CN112159466A - 一种重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法 - Google Patents

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曾婷婷
张娜
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张安英
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Abstract

本发明公开了一种重组草鱼白介素‑6活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：S1.培养含表达质粒pET‑30/gcIL‑6的BL21(DE3)大肠杆菌，诱导蛋白表达15‑25h；S2.收集发酵液，离心，弃上清，重悬菌体，冻融10‑20h；S3.向菌液中加苯甲基磺酰氟溶液，超声处理，然后离心，收集沉淀即为包涵体；S4.用洗涤缓冲液对包涵体进行振荡洗涤，然后离心；S5.用1％Triton X‑114振荡洗涤包涵体，离心；S6.用3M尿素振荡洗涤包涵体，离心；S7.用含6M盐酸胍的结合缓冲液溶解包涵体，离心溶解5‑15min，留上清；S8.对蛋白进行纯化；S9.将纯化的蛋白滴加至折叠缓冲液中，然后搅拌10‑20h，再过滤，离心，得到蛋白溶液；S10.将蛋白溶液置于磷酸盐缓冲液中，离心，即得。通过本发明方法能够获得大量生物学活性高的重组草鱼IL‑6蛋白。

Description

一种重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法。
背景技术
在哺乳动物中，白介素-6在免疫和神经系统中都发挥着重要作用。除此之外，白介素-6还参与调节肝再生和机体的代谢。所以白介素-6是机体中非常重要的细胞因子之一。在鱼类中，有关白介素-6功能的知识还很有限。而要研究鱼类白介素-6的功能需要获得大量的白介素-6重组蛋白。
为研究重组草鱼白介素-6的功能，用毕赤酵母真核表达系统能够获得重组草鱼IL-6蛋白，但获得的重组草鱼IL-6蛋白高度糖基化，仅1000ng/mL该蛋白处理可上调草鱼头肾白细胞中的SOCS3基因的表达；表明其生物学活性不高。利用大肠杆菌表达系统也能获得可溶性重组草鱼IL-6蛋白；即该重组蛋白出现在细菌超声破碎后的上清中，但量比较少；因此，现有技术的方法不利于对草鱼IL-6蛋白功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述现有技术获得重组草鱼白介素-6活性蛋白的活性低或产量少的不足，提供一种重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.培养含表达质粒pET-30/gcIL-6的BL21(DE3)大肠杆菌至600nm处的光吸收值为0.6-0.8，然后加入0.4-0.6mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，12-20℃下诱导蛋白表达15-25h；
S2.收集S1所得发酵液，离心1-3次，弃上清，采用磷酸缓冲液洗涤，加入含溶菌酶的磷酸缓冲液重悬菌体，冻融10-20h；10000×g离心力下离心3-5min；
S3.向S2所得菌液中加入100倍苯甲基磺酰氟溶液，4℃下超声处理，然后离心，弃上清，收集沉淀即为包涵体；10000×g离心力下离心20-25min；
S4.用洗涤缓冲液对S3所得包涵体进行振荡洗涤，然后4℃下离心，弃上清；10000×g离心力下离心10-15min；
S5.用1％Triton X-114振荡洗涤S4所得包涵体，离心，弃上清；10000×g离心力下离心10-15min；
S6.用3M尿素振荡洗涤S5所得包涵体，离心，弃上清；10000×g离心力下离心10-15min；
S7.用含6M盐酸胍的结合缓冲液溶解S6所得包涵体，4℃下离心溶解5-15min，留上清；10000×g离心力下离心10-15min；
S8.对S7所得变性蛋白进行纯化；
S9.将S8纯化的蛋白中以1滴/10s的速度滴加至折叠缓冲液中，然后于4℃搅拌10-20h，再过滤，4℃下置于超滤管中离心，收集上液，得到复性后的蛋白溶液；5000×g离心力下离心25-30min；
S10.将S9所得复性后的蛋白溶液置于磷酸盐缓冲液中，在超滤管4℃离心去除复性液，即得；5000×g离心力下离心25-30min。
进一步地，S1中大肠杆菌接种于卡那霉素终浓度为30μg/mL的LB培养基中，并于180rpm，37℃条件下培养。
进一步地，S2中磷酸盐缓冲液为10mmol/L Na2HPO4和10mmol/L NaH2PO4·2H2O混合液，pH＝8.9；溶菌酶的终浓度为0.5-0.8mg/mL；
进一步地，S3中超声处理具体为：超声5s，停5s，处理2min；超声破碎仪功率为5％。
进一步地，S4中洗涤缓冲液为200mM Tris·HCl、100mM EDTA和10％Triton X-100混合液，pH7.5。
进一步地，S6中盐酸胍的结合缓冲液为6M盐酸胍、0.2M磷酸盐缓冲溶液、0.5MNaCl和20mM咪唑的混合液，pH＝8.5。
进一步地，S8中纯化具体为：用含6M盐酸胍的结合缓冲液平衡镍柱，取含蛋白的包涵体变性液，并以含6M盐酸胍的结合缓冲液稀释；过滤后以1mL/min的流速进行上样，之后以含6M盐酸胍的洗脱缓冲液洗脱并收集样品。
进一步地，S9中经0.22μm过滤器过滤后，置于10KDa超滤管中离心。
进一步地，S9中折叠缓冲液为100mM Tris、400mM L-Arg·HCl、2mM EDTA、1mM苯甲基磺酰氟、5mM还原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽混合溶液，pH＝8.0。
进一步地，S10中磷酸盐缓冲液为10mmol/L Na2HPO4和10mmol/L NaH2PO4·2H2O混合溶液，pH＝7.4。
进一步地，复性后的蛋白超滤浓缩时，第一次超滤后的上液用EP管收集，不跟剩下的复性液中一起再次超滤，减少蛋白的消耗。
进一步地，所得白介素-6蛋白溶液用液氮速冻并在冻干机中冻干后置于-80℃保存。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明中，重组草鱼白介素-6蛋白的变性阶段使用了含6M盐酸胍的结合缓冲液溶解包涵体，克服了常规采用8M的尿素溶解包涵体而高浓度的尿素在低温极易析出，堵塞纯化管路的缺陷；且一部分尿素可转变为氰酸盐和氨，而蛋白质的氨基能够与氰酸盐反应，从而改变蛋白质的电荷分布。因此使用的尿素可能导致变性的蛋白质很难复性，本发明方法避免了该问题。由于盐酸胍溶解的蛋白在酸性条件下会析出，因此本发明将缓冲液pH值调为中性或微碱性。
本发明在洗脱蛋白时，大幅增加了收样体积，在洗脱峰之后仍有大量的蛋白被冲洗下来，收集洗脱液的量较大。
本发明在配制复性液时加大苯甲基磺酰氟的体积；配制复性液时，从最后加入苯甲基磺酰氟改为在称取还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽前加入苯甲基磺酰氟，有效减少盐析出。
本发明中，复性后的蛋白通过调整超滤离心时间至浓缩得到适宜体积的复性液，克服了超滤液体积过大会造成的脱盐后样品稀释严重，蛋白浓度过低的问题；同时解决了超滤液体积过小会造成蛋白的析出的问题。
本发明方法制备的重组草鱼白介素-6蛋白的活性高，当浓度为300和1000ng/mL时处理重组草鱼头肾白细胞3h后，可上调SOCS3基因表达3.2和3.7倍。本发明方法制备的重组草鱼白介素-6蛋白的产量高，每次获得约310μg的白介素-6蛋白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为草鱼白介素-6的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图；图中，M为蛋白分子量标准参照物，1泳道为洗涤缓冲液离心后的上清，2泳道为1％Triton-X-114缓冲液离心后的上清，3泳道为3mM尿素缓冲液离心后的上清，4泳道为变性缓冲液中的草鱼白介素-6蛋白；
图2为重组草鱼白介素-6蛋白的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图；图中，M为蛋白分子量标准参照物，1泳道为复性脱盐后的重组草鱼白介素-6蛋白；
图3为重组草鱼白介素-6蛋白的活性鉴定结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
本发明较佳的实施例提供一种重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，具体步骤如下：
1、接种含表达质粒pET-30/gcIL-6的BL21(DE3)大肠杆菌于6mL含卡那霉素(终浓度为30mg/mL)的LB培养基中。在50mL BD管中以180rpm转速，在37℃活化过夜。
2、次日，将4mL活化的大肠杆菌接种至180mL含卡那霉素(终浓度为30mg/mL)的LB培养基中。在500mL的锥形瓶中以180rpm转速，在37℃的条件培养至600nm处的光吸收值为0.6-0.8。加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，以180rpm转速，在16℃诱导蛋白表达20小时。
3、收集发酵液并分至两个50mL的BD管中，在4℃，10000×g的离心力下离心3min，弃上清，收集菌体，重复一次。
4、用10mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.9，10mmol/L Na2HPO4，10mmol/L NaH2PO4·2H2O)充分振荡洗涤沉淀两次。离心，弃上清后，加入含终浓度为0.6mg/mL溶菌酶的10mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.9)充分悬浮菌体沉淀，冻融过夜。
5、次日，在菌液中加入300μL 100倍的苯甲基磺酰氟溶液，充分混匀后每次取6mL菌液于15mL的BD管中，置于冰上，使用宁波新芝的超声破碎仪以5％的功率超声5s，停5s，处理2min。重复此过程，超声处理剩余的24mL菌液。将处理好的菌液装入新的50mL的BD管中，在4℃以10000×g离心力离心20min，弃上清，收集沉淀即为包涵体。
6、用10mL洗涤缓冲液(200mM Tris·HCl，100mM EDTA，10％Triton X-100，pH7.5)对包涵体进行振荡洗涤，然后在4℃，以10000×g离心力离心10min，弃上清；
7、接着用10mL 1％Triton X-114振荡洗涤步骤6所得的包涵体，以10000×g离心力离心10min，弃上清；
8、用10mL 3M振荡尿素洗涤步骤7所得的包涵体，以10000×g离心力离心10min，弃上清；
9、用5mL含6M盐酸胍的结合缓冲液(pH＝8.5，0.2M磷酸盐缓冲溶液，0.5M NaCl，20mM咪唑)充分溶解包涵体，在4℃、以10000×g的离心力离心溶解的包涵体蛋白10min，留上清，并测量包涵体中蛋白的浓度。
10、用蛋白纯化仪纯化重组草鱼白介素-6蛋白。首先用1mL/min流速的双蒸水冲洗镍柱至电导为0.1ms/cm以下；然后用含6M盐酸胍的结合缓冲液(pH＝8.5)平衡镍柱。取含10mg蛋白的包涵体变性液，并以含6M盐酸胍的结合缓冲液(pH＝8.5)将其稀释至20mL；用0.45μm的过滤器该溶液，并以1mL/min的流速进行上样。上样结束后将镍柱以含6M盐酸胍的结合缓冲液(pH＝8.5)冲洗至吸收值平稳，之后以含6M盐酸胍的洗脱缓冲液(pH＝8.5)洗脱并收集重组草鱼白介素-6蛋白样品。收集得到10mL洗脱液。使用10kD的超滤管在4℃以5000×g的离心力离心20min浓缩样品至2mL，并测定其中重组草鱼白介素-6蛋白的浓度。
11、用1mL注射器取含1.5mg浓缩的重组草鱼白介素-6蛋白样品(步骤10)，缓慢滴加(1滴/10s)至经0.22μm滤膜过滤的50mL折叠缓冲液(100mM Tris，400mM L-Arg·HCl，2mMEDTA，1mM苯甲基磺酰氟，5mM还原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽，pH＝8.0)中，边滴加边搅拌，滴加完毕后，4℃搅拌过夜。
12、取12.5mL步骤11中所得的重组草鱼白介素-6蛋白，经0.22μm滤膜过滤，置于10KDa超滤管，在4℃以5000×g离心力离心25min，离心结束后，剩余1-2mL的溶液，倾斜超滤管用200ul枪靠上壁来回吸打混匀后抽上液，用1.5mL EP管收集。重复该步骤3次，处理完步骤11所得的约50mL含重组草鱼白介素-6蛋白的折叠缓冲溶液；
13、将收集的步骤12的蛋白溶液放入15mL预冷的pH7.4的磷酸盐缓冲液(10mmol/LNa2HPO4，10mmol/L NaH2PO4·2H2O，pH＝7.4)的烧杯中，混匀，倒回超滤管，在4℃以离心力5000×g离心25min去除复性液，重复此步骤一次。
14、将所得重组草鱼白介素-6蛋白分装于1.5mL EP管中，1mL/支，液氮速冻，冻干，放入-80℃保存。
本实施例方法每次获得约310μg的白介素-6蛋白(常规原核表达方法每次原核表达并纯化上清中的草鱼重组白介素-6蛋白约为100μg)，产量高。
实验例1
分别对草鱼和重组草鱼白介素-6纯化过程的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果如图1和图2所示，表明用本发明的方法能够获得纯度高且量多的重组草鱼白介素-6蛋白。
实验例2
分别对本发明方法得到的白介素-6蛋白、毕赤酵母真核表达系统获得的白介素-6蛋白和大肠杆菌原核表达上清中白介素-6蛋白的活性进行检测，结果表明，(图3)本发明所得重组蛋白能够显著上调草鱼头肾淋巴细胞中草鱼SOCS3的基因表达，因此本发明方法获得草鱼重组白介素-6蛋白具有高生物学活性。毕赤酵母真核表达系统获得的草鱼白介素-6蛋白，仅有1000ng/mL浓度的白介素-6重组蛋白对草鱼头肾白细胞中的SOCS3基因表达有1.4倍的上调；用大肠杆菌原核表达上清中的草鱼白介素-6蛋白，当用浓度为1000ng/mL的该处理草鱼头肾细胞3h后，SOCS3基因表达有1.5倍的上调；本发明方法制备的草鱼白介素-6蛋白，当浓度为300和1000ng/mL时处理草鱼头肾白细胞3h后，可上调SOCS3基因表达3.2和3.7倍。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.培养含表达质粒pET-30/gcIL-6的BL21(DE3)大肠杆菌至600nm处的光吸收值为0.6-0.8，然后加入0.4-0.6mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，12-20℃下诱导蛋白表达15-25h；
S2.收集S1所得发酵液，离心1-3次，弃上清，采用磷酸缓冲液洗涤，加入含溶菌酶的磷酸缓冲液重悬菌体，冻融10-20h；
S3.向S2所得菌液中加入100倍苯甲基磺酰氟溶液，4℃下超声处理，然后离心，弃上清，收集沉淀即为包涵体；
S4.用洗涤缓冲液对S3所得包涵体进行振荡洗涤，然后4℃下离心，弃上清；
S5.用1％Triton X-114振荡洗涤S4所得包涵体，离心，弃上清；
S6.用3M尿素振荡洗涤S5所得包涵体，离心，弃上清；
S7.用含6M盐酸胍的结合缓冲液溶解S6所得包涵体，4℃下离心5-15min，留上清；
S8.对S7所得蛋白进行纯化；
S9.将S8纯化的蛋白以1滴/10s的速度滴加至折叠缓冲液中，然后于4℃搅拌10-20h，再过滤，4℃下离心，收集上清，得到蛋白溶液；
S10.将S9所得蛋白溶液置于磷酸盐缓冲液中，在4℃离心，即得。
2.根据权利要求1所述的重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述S1中大肠杆菌接种于卡那霉素终浓度为30μg/mL的LB培养基中，并于180rpm，37℃条件下培养。
3.根据权利要求1所述的重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述S2中磷酸盐缓冲液为10mmol/L Na2HPO4和10mmol/L NaH2PO4·2H2O混合液，pH＝8.9；所述溶菌酶的终浓度为0.5-0.8mg/mL。
4.根据权利要求1所述的重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述S3中超声处理具体为：超声5s，停5s，处理2min。
5.根据权利要求1所述的重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述S4中洗涤缓冲液为200mM Tris·HCl、100mM EDTA和10％Triton X-100混合液，pH7.5。
6.根据权利要求1所述的重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述S6中含盐酸胍的结合缓冲液为6M盐酸胍、0.2M磷酸盐缓冲溶液、0.5M NaCl和20mM咪唑的混合液，pH＝8.5。
7.根据权利要求1所述的重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述S8中纯化具体为：用含6M盐酸胍的结合缓冲液平衡镍柱，取含蛋白包涵体变性液，并以含6M盐酸胍的结合缓冲液稀释；过滤后以1mL/min的流速进行上样，之后以含6M盐酸胍的洗脱缓冲液洗脱并收集样品。
8.根据权利要求1所述的重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述S9中经0.22μm过滤器过滤后，置于10KDa超滤管中离心。
9.根据权利要求1所述的重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述S9中折叠缓冲液为100mM Tris、400mM L-Arg·HCl、2mM EDTA、1mM苯甲基磺酰氟、5mM还原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽混合溶液，pH＝8.0。
10.根据权利要求1所述的重组草鱼白介素-6活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述S10中磷酸盐缓冲液为10mmol/L Na2HPO4和10mmol/L NaH2PO4·2H2O混合溶液，pH＝7.4。
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