KR20210061075A

KR20210061075A - 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 １을 발현하는 형질전환 대장균, 상기 형질전환 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 １의 분리정제 방법 및 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 １의 용도

Info

Publication number: KR20210061075A
Application number: KR1020190148859A
Authority: KR
Inventors: 최재원; 김학용; 엄효지
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2021-05-27

Abstract

본 발명은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 발현하는 형질전환 대장균, 상기 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 분리정제 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균, 상기 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 제조방법, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 대량 생산하는 방법, 상기 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1, 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 일본 뇌염 백신 조성물, 면역 반응 유도용 조성물, 일본 뇌염 진단용 조성물, 진단 키트 및 일본 뇌염 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 이용한 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 생산 방법은 포유류 세포나 곤충 세포와 같은 고등생물의 세포를 이용하지 않고 대장균으로부터 쉽고 저렴하게 상기 단백질을 고순도로 대량 생산할 수 있는 효과가 있고, 본 발명의 방법으로 생산된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1은 안정한 상태로 면역원성을 유지하고 있어 일본 뇌염의 백신 조성물, 진단용 조성물, 진단 키트, 진단 방법 및 일본 뇌염 바이러스의 검출방법에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 １을 발현하는 형질전환 대장균, 상기 형질전환 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 １의 분리정제 방법 및 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 １의 용도{Transformed Escherichia coli strain for expressing Japanese encephalitis virus non-structural protein 1, method for separating and purifying Japanese encephalitis virus non-structural protein 1 from the strain and use thereof}

본 발명은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 발현하는 형질전환 대장균, 상기 형질전환 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 분리정제 방법 및 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 용도에 관한 것이다.

일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus)는 가장 심각한 뇌염을 유발하는 바이러스 중의 하나로, 집모기 속(Culex genus)에 해당하는 모기가 옮기는 것으로 알려져 있으며 작은빨간집모기(Culex tritaeniorhynchus)가 가장 잘 알려져 있다. 일본 뇌염(Japanese encephalitis)은 사람뿐만 아니라 돼지, 말, 가금류 등이 모두 감염될 수 있는 인수공통 감염병으로 1871년에 일본에서 최초로 발생하였으며, 일본 뇌염을 유발하는 바이러스인 일본 뇌염 바이러스는 1934년과 1935년에 각각 이 바이러스에 감염된 원숭이와 사람으로부터 최초로 분리된 것으로 알려져 있다.

일본 뇌염 바이러스는 플라비비리대과(Flaviviridae family)의 하위 분류인 플라비바이러스속(Flavivirus genus)에 해당하는 바이러스이며, 최근들어 비교적 잘 알려진 지카 바이러스(Zika virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus) 및 황열 바이러스(Yellow fever virus) 등이 플라비바이러스에 속한다. 플라비바이러스(Flavivirus)는 모두 공통의 구조를 가지고 있다. 플라비바이러스의 외형은 구형(Spherical)으로 전자현미경을 통해 관찰이 가능하며 직경은 40~65 nm 이다. 플라비바이러스는 양성의 단일가닥 RNA 바이러스(Positive-sense single-stranded RNA virus, (+)ssRNA virus)이며, 유전체는 약 11,000개 내외의 염기(Base)로 구성되어 있다. 이 유전체는 정이십면체형의 캡시드단백질(Icosahedral-like nucleocapsid protein)로 둘러싸여 있으며, 캡시드 단백질을 외피단백질(Envelope protein)이 둘러싸고 있는 구조로 형성되어 있다. 플라비바이러스의 유전체는 3종의 구조단백질(Structural proteins)과 7종의 비구조단백질(Non-structural proteins)을 포함하여 총 10종의 단백질을 암호화하고 있는 것으로 알려져 있다. 구조단백질 3종에는 캡시드단백질(Capsid protein, C), 막단백질(Membrane protein, M) 및 외피단백질(Envelope protein, E)이 있고, 비구조단백질 7종에는 비구조단백질 1(Non-structural protein 1, NS1), 비구조단백질 2A(NS2A), 비구조단백질 2B(NS2B), 비구조단백질 3(NS3), 비구조단백질 4A(NS4A), 비구조단백질 4B(NS4B) 및 비구조단백질 5(NS5)가 있다.

일본 뇌염은 다른 바이러스들이 유발하는 뇌염에 비해 사망률이 매우 높고, 일본 뇌염으로부터 생존한다 하더라도 이 중의 30~50%는 신경계 합병증을 남기는 것으로 알려져 있다. 일본 뇌염은 7일에서 14일의 잠복기를 거쳐 나타나는 것으로 알려져 있으며, 고열, 두통, 현기증, 구토, 복통 등의 증상을 보이며, 급성 뇌염이나 무균성 수막염 등을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 심한 경우에는 의식장애나 경련, 혼수 등의 증상을 보이는 것으로도 알려져 있으며, 일본 뇌염을 예방하기 위한 백신 외에는 일본 뇌염 바이러스에 특화된 항바이러스제나 치료제가 없기 때문에, 현재 상황에서는 일본 뇌염 바이러스에 감염되지 않는 것이 최선이라고 할 수 있다.

현재 식품의약품안전처의 승인을 받아 병원이나 보건소에서 예방접종이 가능한 일본 뇌염 백신으로는 약독화 생백신(Live attenuated vaccine)과 불활성화 사백신(Inactivated vaccine)이 있으며, 균주(Strains)로는 Nakayama 균주와 SA14-14-2 균주가 주로 이용되고 있다. 일본 뇌염은 효과적인 백신들이 존재함에도 불구하고 사망자가 지속적으로 발생해 왔으며, 세계보건기구 및 각 국가의 보건 기관으로부터 매년 일본 뇌염 경계주의보가 발령되고 있는 상황이다. 또한 같은 플라비바이러스속(Flavivirus genus)에 해당하는 지카 바이러스나 뎅기 바이러스 관련 연구와 비교했을 때, 일본 뇌염 바이러스에 대한 이해가 많이 부족한 상황이며, 일본 뇌염 바이러스는 향후 대유행 가능성이 높은 고위험군 병원체(High risk pathogen)이기 때문에 특히 이에 대한 대비가 필요하다.

일본 뇌염 바이러스에 대한 연구 및 백신 개발 연구는 일본 뇌염 바이러스를 구성하는 10종의 단백질 가운데, 숙주(Host)와의 상호작용 및 감염에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 외피단백질(E protein)에 대한 연구가 주로 진행되었고, 외피단백질의 구조와 기능을 밝히는 연구가 비교적 활발하게 이루어졌다.

한편, 2015년 지카 바이러스가 브라질을 시작으로 전 세계에서 대유행하면서, 기존에 알려지지 않았던 바이러스의 인체에 대한 치명적인 병증이 새롭게 밝혀짐에 따라 플라비바이러스가 많은 주목을 받게 되었다. 이러한 과정에서 기존에 많이 연구되던 플라비바이러스의 외피단백질 뿐만 아니라, 다른 종류의 단백질에 대한 연구가 많이 증가되었으며, 특히 비구조단백질에 해당하는 비구조단백질 1이 플라비바이러스의 복제(Viral replication), 숙주의 면역감시 회피(Immune evasion), 혈관누수(Vascular leakage) 등에 관여한다고 밝혀짐에 따라 비구조단백질 1에 대한 관심이 증가하고 있는 상황이다.

비구조단백질 1에 대한 연구를 위해 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 비롯한 여러 바이러스 단백질을 포유류세포(Mammalian cell)나 곤충세포(Insect cell)와 같은 동물세포 및 효모(Yeast)나 세균(Bacteria)과 같은 미생물 세포로부터 발현시키고 분리 및 정제하기 위한 연구가 시도되고 있으나, 아직까지 비구조단백질 1에 대한 기능이 완벽하게 밝혀지지는 않은 상황이다.

이는 지금까지 사용되고 있는 비구조단백질 1의 발현 및 정제 방법들이 단백질이 기능성이 없는 불용성 형태(Insoluble form) 또는 봉입체(Inclusion body)로 발현되고 있다는 문제가 있다. 또한 비구조단백질 1의 정제 수율이 매우 낮다는 문제가 있어 높은 순도로 많은 양의 비구조단백질 1을 수득하기에는 한계가 있다.

따라서 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 고순도로 대량 생산할 수 있는 새로운 기술의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-0731629호

따라서 본 발명의 목적은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자의 도입을 통해 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 과발현시키는 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 유효성분으로 포함하는, 일본 뇌염 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 유효성분으로 포함하는, 일본 뇌염 바이러스에 대한 면역 반응 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 유효성분으로 포함하는, 일본 뇌염 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 일본 뇌염 바이러스 진단용 조성물을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 진단 키트를 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 이용한 항원-항체 반응을 통해 일본 뇌염 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 대장균은 수탁번호 KCTC 13990BP의 균주일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 발현벡터의 제작을 위한 기본벡터는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 분리 또는 정제를 위한 폴리히스티딘 태그(Polyhistidine Tag(His·Tag))가 포함된 벡터일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 발현벡터의 제작을 위한 기본벡터는 pET-21a(+), pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-19b, pET-20b(+), pET-21b(+), pET-21c(+), pET-21d(+), pET-22b(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-23c(+), pET-23d(+), pET-24a(+), pET-24b(+), pET-24c(+), pET-24d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-29a(+), pET-29b(+), pET-29c(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-32b(+), pET-32c(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-41c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a(+), pET-42b(+), pET-42c(+), pET-43.1a(+), pET-43.1b(+), pET-43.1c(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-28a(+), pET-28b(+), pET-28c(+), pET-30a(+), pET-30b(+), pET-30c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET-33b(+), pET-44a(+), pET-44b(+) 및 pET-44c(+)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 도 1a의 개열지도를 갖는 pET-21a(+)-JEV NS1 벡터일 수 있다.

또한 본 발명은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자의 도입을 통해 형질전환된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 과발현시키는 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 배양하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계를 포함하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균은 수탁번호 KCTC 13990BP의 균주일 수 있다.

또한 본 발명은, (1) 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 형질전환시키는 단계; (2) 상기 (1) 단계에 의해 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 배양하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 과발현을 유도하는 단계; (3) 상기 (2) 단계의 과발현이 유도된 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 배양물로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 정제하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계에서 정제된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 투석 처리하는 단계를 포함하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계에서 재조합 발현벡터의 제작을 위한 기본벡터는 pET-21a(+), pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-19b, pET-20b(+), pET-21b(+), pET-21c(+), pET-21d(+), pET-22b(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-23c(+), pET-23d(+), pET-24a(+), pET-24b(+), pET-24c(+), pET-24d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-29a(+), pET-29b(+), pET-29c(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-32b(+), pET-32c(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-41c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a(+), pET-42b(+), pET-42c(+), pET-43.1a(+), pET-43.1b(+), pET-43.1c(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-28a(+), pET-28b(+), pET-28c(+), pET-30a(+), pET-30b(+), pET-30c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET-33b(+), pET-44a(+), pET-44b(+) 및 pET-44c(+)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 재조합 발현벡터는 도 1a의 개열지도를 갖는 pET-21a(+)-JEV NS1 벡터일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (2) 단계의 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균은 수탁번호 KCTC 13990BP의 균주일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (2) 단계의 과발현을 유도하는 것은 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 0.05 mM ~ 1.0 mM의 농도로 배양액에 처리하고 18℃ ~ 24℃의 온도에서 12 시간 ~ 20 시간 동안 배양하여 수행하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계에서 배양물은 과발현이 유도된 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 배양물을 원심분리하여 수득한 펠렛(Pellet) 분획물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펠렛 분획물은 GdnHCl(Guanidine hydrochloride) 용액으로 가용화(Solubilization)시키고 원심분리하여 수득한 상층액(Supernatant)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계의 정제는 친화성 크로마토그래피를 이용하되, (i) 컬럼에 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 배양물로부터 획득한 대장균 파쇄액을 로딩하는 단계; (ii) 상기 컬럼에 5 M ~ 8 M Urea를 함유한 세척버퍼로 세척하는 단계; 및 (iii) 상기 컬럼에 2 M ~ 4 M Urea를 함유한 용출버퍼로 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 용출시키는 단계로 수행할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (4) 단계의 투석 처리는, (i) 정제된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 함유한 용출액을 1 M ~ 2 M Urea 및 200 ~ 300 mM Imidazole이 함유된 1차 투석용액으로 1차 투석 처리하고; (ii) 상기 1 차 투석 처리된 용액을 0.3 M ~ 0.7 M Urea 및 50 mM ~ 150 mM Imidazole이 함유된 2차 투석용액으로 2차 투석 처리하고; 및 (iii) 상기 2 차 투석 처리된 용액을 5 mM ~ 200 mM Tris-HCl 및 0 mM ~ 10 mM Imidzaole이 함유된 3 차 투석용액으로 3차 투석 처리하여 상기 용출액에 함유된 우레아(Urea)를 완전히 제거하는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 유효성분으로 포함하는, 일본 뇌염 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물에 추가로 아쥬반트(Adjuvant)를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 유효성분으로 포함하는, 일본 뇌염 바이러스에 대한 면역 반응 유도용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 유효성분으로 포함하는, 일본 뇌염 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 일본 뇌염 진단용 조성물을 포함하는 일본 뇌염 진단 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 이용한 항원-항체 반응을 통해 일본 뇌염 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 과발현시킬 수 있도록 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균은 포유류 세포나 곤충 세포와 같은 고등생물의 세포를 이용하지 않고 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 쉽고 저렴하게 고순도로 대량 생산할 수 있으며, 본 발명의 방법으로 생산된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1은 안정한 상태로 면역원성을 유지하고 있어 일본 뇌염 백신 조성물, 일본 뇌염 진단용 조성물, 진단 키트 및 일본 뇌염 바이러스 검출방법 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)의 생산을 위한 재조합 플라스미드 DNA(Plasmid DNA) 제작과정에 대한 모식도이다.
도 1b는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)을 암호화하는 유전자가 포함된 재조합 플라스미드 DNA(Plasmid DNA) 제작에 사용한 벡터들을 제한효소(Restriction enzymes)로 처리 후, 아가로스 겔 전기영동(Agarose gel electrophoresis)을 수행한 결과에 대한 사진이다.
도 1c는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)을 암호화하는 유전자가 포함된 재조합 플라스미드 DNA(Plasmid DNA) 제작 후, 이를 확인하기 위해 제한효소(Restriction enzymes)를 처리한 다음 아가로스 겔 전기영동(Agarose gel electrophoresis)을 수행한 결과에 대한 사진이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 제조한 형질전환된 대장균에 IPTG 유도(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside induction)를 수행한 뒤, 시간에 따른 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)의 과발현(Overexpression) 양상을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis) 수행 후, 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색방법으로 확인한 결과에 대한 사진이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 제조한 형질전환된 대장균으로부터 발현된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)의 용해도(Solubility) 확인 및 봉입체(Inclusion body) 형태의 비구조단백질 1(JEV NS1)의 분리정제를 위한 펠렛 세척과정(Pellet washing)에 대해 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis) 수행 후, 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색방법으로 확인한 결과에 대한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 봉입체(Inclusion body)의 변성(Denaturation), 가용화(Solubilization) 및 재접힘(Refolding) 과정을 거친 일본 뇌염 바이러스의 비구조단백질 1(JEV NS1)의 순수 분리정제를 위한 친화 크로마토그래피(Affinity chromatography) 과정에서, 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)의 각 용출(Elution) 분획물에 대해 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis) 수행 후, 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색방법으로 확인한 결과에 대한 사진이다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 고순도로 분리정제된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis) 수행 후, 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색방법으로 확인한 결과에 대한 사진이다.
도 6은 본 발명에서 분리정제한 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)을 주입하여 면역화된 마우스의 혈액을 이용한 웨스턴 블롯(Western blot) 결과에 대한 사진이다.
도 7은 본 발명에서 분리정제한 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)로 면역화된 마우스의 혈액에서 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1에 대한 항체의 존재를 확인하기 위해 효소면역흡착검사(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 및 흡광도 측정을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대장균을 이용하여 고순도로 대량 생산할 수 있는 방법을 개발한 점에 특징이 있다.

특히 본 발명은 비용이 많이 들고 오랜 시간이 소요되는 포유류 세포나 곤충세포와 같은 고등생물의 세포가 아닌 상대적으로 비용이 저렴하고 다루기가 용이한 대장균을 이용하여, 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 과발현시킬 수 있는 형질전환된 대장균을 제공한다는 점에 특징이 있으며, 상기 형질전환된 대장균으로부터 면역원성 활성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 고순도로 대량 생산할 수 있는 최적의 생산 조건을 제공한다는 점에 특징이 있다.

본 발명자들은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 높은 순도로 대량 생산하기 위해 대장균(Escherichia coli ; E. coli )을 이용하였는데, 대장균은 세포의 빠른 성장, 조작의 용이성, 상대적으로 저렴한 비용 및 높은 수득율 등과 같은 다양한 장점으로 인해 다른 세포 시스템보다 가장 널리 이용되고 있다. 또한 숙주세포의 엔지니어링(Engineering), 벡터의 설계(Vector design) 및 배양조건의 최적화 등이 다른 세포 시스템보다 용이하다는 점도 대장균이 가장 널리 이용되고 있는 이유라고 할 수 있다. 그러나 대장균은 고등 생명체가 가지고 있는 단백질 접힘(Protein folding) 및 전사 후 수식(Post-translational modification) 등과 같은 시스템을 가지고 있지 않기에, 바이러스의 외피단백질이나 비구조단백질과 같은 당단백질(Glycoprotein)에 해당하는 관련 단백질을 발현시킬 경우, 단백질이 기능이 없는 불용성 형태(Insoluble form) 또는 봉입체(Inclusion body)로 발현될 수 있어 단백질 고유의 활성을 갖는 목적 단백질을 고순도로 대량 정제하기 어렵다.

따라서 현재 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1은 포유류 세포, 곤충세포 또는 효모를 이용하여 수득하거나, 대장균으로부터 제기능을 수행할 수 없는 비용해성 응집체 형태로 수득하여 사용하고 있다.

이러한 점에서 본 발명은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 발현할 수 있는 형질전환된 대장균의 제작을 통해, 대장균에서 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 과발현시킬 수 있는 최적의 특정 대장균을 스크리닝(Screening)하였고, 상기 대장균으로부터 단백질의 활성을 유지한 채 고수율로 분리 및 정제할 수 있는 방법을 규명하였다.

이와 관련하여, 본 발명자들은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 유전자를 각각 다른 종류의 대장균에 도입 후, 단백질의 과발현을 유도한 다음, 당업계에 공지된 크로마토그래피 방법을 이용하여 단백질을 분리 및 정제한 후, 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 수율 및 활성을 조사하였는데, 그 결과 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균 균주를 이용한 실험군이 BL21 및 BL21(DE3) 대장균 균주(Strain)를 이용한 실험군에 비해 제조된 단백질의 수율 및 순도가 더 높은 것으로 나타났으며, 면역원성을 갖는 것으로 나타났다.

따라서 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 대장균을 이용하여 고수율 및 고순도로 생산하기 위해서는 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 사용함이 중요하다는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 제공할 수 있다.

본 발명자들은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 안정적으로 과발현시킬 수 있는 상기 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 ‘E. coli JEV’로 명명하였고, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures; KCTC)에 2019년 10월 11일에 기탁하여, 수탁번호 KCTC 13990BP를 부여받았다.

본 발명의 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균에서 과발현시켜 수득하고자 하는 상기 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 폴리펩티드와 기능적 동등물도 모두 포함될 수 있다.

상기 ‘기능적 동등물’이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80％ 이상의, 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 서열번호 1의 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.

상기 본 발명의 재조합 발현벡터에 포함되는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)의 유전자는 상기 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 ‘벡터(Vector)’는 클론 유전자 또는 목적 유전자를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.

상기 ‘발현벡터’는 목적하는 유전자 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 함께 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비 형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 암피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 테트라사이클린(Tetracyclin), 젠타마이신(Gentamicin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자를 포함하고 있으며, 상기 유전자를 대장균에 도입시키고 발현시킬 수 있는 벡터라면 모두 사용 가능하다.

본 발명의 재조합 발현벡터의 제작을 위해 사용할 수 있는 기본벡터는 미생물 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터라면 모두 사용 가능하고, 또한 상기 벡터 내에 폴리히스티딘 태그(Polyhistidine Tag(His·Tag))를 포함하고 있는 벡터도 사용할 수 있으며, 목적 유전자가 단백질로 번역(Translation)되었을 때, His·Tag이 N-말단과 C-말단 중 어느 한 말단에 위치하거나, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽 모두에 위치할 수 있는 벡터도 사용할 수 있다. 또한 상기 폴리히스티딘 태그는 복수의 히스티딘 잔기를 암호화하는 염기서열일 수 있고, 바람직하게는 3개 내지 12개의 폴리히스티딘 잔기를 암호화하는 염기서열일 수 있으며, 더 바람직하게는 6개의 폴리히스티딘 잔기(6× His·Tag)를 암호화하는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 재조합 발현벡터의 제작을 위해 사용 가능한 기본벡터로는 이에 제한되지는 않으나, pET-21a(+), pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-19b, pET-20b(+), pET-21b(+), pET-21c(+), pET-21d(+), pET-22b(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-23c(+), pET-23d(+), pET-24a(+), pET-24b(+), pET-24c(+), pET-24d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-29a(+), pET-29b(+), pET-29c(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-32b(+), pET-32c(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-41c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a(+), pET-42b(+), pET-42c(+), pET-43.1a(+), pET-43.1b(+), pET-43.1c(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-28a(+), pET-28b(+), pET-28c(+), pET-30a(+), pET-30b(+), pET-30c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET-33b(+), pET-44a(+), pET-44b(+) 또는 pET-44c(+)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 pET-21a(+)을 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, pUC-JEV NS1 플라스미드 벡터로부터 제한효소를 이용하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 DNA를 수득한 후, 기본벡터로 pET-21a(+) 벡터를 사용하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 DNA가 삽입된 재조합 발현벡터인 pET-21a(+)-JEV NS1 벡터를 제조하였으며, 이의 개열지도를 도 1a에 나타내었다. 이후 상기 제조된 pET-21a(+)-JEV NS1 재조합 발현벡터로 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 형질전환시켜 본 발명에 따른 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균인 ‘E. coli JEV’을 제조하였다.

또한, 본 발명은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 과발현시키는 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 제조방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자의 도입을 통해 상기 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 형질전환시키는 단계를 포함한다.

상기 유전자의 도입은 앞서 기술한 바와 같이, 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 이용하여 상기 대장균을 형질전환시키는 방법으로 수행할 수 있으며, 상기 형질전환 방법은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있고, 이에 제한되지는 않으나, 미세사출법(Microprojectile Bombardment), 전기충격유전자전달법(Electroporation), 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(Microinjection), 리포좀 매개법(Liposome-mediated method) 또는 열충격법(Heat shock)을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 배양하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계를 포함한다.

특히 본 발명에서는 본 발명의 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 활성을 가진 상태로 생산할 수 있는 최적의 생산 조건을 확립하였고, 따라서 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법을 제공할 수 있다.

바람직하게 상기 방법은, (1) 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 형질전환시키는 단계; (2) 상기 (1) 단계에 의해 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 배양하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 과발현을 유도하는 단계; (3) 상기 (2) 단계의 과발현이 유도된 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 배양물로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 정제하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계에서 정제된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 투석 처리하는 단계를 포함한다.

각 단계별 구체적인 방법을 설명하면 다음과 같다.

먼저, (1) 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 형질전환시킨다.

상기 재조합 발현벡터로 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 형질전환시키는 방법은 앞서 기술된 바와 같다.

형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균이 제조되면, 다음으로 (2) 상기 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 배양하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 과발현을 유도한다.

일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 과발현 유도는 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 배양액에 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하여 목적 단백질의 발현을 유도시킨다.

이때 상기 IPTG는 최종 농도가 0.05 mM ~ 1.0 mM가 되도록 배양액에 처리하고, 18℃ ~ 24℃의 온도에서 12 시간 ~ 20 시간 동안 발현 유도를 위한 배양을 진행한다.

한편, IPTG를 0.05 mM 미만의 농도가 되도록 사용할 경우, 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 발현유도가 미비한 문제가 생길 수 있고 반면, 1.0 mM을 초과하여 사용하면 과도한 발현유도로 인해 단백질의 고유 특성에 변성이 초래될 수 있고, 또한 더 높은 농도로 처리한다고 하여도 발현 증가 효과가 미비한 문제가 있다.

또한, 과발현 유도 시, 배양 조건은 18℃ ~ 24℃의 온도에서 12 시간 ~ 20 시간에서 수행할 수 있는데, 18℃ 미만의 온도에서 12 시간 미만의 시간으로 배양하게 되면 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 발현유도가 미비한 문제가 있고, 반면, 24℃를 초과하는 온도에서 20 시간 초과의 시간으로 배양하게 되더라도 발현의 증가 양상을 보이지 않으므로 상기 기술된 온도 및 시간의 범위로 단백질의 과발현을 유도하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예에서는 0.1 mM IPTG로 20℃에서 16 시간 동안 과발현을 유도하였다.

다음으로, (3) 상기 과발현이 유도된 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 배양물로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 정제한다.

본 발명자들은 본 발명의 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균에서 과발현된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 특성을 먼저 확인하고자, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균 파쇄액을 원심분리하여 상층액과 펠렛의 각 분획물로 나누고, 전기영동을 수행한 결과, 본 발명의 형질전환된 로제타 대장균에서 발현된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1은 대부분이 펠렛(Pellet)에 존재하는 것으로 확인되었다.

따라서 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1은 수용성 형태가 아닌 불용성 형태(Insoluble form) 또는 봉입체(Inclusion body)로 발현되고 있음을 알 수 있었다.

그러므로 상기 배양물로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 정제하기 위해서는 상기 단백질이 대부분 포함되어 있는 펠렛(Pellet) 분획물로부터 정제하여야 하며, 이를 위해 상기 펠렛 분획물을 GdnHCl(Guanidine hydrochloride) 용액으로 가용화(Solubilization)시켰고 원심분리하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1이 함유된 상기 펠렛 유래의 상층액을 얻었고, 상층액을 친화성 크로마토그래피를 적용하여 단백질 분리 및 정제과정을 수행하였다.

상기 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제 과정은, 구체적으로 (i) 컬럼에 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 배양물을 로딩하는 단계; (ii) 상기 컬럼에 5 M ~ 8 M Urea를 함유한 세척버퍼로 세척하는 단계; 및 (iii) 상기 컬럼에 2 M ~ 4 M Urea를 함유한 용출버퍼로 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)단백질을 용출시키는 단계로 수행한다.

상기 정제 과정에서, (i) 컬럼에 로딩하는 대장균의 배양물은 앞서 기술한 바와 같이 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균 배양물의 펠렛 분획물에 대한 GdnHCl(Guanidine hydrochloride) 용액으로 가용화시킨 원심분리 상층액이다.

상기 배양물을 컬럼에 로딩한 다음에는 평형버퍼를 컬럼에 흘려주어 컬럼을 평형화시킬 수 있는데, 이때 상기 평형버퍼는 GdnHCl이 함유된 용액을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 6 M GdnHCl(Guanidine hydrochloride), 1 mM β-Mercaptoethanol, 20 mM Tris-HCl, 5 mM Imidazole 및 500 mM NaCl로 구성된 pH 7.4의 평형버퍼를 사용하였다.

일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1이 본 발명의 형질전환된 대장균 내에서 불용성 형태로 발현되기에 가용화를 위해 GdnHCl(Guanidine hydrochloride) 용액을 사용하였으나, GdnHCl 용액은 단백질의 재접힘(Refolding) 및 단백질의 활성에 영향을 줄 수 있다고 알려져 있어, 본 발명에서는 컬럼 로딩 후, GdnHCl 용액을 완전히 제거할 수 있도록 세척버퍼 및 용출버퍼를 사용하여 단백질을 용출 및 정제하였다.

상기 (ii) 단계의 세척은 5 M ~ 8 M Urea를 함유한 세척버퍼(Washing buffer)를 사용할 수 있으며, 세척 과정은 수회 반복 수행할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 세척버퍼로 6 M Urea, 1 mM β-Mercaptoethanol, 20 mM Tris, 20 mM Imidazole 및 500 mM NaCl로 구성된 pH 7.4의 세척버퍼를 사용하였다.

이러한 세척 과정을 통해, 컬럼의 레진과 특이적으로 결합한 본 발명의 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 제외한 다른 비특이적 결합물 및 기타 불순물들을 제거할 수 있다.

상기 (iii) 단계의 용출은 상기 컬럼으로부터 본 발명의 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 분리하는 단계로서, 2 M ~ 4 M Urea를 함유한 용출버퍼를 이용하여 상기 단백질을 컬럼으로부터 용출시킨다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 용출버퍼(Elution buffer)로 3 M Urea, 1 mM β-Mercaptoethanol, 20 mM Tris-HCl, 500 mM Imidazole 및 500 mM NaCl로 구성된 pH 7.4의 용출버퍼를 사용하였다.

이러한 세척과정 및 용출과정을 순차적으로 완료하면, 다음으로 (4) 투석(Dialysis) 과정을 수행한다.

투석 처리는 용출 용액에 함유된 우레아(Urea) 및 β-Mercaptoethanol과 같은 단백질의 재접힘 및 구조적 불안정을 초래할 수 있는 성분들을 완전히 제거하여 정제된 단백질이 고유의 기능을 회복할 수 있도록 3차적원 구조를 재형성하는 과정이다.

본 발명에서는 상기 투석 처리 과정을 3회에 걸쳐 순차적으로 수행하였는데, 구체적으로, (i) 정제된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 함유한 용출액을 1 M ~ 2 M Urea 및 200 mM ~ 300 mM Imidazole이 함유된 1차 투석용액으로 1차 투석 처리하고; (ii) 상기 1 차 투석 처리된 용액을 0.3 M ~ 0.7 M Urea 및 50 mM ~ 150 mM Imidazole이 함유된 2차 투석용액으로 2차 투석 처리하고; 및 (iii) 상기 2 차 투석 처리된 용액을 5 mM ~ 200 mM Tris-HCl 및 0 mM ~ 10 mM Imidzaole이 함유된 3 차 투석용액으로 3차 투석 처리할 수 있다.

상기 1차 투석 및 2차 투석을 거치면서 우레아(Urea)의 농도를 감소시켜가며 제거하였고, 3차 투석용액의 처리로 정제된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 안정화시킬 수 있다.

한편, 종래 불용성 단백질의 정제 및 투석 방법은 최종 용액에 대부분 우레아(Urea)를 포함하고 있어 목적 단백질이 우레아 성분으로 인해 구조의 변성을 가진 형태로 수득되기에 단백질 고유의 기능(활성)을 온전히 발휘할 수 없다는 문제가 있다.

그러나 본 발명에서는 단백질의 기능 및 구조에 영향을 주는 성분들을 모두 제거한 상태로 수득할 수 있으므로, 정제된 단백질의 기능적 활용에 아무런 문제점을 유발하지 않는다.

본 발명의 다른 일실시예에서는, 본 발명의 정제 및 투석 처리 조건을 벗어난 다른 조건에서 단백질 정제를 수행하였는데, 그 결과, 본 발명의 방법에 비해 수득한 단백질의 수율이 낮아지거나 전혀 정제가 되지 않는 문제점이 있었다.

따라서 상기 본 발명의 방법으로만이 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산할 수 있다.

나아가 본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)의 면역원성 여부를 분석하기 위해, 상기 단백질을 마우스의 복강 내로 주입하여 면역화를 수행한 다음, 마우스로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1에 대한 항체가 생성되었는지를 확인한 결과, 상기 단백질이 항원으로 작용하여 마우스 내에서 이에 대한 항체가 생성된 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 제공할 수 있으며, 상기 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 유효성분으로 포함하는 일본 뇌염 백신 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 상기 유효성분 이외에 아쥬반트(Adjuvant)를 포함할 수 있고 약제학적으로 허용되는 담체도 포함할 수 있으며, 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한 본 발명의 백신 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 방법으로 제조된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)은 상기 단백질이 투여된 개체 내에서 항원물질로 작용할 수 있고 이에 대한 항체의 생성을 유도할 수 있어 항원 항체에 의한 면역반응을 유도할 수 있다.

따라서 본 발명의 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)은 면역원성 물질로 작용할 수 있으므로, 본 발명은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역반응 유도용 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 유효성분으로 포함하는 일본 뇌염 진단용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 진단용 조성물은 일본 뇌염을 진단하기 위한 진단 키트의 형태로 제공될 수 있다.

상기 ‘진단’은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 상기 진단은 발병 여부뿐만 아니라 예후, 경과, 병기 등을 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 목적상, 진단은 일본 뇌염을 검출 또는 구별하여 진단하는 것이다.

본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(Flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 미치 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

상기 일본 뇌염 바이러스 진단을 위한 진단 키트는 본 발명의 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 포함할 수 있다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

나아가 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 이용한 항원-항체 반응을 통해 일본 뇌염 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

구체적으로 상기 방법은, 생물학적 시료를 본 발명의 방법으로 제조된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1과 접촉시킨 후, 항원-항체 반응에 의해 항원-항체 복합체가 형성되었는지를 검출하여 일본 뇌염 바이러스를 검출할 수 있고, 나아가 일본 뇌염 바이러스의 감염 여부를 진단할 수 있는 정보를 제공할 수 있다.

상기 생물학적 시료는 이에 제한되지는 않으나, 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 조직파쇄물, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변 등에서 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리 할 수 있으며, 그 예로, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.

상기 항원-항체 복합체 형성여부는 당업계에 공지된 방법에 의해 확인할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 효소면역흡착검사법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 유전자가 도입된 재조합 발현벡터 및 형질전환 대장균의 제조

<1-1> 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 유전자가 도입된 재조합 발현벡터의 제조

본 발명자들은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Japanese encephalitis virus non-structural protein 1, JEV NS1)을 대장균으로부터 높은 순도로 대량 생산하기 위해, 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 암호화하는 DNA 염기서열이 도입된 재조합 발현벡터를 제조하였다. 구체적으로, 서열번호 2로 표기된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 DNA를 플라스미드 벡터(Plasmid vector)의 일종인 pUC 벡터에 삽입하여 pUC-JEV NS1 플라스미드를 제조하였다. 이때 상기 pUC-JEV NS1 플라스미드는 Nde Ⅰ 및 Hind Ⅲ 제한효소(Restriction enzyme)에 의해 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1 DNA의 5' 말단과 3' 말단이 각각 잘리도록 설계되었다.

이후, pUC-JEV NS1 플라스미드 및 단백질 발현(Protein expression)을 위한 플라스미드 벡터(Plasmid vector)의 일종인 pET-21a(+) 벡터를 Nde Ⅰ 및 Hind Ⅲ 제한효소로 처리하여 pUC-JEV NS1 플라스미드 벡터로부터 pET-21a(+) 벡터로 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 암호화하는 JEV NS1 유전자(서열번호 2의 염기서열)가 삽입되도록 클로닝함으로써 재조합 pET-21a(+)-JEV NS1 발현벡터를 제조하였다(도 1a 참조).

여기서 상기 pET-21a(+) 벡터에도 모두 Nde Ⅰ 및 Hind Ⅲ 제한자리(Restriction site)를 갖고 있으며, 상기 제한효소 처리반응은 pUC-JEV NS1 플라스미드 및 pET-21a(+) 플라스미드를 각각 1 ㎍이 되도록 준비한 다음, Nde Ⅰ 및 Hind Ⅲ 제한효소를 각각 20 units (U) 만큼 처리하였으며, 멸균된 증류수와 반응버퍼(Reaction buffer)를 첨가해 각각의 반응물이 최종 50 ㎕가 되도록 한 후, 37℃에서 1시간 동안 진행하였다.

상기 제한효소 처리반응 후, 각 플라스미드의 반응산물은 아가로스 겔 전기영동(Agarose gel electrophoresis)을 수행하였는데, 그 결과, pUC-JEV NS1 플라스미드는 pUC 플라스미드의 크기(길이)인 약 2.7 kb (Kilobase) 부근의 DNA 밴드(DNA band)와 JEV NS1 유전자의 크기(길이)인 약 1.1 kb 부근의 DNA 밴드를 확인할 수 있었다. 또한 상기 pET-21a(+) 플라스미드에 Nde Ⅰ 및 Hind Ⅲ 제한효소를 처리한 반응산물의 경우에는 pET-21a(+)의 크기(길이)인 약 5.4 kb 부근의 단일 DNA 밴드를 확인할 수 있었다(도 1b 참조). 따라서 pUC-JEV NS1 플라스미드 및 pET-21a(+) 플라스미드 모두 제한효소가 인식하는 DNA 염기서열이 제대로 잘렸다는 것을 확인할 수 있었다.

이후 JEV NS1 유전자 (약 1.1 kb) 및 pET-21a(+) (약 5.4 kb) 플라스미드만을 칼(Knife)을 이용하여 아가로스 겔로부터 회수한 다음, 불순물 제거과정을 거쳐 정제하였다. 상기 JEV NS1 유전자와 pET-21a(+) 플라스미드의 연결(Ligation)을 위해 JEV NS1 유전자와 pET-21a(+)의 몰농도 비율(Molar ratio)이 5:1이 되도록 섞어준 다음, T4 DNA 연결효소(Ligase), 멸균된 증류수, 반응버퍼를 첨가해 반응물이 최종 20 ㎕가 되도록 하여 실온에서 15분 동안 반응을 진행하였다.

이러한 과정을 통해 본 발명자들은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)의 유전자가 도입된 본 발명의 pET-21a(+)-JEV NS1 발현벡터를 제조하였고, 상기 발현벡터의 개열지도는 도 1a에 나타내었다.

<1-2> 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 발현하는 형질전환 대장균의 제조

상기 <1-1>에서 제조한 pET-21a(+)-JEV NS1 재조합 발현벡터 2 ㎕를 외부의 DNA를 잘 받아들일 수 있도록 제조된 컴피턴트 대장균(Competent E. coli) 100 ㎕에 첨가하였다. 이 때 이용된 대장균 균주는 Rosetta(DE3) 균주(Strain)를 이용하였다. 당업계에서 목적 단백질의 대장균에서의 발현을 위해 가장 널리 이용되던 BL21(DE3) 대장균 균주에 비해 Rosetta(DE3) 균주는 진핵세포의 단백질(Eukaryotic proteins) 발현에 유리하다는 특징이 있기 때문에, 단백질 합성을 위해 진핵생물(Eukaryotes)을 이용하는 일본 뇌염 바이러스의 단백질을 대장균으로부터 효과적으로 발현하기 위해 사용하였다. 상기 pET-21a(+)-JEV NS1 재조합 발현벡터 DNA와 컴피턴트 Rosetta(DE3) 대장균이 섞일 수 있도록 약하게 섞어준 다음, 얼음(Ice)에서 30분 동안 반응시켰고, 이후 바로 항온기를 이용하여 42℃에서 45초간 반응을 진행한 다음 즉시 다시 얼음에서 2분 동안 반응을 진행하였다. 이후 별도의 항생제(Antibiotics)가 첨가되지 않은 SOC 배지(Super Optimal Broth)를 컴피턴트 대장균이 있는 튜브(Tube)에 500 ㎕ 첨가한 다음, 진탕배양기(Shaking incubator)를 이용하여 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 배양을 마친 대장균은 암피실린(Ampicillin)이 50 ㎍/㎖의 농도로 포함된 LB 아가 플레이트(Luria-Bertani agar plate)에 도말(Spreading)하여 37℃ 항온기에서 16시간 재배양 후, 본 발명의 pET-21a(+)-JEV NS1 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균을 다음과 같은 과정으로 최종 선별하였다.

상기 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 추출 및 정제한 다음, 플라스미드 DNA가 1 ㎍이 되도록 하여 Nde Ⅰ 및 Hind Ⅲ 제한효소를 각각 20 units (U) 만큼 처리하였으며, 멸균된 증류수와 반응버퍼(Reaction buffer)를 첨가해 각각의 반응물이 최종 50 ㎕가 되도록 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응산물을 이용하여 아가로스 겔 전기영동(Agarose gel electrophoresis)을 수행하였고, 제한효소 처리에 의해 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)의 DNA가 삽입되어 있는지를 확인하였다.

그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이 pET-21a(+)의 크기(길이)인 약 5.4 kb 부근의 DNA 밴드와 JEV NS1 유전자의 크기(길이)인 약 1.1 kb 부근의 DNA 밴드를 확인할 수 있었다. 따라서 상기 대장균은 본 발명의 pET-21a(+)-JEV NS1 재조합 발현벡터로 형질전환된 Rosetta(DE3) 대장균임을 확인할 수 있었다.

<실시예 2>

본 발명의 형질전환 대장균을 이용한 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 발현확인

상기 실시예 <1-2>에서 제조된 본 발명의 형질전환 대장균에서 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(JEV NS1)이 발현되는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 본 발명의 pET-21a(+)-JEV NS1 재조합 발현벡터로 형질전환된 Rosetta(DE3) 대장균을 암피실린(Ampicillin)이 50 ㎍/㎖의 농도로 포함된 LB 배지(LB broth)에서 진탕배양기를 이용하여 200 rpm으로 37℃에서 배양하였으며, 600 nm에서의 흡광도(OD600)가 0.6 ~ 0.8의 값이 되도록 배양하였다. 이후 0.1 mM 농도의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하여 20℃에서 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 과발현(Overexpression)을 유도(Induction)하였고 시간에 따른 단백질의 과발현 양상을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis)을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3.5 시간, 6 시간 동안 IPTG로 단백질 발현을 유도한 경우에 비해, 16 시간 동안 IPTG로 단백질 발현을 유도하였을 때, 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 발현양이 가장 많은 것을 확인할 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 통해, 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 최적의 발현을 유도할 수 있는 조건은, 형질전환된 본 발명의 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 50 ㎍/㎖ 농도의 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 배지 2 L에서 진탕배양기를 이용하여 200 rpm 및 37℃에서 OD600 값이 0.6 ~ 0.8이 되도록 배양 후, 0.1 mM 농도가 되도록 LB 배지에 IPTG를 처리한 다음 진탕배양기를 이용하여 200 rpm 및 20℃에서 16시간 동안 단백질의 발현 유도하는 조건임을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 상기 실험을 통해 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 발현할 수 있도록 형질전환시킨 본 발명의 Rosetta(DE3) 대장균을 ‘E. coli JEV’로 명명하였고, 상기 대장균을 한국생명공학연구원에 2019년 10월 11일에 기탁하여, 수탁번호 KCTC 13990BP를 부여받았다.

<실시예 3>

일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 분리 및 정제

상기 <실시예 2>에서 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 발현을 유도시킨 형질전환된 대장균 배양물을 500 ㎖ 부피의 원심분리용 용기(Bottle)를 이용하여 7,500 rpm의 속도로 4℃에서 45분간 원심분리를 진행하여 상층액(Supernatant)을 제거한 다음, 대장균 펠렛(Pellet)을 회수하였다.

이후 회수된 대장균 펠렛(Pellet)을 1 mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride), 0.1% Lysozyme, 50 mM KH₂PO₄, 5 mM Imidazole 및 500 mM NaCl로 구성된 세포 용해버퍼(Lysis buffer)를 이용하여 완전히 녹여준 다음, 초음파 파쇄기(Sonicator)를 이용하여 대장균을 파쇄하였다. 이후 50 ㎖ 부피의 원심분리용 튜브(Tube)를 이용하여 9,000 rpm의 속도로 4℃에서 30분간 원심분리를 수행하여 상층액(Supernatant)과 펠렛(Pellet)을 각각 회수한 후, 전기영동을 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 형질전환 대장균으로부터 발현된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1은 상층액에는 존재하지 않고 펠렛에 대부분 존재하는 것으로 확인됨에 따라 상기 단백질은 불용성 형태(Insoluble form) 또는 봉입체(Inclusion body)로 발현된 것을 확인할 수 있었다.

따라서 봉입체(Inclusion body)로 발현된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1이 다량 존재하는 펠렛으로부터 불순물의 제거를 위해 펠렛 세척(Pellet washing)을 진행하였다. 펠렛 세척은 2 M Urea, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl로 구성된 pH 7.4의 세척용액을 이용하였으며, 세척용액을 펠렛에 첨가한 다음 초음파 파쇄기를 이용하여 완전히 녹여준 후, 9,000 rpm의 속도로 4℃에서 10분간 원심분리를 진행하였다. 이후 상층액은 제거하고 펠렛(Pellet)을 회수하였으며, 같은 과정을 2회 반복하여, 총 3회의 세척 과정을 수행하였다.

세척 과정을 완료한 후, 회수된 펠렛(Pellet)은 가용화시키는 과정을 수행하였는데, 펠렛의 가용화를 위해 상기 펠렛을 6 M GdnHCl(Guanidine hydrochloride), 1 mM β-Mercaptoethanol, 20 mM Tris-HCl, 5 mM Imidazole 및 500 mM NaCl로 구성된 가용화버퍼(Solubilization buffer)를 이용하여 실온에서 가용화시켰다. 이후 9,000 rpm의 속도로 4℃에서 15분간 원심분리를 진행하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1이 다량 용해되어 있는 상층액(Supernatant)을 전량 회수하였다.

다음으로, 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 순수 분리 및 정제를 위해 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography)를 수행하였는데, 상기 본 발명에서 제조한 형질전환 대장균으로부터 발현된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1은 C-말단에 니켈(Nickel)과 높은 친화도로 결합할 수 있는 폴리히스티딘 택(Polyhistidine tag)이 존재하기 때문에, 친화성 크로마토그래피용 레진(Resin)은 Ni-NTA 아가로스(Nickel-nitriloacetic acid agarose)를 이용하였다. Ni-NTA 아가로스 레진이 충진된 컬럼(Column)에 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1이 다량 용해되어 있는 상층액(Supernatant)을 흘려준 다음, 6 M GdnHCl(Guanidine hydrochloride), 1 mM β-Mercaptoethanol, 20 mM Tris-HCl, 5 mM Imidazole 및 500 mM NaCl로 구성된 pH 7.4의 평형버퍼(Equilibration buffer)와 6 M Urea, 1 mM β-Mercaptoethanol, 20 mM Tris-HCl, 20 mM Imidazole 및 500 mM NaCl로 구성된 pH 7.4의 세척버퍼(Washing buffer)를 순차적으로 충분히 흘려주었다.

이후 컬럼 내의 Ni-NTA 아가로스 레진에 결합되어 있는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 용출(Elution)하기 위해, 3 M Urea, 1 mM β-Mercaptoethanol, 20 mM Tris-HCl, 500 mM Imidazole 및 500 mM NaCl로 구성된 pH 7.4의 용출버퍼(Elution buffer)를 흘려주면서 용출액을 1 ㎖씩 차례대로 회수하였다. 회수된 각 용출액은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 정제 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1은 다른 불순물이 거의 존재하지 않은 채, 고순도(High purity)로 다량 용출된 것을 확인할 수 있었다.

한편, 단백질이 고유의 기능을 온전히 갖기 위해서는 3차원의 단백질 구조를 안정하게 유지할 수 있어야 한다. 상기 본 발명의 방법으로 정제된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1은 용출 과정에서 사용된 시약으로 인해 단백질의 구조가 변성되어 있을 수 있다.

이에 본 발명자들은 용출된 상기 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 재접힘(Refolding)을 유도하고 구조적 불안정에 기여하는 Urea과 β-Mercaptoethanol을 제거하여 상기 단백질의 고유의 3차원적 구조를 갖도록 투석(Dialysis) 과정을 진행하였으며, 단계적으로 다음과 같이 3단계의 투석 과정을 진행하였다.

첫 번째 투석은 1.5 M Urea, 250 mM Imidazole, 300 mM NaCl, 200 mM Sucrose, 1 mM GSH(Reduced glutathione), 0.2 mM GSSG(Oxidized glutathione) 및 0.1% Triton X-100으로 구성된 pH 7.4의 1차 투석용액을 이용하였으며, 두 번째 투석은 0.5 M Urea, 100 mM Imidazole, 300 mM NaCl, 200 mM Sucrose, 1 mM GSH(Reduced glutathione), 0.2 mM GSSG(Oxidized glutathione) 및 0.1% Triton X-100으로 구성된 pH 7.4의 2차 투석용액을 이용하였다. 세 번째 투석은 100 mM Tris-HCl, 5 mM Imidzaole, 300 mM NaCl 및 200 mM Sucrose로 구성된 3차 투석용액을 이용하였으며, 이러한 3차의 투석 과정을 거쳐 고순도의 3차원적 구조가 유지되는 본 발명의 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 회수하였다.

또한, 상기의 과정으로부터 분리 및 정제된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 순도를 확인하기 위해, 2 ㎍의 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 12% 폴리아크릴아미드 겔(Polyacrylamide gel)에 로딩(Loading)하여 전기영동을 수행한 다음 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색 용액을 이용하여 단백질을 염색하였고, 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 본 발명의 재접힙(또는 리폴딩) 과정이 완료된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1은 높은 순도로 정제되었음을 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

본 발명에서 분리 및 정제한 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 면역원성 확인

상기 <실시예 3>에서 분리 및 정제한 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1이 동물 내에서 면역반응을 유도할 수 있는 면역원(Immunogen)으로서 적합한지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 30 ㎍의 정제된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 pH 7.4의 인산완충용액(Phosphate buffered saline, PBS)을 이용하여 250 ㎕가 되도록 희석한 후, 같은 부피의 Complete Freund's Adjuvant와 혼합하여 에멀젼(Emulsion) 형태로 만든 다음, 생후 6주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내로 주사하여 1차 면역화를 수행하였다. 1차 면역화 수행으로부터 2주 후에는 Complete Freund's Adjuvant 대신 Incomplete Freund's Adjuvant를 이용하여 상기와 같은 방법 및 실험조건으로 2차 면역화를 수행하였다. 2차 면역화로부터 2주 후에 마우스의 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 마우스 체내에서 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1이 면역원으로 작용하였는지를 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1에 대한 항체의 생성 여부로 분석하였다.

<4-1> 웨스턴 블롯을 이용한 항체 생성 여부 확인

일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1에 대한 항체의 생성 여부 확인은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 이용한 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 수행하였는데, 100 ng의 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 PVDF 멤브레인(Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane)에 트랜스퍼(Transfer) 하였다. 이후 PVDF 멤브레인을 3% 소 혈청 알부민 및 0.05%의 Tween-20 계면활성제가 포함된 pH 7.4의 인산완충용액으로 1시간 30분 동안 블로킹(Blocking) 하였고, 블로킹 과정 후에는 상기에서 수득한 마우스의 혈액을 1:10,000의 비율로 상기 블로킹 버퍼로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 0.05%의 Tween-20 계면활성제가 포함된 pH 7.4의 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 이후 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP) 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG(Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 1:5,000의 비율로 0.05%의 Tween-20 계면활성제가 포함된 pH 7.4의 인산완충용액으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 같은 방법으로 3회 세척하였다. 이후 PVDF 멤브레인에 ECL(Enhanced chemiluminescence) 용액을 뿌려준 다음, 암실(Dark room)에서 화학발광반응(Chemiluminescent reaction)을 필름에 감광한 다음 현상을 진행하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 분리 및 정제한 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1로 면역화된 마우스의 혈액 내에 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1과 특이적으로 결합하는 항체가 존재한다는 것을 확인할 수 있었고 이로 인해 본 발명의 방법으로 분리 및 정제한 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1에 의한 면역반응이 일어났음을 알 수 있었다.

<4-2> 효소면역흡착검사를 이용한 항체 생성 여부 확인

효소면역흡착검사(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 방식으로도 마우스 혈액 내에 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1에 대한 항체의 존재 유무를 분석하였다. 이를 위해 다중 웰(Multi-well)의 이뮤노플레이트(Immunoplate) 웰 각각에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켜 코팅하였다. 그 다음 0.1%의 Tween-20 계면활성제를 포함하고 있는 pH 7.4의 인산완충용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척하였다. 다음으로 블로킹(Blocking)을 위해 1%의 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA) 및 0.1%의 Tween-20 계면활성제를 포함하고 있는 pH 7.4의 인산완충용액을 각각의 웰에 200 ㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, 0.1%의 Tween-20 계면활성제를 포함하고 있는 pH 7.4의 인산완충용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척하였다. 이후 각각의 웰에 1/10², 1/10³, 1/10⁴ 만큼 각각 희석된 마우스 혈액 100 ㎕씩을 각각의 웰(well)에 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 0.1%의 Tween-20 계면활성제를 포함하고 있는 pH 7.4의 인산완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 이후 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP) 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG(Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액 100 ㎕를 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 마지막으로 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H₂SO₄ 용액을 100 ㎕씩 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시킨 다음, 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 희석된 마우스 혈액 대신 인산완충용액만을 처리한 대조군(Control)과 비교했을 때, 마우스의 혈액 내에는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1과 결합할 수 있는 항체가 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

이상의 실험결과를 통해 본 발명자들은 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 발현하는 본 발명의 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 이용할 경우, 면역원성을 갖는 다량의 고순도 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 용해된 상태로 저렴하게 생산할 수 있으므로, 일본 뇌염의 진단, 예방 또는 치료를 위한 용도에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC13990BP

20191011

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Transformed Escherichia coli strain for expressing Japanese encephalitis virus non-structural protein 1, method for separating and purifying Japanese encephalitis virus non-structural protein 1 from the strain and use thereof <130> NPDC81741 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Japanese encephalitis non-structural protein 1 amino acid sequence <400> 1 Met Asp Thr Gly Cys Ala Ile Asp Ile Thr Arg Lys Glu Met Arg Cys 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ile Phe Val His Asn Asp Val Glu Ala Trp Val Asp Arg 20 25 30 Tyr Lys Tyr Leu Pro Glu Thr Pro Arg Ser Leu Ala Lys Ile Val His 35 40 45 Lys Ala His Lys Glu Gly Val Cys Gly Val Arg Ser Val Thr Arg Leu 50 55 60 Glu His Gln Met Trp Glu Ala Val Arg Asp Glu Leu Asn Val Leu Leu 65 70 75 80 Lys Glu Asn Ala Val Asp Leu Ser Val Val Val Asn Lys Pro Val Gly 85 90 95 Arg Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr Gln Glu Lys Phe 100 105 110 Glu Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Ile Leu Phe Ala Pro Glu 115 120 125 Leu Ala Asn Ser Thr Phe Val Val Asp Gly Pro Glu Thr Lys Glu Cys 130 135 140 Pro Asp Glu His Arg Ala Trp Asn Ser Met Gln Ile Glu Asp Phe Gly 145 150 155 160 Phe Gly Ile Thr Ser Thr Arg Val Trp Leu Lys Ile Arg Glu Glu Ser 165 170 175 Thr Asp Glu Cys Asp Gly Ala Ile Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly His 180 185 190 Val Ala Val His Ser Asp Leu Ser Tyr Trp Ile Glu Ser Arg Tyr Asn 195 200 205 Asp Thr Trp Lys Leu Glu Arg Ala Val Phe Gly Glu Val Lys Ser Cys 210 215 220 Thr Trp Pro Glu Thr His Thr Leu Trp Gly Asp Asp Val Glu Glu Ser 225 230 235 240 Glu Leu Ile Ile Pro His Thr Ile Ala Gly Pro Lys Ser Lys His Asn 245 250 255 Arg Arg Glu Gly Tyr Lys Thr Gln Asn Gln Gly Pro Trp Asp Glu Asn 260 265 270 Gly Ile Val Leu Asp Phe Asp Tyr Cys Pro Gly Thr Lys Val Thr Ile 275 280 285 Thr Glu Asp Cys Ser Lys Arg Gly Pro Ser Val Arg Thr Thr Thr Asp 290 295 300 Ser Gly Lys Leu Ile Thr Asp Trp Cys Cys Arg Ser Cys Ser Leu Pro 305 310 315 320 Pro Leu Arg Phe Arg Thr Glu Asn Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile 325 330 335 Arg Pro Val Met His Asp Glu Thr Thr Leu Val Arg Ser Gln Val Asp 340 345 350 Ala <210> 2 <211> 1059 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Japanese encephalitis non-structural protein 1 DNA sequence <400> 2 atggacactg gttgtgcaat tgacattacg cgcaaagaaa tgcgctgtgg ctcaggaatt 60 ttcgtacaca acgacgtcga agcgtgggtc gatagatata agtatctgcc cgagacccct 120 agaagccttg caaaaattgt gcacaaagca cataaggaag gagtttgtgg tgtacgctca 180 gttacacggc ttgagcacca gatgtgggaa gcagtacgtg atgaacttaa tgtgttactt 240 aaagaaaatg ctgttgattt atccgtcgtt gtaaacaaac cagtgggacg ctatcgttcc 300 gcacccaaac gtctgagtat gacccaggag aaattcgaga tgggctggaa ggcttgggga 360 aaaagtatat tatttgcacc tgagttggcg aattcgacat tcgtcgtgga tggcccagag 420 acaaaagaat gtcccgatga acaccgcgcg tggaactcga tgcaaatcga ggacttcggg 480 tttggtatca cgtcaacacg cgtatggctg aaaatccgtg aggaatcgac agacgagtgc 540 gacggggcaa ttataggaac ggcggttaaa ggccacgtcg ctgtgcattc ggatctttca 600 tattggatcg aatctcgtta taatgatact tggaaactgg agcgtgcagt atttggggag 660 gtgaagagtt gtacttggcc cgaaacacac acgttgtggg gtgacgatgt cgaggagtcg 720 gaattgatca tcccccatac tatagctggc cctaagtcaa agcataacag acgtgaggga 780 tataaaactc agaaccaggg tccctgggac gagaatggca ttgtcttaga ttttgattac 840 tgtcccggca ccaaggttac tattaccgaa gattgttcaa aacggggccc gagcgtacgg 900 accactaccg atagtggcaa attaatcact gattggtgct gtcgctcttg ctcccttcca 960 ccattgagat tccgcacaga gaacggctgt tggtatggca tggaaatcag acctgtgatg 1020 cacgatgaga caacccttgt gcgctcgcag gtagacgcc 1059

Claims

일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균.
제1항에 있어서,
상기 대장균은 수탁번호 KCTC 13990BP의 균주인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균.
제1항에 있어서,
상기 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균.
제1항에 있어서,
상기 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균.
제1항에 있어서,
상기 재조합 발현벡터의 제작을 위한 기본벡터는 pET-21a(+), pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-19b, pET-20b(+), pET-21b(+), pET-21c(+), pET-21d(+), pET-22b(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-23c(+), pET-23d(+), pET-24a(+), pET-24b(+), pET-24c(+), pET-24d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-29a(+), pET-29b(+), pET-29c(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-32b(+), pET-32c(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-41c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a(+), pET-42b(+), pET-42c(+), pET-43.1a(+), pET-43.1b(+), pET-43.1c(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-28a(+), pET-28b(+), pET-28c(+), pET-30a(+), pET-30b(+), pET-30c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET-33b(+), pET-44a(+), pET-44b(+) 및 pET-44c(+)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균.
제1항에 있어서,
상기 재조합 발현벡터는 도 1a의 개열지도를 갖는 pET-21a(+)- JEV NS1 벡터인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균.
일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자의 도입을 통해 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 과발현시키는 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 제조방법.
제1항의 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 배양하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계를 포함하는,
형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균은 수탁번호 KCTC 13990BP의 균주인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
(1) 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 형질전환시키는 단계;
(2) 상기 (1) 단계에 의해 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균을 배양하여 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 과발현을 유도하는 단계;
(3) 상기 (2) 단계의 과발현이 유도된 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 배양물로부터 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 정제하는 단계; 및
(4) 상기 (3) 단계에서 정제된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 투석 처리하는 단계를 포함하는,
형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 (1) 단계에서 재조합 발현벡터의 제작을 위한 기본벡터는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1의 분리 또는 정제를 위한 폴리히스티딘 태그(Polyhistidine Tag(His·Tag))가 포함된 벡터인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 (1) 단계에서 재조합 발현벡터의 제작을 위한 기본벡터는 pET-21a(+), pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-19b, pET-20b(+), pET-21b(+), pET-21c(+), pET-21d(+), pET-22b(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-23c(+), pET-23d(+), pET-24a(+), pET-24b(+), pET-24c(+), pET-24d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-29a(+), pET-29b(+), pET-29c(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-32b(+), pET-32c(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-41c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a(+), pET-42b(+), pET-42c(+), pET-43.1a(+), pET-43.1b(+), pET-43.1c(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-28a(+), pET-28b(+), pET-28c(+), pET-30a(+), pET-30b(+), pET-30c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET-33b(+), pET-44a(+), pET-44b(+) 및 pET-44c(+)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 (1) 단계의 재조합 발현벡터는 도 1a의 개열지도를 갖는 pET-21a(+)- JEV NS1 벡터인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 (1) 단계의 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 (2) 단계의 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균은 수탁번호 KCTC 13990BP의 균주인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 (2) 단계의 과발현을 유도하는 것은 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 0.05 mM ~ 1.0 mM의 농도로 배양액에 처리하고 18℃ ~ 24℃의 온도에서 12 시간 ~ 20 시간 동안 배양하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 (3) 단계에서 배양물은 과발현이 유도된 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3))대장균의 배양물을 원심분리하여 수득한 펠렛(Pellet) 분획물인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제17항에 있어서,
상기 펠렛 분획물은 GdnHCl(Guanidine hydrochloride) 용액으로 가용화(Solubilization)시키고 원심분리하여 수득한 상층액(Supernatant)인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 (3) 단계의 정제는 친화성 크로마토그래피를 이용하되,
(i) 컬럼에 형질전환 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균의 배양물로부터 획득한 대장균 파쇄액을 로딩하는 단계;
(ii) 상기 컬럼에 5 M ~ 8 M Urea를 함유한 세척버퍼로 세척하는 단계; 및
(iii) 상기 컬럼에 2 M ~ 4 M Urea를 함유한 용출버퍼로 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)단백질을 용출시키는 단계;로 수행하는 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 (4) 단계의 투석 처리는,
(i) 정제된 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1을 함유한 용출액을 1 M ~ 2 M Urea 및 200 mM ~ 300 mM Imidazole이 함유된 1차 투석용액으로 1차 투석 처리하고;
(ii) 상기 1 차 투석 처리된 용액을 0.3 M ~ 0.7 M Urea 및 50 mM ~ 150 mM Imidazole이 함유된 2차 투석용액으로 2차 투석 처리하고; 및
(iii) 상기 2 차 투석 처리된 용액을 5 mM ~ 200 mM Tris-HCl 및 0 mM ~ 10 mM Imidzaole이 함유된 3 차 투석용액으로 3차 투석 처리하여 상기 용출액에 함유된 우레아(Urea)를 완전히 제거하는 것을 특징으로 하는, 형질전환된 로제타(Rosetta(DE3)) 대장균으로부터 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 대량 생산하는 방법.
제8항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1).
제21항의 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 유효성분으로 포함하는, 일본 뇌염 백신 조성물.
제22항에 있어서,
상기 조성물에 추가로 아쥬반트(Adjuvant)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 일본 뇌염 백신 조성물.
제21항의 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 유효성분으로 포함하는, 일본 뇌염 바이러스에 대한 면역 반응 유도용 조성물.
제21항의 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 유효성분으로 포함하는, 일본 뇌염 진단용 조성물.
제25항의 조성물을 포함하는 일본 뇌염 진단 키트.
제21항의 면역원성을 갖는 일본 뇌염 바이러스 비구조단백질 1(Non-structural protein 1; JEV NS1)을 이용한 항원-항체 반응을 통해 일본 뇌염 바이러스를 검출하는 방법.