CN116121250A - 一种抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs，所述重组siRNAs的序列为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示序列中的一种，或者为与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示序列中的一种相似度达90％以上的序列。另外，本发明还公开了该重组siRNAs的应用。本发明的重组siRNAs具有很好的生物学活性，并且能够在体外显著降低Ⅰ型单纯疱疹病毒的滴度，在体内显著降低皮肤表面病毒载量，提高动物存活率，且具有产量高、成本低、功能性好等优点。

Description

一种抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs及其应用。
背景技术
Ⅰ型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV1)是一种传染率极高的人α亚科-疱疹病毒。感染HSV1主要导致口唇疱疹，在少数免疫缺陷患者中可导致角膜炎、脑炎等并发症，人群普遍易感(成年人血清阳性率高达85％以上)。该病毒主要通过口对口接触传播，绝大多数人感染HSV1是在儿童时期感染上的，持续终生。当前，HSV1防治方法仍存在重大挑战，尚无特效治疗药物，也无疫苗上市。
RNAi(RNA interference)是指由RNA分子介导的基因抑制，RNAi在基因功能研究和疾病治疗方面都有广泛的应用，目前已有多种基于RNAi的药物获得FDA批准或进入临床试验。逐年增加的RNA类药物获批数量充分证明了RNA疗法的可行性，也说明了RNA疗法作为新一代治疗方案正在快速发展当中。
RNA类新药开发以及RNA的功能研究已经掣肘于RNA原料的获取。目前用于ncRNA研究的RNA试剂，主要采用化学或体外转录合成。这些合成方法生产的RNA，不仅价格昂贵，而且产率很低。因此，RNA疗法的开展，还需新兴生物技术的介入，以大大降低研究/医疗成本。利用重组tRNA支架在活细胞内生产表达小分子RNA已经应用于多个研究领域，取得了良好的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs。该重组siRNAs具有很好的生物学活性，并且能够在体内外显著降低HSV1的病毒滴度，在动物实验中能够显著降低皮肤表面病毒载量，延长动物存活率，且具有产量高、成本低、功能性好等优点。与传统的小分子药物相比，siRNA药物可以直接作用于病毒的基因组，利用碱基互补配对原则来干扰病毒mRNA表达，显著抑制病毒的复制，降低病毒载量。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs，其特征在于，所述重组siRNAs的序列为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示序列中的一种，或者为与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示序列中的一种相似度达90％以上的序列。
上述的一种抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs，其特征在于，所述重组siRNAs生产过程中以HSV1基因组不同位置为靶点，设计小干扰RNA，所述小干扰RNA的序列如SEQ IDNO：11至SEQ ID NO：20所示。
进一步地，本发明提供了一种上述重组siRNAs在制备具有体外/内降低Ⅰ型单纯疱疹病毒滴度，延长动物存活率的基因组试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。
更进一步地，本发明提供了一种上述重组siRNAs在制备具有抗Ⅰ型单纯疱疹病毒活性的试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。
本发明的抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs的生产方法，包括以下步骤：
步骤一、设计合成嵌合siRNAs序列的hsa-miR-34a前体引物；
步骤二、利用pBSKrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点，将重组siRNAs的前体序列插入pBSKrnaSeph质粒中，构建表达载体；
步骤三、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌；
步骤四、大肠杆菌培养扩增后，提取菌内总RNA，以FPLC分离纯化目标重组siRNAs。
本发明以人角质形成细胞(HaCaT)、人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)、人神经母细胞瘤细胞(SY5Y)为细胞模型，检测了重组siRNAs抗HSV1的活性，包括：
一、利用表达的重组siRNAs在HaCaT、ARPE19、SY5Y中进行转染，利用Stem loopqPCR技术检测重组siRNAs成熟体表达量；
二、将重组siRNAs在HaCaT、ARPE19、SY5Y中进行转染并感染HSV1病毒，利用qPCR技术检测重组siRNAs对靶基因的抑制情况；
三、将重组siRNAs在HaCaT、ARPE19、SY5Y中进行转染并感染HSV1病毒，利用空斑法检测重组siRNA抗病毒效果；
四、在疱疹性皮肤病动物感染模型中，将HSV1滴加在小鼠皮肤上后并连续5天在小鼠皮肤上涂抹柔性脂质体包裹的重组siRNAs，评价重组siRNAs对小鼠体内病毒载量和保护率的影响。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明利用新型tRNA支架表达的具有生物学活性的siRNAs相比于化学合成的siRNA，产量高，价格低廉，活性和安全性更高。
2、本发明的重组siRNAs具有很好的生物学活性，并且能够在体内外显著降低HSV1的病毒滴度，在动物实验中能够显著降低皮肤表面病毒载量，延长动物存活率，且具有产量高、成本低、功能性好等优点。与传统的小分子药物相比，siRNA药物可以直接作用于病毒的基因组，利用碱基互补配对原则来干扰病毒mRNA表达，显著抑制病毒的复制，降低病毒载量。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例1利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大肠杆菌中重组siRNA的表达；
图2为本发明实施例2利用Bio-Rad NGCTM Chromatography System纯化重组siRNA，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度；
图3为本发明实施例3利用Stem loop qPCR技术检测在HaCaT、ARPE19、SY5Y后成熟体表达含量结果图；
图4为本发明实施例4利用qPCR技术在mRNA水平检测在HaCaT、ARPE19、SY5Y转染重组siRNA 24h后，感染HSV1病毒48h后，其对靶基因的抑制结果图；
图5为本发明实施例5利用空斑法检测HaCaT、ARPE19、SY5Y转染重组siRNA 24h后，感染HSV1病毒48h后，其对病毒滴度影响结果图；
图6为本发明实施例6利用免疫荧光实验技术检测转染重组siRNA 48h后，感染HSV1的ARPE19中的病变细胞数量，以评价重组siRNA的抗病毒效果的结果图；
图7为本发明实施例7利用qPCR技术检测HSV1感染小鼠经过重组SSA(重组r/si-UL8-1的阴性对照)、r/si-UL8-1和阿昔洛韦(ACV)治疗后，小鼠皮肤表面病毒载量的结果图；
图8为本发明实施例7观察HSV1感染后小鼠经过重组SSA、r/si-UL8-1治疗后，小鼠存活率的结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术。
本发明的重组siRNAs的序列为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示序列中的一种，或者为与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示序列中的一种相似度达90％以上的序列。
本发明的小干扰RNA的序列如SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：20所示。
本发明的重组siRNAs的生产方法包括：
步骤一、针对HSV1基因组设计了10对siRNA，合成嵌合siRNAs序列的hsa-miR-34a前体引物；
步骤二、利用pBSKrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点，将重组siRNAs的前体序列插入pBSKrnaSeph质粒中，构建表达载体；所述tRNA支架的序列为基于与人丝氨酸tRNA序列设计，其tRNA部分为与人丝氨酸tRNA序列相似度达90％以上的序列，所述人丝氨酸tRNA序列如SEQ ID NO：21所示；重组siRNAs的前体序列为成熟序列部分被取代的hsa-miR-34a前体序列，所述hsa-miR-34a前体序列如SEQ ID NO：22所示；
步骤三、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌；
步骤四、大肠杆菌培养扩增后，提取菌内总RNA，以FPLC分离纯化目标重组siRNAs。
下面以重组r/si-UL8-1(SEQ ID NO：1)为例，具体介绍本发明重组siRNAs的生产方法：
实施例1：以pBSKrnaSeph/has-mir-34a表达载体构建重组siRNA表达质粒，表达重组siRNAs。
(1)根据重组r/si-UL8-1的有效序列，以及pBSKrnaSeph/has-mir-34a表达载体上的序列设计引物，命名为mir-34a/重组r/si-UL8-1，同时在引物的两端加上1-15nt载体插入位点两侧的同源序列。
(2)插入片段的合成
以表1中的两条引物互为模板，利用pBSKrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点，将重组r/si-UL8-1的前体序列插入pBSKrnaSeph质粒中，构建表达载体；反应体系如表1所示，反应过程如表2所示：
表1聚合酶体外扩增链反应体系(50μL)
Figure BDA0003998297310000051
Figure BDA0003998297310000061
表2聚合酶体外扩增链反应过程
Figure BDA0003998297310000062
(3)pBSKrnaSeph/has-mir-34a载体的双酶切
用Eag I-HFTM，Sac II限制性内切酶对载体进行37℃酶切，反应体系如表3所示。
表3 50μL双酶切体系
Figure BDA0003998297310000063
(4)酶切质粒以及PCR片段的回收及纯化
将PCR产物和酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用OMEGA公司的胶回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit)进行回收纯化。在凝胶成像系统中用365nm的紫外光观察琼脂糖凝胶电泳后的DNA分离结果，用刀片小心切下带有目的DNA区带的凝胶，尽可能切下更少的胶，放入1.5mL的EP离心管中；称取凝胶的质量；按照1:1的体积比向装有琼脂糖凝胶的离心管中加入Binding Buffer结合缓冲液，并将混合物放于60℃-65℃水浴中7min，期间每隔两到三分钟振荡混合一次，直至凝胶完全融化；将融化后得到的溶液转移到DNAMini Column离心柱中，并将离心柱放入2mL的Collection Tube收集管中；10000rpm离心1min。每次离心的溶液体积最多为700μL，可将溶液分多次离心，直至全部离心完，并弃去收集管中的滤液，重复利用收集管；在离心柱中加入700μL的添加过无水乙醇的SPW WashBuffer。放于离心机中10000rpm，室温离心1min，重复此步骤一次；弃去滤液，将离心柱以13000rpm的转速室温下离心2min，以彻底除去纯化柱中的乙醇；将离心柱置于全新干净的离心管中。向离心柱中央悬空滴加30～100μL的Elution Buffer洗脱液，静置2min使DNA完全溶解在洗脱液中。放于离心机中以13000rpm的转速室温离心1min，回收管底的洗脱液。取少量洗脱液进行DNA凝胶电泳测定是否为目的产物，贮存于-20℃。
(5)插入片段与载体的连接
胶回收片段用
Figure BDA0003998297310000072
Ligation-Free Cloning System进行连接，反应体系如表4所示。
表4无缝连接反应体系(20μL)
Figure BDA0003998297310000071
混匀后，置于37℃孵育30min；转化大肠杆菌HST08感受态细菌；对克隆菌落进行氨苄青霉素抗性筛选。
(6)DNA测序鉴定重组r/si-UL8-1表达载体
挑取单克隆菌落，于含有氨苄的LB培养基中培养约8h。取100μL菌液，送擎科生物科技有限公司，用测序引物M13Fow-GTAAAACGACGGCCAGT，Rev-CAGGAAACAGCTATGAC进行DNA测序鉴定。
(7)200ng重组r/si-UL8-1表达质粒转化HST08感受态细菌后，加入5mL LB培养基在37℃，200rpm震荡培养过夜。菌液经10000g离心2min后，收集沉淀。于沉淀中加入180μL10mM醋酸镁-Tris·HCl溶液重悬，再加入200μL的饱和苯酚，室温振摇20-60min。10000g离心10min后收集水相，加入0.1倍水相体积的5M NaCl沉淀大分子杂质。上清液再加入2倍体积无水乙醇，10000g离心10min后，弃掉上清。吸水纸吸干残留乙醇，待RNA干燥后加入DEPC水溶解RNA，测定浓度，-80℃冰箱保存。
(8)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
将2μg RNA样品与2×RNA上样缓冲液混合，加入变性胶样品孔内。120～150V电泳40～60min后，放入含0.5μg/mL溴化乙锭的溶液中轻摇20～30min，于凝胶成像系统下观测，拍照保存。
图1是本实施例利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大肠杆菌中重组r/si-UL8-1的表达。转化重组r/si-UL8-1表达质粒的细菌总RNA在150-300nt之间多了一条带。结果表明，重组siRNA表达质粒在大肠杆菌中可以高表达重组r/si-UL8-1。
实施例2：FPLC纯化重组r/si-UL8-1
(1)采用Bio-Rad NGCTM Chromatography System，以离子交换柱(ENrichTM Q10×100Column)纯化重组r/si-UL8-1。
流动相A：10mM NaH2PO4溶液，pH7.0。流动相B：10mM NaH2PO4溶液，1M NaCl溶液，pH7.0。流速为2.0mL/min。以DEPC水，流动相A，流动相B分别交替冲洗色谱柱约1h。每次冲洗5柱体积。
运行以下程序对总RNA进行分离：0～8.9min(0％ B)，8.9～13.7min(55％ B)，13.7～53.7min(55～75％ B)，53.7～73.7min(75～85％ B)，73.7～83.7min(100％ B)，83.7～93.7min(0％B)。以260nm的吸光度检测RNA，并收集重组RNA所对应的峰。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度。
(2)RNA样品处理方法
总RNA提取步骤同上。所提取的总RNA于4℃13000rpm离心10min后，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，每次进样5-10mg。
(3)FPLC组分收集及浓缩去盐
以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。混合后的各组分用2倍体积无水乙醇沉淀RNA，-80℃冰箱放置约1h。以10000g转速于4℃离心10min收集RNA。将所得RNA沉淀用DEPC水溶解，用tra-2mL Centrifugal Filters 4℃7500g离心10min，去滤液，重复此步骤直至所有溶液离心完，再将Filters倒置，2000g离心2min，收集所得溶液，测定浓度后于-80℃保存。
图2是本实施例利用Bio-Rad NGCTM Chromatography System纯化重组siRNAs(重组r/si-UL8-1)，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。结果表明，经FPLC纯化后，可得到高纯的重组r/si-UL8-1。
实施例3：重组r/si-UL8-1在细胞内的加工、成熟
(1)重组siRNAs转染
将HaCaT、ARPE19和SY5Y以1×105接种到12孔板中，待细胞贴壁展开后，更换培养基为空白DMEM，将重组r/si-UL8-1加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂lipo2000加入到一定量的空白DMEM培养基中各自孵育5min，然后将lipo2000与DMEM孵育物加入到重组r/si-UL8-1与DMEM孵育物中，混匀静置20min，然后将孵育物加入到对应的12孔板中，重组r/si-UL8-1终浓度为10nM，6h后更换为10％ FBS DMEM培养基。
(2)RNA提取
按照RNA提取说明书提取RNA，所得RNA后冻于-80℃冰箱保存。
(3)qPCR检测检测重组r/si-UL8-1在细胞内的表达
利用反转录试剂盒对RNA进行反转录，反转录产物冻于-20℃，具体过程如下：
a:gDNA消化，在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液枪轻轻吹打混匀。42℃2min。
表5Stem loop qPCR gDNA消化反应体系
Figure BDA0003998297310000101
b:反转录反应体系配制(20μL体系)
表6Stem loop qPCR cDNA逆转录反应体系
Figure BDA0003998297310000102
取上述已反转录好的cDNA，稀释5倍，以GAPDH为内参，利用stem loop qPCR方法检测细胞内重组siRNA的表达量，qPCR反应程序如下：95℃，2min；95℃，5s，60℃，30s，39个循环；95℃，5s；65℃，5s；95℃，50s。所使用的引物序列如下：
表7Stem loop qPCR引物
Figure BDA0003998297310000103
Figure BDA0003998297310000111
图3是本实施例利用Stem loop qPCR技术检测重组r/si-UL8-1在ARPE19中的加工和成熟(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用Students’t检验，***P<0.001)。与阴性对照(SSA)相比，成熟si-UL8-1表达显著升高，表明重组r/si-UL8-1在ARPE19细胞中被加工为成熟siRNA。
实施例5：重组r/si-UL8-1对靶基因(UL8)的调控作用
根据HSV1基因组(X04370.1)设计siRNA序列，检测利用tRNA支架表达重组r/si-UL8-1是否能够特异性敲低靶基因的表达。
1.qPCR检测靶基因的敲低效果
(1)重组siRNAs转染及病毒感染
将HaCaT、ARPE19和SY5Y以1×105接种到12孔板中，待细胞贴壁展开后，更换培养基为空白DMEM/，将重组r/si-UL8-1加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂lipo2000加入到一定量的空白DMEM培养基中各自孵育5min，然后将lipo2000与DMEM孵育物加入到重组r/si-UL8-1与DMEM孵育物中，混匀静置20min，然后将孵育物加入到对应的12孔板中，重组r/si-UL8-1为10nM，转染6h后换为10％ FBS DMEM培养基，24h后弃去培养基并感染HSV1病毒(moi＝0.1)，感染2h后，DPBS洗2遍后加入含2％ FBS的DMEM培养基中。
(2)RNA提取
RNA提取说明书提取RNA，所得RNA后冻于-80℃冰箱保存。
(3)qPCR检测靶基因(UL8)表达
利用反转录试剂盒对RNA进行反转录，反转录产物冻于-20℃，具体过程如下：
a:gDNA消化
在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃2min。
表8Real time qPCR gDNA消化反应体系
Figure BDA0003998297310000121
b:逆转录反应体系配制(20μL体系)
表9Real time qPCR cDNA逆转录反应体系
Figure BDA0003998297310000122
取上述已反转录好的cDNA，稀释5倍，以18S为内参，利用qPCR方法检测细胞内靶基因(UL8)表达量，qPCR反应程序如下：95℃，2min；95℃，5s，60℃，30s，39个循环；95℃，5s；65℃，5s；95℃50s。所使用的引物序列如下：
表10重组r/si-UL8-1 qPCR引物
Figure BDA0003998297310000123
图4是本实施例中利用qPCR技术检测检测重组r/si-UL8-1对Ⅰ型-单纯疱疹病毒(HSV1)靶基因UL8的敲低作用(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用Students’t检验，**P<0.01，***P<0.001)。与阴性对照(SSA)组相比，重组r/si-UL8-1能够显著抑制靶基因的表达，表明重组r/si-UL8-1具有生物学活性。
对本发明其他重组siRNAs进行实验，结果显示同样能够显著抑制靶基因的表达，表明本发明的重组siRNAs具有生物学活性。
实施例6：重组r/si-UL8-1体外抗病毒效果评价
1.空斑法检测重组r/si-UL8-1抗病毒效果
(1)重组r/si-UL8-1转染及病毒感染
将HaCaT、ARPE19和SY5Y以1×105接种到12孔板中，待细胞贴壁展开后，更换培养基为空白DMEM，将重组r/si-UL8-1加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂lipo2000加入到一定量的空白DMEM培养基中各自孵育5min，然后将lipo2000与DMEM孵育物加入到重组r/si-UL8-1与DMEM孵育物中，混匀静置20min，然后将孵育物加入到对应的12孔板中，重组r/si-UL8-1终浓度为10nM，转染6h后换液为10％ FBS DMEM培养基，24h后弃掉培养基并感染HSV1病毒(moi＝0.1or 1)，感染2h后用DPBS洗2遍后加入含2％ FBS的DMEM培养基中。
(2)空斑法检测
在12板中接种Vero E6细胞，待细胞长至90％密度以上时，将上述(1)感染24h后的样本分别梯度稀释(10-1至10-7次方)后感染Vero E6细胞，感染2h后，弃掉病毒液，加入维持培养基覆盖液—1.6％甲基纤维素-DMEM(2％ FBS)后放置细胞培养箱培养3d，最后弃掉覆盖液，用DPBS清洗3-5遍，将残留覆盖液清洗干净后加入结晶紫染液室温染色10min，用自来水轻轻将残留的结晶紫洗干净，晾干，数空斑，计算病毒滴度。病毒原液滴度(PFU/mL)＝12孔板斑点数×病毒稀释倍数/12孔板接种病毒量(mL)。
图5是本实施例中利用空斑法检测重组r/si-UL8-1对Ⅰ型-单纯疱疹病毒滴度的影响(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用Students’t检验，***P<0.001，****P<0.001)。如图所示，与阴性对照SSA相比，重组r/si-UL8-1能够显著降低病毒滴度，表明重组r/si-UL8-1具有显著的抗病毒活性。
2.免疫荧光(IF)实验评价重组r/si-UL8-1抗病毒效果
(1)重组siRNAs转染及病毒感染
将ARPE19以1×105接种到12孔板中，待细胞贴壁展开后，更换培养基为空白DMEM，将重组r/si-UL8-1加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂lipo2000加入到一定量的空白DMEM培养基中各自孵育5min，然后将lipo2000与DMEM孵育物加入到重组r/si-UL8-1与DMEM孵育物中，混匀静置20min，然后将孵育物加入到对应的12孔板中，重组r/si-UL8-1终浓度为10nM，转染6h后换液为10％ FBS DMEM培养基，24h后弃掉培养基并感染HSV1病毒(moi＝0.1)，感染2h后用DPBS洗2遍后加入含2％ FBS的DMEM培养基中。
(2)免疫荧光染色
感染24h后，弃掉12孔板中的培养基，DPBS洗2遍，加入4％多聚甲醛固定30min，DPBS洗2遍，加入0.5％ Triton-X100室温破膜10min，DPBS洗2遍，加入3％ BSA封闭30min(现配现用)，DPBS洗2遍，加入HSV1 gD一抗(1：100，Santa)4℃过夜，第二天DPBS洗5遍，加入cy5标记的鼠源二抗(1：500，CST)室温避光孵育1h，弃去二抗，DPBS洗5遍，加入细胞核染料DAPI(1：10000)室温孵育5min，弃去染料，DPBS洗5遍，利用荧光倒置显微镜进行观察拍照(如图6)。
图6是本实施例中利用免疫荧光技术(IF)检测重组r/si-UL8-1对Ⅰ型-单纯疱疹病毒(HSV1)荧光数量的影响(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用Students’t检验，*P<0.05)。如图所示，与阴性对照SSA相比，重组r/si-UL8-1能够显著降低病毒荧光数量，表明重组r/si-UL8-1具有显著的抗病毒活性。
对本发明其他重组siRNAs进行实验，结果相似，表面本发明其他重组siRNAs同样能够显著降低病毒滴度，显著降低病毒荧光数量，表明本发明的重组siRNAs具有显著的抗病毒活性。本发明的重组siRNAs可用于制备具有体外/内降低Ⅰ型单纯疱疹病毒滴度，延长动物存活率的基因组试剂、前药、药物、原料药或药物组合；可用于制备具有抗Ⅰ型单纯疱疹病毒活性的试剂、前药、药物、原料药或药物组合。
实施例7：重组r/si-UL8-1体内抗病毒效果评价
(1)动物造模
将6-8周大小的雌性C57/B6 J小鼠腹腔注射100μL浓度为8％的戊巴比妥钠麻醉剂，利用脱毛膏将小鼠左侧毛发脱离干净，随后在小鼠脊椎外侧，脾上方滴入10μL HSV1病毒(2×106p.f.u/只)，用27G大小针头来回刮20下促进病毒吸收。
(2)药物治疗
在攻毒6h后首次在小鼠皮肤上涂抹40μg柔性脂质体包裹的SSA和r/si-UL8-1，随后每隔24h在小鼠皮肤上涂抹利用柔性脂质体包裹的SSA和r/si-UL8-1或给小鼠进行灌胃(阿昔洛韦组，6mg/只)，连续5天药物治疗后，停止药物治疗，对小鼠病毒载量和小鼠体重、存活率进行统计。
(3)病毒载量检测
1)RNA提取
将上述动物皮肤组织样本加入trizol裂解液后，加入磁珠后，利用组织研磨仪进行破碎研磨，利用Omega RNA提取说明书进行后续RNA提取，所得RNA后冻于-80℃冰箱保存。
2)皮肤组织病毒载量测定
利用反转录试剂盒对RNA进行反转录，反转录产物冻于-20℃，具体过程如下：
a:gDNA消化
在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃2min。
表8Real time qPCR gDNA消化反应体系
Figure BDA0003998297310000161
b:逆转录反应体系配制(20μL体系)
表9Real time qPCR cDNA逆转录反应体系
Figure BDA0003998297310000162
取上述已反转录好的cDNA，稀释5倍，以18S为内参，利用qPCR方法检测细胞内靶基因(UL8)表达量，qPCR反应程序如下：95℃，2min；95℃，5s，60℃，30s，39个循环；95℃，5s；65℃，5s；95℃50s。所使用的引物序列如下：
表10重组r/si-UL8-1 qPCR引物
Figure BDA0003998297310000163
图7是本实施例中利用qPCR技术检测检测重组r/si-UL8-1对HSV1病毒载量的检测(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用Students’t检验，**P<0.01)。与阴性对照(SSA)组相比，重组r/si-UL8-1能够显著降低病毒载量，表明重组r/si-UL8-1具有生物学活性。
(4)小鼠体重、存活率影响
按照上述(1)和(2)步骤对小鼠进行造模和药物治疗，每天观察小鼠体重和生存情况
图8是本实施例中的对小鼠存活率的统计。与空白对照(Blank)阴性对照(SSA)组相比，重组r/si-UL8-1能够显著降低病毒载量，表明重组r/si-UL8-1具有生物学活性。
对本发明其他重组siRNAs进行实验，结果相似，说明本发明其他重组siRNAs能够显著降低病毒载量，表明本发明的重组siRNAs具有生物学活性。本发明的重组siRNAs可用于制备具有抗Ⅰ型单纯疱疹病毒活性的试剂、前药、药物、原料药或药物组合。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (4)

1.一种抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs，其特征在于，所述重组siRNAs的序列为SEQID NO：1至SEQ ID NO：10所示序列中的一种，或者为与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示序列中的一种相似度达90％以上的序列。
2.根据权利要求1所述的一种抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs，其特征在于，所述重组siRNAs生产过程中以HSV1基因组不同位置为靶点，设计小干扰RNA，所述小干扰RNA的序列如SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：20所示。
3.一种如权利要求1所述重组siRNAs在制备具有体外/内降低Ⅰ型单纯疱疹病毒滴度，延长动物存活率的基因组试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。
4.一种如权利要求1所述重组siRNAs在制备具有抗Ⅰ型单纯疱疹病毒活性的试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。
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