CN111662909A - 心肌肌钙蛋白i特异性核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种特异性结合心肌肌钙蛋白I(以下简称cTnI蛋白)的单链DNA核酸适配体，其包含SEQ ID Nos.1‑3中任一个所示的核苷酸序列。本发明的核酸适配体还可以是各种同源性较高的类似序列或由本发明序列得到的衍生物。本发明的核酸适配体与心肌肌钙蛋白I的结合能力更强，且序列更短，还具有分子量小、易于合成、生产时间短、合成的成本更低等优点。本发明还提供所述单链DNA核酸适配体的应用，它们可以单独地或组合地用于cTnI蛋白纯化或cTnI蛋白检测。本发明还提供一种用于检测cTnI蛋白的试剂盒，其包含本发明的单链DNA核酸适配体。

Description

心肌肌钙蛋白I特异性核酸适配体及其应用
技术领域
本发明涉及生物和医学领域，特别涉及一种可用于结合心肌肌钙蛋白I(Cardiactroponin I，cTnI)的核酸适配体和应用。
背景技术
心血管疾病是当今社会影响人类健康的重要疾病之一，而在心血管疾病中急性心肌梗死是造成患者死亡的重要原因。心肌损伤标志物异常是诊断心肌梗死的主要依据之一，所以现阶段有不少用于早期心肌损伤血清标志物的诊断试剂。心肌肌钙蛋白I(Cardiactroponin I，cTnI)是一种心肌的特异性蛋白，其对微小心肌损伤检测有特殊临床价值，正常时，循环中的cTnI水平很低，当心肌细胞受到损伤后，cTnI先于其它生化指标快速进入血液，在3-5小时内升高，随着损伤的加重，其在血液中的浓度不断升高，12-36小时内达到高峰，形成较长的时间窗。大量研究表明，cTnI已被证实是心肌细胞损伤最特异和最敏感的血清标志物之一。因此，快速、敏捷且准确检测cTnI具有重要的临床意义。
核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。得到核酸适配体后通常会对得到的核酸适配体序列进行相关的修饰改造，以期获得性能更佳的核酸适配体，其中将序列截短是一个重要的手段，主要是将一些与靶标相互作用不重要的部分移除。目前已经有一些研究者公布了他们所获得的一些cTnI蛋白的核酸适配体序列。然而，受制于现有核酸适配体筛选技术手段，得到的核酸适配体并不是与靶标结合的最简序列，亲和力和稳定性也不是最优。在实际应用中将会导致成本增加，稳定性低，因此对具有更短序列、亲和力更高、稳定性更高的cTnI核酸适配体存在需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了三种心肌肌钙蛋白I核酸适配体及其应用。本申请发明人基于其先前申请中通过SELEX方法得到的特异性结合cTnI的序列cTnI-14：5’TTCAGCACTCCACGCATAGCTACGGCGGCTACAATGCAGTGGGGAGGGACTTGTTGTAACCCTATGCGTGCTACCGTGAA3’(80nt)进行了改造，通过分析结合的关键区域，将序列简化，去除了结合的无关序列，从而得到本发明的这三条针对于心肌肌钙蛋白的核酸适配体，并检测了它们与cTnI蛋白的结合能力。得到的三条新的序列与原序列相比结合能力更强，序列更短，易于合成，成本也更低。在此基础上，本发明人完成了本发明。
在第一方面，本发明提供一种特异性结合cTnI蛋白的核酸适配体，其包含SEQ IDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列，或与SEQ ID Nos.1-3中任一个所示的核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合cTnI蛋白的核苷酸序列，或由SEQ ID Nos.1-3中任一个所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合cTnI蛋白的核苷酸序列。其中所述的高同源性可以是与SEQ ID Nos.1-3中任一个所示的核苷酸序列至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同源性。由表面等离子共振法检测的核酸适配体(SEQ ID Nos.1-3)与cTnI的结合常数均为pM级别，说明本发明提供的核酸适配体与目标蛋白有很高的亲和力。
优选地，本发明的特异性结合cTnI蛋白的核酸适配体由SEQ ID Nos.1-3中任一个所示的核苷酸序列组成。
其中SEQ ID Nos.1-3所示的核苷酸序列分别显示如下：
SEQ ID No.1(cTnI-14-7)：
5’-CCAATGCAGTGGGGAGGGACTGCGTTGG-3’
SEQ ID No.2(cTnI-14-3)：
5’-CCAATGCAGTGGGGAGGGACTTGTTGG-3’
SEQ ID No.3(cTnI-14-16)：
5’-CCAATGCAGTGGGGGGACTTGTTGG-3’
另外，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合cTnI蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性，或者带有特殊的发光基团便于观察。
本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质，放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合cTnI蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与cTnI蛋白结合。
作为一个总的技术构思，本发明所述的核酸适配体也可以包含以下三种序列中的任意一种：
(1)与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60％以上的核苷酸序列(例如可将前述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸)，优选地，同源性可以为70％以上，80％以上，90％以上，或者99％以上；优选与SEQ ID Nos.1-3中任一个所示的核苷酸序列具有60％以上的同源性的核苷酸序列，优选地，与SEQ ID Nos.1-3中任一个所示的核苷酸序列的同源性可以为70％以上，80％以上，85％以上，90％以上，95％以上，或者99％以上；
(2)能够与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列；或
(3)由前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列；
其中，上述(1)-(3)中的核苷酸序列均能够特异性结合cTnI蛋白。
术语“同源性”是指使用本领域已知的方法(诸如，序列比较算法)，当在比较窗口上以最大一致性比较和对齐时，两个或多个序列具有指定百分比的在指定区域上相同的核苷酸。两个序列之间的“同源性”百分比可以使用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul,StephenF.,Thomas L.Madden,Alejandro A.
Figure BDA0001985079540000041
Jinghui Zhang,Zheng Zhang,WebbMiller,和David J.Lipman(1997),“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation ofprotein database search programs”,Nucleic Acids Res.)使用默认参数来确定。
术语“严格条件”是指在本领域通常被理解为严格的条件。用于杂交的严格条件的实例是在约65-68℃下的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或约42℃下的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺(参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。
此外，作为一个总的技术构思，本发明还提供核酸适配体衍生物，所述衍生物是由前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是前述所有技术方案中所述核酸适配体改造成的相应肽核酸。
以上不论是衍生出的核酸适配体还是衍生出的其他衍生物，都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能。
在第二方面，本发明还提供了一种前述核酸适配体或者核酸适配体衍生物的应用。例如，本发明的核酸适配体或其衍生物可以用于cTnI蛋白纯化或检测，可以使用本发明的核酸适配体或其衍生物来检测样品中cTnI蛋白的浓度，进而判断所述受试者是否具有心肌细胞损伤。优选地，可以利用SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体进行cTnI蛋白纯化或检测。可以利用SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体检测样品中cTnI蛋白的浓度，进而判断所述受试者是否具有心肌细胞损伤。并且更进一步地，可以基于上述信息诊断所述受试者是否患有与心肌细胞损伤相关的疾病，例如，但不限于急性心肌梗死。
在第三方面，本发明提供一种用于纯化cTnI蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的核酸适配体。优选地，所述试剂盒包含SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物。更优选地，所述试剂盒包含SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体。
由于本发明的核酸适配体能够特异性结合cTnI蛋白，可以利用本发明的核酸适配体来纯化样品中的cTnI蛋白。例如，纯化cTnI蛋白时，具体的操作步骤可以为：将SEQ IDNos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体或者修饰后的序列与包含cTnI蛋白的样品液孵育，核酸适配体会特异性结合cTnI蛋白，回收复合物，再通过高盐或者其他的方法将结合的cTnI蛋白洗脱下来，即纯化得到cTnI蛋白；或者先将SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体或者修饰后的序列固定到固相基质上，将包含cTnI蛋白的样品液缓慢流经固相基质，本发明的核酸适配体会与cTnI蛋白特异性结合而不会与其它无关蛋白结合，然后用缓冲液清洗固相基质，去除未结合的无关蛋白，再用高盐或者其他方法破坏核酸适配体与cTnI蛋白的结合，从而特异性洗脱并收集cTnI蛋白。本领域技术人员能够依据实际需要选择适当的纯化方法。
表面等离子共振(简称SPR)实验的结果显示，本发明提供的cTnI核酸适配体与cTnI蛋白有明显的结合现象，且与干扰蛋白无结合现象。
在第四方面，本发明提供一种检测cTnI蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的核酸适配体。优选地，所述试剂盒包括SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物。更优选地，所述试剂盒包含SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体。所述试剂盒可以精确地确定试样中cTnI蛋白的浓度。
更进一步地，本发明提供一种检测样品中cTnI蛋白浓度的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的核酸适配体。优选地，所述试剂盒包括SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物。更优选地，所述试剂盒包含SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体。所述试剂盒能够快速、敏捷且准确地检测样品中的cTnI蛋白浓度，根据所检测的样品中cTnI蛋白浓度，可以进一步判断所述受试者是否具有心肌细胞损伤。换言之，利用样品中cTnI蛋白浓度判断所述受试者是否具有心肌细胞损伤是一种快速、准确的诊断方法。由斑点杂交考察本发明提供的核酸适配体，结果显示与不同浓度的cTnI蛋白孵育后斑点的深浅有较大的梯度差别，证明本发明提供的核酸适配体与cTnI有较好的结合，与对照蛋白BSA和TNFα没有结合或者结合很少。
本发明提供一种用于诊断受试者是否具有心肌细胞损伤的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的核酸适配体。优选地，所述试剂盒包含SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物。更优选地，所述试剂盒包括SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体。更优选地，所述试剂盒包括SEQ ID No.1所示的核酸适配体。所述试剂盒能够快速、敏捷且准确地检测样品中的cTnI蛋白浓度，根据所检测的样品中cTnI蛋白浓度，可以进一步判断所述受试者是否具有心肌细胞损伤。
本领域技术人员可以理解，本发明的用于诊断受试者是否具有心肌细胞损伤的试剂盒也可以用于诊断与心肌细胞损伤相关的疾病，例如，急性心肌梗死。
在第五方面，本发明还提供一种检测样品中cTnI蛋白浓度的方法，所述方法使用本发明第一方面所述的核酸适配体进行。优选地，所述方法使用SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物进行。更优选地，所述方法使用SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体进行。更优选地，所述方法使用SEQ ID No.1所示的核酸适配体进行。
使用本发明的核酸适配体检测样品中cTnI蛋白浓度可以按照本领域使用常规适配体检测靶标的方法进行，例如，可以通过点杂交实验用本发明的核酸适配体检测急性心肌梗死患者的样品中的cTnI蛋白浓度。
本发明还提供诊断受试者是否具有心肌细胞损伤的方法，所述方法使用本发明第一方面所述的核酸适配体进行。优选地，所述方法使用SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物进行。更优选地，所述方法使用SEQ ID Nos.1-3所示的任意一个或多个核酸适配体进行。
在本发明的各个方面中，样品可以是受试者的血清，或者血清的稀释液或者处理液。
本发明的优点在于：与目前已经公布的一些cTnI蛋白的核酸适配体相比，本发明得到的核酸适配体对cTnI蛋白的亲和力更高，序列更短，易于合成，成本更低，可以用于快速、敏捷且准确地检测cTnI蛋白。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1显示本发明实施例1得到的cTnI-14-7(SEQ ID No.1)与cTnI蛋白的亲和力检测数据(SPR数据)。cTnI-14-7用SPR仪检测到与cTnI蛋白有结合，KD值为695pM。
图2显示本发明实施例1得到的cTnI-14-3(SEQ ID No.2)与cTnI蛋白的亲和力检测数据(SPR数据)。cTnI-14-3用SPR仪检测到与cTnI蛋白有结合，KD值为138pM。
图3显示本发明实施例1得到的cTnI-14-16(SEQ ID No.3)与cTnI蛋白的亲和力检测数据(SPR数据)。cTnI-14-16用SPR仪检测到与cTnI蛋白有结合，KD值为86pM。
图4显示了cTnI-14的亲和力检测数据。
图5显示本发明实施例1描述的三条核酸适配体与靶标蛋白以及干扰蛋白的亲和力检测数据(SPR数据)。图5A显示本发明实施例1描述的三条核酸适配体与靶标蛋白cTnI的亲和力很高。图5B显示本发明实施例1描述的三条核酸适配体与肿瘤坏死因子α蛋白(简称TNFα蛋白)没有亲和力或者亲和力很弱。图5C显示本发明实施例1描述的三条核酸适配体与牛血清白蛋白(简称BSA蛋白)没有亲和力或者亲和力很弱。图5D显示本发明实施例1描述的三条核酸适配体与链霉亲和素蛋白(简称SA蛋白)没有亲和力或者亲和力很弱，
图6显示点杂交的方法检测本发明实施例筛选得到的核酸适配体用于cTnI蛋白检测方面的应用。图6A显示的是本发明实施例1描述的三条核酸适配体(SEQ ID Nos.1-3)与cTnI蛋白的点杂交的实验结果，其中三条核酸适配体与靶标cTnI蛋白的结合能力很强，与对照BSA蛋白没有结合。图6B显示的是三条核酸适配体(SEQ ID Nos.1-3)检测点杂交cTnI蛋白的实验结果，可以看出，随着cTnI蛋白浓度的提高，显色的斑点颜色变深，这说明三条核酸适配体均可以用于膜杂交cTnI蛋白的检测，而且灵敏度较高。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，以下的实施例便于更好的理解本发明，本发明并不限于这些具体的实施例。
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
实施例1：特异性结合cTnI蛋白的ssDNA核酸适配体的合成
由生工生物工程(上海)股份有限公司合成SEQ ID No.1(cTnI-14S-7)、SEQ IDNo.2(cTnI-14S-3)、SEQ ID No.3(cTnI-14S-16)所示的核酸适配体。
实施例2：表面等离子共振(SPR)检测cTnI核酸适配体和cTnI蛋白的亲和力
1.将上海生工合成的核酸适配体cTnI-14-7(SEQ ID No.1)、cTnI-14-3(SEQ IDNo.2)、cTnI-14-16(SEQ ID No.3)，用DPBS分别稀释成：0、1.25nM、2.5nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM；
2.将cTnI蛋白偶联到CM5芯片(厂家：GE Healthcare，型号：Biacore Sensor Chipseries CM5)表面：先用50mM NaOH清洗芯片，进样20ul，流速10ul/min，然后用将等体积的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)两个试剂混合后进样50ul活化芯片，流速5ul/min。将cTnI蛋白用pH 4.5的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积15μL，流速5uL/min，cTnI蛋白偶联量为2000Ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5uL/min，进样50uL。
3.检测：使用表面等离子共振仪(厂家：GE Healthcare，型号：Biacore T200)设定动力学检测参数，稀释好各个浓度的核酸适配体cTnI-14-7(SEQ ID No.1)、cTnI-14-3(SEQID No.2)、cTnI-14-16(SEQ ID No.3)依次进样。
亲和力检测数据见图1(cTnI-14-7)、图2(cTnI-14-3)和图3(cTnI-14-16)，这些数据说明cTnI-14-7(SEQ ID No.1)、cTnI-14-3(SEQ ID No.2)、cTnI-14-16(SEQ ID No.3)用SPR仪均检测到与cTnI蛋白有结合，KD值分别为695pM、138pM和86pM。相比于cTnI-14的亲和力(55nM，图4)，改进后的序列亲和力都达到了pM级别，提高了100倍左右。
实施例3：表面等离子共振(SPR)检测cTnI核酸适配体和干扰蛋白的结合情况
1.将上海生工合成的核酸适配体cTnI-14-7(SEQ ID No.1)、cTnI-14-3(SEQ IDNo.2)、cTnI-14-16(SEQ ID No.3)，用DPBS分别稀释到100nM；
2.分别将cTnI蛋白、TNFα蛋白、BSA蛋白、SA蛋白偶联到CM5芯片表面的第1、2、3、4通道上：先用50mM NaOH清洗芯片，进样20ul，流速10ul/min，然后用将等体积的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)两个试剂混合后进样50ul活化芯片，流速5ul/min。将cTnI蛋白用pH 4.5的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积15μL，流速5uL/min，cTnI蛋白偶联量为2000Ru，TNFα蛋白偶联量为2800Ru，BSA蛋白偶联量为2800Ru，SA蛋白偶联量为2000Ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5uL/min，进样50uL。
3.检测：使用Biacore T200设定检测参数，将稀释好浓度到100nM的核酸适配体cTnI-14-7(SEQ ID No.1)、cTnI-14-3(SEQ ID No.2)、cTnI-14-16(SEQ ID No.3)依次进样。亲和力检测数据见图5，这些数据说明cTnI-14-7、cTnI-14-3、cTnI-14-16用SPR仪均检测到与cTnI蛋白有结合，与对照蛋白TNFα、BSA、SA均没有结合或者结合非常非常弱。
实施例4：蛋白点杂交实验检测生物素修饰的cTnI核酸适配体cTnI-14-7、cTnI-14-3和cTnI-14-16与cTnI蛋白相互作用
1.取几块10cm×5cm的硝酸纤维素膜(购自Millipore)，将cTnI蛋白分别用PBS稀释成如下浓度：0.37/0.185/0.093/0.046/0.023mg/ml。点样1ul到硝酸纤维素膜上，自然风干。同时将对照蛋白稀释到一定浓度，点样到膜上，自然风干。
2.待干燥后，用10％BSA在室温封闭3小时，封闭结束后用PBST(PBS含0.5‰tween20)清洗3次，吸净。
3.将生物素修饰的核酸适配体cTnI-14-7、cTnI-14-3和cTnI-14-16分别稀释到1uM，变复性处理：95℃10分钟变性，然后立即冰浴5分钟，再室温平衡10分钟。
4.变复性后的核酸适配体分别和硝酸纤维素膜上的cTnI蛋白摇床室温孵育2小时。
5.孵育结束后用PBST洗三次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。
6.加入HRP-标记的链霉抗生物素蛋白(购自碧云天，货号A0303)用PBST按照1:10000(v/v)配制，室温摇床孵育30分钟。
7.PBST洗3次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。
8.以A液：B液＝1:1(v/v)的比例加入显色液(BeyoECL Star特超敏ECL化学发光试剂盒，购自碧云天，货号P0018A，A液和B液为试剂盒自带溶液)，在室温显色1分钟。
9.成像系统观察拍照：使用仪器为GE医疗生命科学部的ImageQuantTM LAS 4000数字成像系统。
结果如图6所示，图6A显示与对照蛋白BSA的斑点相比，实验组显色明显，这说明生物素修饰的cTnI-14-7、cTnI-14-3和cTnI-14-16均可以用于膜杂交cTnI蛋白的检测，并且不结合对照蛋白BSA。图6B显示的是用cTnI-14-7、cTnI-14-3和cTnI-14-16检测点杂交cTnI蛋白的结果，可以看出，随着cTnI蛋白浓度的提高，显色的斑点颜色变深，这说明cTnI-14-7、cTnI-14-3和cTnI-14-16均可以用于膜杂交cTnI蛋白的检测，而且灵敏度较高。其中cTnI-14-7的效果最好，检测灵敏度最高。由对照蛋白可以看出，本发明得到的适配体与PDL1蛋白结合很弱。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
Figure IDA0001985079590000011

Claims (10)

1.一种特异性结合心肌肌钙蛋白I的核酸适配体，其中所述核酸适配体包含或由以下组成：SEQ ID Nos.1-3中任一个所示的核苷酸序列，或与SEQ ID Nos.1-3中任一个所示的核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合心肌肌钙蛋白I的核苷酸序列，或由SEQ IDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合心肌肌钙蛋白I的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其中所述心肌肌钙蛋白I的核酸适配体的核苷酸序列被修饰，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。
3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其中所述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记。
4.根据权利要求1所述的核酸适配体，其由SEQ ID Nos.1-3中任一个所示的核苷酸序列组成。
5.一种特异性结合心肌肌钙蛋白I的核酸适配体，其中所述核酸适配体包含以下三种序列中的任意一种或由其组成：
(1)与权利要求1所述的核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60％以上的核苷酸序列；
(2)能够与权利要求1所述的核酸适配体的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列；或
(3)由权利要求1所述的核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
6.一种核酸适配体衍生物，其中所述衍生物是由权利要求1-5任一项中所述的核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由权利要求1-5任一项所述的核酸适配体改造成的肽核酸。
7.权利要求1-5中任一项所述的核酸适配体或权利要求6所述的核酸适配体衍生物在制备纯化心肌肌钙蛋白I或检测心肌肌钙蛋白I的试剂盒中的应用。
8.一种试剂盒，其中所述试剂盒包括权利要求1-5中任一项所述的核酸适配体和权利要求6所述的核酸适配体衍生物中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测受试者血清中的心肌肌钙蛋白I水平。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于诊断受试者是否具有心肌细胞损伤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113073101A (zh) * 2021-03-25 2021-07-06 严鹏科 一种心肌肌钙蛋白的寡核苷酸适配体及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040072255A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-15 Van Eyk Jennifer E. Isolated post-translationally modified mammalian proteins for monitoring and diagnosing muscle damage
CN1974594A (zh) * 2006-11-16 2007-06-06 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 人心肌肌钙蛋白ⅰ亚基核酸适配子及应用
CN102703455A (zh) * 2012-07-03 2012-10-03 天津科技大学 一种人心肌肌钙蛋白i适配子及筛选方法和应用
CN102816764A (zh) * 2011-06-07 2012-12-12 浦项工科大学校产学协力团 特异性结合于人心肌肌钙蛋白ⅰ的dna适体
KR20120135857A (ko) * 2011-06-07 2012-12-17 포항공과대학교 산학협력단 인간 심근 트로포닌 ⅰ에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 압타머
CN104195141A (zh) * 2014-09-15 2014-12-10 三诺生物传感股份有限公司 一种心肌肌钙蛋白i核酸适配子及其应用、试剂盒
CN107084966A (zh) * 2017-06-14 2017-08-22 北京理工大学 一种心肌肌钙蛋白i的高灵敏定量检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040072255A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-15 Van Eyk Jennifer E. Isolated post-translationally modified mammalian proteins for monitoring and diagnosing muscle damage
CN1974594A (zh) * 2006-11-16 2007-06-06 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 人心肌肌钙蛋白ⅰ亚基核酸适配子及应用
CN102816764A (zh) * 2011-06-07 2012-12-12 浦项工科大学校产学协力团 特异性结合于人心肌肌钙蛋白ⅰ的dna适体
KR20120135857A (ko) * 2011-06-07 2012-12-17 포항공과대학교 산학협력단 인간 심근 트로포닌 ⅰ에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 압타머
CN102703455A (zh) * 2012-07-03 2012-10-03 天津科技大学 一种人心肌肌钙蛋白i适配子及筛选方法和应用
CN104195141A (zh) * 2014-09-15 2014-12-10 三诺生物传感股份有限公司 一种心肌肌钙蛋白i核酸适配子及其应用、试剂盒
CN107084966A (zh) * 2017-06-14 2017-08-22 北京理工大学 一种心肌肌钙蛋白i的高灵敏定量检测方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUBING LIN ET AL.: "Aptamer-modified magnetic SERS substrate for label-based determination of cardiac troponin I", 《MICROCHIMICA ACTA》 *
GHAMAR SOLTAN DORRAJ ET AL.: "Selection of DNA aptamers against Human Cardiac Troponin I for colorimetric sensor based dot blot application", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *
HUNHO JO ET AL.: "Electrochemical Aptasensor of Cardiac Troponin I for the Early Diagnosis of Acute Myocardial Infarction", 《ANAL. CHEM.》 *
JIANG SHU-HAI ET AL.: "The Detection of cTnⅠ by The Aptamer Biosensor", 《生物化学与生物物理进展》 *
YI CEN ET AL.: "Development of a novel ssDNA aptamer targeting cardiac troponin I and its clinical applications", 《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》 *
ZAHRA REZAEI ET AL.: "Ultra-sensitive, rapid gold nanoparticle-quantum dot plexcitonic self-assembled aptamer-based nanobiosensor for the detection of human cardiac troponin I", 《ENG. LIFE SCI.》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113073101A (zh) * 2021-03-25 2021-07-06 严鹏科 一种心肌肌钙蛋白的寡核苷酸适配体及其应用

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