ES2356394T3

ES2356394T3 - Polipéptidos reconocidos por anticuerpos anti-trichinela y sus aplicaciones.

Info

Publication number: ES2356394T3
Application number: ES07730937T
Authority: ES
Inventors: Mingyuan Liu; Celine Bahuon; Franck Le Guerhier; Isabelle Vallee; Baoquan Fu; Danielle Le Rhun; Romel Hernandez Bello; Xiuping Wu; Pascal Boireau
Original assignee: Agence Nationale Chargee de la Securite Sanitaire De L'alimentation De L'environnement Et Du Travail; Jilin University; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Agence Francaise de Securite Sanitaire des Aliments (AFSSA); Agence National de Securite Sanitaire de l'Alimentation de l'Environnement Et du Travail
Current assignee: Agence Nationale Chargee de la Securite Sanitaire De L'alimentation De L'environnement Et Du Travail; Jilin University; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Agence Francaise de Securite Sanitaire des Aliments (AFSSA); Agence National de Securite Sanitaire de l'Alimentation de l'Environnement Et du Travail
Priority date: 2006-02-07
Filing date: 2007-02-07
Publication date: 2011-04-07
Anticipated expiration: 2027-02-07
Also published as: EP1987357B1; DE602007009803D1; JP2009525740A; US7993860B2; EP1987357B8; FR2897063B1; PL1987357T3; PT1987357E; CA2641499A1; EP1987357A1; DK1987357T3; WO2007090960A1; FR2897063A1; ATE484749T1; US20100098717A1; KR20090015020A; CN101589306A

Abstract

Utilización de un polipéptido antigénico reconocido por anticuerpos anti-Trichinella como reactivo para la detección de anticuerpos anti-Trichinella en una muestra biológica, caracterizada por que dicho polipéptido comprende un epítopo inmunodominante del antígeno NBL1, epítopo que está definido por la secuencia PSSGSRPTYP (SEC ID Nº 5).

Description

Polipéptidos reconocidos por anticuerpos anti-Trichinela y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a la utilización de nuevos antígenos identificados en el parásito Trichinella en el marco del diagnóstico y de la prevención de la triquinelosis.

La triquinelosis es una zoonosis asociada al consumo de carne infestada por el parásito Trichinella (MURRELL et al., 2000).

Este nematodo de la clase Adenophorea pertenece a la familia Trichinellidae la cual comprende 8 especies y 3 genotipos emparentados en 2 grupos filogenéticamente distintos: por un lado las triquinas encapsuladas (T. spiralis; T. nativa; T. britovi; T. murrelli; T. nelsoni) que infestan a mamíferos, y por otro lado las triquinas no encapsuladas (T. pseudospiralis; T. papuae; T. zimbabwensis) que infestan a mamíferos, aves y reptiles (GASSER et a1., 2004). Todas estas especies pueden infestar al ser humano.

El ciclo biológico del parásito es auto-heteroxeno: se desarrolla completamente en un mismo huésped que es sucesivamente huésped definitivo (portador de parásitos adultos) y huésped intermedio (portador de larvas infestantes) (BOIREAU et a1., 2002). El paso de las larvas infestantes de un huésped a otro es necesario para la realización de un nuevo ciclo. Este paso se realiza mediante ingestión de carne cruda o poco cocida contaminada por las larvas. Durante la digestión, éstas son liberadas, y penetran en el epitelio intestinal donde mudarán a gusanos adultos (Ad) sexuados. Las hembras fecundadas expulsan a continuación las larvas L1 NeoNatas (L1NN) que alcanzan los músculos estriados a través de la circulación linfática y sanguínea. Estas larvas L1NN penetran en las células musculares (estadio de desarrollo infestante L1M: Larva L1 Muscular) a las que provocan la desdiferenciación en células nutricias rodeadas por una gruesa cápsula de colágeno protectora, en el caso de triquinas encapsuladas, y muy fina en el caso de las triquinas llamadas no encapsuladas.

Mientras que la triquinelosis es asintomática en el animal, la infestación humana se traduce, durante la fase intestinal inicial, en diarreas asociadas a nauseas, vómitos y violentos dolores abdominales, mientras que los síntomas vinculados a la fase de invasión muscular se caracterizan por la asociación de fiebre, edema facial y mialgias (CAPO & DESPOMMIER, 1996). Ataques oculares, pulmonares, gastrointestinales, cardíacos y neurológicos pueden completar este cuadro clínico de la triquinelosis cuya evolución puede ser mortal. El carácter crónico de la infestación, marcado por la persistencia de dolores musculares en los pacientes, está asociado a la supervivencia del parásito dentro de la célula nutricia.

El tratamiento específico de las triquinelosis humanas con antihelmínticos es tanto más eficaz en cuanto el diagnóstico de la infestación se realiza precozmente para permitir una acción contra todos los estadios parasitarios y sobre todo antes de la formación de la cápsula

\hbox{protectora de
colágeno alrededor de las larvas L1M (FOURESTIE   et al., 
1988).}

Los datos epidemiológicos han demostrado una distribución geográfica del parásito en todas las latitudes asociada a un modo de transmisión que implica muchas especies de la fauna salvaje que mantienen también un ciclo de infestación doméstica representado principalmente por el cerdo (DUPOUY-CAMET, 2000).

Las epidemias de triquinelosis humana, zoonosis emergente o re-emergente, constituyen un auténtico problema de salud pública en el mundo debido a los hábitos alimentarios y a controles sanitarios no siempre eficaces (MURRELL & POZIO, 2000). Estas epidemias implican esencialmente carne de cerdo y de jabalí, así como de caballo (BOIREAU et al., 2000).

La prevención de la contaminación humana pasa, por lo tanto, por una cocción en el centro de la carne y la mejora de las condiciones de cría y/o de control de las triquinelosis animales (cerdo, caballo, jabalí y otras especies animales salvajes sensibles a Trichinella) (BOIREAU et al., 2002).

Las técnicas de cribado de la triquinelosis se dividen en dos categorías: 1) la detección directa de las larvas L1M, mediante triquinoscopia (observación microscópica de un fragmento de carne), o después de la digestión artificial de muestras de músculos, y 2) la detección indirecta mediante diferentes métodos inmunológicos, que permiten detectar anticuerpos dirigidos contra los antígenos de Trichinella.

A cada uno de los estadios de desarrollo del parásito: adulto (Ad), larva neonatal (L1NN), y larva muscular (L1M), le corresponde un perfil antigénico particular.

Son las preparaciones antigénicas obtenidas de larvas del estadio L1M las que se utilizan actualmente para el inmunodiagnóstico. En efecto, las fracciones antigénicas de los dos estadios precoces Ad y L1NN son difíciles de purificar, y hasta ahora no se habían podido identificar antígenos inmunodominantes asociados a uno y/o a otro de estos dos estadios.

Se utilizan principalmente preparaciones de antígeno total soluble, obtenidas mediante lisis de las larvas, centrifugado del lisado, y recuperación del sobrenadante o, más frecuentemente, antígenos de excreción/secreción (antígenos E/S).

Los antígenos de excreción-secreción son producidos durante la puesta de las larvas L1M en condiciones de supervivencia en un medio de cultivo; éstos proceden de un órgano particular, denominado el esticosoma, que está constituido por una cincuentena de células discoidales, los esticocitos. Los esticocitos contienen gránulos cuyo contenido es evacuado por un canalículo en la luz del esófago del parásito. Este contenido es muy antigénico, constituye una parte de los antígenos de excreción secreción. Estos antígenos forman una mezcla compleja de proteínas, que contiene particularmente un grupo de glucoproteínas (denominadas antígenos TSL1) que portan una molécula glucídica particular, conocida únicamente en Trichinella y presente en todas las especies de este parásito, la beta-tivelosa.

Las preparaciones de antígenos de excreción-secreción que se utilizan actualmente como referencia en materia de inmunodiagnóstico de la triquinelosis se obtienen a partir de medio de cultivo de larvas L1M de Trichinella spiralis. Después de 18 a 20 horas de cultivo, el medio se recupera por filtración, y a continuación se concentra (GAMBLE et al., 1983; GAMBLE et al., 1988).

Las preparaciones de antígeno total soluble tienen, como principal inconveniente, su falta de especificidad. Frecuentemente se observan reacciones antigénicas cruzadas con otras parasitosis. Los antígenos de excreción-secreción permiten obtener una mejor especificidad. Sin embargo, en los dos casos, resulta difícil producir en gran cantidad lotes estandarizados de antígeno.

Las secuencias de ADN que codifican el antígeno E/S, y sus utilizaciones para producir antígenos útiles para el diagnóstico o la vacunación contra la infección por T. spiralis, se divulgan en la patente US5422263.

Los antígenos de Trichinella y sus epítopos inmunodominantes son revisados por Boireau et al., MULTIDISCIPLINARITY FOR PARASITES, VECTORS AND PARASITIC DISEASES, VOL 1 MEDIMOND PUBLISHING CO, VIA RUBBIANI 6/2, 40124 BOLONIA, ITALIA, páginas 181-188; 2004.

La estructura sacarídica que contiene beta-tivelosa, que representa un epítopo inmunodominante de las preparaciones de antígeno E/S (REASON et al., 1994; Patentes US 5541075 y 5707817) se sintetizó químicamente, y se ha propuesto su utilización para el inmunodiagnóstico de Trichinella.

Este reactivo presenta una buena especificidad, pero su sensibilidad parece más reducida que la de las preparaciones de antígeno E/S. Además, la síntesis de esta estructura por vía química sigue siendo costosa y pesada de realizar.

Otro problema que se plantea en el marco del diagnóstico serológico de Trichinella es la existencia de una "ventana ciega" de detección que corresponde a los estadios precoces de la infestación, lo que se traduce en resultados falsos negativos. Además, en el caballo, se ha observado una desaparición progresiva de los anticuerpos 25 semanas después de la infestación.

Los inventores intentaron identificar antígenos inmunodominantes asociados a los estadios precoces de la infestación por Trichinella, y utilizables para el diagnóstico serológico de la triquinelosis, para proporcionar medios de obtención de una detección precoz, específica, y sensible de las infestaciones con Trichinella, tanto en el ser humano como en animales. Con este fin, los inventores investigaron si existía, entre los productos de los genes expresados por Trichinella en el estadio L1NN y/o en el estadio Ad, proteínas que poseyeran las propiedades antigénicas deseadas.

En este marco, descubrieron que una proteína de Trichinella spiralis, que forma parte de las proteínas expresadas específicamente en el estadio L1NN en este organismo, constituía un antígeno inmunodominante, que permite una detección precoz de la respuesta humoral dirigida contra Trichinella y que se conservaba además entre diferentes especies de Trichinella.

Esta proteína se denominará en lo sucesivo en este documento NBL1. La secuencia completa de ADNc que codifica esta proteína, así como la secuencia polipeptídica que se deduce de ella son accesibles respectivamente en el Genbank con los números AF331160 y AAK16520 (alias Swissprot Q9BJL7); estas secuencias están anotadas como "serina proteasa SS2, específica de las larvas neonatas". Estas secuencias también son reproducidas respectivamente en el listado de secuencias en el anexo con los números SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2. Una secuencia parcial de ADNc que codifica esta proteína, así como la secuencia polipeptídica que de ella se deduce son accesibles respectivamente en el Genbank con los números EY491941 y AAR36900 (alias Swissprot Q6RUJ3).

Los inventores han demostrado además que la inmunorreactividad asociada a la respuesta humoral dirigida contra NBL1 estaba localizada en la parte C-terminal de esta proteína, e identificaron un epítopo inmunodominante responsable de esta reactividad.

Por otro lado, los inventores identificaron, a partir de un banco de ADNc de los estadios precoces mezclados Ad+L1NN de T. spiralis un nuevo gen, denominado en lo sucesivo en este documento 411.

La secuencia de este gen se representa en el listado de secuencias en el anexo con el número SEC ID Nº 3, y la de su producto de traducción con el número SEC ID Nº 4. Este producto de traducción de este gen está emparentado (78,7% de identidad) con un antígeno E/S, denominado proteína Tp21-3, identificado en T. pseudospiralis (AAF79206; NAGANO et al., 2001), así como con el producto de traducción del ORF 17.20 hipotético de T. spiralis (AAB48489), con el que presenta el 86,6% de identidad.

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El producto de traducción del gen 411 también permite detectar en un estadio precoz, la respuesta humoral dirigida contra diferentes especies de Trichinella.

Además, cada uno de los antígenos NBL1 y 411 permitió, durante los ensayos realizados, detectar animales infestados por Trichinella que no habían sido detectados ni por el otro antígeno, ni por el antígeno E/S, al menos durante el periodo D15-D30 después de la infestación (pi).

La asociación del antígeno NBL1 (o de un epítopo inmunodominante de éste) con el antígeno 411 permite, por lo tanto, mejorar la sensibilidad del diagnóstico, particularmente en los estadios precoces de la infestación (de 15 a 20 días después de la infestación).

La presente invención tiene, por consiguiente, por objeto la utilización de un polipéptido antigénico reconocido por anticuerpos anti-Trichinella como reactivo para la detección de anticuerpos anti-Trichinella en una muestra biológica, caracterizada por que dicho polipéptido se selecciona entre:

a): un polipéptido que comprende un epítopo inmunodominante del antígeno NBL1, epítopo que es definido por la secuencia PSSGSRPTYP (SEC ID Nº 5);

b): un polipéptido, también denominado en lo sucesivo en este documento antígeno 411, que comprende los aminoácidos 25-175 de la secuencia SEC ID Nº 4 (que representan la forma madura de la proteína 411), o que comprende una secuencia que presenta al menos el 80%, y por orden de preferencia creciente, al menos el 85%, el 90%, o el 95% de identidad con la secuencia de los aminoácidos 25-175 de la secuencia SEC ID Nº 4.

La presente invención tiene más particularmente por objeto un procedimiento de detección de la presencia de anticuerpos anti-Trichinella en una muestra biológica, procedimiento que se caracteriza por que comprende:

-: la puesta en contacto de dicha muestra biológica con uno o más polipéptidos a) y/o uno o más polipéptidos b), tal como se han definido anteriormente, en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno/anticuerpo con los anticuerpos anti-Trichinella eventualmente presentes en la muestra;

-: la detección, mediante cualquier medio apropiado, del complejo antígeno/anticuerpo eventualmente formado.

Generalmente, dicha muestra biológica es una muestra de suero. Puede obtenerse a partir de cualquier sujeto (mamíferos, ave o reptil) que pertenezca a una especie que pueda resultar infestada por Trichinella, y en el que se desea detectar la presencia de esta parásito. Ventajosamente, se trata de una muestra obtenida a partir de un mamífero, por ejemplo de un animal de ganadería, o de un paciente humano.

Ventajosamente, se utiliza una mezcla, que comprende uno o más polipéptidos a) y/o uno o más polipéptidos b), tal como se han definido anteriormente.

Esta asociación permite particularmente ampliar el espectro de reactividad, con respecto a cada uno de los polipéptidos utilizado de forma individual.

Los polipéptidos a) definidos anteriormente, con la exclusión del antígeno NBL1 completo identificado con el número de entrada del Genbank AAK16520, también forman parte, como tales, del objeto de la presente invención.

Entre estos polipéptidos de acuerdo con la invención, se mencionarán particularmente los polipéptidos que contienen una o más de las siguientes secuencias: la secuencia: PSSGSRPTYPSSGSR (SEC ID Nº 6); la secuencia PSSGSRPTYPYTGSR (SEC ID Nº 7); la secuencia RPTSPSSGSRPTYPS (SEC ID Nº 8).

Esto engloba, por ejemplo, fragmentos de la región C-terminal del antígeno NBL1: se mencionarán particularmente los fragmentos que contienen la siguiente secuencia:

: ENSPEGTVKWASKEDSPVDLSTASRPTNPYTGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRP TYPSSGSRPTYPYTGSRPTPQKPVFPSYQKYPPAVQKYIDSLPSGTQGTLEYTVTQNGVTTTT (SEC ID Nº 11)

que corresponde a los aminoácidos 326-459 de la secuencia SEC ID Nº 2; y sub-fragmentos de esta secuencia SEC ID Nº 11, particularmente los que comprenden la siguiente secuencia:

: PSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYP (SEC ID Nº 9)

que corresponde a los aminoácidos 363-409 de la secuencia SEC ID Nº 2 y, más particularmente, los fragmentos que comprenden la siguiente secuencia:

: SRPTNPYTGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYPYTGSRPT (SEC ID Nº 10)

que corresponde a los aminoácidos 349-415 de la secuencia SEC ID Nº 2.

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Los polipéptidos b) definidos anteriormente, a excepción de los identificados con los números de entrada al GenBank AAF79206 y AAB48489 forman parte, como tales, del objeto de la presente invención. Los polipéptidos preferidos son, particularmente, el polipéptido de secuencia SEC ID Nº 4, o el polipéptido correspondiente a los aminoácidos 25-175 de la secuencia SEC ID Nº 4, así como los polipéptidos que presentan al menos el 90%, o preferiblemente al menos el 95% de identidad con la secuencia SEC ID Nº 4, o con la secuencia de los aminoácidos 25-175 de la secuencia SEC ID Nº 4. La presente invención engloba particularmente a los polipéptidos quiméricos que comprenden una o más copias de la secuencia PSSGSRPTYP (SEC ID Nº 5), o de un fragmento del antígeno NBL1 que contiene esta secuencia y/o una o más copias de un polipéptido b) tal como se han definido anteriormente, eventualmente fusionados a una o más secuencias heterólogas diferentes.

La presente invención también tiene por objeto los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de acuerdo con la invención, así como vectores recombinantes que comprenden dichos polinucleótidos, y células huésped transformadas por dichos vectores.

La presente invención también tiene por objeto una composición que comprende uno o más polipéptidos a) y uno o más polipéptidos b), tal como se han definido anteriormente, así como una composición que comprende uno o más polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos.

Los polipéptidos a) y b) definidos anteriormente pueden utilizarse en el marco de diferentes métodos de detección de anticuerpos, que se conocen en sí mismos. Como ejemplos, se mencionarán particularmente los métodos de tipo ELISA (directo, indirecto o "sándwich"), los métodos de microaglutinación en perlas, así como los métodos de transferencia electroforética acoplada a un inmunomarcado.

La presente invención también tiene por objeto un kit para la detección de la presencia de anticuerpos anti-Trichinella en una muestra biológica, caracterizado por que comprende uno o más polipéptidos a) y/o uno o más polipéptidos b) tal como se han definido anteriormente, y, llegado el caso, tampones y reactivos apropiados para la constitución de un medio de reacción que permite la formación de un complejo antígeno/anticuerpo y, opcionalmente, medios de detección de dicho complejo antígeno/anticuerpo.

Ventajosamente, dicho kit comprende un polipéptido a) y/o un polipéptido b) tal como se han definido anteriormente, inmovilizados sobre un soporte sólido. Como ejemplos no limitantes de soportes sólidos utilizables, se mencionarán placas de microvaloración, perlas, microperlas o micropartículas, bandas, etc....

Dicho kit también puede comprender muestras de referencia, tales como uno o más sueros negativos y uno o más sueros positivos.

La presente invención también tiene por objeto la utilización de un polipéptido a) o de un polipéptido b), tal como se han definido anteriormente, para la preparación de anticuerpos dirigidos específicamente contra dicho polipéptido.

Estos polipéptidos pueden utilizarse en el marco de diferentes métodos, conocidos en sí mismos, de preparación de anticuerpos. Estos pueden utilizarse, por ejemplo, (eventualmente después de la adición de un adyuvante apropiado) para la inmunización de un animal. También pueden injertarse sobre un soporte de cromatografía de afinidad, para permitir purificar, a partir de un líquido biológico, los anticuerpos dirigidos específicamente contra el polipéptido en cuestión. El líquido biológico puede ser, por ejemplo, suero de un animal previamente inmunizado con el polipéptido en cuestión, o un sobrenadante de hibridoma; también puede tratarse del suero de un animal infestado por Trichinella a partir del que se desea aislar una sub-población de anticuerpos dirigidos específicamente contra el polipéptido en cuestión.

La presente invención también engloba cualquier anticuerpo dirigido específicamente contra un polipéptido a) o un polipéptido b) tal como se han definido anteriormente. Puede tratarse de anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos preferidos son aquellos que reconocen el epítopo PSSGSRPTYP (SEC ID Nº 5).

Los anticuerpos dirigidos específicamente contra un polipéptido pueden obtenerse mediante diversas técnicas conocidas en sí mismas, y particularmente mediante los métodos convencionales que comprenden la inmunización de un animal con el polipéptido en cuestión (eventualmente con la adición de un adyuvante apropiado), y la recuperación de su suero (para la producción de anticuerpos policlonales), o de sus células linfocitarias (para la producción de anticuerpos monoclonales).

Los polipéptidos a) y b) definidos anteriormente, así como los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, pueden utilizarse para la preparación de composiciones inmunógenas, y particularmente de vacunas anti-Trichinella.

La presente invención también tiene por objeto una composición inmunógena, que comprende uno o más polipéptidos a) y/o uno o más polipéptidos b) tal como se han definido anteriormente, o uno o más polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, asociados a uno o más adyuvantes que permiten mejorar la respuesta inmunitaria.

De acuerdo con una realización preferida de una composición inmunógena de acuerdo con la invención, se trata de una vacuna.

Una gran variedad de adyuvantes que permiten aumentar la inmunogenicidad de los péptidos son conocidas en sí mismos por el especialista en la técnica: se mencionarán, como ejemplos de adyuvantes, la alúmina (hidróxido de aluminio), el adyuvante completo o incompleto de Freund (AIF), los liposomas, así como los virosomas (envueltas virales reconstituidas), los derivados peptídicos del ácido murámico, etc. En el caso de una vacuna, se seleccionará, por supuesto, un adyuvante farmacológicamente aceptable; como ejemplos de adyuvantes preferidos se mencionarán los adyuvantes de tipo emulsión "de agua en aceite", por ejemplo los adyuvantes comercializados por la compañía SEPPIC con las denominaciones MONTANIDE ISA 70 y MONTANIDE ISA 775, y que también se describen en las Patentes EP 480 982, EP 825 875, US 5422109, US 6251407 y US 6610309.

Llegado el caso, particularmente en el caso de péptidos cortos (\leq 30 aminoácidos), dichos polipéptidos pueden acoplarse a una proteína portadora.

Como ejemplos de proteínas portadoras, se mencionará particularmente la KLH (keyhole limpet hemocyanin [hemocianina de lapa californiana]), la albúmina de suero bovino (BSA), ovoalbúmina, anatoxina tetánica o diftérica. También puede formarse una composición multiepitópica, asociando varias copias de un mismo péptido entre sí, y eventualmente con otros epítopos peptídicos, en forma de polipéptidos quiméricos, o por medio de una cadena polimérica, por ejemplo una polilisina.

Si se utiliza como inmunógeno un polinucleótido, la composición inmunógena puede presentarse en forma de un vector recombinante en el que se inserta(n) el(los) polinucleótido(s) a administrar. Pueden utilizarse, por ejemplo, vectores virales tales como poxvirus, adenovirus, retrovirus, lentivirus, herpesvirus, y AAV (adeno-associated virus [virus adenoasociado]), etc... También puede presentarse en forma de una bacteria no patógena, transformada por uno o más vectores de expresión que contienen dicho(s) polinucleótido(s). También se puede administrar directamente el(los)
polinucleótido(s), en forma de ADN desnudo, o incorporarlo en liposomas. En el caso de una vacuna, se utilizará preferiblemente una bacteria no patógena (por ejemplo un lactobacilo, o una cepa no patógena de Escherichia coli o de Salmonella suis), o un vector derivado de una cepa viral de vacuna; por ejemplo un vector derivado de una cepa de vacuna del virus de la pseudorabia (enfermedad de Aujeszky).

La presente invención se entenderá mejor con ayuda de la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos que ilustran la utilización de los antígenos NBL1 y 411, para el inmunodiagnóstico precoz de la triquinelosis.

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Leyenda de las figuras

Figura 1: Secuencia de la proteína THX-NBL1(Cterm).

La secuencia procedente de NBL1 se indica en negrita y las secuencias procedentes del plásmido pET102 se indican en cursiva.

Figura 2: Inmunorreactividad de la proteína THX-NBL1(Cterm). M: Marcador de pesos moleculares; 1: suero de cerdo negativo; 2: suero de cerdo infestado experimentalmente por 20000 L1M de T. spiralis.

Figura 3: Comparación de las cinéticas de aparición de los anticuerpos anti-Trichinella detectados mediante ELISA THX-NBL1(Cterm) o mediante ELISA Ag E/S en sueros de cerdos infestados por T. spiralis.

A: Detección mediante ELISA THX-NBL1(Cterm); B: Detección mediante ELISA Ag E/S.

En abscisas: número de días después de la infestación; en ordenadas: porcentaje de reactividad. El umbral de detección de los ELISA está marcado con una raya negra (44% para ELISA THX- NBL1(Cterm) y 14% para ELISA Ag E/S). La media y las desviaciones típicas de la proporción muestra/control positivo son idénticas para cada grupo de cerdos infestados.

Figura 4: Especificidad del ELISA NBL1(Cterm).

En abscisas: cohorte de 230 muestras negativas procedente de cerdos industriales o de cerdos criados al aire libre. Las 5 muestras positivas proceden de sueros de cerdos infestados experimentalmente. El umbral es igual a 2 veces el valor medio de las muestras negativas. En ordenadas: porcentaje de reactividad.

Figura 5: Secuencia de la proteína THX-411.

La secuencia procedente de 411 se indica en negrita. Las secuencias procedentes del plásmido se indican en cursiva.

Figura 6: Inmunorreactividad de la proteína THX-411.

1: suero positivo 50 días pi; 2: suero positivo 30 días pi; 3: suero negativo -5 días; 4: control conjugado. M: Marcador de pesos moleculares.

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Figura 7: Comparación de las cinéticas de aparición de los anticuerpos anti-Trichinella detectados mediante ELISA THX-411 o mediante ELISA Ag E/S en sueros de cerdos infestados por T. spiralis.

A: Detección mediante ELISA THX-411; B: Detección mediante ELISA Ag E/S.

En abscisas: número de días después de la infestación; en ordenadas: porcentaje de reactividad. El umbral de detección de los ELISA está marcado con una raya negra (52% para el ELISA THX-411 y 14% para el ELISA Ag E/S). La media y las desviaciones típicas de la proporción muestra/control positivo se indican para cada grupo de cerdos infestados.

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Ejemplo 1

Producción de la proteína recombinante thx-nbl1(cterm), que contiene una porción c-terminal de NBL1

Se realizó un inmunocribado de un banco de ADNc de L1NN de Trichinella spiralis con un suero de cerdo obtenido 35 días después de la infestación exponencial con 10000 L1M de T. spiralis. La secuenciación de los clones reconocidos por este suero permitió determinar que la mayor parte de estos codificaban una misma proteína.

Esta proteína es una supuesta proteasa de serina, cuya secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos deducida, están disponibles respectivamente en el Genbank con los números AF331160 y AAK16520, y se reproducen también en este documento con los números SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2. Se denomina en este documento NBL1.

Una porción de la parte C terminal de la proteína se amplificó con ayuda de los oligonucleótidos NBL1CtermF (5'-CACCGAAAATTCTCCTGAAGGA-3') (SEC ID Nº 12) y NBL1CtermR (5'-TGTTGTTGTAGTAACTCC-3') (SEC ID Nº 13), y de la ADN polimerasa AccuPrime Pfx DNA polymerase (Invitrogen), y se clonó en el plásmido pET102D/topo utilizando el kit de expresión Champion pETl02 Directional TOPO de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Invitrogen).

El plásmido recombinante obtenido, denominado pETl02-NBL1(Cterm) codifica una proteína de fusión tiorredoxina-NBL1(Cterm) (THX-NBL1(Cterm), de 291 aminoácidos, que porta en posición C-terminal una etiqueta de poli-histidina. La secuencia de esta proteína de fusión se representa en la Figura 1.

La proteína de fusión THX-NBL1(Cterm) se expresó en bacterias E. coli BL21 Star (DE3), BL21 (DE3) pLys (Invitrogen) transformadas con el plásmido pET102-NBL1(Cterm), y se purificó por cromatografía de afinidad en condiciones desnaturalizantes en columna Ni-NTA (Ni-NTA spin columns kit; Ni-NTA beads), utilizando el protocolo recomendado por el proveedor (Qiagen).

La proteína de fusión THX-NBL1(Cterm) purificada aparece, después de la electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) en forma de una banda con el tamaño esperado de 31,1 kDa.

La inmunorreactividad de la proteína THX-NBL1(Cterm) frente a un suero de cerdo libre de triquinelosis y a un suero de cerdo infestado por 20000 larvas L1M de T. spiralis extraído 60 días después de la infestación, se analizó mediante transferencias de Western.

Después de la electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), la proteína se electrotransfirió a una membrana Hybond P (PVDF) siguiendo las instrucciones del proveedor (Amersham). Las membranas se prehibridaron durante 1 h en TBS-T (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,1%) y un 5% de leche desnatada. Después de 2 lavados en TBS-T durante 1 minuto, y a continuación 3 lavados en TBS-T durante 5 minutos, las membranas se incubaron durante 1 h con el suero de cerdo diluido a 1/200 en TBS. Después del lavado, las membranas se incubaron durante 20 minutos con el anticuerpo secundario de conejo anti-IgG de cerdo marcado con fosfatasa alcalina (A1192, Sigma) diluido a 1/30000, y a continuación el sustrato NBT/BCIP (E116, Interchim) puro durante 30 minutos para la revelación del marcado.

Los resultados se ilustran mediante la Figura 2.

Se observa una inmunorreactividad muy fuerte de de THX-NBL1(Cterm) con el suero del cerdo infestado por T. spiralis.

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Ejemplo 2

Utilización de THX-NBL1(Cterm) para detectar la respuesta humoral dirigida contra Trichinella

La proteína THX-NBL1(Cterm), preparada como se ha descrito en el ejemplo 1 anteriormente, se evaluó mediante ELISA indirecto frente a sueros obtenidos de cerdos infestados por Trichinella, en comparación con el antígeno de excreción/secreción (E/S) de T. spiralis.

El antígeno E/S de referencia se prepara de acuerdo con el protocolo descrito por GAMBLE et al., (1988). Se ha obtenido a partir del sobrenadante de cultivo de las larvas L1M mantenidas en condiciones de supervivencia durante 24 h en RPMI 1640 que contiene el 1% de piruvato, el 15% de suero fetal bovino (SVF), el 1% de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina 100 U/ml y 100 \mug/ml de estreptomicina.

Para los ensayos de ELISA, el antígeno diluido en tampón PBS 1X, a razón de 1,25 \mug/ml para el antígeno E/S y de 2 \mug/ml para THX-NBL1(Cterm), se incuba durante 1 noche a 4ºC en placas de 96 pocillos (placas MediSorp, NUNC). Después de 3 lavados (PBS 1X, Tween 20 al 0,05%), las placas se saturan a temperatura ambiente durante 1 h con una solución de leche desnatada diluida al 2% en la solución de lavado.

Se depositan en cada pocillo 100 \mul de suero de cerdo diluido a 1/20 en tampón PBS 1X, con la adición de Tween 20 al 0,05%. Después de la incubación durante 30 minutos a 37ºC, seguida de 3 lavados (PBS 1X, Tween 20 al 0,05%), se depositan en cada pocillo 100 \mul de la solución de conjugado (proteína G-peroxidasa (P-8170, Sigma) diluida al 1/32000 en tampón PBS 1X, con la adición de Tween 20 al 0,05%. Después de una nueva incubación durante 30 minutos a 37ºC, seguida de 3 lavados (PBS 1X, Tween 20 al 0,05%), se depositan en cada pocillo 100 \mul de una solución de sustrato (3,3',5,5' tetrametilbenzidina-peróxido de hidrógeno: TMB3). Después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad, la reacción se interrumpe mediante la adición de 100 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 0,5 M. La lectura de las placas se realiza mediante medición de la absorbancia a 450 nm.

El resultado de las lecturas de las placas de ELISA se presenta en forma del porcentaje de reactividad de un suero de muestra con respecto a un suero de control positivo.

%\ de\ \frac{E}{P} = (DO\ muestra - DO\ control\ negativo/DO\ control\ positivo - DO\ control\ negativo)\ x\ 100

El umbral de positividad (igual a 2 veces el valor medio de las muestras negativas de referencia) es del 14% para el ELISA Ag E/S, y del 44% para el ELISA THX-NBL1 (Cterm).

Se comparó la cinética de aparición de los anticuerpos anti-Trichinella detectados mediante ELISA THX-NBL1 (Cterm) o mediante ELISA Ag E/S en sueros de cerdos convencionales infestados experimentalmente por 200, 1000 ó 20000 larvas L1M de T. spiralis.

Los resultados se ilustran mediante la Figura 3.

El antígeno THX-NBL1(Cterm) permite la detección dependiente de la dosis de las respuestas humorales dirigidas contra T. spiralis. La detección de epítopos conformacionales mediante este ensayo ELISA asociada a la detección de epítopos lineales mediante transferencia de Western demuestran, por otro lado, el carácter inmunodominante de la proteína NBL1 de Trichinella. El ELISA THX-NBL1(Cterm) detecta la seroconversión a partir del 25º día pi, mientras que el ELISA Ag E/S solamente detecta la seroconversión 10 días más tarde.

La detección mediante ELISA Ag E/S, y ELISA THX-NBL1(Cterm) de las respuestas humorales inducidas por T. spiralis y las otras tres especies de Trichinella identificadas en Europa, T. nativa, T. britovi y T. pseudospiralis, también se comparó.

Los resultados se resumen en la Tabla I a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

El conjunto de estos resultados muestra que el ELISA THX-NBL1(Cterm) permite una detección particularmente precoz de las respuestas humorales, a partir del 15º día pi, para los animales fuertemente infestados y una detección ligeramente retardada para los animales infestados con una carga media de 1000 L1M (25º día pi). Se obtuvieron resultados similares con cerdos holoxénicos infestados de acuerdo con el mismo protocolo. La seroconversión más precoz detectada mediante el ELISA Ag E/S era el 25º día pi. La comparación de los resultados obtenidos con los 2 ensayos de ELISA demostró un aumento de 5 a 20 días en términos de precocidad para el diagnóstico de T. spiralis mediante la utilización del ELISA THX-NBL1(Cterm) (Tabla I). Además, los animales infestados por T. spiralis que fueron diagnosticados a la vez mediante el ELISA Ag E/S y el ELISA THX-NBL1(Cterm) vieron como, para todos, su ventana de detección serológica se reducía con el ELISA THX-NBL1(Cterm). La sensibilidad del ELISA THX-NBL1(Cterm) se demostró con el cribado efectivo de 7/9 cerdos convencionales durante este experimento con animales, es decir 3/3 cerdos infestados por 20000 L1M, 3/3 cerdos infestados por 1000 L1M y 1/3 cerdo infestado por solamente 200 L1M de T. spiralis. Las detecciones estaban asociadas a la carga parasitaria muscular de T. spiralis en estos animales que variaba de media de 3 larvas por gramo (LpG) para los cerdos infestados experimentalmente por 200 L1M, 43 LpG para los cerdos infestados experimentalmente por 1000 L1M, y 538 LpG para los cerdos infestados experimentalmente por 20000 L1M.

Las respuestas humorales inducidas por las otras tres especies de Trichinella identificadas en Europa, T. nativa, T. britovi y T. pseudospiralis, también se detectaron, a su vez, de forma dependiente de la dosis mediante el ELISA THX-NBL1(Cterm), demostrando la conservación genética y antigénica de NBL1 en el género Trichinella (inmunodominancia), y por consiguiente todo su interés para el diagnóstico de amplio espectro de las triquinelosis. La sensibilidad y la precocidad del diagnóstico (15º día pi) se confirmaron. La ventana de seroconversión se redujo de 5 a 45 días con el ELISA THX-NBL1(Cterm), y a semejanza de la infestación por T. spiralis, el conjunto de los animales que fueron diagnosticados a la vez mediante ELISA Ag E/S y ELISA THX-NBL1(Cterm) vieron como su ventana de detección serológica se redujo con el ELISA THX-NBL1(Cterm). Además, el análisis de la infestación por la especie T. nativa demuestra la gran sensibilidad del ELISA THX-NBL1(Cterm) que diagnosticó 6/9 animales (contra 5/9 animales mediante el ELISA Ag E/S) de los cuales 2 eran cerdos no cribados mediante el ELISA Ag E/S mientras que la carga parasitaria muscular era de media de solamente 7 x 10^{-4} a 0,1 LpG.

La especificidad del ELISA THX-NBL1(Cterm) se demostró con ayuda de los sueros extraídos en el conjunto de los animales antes de cada infestación experimental y hasta 10 días pi. Más de 200 sueros de cerdos criados al aire libre se utilizaron para mostrar la especificidad de la molécula. Ningún cerdo negativo para Trichinella reaccionó con el ELISA THX-NBL1(Cterm).

Estos resultados se ilustran mediante la Figura 4.

Ejemplo 3

Identificación de un epítopo inmunodominante de NBL1

Se realizó un análisis in silico (por ordenador) de la secuencia de aminoácidos deducida de la parte C terminal de NBL1, para predecir las regiones más antigénicas.

Los resultados del análisis in silico condujeron a la selección de 11 péptidos solapantes que abarcan 113 aminoácidos de la parte C terminal de NBL1 (del aminoácido 327 al aminoácido 440). Las secuencias de estos péptidos se indican a continuación

N5EM1:: NH2-NSPEGTVKWASKEDS-CONH2 (SEC ID Nº 14)

N5EM2:: NH2-ASKEDSPVDLSTASR-CONH2 (SEC ID Nº 15)

N5EM3:: NH2-LSTASRPTNPYTGSR-CONH2 (SEC ID Nº 16)

N5EM4:: NH2-PYTGSRPTSPSSGSR-CONH2 (SEC ID Nº 17)

N5EM5:: NH2-PSSGSRPTYPSSGSR-CONH2 (SEC ID Nº 6)

N5EM6:: NH2-PSSGSRPTSPSSGSR-CONH2 (SEC ID Nº 18)

N5EM7:: NH2-PSSGSRPTYPYTGSR-CONH2 (SEC ID Nº 7)

N5EM8:: NH2-PYTGSRPTPQKPVFP-CONH2 (SEC ID Nº 19)

N5EM9:: NH2-QKPVFPSYQKYPPAV-CONH2 (SEC ID Nº 20)

N5EM10:: NH2-KYPPAVQKYIDSLPS-CONH2 (SEC ID Nº 21)

N5EM11:: NH2-RPTSPSSGSRPTYPS-CONH2 (SEC ID Nº 8).

La antigenicidad de los péptidos N5EM frente a un suero de cerdo infestado por 20000 larvas L1M de T. spiralis y recogido 60 días después de la infestación se evaluó mediante ELISA indirecto, utilizando un protocolo idéntico al descrito en el Ejemplo 2, excepto que los péptidos, previamente biotinilados se incuban (2 \mug/ml en PBS 1X; 100 \mul/pocillo) en placas pretratadas con estreptavidina.

Se detectaron tres péptidos inmunorreactivos (N5EM5, 7 y 11). El análisis de la secuencia primaria de los péptidos inmunorreactivos reveló la presencia de un motivo común de 10 aminoácidos (PSSGSRPTYP) (SEC ID Nº 5). Este motivo está presente, por otro lado, 4 veces en toda la secuencia de la proteína NBL1. Por otro lado, la cartografía de epítopos mediante péptidos solapantes de 6 aminoácidos permitió demostrar la importancia primordial de un solo aminoácido, una tirosina, para la inmunorreactividad del epítopo lineal en los péptidos.

Experimentos complementarios demostraron finalmente que N5EM11 era el péptido más reactivo comparado con N5EM5 y N5EM7 en términos de sensibilidad y de precocidad.

Este péptido se comparó con el antígeno E/S de T. spiralis, como se describe en el Ejemplo 2 para THX-NBL1(Cterm).

Los resultados se resumen en la Tabla II a continuación:

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

4

Estos resultados muestran que el ELISA N5EM11 permite la detección de las infestaciones moderadas con T. spiralis. Además, se obtuvo una detección precoz a partir del 20ésimo día después de la infestación, es decir de 5 a 10 días antes de lo permitido por el ELISA Ag E/S.

Se observa también una disminución del índice de anticuerpos anti-N5EM11 después del pico de detección, lo que confirma este carácter precoz, y que es útil para poner fecha a una infestación reciente. El conjunto de los cerdos infestados por T. spiralis y diagnosticados mediante el ELISA N5EM11 peptídico presenta una ventana de seroconversión en parte similar, pero en la mayoría de los casos más reducida que la observada con el ELISA Ag E/S.

Por otro lado, N5EM11 presenta reacciones antigénicas cruzadas con el suero de cerdos infestados por T. nativa, T. britovi y T. pseudospiralis demostrando la inmunodominancia de este péptido del estadio L1NN de Trichinella. Estas reacciones antigénicas cruzadas conducen a una detección que puede obtenerse de 5 a 30 días antes que con el ELISA Ag E/S.

Sin embargo, se ha observado una erosión de la sensibilidad en comparación con el ELISA Ag E/S, en términos de detección retardada para animales infestados por T. pseudospiralis y co-detectados mediante los dos ensayos. A contrario, el ELISA N5EM11 también permitió diagnosticar un animal infestado por T. nativa y no cribado mediante el ELISA Ag E/S mientras que la carga parasitaria muscular era residual.

La especificidad del ELISA N5EM11 se evaluó con ayuda de sueros extraídos de 300 animales antes de la infestación experimental y hasta 10 días pi. Esta especificidad es superior al 99% (no se ilustran los resultados).

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Ejemplo 4

Identificación y aislamiento del antígeno 411

El clon de ADNc 411 se seleccionó a partir de un banco de ADNc de los estadios invasivos precoces Ad+L1NN de T. spiralis.

La secuencia nucleica de este clon de ADNc, así como la secuencia polipeptídica deducida, se determinaron, y se representan respectivamente en la lista de secuencias con los números SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 4. El marco abierto de lectura de 411 codifica una supuesta proteína de 20 kDa. A excepción de un péptido señal, no se identificó ningún dominio proteico.

La comparación del marco abierto de lectura completo de 411 con las secuencias disponibles en el Genbank muestra que éste presenta el 78,7% de identidad con la proteína Tp21-3 de excreción/secreción identificada en T. pseudospiralis (AAF79206; NAGANO et al., 2001), y el 86,6% de identidad con la secuencia del ORF 17.20 hipotético de T. spiralis presentada por Polvere y Despommier (AAB48489). Estas comparaciones de secuencias identifican a 411 como un nuevo miembro de esta familia de genes común al género Trichinella.

El marco abierto de lectura completo de 411 se amplificó con ayuda de los oligonucleótidos 411F (5'-CACCC
GAGAAAACATGCAT-3') (SEC ID Nº 22) y 411R (5'-TCCATTCAATTTTGCGTCAC-3') (SEC ID Nº 23), y la ADN polimerasa AccuPrime Pfx DNA polymerase (Invitrogen), y se clonó en el plásmido pET102D/topo, utilizando el kit de expresión Champion pET102 Directional TOPO de acuerdo con las recomendaciones del fabricante
(Invitrogen).

El plásmido recombinante obtenido, denominado pET102-411 codifica una proteína de fusión tiorredoxina-411 (THX-411) de 330 aminoácidos, para una masa molecular predicha de 36,7 kDa, y que porta en posición C-terminal una etiqueta de polihistidina. La secuencia de esta proteína de fusión se representa en la Figura 5.

La proteína de fusión THX-411 se expresó en bacterias E. coli BL21 Star (DE3), BL21 (DE3)pLys (Invitrogen) transformadas con el plásmido pET102-411, y se purificó mediante cromatografía de afinidad en condiciones desnaturalizantes en columna Ni-NTA (Ni-NTA spin columns kit; Ni-NTA beads), utilizando el protocolo recomendado por el proveedor (Qiagen).

La proteína de fusión THX-411 purificada aparece, después de la electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) en forma da una banda con el tamaño esperado de 36,7 kDa.

La inmunorreactividad de la proteína THX-411 frente a un suero de cerdo libre de triquinelosis, y del suero del mismo cerdo, 30 días y 50 días después de la infestación por 20000 larvas L1M de T. spiralis se comparó con la del antígeno de referencia E/S (preparado como se ha descrito en el ejemplo 2 anteriormente). El análisis se realizó mediante transferencia de Western, utilizando el mismo protocolo que el descrito en el ejemplo 1 anterior-
mente.

Los resultados se ilustran mediante la Figura 6.

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Se observa una inmunorreactividad muy fuerte de THX-411 con los sueros del cerdo infestado por T. spiralis y la detección precoz de anticuerpos anti-411 (30 días pi). Se observa un ligero ruido de fondo debido a las reacciones cruzadas entre las proteínas bacterianas residuales de alta masa molecular que subsisten en la preparación de THX-411 y los anticuerpos anti E. coli presentes en los sueros.

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Ejemplo 5

Utilización de THX-411 para detectar la respuesta humoral dirigida contra Trichinella

La proteína, preparada como se ha descrito en el ejemplo 4 anteriormente, se evaluó mediante ELISA indirecto frente a sueros obtenidos de cerdos infestados por Trichinella, en comparación con el antígeno de excreción/secreción (E/S) de T. spiralis.

Se comparó la cinética de aparición de los anticuerpos anti-Trichinella detectados mediante ELISA THX-411 o mediante ELISA Ag E/S en sueros de cerdos convencionales infestados experimentalmente con 200, 1000 ó 20000 larvas L1M de T. spiralis. La detección mediante ELISA Ag E/S, y ELISA THX-411 de las respuestas humorales inducidas por T. spiralis y las otras tres especies de Trichinella identificadas en Europa, T. nativa, T. britovi y T. pseudospiralis, también se comparó.

El protocolo utilizado es idéntico al descrito en el Ejemplo 2. El antígeno THX-411 se utilizó a 2 \mug/ml, y el antígeno E/S a 1,25 \mug/ml.

El umbral de positividad es del 14% para el ELISA Ag E/S, y del 52% para el ELISA THX-411.

Los resultados se ilustran mediante la Figura 7, así como mediante la Tabla III a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

5

6

El conjunto de estos resultados muestra que el antígeno 411 permite la detección dependiente de la dosis de las respuestas humorales dirigidas contra T. spiralis. La detección de epítopos conformacionales mediante este ensayo ELISA asociada a la detección de epítopos lineales mediante transferencia de Western demuestran, por otro lado, el carácter inmunodominante de la proteína 411 de Trichinella.

La proteína recombinante THX-411 permite una detección particularmente precoz de los anticuerpos dirigidos contra T. spiralis (a partir del 20º día pi para los animales fuertemente infestados por 20000 L1M). La seroconversión viene acompañada por un perfil de respuestas humorales que tienen valores elevados y mantenidos hasta el 60 día pi. La seroconversión de los animales infestados con una carga moderada y reducida del parásito se detectó de forma más tardía al 30º día pi y 60º día pi, respectivamente. La seroconversión más precoz detectada mediante el ELISA Ag E/S es el 25º día pi.

Los animales infestados por T. spiralis que fueron diagnosticados a la vez mediante el ELISA Ag E/S y el ELISA THX-411 vieron como, para 2/5 de ellos, su ventana de detección serológica se reducía con el ELISA THX-411, con una ganancia de 5 a 10 días en términos de precocidad. La sensibilidad del ELISA THX-411 se demostró con el cribado efectivo de 5/9 cerdos convencionales durante esta experimentación animal, es decir 3/3 cerdos infestados por 20000 L1M, 1/3 cerdos infestados por 1000 L1M y 1/3 cerdo infestado por solamente 200 L1M de T. spiralis. Las detecciones estaban asociadas a la carga parasitaria muscular de T. spiralis en estos animales, que variaba de media de 3 larvas por gramo (LpG) para los 30 cerdos infestados experimentalmente por 200 L1M, 43 LpG para los cerdos infestados por 1000 L1M, y 538 LpG para los cerdos infestados por 20000 L1M.

Las respuestas humorales inducidas por T. nativa, T. britovi y T. pseudospiralis también se detectaron, a su vez, mediante el ELISA THX-41l (10/12 animales infestados por 20000 L1M), que demuestran la conservación genética y antigénica de 411 en el género Trichinella y, por consiguiente, todo su interés para el diagnóstico de amplio espectro de las triquinelosis. La precocidad del diagnóstico se confirmó a partir del 20º día pi. La ventana de seroconversión se redujo de 5 a 20 días con el ELISA 411, y a semejanza de la infestación por T. spiralis, del 50% al 100 de los animales que fueron diagnosticados a la vez con ELISA Ag E/S y ELISA THX-411 vieron como su ventana de detección serológica se reducía con el ELISA THX-411. El análisis de la infestación por la especie T. nativa demostró una mayor sensibilidad del ELISA THX-411 que diagnosticó 6/9 animales (contra 5/9 animales mediante el ELISA Ag E/S) mientras que la carga parasitaria muscular era solamente de media de 7 x 10^{-4} a 0,1 LpG. Además, se obtuvieron perfiles de respuestas humorales similares para los animales infestados por T. spiralis y T. nativa, mientras que la intensidad de la infestación generada por esta última especie era significativamente menor, lo que sugiere un carácter inmunógeno muy importante de la proteína 411 de T. nativa y su utilización para la detección de esta especie resistente a la congelación.

La especificidad del ELISA THX-411 se evaluó con ayuda de sueros extraídos de 150 animales antes de la infestación experimental y hasta 10 días pi. Esta especificidad es superior al 99% (no se ilustran los resultados).

Conclusión

Los antígenos NBL1 y 411 constituyen antígenos inmunodominantes y conservados en el género Trichinella. Los ensayos ELISA que utilizan estos antígenos (NBL1 parte C terminal; epítopo peptídico N5EM11 de NBL1; antígeno 411) tienen una especificidad frente a Trichinella superior al 99%, y permiten el diagnóstico precoz (15-60 días después de infestación) de las triquinelosis porcinas producidas por las 4 especies de Trichinella identificadas en Europa.

El ensayo ELISA que utiliza la proteína recombinante purificada THX-NBL1(Cterm), que contiene el epítopo inmunodominante de NBL1 localizado en la parte C terminal de la proteína, es específico de Trichinella, sensible, y permite el diagnóstico de las triquinelosis porcinas con una precocidad aumentada en de 5 a 45 días con respecto al ELISA Ag E/S. Además, este ensayo permitió obtener una ventana de detección serológica reducida con respecto al ELISA Ag E/S en el 100% de los animales que fueron diagnosticados a la vez mediante el ELISA Ag E/S y mediante el ELISA THX-NBL1(Cterm).

El ensayo ELISA que utiliza la proteína recombinante purificada THX-41l reproduce con una sensibilidad actualmente un poco más reducida (17/36 animales diagnosticados) las cinéticas de las respuestas humorales detectadas mediante el ELISA Ag E/S. Sin embargo, la sensibilidad de este nuevo ELISA permitió diagnosticar un cerdo no cribado mediante el ELISA Ag E/S. El ELISA THX-411 puede permitir el diagnóstico de las triquinelosis porcinas con una precocidad aumentada en de 5 a 20 días con respecto al ELISA Ag E/S. Además, del 50% al 100% de los animales que fueron diagnosticados a la vez mediante ELISA Ag E/S y ELISA THX-411 vieron como su ventana de detección serológica se reducía con el ELISA THX-411.

El conjunto de estos resultados muestra que los antígenos NBL1 y 411 pueden utilizarse, como alternativa al antígeno E/S, o como complemento a éste, para el diagnóstico serológico precoz de las triquinelosis. Además, la asociación de estos dos nuevos antígenos de Trichinella permite la mejora de la sensibilidad del ELISA mediante el diagnóstico de un animal suplementario.

La asociación de NBL1 (Cterm) con un péptido inmunodominante de tipo N5EM11, y 411 permite mejorar la sensibilidad del diagnóstico de Trichinella (24/36 animales detectados).

El efecto aditivo de NBL1 con 411 se traduce en el aumento de detección de un animal, inducido por 411, así como en la detección más precoz de un animal, inducida por 411. El tríptico (NB1L, 411, N5EM11) estabiliza en el tiempo los ensayos ELISA mediante la co-detección simultánea de anticuerpos mediante 2 ó 3 antígenos, sin aumento suplementario, sin embargo, en términos de número de animales.

Por el contrario, el diagnóstico precoz < 30 días pi se obtiene gracias a los dos antígenos NBL1 y 411.

Referencias

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<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE AGENCE FRANCAISE DE SECURITE SANITAIRE DES ALIMENTS JILIN UNIVERSITY

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BOIREAU, Pascal

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LIU, Mingyuan

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FU, Baoquan

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LE RHUN Danielle

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BAHUON, Céline

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VALLEE, Isabelle

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LE GUERHIER, Franck

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HERNANDEZ BELLO, Romel

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<120> POLIPÉPTIDOS RECONOCIDOS POR ANTICUERPOS ANTI-TRICHINELLA, Y SUS APLICACIONES

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<130> MJP/mad-F539/130-PCT

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<150> FR 06/01058

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<151> 02-02-2006

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<160> 23

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 1609

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<212> ADN

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<213> Trichinella spiralis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (90)..(1487)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip0,8cm

7

\hskip0,8cm

8

\hskip0,8cm

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 465

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

10

\hskip0,8cm

11

\hskip0,8cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 700

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(528)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip0,8cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip0,8cm

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip0,8cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip0,8cm

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip0,8cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip0,8cm

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip0,8cm

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip0,8cm

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NBL1CtermF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccgaaaat tctcctgaag ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NBL1CtermR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttgttgta gtaactcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip0,8cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip0,8cm

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip0,8cm

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip0,8cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip0,8cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip0,8cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip0,8cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trichinella spiralis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip0,8cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 411F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacccgagaa aacatgcat

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 411R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccattcaat tttgcgtcac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Utilización de un polipéptido antigénico reconocido por anticuerpos anti-Trichinella como reactivo para la detección de anticuerpos anti-Trichinella en una muestra biológica, caracterizada por que dicho polipéptido comprende un epítopo inmunodominante del antígeno NBL1, epítopo que está definido por la secuencia PSSGSRPTYP (SEC ID Nº 5).

2. Utilización de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizada por que se utiliza una mezcla que comprende uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 1, opcionalmente en combinación con uno o más polipéptidos que comprenden los aminoácidos 25-175 de la secuencia SEC ID Nº 4, o que comprenden una secuencia que presenta al menos el 70% de identidad con la secuencia de los aminoácidos 25-175 de la secuencia SEC ID
Nº 4.

3. Polipéptido antigénico reconocido por anticuerpos anti-Trichinella, tal como se define en la Reivindicación 1, con la exclusión del polipéptido identificado por el número de entrada del GenBank AAK16520.1 y del polipéptido identificado por el número de entrada del GenBank AAR36900.1.

4. Polipéptido antigénico de acuerdo con la Reivindicación 3, que contiene una o más de las siguientes secuencias: la secuencia: PSSGSRPTYPSSGSR (SEC ID Nº 6); la secuencia PSSGSRPTYPYTGSR (SEC ID Nº 7); y la secuencia RPTSPSSGSRPTYPS (SEC ID Nº 8).

5. Polipéptido antigénico de acuerdo con la Reivindicación 4, que contiene los aminoácidos 363-409 de la secuencia SEC ID Nº 2.

6. Polipéptido antigénico de acuerdo con la Reivindicación 3, caracterizado por que está constituido por un polipéptido quimérico que comprende una o más copias de un polipéptido tal como se define en la Reivindicación 1, opcionalmente con una o más copias de un polipéptido tal como se define en la Reivindicación 2, eventualmente fusionados con una o varias secuencias heterólogas.

7. Polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 6.

8. Vector recombinante que contiene uno o más polinucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 7.

9. Célula huésped transformada por un vector recombinante de acuerdo con la Reivindicación 8.

10. Utilización de un polipéptido tal como se define en la Reivindicación 1, para la obtención de una composición utilizable para la producción de anticuerpos.

11. Anticuerpo que reconoce específicamente a un polipéptido tal como se define en la Reivindicación 1.

12. Anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 11, caracterizado por que reconoce al epítopo PSSGSRPTYP (SEC ID Nº 5).

13. Procedimiento de detección de la presencia de anticuerpos anti-Trichinella en una muestra biológica, procedimiento que se caracteriza por que comprende:

-: la puesta en contacto de dicha muestra biológica con uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 1, opcionalmente en combinación con uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 2, en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno/anticuerpo con los anticuerpos anti-Trichinella eventualmente presentes en dicha muestra;

\vskip1.000000\baselineskip

14. Kit para la detección de la presencia de anticuerpos anti-Trichinella en una muestra biológica, caracterizado por que comprende uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 1, opcionalmente en combinación con uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 2 y, llegado el caso, tampones y reactivos apropiados para la constitución de un medio de reacción que permita la formación de un complejo antígeno/anticuerpo y, opcionalmente, medios de detección de dicho complejo antígeno/anticuerpo.

15. Kit de acuerdo con la Reivindicación 14, caracterizado por que dicho(s) polipéptido(s) está(n) inmovi-
lizado(s) sobre un soporte sólido.

16. Composición inmunógena, que comprende uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 1, opcionalmente en combinación con uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 2, o uno o más polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 1, opcionalmente en combinación con uno o más polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 2, asociados a uno o más adyuvantes que permiten mejorar la respuesta inmunitaria.

17. Composición inmunógena de acuerdo con la Reivindicación 16, caracterizada por que se trata de una vacuna.