CN112876557A

CN112876557A - 草鱼黏液IgM重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用

Info

Publication number: CN112876557A
Application number: CN202110013346.5A
Authority: CN
Inventors: 许国晶; 张金路; 杜兴华; 孟庆磊; 王志忠; 李壮; 巩俊霞; 成慧中; 张明磊
Original assignee: Shandong Freshwater Fisheries Research Institute
Current assignee: Shandong Freshwater Fisheries Research Institute
Priority date: 2021-01-06
Filing date: 2021-01-06
Publication date: 2021-06-01

Abstract

本发明涉及一种草鱼黏液IgM重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用。本发明草鱼黏液IgM重组表达蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建黏液IgM表达载体pET28a(+)‑IgM；将构建的重组质粒pET28a(+)‑IgM转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼黏液IgM。本发明还涉及一种抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法和抗草鱼IgM多克隆抗体的应用。本发明为研究草鱼黏液IgM的结构、来源、功能提供了重要工具，为草鱼疾病的预防及治疗提供了重要的技术手段，为其他养殖鱼类疾病的防治提供参考。

Description

草鱼黏液IgM重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种多克隆抗体的制备方法及其应用，具体讲是一种抗草鱼(Paralichthys olivaceus)黏液IgM重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用，属于鱼类分子免疫学技术领域。

背景技术

鱼类具有以免疫球蛋白(Ig)为中心的特异性免疫机制，在水环境中，其皮肤、鳃及其分泌的黏液等与外界环境直接接触，是鱼体抵抗外界病毒和细菌入侵的第一道防线，在免疫应答与免疫保护过程中起着极其重要的作用。鱼类黏液除含有非特异性免疫成分外，还含有免疫球蛋白。关于鱼类黏液免疫球蛋白与血清免疫球蛋白是否有着共同的起源，是否是一样的，目前还有很多争议。

草鱼作为我国淡水养殖的四大家鱼之一，其养殖对我国农业经济增长具有重要的意义。目前，关于其免疫球蛋白的研究较多，已经报道了IgM、IgZ和IgD三种类型免疫球蛋白，及新型免疫球蛋白IgZ2、IgM-IgZ，其中，IgM、IgZ存在分泌型(即黏液IgM、IgZ)和膜结合型两种形式。本专利制备抗草鱼黏液IgM的多克隆抗体，可以为阐明IgM的结构、来源、功能以及与血清免疫球蛋白的关系等提供有力工具；另外，鱼类感染某种病原或接种疫苗后，鱼体会产生黏液IgM即分泌型IgM(SIgM)。因此，利用抗草鱼黏液IgM的多克隆抗体，通过检测草鱼黏液中IgM的产生，可以进行草鱼疾病的早期诊断和疫苗使用效果的评价，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治具有参考价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种草鱼黏液IgM重组表达蛋白及抗草鱼黏液IgM多克隆抗体的制备方法；本发明的另一个目的是提供一种抗草鱼黏液IgM多克隆抗体的应用。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：

一种草鱼黏液IgM重组表达蛋白及抗草鱼黏液IgM多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：构建黏液IgM表达载体pET28a(+)-IgM；将构建的重组质粒pET28a(+)-IgM 转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼黏液IgM。优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。以制备的草鱼黏液IgM蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，经过3-4次免疫之后，经免疫学检测筛选方法，筛选出特异性分泌抗草鱼黏液IgM多克隆抗体。

所述的构建黏液IgM表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼黏液IgM基因，经EcoRV及XhoI双酶切后连接pET28a(+)。

所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法和转印免疫印迹法；其中所述的间接酶联免疫法是将制备的免疫兔血清与纯化的草鱼黏液IgM蛋白于96孔酶标板中反应；继而加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体；450nm工作波长测定各孔光吸收值，筛选抗草鱼黏液IgM蛋白的多克隆抗体。所述的转印免疫印迹法是将制备的抗草鱼黏液IgM蛋白的多克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的草鱼黏液IgM蛋白反应，确定该多抗的抗原决定簇是分子量为62.50kDa的草鱼黏液IgM蛋白。

一种所述抗草鱼黏液IgM多克隆抗体的应用，包括如下步骤：利用ELISA分析灭活柱状黄杆菌免疫草鱼后黏液IgM免疫应答规律；用免疫组织化学染色法定位草鱼黏液IgM在系统及黏膜组织中的分布。

所述的ELISA是将收集免疫后的草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁包被至96孔板，多克隆抗体孵育；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；分析免疫后各分泌液中IgM 蛋白水平变化。

所述的免疫组织化学染色法是将多克隆抗体与草鱼黏膜组织石蜡切片反应；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；检测多克隆抗体可以特异性结合黏膜细胞膜表面的抗原决定簇。

本发明的制备技术路线设计新颖，其通过构建重组质粒转入表达菌株，使用IPTG诱导表达草鱼黏液IgM，优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得高纯度的草鱼黏液IgM蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔；经筛选得到抗草鱼黏液IgM的多克隆抗体；所得的多克隆抗体再经间接酶联免疫法和转印免疫印迹法验证其特性。这样的制备技术路线严密合理且可行，充分发挥了现有免疫学检测筛选方法的作用和效果。

抗草鱼黏液IgM的多克隆抗体能与草鱼黏液IgM特异性结合，且效价高。抗草鱼黏液IgM多克隆抗体的制得为研究草鱼黏液IgM的结构、来源、功能提供了重要工具，尤其是在疫苗效果评价使用中发挥重要作用。目前我国针对鱼类病原的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗的研究已取得了丰硕成果，但应用尚处于初级阶段，绝大多数尚未实现真正意义的产业化应用，且疫苗效果缺乏简便、准确、有效的评价技术体系。传统疫苗效果评价一般采用攻毒实验测定保护率进行判定，存在引发疾病感染流行的隐患，结果受到病原特性、鱼体生理机能以及环境理化因素的影响，且对潜伏期长的病原容易造成误判。因此，亟需监测鱼体接种疫苗后体内细胞免疫应答和体液免疫应答的动态规律，分析和明确与疫苗免疫效果密切相关的关键免疫因子,并实现相关性的定量分析，从而构建鱼类疫苗效果评价体系。疫苗效果的评价主要包括检测鱼体内的免疫球蛋白和免疫细胞水平两个方面，利用制备的抗草鱼黏液IgM的多克隆抗体，通过ELISA、免疫渗滤、检测试纸、抗独特型抗体等测定鱼体抗致病性抗原(柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、呼肠孤病毒等)抗体IgM的含量，通过流式细胞术、免疫荧光技术测定鱼体免疫细胞的数量和免疫水平，从而进行疾病的早期诊断和疫苗使用效果的评价，为草鱼疾病的预防及治疗提供了重要的技术手段，为其他养殖鱼类疾病的防治提供参考。

附图说明

图1为构建的重组质粒pET28a(+)-IgM图谱。

图2为IPTG诱导IgM重组表达及Ni柱亲和纯化IgM电泳图。

图3为本发明的抗草鱼IgM多抗的转印免疫印迹检测结果图。

图4为本发明的多克隆抗体ELISA法检测免疫刺激后草鱼IgM表达水平变化结果图。

图5为本发明的抗草鱼IgM多抗的免疫组织化学的结果图。

参见图1-图5：

图1所示：构建的重组质粒pET28a(+)-IgM图谱。

图2所示：M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；1表示IPTG诱导空质粒；2表示IPTG未诱导重组质粒结果；3表示IPTG诱导重组质粒表达结果；4表示Ni柱亲和纯化结果，分子量为62.50kDa。

图3所示：M是标准分子量蛋白；1表示抗IgM多抗孵育IPTG未诱导重组质粒结果；2表示抗IgM多抗孵育IPTG诱导重组质粒结果；3表示His单抗孵育IPTG诱导重组质粒结果分子量为62.50kDa。

图4所示：A表示草鱼皮肤黏液IgM的ELISA结果；B表示草鱼鳃黏液IgM的 ELISA结果；C表示草鱼肠黏液IgM的ELISA结果；D表示草鱼胆汁IgM的ELISA 结果。小写字母：灭活柱状黄杆菌免疫刺激后各组不同时间蛋白表达水平显著性差异水平(P<0.05)。

图5所示：A表示草鱼肠与兔抗草鱼IgM免疫组化结果；a表示草鱼肠与未免疫兔血清免疫组化结果；B表示草鱼皮肤与兔抗草鱼IgM多抗免疫组化结果；b表示草鱼皮肤与未免疫兔血清免疫组化结果。C表示草鱼胃与兔抗草鱼IgM免疫组化结果；c 表示草鱼胃与未免疫兔血清免疫组化结果；D表示草鱼鳃与兔抗草鱼IgM多抗免疫组化结果；d表示草鱼鳃与未免疫兔血清免疫组化结果。标尺：50μm。箭头表示阳性反应区域。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例进一步说明本发明。

实施例1：抗草鱼黏液IgM多克隆抗体的制备。

一、重组蛋白IgM的制备

1.草鱼IgM表达引物的设计

根据草鱼IgM(Genbank No.DQ417927)开放阅读框cDNA序列和表达载体 pET-28(a)的多克隆位点序列，加入EcoRV及XhoI位点，设计了一对特异引物IgM -F和IgM-R。

IgM-F：CCATGCATCATCATCATCATCACCAGA

IgM-R：CTCGAGCTAGTCCTTGCAGGATGCAG

2.IgM表达基因的扩增、纯化及双酶切

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA片段回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收。然后以EcoRV及XhoI对产物进行双酶切，酶切体系如下：回收PCR 产物：1μg，Hbuffer：2μl，EcoRV：1μl，XhoI：1μl，加ddH₂O至终体积20μl，37 ℃酶切6h，取出后直接利用PCR产物纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收。

3.pET28a-质粒双酶切

酶切体系如下。

4.IgM表达载体(pET-28a-IgM)的构建

预先根据目的基因和质粒的浓度将两者的摩尔浓度调整至一致，再将目的基因与质粒按照4：1的比例(摩尔比)进行混合连接。

5.pET28a-IgM载体转化至大肠杆菌Arctic Express

(1)将质粒1μl加入100μl感受态细菌中，置冰上20min；

(2)42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μl LB培养液；

(3)37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Kan的LB平板， 37℃倒置培养过夜。

6.IPTG诱导pET28a-IgM载体融合蛋白的表达

(1)挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml Kan的3ml LB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜；

(2)次日按1:100接种于50μg/ml Kan的30ml LB培养液中，37℃220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8；

(3)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；

(4)向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达；

(5)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。

7.包涵体蛋白的变复性

(1)将菌体沉淀重悬于20ml裂解液(20mM Tris-HCl containing 1mM PMSF andbacteria protease inhibitor cocktail，pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)；

(2)将超声破碎的细胞裂解液4℃10000r/mim离心20min，收集沉淀；

(3)使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3次；

(4)用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH8.0)，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000r/mim离心15min；

(5)将上述溶液滴加20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0 溶液中透析过夜。

8.Ni柱纯化

(1)利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer 预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；

(2)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(3)用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(4)用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

(5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl， pH8.0进行透析过夜；

(6)进行12％SDS-PAGE分析。

9.结果分析

如图2所示，利用IPTG诱导蛋白表达，经12％SDS-PAGE分析，目标蛋白分子量为62.5kDa。包涵体经过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过Ni柱亲和纯化获得纯度很高的目的表达蛋白，无其他明显杂带存在。

二、免疫新西兰大白兔

以制备的草鱼多聚免疫球蛋白受体进行BCA蛋白浓度测定后，免疫新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫1次。3-4次免疫之后，采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对草鱼黏液IgM的效价，待效价大于1：50000进行最终采血制备抗血清。

三、免疫学检测筛选

1.间接ELISA效价检测

(1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。

(2)用PBS包被液将草鱼多聚免疫球蛋白受体抗原稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100ul，4℃冰箱过夜。

包被抗原：草鱼黏液IgM

包被浓度：5μg/ml，100μl/孔

包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)

(3)包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

(4)抗血清按1/500，3倍稀释，每孔100μl，37℃恒温箱1h。

(5)取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μl稀释好的酶标二抗，酶标二抗：山羊抗兔-HRP，1/5000。37℃恒温箱1h。

(6)取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μl TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。

(7)每孔加入100μl 1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

2.转印免疫印迹法检测

(1)样品上样1μl，纯化蛋白上样0.05μg。

(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先100V跑完积层胶，再将电压升至130V 直到电泳结束。

(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒流250mA转膜，约为1h。

(4)电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min。

(5)将PVDF膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。

(6)用PBST稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。

(7)次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min。

(8)用含5％脱脂奶粉的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1h。

(9)反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。

(10)ECL显影，曝光。

3.结果分析

(1)通过ELISA检测效价得出，草鱼黏液IgM抗血清效价在121.5K左右。

表1抗血清的检测结果

Table 1The test result of antibody purification

起始稀释度:1:500，效价即样品OD/空白OD≥2.1的最高稀释度。

(2)Western Blot检测结果

所获得的多抗及抗His标签蛋白单抗能与分子量为62.5kDa的IgM重组蛋白发生特异性结合，多抗与IPTG未诱导重组质粒不发生反应。

实施例2：本发明多克隆抗体ELISA法检测草鱼黏液及胆汁中IgM蛋白水平变化。

1.灭活柱状黄杆菌的制备

柱状黄杆菌菌株(Flavobacterium columnare G4)在25℃条件下于Shieh培养基(1L 培养液中，含蛋白胨5g，酵母粉0.5g，0.01g CH₃COONa·3H₂O，0.01g BaCl₂·2H₂O，0.1g K₂HPO₄，0.05gKH₂PO₄，0.3g MgSO₄·7H₂O，0.0067g CaCl₂·2H₂O，0.001g FeSO₄·7H₂O，0.05g NaHCO₃，pH7.2)中振摇培养48h。

取25℃振荡培养48h后的100mL细菌培养液，11000r/min离心10min，沉淀用灭菌磷酸缓冲液(PBS，pH7.2)清洗三次，用含1.0％福尔马林的PBS重新悬浮，室温下放置24h。灭活后的细菌悬浮液再次以11000r/min离心10min，用灭菌PBS清洗两次以去除福尔马林，最后用灭菌PBS稀释到约1.0×10⁸cells/mL，制备好的FKG 菌苗置于4℃冰箱备用。

2.草鱼免疫及样品采集

实验前将健康草鱼随机饲养在2.0×2.0×0.5m容积的玻璃钢水槽中，水温20±1℃， pH为7.6-8.2，饲养期间连续充气，每天换水1/3-1/2，投喂饲料2次，暂养一周后，把鱼分成两组用于免疫。第一组腹腔注射由PBS稀释的浓度为1×10⁸CFU/mL的柱状黄杆菌灭活疫苗，每尾注射100μL；第二组浸泡于由养殖稀释的浓度为1×10⁸CFU/mL 灭活菌液中，连续充气浸泡30min。

两组鱼分别于免疫前及免疫后4h、8h、12h、24h、48h、72h、7d、14d、28d每组随机取鱼三尾，解剖并分别取皮肤、鳃、肠、肝、脾和头肾6种组织，分别混合三尾鱼的各组织，放入组织保护液中-20℃保存，用于实时荧光定量PCR分析。

3.草鱼黏液及胆汁的收集

分别于免疫前及免疫后1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d、28d、35d、42d每组随机取草鱼五尾，分别收集皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液和胆汁。

用干净无菌的载玻片轻轻刮取草鱼皮肤表面的黏液并收集，加入等体积的PBS，混合五尾鱼的皮肤黏液。

从采过血的草鱼中剪下鱼鳃，切成数断，PBS冲洗数次，放入装有PBS的离心管中，4℃放置2h，期间震荡数次。

取采过血的草鱼中剪下鱼肠，仔细剔除肠系膜和血管，PBS冲洗数次，剪成小段，再纵向剪开，放入装有PBS的离心管中，4℃放置2h，期间震荡数次。

从取过血的草鱼中取出胆囊，小心剥离胆囊周围组织，用PBS冲洗数次，吸取表层水分，刺破胆囊，使胆汁流出并收集，混合五尾鱼的胆汁。

将上述各时间点五尾鱼的胆汁以及皮肤、鳃和肠黏液，分别于4℃条件下12000g离心15min，取上清，将各组蛋白浓度调成一致，-80℃保存备用。

4.ELISA法检测草鱼黏液及胆汁中IgM的蛋白水平变化

为了使ELISA的条件最优化，正式实验前对抗原包被浓度、样品稀释倍数和抗体稀释倍数进行了预实验，确定了最适条件，下面给出的即为最适条件。

(1)将收集的皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁浓度提前稀释到0.1mg/mL加入到96孔板中，每孔加100μL，放入4℃冰箱过夜。

(2)次日用含0.05％吐温20的PBS(PBST)洗涤三次，每次5min，之后加入 200μL含5％BSA的PBS，37℃封闭1h。

(3)同法洗涤三次，每孔加入PBS稀释的兔抗草鱼IgM重组蛋白多抗100μL (1:6000稀释)，37℃孵育1h。

(4)PBST洗涤三次后，每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体 (1:5000稀释)，37℃孵育1h。

(5)PBST洗涤三次，最后一次洗涤完毕后，每孔加入含0.1％pNPP的pNPP缓冲液(35mM NaHCO₃，15mM Na₂CO₃，0.5mM MgCl₂·6H₂O，pH 9.6)100μL，室温显色30min，2M的NaOH中止发色，在405nm波长下测定平均吸光度值(OD)。未免疫兔血清代替兔抗草鱼IgM重组蛋白多抗作为阴性对照，计算OD值比例P/N，当 P/N≥2.1时判定为阳性。

结果：皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液和胆汁等外分泌液中的IgM蛋白水平在49d内先上调，而后下调到对照组水平。在浸泡组中，皮肤黏液IgM的表达水平在免疫后7d 达到峰值，鳃黏液IgM的表达水平在免疫后14d达到峰值；而在肠黏液和胆汁中在免疫后21d达到峰值；在注射组中，所有外分泌中IgM的表达水平均在免疫后21d达到峰值。浸泡组皮肤黏液和鳃黏液的峰值较注射组高，而肠黏液和胆汁的峰值较注射组低。

实施例3：本发明多克隆抗体免疫组织化学染色法定位草鱼黏膜组织中IgM。

1.草鱼组织石蜡切片的制备

(1)取材：利用提前灭菌处理的解剖刀、剪刀、纱布、镊子等工具解剖草鱼，将皮肤、鳃、后肠和胃等组织切成大小为0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，无菌PBS冲洗干净后放入4％多聚甲醛固定24h。

(2)脱水浸蜡：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯 5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-65°融化石蜡I1h-65°融化石蜡II 1h-65°融化石蜡III 1h。

(3)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

(4)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm。切片漂浮于摊片机40 ℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

2.免疫组织化学染色

(1)抗原修复：将切片放入修复盒中，加入抗原修复液(柠檬酸缓冲液)，高压锅加热到自动放气，2min后离开热源自然冷却，弃去抗原修复液，将切片用PBS淋洗。抗原修复液配方：称取柠檬酸钠Na₃C₆H₅O₇·2H₂O 29.4g，加蒸馏水至1L，称取柠檬酸 C₆H₅O₇·H₂O21.0g，加蒸馏水至1L；量取柠檬酸钠溶液16.2mL，柠檬酸溶液3.8mL，加蒸馏水至200mL，调整pH到6.0。

(2)将切片移入湿盒中，加入新鲜配制的3％双氧水，以去除内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10min，PBS充分淋洗。

(3)封闭：PBS浸洗玻片3次，每次5min，吸水纸吸干组织周围的PBS，在玻片上滴加5％BSA，37℃封闭30min。

(4)PBST洗涤三次，甩干之后分别滴加兔抗草鱼IgM重组蛋白多抗(1:500)， 37℃孵育1h。

(5)PBST浸洗三次，之后滴加山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1：100)工作液，37℃孵育30min。

(6)PBST清洗三次，DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度，自来水冲洗1min。

(7)苏木精复染3min，盐酸酒精分化，返蓝；自来水冲洗1min，脱水、透明、封片、镜检。

(8)未免疫兔子血清代替重组蛋白多抗作为阴性对照。

结果：使用抗草鱼黏液IgM重组蛋白多抗对草鱼黏膜免疫组织后肠、皮肤、鳃及胃进行免疫组化染色，结果显示在草鱼后肠、皮肤、鳃及胃中，实验组出现了明显的红色阳性信号，而对照组中未观察到阳性信号。

Western blot结果表明该多抗可与黏液IgM特异性反应，从而证实本发明多抗可以用作研究黏液IgM的结构、来源及在黏液免疫应答中的功能的重要工具。另外，可以通过检测草鱼黏液中IgM的产生，进行草鱼疾病的诊断及疫苗使用效果的评价，使得本发明多抗可用于制备草鱼疾病早期诊断试剂盒或构建疫苗使用效果评价体系，为草鱼疾病的预防及治疗提供工具与技术手段，为其他养殖鱼类疾病的防治提供参考。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims

1.一种草鱼黏液IgM重组表达蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建黏液IgM表达载体pET28a(+)-IgM；将构建的重组质粒pET28a(+)-IgM转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼黏液IgM。

2.一种抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：构建黏液IgM表达载体pET28a(+)-IgM；将构建的重组质粒pET28a(+)-IgM转入Arctic Express菌株，使用IPTG诱导表达草鱼黏液IgM。

3.权利要求2所述的抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征在于：优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。

4.权利要求2所述的抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征在于：以制备的草鱼黏液IgM蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，经过3-4次免疫之后，经免疫学检测筛选方法，筛选出特异性分泌抗草鱼黏液IgM多克隆抗体。

5.权利要求2所述的抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的构建黏液IgM表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼黏液IgM基因，经EcoRV及XhoI双酶切后连接pET28a(+)。

6.权利要求4所述的抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法和转印免疫印迹法；其中所述的间接酶联免疫法是将制备的免疫兔血清与纯化的草鱼黏液IgM蛋白于96孔酶标板中反应；继而加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体；450nm工作波长测定各孔光吸收值，筛选抗草鱼黏液IgM蛋白的多克隆抗体。

7.权利要求2所述的抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的转印免疫印迹法是将制备的抗草鱼黏液IgM蛋白的多克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的草鱼黏液IgM蛋白反应，确定该多抗的抗原决定簇是分子量为62.50kDa的草鱼黏液IgM蛋白。

8.一种抗草鱼IgM多克隆抗体的应用，包括如下步骤：利用ELISA分析灭活柱状黄杆菌免疫草鱼后黏液IgM免疫应答规律；用免疫组织化学染色法定位草鱼黏液IgM在系统及黏膜组织中的分布。

9.根据权利要求8所述的抗草鱼IgM多克隆抗体的应用，其特征在于：所述的ELISA是将收集免疫后的草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁包被至96孔板，多克隆抗体孵育；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；分析免疫后各分泌液中IgM蛋白水平变化。

10.根据权利要求8所述的抗草鱼IgM多克隆抗体的应用，其特征在于：所述的免疫组织化学染色法是将多克隆抗体与草鱼黏膜组织石蜡切片反应；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；检测多克隆抗体可以特异性结合黏膜细胞膜表面的抗原决定簇。