KR20100050071A - 고감도의 마이크로 캔틸레버 기반 생체물질 검출 시스템 - Google Patents

고감도의 마이크로 캔틸레버 기반 생체물질 검출 시스템 Download PDF

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Abstract

마이크로 캔틸레버를 이용하고 면역 반응을 기반으로 하는 단백질 검출에 있어서 마이크로 캔틸레버의 감도가 획기적으로 향상된 극미량 생체물질 검출 시스템을 개시한다. 이는 단일클론 항체를 비롯한 특이적 결합 물질(Specific binding agent)을 이용한 샌드위치 면역 검사법을 마이크로 캔틸레버에 적용함으로써 캔틸레버의 출력 신호 변화가 증폭되어 검출 감도가 획기적으로 향상될 수 있는 시스템이다. 이 시스템을 통해 극미량의 질병 특이 항원을 검출할 수 있고, 질병 특히 암과 관련된 극미량의 단백질 분석을 용이하게 수행할 수 있다.
마이크로 캔틸레버, 샌드위치 면역 검사법, 단일클론 항체, 특이적 결합

Description

고감도의 마이크로 캔틸레버 기반 생체물질 검출 시스템{System for detecting biomolecule with high sensitivity using micro-cantilever}
본 발명은 고감도의 마이크로 캔틸레버 기반 생체물질 검출 시스템에 관한 것이다.
마이크로 캔틸레버는 MEMS(micro electromechanical systems), NEMS(nano electromechanical systems)의 발전과 함께 구조적, 재료적 발전을 이루었을 뿐만 아니라 나노·생명공학의 대두로 인하여 응용 분야를 비약적으로 확장시킬 수 있었다. 바이오 센서로서의 마이크로 캔틸레버는 고감도(high sensitivity), 고선택성(high selectivity) 및 비표지 검출(labeling-free detection)을 특징으로 하고 있으며, DNA, 질병 표지 단백질(marker protein), 및 저분자 생체물질을 포함한 병원성 물질(pathogen)을 분석의 대상으로 하고 있다.
마이크로 캔틸레버 센서는 그 응용에 있어서 미세천칭(microbalance) 원리 및 표면 스트레스(surface stress) 원리로 크게 나뉜다. 전자는 캔틸레버의 질량 및 스프링 상수 변화에 의해 발현되는 공진주파수의 변화를 측정하는 동적 모드(dynamic mode)이고, 후자는 마이크로 캔틸레버 위에서의 특이 반응에 의한 표면 스트레스 변화에 의해 발생하는 변위를 측정하는 정적 모드(static mode)이다.
바이오센서로서의 마이크로 캔틸레버의 경우, 미량의 생체물질이 특이 결합하면서 이웃하는 물질 간에 서로 작용하는 힘과 특이 결합에 의하여 발생하는 구조변화에 의하여 캔틸레버 센서의 표면 스트레스가 발생하고 이로 인하여 마이크로 캔틸레버 센서의 휨 현상이나 공진주파수의 변화가 발생한다.
바이오센서에 있어서 민감도는 선택성 및 신속성과 더불어 중요한 요소중의 하나이다. 바이오센서는 크게 생체물질을 받아들이는 수용체 요소(receptor element)와 이를 전기적 신호로 변환시켜주는 변환기 요소(transducer element)로 구성되어 있으며 광학적 또는 기계적 변화를 매개로 하여 생체물질의 인식을 전기 신호로 변환된다. 바이오센서의 신호를 증폭하고 감도를 향상시키기 위해, 전기적, 광학적 측면에서 변환기 요소의 개선과 화학적, 생물학적 측면에서 수용체 요소의 개선이 동시에 이루어져 왔다.
이에, 본 발명자들은 면역 반응을 이용하는 마이크로 캔틸레버 기반 단백질 검출에 있어서, 단일클론 항체를 비롯한 특이적 결합 물질(Specific binding agent)을 이용한 샌드위치 면역 검사법을 마이크로 캔틸레버에 적용하면 캔틸레버의 출력 신호 변화가 증폭되어 검출 감도가 획기적으로 향상될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 따라서 본 발명은 극미량의 생체물질, 특히 질병 표지 단백질을 검출할 수 있는 마이크로 캔틸레버 기반 고감도 생체물질 검출 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 마이크로 캔틸레버 센서를 기반으로 하는 단백질 검출 시스템으로서, 마이크로 캔틸레버 센서; 상기 센서 표면에 형성된, 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프(epitope)와 결합하는 단일클론 일차 항체(monoclonal antibody)층; 상기 단일클론 일차 항체층 위에 형성된 검출 대상 단백질층; 및 상기 검출 대상 단백질층 위에 형성된, 상기 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프와 결합하는 특이적 결합 물질(Specific binding agent)층을 포함하고, 상기 특이적 결합 물질(Specific binding agent)이 결합하는 에피토프는 상기 단일클론 일차 항체가 결합하는 에피토프와 상이한, 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 생체물질 검출 시스템을 사용하면, 질병 특히 암과 관련된 극미량의 표지 단백질을 수 펨토 몰농도 수준으로 용이하게 검출할 수 있다.
본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서를 기반으로 하는 단백질 검출 시스템은, 마이크로 캔틸레버 센서; 상기 센서 표면에 형성된 검출 대상 단백질의 단일클론 일차 항체(monoclonal antibody)층; 상기 단일클론 일차 항체층 위에 형성된 검출 대상 단백질층; 및 상기 단백질층 위에 형성된 상기 단백질의 특이적 결합 물질(Specific binding agent)층을 포함한다. 상기 단일클론 일차 항체는 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프와 결합하고, 상기 특이적 결합 물질(Specific binding agent)도 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프와 결합한다. 상기 특이적 결합 물질(Specific binding agent)이 결합하는 에피토프(epitope)는 상기 단일클론 일차 항체가 결합하는 에피토프와 상이하다.
특이적 결합 물질(Specific binding agent)이란, 정해진 표적에만 특이적으로 결합하는 물질로서, 특정 항원의 특정 위치(에피토프)에만 결합하는 단일클론 항체, 리간드 또는 앱타머(aptamer) 등이 있다. 앱타머는 특정 표적 분자에 결합하는 올리고핵산 또는 펩티드 분자를 의미한다.
본 명세서에 기재된 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질을 이용하는 마이크로 캔틸레버 센서 기반 단백질 검출 시스템에 있어서, 결합하는 에피토프가 상이한 특이적 결합 물질들이 캔틸레버 표면에 각각 동일한 양으로 결합 반응되더라도, 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질들이 각각 검출 대상 단 백질 항원을 인식하는 위치(에피토프)에 따라, 특이적 결합 물질과 캔틸레버 표면 사이에서 발생하는 힘에 변화가 발생하여 공진주파수의 변화에 영향을 미친다. 특히, 검출 대상 단백질이 극미량일 경우에도, 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질이 검출 대상 단백질 항원을 인식하는 위치(에피토프)에 따라, 특이적 결합 물질과 캔틸레버 표면 사이에 힘이 발생함으로써 공진주파수가 변화하므로, 감도를 획기적으로 향상시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질을 이용하는 마이크로 캔틸레버 센서 기반 단백질 검출 시스템에서, 가장 높은 감도의 검출 결과를 낼 수 있는 특이적 결합 물질을 구별하기 위하여, 검출 대상 단백질에 알려진 모든 에피토프들에 대응하는 각각의 특이적 결합 물질들을 이용하여 예비실험할 수 있다.
본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템은 상기 마이크로 캔틸레버 센서와 단일클론 일차 항체층 사이에 자기조립단분자층(self assembled monolayer, SAM)을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템에서 상기 마이크로 캔틸레버 센서는 PZT 층을 포함할 수 있고, 상기 마이크로 캔틸레버 센서의 하측면에 금박층을 포함할 수 있으며, 상기 마이크로 캔틸레버 센서의 금박층과 단일클론 일차 항체층 사이에 자기조립단분자층을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템은 상기 단일클론 일차 항체층 위에 비특이적 흡착 억제용 생체 고분자를 결합시킬 수 있고, 본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템에서 상기 검출 대상 단백질층 위에 결합되는 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질은 형광물질로 표지될 수 있다.
샌드위치 면역 검사법이란 면역 반응 후 추가적으로 형광 염료, 효소 또는 나노 입자와 결합하고 있는 특이적 결합 물질(specific binding agent)을 반응시킴으로써 신호를 발생시키는 방법이다.
본 발명의 일 실시예는 마이크로 캔틸레버 바이오센서의 신호를 증폭하여 민감도를 높이기 위해서 (1) PZT 기반의 공진형 마이크로 캔틸레버 센서를 준비하는 단계; (2) 상기 마이크로 캔틸레버 센서 하측면에 금박을 입히고, 그 금박면에 캘릭스크라운(calixcrown) 자기조립단분자층(self assembled monolayer)을 형성하는 단계; (3) 상기 단분자층위에 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프와 결합하는 단일클론 일차 항체를 고정하고, 비특이적 흡착을 억제하기 위하여 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 코팅하는 단계; (4) 상기 단일클론 일차 항체층 위에 검출 대상 단백질을 가하여 결합시키는 단계; 및 (5) 상기 검출 대상 단백질층 위에 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프와 결합하는 단일클론 이차 항체를 가하여 결합시키는 단계를 포함하는 방법으로 극미량의 단백질을 정량 분석한다. 본 발명의 일실시예에 따라 전립선 특이 항원(PSA)의 단일클론 항체 및 전립선 특이 항원이 반응된 마이크로 캔틸레버의 개략적인 모습이 도 1에 나타나 있다.
상기 본 발명의 일 실시예에 따른 PZT 기반의 공진형 마이크로 캔틸레버는 캔틸레버의 공진 주파수를 분석하는 동적 모드(dynamic mode)를 이용한다. 상기 공 진 주파수 분석은, 검출 대상 단백질이, 마이크로 캔틸레버의 하측면에 고정화된 단일클론 일차 항체와 결합하고, 검출 대상 단백질 상에 단일클론 이차 항체가 결합하면서, 단일클론 이차 항체와 캔틸레버 표면 사이에 힘이 발생하여 캔틸레버의 고유진동수를 변화시킬 때 임피던스의 위상 각도 변화를 분석함으로써 수행된다.
상기 본 발명의 일 실시예에 따른 자기조립단분자층은 항체를 고정화하기 위한 것으로서 티올(thiol)기가 달린 캘릭스크라운(calixcrown) 화합물을 코팅하였다. 캘릭스크라운의 에테르 링 구조는 아민기(amine)와 같은 양전하를 띠는 기능기를 포획할 수 있으므로 단일클론 항체 표면의 아민기를 포획하여 항체를 안정적으로 고정할 수 있다. 캘릭스크라운 외에 11-머캡토언데카노산(11-mercaptoundecanoic acid) 또는 티옥트산(thioctic acid)을 사용할 수 있다. BSA는 검출 대상 단백질과 섞여있는 환경 물질 및 검출 대상 단백질 자체의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 사용되었다. BSA 외에 카세인 단백질을 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 검출 대상 단백질로서 전립선 특이 항원(PSA)을 포획하였다. 전립선 특이 항원은 일반적으로 전립선암의 표지 단백질로서 현재까지 암 표지자중에 가장 많은 연구가 이루어진 단백질이다. 일반적으로 정상 남성인 경우 4 ng/mL 이하의 전립선 특이 항원을 가지고 있으며, 10 ng/mL 이상에서는 전립선암으로 진단한다. 전립선 특이 항원은 전립선 제거 수술 후에도 재발현 되어 암재발로 이어질 수 있으며, 이는 극미량 분석에 의한 조기 발견을 통해 해결될 수 있다. 한편, 간암의 표지 단백질인 AFP, 대장암 등의 표지 단백질인 CEA, 유방암의 표지 단백질인 HER2, 심혈관 질환의 표지 단백질인 CRP, 뇌졸중의 표지 단백질인 MMP-9, 심근경색의 표지 단백질인 미오글로빈, CK-MB 또는 트로포닌 I, 또는 췌장암의 표지 단백질인 CA 19-9, CA 125, RCAS1, TSGF, CA 242, MIC-1, CECAM1 또는 오스테오폰틴(osteopontin)을 항원으로 사용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템의 일실시예에서, 형광 염료가 결합된 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질을 이용할 수 있다. 형광 염료를 결합시키는 이유는 형광 분석을 통해 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질을 이용한 결합 반응이 순조롭게 이루어짐을 확인하고, 증폭된 신호와 상호 비교하기 위함이다.
본 명세서에 기재된 특이적 결합 물질을 이용한 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템을 통하여 전립선 특이 항원을 검출한 결과, 수 펨토몰 수준으로 생체 물질을 검출할 수 있는 다클론 이차 항체를 이용한 경우에 비해서 공진 주파수가 증폭 정도가 최대 2배 정도 증가하여 검출 감도가 더욱 향상되었음을 알 수 있었다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 등 구체예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 구체예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예] 단일클론항체를 이용한 샌드위치 면역 검사
1-1. 전립선 특이항원 단일클론 항체의 고정
마이크로 캔틸레버 하단의 금박면에 자기조립단분자층(SAM)을 형성하기 위해, 금박면을 증착한 즉시 3mM 캘릭스크라운/클로로포름(chloroform) 용액에 상온에서 2시간동안 정치시켰다. 반응 종료 후 클로로포름과 에탄올, 증류수를 차례로 이용하여 마이크로 캔틸레버를 세척하였다. 전립선 특이항원의 PS1 에피토프와 결합하는 단일클론 일차 항체를 고정시키기 위해 캘릭스크라운 SAM이 형성된 마이크로 캔틸레버를 10μg/mL 전립선 특이항원의 PS1 에피토프 결합 단일클론 항체/인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS) 수용액에 1시간동안 상온에서 정치시켰다. 반응 후 PBST(1% 트윈20/PBS)로 15분, PBS로 10분동안 마이크로 캔틸레버를 세척하였다. 그리고 비특이적 흡착을 방지하기 위하여 마이크로 캔틸레버를 1% BSA 수용액에 1시간동안 정치한 후 PBST(1% 트윈20/PBS)로 15분, PBS로 10분, 증류수로 5분동안 세척하였다. 이 상태의 마이크로 캔틸레버에 대하여 항온습 장치가 갖춰진 마이크로 캔틸레버 측정시스템을 이용하여 초기 공진주파수(F0)을 측정하였다.
1-2. 전립선 특이항원의 1차 면역반응
마이크로 캔틸레버에 고정화된 전립선 특이항원의 단일클론 항체에 전립선 특이항원을 면역 반응 시켰다. 100μg/mL 농도의 전립선 특이항원 수용액 1mL에 PS1 에피토프 결합 단일클론 항체가 고정된 마이크로 캔틸레버를 1시간 동안 상온에서 정치시켰다. 음성 대조군으로서, CRP(C-Reactive Protein) 항원을 PS1 에피토 프 결합 단일클론 항체가 고정된 마이크로 캔틸레버에 반응시켰다. 면역 반응 후 PBST(1% 트윈20/PBS)로 15분, PBS로 10분, 증류수로 5분동안 세척하였다. 그리고 항온습 장치가 갖춰진 마이크로 캔틸레버 측정시스템을 이용하여 공진주파수(F1)를 측정하였다.
1-3. 단일클론 이차 항체를 이용한 샌드위치 2차 면역 반응
마이크로 캔틸레버를 이용한 면역 검출 반응의 신호를 증폭하기 위해 2차적으로 단일클론 항체를 반응시켰다. 형광염료가 결합되고, 전립선 특이항원의 에피토프 중 PS1, PS6, 5A6, 2H9 에피토프에 결합하는 10μg/mL 농도의 전립선 특이항원의 단일클론항체 수용액 각각의 1mL에 1차 면역 반응을 거친 상기 마이크로 캔틸레버를 1시간 동안 상온에서 정치시켰다. 반응 종료 후 PBST(1% 트윈20/PBS)로 15분, PBS로 10분, 증류수로 5분동안 세척하였다. 그리고 항온습 장치가 갖춰진 마이크로 캔틸레버 측정시스템을 이용하여 공진주파수(F2)를 측정하였다.
비교를 위하여, 대조군으로서, 형광염료가 결합된 전립선 특이항원의 다클론항체를 이차 항체로 사용하였다.
이차 항체가 전립선 특이 항원에 결합된 후, 이차 항체의 형광 분석을 통해 이차 면역 반응을 확인하였다. 그 결과는 마이크로 캔틸레버의 형광 사진인 도 2에 나타나 있다. 도 2에 따르면, PS6, 5A6, 2H9 에피토프에 결합하는 전립선 특이항원의 단일클론항체 각각이 해당 에피토프에 결합한 정도는 유사하였다. PS1 에피토프 에 결합하는 전립선 특이항원의 단일클론항체의 경우, PS1 에피토프는 이미 단일클론 일차 항체에 의하여 결합되었으므로, 단일클론 이차 항체의 형광이 관찰되지 않았다. 비특이적 항원인 CRP 항원은 전혀 결합이 일어나지 않았음을 확인하였다.
이차 항체가 전립선 특이 항원에 결합된 후, 공진 주파수의 증폭 정도를 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타나 있다.
단일클론 일차 항체와 결합하는 에피토프가 다른 단일클론 이차 항체의 경우, 다클론 이차 항체를 이용한 경우와 비교하여 공진 주파수가 증폭 정도가 최대 2배 정도 증가하여 검출 감도가 향상되었음을 알 수 있었다. 특히, 단일클론 이차 항체들이 결합하는 에피토프에 따라, 공진주파수 증폭 정도에 차이가 있었다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 단일클론 이차 항체(monoclonal antibody)를 이용하여 샌드위치 면역 검사를 수행할 때의 마이크로 캔틸레버의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 마이크로 캔틸레버에서 전립선 특이 항원(prostate specific antigen, PSA)의 단일클론 이차 항체를 이용한 샌드위치 면역 검사를 적용한 후 단일클론 이차 항체가 결합하는 에피토프에 따른 마이크로 캔틸레버 표면의 형광 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 마이크로 캔틸레버에서 전립선 특이 항원(prostate specific antigen, PSA)의 단일클론 이차 항체를 이용한 샌드위치 면역 검사를 적용한 후 단일클론 이차 항체가 결합하는 에피토프에 따른 마이크로 캔틸레버 공진 주파수의 변화를 보여주는 그래프이다.

Claims (10)

  1. 마이크로 캔틸레버 센서를 기반으로 하는 단백질 검출 시스템으로서,
    마이크로 캔틸레버 센서;
    상기 센서 표면에 형성된, 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프(epitope)와 결합하는 단일클론 일차 항체(monoclonal antibody)층;
    상기 단일클론 일차 항체층 위에 형성된 검출 대상 단백질층; 및
    상기 검출 대상 단백질층 위에 형성된, 상기 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프와 결합하는 특이적 결합 물질(Specific binding agent)층을 포함하고,
    상기 특이적 결합 물질(Specific binding agent)이 결합하는 에피토프는 상기 단일클론 일차 항체가 결합하는 에피토프와 상이한, 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 특이적 결합 물질(Specific binding agent)은 단일클론 이차 항체(monoclonal secondary antibody), 리간드 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 캔틸레버 센서와 단일클론 일차 항체층 사이에 자기조립단분자층(self assembled monolayer, SAM)을 더 포함하는 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 캔틸레버 센서는 PZT 층을 포함하고, 상기 마이크로 캔틸레버 센서의 하측면에는 금박층을 포함하는 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 마이크로 캔틸레버 센서의 금박층과 단일클론 일차 항체층 사이에 자기조립단분자층을 더 포함하는 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  6. 제3항 또는 제5항에 있어서,
    상기 자기조립단분자층은 캘릭스크라운(calixcrown), 11-머캡토언데카노산(11-mercaptoundecanoic acid) 및 티옥트산(thioctic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일클론 일차 항체층 위에 비특이적 흡착 억제용 생체 고분자가 결합되어 있는 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 비특이적 흡착 억제용 생체 고분자는 우혈청 알부민(BSA) 및 카세인(casein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 특이적 결합 물질(Specific binding agent)은 형광물질로 표지되어 있는 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질은 질병 표지 단백질이고,
    상기 질병 표지 단백질은
    AFP, CEA, HER2, PSA, CRP, MMP-9, 미오글로빈, CK-MB, 트로포닌 I, CA 19-9, CA 125, RCAS1, TSGF, CA 242, MIC-1, CECAM1 및 오스테오폰틴(osteopontin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
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