JP2009525740A - 抗旋毛虫抗体によって認識されるポリペプチドとその使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)配列PSSGSRPTYP(SEQ ID NO:5)によって定義されるNBL1抗原の免疫優性のエピトープを含んだポリペプチドと、
b)以下で411抗原とも称されるポリペプチドであり、配列SEQ ID NO:4の25〜175番目のアミノ酸を含むか(411タンパク質の成長した形に相当する)、あるいは、配列SEQ ID NO:4の25〜175番目のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくはより高く、少なくとも85%、90%、または95%の同一性を有する配列を含むポリペプチド、
から選択されることを特徴としている。
−前記生体サンプルを、前記生体サンプルに場合によっては存在する抗旋毛虫抗体との抗原/抗体複合体の形成を可能にする条件のもとで、上記で定義した一つもしくは複数のポリペプチドa)および/または一つもしくは複数のポリペプチドb)と接触させることと、
−あらゆる適切な手段によって、場合によっては形成される抗原/抗体複合体を検出すること、
を含むことを特徴としている。
ENSPEGTVKWASKEDSPVDLSTASRPTNPYTGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYPYTGSRPTPQKPVFPSYQKYPPAVQKYIDSLPSGTQGTLEYTVTQNGVTTTT(SEQ ID NO:11)、
を含んだ断片が挙げられ、またこの配列SEQ ID NO:11の小断片、とりわけ、配列SEQ ID NO:2の363〜409番目のアミノ酸に対応する、
PSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYP(SEQ ID NO:9)という配列を含んだ小断片も含まれ、より特徴的には、配列SEQ ID NO:2の349〜415番目のアミノ酸に対応する、
SRPTNPYTGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYPYTGSRPT(SEQ ID NO:10)という配列を含んだ小断片が含まれる。
NBL1に由来する配列を太字で示し、pET102プラスミドに由来する配列は斜体で示している。
M:分子量マーカー、1:陰性のブタの血清、2:20000匹のT.spiralisのL1Mで実験的に感染させたブタの血清。
A:ELISA THX−NBL1(Cterm)による検出、B:ELISA Ag E/Sによる検出。
横軸:感染後の日数、縦軸:反応性のパーセント。ELISAによる検出限界は黒い線で示している(ELISA THX−NBL1(Cterm)については44%、ELISA Ag E/Sについては14%)。サンプル/ポジティブコントロール比の平均および標準偏差は感染したブタの各群について示している。
横軸:産業用のブタと野外飼育のブタに由来する230の陰性サンプルのコホート。5つの陽性サンプルは実験的に感染させたブタの血清に由来している。限界値は陰性サンプルの平均値の2倍に等しい。縦軸:反応性のパーセント。
411に由来する配列は太字で示している。プラスミドに由来する配列は斜体で示している。
1:感染後50日の陽性血清、2:感染後30日の陽性血清、3:5日前の陰性血清、4:共役型コントロール。M:分子量マーカー。
A:ELISA THX−411による検出、B:ELISA Ag E/Sによる検出。
横軸:感染後の日数、縦軸:反応性のパーセント。ELISAによる検出限界は黒い線で示している(ELISA THX−411では52%、ELISA Ag E/Sでは14%)。サンプル/ポジティブコントロール比の平均と標準偏差は感染したブタの各群について示している。
Trichinella spiralisのL1NNのcDNAライブラリーに対する免疫スクリーニングを、T.spiralisの10000匹のL1Mによって実験的に感染させた後35日目に得られたブタの血清を用いて行った。この血清によって認識されたクローンのシーケンシングによって、それらのうち大半が同一のタンパク質をコードしていることが判定できた。
上記実施例1に記載したように調製したタンパク質THX−NBL1(Cterm)を、T.spiralisの排泄/分泌抗原(E/S)と比較して、旋毛虫に感染したブタに由来する血清に対する間接ELISA法によって評価した。
E/P%=(サンプルのOD−ネガティブコントロールのOD/ポジティブコントロールのOD−ネガティブコントロールのOD)×100
という、ポジティブコントロールの血清に対するサンプル血清の反応性のパーセントの形で示される。
NBL1のC末端部分から推定されるアミノ酸配列のin silico分析を行い、最も抗原性の強い領域を予測できるようにした。
N5EM1:NH2−NSPEGTVKWASKEDS−CONH2(SEQ ID NO:14)
N5EM2:NH2−ASKEDSPVDLSTASR−CONH2(SEQ ID NO:15)
N5EM3:NH2−LSTASRPTNPYTGSR−CONH2(SEQ ID NO:16)
N5EM4:NH2−PYTGSRPTSPSSGSR−CONH2(SEQ ID NO:17)
N5EM5:NH2−PSSGSRPTYPSSGSR−CONH2(SEQ ID NO:6)
N5EM6:NH2−PSSGSRPTSPSSGSR−CONH2(SEQ ID NO:18)
N5EM7:NH2−PSSGSRPTYPYTGSR−CONH2(SEQ ID NO:7)
N5EM8:NH2−PYTGSRPTPQKPVFP−CONH2(SEQ ID NO:19)
N5EM9:NH2−QKPVFPSYQKYPPAV−CONH2(SEQ ID NO:20)
N5EM10:NH2−KYPPAVQKYIDSLPS−CONH2(SEQ ID NO:21)
N5EM11:NH2−RPTSPSSGSRPTYPS−CONH2(SEQ ID NO:8)
411のcDNAクローンをT.spiralisの早期侵入段階AdおよびL1NNのcDNAライブラリーから選別した。
上記実施例4に記載したように調製したタンパク質を、旋毛虫で感染させたブタに由来する血清に対する間接ELISA法により、T.spiralisの排泄/分泌抗原(E/S)との比較で評価した。
NBL1抗原および411抗原は免疫優性の抗原を構成し、旋毛虫属内に保持されている。これらの抗原(NBL1のC末端、NBL1のペプチドエピトープN5EM11、411抗原)を用いたELISA検定は、旋毛虫に対する99%を超える特異性を有し、また該検定によって、欧州で特定されている4種の旋毛虫によって引き起こされるブタの旋毛虫症に対する早い診断が可能となる(感染後15〜60日)。
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Claims (17)
- 生体標本において抗旋毛虫抗体を検出する試薬としての、抗旋毛虫抗体によって認識される抗原ポリペプチドの利用方法であり、前記ポリペプチドがNBL1抗原の免疫優性のエピトープを含み、該エピトープが配列PSSGSRPTYP(SEQ ID NO:5)によって定義されることを特徴とする利用法。
- 配列SEQ ID NO:4の25〜175番目のアミノ酸を含むかまたは配列SEQ ID NO:4の25〜175番目のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有する配列を含む一つもしくは複数のポリペプチドと随意に組み合わせた、請求項1で定義した一つまたは複数のポリペプチドを含む混合物を用いることを特徴とする、請求項1に記載の利用方法。
- アクセス番号GenBank AAK16520で特定されるポリペプチドおよびアクセス番号GenBank AAR36900で特定されるポリペプチドを除く、請求項1で定義した抗旋毛虫抗体によって認識される抗原ポリペプチド。
- 配列PSSGSRPTYPSSGSR(SEQ ID NO:6)、配列PSSGSRPTYPYTGSR(SEQ ID NO:7)、配列RPTSPSSGSRPTYPS(SEQ ID NO:8)の一つまたは複数の配列を含む、請求項3に記載の抗原ポリペプチド。
- 配列SEQ ID NO:2の363〜409番目のアミノ酸を含む、請求項4に記載の抗原ポリペプチド。
- 請求項1で定義したポリペプチドの一つまたは複数のコピーを、場合によっては一つまたは複数の異種配列と融合している、請求項2で定義したポリペプチドの一つまたは複数のコピーと随意に組み合わせて含んでいるキメラポリペプチドで構成されることを特徴とする、請求項3に記載の抗原ポリペプチド。
- 請求項3〜請求項6のいずれか一つに記載の抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項7に記載のポリヌクレオチドを一つまたは複数含む組換えベクター。
- 請求項8に記載の組換えベクターによって形質転換された宿主細胞。
- 抗体の産生に利用可能な組成物を得るための、請求項1で定義したポリペプチドの利用方法。
- 請求項1で定義したポリペプチドを特異的に認識する抗体。
- エピトープPSSGSRPTYP(SEQ ID NO:5)を認識することを特徴とする、請求項11に記載の抗体。
- 生体サンプル中で抗旋毛虫抗体の存否を検出する方法であり、
−前記生体サンプルを、前記サンプルの中に場合によっては存在する抗旋毛虫抗体との抗原/抗体複合体の形成を可能にする条件のもとで、請求項2で定義した一つまたは複数のポリペプチドと随意に組み合わせた、請求項1で定義した一つまたは複数のポリペプチドと接触させることと、
−あらゆる適切な手段によって、場合によっては形成される抗原/抗体複合体を検出すること、
を含んでいることを特徴とする検出方法。 - 生体サンプル中で抗旋毛虫抗体の存否を検出するために必要な物のセットであり、請求項2で定義した一つまたは複数のポリペプチドと随意に組み合わせた、請求項1で定義した一つまたは複数のポリペプチドを含み、そして、場合によっては、抗原/抗体複合体の形成を可能にする反応培地を構築するための適切な緩衝液および試薬、そして随意に前記抗原/抗体複合体の検出手段を含んでいることを特徴とするセット。
- 前記ポリペプチドが固体の担体上に固定されていることを特徴とする、請求項14に記載のセット。
- 免疫応答を向上させることを可能にする一つまたは複数のアジュバントと結びついている、
請求項2で定義した一つまたは複数のポリペプチドと随意に組み合わせた、請求項1で定義した一つまたは複数のポリペプチド、
あるいは、請求項2で定義した前記ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドと随意に組み合わせた、請求項1で定義した前記ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチド
を含む免疫原性組成物。 - ワクチンであることを特徴とする、請求項16に記載の免疫原性組成物。
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