KR101765068B1 - 원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버를 이용한 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질검지방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템 - Google Patents

원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버를 이용한 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질검지방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR101765068B1
KR101765068B1 KR1020150028443A KR20150028443A KR101765068B1 KR 101765068 B1 KR101765068 B1 KR 101765068B1 KR 1020150028443 A KR1020150028443 A KR 1020150028443A KR 20150028443 A KR20150028443 A KR 20150028443A KR 101765068 B1 KR101765068 B1 KR 101765068B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tumor cell
cantilever
cancer
circulating tumor
specific protein
Prior art date
Application number
KR1020150028443A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160105137A (ko
Inventor
이상우
이형빈
고관휘
김민형
이원석
윤대성
Original Assignee
연세대학교 원주산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 연세대학교 원주산학협력단 filed Critical 연세대학교 원주산학협력단
Priority to KR1020150028443A priority Critical patent/KR101765068B1/ko
Publication of KR20160105137A publication Critical patent/KR20160105137A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101765068B1 publication Critical patent/KR101765068B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer

Abstract

본 발명은 AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템에 관한 것으로서, 0.5 nM 수준의 순환종양세포 특이 단백질을 고감도로 검지함으로써 암 조기지단을 실현할 수 있는 순환암세포 표적의 암 조기진단 분자진단기술을 제공한다.

Description

원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버를 이용한 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질검지방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템{Circulating tumor cell specific protein detection method and sensor system using atomic force microscopic cantilever}
본 발명은 원자힘현미경(Atomic force microscope, 이하, AFM) 캔틸레버 표면에 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질에 대한 특이 항체를 고정화시키는 단계, 순환종양세포 특이 단백질을 반응시키는 단계 및 원자힘현미경을 이용하여 공진 주파수의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템에 관한 것이다.
AFM(Atomic force microscope)은 생리학적으로 관련된 조건에서 유지되므로 생물학적 물질을 허용할 수 있고, 마이크로 캔틸레버와 같은 나노기계 소자 (nano mechanical device) 는 DNA 혼성화, 단백질 항원-항체 결합,RNA-단백질 상호작용, 펩타이드-약물 상호작용, 및 막 단백질 상에 리간드-결합과 같은 다양한 생물학적 분자 사이에 상호작용 분석을 가능하게 한다. 이러한 상호작용의 비표지(label-free) 검출은 상기한 바와 같은 분자 상호작용들로부터 발생되는 캔틸레버 굽힘 편향 변화량(bending deflection change) 측정에 전형적으로 기반을 둔다. 즉, 캔틸레버 표면 상에 화학적 상호작용이 캔틸레버 굽힘 편향 변화량으로의 전환되는 것으로, Stoney 식으로 잘 기술된다. 그러나 표면상의 분자 상호작용과 표면 장력 (surface stress) 사이의 관계는 직접적이지 않은데, 그럼에도 불구하고 최근에는 표면 장력과 분자 상호작용 사이에 관계를 이론적으로 규명하는 시도를 해 왔다.
캔틸레버 굽힘 편향을 이용한 비표지 검출 대신 캔틸레버 표면상에 분자 상호작용에 의해 유발되는 캔틸레버의 공진 주파수 변화량의 평가에 기초하는 비표지 검출로의 대안이 제기되어 왔다. 공진 마이크로캔틸레버는 원자 수준의 해상도로 화학 분자들의 고감도 검출을 가능하게 하며, 이는 역동적-주파수 범위의 증가를 이끄는 소형화(scaling down)에 기인한다는 것이 보고되었다. 분자 결합과 공진 주파수 이동(shift) (변화) 사이 관계는 연속체 탄성 모델(continuum elastic model)에 기초하여 제시되었다. 구체적으로는, 캔틸레버 두께가 상기 캔틸레버 표면상의 분자 단일막보다 상대적으로 큰 범위에서는, 공진 주파수 이동(변화)는 상기 표면상에 분자 결합(또는 상호작용)에 수반되는 분자들의 전체 질량에 선형적으로 비례한다.
상설한 원리를 이용한 한국등록특허 제999,424호는 마이크로 캔틸레버를 이용하고 면역 반응을 기반으로 하는 단백질 검출에 있어서 마이크로 캔틸레버의 감도가 획기적으로 향상된 극미량 생체물질 검출 시스템을 개시하고 있으나 감도향상을 위하여 출력 신호 증폭을 위한 샌드위치 면역 검사법을 적용함으로써 단백질 검출을 위한 일차항체 뿐만 아니라 이체항체, 비특이적 흡착 억제용 생체 고분자 및 형광물질 표지가 필요하므로 과정이 매우 복잡하고 경제성이 떨어지는 단점이 있다.
더욱이 신호 증폭을 위한 별도의 과정이 필요 없이 편이성 및 경제성이 높아 임상적용이 가능한 암 조기진단을 위한 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC)를 확인할 수 있는 순환종양세포 특이 단백질 검출할 수 있는 AFM 캔틸레버를 이용한 CTC-특이 단백질 검출용 센서 개발은 미흡한 실정이다.
한국등록특허 제999,424호
본 발명의 목적은 암 조기진단을 위하여 세포주로부터 극미량의 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질의 발현도 검지할 수 있는 AFM 캔틸레버 기반의 고감도 순환종양세포 특이 단백질 검지 방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버 표면에 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질에 대한 특이 항체를 고정화시키는 단계, 순환종양세포 특이 단백질을 반응시키는 단계 및 원자힘현미경을 이용하여 공진 주파수의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질을 검지하는 방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템은 0.5 nM 수준의 순환종양세포 특이 단백질을 고감도로 검지함으로써 암 조기지단을 실현할 수 있는 순환암세포 표적의 암 조기진단 분자진단기술이다.
도 1은 캔틸레버 표면 위에 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질(이하, CTC-특이 단백질)을 고정화시키기 위해서 항체를 코팅시키는 과정을 AFM 이미징(캔틸레버 표면)과 공진특성으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 캔틸레버 센서의 액상과 공기 중에서의 공진 특성 변화를 나타내는 공진 주파수 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 캔틸레버 센서를 CTC-특이 단백질과 반응시켰을 때, 공기 중에서의 공진특성 변화를 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 캔틸레버 센서를 CTC-특이 단백질과 반응시켰을 때, 액상에서의 공진특성 변화를 실시간으로 측정한 그래프이다.
도 5는 HER2 농도에 따른 웨스턴 블롯팅(western blotting) 실험결과와 본 발명에 따른 AFM 캔틸레버 센서를 이용하여 측정한 공진 주파수 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 세포주에 따른 웨스턴 블롯팅(western blotting) 실험결과, 본 발명에 따른 AFM 캔틸레버 센서를 이용하여 측정한 공진주파수 변화량, 및 세포주에 따른 공진 주파수에 대한 HER2 농도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 AFM 캔틸레버 센서를 이용하여 HER2 양성형 세포주의 세포 개체 수에 따른 세포 용해액 내의 HER2 검지 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 (a) 원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버 표면에 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질에 대한 특이 항체를 고정화시키는 단계; (b) 순환종양세포 특이 단백질을 반응시키는 단계; 및 (c) 원자힘현미경을 이용하여 공진 주파수의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, AFM 캔틸레버 표면에 특이 항체를 고정화시키는 단계 이전에 상기 캔틸레버 표면을 기능화 시키는 단계를 추가로 포함한다. 즉, 상기 AFM 캔틸레버 표면을 기능화 시키는 단계는, 상기 캔틸레버 표면을 아민화하거나 금 박막으로 코팅하는 단계; 및 자기조립단분자층(self assembled monolayer, SAM)을 형성하는 단계를 통해 이루어질 수 있으며, 상기 자기조립단분자층은 캘릭스크라운(Calixcrown), 11-머캅토언데카노산(11-mercaptoundecanoic acid) 및 티옥트산(thioctic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고 보다 더 구체적으로 캘릭스크라운(Calixcrown)일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(b)에서, 순환종양세포 특이 단백질은 HER2일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(b)에서, 순환종양세포 특이 단백질이 5 nM 이하의 농도로 존재하는 경우에도 순환종양세포 특이 단백질이 검지될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(b)에서, 순환종양세포 특이 단백질이 0.5 nM 농도 이상인 경우 순환종양세포 특이 단백질이 검지될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 단계(c)에서, 원자힘현미경을 이용한 공진 주파수 변화 측정은 공기 중 또는 액상에서 측정 시 순환종양세포 특이 단백질이 검지될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 순환종양세포 특이 단백질이 과발현 되는 양성형(positive type) 및 소량 발현되는 음성형(negative type) 세포주 모두에서 순환종양세포 특이 단백질이 검지될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 공진 주파수의 변화 정도는 항체와 순환종양세포 특이 단백질 간 결합 유무로 인한 AFM 캔틸레버의 질량 변화량과 비례하고, 공진 주파수의 변화량은 순환종양세포 특이 단백질 발현량에 비례한다. 여기서 공진 주파수의 변화량은 순환종양세포 특이 단백질에 대한 특이 항체 고정화되기 전의 캔틸레버 자체의 공진주파수를 기준 공진주파수로 하여 이로부터 실시간으로 측정한 공진주파수의 차이로 측정되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상설한 측정된 공진 주파수의 변화량을 통해 순환종양세포 특이 단백질 발현량을 정량적으로 분석하는 단계와 동일한 순환종양세포 특이 단백질에 대하여 세포주 별 발현량을 비교하는 단계를 거쳐, 순환종양세포 특이 단백질이 과발현되는 양성형(positive type) 또는 소량 발현되는 음성형(negative type) 세포주로 분류할 수 있다.
본 발명은 상기 AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법으로 순환종양세포 특이 단백질 유무를 검출함으로써, 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 암은 유방암, 자궁경부암, 자궁내막체암, 난소암, 위암, 식도암, 간암, 췌장암, 폐암, 대장암, 직장암, 결장암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 골암, 결합조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨 질환, 림프종 및 다발성 골수종혈액암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 암은 검지 대상이 되는 순환종양세포 특이 단백질이 HER2인 경우 유방암일 수 있다.
본 발명은 AFM 캔틸레버 센서를 기반으로 하는 단백질 검출 시스템으로서, AFM 캔틸레버; 상기 AFM 캔틸레버 표면에 고정된 검지대상이 되는 순환종양세포 특이 단백질 특이 항체층; 및 상기 특이 항체층 위에 형성된 검출 대상 순환종양세포 특이 단백질층을 포함하고, 상기 특이 항체층과 순환종양세포 특이 단백질의 결합 반응에 따른 캔틸레버의 공진 주파수 변화를 실시간으로 측정함으로써 암 진단을 위한 정보를 제공하는, AFM 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 순환종양세포 특이 단백질 특이 항체층은 AFM 캔틸레버 표면의 기능화에 의해 캔틸레버 표면에 결합되는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 AFM 캔틸레버 표면의 기능화는 캔틸레버 표면을 아민화하거나 금 박막으로 코팅하는 단계; 및 자기조립단분자층(self assembled monolayer, SAM)을 형성하는 단계로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 자기조립단분자층은 캘릭스크라운(calixcrown), 11-머캅토언데카노산(11-mercaptoundecanoic acid) 및 티옥트산(thioctic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 보다 구체적으로 캘릭스크라운(calixcrown)일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 암은 순환종양세포를 포함하는 암이다.
본 발명에 있어서 AFM 캔틸레버란 마이크로 캔틸레버를 포함하는 의미이다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예 및 실험예 등에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
1) AFM 캔틸레버 표면을 기능화 시키는 단계
Bruker에서 구입한 상용화된 실리콘(Si) 캔틸레버를 피라나(piranha) 용액(4:1 비율과 같이 H2SO4(98.08%):H2O2(34.01%))에 1분 동안 담가두어 유기물을 세척한 후 APTMS((3-Aminopropyl)trimethoxysilane)을 에탄올에 10%로 희석한 용액에 상기 세척한 캔틸레버를 1시간 동안 담가 아민화를 진행시킨 뒤 에탄올과 탈이온수(deionized water)로 세척하였다. 그 다음 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질(이하, CTC-특이 단백질)과 결합하는 특이 항체를 고정화하기 위하여 10 mM ProlinkerTMA 용액에 5시간 동안 담가 중간물질인 캘릭스크라운(Calixcrown) 자가조립분자단층막(assembly monolayer, SAM)을 형성되게 하고 꺼내어 클로로포름(CHCl3), 에탄올, 및 탈이온수로 순차적으로 세척하였다.
2) AFM 캔틸레버 표면에 특이 항체를 고정화시키는 단계
특이 항체를 중간물질과 접합시키기 위하여 PBS 용액(pH 7.4)에 특이 항체를 100 ㎍/mL이 되게 희석한 후 희석용액에 상기 AFM 캔틸레버 표면을 기능화 시키는 단계를 거친 캔틸레버를 1시간 동안 담가 후 꺼내어 PBS 용액(pH 7.4)으로 세척하였다.
3) CTC-특이 단백질을 용액을 반응시키는 단계
순환종양세포 특이 단백질인 HER2 용액을 반응시키기 위하여, 특이 항체가 고정된 AFM 캔틸레버를 리퀴드 셀(liquid cell)에 장착 시킨 후 CTC-특이 단백질 용액 100μL를 인렛튜브(inlet tube)를 이용하여 넣었다. 그 후 30-60분 간 반응을 일으킨 후 공진주파수의 변화로 CTC-특이 단백질과 특이 항체의 반응이 일어남을 관측하였다.
4) 원자힘현미경(Atomic force microscopy, AFM)을 이용하여 공진 주파수를 측정하는 단계
상기의 각각의 단계들의 캔틸레버를 AFM 이미징을 통하여 거칠기(roughness)를 확인하고, 또한 캔틸레버의 공진주파수를 측정하여 다운쉬프트(downshift)되는 것을 확인하여 무게가 증가함을 측정하였다.
[실험예]
실험예1. 캔틸레버 센서의 액상과 공기 중에서의 공진특성 변화 규명
캔틸레버 센서의 공진특성을 공기 중과 액상에서 측정 후 분석하였다. 그 결과, 도 2에서 확인할 수 있는바와 같이 공기 중에서 보다 액상에서 공진의 q-factor가 다소 떨어지나, 공진특성을 이용하여 캔틸레버 센서의 무게를 측정할 수 있고 CTC-특이 단백질 항체를 센싱할 수 있을 것이라 사료되었다. 따라서 하기 실험예2 및 3을 통해 캔틸레버 센서를 CTC-특이 단백질과 반응시켰을 때, 공기 중에서의 그리고 액상에서의 공진특성 변화 각각 측정하여 본 발명에 따른 캔틸레버 센서의 공기 중 및 액상에서의 검지 능력을 검증하였다.
실험예2. 캔틸레버 센서를 CTC-특이 단백질과 반응시켰을 때, 공기 중에서의 공진특성 변화 측정
실시예와 같이 캔틸레버 센서의 공진특성을 측정한 뒤, 센서에 HER2 용액을 반응 시킨 후 공기 중에서 공진특성을 측정하였다. 그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 HER2 용액 반응에 의해 공진특성이 다운쉬프트(down shift) 되었으므로 HER2 단백질이 검지되는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에 따른 캔틸레버 센서를 CTC-특이 단백질과 반응시켰을 때, 공기 중에서의 공진특성 변화 측정 시 CTC-특이 단백질이 검지될 수 있다는 것을 확인하였다.
실험예3. 캔틸레버 센서를 CTC-특이 단백질과 반응시켰을 때, 액상에서의 공진특성 변화 측정
실시예와 같이 센서에 HER2 용액을 반응 시킨 후 액상에서 공진특성 변화를 실시간으로 측정하였다. 그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 공진 주파수가 실시간으로 다운쉬프트(down shift)되어 일정한 값에서 포화(saturation)되는 것으로 나타나 항체에 HER2가 상호작용하여 부착됨을 확인할 수 있고, 이를 통해 HER2 단백질이 검지되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 캔틸레버 센서를 CTC-특이 단백질과 반응시켰을 때, 액상에서의 공진특성 변화 측정 시 CTC-특이 단백질 항체에 CTC-특이 단백질이 상호작용하여 부착되고, CTC-특이 단백질이 검지될 수 있다는 것을 확인하였다.
실험예4. CTC-특이 단백질 농도에 따른 AFM 캔틸레버의 공진주파수 변화
실시예와 같이 HER2 농도에 따른 AFM 캔틸레버의 공진주파수를 측정하였고, 센서의 정확도 및 신뢰성을 확인하기 위해 기존의 실험방법인 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 이용해, AFM 캔틸레버 센서의 HER2 농도별 검지와 비교하였다. 그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 웨스턴 블롯팅(western blotting) 실험결과는 5 nM 이하의 농도는 측정이 불가하지만 본 발명에 따른 AFM 캔틸레버 센서를 이용하면, 0.5 nM 까지 측정이 가능한 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 AFM 캔틸레버 센서는 매우 낮은 농도의 검출한계를 갖는 센서로써 순환암세포 표적의 암 조기진단에 적합한 고감도 센서라는 것을 확인하였다.
실험예5. 캔틸레버 센서를 이용한 세포주(Cell line) 별 CTC-특이 단백질 발현량 검출
본 발명에 따른 AFM 캔틸레버는 임상혈액 검체에 존재하는 CTC를 검지하기 위한 것이므로 실제 세포 용해를 실행하여 실시예의 방법과 동일하게 CTC-특이 단백질 검지를 실시하였다. 특히 본 발명에 따른 캔틸레버 센서의 고감도 검지 능력을 검증하고자 검지대상으로 사용한 CTC-특이 단백질(바이오 마커)은 HER2로 모든 CTC가 HER2를 많이 내재하고 있지 않다. CTC는 HER2가 과발현 되는 HER2 양성형(positive type)과 HER2가 소량으로 발현되는 HER2 음성형(negative type)으로 나뉜다. 모두 동일한 조건에서 배양된 HER2 양성형 세포주인 BT474와 SK-BR3 및 HER2 음성형 세포주인 MCF7과 MDA-MB-231를 세포주 별 HER2 발현량 검지를 위해 사용하였다. 또한 센서의 정확도 및 신뢰성을 확인하기 위해 동일 조건으로 기존의 실험방법인 웨스턴 블롯팅(western blotting) 실시하였다.
그 결과, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 웨스턴 블롯팅(western blotting) 실험 결과로 HER2 양성형 세포주인 BT474와 SK-BR3에서 HER2 발현량이 높다는 것을 확인할 수 있으나 HER2 음성형 세포주인 MCF7과 MDA-MB-231에서는 HER2의 발현량을 측정할 수 없는 것으로 나타났다(도 6a). 한편 본 발명에 따른 AFM 캔틸레버 실험 결과는 HER2 양성형 세포주인 BT474와 SK-BR3에서 HER2 발현량이 높은 것을 확인할 수 있을 뿐만 아니라, HER2 음성형 세포주인 MCF7과 MDA-MB-231에서 발현되는 소량의 HER2의 발현량까지 측정이 가능한 것으로 나타났다(도 6b). 또한 세포주 별 HER2의 발현량을 통해 역 추적함으로써 CTC타입을 분류 할 수 있다(도 6c). 따라서 본 발명에 따른 AFM 캔틸레버기 센서는 기존의 검지 방법인웨스턴 블롯팅(western blotting)을 이용한 HER2 검지법에 비해 더 발전된 형태라는 것을 확인하였다.
실혐예6. 캔틸레버 센서를 이용한 HER2 양성형 세포주인 BT474와 SK-BR3 에 대한 세포 개체 수에 따른 세포 용해액 내의 HER2 검지
상기 실험예5와 동일한 방법으로 캔틸레버 센서를 이용하여 HER2 양성형 세포주인 BT474와 SK-BR3 에 대한 세포 개체 수에 따른 세포 용해액 내의 HER2에 대한 공진 주파수 변화량을 측정하였다. 그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이HER2 양성형 세포주의 경우 10개 미만의 CTC 개체 수가 존재 하여도 검지가 가능한 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 AFM 캔틸레버 센서는 미량의 시료로 검지가 가능한 센서로써 순환암세포 표적의 암 조기진단에 적합한 고감도 센서라는 것을 확인하였다.

Claims (20)

  1. (a) 원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버 표면에 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질인 Her2 단백질에 대한 특이 항체를 고정화시키는 단계;
    (b) 순환종양세포 특이 단백질을 반응시키는 단계; 및
    (c) 원자힘현미경을 이용하여 공진 주파수의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 AFM 캔틸레버를 이용하여 5 nM 농도 이하의 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    AFM 캔틸레버 표면에 특이 항체를 고정화시키는 단계 이전에 상기 캔틸레버 표면을 기능화 시키는 단계를 추가로 포함하는, AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 AFM 캔틸레버 표면을 기능화 시키는 단계는,
    상기 캔틸레버 표면을 아민화하거나 금 박막으로 코팅하는 단계; 및
    자기조립단분자층(self assembled monolayer, SAM)을 형성하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 자기조립단분자층은 캘릭스크라운(Calixcrown), 11-머캅토언데카노산(11-mercaptoundecanoic acid) 및 티옥트산(thioctic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    단계(b)에서, 순환종양세포 특이 단백질이 0.5 nM 농도 이상인 경우 순환종양세포 특이 단백질이 검지되는 것을 특징으로 하는, AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    단계(c)에서, 원자힘현미경을 이용한 공진 주파수 변화 측정은 공기 중 또는 액상에서 측정 시 순환종양세포 특이 단백질이 검지되는 것을 특징으로 하는, AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    순환종양세포 특이 단백질이 과발현 되는 양성형(positive type) 및 소량 발현되는 음성형(negative type) 세포주 모두에서 순환종양세포 특이 단백질이 검지되는 것을 특징으로 하는, AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 공진 주파수의 변화 정도는 항체와 순환종양세포 특이 단백질 간 결합 유무로 인한 AFM 캔틸레버의 질량 변화량과 비례하고,
    공진 주파수의 변화량은 순환종양세포 특이 단백질 발현량에 비례하는 것을 특징으로 하는, AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 공진 주파수의 변화량은 순환종양세포 특이 단백질에 대한 특이 항체 고정화되기 전의 캔틸레버 자체의 공진주파수를 기준 공진주파수로 하여 이로부터 실시간으로 측정한 공진주파수의 차이로 측정되는 것을 특징으로 하는, AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    제10항 또는 제11항의 방법에 의하여 측정된 공진 주파수의 변화량을 통해 순환종양세포 특이 단백질 발현량을 정량적으로 분석하는 단계;
    동일한 순환종양세포 특이 단백질에 대하여 세포주 별 발현량을 비교하는 단계를 거쳐,
    순환종양세포 특이 단백질이 과발현되는 양성형(positive type) 또는 소량 발현되는 음성형(negative type) 세포주로 분류하는 것을 특징으로 하는, AFM 캔틸레버를 이용하여 순환종양세포 특이 단백질을 검지하는 방법.
  13. 제1항에 따른 방법으로 순환종양세포 특이 단백질인 Her2 단백질을 검출함으로써, 순환종양세포를 포함하는 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 자궁경부암, 자궁내막체암, 난소암, 위암, 식도암, 간암, 췌장암, 폐암, 대장암, 직장암, 결장암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 골암, 결합조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨 질환, 림프종 및 다발성 골수종혈액암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  15. 삭제
  16. AFM 캔틸레버 센서를 기반으로 하는 단백질 검출 시스템으로서,
    AFM 캔틸레버;
    상기 AFM 캔틸레버 표면에 고정된 검지대상이 되는 순환종양세포 특이 단백질인 Her2 단백질 특이 항체층; 및
    상기 특이 항체층 위에 형성된 5 nM 농도 이하의 검출 대상 순환종양세포 특이 단백질층을 포함하고,
    상기 특이 항체층과 순환종양세포 특이 단백질의 결합 반응에 따른 캔틸레버의 공진 주파수 변화를 실시간으로 측정함으로써 순환종양세포를 포함하는 암 진단을 위한 정보를 제공하는, AFM 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 순환종양세포 특이 단백질 특이 항체층은 AFM 캔틸레버 표면의 기능화에 의해 캔틸레버 표면에 결합되는 것을 특징으로 하는, AFM 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 AFM 캔틸레버 표면의 기능화는 캔틸레버 표면을 아민화하거나 금 박막으로 코팅하는 단계; 및
    자기조립단분자층(self assembled monolayer, SAM)을 형성하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, AFM 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  19. 제18항에 있어서,
    자기조립단분자층은 캘릭스크라운(calixcrown), 11-머캅토언데카노산(11-mercaptoundecanoic acid) 및 티옥트산(thioctic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, AFM 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템.
  20. 삭제
KR1020150028443A 2015-02-27 2015-02-27 원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버를 이용한 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질검지방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템 KR101765068B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150028443A KR101765068B1 (ko) 2015-02-27 2015-02-27 원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버를 이용한 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질검지방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150028443A KR101765068B1 (ko) 2015-02-27 2015-02-27 원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버를 이용한 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질검지방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160105137A KR20160105137A (ko) 2016-09-06
KR101765068B1 true KR101765068B1 (ko) 2017-08-04

Family

ID=56946026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150028443A KR101765068B1 (ko) 2015-02-27 2015-02-27 원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버를 이용한 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질검지방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101765068B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200026168A (ko) 2018-08-31 2020-03-10 연세대학교 원주산학협력단 유전영동을 이용한 주파수의 급격한 변화를 통한 세포 종류 구분 및 특성 분석법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007139681A (ja) * 2005-11-22 2007-06-07 National Agriculture & Food Research Organization 抗原抗体反応の検出方法と抗原抗体反応検出用キット

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100999424B1 (ko) 2008-11-05 2010-12-09 한국과학기술연구원 고감도의 마이크로 캔틸레버 기반 생체물질 검출 시스템

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007139681A (ja) * 2005-11-22 2007-06-07 National Agriculture & Food Research Organization 抗原抗体反応の検出方法と抗原抗体反応検出用キット

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biosensors and Bioelectronics., 2005, Vol. 20, pp 2157-2162.*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200026168A (ko) 2018-08-31 2020-03-10 연세대학교 원주산학협력단 유전영동을 이용한 주파수의 급격한 변화를 통한 세포 종류 구분 및 특성 분석법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160105137A (ko) 2016-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Johari-Ahar et al. An ultra-sensitive impedimetric immunosensor for detection of the serum oncomarker CA-125 in ovarian cancer patients
Datar et al. Cantilever sensors: nanomechanical tools for diagnostics
Xie et al. An electrochemical peptide cleavage-based biosensor for prostate specific antigen detection via host–guest interaction between ferrocene and β-cyclodextrin
Wang et al. Sensitive immunoassay of a biomarker tumor necrosis factor-α based on poly (guanine)-functionalized silica nanoparticle label
Gruhl et al. Biosensors for diagnostic applications
Nagaraj et al. NanoMonitor: a miniature electronic biosensor for glycan biomarker detection
KR100830811B1 (ko) 종양표시인자 검출용 바이오센서
CN101198870A (zh) 精密磁性生物传感器
Büyüktiryaki et al. Phosphoserine imprinted nanosensor for detection of Cancer Antigen 125
Yang et al. A flexible giant magnetoimpedance-based biosensor for the determination of the biomarker C-reactive protein
Olmsted et al. Comparison of free-solution and surface-immobilized molecular interactions using a single platform
Dolati et al. The trends in nanomaterial-based biosensors for detecting critical biomarkers in stroke
Pal et al. Zinc oxide nanoparticle-enhanced ultrasensitive chemiluminescence immunoassay for the carcinoma embryonic antigen
Chornokur et al. Impedance-based miniaturized biosensor for ultrasensitive and fast prostate-specific antigen detection
Liu et al. Nanogram per milliliter-level immunologic detection of alpha-fetoprotein with integrated rotating-resonance microcantilevers for early-stage diagnosis of heptocellular carcinoma
Martin-Yerga et al. Towards a blocking-free electrochemical immunosensing strategy for anti-transglutaminase antibodies using screen-printed electrodes
Hianik Advances in electrochemical and acoustic aptamer-based biosensors and immunosensors in diagnostics of leukemia
US9645141B2 (en) Method for diagnosing biomarkers and biomarker diagnosis kit
Agarwal et al. Detection of heart-type fatty acid-binding protein (h-FABP) using piezoresistive polymer microcantilevers functionalized by a dry method
Yin et al. A micro-cantilever sensor chip based on contact angle analysis for a label-free troponin I immunoassay
Yang et al. Microcontact surface imprinting of affinity peptide for electrochemical impedimetric detection of neutrophil gelatinase-associated lipocalin
Albuquerque et al. Magnetoresistive detection of clinical biomarker for monitoring of colorectal cancer
Zou et al. All-in-one magnetic beads: Searching, capturing and simultaneous detection of dual tumor related proteins in real samples
KR100999424B1 (ko) 고감도의 마이크로 캔틸레버 기반 생체물질 검출 시스템
KR101765068B1 (ko) 원자힘현미경(Atomic force microscope, AFM) 캔틸레버를 이용한 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 특이 단백질검지방법 및 캔틸레버 기반의 생체물질 검출 시스템

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)