CN104130322A - 旋毛虫Ts834蛋白基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫学和分子生物学领域，涉及一种旋毛虫Ts834基因及其蛋白和用途。具体地，所述旋毛虫Ts834基因为或者包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的序列。旋毛虫Ts834基因表达蛋白免疫动物后产生高滴度的抗体并对攻击感染产生有效的免疫保护性，具有应用于制备旋毛虫病的免疫诊断或防治的药物的潜力。

Description

旋毛虫Ts834蛋白基因及其应用

发明领域

本发明属于免疫学和分子生物学领域，涉及一种旋毛虫Ts834基因及其蛋白和用途。

背景技术

旋毛形线虫(Trichinella spiralis，简称旋毛虫)，可感染人及150多种动物，它所引起的旋毛虫病是一种人畜共患寄生虫病，呈全球性分布，严重地威胁了人类健康并对畜牧业造成巨大经济损失。旋毛虫生活史简述如下：当人或动物宿主生食或半生食含旋毛虫囊包的肉类(猪肉、狗肉等)，囊包内幼虫在胃液、肠液作用下逸出并在小肠内发育为成虫。雌、雄虫交配后雌虫产新生幼虫。新生幼虫侵入肠粘膜淋巴管或静脉，随淋巴和血循环到达宿主横纹肌继续发育。旋毛虫的致病过程分为三期：侵入期、幼虫移行及囊包形成期，即在该虫生活史的每个环节均可使宿主致病。

旋毛虫病临床表现复杂多样，诊断较困难，给及时的治疗造成一定难度，因此该病的免疫诊断及预防成为当务之急。由于病原体不能在体外大量传代培养，限制了抗原的获取；加之旋毛虫抗原的复杂性、多样性，造成目前尚无很好的高敏感度高特异性的抗原作为诊断或保护性疫苗的候选抗原分子。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种旋毛虫抗原新基因。本发明人进一步制备了该基因的基因重组蛋白及高效价免疫血清，并进行了免疫学功能的研究。本发明人惊奇地发现，制得的重组蛋白具有良好的免疫原性，并且免疫动物后对旋毛虫攻击感染产生有效的免疫保护性。具有应用于制备旋毛虫病的免疫诊断或防治的药物的潜力。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列为或者包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的序列。

172aa

AKSLDAVDDELKRCTEKQTEI CAQTECKAEDAIMTDLLLEGESDITDHPDFLLYATCMQRCCARLN GAQVAPLKEEEKRRGPSKLPFQSIFEVADQKTVERCDETMCKSYR KKYENLVALTSSYKKLRSSQELKDYKQCIERCDAKLNGLQ(SEQID NO：1)

其中，上面的加框部分(SEQ ID NO：2，21aa)为信号肽序列；下划线部分为成熟肽序列(SEQ ID NO：3，151aa)。

本发明的另一方面涉及一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列编码本发明任一项所述的多肽。

本发明还涉及一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列为或者包含SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8所示的序列或其互补序列。

700bp

GAAAATCGAAAGCTGTTGCAAAAC GCGAAATCACTGGATGCCGTAGACGATGAATTAAAAAGATG TACTGAGAAGCAAACTGAAATTTGTGCTCAAACAGAATGCAAA GCAGAAGATGCAATTATGACAGATCTGCTTCTCGAGGGAGAAA GCGACATTACTGATCATCCTGACTTCCTTTTATACGCAACTTGC ATGCAACGTTGCTGTGCAAGACTGAACGGCGCTCAAGTAGCTC CATTGAAAGAAGAAGAAAAACGAAGAGGACCTTCAAAATTACC GTTCCAAAGCATTTTTGAAGTTGCTGATCAAAAAACAGTTGAA AGATGTGATGAAACAATGTGCAAGAGTTATAGAAAGAAATATGA AAATTTGGTAGCATTGACTTCAAGCTACAAAAAGCTACGATCAA GCCAAGAATTGAAAGACTACAAACAATGCATCGAAAGATGTGA CGCAAAATTGAATGGATTACAGTAAAGCCAGATATGAAGAATGAAGATATGCATTACAAAGAAAAATTTTAACTGAAATAATTTTTGTTTTATAAAATCTATAAATATCATTTCTAACTGCATTAGAATTTTTTTGAAGAAAAATAAAATAAAAAAATTCTTAATAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：4，命名为Ts834基因)

其中，起始密码子ATG位于序列第25bp处，TAA为终止密码子。上面的下划线部分为读码框序列(SEQ ID NO：5，516bp)，其编码SEQID NO：1所示的多肽序列。加框部分为编码信号肽的核苷酸序列(SEQID NO：6，63bp)，下划线部分中扣除加框部分的剩余序列为编码成熟肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：7，453bp)。

SEQ ID NO：8为实施例2添加有酶切位点的PCR扩增得到的序列。

本发明的再一方面涉及一种核酸构建体，其含有本发明任一项所述的多核苷酸；具体地，所述核酸构建体为重组表达载体；更具体地，所述重组表达载体为重组原核表达载体或者重组真核表达载体；进一步具体地，所述重组原核表达载体为重组PET-28a(+)载体。

本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明任一项所述的核酸构建体；具体地，为重组大肠杆菌细胞。

本发明的再一方面涉及一种抗体，其能够与本发明任一项所述的多肽特异性结合；具体地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

本发明的再一方面涉及一种免疫血清，其由本发明任一项所述的多肽免疫哺乳动物制得；具体地，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊、人或猴。

本发明利用基因表达及免疫学技术获得该基因的重组蛋白及高效价免疫血清；并对该蛋白的细胞定位、免疫原性及免疫保护性进行了分析。实施例4的结果表明，旋毛虫Ts834基因表达蛋白为感染旋毛虫的病鼠血清、病猪血清、病兔血清所识别。并与Ts834基因表达蛋白免疫血清发生反应(图2)。

本发明的再一方面涉及一种组合物，其含有本发明任一项所述的多肽、本发明任一项所述的多核苷酸、本发明任一项所述的核酸构建体、本发明任一项所述的重组宿主细胞、本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的免疫血清；可选地，其还包含药学上可接受的辅料；具体地，所述组合物为药物组合物；更具体地，所述组合物为人畜旋毛虫疾病诊断试剂或者防治人畜旋毛虫疾病的药物例如疫苗。具体地，所述人畜为小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊、人或猴。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽、本发明任一项所述的多核苷酸、本发明任一项所述的核酸构建体、本发明任一项所述的重组宿主细胞、本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的免疫血清在制备如下的(1)至(4)中任一项的用途：

(1)旋毛虫或旋毛虫所致疾病诊断试剂，

(2)预防和/或治疗和/或辅助治疗旋毛虫感染的药物例如疫苗，

(3)抑制旋毛虫的药物或者试剂，和

(4)旋毛虫抗原或者抗原表位。

实施例5的结果表明，旋毛虫Ts834基因表达蛋白免疫动物后对攻击感染产生有效的免疫保护性(表1)。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外检测或者抑制旋毛虫的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述的多肽或者本发明任一项所述的多核苷酸的步骤。具体地，所述方法是非治疗目的的。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/辅助治疗旋毛虫感染所致疾病或者预防旋毛虫感染的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述的多肽或者本发明任一项所述的多核苷酸的步骤。

在本发明的一个实施方案中，所述旋毛虫为国际标准虫株ISS533。

本发明中部分术语的解释：

多核苷酸

本发明还涉及含有编码本发明所述多肽的核酸序列的分离多核苷酸。在一个优选实施方案中，该多核苷酸包含编码具有SEQ ID NO：1、2或3氨基酸序列的多肽的核酸序列。在另一个优选实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO：4、5、6或7的核苷酸序列。本发明的核酸序列包括基因组序列，以及相应的cDNA和RNA序列。此处所用术语“核酸序列”应理解为包括合成DNA在内的所有这类变种。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明所述核酸序列及与之可操作连接的一个或多个调控序列的核酸构建体，所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中进行表达。表达应理解为包括多肽生产中所涉及的任何步骤，包括，但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

“核酸构建体”在文中定义为单链或双链核酸分子，它们分离自天然基因，或者经修饰而含有以非天然方式组合和并列的核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明所述编码序列必需的所有调控序列时，术语核酸构建体与表达盒同义。术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。

可以以多种方式操作编码本发明所述肽的分离的核酸序列，使其表达所述肽。可能期望或必须在插入载体之前对核酸序列进行加工，这取决于表达载体。应用重组DNA方法修饰核酸序列的技术为本领域所熟知。

本文中术语“控制序列”定义为包括表达本发明肽所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。

调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。

调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。

调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。

调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在多肽氨基端的氨基酸序列，能引导编码多肽进入细胞分泌途径。核酸序列编码区的5’端可能天然含有翻译读框一致地与分泌多肽的编码区片段自然连接的信号肽编码区。或者，编码区的5’端可含有对编码序列是外来的信号肽编码区。当编码序列在正常情况下不含有信号肽编码区时，可能需要添加外来信号肽编码区。或者，可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽分泌。但是，任何能引导表达后的多肽进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。

调控序列还可以是肽原编码区，该区编码位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被称为酶原或多肽原。多肽原通常没有活性，可以通过催化或自我催化而从多肽原切割肽原而转化为成熟的活性多肽。

在多肽的氨基末端即有信号肽又有肽原区时，肽原区紧邻多肽的氨基末端，而信号肽区则紧邻肽原区的氨基末端。

添加能根据宿主细胞的生长情况来调节多肽表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码多肽的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。

表达载体

本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括一个或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。

重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。

载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。

优选本发明所述载体含有一个或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。

优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。

就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如，fEhrlich,1978，美国国家科学院学报75：1433)。

可以向宿主细胞插入1个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少1个附加拷贝插入宿主细胞基因组中，或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。

用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。

宿主细胞

本发明还涉及包含可用来重组生产多肽的本发明所述核酸序列的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。

宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。

制备方法

本发明还涉及重组制备本发明肽的方法，该方法包括：(a)在适于产生所述肽的条件下，培养含有核酸构建体的宿主细胞，该核酸构建体包含编码所述肽的核酸序列；和(b)回收该肽。

在本发明所述制备方法中，用本领域已知方法在合适多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物中回收。

可以用本领域已知方法回收所产生的多肽。例如，可以通过常规操作(包括，但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收多肽。

可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述多肽，这些操作包括，但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳(例如，制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如，蛋白质纯化，J.C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers,New York,1989)。

药物组合物

本发明还涉及含有本发明多肽和药学可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物可用于诊断、缓解或治疗与旋毛虫感染有关的疾病或病症。在一个实施方案中，含有治疗有效量的本发明多肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药，并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。

含治疗有效量的本发明多肽的药物组合物可口服、非肠道给药、脑池内给药、鞘内给药等。“药学可接受辅料”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下、鞘内和关节内注射和输注。本发明多肽还可通过缓释系统恰当地给药。

附图说明

图1：由大肠杆菌中的表达及纯化的Ts834基因表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中：泳道M，蛋白分子量Marker；泳道1，未经IPTG诱导的含Ts834基因片段质粒的细胞裂解物；泳道2，IPTG诱导后的含Ts834基因片段质粒的细胞裂解物；泳道3，纯化的Ts834基因表达蛋白，箭头所指为重组表达的蛋白带。

图2：Western免疫印迹鉴定Ts834基因表达蛋白的免疫特性。其中，泳道M，蛋白分子量Marker；泳道1，纯化的Ts834基因表达蛋白与旋毛虫病鼠血清反应；泳道2，纯化的Ts834基因表达蛋白与感染旋毛虫的猪血清反应；泳道3，纯化的Ts834基因表达蛋白与感染旋毛虫的兔血清反应；泳道4，纯化的Ts834基因表达蛋白与Ts834基因表达蛋白免疫兔血清反应。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：旋毛虫Ts834基因的克隆及序列分析

1.筛选血清的制备

收集旋毛虫肌幼虫(国际标准虫株ISS533)，实验猪(五指山小型猪)，20kg/头，共4头，经口感染旋毛虫肌幼虫20000条，新西兰大耳白兔和BALB/C小鼠各2只，经口分别感染旋毛虫肌幼虫4000条和500条，4周后获人工感染猪血清、感染兔血清以及感染鼠血清。经ELISA测定血清滴度，感染猪血清达1：80000以上，感染兔血清以及感染鼠血清达1：1000以上。

2.免疫筛选表达文库

旋毛虫成虫λZAPⅡcDNA表达文库参考“刘明远，中国旋毛虫分离株成虫和新生幼虫基因文库的构建和筛选，中国兽医学报，1998，18(2)：147-150”制备。

1μl旋毛虫成虫λZAPⅡcDNA表达文库，稀释液加入600μl宿主菌XL1-Blue中，37℃，吸附20分钟加入顶层琼脂，倒置于42℃温箱中培养至有针尖大小的噬菌斑长出。把硝酸纤维素膜铺在平板上，放在37℃温箱培养过夜。第二天在室温下将膜做好标记，从平板上揭下，浸入实施例1制备的旋毛虫感染猪血清(1:10000)2小时，用TBST(TBS含0.5％Tween20)洗膜3次，再把膜浸入二抗工作液—1：10000辣根过氧化物酶-兔抗猪IgG(Sigma公司)2小时。将膜浸入显色液DAB中(Pierce公司)，显色充分后，加入H2O终止反应。用1：10000实施例1制备的旋毛虫感染猪血清进一步筛选获得的阳性噬菌斑，经三轮复筛，获得74个阳性噬菌斑。

随后进行阳性噬菌斑(使用全部74个阳性噬菌斑)的体内剪切，以获得环化质粒。挑取阳性噬菌斑，加入至含1ml的λ噬菌体文库稀释液的1.5ml离心管中，混匀，再加25μl氯仿，涡旋震荡充分后，为噬菌斑液，4℃保存。将500μl宿主菌XL1-Blue和500μl筛选得到的阳性噬菌斑液加入至5ml的NZY Broth中，37℃振摇培养4～5hr，再加入3滴氯仿，37℃，振摇培养15min，3000rpm，4℃离心15min后，用1.5ml离心管分装上清，每管加5μl氯仿，4℃保存备用。将200μl宿主菌XL1-Blue、150μl上述扩增后噬菌体上清和5μl辅助噬菌体混合，37℃水浴15min；加入3ml的LB液体培养基，37℃，振摇培养3hr；65℃水浴20min；4000rpm，4℃离心15min后取上清分装，即为噬菌体体内剪切后的上清。

取4μl体内剪切后的上清加入至200μl宿主菌SOLR中，37℃，水浴15min；涂布于平板上，进行蓝白筛选，白色菌落为阳性克隆(pBluescript/Ts834)。经PCR鉴定后，选取Ts834克隆进行DNA序列测定。测序结果SEQ ID NO：1所示，命名为Ts834基因。

3.Ts834的cDNA序列与编码的氨基酸分析

Ts834cDNA全长700bp，开放阅读框为172个氨基酸(SEQ ID NO：1)，其理论分子量为约20KDa。经信号肽分析，该蛋白需剪切21个氨基酸的信号肽(SEQ ID NO：2)，表达时仅需表达151个氨基酸(SEQ IDNO：3)。

实施例2：Ts834基因表达蛋白的制备及免疫血清

将旋毛虫Ts834基因的151个氨基酸(SEQ ID NO：3)的重组蛋白在大肠杆菌BL21株中表达并进行纯化。具体步骤如下：

添加了BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的Ts834基因成熟肽编码序列(SEQ ID NO：8)经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，亚克隆于原核表达载体PET-28a(+)。正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21株，经37℃150转/分1.0mM IPTG诱导3小时，获得Ts834基因表达蛋白，重组蛋白经His-binding(Novagen公司)亲和层析柱纯化后，经电洗脱仪洗脱使纯度更高。通过SDS-PAGE电泳进行鉴定(图1)。

469bp

CGGGATCCGCGAAATCACTGGATGCCGTAGACGATGAATTAAAAAGATGTACTGAGAAGCAAACTGAAATTTGTGCTCAAACAGAATGCAAAGCAGAAGATGCAATTATGACAGATCTGCTTCTCGAGGGAGAAAGCGACATTACTGATCATCCTGACTTCCTTTTATACGCAACTTGCATGCAACGTTGCTGTGCAAGACTGAACGGCGCTCAAGTAGCTCCATTGAAAGAAGAAGAAAAACGAAGAGGACCTTCAAAATTACCGTTCCAAAGCATTTTTGAAGTTGCTGATCAAAAAACAGTTGAAAGATGTGATGAAACAATGTGCAAGAGTTATAGAAAGAAATATGAAAATTTGGTAGCATTGACTTCAAGCTACAAAAAGCTACGATCAAGCCAAGAATTGAAAGACTACAAACAATGCATCGAAAGATGTGACGCAAAATTGAATGGATTACAGGAATTCCG(SEQ ID NO：8)

其中，上面所述添加了BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的Ts834基因成熟肽编码序列(SEQ ID NO：8)，由PCR扩增得到，所用引物为添加了BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物：

引物1：CGGGATCCGCGAAATCACTGGATGCCGT(SEQ IDNO：9)，

引物2：CGGGATCCATGCATTGCCAATTCATTCT(SEQ IDNO：10)。

模板为pBluescript/Ts834菌液。

50μL体系如下：

PCR反应循环设置：95℃5min；94℃30sec，65℃30sec，72℃2min，30cycles；72℃5min。

反应结束后，取5μL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。

本实施例制备的Ts834基因表达蛋白(151aa的成熟肽)用于下面的实施例3－5。

实施例3：Ts834基因表达蛋白免疫血清的制备

将实施例2中制备的Ts834基因表达蛋白经皮肤多点注射免疫BALB/c小鼠(25μg/只)，加强2次。5周后摘眼球取血。ELISA测定抗体效价高达1：256000以上。

实施例4：Ts834基因表达蛋白的免疫特性

1.酶联免疫吸附(ELISA)检测

以1μg Ts834基因表达蛋白为抗原包被96孔酶标板，一抗为待检血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的相应二抗，该蛋白可与旋毛虫病人血清、感染旋毛虫的兔及猪血清产生阳性反应，说明Ts834基因的重组蛋白具有特异的免疫原性，是极具潜力的诊断试剂。

2.Western印迹分析

纯化的Ts834基因表达蛋白(200ng)经SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜，用ECL化学发光试剂盒(Amersham公司)检测，分别以病鼠血清1：200、感染猪血清1：200、感染兔血清1：500、Ts834基因表达蛋白免疫血清1：10000作为第一抗体。结果显示约25KDa处均呈现一明显的蛋白印迹带(图2)，表明Ts834基因表达蛋白可为感染旋毛虫的鼠、猪、兔血清及Ts834基因表达蛋白免疫血清所识别。

实施例5：动物体内保护性实验

BALB/c小鼠24只，随机分为2组，每组12只。

Ts834基因表达蛋白免疫组以25μg/只的抗原加等体积的ISA50V2佐剂皮下注射。以后每隔14天以相同剂量抗原加等量ISA50V2佐剂，加强2次。

末次注射后10天，每只鼠用500条旋毛虫感染性幼虫进行攻击感染。对照组注射相同剂量的PBS，与免疫组同时接受500条旋毛虫感染性幼虫攻击。

于攻击后5天每组取6只小鼠处理，取小鼠小肠经生理盐水37℃孵育，收集成虫，计数。于攻击45天后将每组剩余6只小鼠处理，取全部肌肉用胃蛋白酶消化收集幼虫，计数。

结果如下面的表1所示。

经单因素方差分析，Ts834基因表达蛋白免疫组成虫减虫率为27％，肌幼虫减虫率为42.1％，与对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)。

％肌幼虫减虫率＝(1-免疫组平均肌幼虫虫荷/对照组平均肌幼虫虫荷)×100％

％成虫减虫率＝(1-免疫组平均成虫数/对照组平均成虫数)×100％

表1：Ts834基因表达蛋白免疫BALB/c小鼠的保护性结果

结果表明，由于本实验Ts834基因表达蛋白在动物体内产生有效的减虫率，据此可作为保护性候选抗原，应用于旋毛虫病的免疫治疗。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种分离的多肽，其氨基酸序列为或者包含SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3所示的序列。

2.一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列编码权利要求1所述的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列为或者包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的序列。

4.一种核酸构建体，其含有权利要求2或3所述的多核苷酸；具体地，所述核酸构建体为重组表达载体；更具体地，所述重组表达载体为重组原核表达载体或者重组真核表达载体；进一步具体地，所述重组原核表达载体为重组PET-28a(+)载体。

5.一种重组宿主细胞，其含有权利要求4所述的核酸构建体；具体地，为重组大肠杆菌细胞。

6.一种抗体，其能够与权利要求1所述的多肽特异性结合；具体地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

7.一种免疫血清，其由权利要求1所述的多肽免疫哺乳动物制得；具体地，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊、人或猴。

8.一种组合物，其含有权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的多核苷酸、权利要求4所述的核酸构建体、权利要求5所述的重组宿主细胞、权利要求6所述的抗体或者权利要求7所述的免疫血清；可选地，其还包含药学上可接受的辅料；具体地，所述组合物为药物组合物；更具体地，所述组合物为人畜旋毛虫疾病诊断试剂或者防治人畜旋毛虫疾病的药物例如疫苗。

9.权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的多核苷酸、权利要求4所述的核酸构建体权利要求5所述的重组宿主细胞、权利要求6所述的抗体或者权利要求7所述的免疫血清在制备如下的(1)至(4)中任一项的用途：

(1)旋毛虫或旋毛虫感染疾病诊断试剂，

(2)预防和/或治疗和/或辅助治疗旋毛虫感染的药物例如疫苗，

(3)抑制旋毛虫的药物或者试剂，和

(4)旋毛虫抗原或者抗原表位。

10.一种在体内或体外检测或者抑制旋毛虫的方法，包括使用有效量的权利要求1所述的多肽或者权利要求2或3所述的多核苷酸的步骤。