CN116514945A - 一种抗加州鲈pIgR抗体的抗原表位多肽筛选、多克隆抗体制备及其应用 - Google Patents

一种抗加州鲈pIgR抗体的抗原表位多肽筛选、多克隆抗体制备及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫化学和鱼类分子生物学技术领域，具体涉及一种抗加州鲈pIgR抗体的抗原表位多肽筛选、多克隆抗体制备及其应用。本发明通过对加州鲈多聚免疫球蛋白受体pIgR进行研究，从而获得抗加州鲈pIgR抗体的优势抗原表位多肽，并以其作为抗原成功制备了加州鲈pIgR多克隆抗体，从而为进一步研究鱼类pIgR的作用与功能提供重要工具和技术手段，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种抗加州鲈pIgR抗体的抗原表位多肽筛选、多克隆抗体制 备及其应用
技术领域
本发明属于免疫化学和鱼类分子生物学技术领域，具体涉及一种抗加州鲈pIgR抗体的抗原表位多肽筛选、多克隆抗体制备及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
在哺乳动物中，多聚免疫球蛋白受体pIgR能够与分泌型多聚免疫球蛋白(IgA或IgM)形成复合物，pIgR经蛋白酶裂解切割后为分泌成分，从而形成分泌型免疫球蛋白阻止病毒、细菌、毒素和外来异物对黏膜组织的黏附和入侵。因此，pIgR的有效分泌是IgA或IgM发挥黏膜防御功能的必要条件。
鱼类虽然是低等脊椎动物，但它仍有与高等脊椎动物类似的较为完善的免疫系统。研究表明硬骨鱼的皮肤及肠道和哺乳动物的肠道采用同样的免疫球蛋白转运系统，即能够通过上皮细胞中的pIgR转运四聚体免疫球蛋白进入黏液而发挥其免疫功能。制备抗加州鲈多聚免疫球蛋白受体的多克隆抗体，可以为阐明多聚免疫球蛋白受体的结构、来源、功能以及与免疫球蛋白的关系等提供有力工具；另外，鱼类感染某种病原或接种疫苗后，鱼体会产生pIgR与免疫球蛋白复合物即分泌型免疫球蛋白(SIgs)。因此，利用抗加州鲈多聚免疫球蛋白受体的多克隆抗体，通过检测加州鲈黏液中多聚免疫球蛋白受体的产生，可以进行加州鲈疾病的早期诊断和疫苗使用效果的评价，对加州鲈疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治具有参考价值。然而，目前鲜有制备抗鱼类特别是加州鲈pIgR抗体的报道。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明提供一种抗加州鲈pIgR抗体的抗原表位多肽筛选、多克隆抗体制备及其应用。本发明通过对加州鲈多聚免疫球蛋白受体pIgR进行研究，从而获得抗加州鲈pIgR抗体的优势抗原表位多肽，并以其作为抗原成功制备了加州鲈pIgR多克隆抗体，从而为进一步研究鱼类pIgR的作用与功能提供重要工具和技术手段，因此具有良好的实际应用之价值。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种抗加州鲈pIgR抗体的抗原表位多肽，所述多肽的氨基酸序列选自：包括或由SEQ ID NO.1构成的序列。
所述多肽的表位是加州鲈pIgR蛋白的第251-262个氨基酸序列。
本发明的第二个方面，提供上述抗原表位多肽在制备抗加州鲈pIgR抗体中的应用。
其中，所述抗加州鲈pIgR抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
上述抗体可用于检测加州鲈pIgR蛋白。
本发明的第三个方面，提供一种抗加州鲈pIgR抗体，所述抗加州鲈pIgR抗体其特异性结合加州鲈pIgR蛋白并且特异性识别上述抗原表位多肽。
本发明的第四个方面，提供一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸能够编码上述抗加州鲈pIgR抗体。
本发明的第五个方面，提供上述抗加州鲈pIgR抗体的制备方法，所述制备方法包括：针对上述抗原表位多肽构成的抗原对非人动物进行免疫获得。
本发明的第六个方面，提供一种用于检测加州鲈pIgR蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含上述抗加州鲈pIgR抗体。
本发明的第七个方面，提供一种检测加州鲈pIgR蛋白的方法，所述方法包括：采用上述抗加州鲈pIgR抗体和/或上述试剂盒对待测样品进行检测。
本发明的第八个方面，提供上述抗原表位多肽、抗加州鲈pIgR抗体、试剂盒或方法在如下任意一种或多种中的应用：
a)对加州鲈pIgR蛋白的结构、来源、功能及与免疫球蛋白之间关系的研究；
b)对加州鲈pIgR在黏膜免疫防御过程中的作用研究。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案提供了一种抗加州鲈pIgR的抗原表位多肽、抗加州鲈pIgR多克隆抗体的制备方法及应用。经试验验证，以该抗原表位多肽制备的多克隆抗体能与加州鲈pIgR蛋白特异性结合，且效价高，甚至优于以完整pIgR蛋白制备的多克隆抗体。因此，可以将其用于制备抗加州鲈pIgR抗体的制备，从而为鱼类特别是加州鲈pIgR蛋白相关研究奠定基础，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为本发明实施例中加州鲈pIgR蛋白稀有密码子分析图。
图2为本发明实施例中加州鲈pIgR蛋白亲疏水分析图。
图3为本发明实施例中加州鲈pIgR蛋白跨膜结构域和信号肽分析图。
图4为本发明实施例中加州鲈pIgR蛋白抗原性分析图。
图5为本发明实施例中多肽的HPLC分析图。
图6为本发明实施例中多肽的MS分析图。
图7为本发明实施例中加州鲈pIgR多抗的纯化后SDS-PAGE分析图；M:蛋白质分子质量标准；1:抗体纯化分析结果。
图8为本发明实施例中多克隆抗体ELISA法检测加州鲈黏液及胆汁中pIgR蛋白水平变化图。A，B，C，D分别为加州鲈皮肤、鳃、肠黏液及胆汁pIgR的ELISA结果。小写字母：灭活嗜水气单胞菌免疫刺激后各组不同时间蛋白表达水平显著性差异水平(P<0.05)。
图9为本发明实施例中抗体检测加州鲈黏液及胆汁中pIgR蛋白水平变化。其中，M：蛋白质分子质量标准；1：皮肤黏液，2：鳃黏液，3：肠黏液，4：胆汁。
图10为本发明实施例中抗体检测加州鲈肠免疫组化结果。其中，A，a分别为加州鲈肠与兔抗加州鲈pIgR多抗及未免疫兔血清免疫组化结果。标尺：100μm。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个典型实施方式中，提供一种抗加州鲈pIgR抗体的抗原表位多肽，所述多肽的氨基酸序列选自：包括或由SEQ ID NO.1构成的序列。
本发明的又一具体实施方式中，所述多肽的表位是加州鲈pIgR蛋白的第251-262个氨基酸序列。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述抗原表位多肽在制备抗加州鲈pIgR抗体中的应用。
其中，所述抗加州鲈pIgR抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
上述抗体可用于检测加州鲈pIgR蛋白。所述检测可以为定性检测或定量检测。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种抗加州鲈pIgR抗体，所述抗加州鲈pIgR其特异性结合加州鲈pIgR并且特异性识别上述抗原表位多肽。
具体的，所述抗加州鲈pIgR抗体是使用上述抗原表位多肽作为抗原制备得到。
所述抗加州鲈pIgR抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸能够编码上述抗加州鲈pIgR抗体。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述抗加州鲈pIgR抗体的制备方法，所述制备方法包括：针对上述抗原表位多肽构成的抗原对非人动物进行免疫获得。
所述抗加州鲈pIgR抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
当制备加州鲈pIgR多克隆抗体时，所述非人动物为兔。因此最终制备得到的是抗加州鲈pIgR抗体的抗原表位多肽的兔多克隆抗体。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于检测加州鲈pIgR蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含上述抗加州鲈pIgR抗体。
所述试剂盒可以为基于免疫组织化学染色法或ELISA法等实现的试剂盒，所述试剂盒还可以包含用于检测常用的缓冲溶液，试剂等，在此不再赘述。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测加州鲈pIgR蛋白的方法，所述方法包括：采用上述抗加州鲈pIgR抗体和/或上述试剂盒对待测样品进行检测。经试验验证，以该抗原表位多肽制备的多克隆抗体能与加州鲈pIgR蛋白特异性结合，且效价高，其检测效果甚至优于以完整pIgR蛋白制备的多克隆抗体。上述检测方法可采用诸如免疫组织化学染色法、ELISA法等，从而实现对加州鲈pIgR蛋白的定性或定量检测，在此不再赘述。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述抗原表位多肽、抗加州鲈pIgR抗体、试剂盒或方法在如下任意一种或多种中的应用：
a)对加州鲈pIgR蛋白的结构、来源、功能及与免疫球蛋白之间关系的研究；
b)对加州鲈pIgR在黏膜免疫防御过程中的作用研究。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
一、基因pIgR的序列分析
基因pIgR序列选自GenBank:MT919254.1(Micropterus salmoides polymericimmunoglobulin receptor mRNA,complete cds)，通过对其及其编码蛋白进行稀有密码子分析、亲疏水分析、跨膜结构域分析和信号肽预测以及抗原性分析，通过对抗原表位分析结果及跨膜分析结果来选择肽段，采用化学合成的方式合成肽段，免疫后制备多克隆抗体。
最终确定抗原表位多肽序列：PPPKPITKESWN-C(SEQ ID NO.1)，是加州鲈pIgR蛋白的第251-262个氨基酸序列。
二、实验方案
(1)抗原制备
多肽合成及完全抗原制备，多肽合成并偶联载体蛋白，裸肽提供MS和HPLC质控报告，如图5-6所示，纯度大于90％。
(2)抗原质控
SDS-PAGE检测，完全抗原(-BSA或-OVA或-KLH均可)6-7mg，纯度大于90％，免疫两只兔子。
(3)动物免疫
采用抗原乳化后免疫2只实验兔。第一免疫3周后进行第二次免疫，间隔2周后进行第三次免疫，第三次免疫间隔2周后进行第四次免疫，第四次免疫间隔2周后进行第五次免疫。
(4)效价检测
第三次免疫后取血测效价，最多进行6次免疫提高抗血清效价，免疫期间分别取血清Western Blot检测阳性组织裂解液。
(5)抗体纯化
采用ProteinA/G琼脂糖纯化树脂亲和纯化抗体。
(6)Western Blot验证
抗血清以及抗血清纯化后抗体分别Western Blot检测重组蛋白或者阳性组织裂解液。
2.1动物免疫
免疫次数 免疫周期 免疫剂量 免疫佐剂 免疫动物状态
第一次免疫 1天 0.5mg 完全弗氏佐剂 良好
第二次免疫 14天 0.5mg 不完全弗氏佐剂 良好
第三次免疫 28天 0.5mg 不完全弗氏佐剂 良好
三免取血 35天 / / 采血正常
第四次免疫 42天 0.5mg 不完全弗氏佐剂 良好
四免取血 49天 / / 采血正常
免疫动物采血 56天 / / 采血正常
2.2抗血清ELISA检测
(1)抗原包被：用包被液稀释抗原到2μg/ml，100μL/孔加入96孔酶标反应板中，4℃过夜包被。
(2)洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗3次。
(3)封闭：加200μL/孔封闭液，37℃温育2h。
(4)洗涤：用洗涤液洗3次。
(5)加待测样品(一抗)：加入抗血清(取血4℃4000rmp离心10min取上清)，用稀释液将血清按1:2000,1:4000,1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000......进行倍比稀释(空白血清同比稀释做阴性对照)，每孔100μl，37℃孵育1h。
(6)洗涤：用洗涤液洗3次。
(7)加酶标抗抗体：加入HRP标记IgG二抗，100μl/孔，37℃孵育40min。(羊抗小鼠-HRP 1：5000-1：10000，羊抗兔-HRP 1：5000-1：10000)
(8)洗涤：用洗涤液洗5次后拍干。
(9)显色：加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，37℃遮光放置5～20min。
(10)终止反应、比色：加50μL/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。
2.3抗血清效价
通过ELISA检测效价得出，加州鲈pIgR抗体效价在9841.5K以上。
表1纯化抗体的检测结果
起始稀释度：1μg/mL(即1:850稀释起始)
效价即样品OD/空白OD≥2.1的最高稀释度
三、抗体纯化
3.1抗体纯化
(1)层析柱预处理：10倍柱床体积的去离子水冲洗3-5遍，流速1ml/min；10倍柱体积的0.02M PB+0.3M NaCl冲洗3-5遍，流速1ml/min。
(2)样品上样：4-10ml抗血清/腹水，用0.02M PB稀释后，0.22um滤器过滤后上柱，调整流速为5-7s/滴。
(3)洗杂：0.02M PB冲洗至检测(G250不变蓝)无蛋白流出为止，流速2s/滴。
(4)抗体洗脱：0.1M PH＝3.0甘氨酸以3-5s/滴过柱洗脱，收集洗脱物并用G250检测洗脱产物至不变蓝为止。
(5)PH值调节：饱和碳酸钠调节洗脱产物pH至中性。
(6)超滤浓缩：10kDa超滤管，超滤浓缩至1-3ml左右。
(7)透析：5L，0.01M PH＝7.4PBS透析过夜，第二天换液1次后再透析4-6h左右后跑SDS胶并测定抗体浓度后装入标记好EP管，可暂存于4℃备用或直接保存于-20℃。
(8)层析柱洗涤与贮存：去离子水冲洗层析柱，5倍柱床体积20％乙醇冲洗层析柱后，4℃封存。
3.2抗体纯化结果
纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。可见抗体纯化后纯度在85％以上。
四、本发明多克隆抗体ELISA法检测加州鲈黏液及胆汁中pIgR蛋白水平变化
1.灭活嗜水气单胞菌的制备
嗜水气单胞菌菌株(Aeromonas hydrophila)在28℃条件下于LB培养基中振摇培养48h。取28℃振荡培养48h后的100mL细菌培养液，11000r/min离心10min，沉淀用灭菌磷酸缓冲液(PBS，pH7.2)清洗三次，用含0.3％福尔马林的PBS重新悬浮，室温下放置24h。灭活后的细菌悬浮液再次以11000r/min离心10min，用灭菌PBS清洗两次以去除福尔马林，最后用灭菌PBS稀释到约1.0×108cells/mL，制备好的嗜水气单胞菌苗置于4℃冰箱备用。
2.加州鲈免疫及样品采集
实验前将健康加州鲈随机饲养在2.0×2.0×0.5m容积的玻璃钢水槽中，水温20±1℃，pH为7.6-8.2，饲养期间连续充气，每天换水1/3-1/2，投喂饲料2次，暂养一周后，把鱼分成两组用于免疫。第一组腹腔注射由PBS稀释的浓度为1×108CFU/mL的嗜水气单胞菌灭活疫苗，每尾注射100μL；第二组浸泡于由养殖稀释的浓度为1×108CFU/mL灭活菌液中，连续充气浸泡30min。
3.加州鲈黏液及胆汁的收集
分别于免疫前及免疫后1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d、28d、35d、49d每组随机取加州鲈五尾，分别收集皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液和胆汁。
用干净无菌的载玻片轻轻刮取加州鲈皮肤表面的黏液并收集，加入等体积的PBS，混合五尾鱼的皮肤黏液。
从采过血的加州鲈中剪下鱼鳃，切成数断，PBS冲洗数次，放入装有PBS的离心管中，4℃放置2h，期间震荡数次。
取采过血的加州鲈中剪下鱼肠，仔细剔除肠系膜和血管，PBS冲洗数次，剪成小段，再纵向剪开，放入装有PBS的离心管中，4℃放置2h，期间震荡数次。
从取过血的加州鲈中取出胆囊，小心剥离胆囊周围组织，用PBS冲洗数次，吸取表层水分，刺破胆囊，使胆汁流出并收集，混合五尾鱼的胆汁。
将上述各时间点五尾鱼的胆汁以及皮肤、鳃和肠黏液，分别于4℃条件下12000g离心15min，取上清，将各组蛋白浓度调成一致，-80℃保存备用。4.加州鲈黏液及胆汁中pIgR的蛋白水平变化检测
为了使ELISA的条件最优化，正式实验前对抗原包被浓度、样品稀释倍数和抗体稀释倍数进行了预实验，确定了最适条件，下面给出的即为最适条件。
(1)将收集的皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁浓度提前稀释到0.1mg/mL加入到96孔板中，每孔加100μL，放入4℃冰箱过夜。
(2)次日用含0.05％吐温20的PBS(PBST)洗涤三次，每次5min，之后加入200μL含5％ BSA的PBS，37℃封闭1h。
(3)同法洗涤三次，每孔加入PBS稀释的兔抗加州鲈pIgR多抗100μL(1:4000稀释)，37℃孵育1h。
(4)PBST洗涤三次后，每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体(1:5000稀释)，37℃孵育1h。
(5)PBST洗涤三次，最后一次洗涤完毕后，每孔加入含0.1％pNPP的pNPP缓冲液(35mM NaHCO3，15mM Na2CO3，0.5mM MgCl2·6H2O，pH 9.6)100μL，室温显色30min，2M的NaOH中止发色，在405nm波长下测定平均吸光度值(OD)。未免疫兔血清代替兔抗加州鲈pIgR多抗作为阴性对照，计算OD值比例P/N，当P/N≥2.1时判定为阳性。
5.结果
5.1加州鲈黏液及胆汁中pIgR蛋白水平变化
经腹腔注射和浸泡两种不同方式免疫嗜水气单胞菌后，ELISA结果显示皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液和胆汁等外分泌液中的pIgR蛋白水平在28d内先上调，而后下调到对照组水平。经浸泡免疫后，在皮肤黏液和鳃黏液中，pIgR蛋白的表达水平在免疫后3d达到峰值，在肠黏液中，pIgR的表达水平在5d达到峰值，而在胆汁中则需要7d达到峰值；在注射组中，肠黏液和胆汁中pIgR的蛋白水平在免疫后7d达到峰值，而在皮肤黏液和鳃黏液中，pIgR的蛋白水平在免疫后5d达到峰值。浸泡组中皮肤黏液、鳃黏液和肠黏液的峰值较注射组高，而胆汁的峰值较注射组低。
五、本发明多克隆抗体ELISA法检测加州鲈外分泌液和血清中pIgR
1.样品采集及前处理
随机取一尾加州鲈，尾静脉采血，室温静置1h，4℃过夜，次日4℃条件下12000g离心15min，分离血清，-80℃保存备用。
将所取的血清与实验3中收集的加州鲈皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁经过100kDa超滤管超滤浓缩，最终去除部分小分子量蛋白并增大蛋白浓度。
2.蛋白电泳及Western Blot
(1)配置SDS-PAGE胶
注：表格中斜体字为此次配置的10％分离胶体积。
注：表格中斜体字为此次配置的5％浓缩胶体积。
(2)按照配方配好分离胶，加入已经架好的制胶板中。缓慢加入至板的2/3的位置。加入无水乙醇压胶。待分离胶凝固后，加入浓缩胶，并插上齿梳。(3)等到浓缩胶完全凝固后，配置1×电泳液。
(4)将架子放入到电泳液里拔去齿梳，加入一定体积的蛋白样品和Marker。蛋白上样量：
(5)配制1×电泳液，用1×电泳液浸没胶板，开始电泳，60V压缩蛋白，80V分离蛋白(120分钟)。
(6)当条带跑至胶板一半的时候配置1×转膜液，并预冷。
(7)根据预计条带的位置裁剪好PVDF膜(约1-2cm)，甲醇激活15s。
(8)切好大小合适含有内参或目的条带的胶。
(9)放好＂三明治＂(海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵)。
(10)用1×转膜液将“三明治”浸没，用300mA恒流转膜1小时20min。
注：此表为各个指标电泳及转膜时间
(11)用1×TBST配置3％的脱脂牛奶封闭液，封闭过夜。
(12)配置兔抗加州鲈pIgR稀释液(1:3000)，将PVDF膜孵育一抗3小时。
(13)洗膜，用1×TBST浸泡10min后弃掉1×TBST，重复3次。
(14)配置2抗辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)稀释液(1：5000稀释)，将PVDF膜孵育二抗2小时。
(15)洗膜，用1×TBST浸泡10min后弃掉1×TBST，重复3次。
(16)配置发光液，用发光液浸湿PVDF膜后放置于超高灵敏度化学发光成像系统样品放置区运行程序显影成像。
结果：本发明多抗兔抗加州鲈pIgR多克隆抗体与加州鲈皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁反应，且均在相对分子质量约37kDa位置出现单一条带，但是不与加州鲈血清反应，说明皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液和胆汁中均存在pIgR，而血清中则不存在pIgR。
六、本发明多克隆抗体免疫组织化学染色法定位加州鲈黏膜组织中pIgR1.加州鲈组织石蜡切片的制备
(1)取材：利用提前灭菌处理的解剖刀、剪刀、纱布、镊子等工具解剖加州鲈，将皮肤、后肠组织切成大小为0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，无菌PBS冲洗干净后放入4％多聚甲醛固定24h。
(2)脱水浸蜡：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-65°融化石蜡I1h-65°融化石蜡II 1h-65°融化石蜡III 1h。
(3)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
(4)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
2.免疫组织化学染色
(1)抗原修复：将切片放入修复盒中，加入抗原修复液(柠檬酸缓冲液)，高压锅加热到自动放气，2min后离开热源自然冷却，弃去抗原修复液，将切片用PBS淋洗。抗原修复液配方：称取柠檬酸钠Na3C6H5O7·2H2O 29.4g，加蒸馏水至1L，称取柠檬酸C6H5O7·H2O 21.0g，加蒸馏水至1L；量取柠檬酸钠溶液16.2mL，柠檬酸溶液3.8mL，加蒸馏水至200mL，调整pH到6.0。
(2)将切片移入湿盒中，加入新鲜配制的3％双氧水，以去除内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10min，PBS充分淋洗。
(3)封闭：PBS浸洗玻片3次，每次5min，吸水纸吸干组织周围的PBS，在玻片上滴加5％BSA，37℃封闭30min。
(4)PBST洗涤三次，甩干之后分别滴加兔抗加州鲈pIgR重组蛋白多抗(1:500)，37℃孵育1h。
(5)PBST浸洗三次，之后滴加山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1：100)工作液，37℃孵育30min。
(6)PBST清洗三次，DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度，自来水冲洗1min。
(7)苏木精复染3min，盐酸酒精分化，返蓝；自来水冲洗1min，脱水、透明、封片、镜检。
(8)未免疫兔子血清代替多抗作为阴性对照。
结果：使用抗加州鲈pIgR多抗对加州鲈黏膜免疫组织后肠进行免疫组化染色，结果显示在加州鲈后肠中，实验组出现了明显的红色阳性信号，而对照组中未观察到阳性信号。
Western blot结果表明该多抗可与pIgR特异性反应，从而证实本发明多抗可以用作研究多聚免疫球蛋白受体的结构、来源及在黏膜免疫应答中的功能的重要工具。另外，可以通过检测加州鲈黏液中多聚免疫球蛋白受体的产生，进行加州鲈疾病的诊断及疫苗使用效果的评价，使得本发明多抗可用于制备加州鲈疾病早期诊断试剂盒或构建疫苗使用效果评价体系，为加州鲈疾病的预防及治疗提供工具与技术手段，为其他养殖鱼类疾病的防治提供参考。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种抗加州鲈pIgR抗体的抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽的氨基酸序列选自：包括或由SEQ ID NO.1构成的序列。
2.权利要求1所述抗原表位多肽在制备抗加州鲈pIgR抗体中的应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述抗加州鲈pIgR抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；所述抗体用于检测加州鲈pIgR蛋白。
4.一种抗加州鲈pIgR抗体，所述抗加州鲈pIgR抗体其特异性结合加州鲈pIgR蛋白并且特异性识别权利要求1所述抗原表位多肽。
5.一种多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸能够编码权利要求4所述抗加州鲈pIgR抗体。
6.权利要求4所述抗加州鲈pIgR抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：针对权利要求1所述抗原表位多肽构成的抗原对非人动物进行免疫获得。
7.一种用于检测加州鲈pIgR蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求4所述抗加州鲈pIgR抗体。
8.一种检测加州鲈pIgR蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求4所述抗加州鲈pIgR抗体和/或权利要求7所述试剂盒对待测样品进行检测。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，检测方法可以为定性检测或定量检测。
10.权利要求1所述抗原表位多肽、权利要求4所述抗加州鲈pIgR抗体、权利要求7所述试剂盒或权利要求8-9任一项所述方法在如下任意一种或多种中的应用：
a)对加州鲈pIgR蛋白的结构、来源、功能及与免疫球蛋白之间关系的研究；
b)对加州鲈pIgR在黏膜免疫防御过程中的作用研究。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105085672A (zh) * 2015-01-19 2015-11-25 鄢慧民 3d蛋白特异性单克隆免疫球蛋白a抗体及其组合物
CN112552405A (zh) * 2021-01-06 2021-03-26 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用
CN113308487A (zh) * 2021-05-28 2021-08-27 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 多种草鱼重组细胞因子及其制备方法和在协同增强草鱼免疫功能中的应用
CN115806592A (zh) * 2022-11-04 2023-03-17 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 一种抗乌鳢pIgR抗体及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105085672A (zh) * 2015-01-19 2015-11-25 鄢慧民 3d蛋白特异性单克隆免疫球蛋白a抗体及其组合物
CN112552405A (zh) * 2021-01-06 2021-03-26 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用
CN113308487A (zh) * 2021-05-28 2021-08-27 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 多种草鱼重组细胞因子及其制备方法和在协同增强草鱼免疫功能中的应用
CN115806592A (zh) * 2022-11-04 2023-03-17 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 一种抗乌鳢pIgR抗体及其制备方法和应用

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