的分化和功能活性，限制诱导性T细胞(Treg)的分化，使得T细胞对于Treg介导的免疫抑制发生抵抗。IL-21作为一种的新型的免疫系统调节因子，具有多种生物学功能，对于炎症性疾病的治疗具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种草鱼白细胞介素21重组蛋白。本发明的另一目的在于提供一种草鱼白细胞介素21重组蛋白的制备方法。为实现本发明的目的，本发明提供了包括该蛋白基因的克隆、该蛋白成熟肽重组表达质粒的构建方法、大肠杆菌BL21(DE3)的转化、阳性转化菌的筛选、大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达方法以及重组蛋白的分离纯化和变复性方法、重组蛋白的生物活性鉴定等。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种草鱼白细胞介素21重组蛋白，其特征在于，所述草鱼白细胞介素21重组蛋白的基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，所述草鱼白细胞介素21重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种草鱼白细胞介素21重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1、获得草鱼白细胞介素21蛋白的编码序列：在PCR反应条件下，以草鱼鳃组织制备cDNA为模板，引入PCR引物，进行PCR扩增，得到目标片段，在克隆PCR反应条件下利用同源克隆技术获得草鱼白细胞介素21蛋白的编码序列；
S2、构建蛋白成熟肽重组表达质粒及工程菌株：对照草鱼白细胞介素21蛋白的编码序列对应的酶切位点和pET30a（+）载体的酶切位点，设计含有酶切位点的引物，PCR扩增，完成加A反应后将其连接到pGEM-T easy质粒中，转化，扩增目的克隆，抽提质粒与表达载体分别进行双酶切反应，电泳回收目的片段，得到质粒酶切产物和载体酶切产物，用连接酶将其连接到所需载体，在0~10℃温度下转化克隆培养，提取出具有草鱼IL-21活性蛋白的重组表达质粒，将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，培育出工程菌株；
S3、获取重组草鱼白介素21蛋白：将筛选所得的工程菌株，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂进行诱导表达后，经分离纯化变复性方法处理获得有活性的重组草鱼白介素21蛋白。
进一步地，所述步骤S2中含酶切位点的引物：gcIL-21 F NdeI 5’ CAT ATG GAGCTG TCG CCG ATG CAA CTCA 3’，gcIL-21 R BamHI5’ GGA TCC CCT GCT TGA CTG GCA TAGATC TTT TG 3’。
进一步地，所述步骤S2中克隆培养的优选温度：4℃，提取质粒工具为天根质粒抽提试剂盒。
进一步地，所述的步骤S3中的分离纯化变复性方法包括以下步骤：
（ⅰ）包涵体的洗涤：用培养基0.1倍体积的洗涤缓冲液对包涵体进行洗涤，4℃、10000*g、10min离心弃上清，重复洗涤三次；所述洗涤缓冲液为200mM Tris·Hcl，100mM EDTA，10%Triten X-100，pH7.5；
（ⅱ）包涵体蛋白的溶解：按30mg/ml的终浓度加入变性缓冲液，4℃溶解包涵体蛋白，溶解后的包涵体蛋白低温高速离心，4℃、10000*g、10min，除去未溶解沉淀，离心后留上清置于-80℃冻存备用；所述变性缓冲液为8M urea，10% 甘油，50mM Tris，100mM Nacl，10mMEDTA，10mM DTT，pH8.0；
（ⅲ）溶解蛋白质的折叠复性：溶解蛋白质的折叠复性，将上步所得的溶解后包涵体蛋白质以终浓度20-50μg/ml缓慢滴加至经0.22μm滤膜过滤后的折叠缓冲液中，以5-6滴/次、1min/次的滴加速度边滴加边搅拌，滴加完毕后，4℃搅拌过夜；所述折叠缓冲液为100mMTris，400mM L-Arg·Hcl，2mM EDTA，5mM 还原型谷胱甘肽，0.5mM 氧化性型谷胱甘肽，0.5mM PMSF，pH8.0；
（ⅳ）收集重组蛋白：利用Milliproe截留量3KDa的离心超滤管进行超滤去折叠缓冲液并以缓冲液稀释复性后蛋白从而进行脱盐，收集超滤管中截留的重组蛋白；所述缓冲液为10mmol/L Na2HPO4，10mmol/L NaH2PO4 ·2H2O，pH=7.4。
进一步地，所述的步骤还包括鉴定重组蛋白的功能鉴定，具体操作如下：分离草鱼头肾淋巴细胞，按6×105/孔接种到24孔板中，用含10％小牛血清，0.1%双抗的RPMI 1640培养液于28℃，5% CO2 浓度下培养过夜，分别加入不同浓度的所得重组蛋白刺激细胞3小时后，检测rgcIL-21所诱导表达的IFN-γ2的基因表达情况。
本发明的有益效果是：在获得高纯度的重组蛋白时减少了亲和层析步骤，极大地简化了获取目的蛋白的流程和成本，且纯度高达95%；具有较高的活性蛋白获得率，从1.6mg的变性蛋白中就能够获得200 μg的活性蛋白；操作简便易行，生产成本低。
附图说明
图1为重组草鱼白介素21的SDS–PAGE电泳分析图；
其中M为Mark，1为变性缓冲液中的包涵体蛋白，2为复性脱盐后重组蛋白；
图2为rgcIL-21刺激IFN-γ2表达的效应图；
其中，横坐标表示不同浓度的rgcIL-21，单位为ng/ml；纵坐标表示不同药物浓度处理相比于内参基因β-actin的草鱼IFN-γ2的上调倍数。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例一、获得草鱼白细胞介素21蛋白的编码序列
利用同源克隆技术从草鱼鳃组织中克隆获得草鱼白细胞介素21蛋白的编码序列。
根据鱼类白介素21基因同源比较的结果，从草鱼全基因组中设计引物IL-21 F5’-GTACAGAAGAAACTTTGCAGC-3’,IL-21 R 5’-GTCTCTTCACTCTTCTCGTCT-3’。由草鱼鳃组织制备cDNA，从中克隆得到草鱼白介素21蛋白的编码序列。使用Taq酶进行PCR扩增。
PCR 反应条件如下：
草鱼鳃组织cDNA 0.3μl
10×PCR Buffer 1μl
25mM MgCL2 0.8μl
10mM dNTP 0.2μl
10μM IL-21F 0.2μl
10Μm IL-21R 0.2μl
5U/μl Taq酶 0.1μl
加水补到总体积为 10μl
PCR 反应条件：l个循环：94℃ 5min；35个循环：94℃ 30s ， 63℃ 30s,，72℃ 15s ；l个循环：72℃ 10min ，4℃ 保存。用1%琼脂糖对目标PCR产物进行电泳，将目的片段回收，并用连接酶将目的片段与pGEM-T easy载体,转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中，通过LB/Amp+平板进行筛选后，用基因特异性引物进行PCR近一步筛选阳性克隆，单克隆筛选的PCR条件如下：1个循环：94℃ 5min；25个循环：94℃ 30s ， 63℃ 30s，72℃ 15s ；l个循环：72℃ 10min ，4℃ 保存。挑取阳性单克隆测序。
本步骤成功进行后，得到一种草鱼白细胞介素21蛋白的编码序列，该碱基序列是序列表中的 SEQ ID No.1。由该碱基序列翻译得到草鱼白细胞介素21蛋白，该蛋白的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.2。
序列Seq No.1
1 ATGAAGGCAT CCGTGTTTGT TCTGTTCGCA GTGGCGTGTT GGTTCGTTTC GCAGGCAGAG
61 CTGTCGCCGA TGCAACTCAC GCTCAGAAAA GTTATGAATG AACTCGAGAA GGTCAATAAC
121 GTAATGGACA AAAGCACAAG TTCGTTCAAC TCACCCACCA CCAACGATTT GAAGGACTGC
181 TGCATCAGAT CTGCTCTGGA GTGCTTTAGG TCCCAAGTGA TGAACCTGAA TGTCACTCAA
241 GAGAAACCTA TAATAAAGTC ACTGAAGAGC ATCTCCAACG AGTCCCGAAA AAAAGTCATT
301 GTGGAAAAGT TGCCCAGTTG CAACCTGGTA GAAGGTGAGA AAAAGGAAGC TCAGTGCAAA
361 CCCTGTGAAT CGTACAGCAA GGTTAACAGC CAAATGTTCG TGCAGAACTT TCAAACTCTT
421 CTTCAAAAGA TCTATGCCAG TCAAGCATAG
序列Seq No.2
Met Lys Ala Ser Val Phe Val Leu Phe Ala Val Ala Cys Trp Phe Val
1 5 10 15
Ser Gln Ala Glu Leu Ser Pro Met Gln Leu Thr Leu Arg Lys Val Met
20 25 30
Asn Glu Leu Glu Lys Val Asn Asn Val Met Asp Lys Ser Thr Ser Ser
35 40 45
Phe Asn Ser Pro Thr Thr Asn Asp Leu Lys Asp Cys Cys Ile Arg Ser
50 55 60
Ala Leu Glu Cys Phe Arg Ser Gln Val Met Asn Leu Asn Val Thr Gln
65 70 75 80
Glu Lys Pro Ile Ile Lys Ser Leu Lys Ser Ile Ser Asn Glu Ser Arg
85 90 95
Lys Lys Val Ile Val Glu Lys Leu Pro Ser Cys Asn Leu Val Glu Gly
100 105 110
Glu Lys Lys Glu Ala Gln Cys Lys Pro Cys Glu Ser Tyr Ser Lys Val
115 120 125
Asn Ser Gln Met Phe Val Gln Asn Phe Gln Thr Leu Leu Gln Lys Ile
130 135 140
Tyr Ala Ser Gln Ala
145
实施例二、构建蛋白成熟肽重组表达质粒及工程菌株
对该蛋白基因序列翻译所得的氨基酸序列进行生物信息学分析，通过与其它物种的类似功能蛋白的结构进行比较后，确定该蛋白需表达的成熟肽。
再对该蛋白成熟肽所对应的核酸序列通过NEB cutter 软件进行分析，确定核酸序列上所含有的内切酶的酶切位点。选用pET30a（+）质粒为表达该蛋白成熟肽所需的载体，将该蛋白成熟肽对应核酸序列上所含的酶切位点与该载体上的多克隆位点上的酶切位点进行比对，选择表达载体上含有而目的核酸序列上没有的NdeI和BamHI位点作为构建质粒的酶切位点，设计含有酶切位点的引物为：gcIL-21 F NdeI 5’ CAT ATG GAG CTG TCG CCGATG CAA CTCA 3’ 和gcIL-21 R BamHI5’ GGA TCC CCT GCT TGA CTG GCA TAG ATC TTTTG 3’。使用高保真酶phusion进行PCR扩增。
PCR 反应条件如下：
草鱼鳃组织cDNA 0.3μl
5×PCR Buffer 4μl
25mM MgCL2 0.6μl
10mM dNTP 0.4μl
10μM gcIL-21 NdeI 0.4μl
10μM gcIL-21 BamHI 0.4μl
5U/μl 高保真酶 0.4μl
加水补到总体积为 20μl
PCR 反应条件：l个循环：94℃ 5min；35个循环：94℃ 30s ， 63℃ 30s,，72℃ 15s ；l个循环：72℃ 10min ，4℃ 保存。
扩增将产物两端进行加A反应后，将其连接到pGEM-T easy 质粒中，转化，扩增培养目的克隆，抽提质粒与表达载体分别进行NdeI和和BamHI双酶切反应。
双切酶消化条件如下：
DNA 0 .5μg
10×NE Buffer 2μl
100×BSA 0.2μl
NdeI 0.5μl
BamHI 0.5μl
加水补到总体积为25μl
将上述反应体系混合，于37℃孵育3小时。将质粒酶切产物和表达载体酶切产物用琼脂糖进行电泳，将目的片段回收，并将目的片段用连接酶连接到所需的载体中。4 ℃连接过夜后将产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，筛选出阳性克隆并用LB液体培养基扩大培养，用天根质粒抽提试剂盒提取质粒作为具有草鱼IL-21活性蛋白的重组表达质粒。
将上述提取的草鱼IL-21活性蛋白的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，分别以载体引物和基因特异性引物进行PCR双向筛选。筛选出的阳性克隆经序列鉴定后作为工程菌株。
实施例三、获取重组草鱼白介素21蛋白
将筛选所得的工程菌株，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）为诱导剂进行诱导表达。诱导表达完成后，菌液经超声裂解并离心得到融合表达的包涵体，经洗涤剂洗涤后用含8M尿素的变性缓冲液溶解包涵体蛋白，之后用折叠缓冲液快速稀释将去折叠的溶解蛋白质进行再折叠，最后超滤去除折叠缓冲液并脱盐，获得有活性的重组草鱼白介素21蛋白。
将筛选所得的阳性重组菌BL21（DE3）/Pet30a-gcIL-21单菌落，接种到LB培养基中，37℃震荡培养16h。然后按5%比例转接到新鲜LB中，37℃继续培养至OD600值为0.6-0.8时，加入1mM IPTG在37℃诱导4h后，收集菌体，向菌体中加入10mL缓冲液（10mmol/LNa2HPO4，10mmol/L NaH2PO4 ·2H2O 4，1mg/mL 溶菌酶，0.5mM PMSF ，pH=7.4）。超声波（200W，超声3秒，间歇7秒）破菌两分钟，4℃ 10000*g离心30分钟尽可能完全地除去上清，获得包涵体沉淀。从包涵体中回收活性蛋白质，从而完成诱导表达。
按照上述的蛋白表达条件，扩大培养体积，诱导表达后收集菌体，超声破碎菌体后离心收集沉淀。从包涵体回中收活性蛋白质，第一步，包涵体的洗涤，用培养基0.1倍体积的洗涤缓冲液（200mM Tris·Hcl，100mM EDTA，10% Triten X-100，pH7.5）对包涵体进行洗涤，4℃、10000*g、10min离心弃上清，重复洗涤三次，可在第二遍洗涤后，增加选用3M尿素洗涤、离心一次。
第二步，包涵体蛋白的溶解，按30mg/ml的终浓度加入变性缓冲液(8M urea，10%甘油，50mM Tris，100mM Nacl，10mM EDTA，10mM DTT，pH8.0)，4℃溶解包涵体蛋白，溶解后的包涵体蛋白低温高速离心，4℃、10000*g、10min，除去未溶解沉淀，离心后留上清置于-80℃冻存备用。
第三步，溶解蛋白质的折叠复性，将上步所得的溶解后包涵体蛋白质以终浓度20-50μg/mL缓慢滴加至经0.22μm滤膜过滤后的折叠缓冲液（100mM Tris，400mM L-Arg·Hcl，2mM EDTA，5mM 还原型谷胱甘肽，0.5mM 氧化性型谷胱甘肽，0.5mM PMSF，pH8.0）中，以5-6滴/次、1min/次的滴加速度边滴加边搅拌，滴加完毕后，4℃搅拌过夜。第四步，利用Milliproe截留量3KDa的离心超滤管进行超滤去折叠缓冲液并以缓冲液（10mmol/LNa2HPO4，10mmol/L NaH2PO4 ·2H2O，pH=7.4）稀释复性后蛋白从而进行脱盐，收集超滤管中截留的重组蛋白，并经SDS-PAGE鉴定，从而完成包涵体蛋白的分离纯化和变复性。所得蛋白放入-80 ℃保存。如图1所示，图1为重组草鱼白介素21的SDS–PAGE电泳分析图。M为Mark，1为变性缓冲液中的包涵体蛋白，2为复性脱盐后重组蛋白。
结果分析：由图1可知，我们能够从包涵体中回收到大量且纯度较高重组草鱼白介素21蛋白，且重组蛋白纯度至少高达95%。使用100ml的新鲜培养基获得目的蛋白菌株的菌体沉淀，同时仅需将1ml的变性蛋白液其中含1.6mg的变性蛋白，用于稀释复性到50ml的复性缓冲液中即可获得200ug的活性目的蛋白。在上述反应步骤中，并不需通过亲和层析的方法，极大地节省耗材，最终获得高纯度的蛋白，且活性蛋白的获得率高。
实施例四、重组蛋白的功能鉴定
分离草鱼头肾淋巴细胞，按6×105/孔（每孔0.4mL）接种到24孔板中，用含10％小牛血清，0.1%双抗的RPMI 1640培养液于28℃，5% CO2 浓度下培养过夜。分别加入不同浓度（0-10 ng/mL）的所得重组蛋白刺激细胞3小时后，检测rgcIL-21所诱导表达的IFN-γ2基因表达情况，得到rgcIL-21刺激IFN-γ2表达的效应图，如图2所示。
结果分析：由图2可知，由结果可知所得重组蛋白能够显著上调草鱼头肾淋巴细胞中草鱼IFN-γ2的表达且具有剂量依赖效应，表明该草鱼IL-21重组蛋白的生物学活性功能。
通过上述实施例获得的重组蛋白具有以下应用前景：
1．该重组蛋白用作抗炎症药物。在炎症发生时，直接使用该蛋白作为多种防治病害的预防或治疗药物，对鱼类和其它动物病害进行治疗。
2．该重组蛋白用于鱼类免疫机制的研究。直接使用该蛋白或该蛋白制备的的单克隆抗体或多克隆抗体，进行鱼类及其它动物免疫机制的研究。
需要说明的是，对于前述的实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本申请并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本申请，某一些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和单元并不一定是本申请所必须的。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 电子科技大学
<120> 一种草鱼白细胞介素21重组蛋白及其制备方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> DNA
<213> Ctenopharyngodon idella
<400> 1
atgaaggcat ccgtgtttgt tctgttcgca gtggcgtgtt ggttcgtttc gcaggcagag 60
ctgtcgccga tgcaactcac gctcagaaaa gttatgaatg aactcgagaa ggtcaataac 120
gtaatggaca aaagcacaag ttcgttcaac tcacccacca ccaacgattt gaaggactgc 180
tgcatcagat ctgctctgga gtgctttagg tcccaagtga tgaacctgaa tgtcactcaa 240
gagaaaccta taataaagtc actgaagagc atctccaacg agtcccgaaa aaaagtcatt 300
gtggaaaagt tgcccagttg caacctggta gaaggtgaga aaaaggaagc tcagtgcaaa 360
ccctgtgaat cgtacagcaa ggttaacagc caaatgttcg tgcagaactt tcaaactctt 420
cttcaaaaga tctatgccag tcaagcatag 450
<210> 2
<211> 149
<212> PRT
<213> Ctenopharyngodon idella
<400> 2
Met Lys Ala Ser Val Phe Val Leu Phe Ala Val Ala Cys Trp Phe Val
1 5 10 15
Ser Gln Ala Glu Leu Ser Pro Met Gln Leu Thr Leu Arg Lys Val Met
20 25 30
Asn Glu Leu Glu Lys Val Asn Asn Val Met Asp Lys Ser Thr Ser Ser
35 40 45
Phe Asn Ser Pro Thr Thr Asn Asp Leu Lys Asp Cys Cys Ile Arg Ser
50 55 60
Ala Leu Glu Cys Phe Arg Ser Gln Val Met Asn Leu Asn Val Thr Gln
65 70 75 80
Glu Lys Pro Ile Ile Lys Ser Leu Lys Ser Ile Ser Asn Glu Ser Arg
85 90 95
Lys Lys Val Ile Val Glu Lys Leu Pro Ser Cys Asn Leu Val Glu Gly
100 105 110
Glu Lys Lys Glu Ala Gln Cys Lys Pro Cys Glu Ser Tyr Ser Lys Val
115 120 125
Asn Ser Gln Met Phe Val Gln Asn Phe Gln Thr Leu Leu Gln Lys Ile
130 135 140
Tyr Ala Ser Gln Ala
145

Claims (7)

1.一种草鱼白细胞介素21重组蛋白，其特征在于，所述草鱼白细胞介素21重组蛋白的基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种草鱼白细胞介素21重组蛋白，其特征在于，所述草鱼白细胞介素21重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种草鱼白细胞介素21重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、获得草鱼白细胞介素21蛋白的编码序列：在PCR反应条件下，以草鱼鳃组织制备cDNA为模板，引入PCR引物，进行PCR扩增，得到目标片段，在克隆PCR反应条件下利用同源克隆技术获得草鱼白细胞介素21蛋白的编码序列；
S2、构建蛋白成熟肽重组表达质粒及工程菌株：对照草鱼白细胞介素21蛋白的编码序列对应的酶切位点和pET30a（+）载体的酶切位点，设计含有酶切位点的引物，PCR扩增，完成加A反应后将其连接到pGEM-T easy质粒中，转化，扩增目的克隆，抽提质粒与表达载体分别进行双酶切反应，电泳回收目的片段，得到质粒酶切产物和载体酶切产物，用连接酶将其连接到所需载体，在0~10℃温度下转化克隆培养，提取出具有草鱼IL-21活性蛋白的重组表达质粒，将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，培育出工程菌株；
S3、获取重组草鱼白介素21蛋白：将筛选所得的工程菌株，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂进行诱导表达后，经分离纯化变复性方法处理获得有活性的重组草鱼白介素21蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种草鱼白细胞介素21重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中含酶切位点的引物：gcIL-21 F NdeI 5’ CAT ATG GAG CTG TCG CCG ATG CAACTCA 3’，gcIL-21 R BamHI5’ GGA TCC CCT GCT TGA CTG GCA TAG ATC TTT TG 3’。
5.根据权利要求3所述的一种草鱼白细胞介素21重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中克隆培养的优选温度：4℃，提取质粒工具为天根质粒抽提试剂盒。
6.根据权利要求3所述的一种草鱼白细胞介素21重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述的步骤S3中的分离纯化变复性方法包括以下步骤：
（ⅰ）包涵体的洗涤：用培养基0.1倍体积的洗涤缓冲液对包涵体进行洗涤，4℃、10000*g、10min离心弃上清，重复洗涤三次；所述洗涤缓冲液为200mM Tris·Hcl，100mM EDTA，10%Triten X-100，pH7.5；
（ⅱ）包涵体蛋白的溶解：按30mg/ml的终浓度加入变性缓冲液，4℃溶解包涵体蛋白，溶解后的包涵体蛋白低温高速离心，4℃、10000*g、10min，除去未溶解沉淀，离心后留上清置于-80℃冻存备用；所述变性缓冲液为8M urea，10% 甘油，50mM Tris，100mM Nacl，10mMEDTA，10mM DTT，pH8.0；
（ⅲ）溶解蛋白质的折叠复性：溶解蛋白质的折叠复性，将上步所得的溶解后包涵体蛋白质以终浓度20-50μg/ml缓慢滴加至经0.22μm滤膜过滤后的折叠缓冲液中，以5-6滴/次、1min/次的滴加速度边滴加边搅拌，滴加完毕后，4℃搅拌过夜；所述折叠缓冲液为100mMTris，400mM L-Arg·Hcl，2mM EDTA，5mM 还原型谷胱甘肽，0.5mM 氧化性型谷胱甘肽，0.5mM PMSF，pH8.0；
（ⅳ）收集重组蛋白：利用Milliproe截留量3KDa的离心超滤管进行超滤去折叠缓冲液并以缓冲液稀释复性后蛋白从而进行脱盐，收集超滤管中截留的重组蛋白；所述缓冲液为10mmol/L Na2HPO4，10mmol/L NaH2PO4 ·2H2O，pH=7.4。
7.根据权利要求3所述的一种草鱼白细胞介素21重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述的步骤还包括鉴定重组蛋白的功能鉴定，具体操作如下：分离草鱼头肾淋巴细胞，按6×105/孔接种到24孔板中，用含10％小牛血清，0.1%双抗的RPMI 1640培养液于28℃，5% CO2浓度下培养过夜，分别加入不同浓度的所得重组蛋白刺激细胞3小时后，检测rgcIL-21所诱导表达的IFN-γ2的基因表达情况。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109468361A (zh) * 2018-11-29 2019-03-15 电子科技大学 鱼类自然杀伤细胞杀伤细菌感染的单核/巨噬细胞能力的测定方法
CN112159466A (zh) * 2020-10-09 2021-01-01 电子科技大学 一种重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法
CN112552405A (zh) * 2021-01-06 2021-03-26 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用
CN113476599A (zh) * 2021-07-05 2021-10-08 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 疫苗免疫增强剂重组IFNγ、IL-1β及TNFα及其制备方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001055174A2 (en) * 2000-01-25 2001-08-02 Oklahoma Medical Research Foundation Universal procedure for refolding recombinant proteins
CN1521183A (zh) * 2003-01-28 2004-08-18 大连百奥科技发展有限公司 一种变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法
CN1534044A (zh) * 2003-03-28 2004-10-06 成都地奥制药集团有限公司 重组人干扰素α8多肽编码cDNA序列、制备方法及应用
CN102455360A (zh) * 2010-10-20 2012-05-16 新疆农业大学 一种新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒
CN102747086A (zh) * 2011-04-18 2012-10-24 电子科技大学 一种草鱼白细胞介素10基因和蛋白及其重组表达方法
EP2561071A1 (de) * 2010-04-22 2013-02-27 Scil Proteins GmbH Verfahren zur herstellung von rekombinantem thrombin
CN103710367A (zh) * 2013-12-23 2014-04-09 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种重组人激肽释放酶1及其编码基因和制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001055174A2 (en) * 2000-01-25 2001-08-02 Oklahoma Medical Research Foundation Universal procedure for refolding recombinant proteins
CN1521183A (zh) * 2003-01-28 2004-08-18 大连百奥科技发展有限公司 一种变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法
CN1534044A (zh) * 2003-03-28 2004-10-06 成都地奥制药集团有限公司 重组人干扰素α8多肽编码cDNA序列、制备方法及应用
EP2561071A1 (de) * 2010-04-22 2013-02-27 Scil Proteins GmbH Verfahren zur herstellung von rekombinantem thrombin
CN102455360A (zh) * 2010-10-20 2012-05-16 新疆农业大学 一种新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒
CN102747086A (zh) * 2011-04-18 2012-10-24 电子科技大学 一种草鱼白细胞介素10基因和蛋白及其重组表达方法
CN103710367A (zh) * 2013-12-23 2014-04-09 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种重组人激肽释放酶1及其编码基因和制备方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUN ZOU等: "The Function of Fish Cytokines", 《BIOLOGY》 *
KERRY J.LAING等: "Fish T cells: Recent advances through genomics", 《DEVELOPMENTAL & COMPARATIVE IMMUNOLOGY》 *
SONG K等: "Ctenopharyngodon idella interleukin 21 transcript variant X1 (IL-21) mRNA, complete cds", 《GENBANK DATABASE》 *
SONG K等: "interleukin 21 transcript variant X1 [Ctenopharyngodon idella]", 《GENBANK DATABASE》 *
杨敏等: "重组猪胰蛋白酶突变体基因在大肠杆菌中的克隆、表达与活性分析", 《药物生物技术》 *
钱冬萌等: "GST-IL-21融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性测定", 《生物技术通讯》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109468361A (zh) * 2018-11-29 2019-03-15 电子科技大学 鱼类自然杀伤细胞杀伤细菌感染的单核/巨噬细胞能力的测定方法
CN109468361B (zh) * 2018-11-29 2021-11-02 电子科技大学 鱼类自然杀伤细胞杀伤细菌感染的单核/巨噬细胞能力的测定方法
CN112159466A (zh) * 2020-10-09 2021-01-01 电子科技大学 一种重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法
CN112552405A (zh) * 2021-01-06 2021-03-26 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用
CN113476599A (zh) * 2021-07-05 2021-10-08 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 疫苗免疫增强剂重组IFNγ、IL-1β及TNFα及其制备方法和应用
CN113476599B (zh) * 2021-07-05 2023-08-22 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 疫苗免疫增强剂重组IFNγ、IL-1β及TNFα及其制备方法和应用

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