CN112552405A - 抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用。本发明抗草鱼pIgR的制备方法，包括如下步骤：构建pIgR表达载体pET28a(+)‑pIgR；将构建的重组质粒pET28a(+)‑pIgR转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼pIgR。本发明还涉及一种所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用。本发明为研究草鱼pIgR蛋白的结构、来源、功能及与免疫球蛋白的关系中的应用提供了重要工具，为草鱼pIgR在黏膜免疫防御的过程中起到的作用研究提供了重要的技术手段。

Description

抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种多克隆抗体的制备方法及其应用，具体讲是一种抗草鱼(Paralichthys olivaceus)多聚免疫球蛋白受体重组蛋白的多克隆抗体制备方法及其应用，属于鱼类分子免疫学技术领域。
背景技术
在哺乳动物中，多聚免疫球蛋白受体pIgR能够与分泌型多聚免疫球蛋白(IgA或IgM)形成复合物，pIgR经蛋白酶裂解切割后为分泌成分，从而形成分泌型免疫球蛋白阻止病毒、细菌、毒素和外来异物对黏膜组织的黏附和入侵。因此，pIgR的有效分泌是IgA或IgM发挥黏膜防御功能的必要条件。
鱼类虽然是低等脊椎动物，但它仍有与高等脊椎动物类似的较为完善的免疫系统。研究表明硬骨鱼的皮肤及肠道和哺乳动物的肠道采用同样的免疫球蛋白转运系统，即能够通过上皮细胞中的pIgR转运四聚体免疫球蛋白进入黏液而发挥其免疫功能。制备抗草鱼多聚免疫球蛋白受体的多克隆抗体，可以为阐明多聚免疫球蛋白受体的结构、来源、功能以及与免疫球蛋白的关系等提供有力工具；另外，鱼类感染某种病原或接种疫苗后，鱼体会产生pIgR与免疫球蛋白复合物即分泌型免疫球蛋白(SIgs)。因此，利用抗草鱼多聚免疫球蛋白受体的多克隆抗体，通过检测草鱼黏液中多聚免疫球蛋白受体的产生，可以进行草鱼疾病的早期诊断和疫苗使用效果的评价，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治具有参考价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法；本发明的另一个目的是提供一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用。
本发明的目的是由以下技术方案实现的：
一种所述抗草鱼pIgR的制备方法，包括如下步骤：构建pIgR表达载体pET28a(+)-pIgR；将构建的重组质粒pET28a(+)-pIgR转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼pIgR。优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。以制备的草鱼pIgR蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，经过3-4次免疫之后，经免疫学检测筛选方法，筛选出特异性分泌抗草鱼pIgR多克隆抗体。
所述的构建pIgR表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼pIgR基因，经EcoRV及XhoI双酶切后连接pET28a(+)。
所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法和转印免疫印迹法；其中所述的间接酶联免疫法是将制备的免疫兔血清与纯化的草鱼pIgR蛋白于96孔酶标板中反应；继而加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体；450nm工作波长测定各孔光吸收值，筛选抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体。所述的转印免疫印迹法是将制备的抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的草鱼pIgR蛋白反应，确定该多抗的抗原决定簇是分子量为27.64kDa的草鱼pIgR蛋白。
一种所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用，包括如下步骤：利用ELISA分析灭活柱状黄杆菌免疫草鱼后pIgR及SIgs免疫应答规律，弄清pIgR表达与SIgs免疫应答关系；转印免疫印迹法检测并分析草鱼血清及黏液中的plgR；用免疫组织化学染色法定位草鱼pIgR在系统及黏膜组织中的分布。
所述的ELISA是将收集免疫后的草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁包被至96孔板，多克隆抗体孵育；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；分析免疫后各分泌液中pIgR(SC)蛋白水平变化。
所述的转印免疫印迹法是将草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及血清电泳后转移至PVDF膜，多克隆抗体孵育PVDF膜；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；检测多克隆抗体可以特异性结合黏液中天然存在的草鱼pIgR。
所述的免疫组织化学染色法是将多克隆抗体与草鱼黏膜组织石蜡切片反应；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；检测多克隆抗体可以特异性结合黏液细胞膜表面的抗原决定簇。
本发明的制备技术路线设计新颖，其通过构建重组质粒转入表达菌株，使用IPTG诱导表达草鱼pIgR，优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得高纯度的草鱼pIgR蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔；经筛选得到抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体；所得的多克隆抗体再经间接酶联免疫法和转印免疫印迹法验证其特性。这样的制备技术路线严密合理且可行，充分发挥了现有免疫学检测筛选方法的作用和效果。
抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体能与草鱼pIgR蛋白特异性结合，且效价高。研究表明pIgR在硬骨鱼体内参与了Ig向黏液中的转运，是黏液发挥免疫防御功能的必要条件。除了介导和转运免疫球蛋白进入黏液中外，pIgR还具有非特异性免疫防御功能。具体表现在pIgR能够激发其它免疫因子的合成；pIgR被蛋白酶水解以后，游离的SC能够阻止嗜中性粒细胞的趋化作用从而降低机体的炎症反应，保护上皮细胞；游离的SC分泌片段能够结合细菌从而有效限制细菌对机体的侵染等等。可见pIgR在生物体自身发挥免疫防御功能，尤其是黏膜免疫防御的过程中起到了非常关键的作用，因此抗草鱼pIgR蛋白多克隆抗体的制得为研究草鱼pIgR蛋白的结构、来源、功能及与免疫球蛋白的关系中的应用提供了重要工具，为草鱼pIgR在黏膜免疫防御的过程中起到的作用研究提供了重要的技术手段。
附图说明
图1为构建的重组质粒pET28a(+)-pIgR图谱。
图2为IPTG诱导pIgR重组表达及Ni柱亲和纯化pIgR电泳图。
图3为本发明的抗草鱼pIgR多抗的转印免疫印迹检测结果图。
图4为本发明的多克隆抗体ELISA法检测免疫刺激后草鱼pIgR表达水平变化结果图。
图5为本发明的多克隆抗体转印免疫印迹法检测的结果图。
图6为本发明的抗草鱼pIgR多抗的免疫组织化学的结果图。
参见图1-图6：
图1所示：构建的重组质粒pET28a(+)-pIgR图谱。
图2所示：M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；1表示IPTG诱导空质粒；2表示IPTG未诱导重组质粒结果；3表示IPTG诱导重组质粒表达结果；4表示Ni柱亲和纯化结果，分子量为27.64kDa。
图3所示：M是标准分子量蛋白；1表示抗pIgR多抗孵育IPTG未诱导重组质粒结果；2表示抗pIgR多抗孵育IPTG诱导重组质粒结果；3表示His单抗孵育IPTG诱导重组质粒结果分子量为27.64kDa。
图4所示：A表示草鱼皮肤黏液pIgR的ELISA结果；B表示草鱼鳃黏液pIgR的ELISA结果；C表示草鱼肠黏液pIgR的ELISA结果；D表示草鱼胆汁pIgR的ELISA结果。小写字母：灭活柱状黄杆菌免疫刺激后各组不同时间蛋白表达水平显著性差异水平(P<0.05)。
图5所示：M是标准分子量蛋白；1表示血清与抗pIgR多抗孵育结果；2表示胆汁与抗pIgR多抗孵育结果；3表示皮肤黏液与抗pIgR多抗孵育结果；4表示鳃黏液与抗pIgR多抗孵育结果；4表示皮肠黏液与抗pIgR多抗孵育结果。
图6所示：A表示草鱼肠与兔抗草鱼pIgR免疫组化结果；B表示草鱼肠与未免疫兔血清免疫组化结果。C表示草鱼皮肤与兔抗草鱼pIgR免疫组化结果；D表示草鱼皮肤与未免疫兔血清免疫组化结果。标尺：50μm。箭头表示阳性反应区域。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例进一步说明本发明。
实施例1：抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备。
一、重组蛋白pIgR的制备
1.草鱼pIgR表达引物的设计
根据草鱼pIgR(Genbank：KP768418)开放阅读框cDNA序列和表达载体pET-28(a)的多克隆位点序列，加入EcoRV及XhoI位点，设计了一对特异引物pIgR-F和pIgR-R。
pIgR-F：CCATGCATCATCATCATCATCACACA
pIgR-R：CTCGAGTTAAGGTCGACTGTGAGGG
2.pIgR表达基因的扩增、纯化及双酶切
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA片段回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收。然后以EcoRV及XhoI对产物进行双酶切，酶切体系如下：回收PCR产物：1μg，H buffer：2μl，EcoRV：1μl，XhoI：1μl，加ddH2O至终体积20μl，37℃酶切6h，取出后直接利用PCR产物纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收。
3.pET28a-质粒双酶切
酶切体系如下。
Figure BDA0002885635610000041
4.pIgR表达载体(pET-28a-pIgR)的构建
预先根据目的基因和质粒的浓度将两者的摩尔浓度调整至一致，再将目的基因与质粒按照4：1的比例(摩尔比)进行混合连接。
5.pET28a-pIgR载体转化至大肠杆菌Arctic Express
(1)将质粒1μl加入100μl感受态细菌中，置冰上20min；
(2)42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μl LB培养液；
(3)37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Kan的LB平板，37℃倒置培养过夜。
6.IPTG诱导pET28a-pIgR载体融合蛋白的表达
(1)挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml Kan的3ml LB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜；
(2)次日按1:100接种于50μg/ml Kan的30ml LB培养液中，37℃220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8；
(3)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；
(4)向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达；
(5)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。
7.包涵体蛋白的变复性
(1)将菌体沉淀重悬于20ml裂解液(20mM Tris-HCl containing 1mM PMSF andbacteria protease inhibitor cocktail，pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)；
(2)将超声破碎的细胞裂解液4℃10000r/mim离心20min，收集沉淀；
(3)使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3次；
(4)用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH8.0)，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000r/mim离心15min；
(5)将上述溶液滴加20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0溶液中透析过夜。
8.Ni柱纯化
(1)利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；
(2)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
(3)用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
(4)用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；
(5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0进行透析过夜；
(6)进行12％SDS-PAGE分析。
9.结果分析
如图2所示，利用IPTG诱导蛋白表达，经12％SDS-PAGE分析，目标蛋白分子量为27.64kDa。包涵体经过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过Ni柱亲和纯化获得纯度很高的目的表达蛋白，无其他明显杂带存在。
二、免疫新西兰大白兔
以制备的草鱼多聚免疫球蛋白受体进行BCA蛋白浓度测定后，免疫新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫1次。3-4次免疫之后，采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对草鱼多聚免疫球蛋白受体的效价，待效价大于1：50000进行最终采血制备抗血清。
三、免疫学检测筛选
1.间接ELISA效价检测
(1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。
(2)用PBS包被液将草鱼多聚免疫球蛋白受体抗原稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100ul，4℃冰箱过夜。
包被抗原：草鱼多聚免疫球蛋白受体
包被浓度：5μg/ml，100μl/孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)
(3)包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。
(4)抗血清按1/500，3倍稀释，每孔100μl，37℃恒温箱1h。
(5)取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μl稀释好的酶标二抗，酶标二抗：山羊抗兔-HRP，1/5000。37℃恒温箱1h。
(6)取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μl TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。
(7)每孔加入100μl 1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。
2.转印免疫印迹法检测
(1)样品上样1μl，纯化蛋白上样0.05μg。
(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先100V跑完积层胶，再将电压升至130V直到电泳结束。
(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒流250mA转膜，约为1h。
(4)电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min。
(5)将PVDF膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。
(6)用PBST稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。
(7)次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min。
(8)用含5％脱脂奶粉的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1h。
(9)反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。
(10)ECL显影，曝光。
3.结果分析
(1)通过ELISA检测效价得出，草鱼多聚免疫球蛋白受体抗血清效价在121.5K左右。
表1抗血清的检测结果
Table 1 The test result of antibody purification
Figure BDA0002885635610000071
起始稀释度:1:500，效价即样品OD/空白OD≥2.1的最高稀释度。
(2)Western Blot检测结果
所获得的多抗及抗His标签蛋白单抗能与分子量为27.64kDa的pIgR重组蛋白发生特异性结合，多抗与IPTG未诱导重组质粒不发生反应。
实施例2：本发明多克隆抗体ELISA法检测草鱼黏液及胆汁中pIgR蛋白水平变化。
1.灭活柱状黄杆菌的制备
柱状黄杆菌菌株(Flavobacterium columnare G4)在25℃条件下于Shieh培养基(1L培养液中，含蛋白胨5g，酵母粉0.5g，0.01g CH3COONa·3H2O，0.01g BaCl2·2H2O，0.1gK2HPO4，0.05gKH2PO4，0.3g MgSO4·7H2O，0.0067g CaCl2·2H2O，0.001g FeSO4·7H2O，0.05gNaHCO3，pH7.2)中振摇培养48h。
取25℃振荡培养48h后的100mL细菌培养液，11000r/min离心10min，沉淀用灭菌磷酸缓冲液(PBS，pH7.2)清洗三次，用含1.0％福尔马林的PBS重新悬浮，室温下放置24h。灭活后的细菌悬浮液再次以11000r/min离心10min，用灭菌PBS清洗两次以去除福尔马林，最后用灭菌PBS稀释到约1.0×108cells/mL，制备好的FKG菌苗置于4℃冰箱备用。
2.草鱼免疫及样品采集
实验前将健康草鱼随机饲养在2.0×2.0×0.5m容积的玻璃钢水槽中，水温20±1℃，pH为7.6-8.2，饲养期间连续充气，每天换水1/3-1/2，投喂饲料2次，暂养一周后，把鱼分成两组用于免疫。第一组腹腔注射由PBS稀释的浓度为1×108CFU/mL的柱状黄杆菌灭活疫苗，每尾注射100μL；第二组浸泡于由养殖稀释的浓度为1×108CFU/mL灭活菌液中，连续充气浸泡30min。
两组鱼分别于免疫前及免疫后4h、8h、12h、24h、48h、72h、7d、14d、28d每组随机取鱼三尾，解剖并分别取皮肤、鳃、肠、肝、脾和头肾6种组织，分别混合三尾鱼的各组织，放入组织保护液中-20℃保存，用于实时荧光定量PCR分析。
3.草鱼黏液及胆汁的收集
分别于免疫前及免疫后1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d、28d、35d、42d每组随机取草鱼五尾，分别收集皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液和胆汁。
用干净无菌的载玻片轻轻刮取草鱼皮肤表面的黏液并收集，加入等体积的PBS，混合五尾鱼的皮肤黏液。
从采过血的草鱼中剪下鱼鳃，切成数断，PBS冲洗数次，放入装有PBS的离心管中，4℃放置2h，期间震荡数次。
取采过血的草鱼中剪下鱼肠，仔细剔除肠系膜和血管，PBS冲洗数次，剪成小段，再纵向剪开，放入装有PBS的离心管中，4℃放置2h，期间震荡数次。
从取过血的草鱼中取出胆囊，小心剥离胆囊周围组织，用PBS冲洗数次，吸取表层水分，刺破胆囊，使胆汁流出并收集，混合五尾鱼的胆汁。
将上述各时间点五尾鱼的胆汁以及皮肤、鳃和肠黏液，分别于4℃条件下12000g离心15min，取上清，将各组蛋白浓度调成一致，-80℃保存备用。
4.ELISA法检测草鱼黏液及胆汁中pIgR的蛋白水平变化
为了使ELISA的条件最优化，正式实验前对抗原包被浓度、样品稀释倍数和抗体稀释倍数进行了预实验，确定了最适条件，下面给出的即为最适条件。
(1)将收集的皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁浓度提前稀释到0.1mg/mL加入到96孔板中，每孔加100μL，放入4℃冰箱过夜。
(2)次日用含0.05％吐温20的PBS(PBST)洗涤三次，每次5min，之后加入200μL含5％BSA的PBS，37℃封闭1h。
(3)同法洗涤三次，每孔加入PBS稀释的兔抗草鱼pIgR重组蛋白多抗100μL(1:6000稀释)，37℃孵育1h。
(4)PBST洗涤三次后，每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体(1:5000稀释)，37℃孵育1h。
(5)PBST洗涤三次，最后一次洗涤完毕后，每孔加入含0.1％pNPP的pNPP缓冲液(35mM NaHCO3，15mM Na2CO3，0.5mM MgCl2·6H2O，pH 9.6)100μL，室温显色30min，2M的NaOH中止发色，在405nm波长下测定平均吸光度值(OD)。未免疫兔血清代替兔抗草鱼pIgR重组蛋白多抗作为阴性对照，计算OD值比例P/N，当P/N≥2.1时判定为阳性。
结果：皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液和胆汁等外分泌液中的pIgR蛋白水平在28d内先上调，而后下调到对照组水平。浸泡免疫中皮肤黏液、鳃黏液pIgR蛋白水平到达峰值较注射组早，浸泡组中皮肤黏液、鳃黏液和肠黏液的峰值较注射组高。说明浸泡免疫比注射免疫更容易诱发pIgR的产生，草鱼pIgR在免疫防御抵抗病原的过程中起到了重要作用。
实施例3:本发明多克隆抗体western blot法检测草鱼血清、胆汁及黏液中pIgR。
1.样品采集及前处理
随机取一尾草鱼，尾静脉采血，室温静置1h，4℃过夜，次日4℃条件下12000g离心15min，分离血清，-80℃保存备用。
将所取的血清与实验3中收集的草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁经过100kDa超滤管超滤浓缩，最终去除部分小分子量蛋白并增大蛋白浓度。
2.蛋白电泳及western blot
(1)配置SDS-PAGE胶
Figure BDA0002885635610000101
注：表格中斜体字为此次配置的10％分离胶体积。
Figure BDA0002885635610000102
注：表格中斜体字为此次配置的5％浓缩胶体积。
(2)按照配方配好分离胶，加入已经架好的制胶板中。缓慢加入至板的2/3的位置。加入无水乙醇压胶。待分离胶凝固后，加入浓缩胶，并插上齿梳。
(3)等到浓缩胶完全凝固后，配置1×电泳液。
(4)将架子放入到电泳液里拔去齿梳，加入一定体积的蛋白样品和Marker。
蛋白上样量：
Figure BDA0002885635610000103
Figure BDA0002885635610000111
(5)配制1×电泳液，用1×电泳液浸没胶板，开始电泳，60V压缩蛋白，80V分离蛋白(120钟)。
(6)当条带跑至胶板一半的时候配置1×转膜液，并预冷。
(7)根据预计条带的位置裁剪好PVDF膜(约1-2CM)，甲醇激活15s。
(8)切好大小合适含有内参或目的条带的胶。
(9)放好＂三明治＂(海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵)。
(10)用1×转膜液将“三明治”浸没，用300mA恒流转膜1小时20min。
Figure BDA0002885635610000112
注：此表为各个指标电泳及转膜时间
(11)用1×TBST配置3％的脱脂牛奶封闭液，封闭过夜。
(12)配置兔抗草鱼pIgR稀释液(1:3000)，将PVDF膜孵育一抗3小时。
(13)洗膜，用1×TBST浸泡10min后弃掉1×TBST，重复3次。
(14)配置2抗辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)稀释液(1：5000稀释)，将PVDF膜孵育二抗2小时。
(15)洗膜，用1×TBST浸泡10min后弃掉1×TBST，重复3次。
(16)配置发光液，用发光液浸湿PVDF膜后放置于超高灵敏度化学发光成像系统样品放置区运行程序显影成像。
结果：本发明多抗与草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁反应，且均在相对分子质量约40kDa位置出现单一条带，但是不与草鱼血清反应。
实施例4：本发明多克隆抗体免疫组织化学染色法定位草鱼黏膜组织中pIgR。
1.草鱼组织石蜡切片的制备
(1)取材：利用提前灭菌处理的解剖刀、剪刀、纱布、镊子等工具解剖草鱼，将皮肤、后肠组织切成大小为0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，无菌PBS冲洗干净后放入4％多聚甲醛固定24h。
(2)脱水浸蜡：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-65°融化石蜡I1h-65°融化石蜡II 1h-65°融化石蜡III 1h。
(3)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
(4)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
2.免疫组织化学染色
(1)抗原修复：将切片放入修复盒中，加入抗原修复液(柠檬酸缓冲液)，高压锅加热到自动放气，2min后离开热源自然冷却，弃去抗原修复液，将切片用PBS淋洗。抗原修复液配方：称取柠檬酸钠Na3C6H5O7·2H2O 29.4g，加蒸馏水至1L，称取柠檬酸C6H5O7·H2O 21.0g，加蒸馏水至1L；量取柠檬酸钠溶液16.2mL，柠檬酸溶液3.8mL，加蒸馏水至200mL，调整pH到6.0。
(2)将切片移入湿盒中，加入新鲜配制的3％双氧水，以去除内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10min，PBS充分淋洗。
(3)封闭：PBS浸洗玻片3次，每次5min，吸水纸吸干组织周围的PBS，在玻片上滴加5％BSA，37℃封闭30min。
(4)PBST洗涤三次，甩干之后分别滴加兔抗草鱼pIgR重组蛋白多抗(1:500)，37℃孵育1h。
(5)PBST浸洗三次，之后滴加山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1：100)工作液，37℃孵育30min。
(6)PBST清洗三次，DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度，自来水冲洗1min。
(7)苏木精复染3min，盐酸酒精分化，返蓝；自来水冲洗1min，脱水、透明、封片、镜检。
(8)未免疫兔子血清代替重组蛋白多抗作为阴性对照。
结果：使用抗草鱼pIgR重组蛋白多抗对草鱼黏膜免疫组织后肠及皮肤进行免疫组化染色，结果显示在草鱼后肠、皮肤中，实验组出现了明显的红色阳性信号，而对照组中未观察到阳性信号。
Western blot结果表明该多抗可与pIgR特异性反应，从而证实本发明多抗可以用作研究多聚免疫球蛋白受体的结构、来源及在黏膜免疫应答中的功能的重要工具。另外，可以通过检测草鱼黏液中多聚免疫球蛋白受体的产生，进行草鱼疾病的诊断及疫苗使用效果的评价，使得本发明多抗可用于制备草鱼疾病早期诊断试剂盒或构建疫苗使用效果评价体系，为草鱼疾病的预防及治疗提供工具与技术手段，为其他养殖鱼类疾病的防治提供参考。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：构建pIgR表达载体pET28a(+)-pIgR；将构建的重组质粒pET28a(+)-pIgR转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼pIgR。
2.权利要求1所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。
3.权利要求1所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：以制备的草鱼pIgR蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，经过3-4次免疫之后，经免疫学检测筛选方法，筛选出特异性分泌抗草鱼pIgR多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的构建pIgR表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼pIgR基因，经EcoRV及XhoI双酶切后连接pET28a(+)。
5.根据权利要求3所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法和转印免疫印迹法；其中所述的间接酶联免疫法是将制备的免疫兔血清与纯化的草鱼pIgR蛋白于96孔酶标板中反应；继而加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体；450nm工作波长测定各孔光吸收值，筛选抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体。所述的转印免疫印迹法是将制备的抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的草鱼pIgR蛋白反应，确定该多抗的抗原决定簇是分子量为27.64kDa的草鱼pIgR蛋白。
6.一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用，包括如下步骤：利用ELISA分析灭活柱状黄杆菌免疫草鱼后pIgR及SIgs免疫应答规律，弄清pIgR表达与SIgs免疫应答关系；转印免疫印迹法检测并分析草鱼血清及黏液中的plgR；用免疫组织化学染色法定位草鱼pIgR在系统及黏膜组织中的分布。
7.根据权利要求6所述的抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用，其特征在于：所述的ELISA是将收集免疫后的草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁包被至96孔板，多克隆抗体孵育；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；分析免疫后各分泌液中pIgR(SC)蛋白水平变化。
8.根据权利要求6所述的抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用，其特征在于：所述的转印免疫印迹法是将草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及血清电泳后转移至PVDF膜，多克隆抗体孵育PVDF膜；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；检测多克隆抗体可以特异性结合黏液中天然存在的草鱼pIgR。
9.根据权利要求6所述的抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用，其特征在于：所述的免疫组织化学染色法是将多克隆抗体与草鱼黏膜组织石蜡切片反应；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；检测多克隆抗体可以特异性结合黏液细胞膜表面的抗原决定簇。
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