CN115963274A

CN115963274A - 一种心肌肌钙蛋白i的检测试剂及方法

Info

Publication number: CN115963274A
Application number: CN202211230474.6A
Authority: CN
Inventors: 任江涛; 呼思乐; 何柳; 汪尔康; 李敬
Original assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Current assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2023-04-14

Abstract

本发明提供了一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂，包括：第一标记物标记的cTnI适配体和第二标记物标记的辣根过氧化物酶共价连接物；所述第一标记物和第二标记物可结合。本发明还提供了检测试剂的应用、检测试剂盒以及检测方法。本发明以cTnI适配体代替信号抗体对cTnI进行检测，核酸适配体作为分子识别元件具有体外合成简单、稳定性良好、易于序列设计与修饰等诸多优良特性，从而在保证灵敏度的基础上降低了制备难度，无需复杂且高成本的DNA扩增技术以及纳米材料合成与修饰，方法简单且成本低。进一步的，本申请在信号适配体溶液中加入白蛋白作为支持剂，显著提高了该方法的灵敏度、重复性、复杂样品适用性以及稳定性。

Description

一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂及方法。

背景技术

心血管疾病(如心肌梗塞)的早期诊断对于提高患者生存率以及病后生存质量至关重要。近十几年来，人们不断开发出针对各种心血管疾病生物标志物的简单、灵敏、快速检测方法。基于抗体的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是目前市场上最常见的疾病标志物检测策略，其基本步骤是：将一抗体(捕获抗体)通过吸附包被在固定相上，依次加入待测抗原目标物以及生物酶标记的另一抗体(信号抗体)，进而形成捕获抗体-抗原-信号抗体的三明治结构，最后利用酶催化反应产生有色产物并借助于紫外分光光度计或者酶标仪标定抗原的含量。

心肌肌钙蛋白I(cTnI)是其中一种可反映早期心肌损伤的重要生物标志物。近年来，人们筛选获得了多条cTnI适配体，报道了用于检测cTnI的适配体传感方法与器件，采用了紫外吸收、荧光、拉曼、电化学发光以及电化学等诸多信号读取方式，并且引入纳米材料以及DNA扩增技术进一步提高了检测灵敏度。然而，人们在追求高灵敏度的同时也面临诸多问题，如复杂的界面修饰与操作过程，不稳定微纳米材料制备、修饰与使用等，这些严重削弱了适配体方法或器件的重复性与未来商业化的可能性。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种灵敏度高、重复性好且稳定性好的心肌肌钙蛋白I的检测试剂及方法。

核酸适配体是一种人工筛选出来能够特异性结合配体(如蛋白质、小分子等)的DNA或者RNA链，其与配体的结合常数可达到纳摩尔甚至皮摩尔水平，与单克隆抗体相当，其可以与抗体同时对目标配体进行识别结合，又可以称之为杂化识别。

相较于基于抗体的ELISA方法，核酸适配体作为分子识别元件因具有体外合成简单、稳定性良好、易于序列设计与修饰等诸多优良特性，因此结合成熟的核酸化学合成技术，人们研发了基于核酸适配体的生物标志物检测方法。本申请在成熟的酶联免疫吸附测定方法基础上，将其中的信号抗体替换为信号适配体，构建了一种用于检测cTnI的基于抗体与适配体杂化识别的分析方法，并首次通过在信号适配体溶液中额外引入支持蛋白质，获得了能够有效提高该杂化检测方法灵敏度、重复性以及复杂样品实用性的有效路径。

本发明提供了一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂，包括：第一标记物标记的cTnI适配体和第二标记物标记的辣根过氧化物酶共价连接物；

所述第一标记物和第二标记物可结合。

本发明以cTnI适配体代替信号抗体对cTnI进行检测，灵敏度高、重复性好且稳定性好。

在一些可能的实现方式中，所述检测试剂还包括支持剂，所述支持剂选自牛血清白蛋白。本申请发明人意外地发现，在以cTnI适配体代替信号抗体的基础上，向cTnI适配体溶液中加入白蛋白，尤其是牛血清白蛋白(BSA)能够极大地促进适配体与捕获抗体对cTnI的分子识别，从而进一步提高检测的灵敏度。

在一些可能的实现方式中，所述支持剂选自白蛋白，例如牛血清白蛋白、人血清白蛋白等。在一些可能的实现方式中，所述支持剂的工作浓度为0.002％～5％。在一些可能的实现方式中，所述支持剂的工作浓度为0.02％～5％。在一些可能的实现方式中，所述支持剂的工作浓度为0.2％～2％。在一些可能的实现方式中，所述支持剂的工作浓度为2％。

本发明提供的检测试剂还包括：捕获抗体；酶催化反应物；稀释液；清洗剂；封闭剂和反应终止液。

在一些可能的实现方式中，所述第一标记物选自生物素；所述第二标记物选自链霉亲和素。生物素和链霉亲和素可以结合从而使得cTnI适配体与辣根过氧化物酶连接生成信号适配体。

本申请对所述cTnI适配体没有特殊限制，优选具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的碱基序列。其中，SEQ ID No.1所示的序列具体为：

5'-TTTTTTCGCATGCCAAACGTTGCCTCATAGTTCCCTCCCCGTGTCC-3'；

SEQ ID No.2所的序列具体为：

5'-TTTTTTCGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA-3'。

在一些可能的实现方案中，所述酶催化反应物选自过氧化氢(H₂O₂)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)；所述稀释液选自PBS稀释液；所述清洗剂选自吐温20；所述封闭剂选自牛血清白蛋白；所述反应终止液选自2M硫酸。

在一些具体的实现方案中，用于检测cTnI的试剂组成的一个典型组成为：捕获抗体；生物素标记的cTnI适配体(Biotin-apt)；链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶共价连接物(S-HRP)；酶催化反应物TMB和H₂O₂；稀释液PBS溶液；清洗剂吐温20；封闭剂牛血清白蛋白、反应终止液2M硫酸和支持剂牛血清白蛋白。

其中，所述PBS溶液包括10mM磷酸盐和137mM NaCl，pH值为7.2～7.4；

所述捕获抗体的工作浓度为3μg/mL，溶剂为PBS溶液；

所述生物素标记的cTnI适配体的工作浓度为20nM，溶剂为PBS溶液；

所述链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶共价连接物的工作浓度为0.55μg/mL，溶剂为PBS溶液；

所述酶催化反应物TMB的工作浓度为2.16mM，溶剂为20mM H₂SO₄；H₂O₂的工作浓度为0.035％，溶剂为乙酸缓冲溶液(0.14M,pH 5.8)；

所述清洗剂的工作浓度为0.05％，溶剂为PBS溶液；

封闭剂牛血清白蛋白的工作浓度为10％，溶剂为PBS溶液；

支持剂牛血清白蛋白的工作浓度为2％，溶剂为PBS溶液。

在上述试剂中，牛血清白蛋白同时作为封闭剂和支持剂，使用时机和所起作用不同：牛血清白蛋白作为支持剂加入到生物素标记的cTnI适配体和链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶共价连接物形成的信号适配体溶液中，用于提高检测灵敏度；作为封闭剂加入到结合有捕获抗体的高结合力孔板中，用于封闭孔板上的未反应结合位点。

本发明还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的试剂。

本发明提供的试剂及试剂盒的检测原理如图1所示，图1为本发明提供的试剂进行检测的原理示意图：捕获抗体通过吸附被包被在高结合力96孔板基底上，然后加入cTnI与信号适配体混合溶液，形成捕获抗体-cTnI-信号适配体的三明治结构，其中，信号适配体由生物素标记cTnI适配体(Biotin-apt)和链霉亲和素-辣根过氧化物酶共价连接物(S-HRP)通过生物素与链霉亲和素的结合作用生成，利用辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)产生有色产物(TMB²⁺)，并借助于酶标仪标定cTnI的含量。

本发明还提供了一种心肌肌钙蛋白I的检测方法，采用上述技术方案所述的检测试剂或者检测试剂盒进行检测。

根据传统ELISA操作步骤，抗原须与捕获抗体先结合，然后与信号抗体作用形成三明治结构。但对于本发明杂化识别体系而言，生物标志物cTnI与分子识别元(抗体与适配体)的识别先后顺序，即加样方式，直接影响到方法的响应强度。因此，除了传统的加样方式，即cTnI先与孔板基底上捕获抗体作用，之后引入信号适配体之外，本申请发明人创造性地发现，第二种加样方式更有利于试剂或试剂盒对低浓度(≤40ng/mL)cTnI的响应，且获得的线性响应范围为5～40ng/mL，其中，第二种加样方式为：cTnI与信号适配体在均相溶液中相互作用，再注入孵育好捕获抗体的孔板与捕获抗体结合。

在大量界面传感方法中，牛血清白蛋白(BSA)常作为界面封闭剂，用于去除非特异性吸附，以降低检测背景和提高灵敏度。本发明中孵育抗体的孔板也经过10％BSA全封闭处理(孔板容量300μL)之外，还在信号适配体溶液中额外引入支持蛋白质BSA，显著提高了该方法的灵敏度、重复性以及复杂样品适用性。

本发明以cTnI适配体代替信号抗体对cTnI进行检测，核酸适配体作为分子识别元件具有体外合成简单、稳定性良好、易于序列设计与修饰等诸多优良特性，从而在保证灵敏度的基础上降低了制备难度，无需复杂且高成本的DNA扩增技术以及纳米材料合成与修饰，方法简单且成本低。进一步的，本申请在信号适配体溶液中加入白蛋白作为支持剂，显著提高了该方法的灵敏度、重复性、复杂样品适用性以及稳定性。

附图说明

图1为本发明提供的试剂进行检测的原理示意图，其中Biotin-apt代表生物素标记的cTnI适配体序列，S-HRP是链霉亲和素-辣根过氧化物酶共价连接物，TMB为常用酶反应底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺；

图2为不同加样方式下cTnI的测试结果；

图3为信号适配体溶液中引入BSA前后cTnI的测试结果；

图4为信号适配体溶液中引入不同浓度BSA后cTnI(20ng/mL)的响应变化；

图5为潜在干扰物质的响应情况；

图6为不同信号适配体溶液中引入BSA前后对cTnI(20ng/mL)的响应。

具体实施方式

本发明提供了心肌肌钙蛋白I的检测试剂及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下各实施例中，捕获抗体是购自上海领潮生物科技有限公司的鼠源cTnI单克隆抗体；

cTnI适配体1的序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5'-TTTTTTCGCATGCCAAACGTTGCCTCATAGTTCCCTCCCCGTGTCC-3'；

cTnI适配体2的序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5'-TTTTTTCGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA-3'；

生物素标记的cTnI适配体由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并提供。

链霉亲和素-辣根过氧化物酶共价连接物由生工生物工程(上海)股份有限公司制备并提供。

实施例1

1)配制所需溶液，主要包括：

PBS稀释液：10mM磷酸盐,137mM NaCl,pH 7.2～7.4；

PBST清洗液：含0.05％吐温20的PBS溶液；

酶催化反应液：3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(2.16mM)和H₂O₂(0.035％)；

BSA溶液：含10％BSA的PBS溶液；

反应终止液：2M硫酸。

2)在高结合力孔板中加入100μL含3μg/mL捕获抗体的PBS溶液，置于4℃孵育过夜，然后利用PBST清洗三次。

3)加入300μL含10％BSA的PBS溶液进行界面封闭处理，37℃下孵育2小时，PBST清洗三次后待用。

4)利用PBS稀释液配制10μM生物素标记的cTnI适配体1(Biotin-apt)溶液，95℃加热3分钟后冷却至室温；然后配制信号适配体溶液，其中生物素标记的cTnI适配体中DNA链浓度为160nM，链霉亲和素-辣根过氧化物酶共价连接物(S-HRP)浓度为4.4μg/mL，两者混合后室温下振荡1小时。

5)将一定浓度的cTnI与上述步骤4)中信号适配体溶液混合，DNA链与S-HRP最终浓度分别为20nM和0.55μg/mL，室温反应1小时。

6)将上述步骤5)中100μL溶液注入步骤3)中所获得的包被有捕获抗体的孔中，37℃下反应1小时，然后PBST清洗四次。

7)加入酶催化反应底物，所述酶催化底物包括50μL TMB(2.16mM)和50μL H₂O₂(0.035％)，室温反应8分钟后，加入50μL反应终止液，利用酶标仪获取450nm处吸光度值。

实施例2

与实施例1的区别在于：

5)将100μL一定浓度的cTnI溶液注入步骤3)中所获得的包被有捕获抗体的孔中，37℃下反应1小时，然后PBST清洗四次；

6)向步骤5)的孔中注入上述步骤4)中信号适配体溶液混合，DNA链与S-HRP最终浓度分别为20nM和0.55μg/mL，室温反应1小时。

结果参见图2，图2为实施例1和2对应不同加样方式下cTnI的测试结果，其中，方式a为cTnI先与孔板基底上捕获抗体作用，之后引入信号适配体(即实施例2的加样方式)，b为cTnI先与信号适配体在均相溶液中相互作用，之后注入孵育好抗体的孔板(即实施例1的加样方式)。线b'反映该检测体系在新加样方式b下对cTnI的线性响应关系(5～40ng/mL)。图中误差棒来源于三组平行样品的标准偏差，以下图中误差棒同。

由图2可知，相对于传统的加样方式(a)，cTnI先与适配体结合的加样方式(b)更加有利于体系对低浓度(≤40ng/mL)cTnI的响应，且获得的线性响应范围为5～40ng/mL(图2b')，线性方程为y＝0.2660+0.0127x(x代表cTnI的浓度，y是不同浓度cTnI下体系吸光度值，R²＝0.9925)，检测限计算为3.59ng/mL(信噪比为3，背景样品数量为11)。该结果说明抗体与cTnI结合后在空间上将严重影响适配体识别cTnI，而适配体则对抗体识别cTnI影响不大。

实施例3

与实施例1的区别在于：

5)将一定浓度的cTnI溶液以及支持蛋白质BSA一并与上述步骤4)中信号适配体溶液混合，DNA链与S-HRP最终浓度分别为20nM和0.55μg/mL，BSA浓度为2％，室温反应1小时。

结果参见图3，图3为信号适配体溶液中引入BSA前后cTnI的测试结果，其中，b为cTnI先与信号适配体在均相溶液中相互作用，之后注入孵育好抗体的孔板，c为在b的基础上引入支持蛋白质2％BSA。线b'反映该检测体系在新加样方式b下对cTnI的线性响应关系(5～40ng/mL)，线c'反映该检测体系在BSA辅助下对cTnI的线性响应关系(0.5～10ng/mL)。

由图3可知，在2％BSA辅助下体系对cTnI的检测灵敏度有了明显的提高(b→c)，拟合标准曲线c'的线性方程为y＝0.2401+0.1612x(R²＝0.9905)，线性范围是0.5～10ng/mL，检测限计算为0.24ng/mL(信噪比为3，背景样品数量为11)。从线性响应斜率可得知，加入支持蛋白质BSA后的体系灵敏度是无BSA情况下的12.7倍，进而使得cTnI检测限降低了一个数量级，该现象表明支持蛋白质BSA能够极大地促进适配体与抗体对cTnI的分子识别。

检测线性范围内5个浓度点的平均相对标准偏差(每个浓度点样品数量为5)用于表征方法的重复性。有无BSA两种情况下检测体系在线性检测范围内(图3b'与c')的平均相对标准偏差分别为11.5％±0.05和8.3％±0.04，证实BSA辅助提高了该检测体系的重复性。

实施例4

与实施例1的区别在于：

5)将20ng/mL的cTnI溶液以及支持蛋白质BSA一并与上述步骤4)中信号适配体溶液混合，DNA链与S-HRP最终浓度分别为20nM和0.55μg/mL，BSA浓度为0％、0.002％、0.02％、0.2％、2％和5％，室温反应1小时。

结果参见图4，图4为信号适配体溶液中引入不同浓度BSA后cTnI(20ng/mL)的响应变化。由图4可知，信号适配体溶液中BSA的引入使得该方法的检测效果有了显著的提高，尤其在2％以上浓度BSA的存在下，该杂化识别体系的对cTnI响应达到最大。

实施例5

与实施例3的区别在于，将步骤5)中20ng/mL的cTnI溶液替换为空白、VEGF165、CEA、AFP、和肽素、hFABP、PSA、MUC1、凝血酶、溶菌酶、肌红蛋白，结果参见图5，图5为潜在干扰物质的响应情况，其中，hFABP是心型脂肪酸结合蛋白，与cTnI以及肌红蛋白类似，都是心血管疾病生物标志物；VEGF165是血管内皮生长因子A(VEGF-A)的亚型，CEA为癌胚抗原，AFP甲胎蛋白，PSA是前列腺特异抗原，MUC1是一种糖蛋白，这些都是与肿瘤相关的生物标志物。如图5所示，仅cTnI的加入能够使体系产生明显的紫外信号，而其他生物标志物均无响应，该体系在最终优化条件下具有良好的选择性。

实施例6

与实施例3的区别在于，将步骤5)中cTnI溶液中的PBS溶液替换为50倍稀释的人体血清，该血清由吉林大学第一医院免费提供。结果参见表1，表1为在50倍稀释血清中对cTnI的检测结果。

表1在50倍稀释血清中对cTnI的检测结果

血液中cTnI检测是心血管疾病诊断的重要手段。但是复杂的血液成分使得诸多设计的cTnI适配体传感方法失效。本技术方案中信号适配体溶液中支持蛋白质BSA的引入不仅提高了该杂化识别方法的灵敏度与重复性，而且增强了其抗血清干扰能力，提高了该杂化识别方法的复杂样品适应性。表1中良好的回收率与相对标准偏差证实该检测体系可在稀释血清中检测cTnI，说明该体系有望应用于未来实际样品的检测。

实施例7

与实施例1相比，区别在于，采用生物素标记的cTnI适配体2替换生物素标记的cTnI适配体1，结果参见图6，图6为不同信号适配体溶液中引入BSA前后对cTnI(20ng/mL)的响应。

实施例8

与实施例3相比，区别在于，采用生物素标记的cTnI适配体2替换生物素标记的cTnI适配体1，结果参见图6，图6为不同信号适配体溶液中引入BSA前后对cTnI(20ng/mL)的响应。图6数据显示无论是基于适配体1还是适配体2的杂化识别体系，BSA在信号适配体溶液中的引入都使其对cTnI的响应有了明显的提高。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂，包括：第一标记物标记的cTnI适配体和第二标记物标记的辣根过氧化物酶共价连接物；

所述第一标记物和第二标记物可结合。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，还包括支持剂，所述支持剂选自白蛋白。

3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述支持剂选自牛血清白蛋白。

4.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述支持剂的工作浓度为0.002％～5％。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的检测试剂，其特征在于，还包括：捕获抗体；酶催化反应物；稀释液；清洗剂；封闭剂和反应终止液。

6.根据权利要求5所述的检测试剂，其特征在于，所述第一标记物选自生物素；

所述第二标记物选自链霉亲和素。

7.根据权利要求6所述的检测试剂，其特征在于，所述cTnI适配体具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的碱基序列。

8.根据权利要求7所述的检测试剂，其特征在于，所述酶催化反应物选自过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺；

所述稀释液选自PBS稀释液；

所述清洗剂选自吐温20；

所述封闭剂选自牛血清白蛋白；

所述反应终止液选自2M硫酸。

9.权利要求1～8任意一项所述的检测试剂在制备检测心肌肌钙蛋白I的试剂盒中的用途。

10.一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂盒，包括权利要求1～8任意一项所述的检测试剂。