MX2007011667A - Vacunas y antibioticos en contra de nematodos parasitos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una vacuna capaz de proporcionar inmunoproteccion contra Dictyocaulus viviparus en ganado bovino, y el uso de la vacuna para producir anticuerpos especificos contra Dictyocaulus viviparus. La vacuna proporciona la ventaja de promover una reaccion inmune contra las larvas inhibidas y no inhibidas de Dictyocaulus viviparus y esta caracterizada por comprender epitopos obtenibles de PNMT (fenil-etanolamina-N-metiltransferasa) de Dictyocaulus viviparus. En un aspecto adicional, la presente invencion tambien proporciona el anticuerpo especifico para dicha vacuna.

Description

VACUNA Y ANTIBIÓTICOS EN CONTRA DE NEMATODOS PARÁSITOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a una vacuna contra los nemátodos parásitos del género Strongylida , especialmente al Dictyocaulus spp . , preferentemente al Dictyocaulus filaría, Dictyocaulus arnfieldi , Dictyocaulus capreolus, Di ctyocaulus cameli , Dictyocaulus africanus, y más preferentemente al Dictyocaulus viviparus . Para los propósitos de la presente invención la referencia a Dictyocaulus spp . incluye las especies antes mencionadas. Además la invención se relaciona al uso de péptidos antigénicos para los propósitos analíticos y de diagnóstico para detectar una infección por nemátodos parásitos del género Strongylida , especialmente por Dictyocaulus spp. y dar un metido para proveer inmuno-protección en contra de los nemátodos parásitos del género Strongylida , especialmente Dictyocaulus spp. Además, la presente invención se relaciona con un proceso para producir una vacuna apropiada para dar inmunidad en contra de infecciones por nemátodos parásitos del género Strongylida , especialmente por Dictyocaulus spp . , como también antibióticos, específicamente dirigidos en contra de los nemátodos parásitos del género Strongylida , especialmente por Dictyocaulus spp . REF: 185878 En mayor detalle, la presente invención da una combinación de péptidos antigénicos que son componentes inmuno-reactivos del Dictyocaulus spp., especialmente del Dictyocaulus viviparus que pueden ser utilizados para producir una vacuna para producir una respuesta inmune y antibiótica dirigida en contra de los nemátodos parásitos del género Strongylida , especialmente por Dictyocaulus spp. y Dictyocaulus viviparus .

Antecedentes de la Invención Dictyocaulus viviparus, una lombriz pulmonar de bovinos, es la causa de la bronquitis parasitaria, que daña el desarrollo de los animales infectados, muchas veces conllevando a la muerte de los terneros. Dictyocaulus viviparus tiene un ciclo de desarrollo de una primera etapa larval, la cual es secretada por las heces de los animales hospederos infectados. Bajo las circunstancias climáticas apropiadas, estas larvas de primera etapa se desarrollan en una semana a la segunda etapa larval y la tercera etapa larval, las cuales son larvas infecciosas. La infección del Ganado es por ingestión de la larva de tercera etapa de la lombriz pulmonar, las cuales se activan por el contacto con la bilis vesicular del hospedero, permitiéndolo a la larva pasar a la mucosa intestinal y a moverse a través del sistema linfoide hacia los nodulos linfáticos mesentéricos, donde la larva de la cuarta etapa se desarrolla despellejándose. Las larvas de la cuarta etapa, por medio del paso a través del corazón llegan a los pulmones, donde la larva perfora al alvéolo. Dentro del alvéolo, la piel de la larva se desarrolla a una larva pre-adulta de la quinta etapa y llega a los bronquiolos y a los tubos bronquiales en aproximadamente 1 semana luego de la infección (p. i.). Luego de una fase de crecimiento intenso las lombrices pulmonares adultas que se pueden reproducir aparecen de 3 a 4 semanas p. i. Los huevos de las lombrices llegan a la faringe por medio del epitelio traqueal y son tragados por el animal hospedero y una pequeña proporción son tosidos. Durante el paso por el estómago y el intestino, las primeras larvas salen de los huevos y llegan al pasto con las heces. En temperaturas menores a 8 °C en el ambiente, luego de la ingestión por un hospedero nuevo, una inhibición del desarrollo ocurre en la etapa temprana de pre-adulto de la larva . La inhibición del desarrollo de Dictyocaul us viviparus es causada al menos en parte por las condiciones climáticas, las cuales no son favorables para el desarrollo y sobrevivencia de las etapas activas fuera del hospedero, como temperaturas bajas (inhibición de invierno) o a altas temperaturas o un clima muy seco (inhibición de estación seca) . A la fecha una vacuna contra Dictyocaulus viviparus consta de larvas aisladas de las heces de animales infectados, estas larvas son atenuadas por irradiación a 400 Gray evitando un desarrollo a la etapa adulta. Sin embargo, la producción de esta vacuna utiliza una infección artificial de los terneros para producir larvas secretadas en las heces y es bastante costosa. Además, una desventaja de una vacuna viva conocida tiene una vida útil limitada de aproximadamente cuatro meses . Liddell et al. (Cu/Zn Superoxido-dismutasas Extracelularer y citoplásmicas de Haemonchus contortus , Parasitology 116, 383-394 (1998)) cita la importancia inmunológica de SOD de Dictyocaulus viviparus para la inmunización del ganado. Adicionalmente, una combinación de Cu/Zn superóxido dismutasa extracelular y citoplásmica es utilizada como vacuna en contra de Haemonchus contortus . Para la paramiosina, paramiosina de longitud completa y fragmentada de Taenia solium han sido descritas en detalle como una posible vacuna en contra de cisticercosis (Vázquez-Talavera et al., Caracterización y potencial protector de la respuesta inmune hacia Taenia solium en un modelo murino de cisticercosis, Infection and Immunity 5412- 5416 (2001) ) . Sin embargo, estos inventores han encontrado que el gen de paramiosina de Taenia solium solo tiene homología limitada al gen de la paramiosina nuevamente identificado de Dictyocaulus viviparus . En contraste con la adecuación sugerida de la paramiosina de Taenia solium como una posible vacuna en contra de esquistosoma y filaría, Pearce et al. (Inducción de la inmunidad protectora en contra de Schistoso a mansoni mediante vacunación con paramiosina de esquistosoma (Sm97) , un antígeno parasitario que no es de superficie, PNAS 85, 5678-5682 (1988)) demostró que paramiosina de Mercenaria mercenaria, una paramiosina heterológica a la de Schistosoma mansoni , no indujo una respuesta protectora inmunológica en ratones . Otra paramiosina que ha sido sugerida para el uso como una antígeno en contra de una infección parasitaria es paramiosina de Brugia alayi (Nanduri et al., The Journal of Immunology, 143, 3359-336 (1989) La Paramiosina con despejo mejorado de microfilaremia por Brugia malayi en ratones) . Aunque esté clasificada como un nemátodo, Brugia , que vive en la sangre de los humanos hospederos, no pertenece a la cepa de Strongylida , y tiene un ciclo de vida diferente a Strongylida . Una pista adicional de la importancia de la paramiosina para la inmunoprotección en contra de Brugia malayi viene de Li et al., The Journal of Immunology 150, 1881-1885 (1993) que analizan la inmunoprotección obtenida luego de la inmunización con larva irradiada o con paramiosina de Brugia malayi . McManus et al . (Una vacuna en contra de la esquistosomiasis asiática, Parasitology International 53, 163-173 (2004)) relacionado al uso potencial de paramiosina como un compuesto antigénico que se obtiene de Schistosoma japonicum para dar inmunidad protectora en contra de varias Esquistosomas . McManus et al. preferentemente se refieren a las regiones de alta homología de paramiosinas de Schistosoma . Investigando la paramiosina como una posible vacuna antigénica en contra del parásito humano Schistosoma japonicum, Ramírez et al. (Parasite Immunology 18, 49-52 (1996)) pudo demostrar que la miosina esquistosoma así como la paramiosina del nemátodo Mercenaria no indujo protección inmunológica en contra de Schistosoma japonicum. El descubrimiento que la vacunación con paramiosina de Schistosoma japonicum en contraste con la paramiosina de Schistosoma mansoni promueve una mejor respuesta inmune protectora, indica que el origen de la paramiosina determina su especificidad para las correspondientes especies de parásitos. De acuerdo con las sugerencias hechas por Ramírez et al . de hacer pruebas al potencial inmunoprotector promovidopor la paramiosina de una cepa de Schistosoma japonicum aun en contra de diferentes cepas, es razonable asumir que la importancia inmunológica de paramiosina como un antigénico para la inmunidad protectora está limitada a las especies específica de Esquistosomas, posiblemente hasta la cepa específica en investigación. En contraste al estado de la técnica que hace referencia a la paramiosina obtenida de ciertas especies de tremátodos y céstodos, la presente invención se refiere a la paramiosina obtenida de Dictyocaulus viviparus, que pertenece a la clase de Strongylida , para ser usada como un componente de vacuna antigénica para obtener una inmunoreacción en contra de Strongylida , preferentemente en contra de Dictyocaulus spp. . Se sabe que los parásitos reportados de estar en investigación, por ejemplo Taenia solium, Schistosoma mansoni , Schistosoma japonicum y Brugia malayi , cada uno tiene ciclos de desarrollo infecciosos a los hospederos muy diferentes y causan diferentes enfermedades de Strongylida , especialmente Dictyocaulus viviparus . La inmunoreactividad de SOD de Dictyocaulus viviparus es conocida de Britton et al. (Actividad Superóxido dismutasa (SOD) de Dictyocaulus viviparus y su inhibición por anticuerpos de bovinos hospederos infectados y vacunados, Parasitology, 109, 255-261 (1994)). La actividad de SOD fue detectada en extractos solubles de PBS de L3 y etapas adultas de Dictyocaulus viviparus como también en productos de excremento con secreción en las etapas adultas. Cuando se analizó el SOD por electroforesis en gel de poliacrilamida nativa, fueron encontradas diferentes distribuciones de isoenzimas en extractos adultos en comparación con los productos de excremento con secreción. Se demostró que la isoenzima de excremento de secreción de SOD es antigénica por una reacción inmunológica con el anticuerpo IgG obtenido del suero de bovinos hospederos infectados o vacunados. Sin embargo, la presente invención se refiere a un SOD definido, principalmente un SOD extracelular que se obtiene de Dictyocaulus viviparus, para el uso como un componente de una vacuna .

Breve Descripción de la Invención El objeto de la presente invención es proporcionar una composición de vacuna que proporcione efectivamente inmunoprotección en contra de los parásitos del género Strongylida , especialmente en contra de Dictyocaulus viviparus . Debido a la aparición simultanea de etapas larvales inhibidas y no inhibidas de Dictyocaulus viviparus, es un objeto preferido de la presente invención proporcionar una composición de vacuna que dé inmuprotección en contra de las etapas inhibidas como de las no inhibidas de la lombriz pulmonar . También es objetivo de la presente invención proporcionar una vacuna efectiva en contra de Strongylida , especialmente en contra de Díctyocaulus viviparus , que puede ser producida sin la infección artificial de animales hospederos, preferiblemente como resultado una vacuna que tenga estabilidad mejorada durante el almacenamiento. Asimismo, es objeto de la presente invención dar anticuerpos reactivos con ambas etapas, inhibidas y no inhibidas de Strongylida , especialmente de Dictyocaulus viviparus . Dicho anticuerpo puede ser utilizado para-propósitos de diagnósticos para detectar una infección en rumiantes, especialmente en ganado, independiente de la etapa de desarrollo de Strongylida , especialmente Dictyocaulus viviparus . Como una aplicación adicional de tal anticuerpo, se desea la inmunización pasiva para proporcionar una inmunidad pasiva o para apoyar la defensa inmunológica del hospedero en contra de Strongylida , especialmente Dictyocaulus spp . . Como un objetivo adicional, la presente invención busca dar un método para producir una proteína antigénica para el uso en vacunas, para obtener protección en contra de Strongylida , especialmente Dictyocaulus spp .

En general la presente invención proporciona una vacuna capaz de obtener una respuesta immunológica en ganado en contra de Strongylida, efectiva para reducir la excreción de larvas de los animales infectados y para reducir la carga de la lombriz en los animales infectados. De acuerdo a ello, la inmunización del ganado con una vacuna de acuerdo con la presente invención reduce los efectos de una infección por Strongylida , especialmente Dictyocaulus spp . , preferentemente hasta una protección total en contra de la infección, por ejemplo en contra del síndrome re-infección. En una primera modalidad, la presente invención proporciona una vacuna apropiada para dar inmunoprotección en contra de Strongylida, especialmente Dictyocaulus spp, que consta de proteínas que contienen epítopos inmunogénicos de al menos un fenil-etanolamio-N-metiltrasferasa (PNMT) , paramiosina y superóxido-dismutasa (SOD) de cobre-zinc extracelular, todos obtenidos de los genes respectivos de Strongylida , especialmente Dictyocaulus spp. Los epítopos de la vacuna pueden ser proporcionados en la forma de productos de traducción completa o parcial de los genes respectivos que codifican para PNMT, paramiosina y SOD, respectivamente. Además, los péptidos de fusión pueden ser utilizados para dar epítopos de uno o más combinación de los genes originales. Dichos péptidos de fusión pueden ser traducidos de secuencias de ácidos nucleicos producidos sintéticamente que codifican para una combinación no natural de epítopos derivados de los genes que codifican a PNMT, paramiosina y SOD. Los epítopos pueden ser identificados de acuerdo a la práctica estándar, por ejemplo mediante un análisis asistido por computadora de las regiones de proteínas inmunogénicas y/o haciendo pruebas de la inmunogenicidad de las porciones de proteínas. Por consiguiente, en la siguiente descripción los términos SOD, PNMT y paramiosina se refieren a los productos de expresión de los genes correspondientes que se obtienen de Strongylida , preferentemente de Dictyocaulus sp . , especialmente de Dictyocaulus viviparus, y sus derivados que tienen una inmunorreactividad, por ejemplo los péptidos que se componen de epítopos de los productos de genes anteriormente mencionados, los cuales son inmunorreactivos al menos en el ganado. También se ha mostrado que una combinación de epítopos de al menos dos, preferentemente tres, péptidos del grupo de SOD, PNMT y paramiosina dio como resultado una inmunoprotección más potente que una vacuna que se compone de epítopos únicamente de una de las proteínas inmunogénicas mencionadas. Por consiguiente, es preferible que la vacuna se componga de epítopos de al menos dos de SOD, P-SpYIT y paramiosina, que se obtienen de Strongylida , preferentemente de Dictyocaulus viviparus . Se prefiere aún más que la vacuna se componga de PNMT y de una o ambas de SOD y paramiosina, con el fin de proporcionar protección en contra de las etapas inhibidas y no inhibidas de Strongylida , especialmente Dictyocaulus viviparus .

Las composiciones de la vacuna pueden ser utilizadas para el tratamiento de animales seronegativos y/o infectados . En adición a la obtención de una respuesta de anticuerpo, se prefiere proporcionar inmunoprotección en rumiantes, especialmente en ganado en contra de Strongylida , especialmente Dictyocaulus spp. por la promoción de una respuesta inmune celular. De acuerdo con los análisis de ganado inmunizado con las composiciones de vacuna de acuerdo a la presente invención, se ha encontrado una reducción significativa de la carga de la lombriz de Dictyocaulus viviparus luego de que la infección artificial pudo ser alcanzada, en comparación con los animales de control no vacunados. Sin embargo, la reducción de la carga de las lombrices no se pudo asignar únicamente a los títulos de anticuerpos, y por consiguiente, se asume que las composiciones de vacunas pueden promover una respuesta inmune en ganado . En uno de los aspectos de la primera modalidad, la presente invención está enfocada a la inmunorreactividad de la paramiosina que se obtiene de Strongylida , especialmente Dictyocaulus viviparus . Aunque la Strongylida pertenece a una cepa diferente de helmintos que los géneros investigados en el estado conocido de la técnica para su inmunorreactividad con respecto a su paramiosina específica, los presentes inventores han encontrado que la paramiosina que se obtiene de Strongylida , especialmente la paramiosina de Dictyocaulus viviparus es un antígeno apropiado para obtener al menos parcialmente una respuesta inmunoprotectora en rumiantes, especialmente en ganado. En un aspecto adicional de la primera modalidad, la presente invención está basada en el hallazgo que una combinación de paramiosina y SOD que se obtienen de Dictyocaulus viviparus, que son ambos predominantemente expresados en una etapa de la larvaria no inhibida de Dictyocaulus viviparus, puede inducir una inmunorreacción mejorada en ganado, preferentemente suficiente para proporcionar inmunoprotección en contra de la infección por Strongylida , preferentemente Dictyocaulus spp.. En su modalidad preferida, la primera modalidad de la presente invención está basada en el descubrimiento que PNMT es predominantemente expresada, por ejemplo es característica para las etapas de las larvas inhibidas en al menos Dictyocaulus viviparus, y promueve una reacción inmunológica en rumiantes, en tanto que la paramiosina y SOD son preferentemente expresados en Strongylida , especialmente en Dictyocaulus viviparus , durante sus etapas no inhibidas. Por ello, se prefiere que la vacuna contenga epítopos de PNMT en combinación con al menos uno de SOD y paramiosina, preferentemente en combinación con al menos paramiosina que se obtiene de Strongylida, especialmente de Dictyocaulus viviparus . Cuando está presente en combinación con al menos una de SOD y paramiosina, la vacuna que comprende PNMT es más efectiva para obtener una respuesta inmune en ganado en contra de las etapas no inhibidas e inhibidas de Strongylida, especialmente en contra de Dictyocaulus spp.. En adición a los epítopos de PNMT en combinación con SOD y/o paramiosina, la vacuna puede comprender epítopos de acetilcolinesterasa (ACE) , proteína principal de esperma (MSP) y/ o proteína de disulfuro-isomerasa (PDI) que se obtienen de Strongylida , especialmente de Dictyocaulus viviparus . Los epítopos derivados de ACE, MSP y PDI pueden estar presentes en la vacuna en la forma de productos de traducción de las respectivas secuencias de genes naturales respectivas, o como una traducción de productos parcial o como porciones de péptidos de fusión según lo descrito para PNMT, SOD y paramiosina. Tal péptido de fusión puede comprender epítopos específicos en un arreglo nuevo, por ejemplo, uno no natural. En adición a los péptidos inmunogénicos mencionados anteriormente, la vacuna, de acuerdo con la invención, puede comprender adyuvantes, por ejemplo Alumbre, más preferentemente Quil A y aditivos más conocidos como conservadores y antioxidantes.

Además, la presente invención proporciona un método para producir composiciones de vacunas apropiadas para promover una inmunoprotección parcial, preferentemente completa, en contra de Strongylida , por ejemplo en contra de Dictyocaulus spp., cuyo método está caracterizado por proporcionar proteínas inmunorreactivas específicas de la invención. Para producción la expresión heteróloga de cada una de PNMT, paramiosina y/o SOD, opcionalmente cada una de ACE, MSP y PDI , cada uno de los péptidos anteriormente mencionados como productos de traducción completa o parcial de los genes naturales correspondientes en un microrganismo es preferido. Para la expresión heteróloga y pasos de purificación subsiguientes de las proteínas inmunorreactivas, las secuencias de ácido nucleicos que codifican las secuencias de amino ácidos pueden ser añadidas o removidas, por ejemplo una etiqueta para la purificación de afinidad como una secuencia de poli-histidina puede ser añadida para facilitar la purificación, o regiones no inmunogénicas pueden ser removidas. Modificaciones de las proteínas inmunorreactivas de la invención pueden ser practicadas siempre y cuando las propiedades inmunorreactivas se mantienen esencialmente sin cambios, por ejemplo siempre y cuando los epítopos específicos de PNMT, paramiosina y/o SOD, opcionalmente de ACE, MSP y/o PDI no sean dañados con respecto a su antigenicidad.

En una segunda modalidad, la presente invención proporciona preparaciones de anticuerpos dirigidos en contra de las proteínas antigénicas de las composiciones de la vacuna de acuerdo con la primera modalidad. Tales preparaciones de anticuerpos son específicas para al menos una de PNMT, SOD y paramiosina, o alternativamente, específicas para dos o todos los tres de paramiosina, SOD y PNMT, preferentemente incluyendo especificidad en contra de PNMT en combinación con al menos uno de SOD y PNMT. Por consiguiente, estas preparaciones de anticuerpos son inmunorreactivas con ambas proteínas expresadas en el estado inhibido así como también con la proteína expresada en el estado de no inhibición de Dictyocaulus spp.. Estas composiciones de anticuerpos pueden ser utilizadas para proporcionar inmunización pasiva a los animales hospederos en contra de Strongylida , especialmente en contra de Dictyocaulus viviparus, por ejemplo para el tratamiento de animales seronegativos y/ o infectados. Además estas composiciones de anticuerpos pueden ser utilizadas para propósitos analíticos, por ejemplo para detectar una infección en rumiantes por Strongylida como Dictyocaulus viviparus . El examen de la transcripción del gen preferencial de la larva de la tercera etapa en un estado inhibido (L3i) y no inhibido (L3ni) de Dictyocaulus viviparus demuestra que PNMT, SOD y paramiosina se expresan diferencialmente en la larva de la tercera etapa, con PNMT característico para la etapa inhibida, y SOD así como paramiosina también con características para la etapa no inhibida, respectivamente. De acuerdo con la expresión diferencial, los genes son transcritos diferencialmente de acuerdo con el estatus de inhibición. Una reacción inmunológica en rumiantes en contra de cada una de las proteínas PNMT, SOD y paramiosina fue mostrada por la producción de anticuerpos en respuesta a la inmunización con cada una de estas proteínas o una combinación de ellas, en terneros que tenían originalmente un estatus inmune negativo hacia Dictyocaulus viviparus . Además de la inducción de una respuesta inmune en contra de PNMT, SOD y/ o paramiosina en un ternero, una reacción inmunológica específica también podría ser inducida al inmunizar rumiantes, por ejemplo ganado, con porciones inmunorreactivas de dichas proteínas, por ejemplo péptidos sintéticos o que se compongan de epítopos que promueven una respuesta de anticuerpos específica. La vacunación fue hecha por medio de inyección i.m, i.v, i.p en una mezcla con un adyuvante apropiado, por ejemplo Quil A. Sin embargo, otras vías de administración pueden ser escogidas, por ejemplo administración oral. Además de la producción de anticuerpos, la respuesta inmune también incluyó una respuesta inmune celular, la cual por ejemplo puede ser demostrada en ensayos de proliferación de linfocitos. La efectividad de la vacuna de acuerdo con la invención es evidente cuando se comparan animales infectados sin o luego de la inmunización anterior con la vacuna, mostrando, por un lado, una reducción del número de larvas de Dictyocaulus viviparus dispersadas con las heces por un factor de al menos 2, y por el otro lado, una reducción de la carga de la lombriz dentro de los pulmones de los terneros infectados. El análisis de esta comparación también demuestra que la vacunación redujo significantemente el número de larvas de Díctyocaulus viviparus inhibida y no inhibida, según lo contado en los pulmones de los animales sacrificados. Para la producción de una respuesta inmune específica para nemátodos parásitos, preferentemente del género Strongylida , preferentemente en contra de Dictyocaulus spp, los animales hospederos se inmunizan con una vacuna de acuerdo con la presente invención utilizando una estrategia de inmunización, por ejemplo utilizando un estrategia de refuerzo, de acuerdo con procedimientos estándares. Para propósitos analíticos, suero de animales inmunizados puede ser utilizado para detectar específicamente nemátodos parásitos, por ejemplo Dictyocaulus viviparus, independiente de su condición de etapa inhibida o no inhibida, por ejemplo utilizando una preparación de anticuerpos ligada a un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser purificados de acuerdo con procedimientos conocidos. Los animales hospederos apropiados son, por ejemplo, rumiantes, como ganado y ovejas, o ratones, ratas y conejos. Aparte de las preparaciones policlonales de anticuerpos, el anticuerpo monoclonal puede ser producido de acuerdo con procedimientos estándares, por ejemplo utilizando la técnica de hibridoma en células del bazo obtenidas de animales hospederos inmunizados. Los anticuerpos monoclonales pueden ser identificados por su especificidad en contra ya sea de PNMT, SOD, paramiosina, MSP, ACE o PDI . La producción de anticuerpos monoclonales puede ser llevada a cabo de acuerdo con procedimientos conocidos. De acuerdo con la invención, se prefiere que el anticuerpo monoclonal específico para PNMT sea combinado con al menos uno de los anticuerpos específicos de SOD o anticuerpos específicos para paramiosina, con el fin de detectar tanto Strongylida inhibida como no inhibida. El anticuerpo policlonal, por ejemplo el suero de animales inmunizados, o anticuerpo monoclonal fue utilizado para propósitos analíticos, con el fin de determinar la presencia de nemátodos parásitos, principalmente Dictyocaulus viviparus en el ganado hospedero. Para este propósito, una muestra del fluido del cuerpo o un lavado del animal que se sospecha que esté infectado con Dictyocaulus viviparus, fue homogenizada y analizada en una reacción inmunológica específica, generalmente utilizando un formato de ELISA. Las preparaciones de anticuerpos policlonales o una combinación de anticuerpos monoclonales específicos para la paramiosina fueron utilizados en una inmunización pasiva de ganado, por ejemplo terneros, para proporcionar al menos una inmunoprotección parcial en contra de una infección subsiguiente con Dictyocaulus viviparus por medio de ingestión. Resultados mejorados fueron encontrados para las preparaciones de anticuerpos que adicionalmente contenían anticuerpos contra MSP, opcionalmente también anticuerpos en contra de ACE y/o PDI . Es una ventaja específica de la presente invención que la composición de la vacuna comprende tanto PNMT como al menos uno de SOD y paramiosina, dando inmunoprotección en contra de nemátodos parásitos inhibidos y no inhibidos, especialmente sus larvas, preferentemente en contra de Dictyocaulus viviparus . Por consiguiente, una respuesta inmune puede ser promovida en animales hospederos vacunados que también está dirigida en contra de las larvas inhibidas de Dictyocaulus viviparus, dando como resultado una reducción o remoción de la larva inhibida, lo cual es apropiado para la interrupción del ciclo de vida de dicho nemátodo parásito. Esto es considerado como una ventaja específica porque por ejemplo el ganado adulto puede ser infectado por la larva inhibida de Dictyocaulus viviparus sin mostrar síntomas, por ejemplo ellos no son reconocidos como una fuente de contaminación de pastos con huevos infecciosos o larvas. Para un uso alternativo de anticuerpos, en aplicaciones de diagnóstico, anticuerpos específicos contra PNMT, paramiosina, SOD, ACE, MSP y PDI son proporcionados por la presente invención. Los anticuerpos analíticos y los anticuerpos utilizados para el tratamiento de animales pueden ser monoclonales o policlonales. Para los anticuerpos monoclonales y policlonales que van a ser utilizador para el tratamiento de animales, por ejemplo, para propósitos terapéuticos, se prefiere que sus cadenas constantes estén en concordancia con las especies de animales que son tratados, por ejemplo, es evitada una inmunorreacción por el animal tratado en contra del anticuerpo de acuerdo con la invención.

Breve Descripción de las Figuras La presente invención se describe ahora con mayor detalle por medio de los ejemplos con referencia a las figuras, donde son mostrados los resultados de ELISA' s de suero de terneros inmunizados: • La Figura 1 muestra los títulos de IgG de los terneros sin inmunización (control, animales 598, 596, 588, 950) e inmunizados con PNMT (animales 601, 756, 625, 915, 593, 580, 603,748) , • La Figura 2 muestra los títulos de IgG de terneros inmunizados con una combinación de PNMT, PDI y MSP (Mezcla, animales 749, 757, 914, 611, 544, 597, 586, 952) y controles sin inmunización. • La Figura 3 muestra los títulos de IgGl de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con PNMT, • La Figura 4 muestra los títulos de IgGl de terneros inmunizados con una combinación de PNMT, PDI y MSP (Mezcla) y controles sin inmunización, • La Figura 5 muestra títulos de IgG2 de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con PNMT, • La Figura 6 muestra los títulos de IgG2 de terneros inmunizados con una combinación de PNMT, PDI y MSP (Mezcla) y controles sin inmunización, • La Figura 7 muestra los títulos de IgA de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con PNMT, • La Figura 8 muestra los títulos de IgA de terneros inmunizados con una combinación de PNMT, PDI y MSP (Mezcla) y controles sin inmunización • La Figura 9 muestra los títulos de IgM de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con PNMT, y • La Figura 10 muestra los títulos de IgM de terneros inmunizados con una combinación de PNMT, PDI y MSP (Mezcla) y controles sin inmunización.

Las Figuras 11 a 19 muestran los resultados de ELISA utilizando paramiosina de Dictyocaulus viviparus como el antígeno y suero de los terneros en las pruebas de vacunación II, en donde « La Figura 11 muestra los títulos de IgG de terneros sin inmunización (control, animales 814, 795, 110, 805, 802, 808) e inmunizados con paramiosina (animales 812, 813, 806, 822) , • La Figura 12 muestra los títulos de IgG de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con una Mezcla que contiene paramiosina, PNMT, MSP, PDI y ACE (animales 810, 790, 754, 816, 762, 807), • La Figura 13 muestra los títulos de IgGl de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con paramiosina, • La Figura 14 muestra los títulos de IgGl de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con la Mezcla, • La Figura 15 muestra los títulos de IgG2 de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con paramiosina, • La Figura 16 muestra los títulos de IgG2 de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con la Mezcla, • La Figura 17 muestra los títulos de IgA de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con paramiosina, • La Figura 18 muestra los títulos de IgA de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con la Mezcla, • La Figura 19 muestra los títulos de IgM de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con paramiosina, • La Figura 20 muestra los títulos de IgM de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con la Mezcla, Las Figuras 21 a 30 muestran los resultados de ELISA utilizando PNMT de Dictyocaulus viviparus como el antígeno y el suero de terneros en la prueba de vacunación II, en donde • La Figura 21 muestra los títulos de IgG de terneros sin inmunización (control, animales 814, 795, 110, 805, 802, 808) e inmunizados con PNMT (animales 818, 809, 821, 761) , • La Figura 22 muestra los títulos de IgG de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con la Mezcla, compuesta por paramiosina, PNMT, MSP, PDI y ACE (animales 810, 790, 754, 816, 762, 807), • La Figura 23 muestra los títulos de IgGl de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con la Mezcla, • La Figura 24 muestra los títulos de IgGl de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con la Mezcla, • La Figura 25 muestra los títulos de IgG2 de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con PNMT, • La Figura 26 muestra los títulos de IgG2 de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con la Mezcla, • La Figura 27 muestra los títulos de IgA de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con PNMT, • La Figura 28 muestra los títulos de IgA de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con la Mezcla, • La Figura 29 muestra los títulos de IgM de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con PNMT, y • La Figura 30 muestra los títulos de IgM de terneros sin inmunización (control) e inmunizados con la Mezcla .

Descripción Detallada de la Invención En las figuras los números indican los terneros individuales y la leyenda de cada figura da la proteína inmunogénica y el adyuvante utilizado; por ejemplo animales de control (598, 596, 588 y 950) recibieron adyuvante únicamente sin la proteína inmunológica específica.

Ejemplo 1: Análisis de expresión diferencial de genes en larvas de la tercera etapa de Dictyocaulus viviparus inducida por hipobiosis (inhibida) y no inducida (no inhibida) En general, la hibridación substractiva de hibridación, seguida por selección diferencial de las bibliotecas de cADN sustractivas se utilizó para identificar los genes diferencialmente expresados, con base en el ARN poli (A) + de larvas de Dictyocaulus viviparus de tercera etapa, inducidas por hipobiosis (L3i) y no inducidas (L3ni) . Par aislar el ARN poli (A) +, las larvas desenvainadas fueron homogeneizados con un mortero y pistilo en nitrógeno líquido. El ARN poli (A) + fue extraído utilizando esferas de oligo (dT) -celulosa del kit de purificación de mARN Quick PrepMR Micro (American Biosciences). El rendimiento de ARN poli (A) + fue determinado al medir la absorbancia a 260 nm. El AR? poli (A) + de las dos poblaciones larvales fue transcrito en cAD? de doble hebra, mediante el uso del kit de síntesis de cAD? por PCR, SMARTMR (BD Clontech) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante . La hibridación sustractiva por supresión fue realizada con el kit de substracción de cAD? PCR-SelectMR (BD Clontech) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, después de la digestión con la enzima de restricción de los cADNs y ligadura de adaptador de los probadores, se realizaron dos rondas de substracción. En la substracción delantera, el L3i-cADN sirvió como el probador que contiene transcritos suprarregulados . Este probador fue hibridazo con el cADN impulsor de L3ni para eliminar la secuencia de genes comunes. En una substracción inversa el cADN de L3ni sirvió como el probador y fue hibridado con el cADN de L3i como el impulsor. Las secuencias diferencialmente expresadas, substraídas, de ambas poblaciones larvales fueron amplificadas utilizando 27 ciclos de PCR primaria y 12 ciclos de PCR secundaria. Para examinar la eficiencia de la substracción, los productos de PCR secundarios, sustraídos y no sustraídos de L3i y L3ni fueron amplificados utilizando los cebadores para una secuencia génica no especificada que se sabe es expresada en ambas poblaciones larvales . Las secuencias de los cebadores fueron 5 ' -ACG CGT TTA GCA CTA CTG GTT GT-31 (Seq. -ID No 1) y 5 ' -GGA CGG AAG CTG CTA CAA-3 ' (Seq. -ID No 2). El ciclo de PCR fue realizado utilizando el siguiente perfil de temperatura: desnaturalización a 94°C por 30 segundos, recocido a 56°C por 30 segundos, y extensión a 68°C por 2 minutos. Para generar bibliotecas substraídas, los productos de PCR secundarios de L3i y L3ni generados mediante hibridación sustractiva de supresión fueron directamente clonados dentro del vector pCRMR 4-T0P0MR y transformados dentro de E. coli cepa One ShotMR TOP10 por el kit para secuenciamiento TOPO TA CloningMR (Invitrogen) . Antes de la generación de las bibliotecas substraídas los clones aleatoriamente seleccionados de L3ni y L3i fueron verificados para los insertos utilizando los cebadores anidados de la PCR secundaria. Los insertos de las bibliotecas substraídas fueron analizados para la expresión diferencial por selección diferencial. Por lo tanto, los productos de PCR primarios, substraídos y no substraídos del L3i y L3ni fueron marcados con DIG-dUTP. La marcación de los cADNs fue realizada mediante PCR secundaria con una proporción DIG-dUTP:dTTP de 1:6 utilizando la mezcla de marcación de ADN DIG (Roche), purificado con las columnas CHROMA SPINMR-100 (BD Clontech) , digeridos con Rsal, Smal, y Eael (Roche) para eliminar los adaptadores y purificados nuevamente con las columnas CHROMA SPINMR-100. Los insertos de las bibliotecas sustraídas fueron amplificados y acomodados por duplicado sobre cuatro membranas de nailon positivamente cargadas (Roche) de acuerdo al protocolo del kit de selección diferencial PCR-SelectMR (BD Clontech) . Las membranas fueron encerradas en una bolsa de hibridación (Roche) y prehibridadas con la solución DIG Easy Hyb (Roche) que contenía la solución 50 µl de la solución bloqueadora (kit de selección diferencial PCR-SelectMR, BD Clontech) , y desnaturalizada a 99°C por 10 minutos antes de apagar sobre hielo. La prehibridación fue realizada a 42 °C por 90 minutos en un baño de agua con agitación suave. De cada sonda marcada con DIG, 495 - ng fueron desnaturalizados junto con 50 µl de la solución bloqueadora y agregados a 30 ml de DIG Easy Hyb (16.5 ng de sonda/ml). Esta solución de hibridación fue agregada a las membranas. La hibridación fue realizada a 42 °C por 22 horas en un baño de agua con agitación suave, seguido por lavados dos veces a temperatura ambiente (10 minutos/lavado) en 2x SSC, 1% de SDS y dos veces a 68°C en 0.5 x SSC, 0.1% de SDS (20 minutos/lavado). La detección quimioluminiscente fue realizada utilizando el kit de marcación e iniciador de detección II (DIG High Prime) (Roche) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Después de la exposición de las membranas a películas de luz KODAK BioMaxMR (Amersham Biosciences) a temperatura ambiente por 40 minutos, las películas fueron reveladas utilizando el revelador RODAK® GBX y el reabastecedor KODAK* GBX (Integra) . Para confirmar los resultados del procedimiento de selección diferencial, se realizó una hibridación de cADN adicional. En resumen, los insertos amplificados de las bibliotecas substraídas fueron acomodados nuevamente por duplicado sobre dos membranas de nailon positivamente cargadas (Roche) . El ARN poli (A) + recién aislado (kit de purificación de mARN Quick PrepMR Micro, Amersham Biosciences) del L3i y L3ni se utilizó para generar el cADN marcado con DIG utilizando el kit de síntesis de cADN por PCR SMARTMR (BD Clontech) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las sondas son luego marcadas con una proporción DIG-dUTP:dTTP de 1:6 durante la PCR de LD. Para eliminar los oligonucleótidos SMART II, las sondas fueron purificadas con columnas CHROMA SPINMR-100 (BD Clontech) de acuerdo a la recomendación del fabricante, digeridas con Rsal (Roche) , y purificadas nuevamente con las columnas CHROMA SPINMR-100. La preparación de las membranas, la hibridación, y la detección fueron llevadas a cabo como se describe anteriormente con las siguientes modificaciones: se utilizaron 25 ng de sonda/ml de DIG Easy Hyb (Roche) , y las membranas fueron expuestas por 90 minutos a las películas de quimioluminiscencia.

Ejemplo 2: Secuenciamiento de los genes diferencialmente expresados El ADN plásmido de los clones que contenían cADNs diferencialmente expresados fue obtenido utilizando el kit Plasmid Midi Kit (Qiagen) y secuenciado en los laboratorios SEQLAB Sequence (Góttingen, Alemania) . Los datos de las secuencias resultantes fueron analizados para las identidades a los genes y a las proteínas depositadas en la base de datos NCBI utilizando el programa de búsqueda BLAST (disponible en http : //ww . ncbi . nl . nih . gov/BLAST/ ) . Como resultado de la hibridación substractiva de supresión de acuerdo al ejemplo 1, se encontró que éste es PNMT que es predominantemente expresado en la etapa inhibida de Dictyocaulus viviparus, mientras que SOD y paramiosina son las proteínas predominantemente expresadas en su etapa no inhibida .

Ejemplo 3 : Generación de secuencias de cADN de longitud completa Para obtener las secuencias de longitud completa de PNMT, SOD y paramiosina, se llevó a cabo la amplificación rápida de los extremos de cADN (RACE) utilizando el kit de amplificación de cADN SMARTa RACE (BD Clontech) . En resumen, el ARN poli (A) + de las dos poblaciones larvales fue convertido al cADN de primera hebra y subsecuentemente amplificados utilizando PCR de anotación. En 3 '-RACE se utilizaron los siguientes cebadores específicos de genes: 5 ' -CACAAAATCGCCAAGAGCTAATGCGGTGGTATGA- 3 ' (Seq. -ID No 3) para PNMT, 5' -GGCAAACGGTTGTCTAGCAGCTGGAGGTCATTATA-3 ' (Seq. -ID No 4) para SOD, y 5' -CTTGCCGATGCGAATCGAAAACTGCATGAGTT-3 ' (Seq. -ID No 5) y 5' -AAGCTAGTTTGGAAGATACCCAACGTCAGCTCCAACAAG-3 ' (Seq. -ID NO 6 ) , para paramiosina respectivamente.

Se utilizaron los siguientes cebadores específicos de genes en 5 '-RACE: 5'-ATTTCGCGTATCACTGTGCTGCCTCAACACCAC-3 ' (Seq. -ID No 7) para PNMT, 5'-ATACGTATCGCGCCCAATTCCAAGCGTTTAGTTTA-3 ' (Seq. -ID No 8) para SOD, y 5 ' -AGCGGTCGATTTCAAATTGCATATTCTTGCGAAGAG-3 ' (Seq. -ID No 9), y 5 ' -GAATAGCGATGGTGTTCTGAGCTTTCTCAAGGTCAACAATAAG- 3 ' (Seq . - ID No 10) para paramiosina, respectivamente. Las bandas candidatas fueron cortadas del gen ligadas dentro del vector pCRMR 4-TOPOMR (Kit para Secuenciamiento TOPO TA CloningMR, Invitrogen) seguido por secuenciamiento. Las secuencias de cADN de longitud completa fueron obtenidas mediante traslape de los fragmentos y comparados subsecuentemente a los genes, a las proteínas y los dominios conservados depositados en la base de datos NCBI utilizando el programa de búsqueda BLAST para confirmar que las secuencias de longitud completa son PNMT, SOD y paramiosina. Para PNMT, fueron identificados cinco isotipos, para SOD dos isotipos. Las secuencias dadas son secuencias de cADN, a partir de las cuales fueron traducidas las secuencias de aminoácidos respectivas. Se asume que el número de isotipos es provocado por el procesamiento post-transcripcional , por ejemplo, mediante empalme alternativo.

Los listados de secuencias comprenden: Para PNMT secuencia de ácido secuencia de nucleico aminoácido Isotipo 1 Seq. -ID No. 11 Seq. -ID No. 16 Isotipo 2 Seq. -ID No. 12 Seq. -ID No. 17 Para PNMT secuencia de ácido secuencia de nucleico aminoácido Isotipo 3 Seq. -ID No. 13 Seq. -ID No. 18 Isotipo 4 Seq. -ID No. 14 Seq. -ID No. 19 Isotipo 5 Seq. -ID No. 15 Seq. -ID No. 20; Para SOD secuencia de ácido secuencia de nucleico aminoácido Isotipo 1 Seq. -ID No. 21 Seq. -ID No. 23 Isotipo 2 Seq. -ID No. 22 Seq. -ID No. 24; Para secuencia de ácido secuencia de paramiosina nucleico aminoácido Seq. -ID No. 25 Seq. -ID No. 26; Para MSP secuencia de ácido secuencia de nucleico aminoácido Seq. -ID No. 27 Seq. -ID No. 28 ; Para ACE secuencia de ácido secuencia de nucleico aminoácido Seq. -ID No. 29 Seq. -ID No. 30; y Para PDI secuencia de ácido secuencia de nucleico aminoácido Isotipo 1 Seq. -ID No. 31 Seq. -ID No. 33 Isotipo 2 Seq. -ID No. 32 Seq. -ID No. 34; Ejemplo 4: Producción de PNMT, SOD y paramiosina por expresión heteróloga A partir de cada proteína, la región de codificación completa con la excepción del codón de inicio fue ligada dentro de pGEX-2T, pGEX-4T-3, pGEX-6P-3 (Amersham Biosciences) , seguido por PCR para la incorporación de un sitio de restricción BamHI en el extremo 5' y Notl (PNMT y paramiosina) y sitios de restricción de EcoRI (SOD) , respectivamente, en sus extremos 3' . Los cebadores utilizados para PNMT fueron (5' -GGATCCGAGTCAGCAGACGGTG-3 Y Seq. -ID No 35), PNMT rev (51-GCGGCCGCAACAACAGAGTAGAATTAGGAAGTA-3 Y Seq. -ID No 36), para SOD (5'- GGATCCATACTCCACATTTCACTC -3 Y Seq. -ID No 37), SOD rev (5'-CTTAAGC CAATT CCAAGCGTTTAGTTTAGA-3 Y Seq. -ID No 38), para paramiosina (5'-GGAT CCTCTGCTAACTTGTACAG-3 ' , Seq. -ID No 39), y paramiosina rev (5'-GCGGC CGCTTTTGCG GTCACCTTAGAAATC-3 Y Seq. -ID No 40). Las construcciones resultantes fueron expresadas en Escherichia coli químicamente competente BL21 StarMR (DE3) One Shot (Invitrogen). Las bacterias fueron desarrolladas hasta fases semilogarítmica y se agregó isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG) para inducir la expresión de PNMT, SOD y paramiosina, respectivamente. Los cultivos fueron incubados con agitación vigorosa a 37°C. Las bacterias fueron cosechadas mediante centrifugación. Después de la lisis de las células, las proteínas expresadas que contenían un marcador GST basado en vector fueron purificadas utilizando el sistema de purificación de proteína MagneGSTMR (Promega) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante y analizadas mediante electroforesis en gel de dodecil-sulfato de sodio-poliacrilamida . Para el aislamiento de PNMT, SOD y paramiosina, los productos de amplificación que contenían sus secuencias de codificación fueron adicionalmente ligados dentro del vector pET41a (plus) , que caracteriza a un marcador de His además de un marcador de GST, utilizando los mismos procedimientos que se describen anteriormente. Para la purificación, se hizo uso del marcador GST mediante el empleo del sistema de purificación de proteína MagneGST (Promega) en un procedimiento automatizado, utilizando la cromatografía líquida de proteína rápida (ÁKTAMRPLC, GE Healthcare) con las columnas GSTrapMR HP y HisTrapMR HP (GE Healthcare) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Después de la elusión, PNMT, SOD y paramiosina marcados con GST y marcados con His, respectivamente, fueron cuantificados en ensayos estándares de proteínas, SDS-PAGE o automatizados utilizando un bioanalizador 2001 (Agilent Technologies) .

Ejemplo 5: Inmunización activa del ganado para inmunidad protectora contra Dictyocaulus viviparus Terneros libres de lombrices de menos de seis meses de edad al principio del experimento fueron asignados en tres grupos de cuatro cada uno. Cuatro terneros fueron inmunizados tres veces intramuscularmente en el cuello a intervalos de tres semanas con 200 µg de proteína recombinante de acuerdo al Ejemplo 4, emulsificado en 4 mg de adyuvante (alumbre) y amortiguador de Tris (10 mM, pH 7.4 o, preferentemente, 50 mM, pH 8.0) hasta 1.5 ml . Otros cuatro terneros fueron inmunizados tres veces intramuscularmente en el cuello a intervalos de tres semanas con 200 µg de proteína recombinante de acuerdo al Ejemplo 4, emulsificado en 750 µg de Quil A como adyuvante y amortiguador de Tris (10 mM, pH 7.4 o, preferentemente, 50 mM, pH 8.0) hasta 1.5 ml . Fueron preparadas las inyecciones control (cuatro terneros cada una) de la misma manera excepto con el amortiguador de elusión contenido en el sistema de purificación de proteínas MagneGSTMR (Promega) que reemplaza al antígeno. Todos los terneros fueron retados tres semanas después de la inyección final por infección artificial con Dictyocaulus viviparus y se les realizó la necrosis cinco semanas después. Los animales fueron observados para la normalidad clínica cada día con atención cuidadosa sobre los signos clínicos de la infección por la lombriz pulmonar. Las cuentas de las larvas fecales fueron realizadas en los días de la inyección, el día del reto y diariamente por los 28 días después del reto hasta la necrosis. Después de la necrosia, los parásitos fueron lavados de los pulmones perfectamente para calcular la carga final de lombrices. Además, se determinó el sexo y la etapa del desarrollo de los parásitos donde era posible, y se midió su longitud, analizando 100 lombrices hembras y 100 lombrices macho de cada grupo de terneros, con las lombrices recolectadas uniformemente (25 cada una) de los terneros. Las pruebas de protección posteriores realizadas con cada uno de PNMT, SOD y paramiosina únicamente, combinaciones de PNMT y SOD únicamente, PNMT y paramiosina únicamente, SOD y paramiosina, y PNMT combinados con SOD y paramiosina mostraron también la inmunización. Prueba de vacunación I: Inmunización con a) PNMT, b) PDI, y c) una combinación de PNMT, PDI y MSP Utilizando las proteínas aisladas anteriores en una prueba de protección, se encontró que la mejor protección inmunológica pudo ser obtenida con una vacuna que comprendía PNMT, incluso PNMT sin las proteínas inmunorreactivas adicionales, preferentemente utilizando QuilA como el adyuvante. El análisis de la carga parasitaria en terneros inmunológicamente retados, por ejemplo, artificialmente inyectados, pudo mostrar que la mayor reducción de la carga de parásitos en los terneros, analizada después de su necrosis, pudo ser encontrada para las composiciones de vacuna que comprendían PNMT. Los números de parásitos macho y hembra y su número total así como su reducción en comparación a los animales control se muestran en la siguiente tabla 1.

Tabla 1: Número de parásitos adultos machos y hembras en terneros artificialmente infectados después de la inmunización Los terneros individuales son identificados por números, a saber los números control con alumbre como 588, 596, 598, 950, animales con mezcla/alumbre como 611, 749, 757, 914, animales con mezcla/Quil A como 544, 586, 597, 952, y animales con PNMT/QuilA 580, 593, 603, 748, las proteínas inmunogénicas utilizadas para las inmunizaciones son indicadas como control (proteína no immunorreactiva) , mezcla (PNMT, PDI, MSP en combinación) , y PNMT por si misma, indicando los adyuvantes alumbre y QuilA, respectivamente. Las reducciones en la carga parasitaria fueron determinadas a un promedio de 32.56% para los animales inmunizados con mezcla en alumbre, un promedio de 36.60% para los animales inmunizados con la mezcla en Quil A, y un promedio de 48.99% para los animales inmunizados con PNMT como la única proteína inmunogénica en Quil A, determinado en comparación a las inmunizaciones control, por ejemplo, sin la proteína inmunogénica. Los resultados de la tabla 1 son además apoyados por la observación de que la inmunización con una vacuna que comprende PNMT también reduce una longitud y anchura de las lombrices parasitarias individuales . Además, la tabla 1 muestra que los parásitos macho y hembra son igualmente afectados por la respuesta inmune provocada promovida por la vacuna de la invención. El apoyo adicional para el efecto de la inmunización con una vacuna que comprende PNMT es encontrado en el análisis de las cuentas larvales encontradas en las heces de estos terneros de prueba. Los resultados son dados en la siguiente tabla 2, dando los números totales de las lombrices para cada ternero, comenzando en el día 84, por ejemplo veintiún días después del inmunorreto hasta la fecha de la necrosis, que es el día 98. t t ) O -1^ t t ?n O Tabla 2: Continuación ) Las reducciones en la carga larval fueron determinadas a un promedio de 22.22% para los animales (611, 749, 757, 914) inmunizados con mezcla en alumbre, un promedio de 64.74% para los animales (544, 586, 597, 952) inmunizados con mezcla en Quil A, y un promedio de 62.9% para los animales (580, 593, 603, 748) inmunizados con PNMT como la única proteína inmunogénica en Quil A, determinada en comparación a las inmunizaciones control, por ejemplo, sin la proteína inmunogénica. Mejoramientos adicionales en la inmunoprotección son obtenidos utilizando los adyuvantes conocidos y mezclas de éstos . Los resultados de la sero-conversión de la prueba de vacunación I son descritos en las figuras 1 a la 10 y demuestran que una vacuna que comprende PNMT, sin proteína inumnogénica adicional, utilizando ya sea adyuvante de alumbre (animales 601, 756, 625 y 915) o QuilA (animales 593, 580, 603, y 748), induce la producción de anticuerpo en los terneros inmunizados específicamente dirigidos contra Dictyocaulus viviparus . Con detalle, la figura 1 demuestra la inducción de la igG por vacunas que contienen únicamente PNMT como un péptido inmunogénico específico, utilizando alumbre o Quil A como adyuvante, la figura 2 demuestra la inducción de una respuesta inmune específica de IgG dirigida contra Dictyocaulus viviparus por las composiciones de vacuna, que comprenden PNMT en mezcla con la proteína inmunogénica adicional, ejemplificada por la mezcla (Mix) de PNMT, paramiosina, ACE, MSP, y PDI , utilizando adyuvante de alumbre (animales 749, 757, 914 y 611) , o adyuvante QuilA (animales 544, 597, 586, y 952), respectivamente. Este efecto inmunoprotector de PNMT ya sea sin proteína inmunogénica específica adicional, o en combinación con proteína inmunogénica adicional es además demostrada para los mismos animales para IgGl en las Figuras 3 y 4, respectivamente, para IgG2 en las Figuras 5 y 6, respectivamente, para IgA en las Figuras 7 y 8, respectivamente, así como para IgM en las Figuras 9 y 10, respectivamente .

Prueba de vacunación II: Inmunización con a) combinación de PNMT, paramiosina, ACE, MSP y PDI , b) paramiosina, y c) PNMT. En una prueba de inmunización, una vacuna que comprende una combinación de proteínas que incluyen PNMT fueron probadas, a saber a) PNMT, paramiosina, ACE, MSP y PDI fueron comparadas a b) paramiosina y c) PNMT sin adición de proteína inmunogénica adicional. De manera interesante, los análisis muestran que la reducción más significativa en la carga parasitaria fue encontrada para las composiciones de vacuna que comprenden PNMT, preferentemente PNMT sin la adición de proteínas inmunogénicas adicionales. En esta prueba, se utilizó QuilA consistentemente como el adyuvante. La reducción de la carga parasitaria después de la necrosis de los terneros de prueba se da en la siguiente tabla 3. La reducción de la carga parasitaria fue de 10.72% en animales (754, 762, 790, 807, 810, 816) vacunados con a) la combinación de PNMT, paramiosina, ACE, MSP y PDI, 68.81% en animales (761, 809, 818, 821) vacunados con c) PNMT, y 54.44% en animales (806, 812, 813, 822) vacunados con b) paramiosina, en promedio, en comparación con las inmunizaciones control, por ejemplo, sin la proteína inmunogénica . t IO O Tabla 3: Número de parásitos adultos machos y hembras y reducción en comparación a los animales control 4^.

Estos resultados muestran que PNMT es el componente inmunogénico más efectivo de la composición de vacuna, para reducir el número de Dictyocaulus viviparus adultos dentro de animales infectados, y para la secreción de larvas con las heces . El análisis de las larvas secretadas con las heces de terneros de prueba artificialmente inmunizados e infectados se da en la siguiente tabla 4. Las reducciones en la carga larval fueron determinadas a un promedio de 45.26% para animales (754, 762, 790, 807, 810, 816) inmunizados con a) la combinación de PNMT, paramiosina, ACE, MSP y PDI , un promedio de 46.63% para animales (806, 812, 813, 822) inmunizados con b) paramiosina, y un promedio de 69.3% para los animales (761, 809, 818, 821) inmunizados con PNMT como la única proteína inmunogénica, determinada en comparación a las inmunizaciones control, por ejemplo, sin la proteína inmunogénica . to t O Tabla 4: Númro de larvas secretadas con las heces de los temeros de prueba, comenzando en el día 21 después de la infección artificial (día 84) hasta la necropsia en el día 97 En las tablas 1 a la 4, "Media" significa los números promedio de los totales de los terneros de prueba individuales de un grupo, por ejemplo, los terneros tratados idénticamente . Los resultados de la sero- conversión a partir de la prueba de vacunación II, por ejemplo, el efecto protector de la paramiosina y la mezcla se describen en las Figuras 11 a la 20, demostrando que una vacuna que comprende paramiosina, sin proteína inmunogénica adicional o en mezcla con proteína inmunogénica adicional (Mix) , induce producción de anticuerpo de terneros inmunizados específicamente dirigidos contra la paramiosina de Dictyocaulus viviparus (utilizada como el antígeno en la ELISA) . Con detalle, la figura 11 demuestra la inducción de la IgG por vacunas que contienen únicamente paramiosina como un péptido inmunogénico específico, la figura 12 demuestra la inducción de una respuesta inmune específica de IgG dirigido contra Dictyocaulus viviparus por las composiciones de vacuna que comprenden paramiosina con la proteína inmunogénica adicional, ejemplificada por la mezcla a) (Mix) de PNMT, paramiosina, ACE, MSP y PDI . Este efecto inmunoprotector de la paramiosina, ya sea sin la proteína inmunogénica específica adicional, o en combinación con la proteína inmunogénica adicional (Mix) es además demostrada para los mismos animales para IgGl en las Figuras 13 y 14, respectivamente, para IgG2 en las Figuras 15 y 16, respectivamente, para la IgA en las Figuras 17 y 18, respectivamente, así como para IgM en las Figuras 19 y 20, respectivamente . El efecto inmunoprotector de PNMT como la única proteína inmunogénica y la mezcla (Mix) es además apoyado por los resultados descritos en las figuras 21 a la 30, mostrando que una respuesta inmune que comprende una gran variedad de clases de anticuerpo, que están dirigidos específicamente contra PNMT de Dictyocaulus viviparus es promovida por las composiciones de vacuna que comprenden PNMT, opcionalmente en combinación con la proteína adicional. De manera interesante, las pruebas adicionales utilizando una combinación de PNMT y paramiosina o una combinación de PNMT y SOD dio como resultado una reducción menos pronunciada de la carga parasitaria de los terneros. Resultados especialmente satisfactorios fueron determinados para las composiciones de proteína que comprendían PNMT o paramiosina, incluso sin el péptido inmunogénico adicional, y por las composiciones de vacuna que comprendían una combinación de PNMT con al menos uno de SOD y paramiosina. Una alternativa a MSP o además de MSP, la adición de ACE y/o PDI a una vacuna que comprende una combinación de PNMT, paramiosina y SOD dio como resultado una reducción adicional de la carga parasitaria. Resultados de vacunación similares para la reducción de la carga de lombrices y larvas así como la sero-conversión fueron obtenidas con preparaciones de vacunas que comprenden secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, ADN, que codifica para la proteína inmunogénica. En consecuencia, la presente invención también proporciona las vacunas que comprenden secuencias de ácido nucleico, preferentemente ADN, que codifican para la proteína inmunogénica, preferentemente PNMT y/o paramiosina, opcionalmente en combinación con MSP, ACE y/o PDI así como epitopos inmunogénicos de estas proteínas. Preferentemente, las secuencias de ácido nucleico que codifican para la proteína inmunogénica o sus espitopos, que codifican opcionalmente para una combinación de epitopos de PNMT y/o paramiosina, opcionalmente en combinación con MSP, ACE y/o PDI, fueron enlazadas a las secuencias promotoras y/o aumentadoras en dirección 5 ' así como enlazadas a los elementos de terminación y/o de poliadenilación en dirección 3 Y Además, más de una primera secuencia de codificación puede estar contenida entre los elementos promotor y terminador, utilizando los elementos IRES en dirección 5 ' a la segunda secuencia de codificación, acomodada en dirección 3 ' a la primera secuencia de codificación. Con base en las proteínas inmunogénicas de esta invención, la persona experta es capaz de construir la secuencias de ácido nucleico adecuadas para la expresión de las proteínas inmunogénicas codificadas después de la administración al rumiante que va a ser inmunizado. Para la administración, la inyección intramuscular de estas construcciones de ácido nucleico es suficiente para la expresión de las proteínas inmunogénicas de la invención por las células del paciente.

Ejemplo 6: Epitopos de PNMT, SOD y paramiosina para inmunizar el ganado contra Dictyocaulus viviparus Los epitopos, que son regiones pequeñas de una molécula de una molécula de proteína hacia la cual el sistema inmune reconoce y responde, pueden ser identificadas y localizadas en PNMT, SOD y paramiosina, respectivamente. Esto fue realizado de acuerdo a métodos conocidos utilizando una tecnología de mapeo de epitopos, por ejemplo, digestión proteolítica de las proteínas enlazadas a los anticuerpos inmovilizados, combinado con la identificación espectrométrica de masa de deserción de láser, asistida por matriz, de los péptidos enlazados por afinidad, remanentes. Después de la identificación y la síntesis, estos péptidos fueron utilizados para la inmunización del ganado contra Dictyocaulus viviparus en un tratamiento de protección comparable al ejemplo 5, produciendo reducciones comparables en la carga de las lombrices. La vacunación con epitopos en vez de las proteínas puede ser ventajosa para reducir el potencial alergénico, que puede ser acompañado por respuestas inmunes atípicas o no específicas .

Ejemplo 7: Producción de anticuerpos de PNMT, SOD o paramiosina La presente invención también se refiere al uso de PNMT, SOD y paramiosina como antígenos para producir anticuerpos monoclonales o anticuerpos monoclonales que se enlazan a o neutralizan Dictyocaulus viviparus . Los protocolos ilustrativos para producir los anticuerpos son descritos por ejemplo por Harlow y Lañe (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (1988)) o Goding (Monoclonal antibodies. Principies and Practice, Academic Press, San Diego, California, USA (1996)). El inoculo para la producción del anticuerpo policlonal es preparado típicamente para dispersar el antígeno en un diluyente fisiológicamente tolerable tal como solución salina para formar una solución acuosa. Una cantidad inmunoestimuladora del inoculo con o sin adyuvante, es administrada a un mamífero, y el mamífero inoculado es luego mantenido por un periodo de tiempo suficiente para que el antígeno induzca los antígenos protectores anti-antígenos de Dictyocaulus viviparus . La dosis de refuerzo del antígeno pueden ser utilizadas a individuos que no están ya aprestados para responder al antígeno. Los anticuerpos pueden ser cosechados y aislados al grado deseado mediante técnicas bien conocidas, tales como fraccionamiento con alcohol y cromatografía en columna, o mediante cromatografía de afinidad; es decir, mediante el enlace del antígeno a un empaquetamiento de columna cromatográfica como SephadexMR, pasando el antisuero a través de la columna, con lo cual se retienen los anticuerpos específicos y se separan otras inmunoglobulinas (IgGs) y contaminantes, y luego se recuperan los anticuerpos purificados mediante elusión con un agente caotrópico, seguido opcionalmente por purificación adicional. Los anticuerpos policlonales fueron generados contra PNMT, SOD o paramiosina únicamente y combinaciones de estas proteínas (PNMT con SOD únicamente, PNMT con paramiosina únicamente, PNMT con SOD y paramiosina, y SOD con paramiosina) mediante inmunización con la proteína completa o fragmentos de proteína o péptidos de fusión que contienen epitopos antigénicos. En general, una composición de anticuerpo monoclonal que contiene únicamente una especie de anticuerpo que se enlaza a un epitopo. Los anticuerpos adecuados en la forma monoclonal a PNMT, SOD o paramiosina pueden ser preparados utilizando tecnología de hibridoma convencional. Para formar hibridomas a partir de los cuales es producida una composición anticuerpo monoclonal de la presente invención, un mieloma u otra línea celular de auto-perpetuamiento es fusionada con linfocitos obtenidos de sangre periférica, nodulos linfáticos o el bazo de un mamífero hiperinmunizado con el antígeno. Se prefiere que la línea celular de mieloma sea proveniente de la misma especie que los linfocitos. Los esplenocitos son típicamente fusionados con las células de mieloma utilizando polietilenglicol 1500. Los híbridos fusionados son seleccionados por su sensibilidad a HAT. Los hibridomas que secretan las moléculas de anticuerpo de esta invención pueden ser identificados utilizando un ensayo de ELISA. El inicio de un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio nutritivo que contiene un hibridoma que secreta las moléculas de anticuerpo de la especificidad apropiada, puede producir una combinación de anticuerpo monoclonal de la presente invención. El cultivo es mantenido bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo hacia el medio. El medio que contiene anticuerpo es luego recolectado. Las moléculas de anticuerpo pueden ser luego aisladas adicionalmente mediante técnicas bien conocidas. Las composiciones de anticuerpos monoclonales y policlonales producidas pueden ser utilizadas en inmunización pasiva, para proporcionar una reacción inmune para la prevención o tratamiento de la infección por Dictyocaulus viviparus . A este respecto, la preparación de anticuerpos puede ser una composición policlonal. Alternativamente, puede ser utilizada una mezcla "oligoclonal manipulada por ingeniería" , la cual es una mezcla de anticuerpos monoclonales.

Ejemplo 8 : Ensayo de diagnóstico de muestras bovinas para la presencia de antígenos de Dictyocaulus vi viparus o anticuerpos específicos contra éstos Las moléculas de ácido nucleico que codifican para PNMT, SOD y paramiosina, así como las proteínas que contienen epitopos codificados por estos ácidos nucleicos y anticuerpos dirigidos contra éstos, pueden ser utilizados como reactivos de diagnóstico para detectar la infección por Strongylida , especialmente por Di ctyocaulus viviparus . Un ejemplo para detectar la presencia o ausencia del mARN o el ADN genónico en una muestra biológica (por ejemplo, heces, suero o leche) es la transcripción inversa y la amplificación utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR), respectivamente. Estos métodos involucran el uso de oligonucleótidos sintéticos adecuados como cebadores para la PCR capaces de hibridarse a los ácidos nucleicos. Las secuencias de tales cebadores pueden ser fácilmente establecidas por aquellos expertos en la técnica para ser específicos para las secuencias nucleotídicas dadas como Seq ID Nos. 11 a 15 para PNMT, Seq ID Nos. 21 y 22 para SOD y Seq ID No. 25 para paramiosina, respectivamente. Los cebadores pueden tener en general de 10 a 40 nucleótidos, preferentemente de 15 a 25 nucleótidos. Además, las sondas de ácido nucleico marcadas capaces de hibridar al mARN o al ADN genómico, específicos para los genes de PNMT, SOD o paramiosina son herramientas de diagnósticos adecuadas. La sonda de ácido nucleico puede ser por ejemplo, un ácido nucleico de longitud completa o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido suficiente para hibridarse específicamente al mARN o al ADN genómico de los genes de PNMT, SOD o paramiosina, respectivamente, por ejemplo en hibridación de Northern o Southern. Además, los antígenos PNMT, SOD y paramiosina, péptidos sintéticos que comprenden epitopos específicos para estos antígenos, o anticuerpos dirigidos contra éstos, son útiles en la producción de inmunoensayos de diagnóstico para detectar la presencia de antígenos de Dictyocaulus viviparus , preferentemente el antígeno de PNMT y/o anticuerpos anti-Dictyocaulus viviparus, preferentemente anticuerpos anti-PNMT, contenidos en una muestra biológica tal como suero, preferentemente la leche. Cualquier antígeno de Dictyocaulus viviparus o anticuerpos específicos para el anticuerpo de Dictyocaulus viviparus , preferentemente PNMT o el anticuerpo anti -PNMT es mezclado con una muestra sospechosa de contener el anticuerpo o antígeno de Dictyocaulus vi viparus, respectivamente, y monitorizada para el enlace antígeno-anticuerpo. En una modalidad preferida, el antígeno o el anticuerpo de la prueba es movilizado sobre una matriz sólida, tal que el antígeno o el anticuerpo es accesible al anticuerpo o al antígeno complementario, respectivamente, a partir de la muestra para hacer contacto con una superficie de la matriz. La muestra es luego puesta en contacto con la superficie de la matriz, y la superficie es monitorizada para el enlace antígeno-anticuerpo. Preferentemente, el antígeno o el anticuerpo tendrá un nivel detectable. Los anticuerpos son policlonales, o más preferentemente, monoclonales. Un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab')2) puede ser utilizado. El término "marcado" está destinado a abarcar la marcación directa por acoplamiento (por ejemplo, enlace físico) de una sustancia detectable así como la marcación indirecta por reactividad con otro reactivo que es directamente marcado. La marcación indirecta es por ejemplo la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado fluorescente o de otro modo. Por ejemplo, el antígeno o el anticuerpo puede ser utilizado en un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) , en el cual el antígeno o el anticuerpo proveniente de una muestra es enlazado a una fase sólida y un conjugado específico enzima-anticuerpo o enzima-antígeno, preferentemente, anticuerpo anti-PNMT Ab o PNMT, respectivamente, es utilizado para detectar y/o cuantificar el anticuerpo o el antígeno presente en una muestra. Alternativamente, puede ser también utilizado el ensayo Western blot, en el cual los antígenos solubilizados y separados provenientes de una muestra son enlazados a una membrana de nitrocelulosa. El anticuerpo es luego detectado por una anti- inmunoglobulina conjugada a una enzima o a un marcador (Ig), tal como conjugado peroxidasa de rábano Ig mediante la incubación de la membrana en presencia de un sustrato precipitable o detectable. Los ensayos de transferencia de Western tienen la ventaja de no requerir pureza mayor de 50% para el antígeno deseado. La invención también abarca los kits para detectar la presencia de Dictyocaulus viviparus en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto o agente marcado para detectar PNMT, posiblemente en combinación con SOD o paramiosina en términos de los ácidos nucleicos, proteínas o anticuerpos para ellos, por ejemplo, un kit de diagnóstico puede comprender las sondas de ácido nucleico específicas para el mARN y/o ADN que codifica paramiosina, PNMT y/o SOD, puede comprender el anticuerpo monoclonal y/o policlonal específico para PNMT, y opcionalmente además del anticuerpo específico para la paramiosina y/o SOD o puede comprender la proteína que comprende los epitopos de PNMT (por ejemplo, las secuencias naturales de longitud completa heterólogamente expresadas) . Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

1. Una vacuna adecuada para promover inmunoprotección contra Dictyocaulus sp . en rumiantes, caracterizada porque comprende proteína que incluye epitopos inmunoprotectores de paramiosina y/o PNMT (fenil-etanolamina-N-metiltransferasa) , cada uno obtenible de Dictyocaul us sp .

2 . La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína que comprende los epitopos inmunoprotectores de paramiosina es la paramiosina de longitud completa o longitud parcial y la proteína que comprende los epitopos inmunoprotectores de PNMT es PNMT de longitud completa o de longitud parcial.

3. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende además epitopos inmunoprotectores de al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste de MSP (proteína mayor de esperma obtenible de Dictyocaulus spp . ) , ACE (acetilcolina-esterasa obtenible de Dictyocaulus spp . ) , PDI (proteína disulfuro- isomerasa obtenible de Dictyocaulus spp . ) , y SOD obtenible de Dictyocaulus spp.

4. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los epitopos están contenidos en proteínas que son esencialmente idénticas al producto de traducción natural del genoma de Dictyocaulus viviparus .

5. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque Dictyocaulus sp. es Dictyocaulus viviparus .

6. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el PNMT comprende al menos una porción de la Seq ID Nos. 16 a 20, SOD comprende al menos una porción de una de las Seq ID Nos 23 ó 24, paramiosina comprende al menos una porción de la Seq ID No 26, MSP comprende al menos una porción de la Seq ID No 28, ACE comprende al menos una porción de la Seq ID No 30, y PDI comprende al menos una porción de las Seq ID Nos. 33 y 34.

7. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la PNMT es codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida a una de las Seq ID Nos. 11 a 15, SOD es codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida a una de las Seq ID Nos. 21 y 22, paramiosina es codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida a la Seq ID No 25, MSP es codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida a la Seq ID No 27, ACE es codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida a la Seq ID No 29, y PDI es codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida a una de las Seq ID Nos. 31 y 32.

8. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el rumiante es ganado bovino.

9. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la proteína que comprende los epitopos inmunoprotectores de paramiosina y/o PNMT (fenil-etanolamina-N-metiltransferasa) , cada uno obtenible de Dictyocaul us sp . , es reemplazada por una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína .

10. La paramiosina, caracterizada porque es obtenible de Dictyocaul us sp .

11. La PNMT (fenil-etanolamina-N-metiltransferasa) , caracterizada porque es obtenible de Dictyocaulus sp.

12. El anticuerpo caracterizado por una especificidad contra una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. Un método analítico para la determinación de la presencia de un nemátodo parásito del género Strongylida en un animal, caracterizado por el uso de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11.

14. El método analítico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el uso de una proteína que comprende al menos un epitopo de paramiosina y/o al menos un epitopo de PNMT (fenil-etanolamina-N- etiltransferasa) , es cada uno obtenible de Dictyocaulus viviparus .

15. El método analítico de conformidad con las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque analiza leche o suero.

16. Un método para la inmunización pasiva, caracterizado por el uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12.

17. Un método para la producción de una vacuna para rumiantes, caracterizado porque se produce una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado por la expresión heteróloga de al menos uno de los compuestos peptídicos.