JPH11514874A

JPH11514874A - プリオン蛋白のイソ型ＰｒＰ▲上Ｃ▼およびＰｒＰ▲上ＳＣ▼を識別できる核酸分子ならびにそれらの製造方法

Info

Publication number: JPH11514874A
Application number: JP9516298A
Authority: JP
Inventors: ヴィンアッカー，エルンスト−ルートヴィッヒ; ヴァイス，シュテファン; ファミュロック，ミヒャエル
Original assignee: ヴィンアッカー，エルンスト−ルートヴィッヒ
Priority date: 1995-10-26
Filing date: 1996-10-25
Publication date: 1999-12-21
Also published as: ES2171231T3; WO1997015685A1; US20030119019A1; US6426409B1; DE69618614D1; DE69618614T2; DK0862653T3; EP0862653A1; ATE212065T1; EP0862653B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、プリオン蛋白のイソ型ＰrＰ^cおよびＰrＰ^Scを識別可能な核酸分子の同定および分離のための方法、ならびにこの方法により得られる核酸分子を記載するものである。さらに、プリオン蛋白のイソ型に特異結合する核酸分子を含む医薬組成物および診断用組成物、ならびに係る分子を用いる診断方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】プリオン蛋白のイソ型ＰrＰ^cおよびＰrＰ^Scを識別できる核酸分子ならびにそれらの製造方法本発明は、プリオン蛋白のイソ型ＰrＰ^cおよびＰrＰ^Scを識別できる核酸分子の同定および分離のための方法、ならびにこの方法により得られる核酸分子に関するものである。さらに本発明は、当該核酸分子を含む医薬および診断用組成物に関するものである。プリオンと呼ばれる蛋白性感染性粒子は、羊のスクレイピー、子牛のウシ海綿状脳症(ＢＳＥ)、ミンクの伝達性ミンク脳症(ＴＭＥ)、ならびに人間の場合のクールー病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群(ＧＳＳ)、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）および致死的家族性不眠症（ＦＦＩ）のような伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）の原因物質であると考えられている(プルシナー、1982)。アミロイド様桿状体に付随するプリオン(プルシナー等、1983；1984 )またはスクレイピーに付随する原線維（ＳＡＦ、ホープ等、1986）の主たる成分は、Ｎ末端切除された、プリオン蛋白ＰrＰ^Sc（オエシュ等、1994）の極めてプロテアーゼ耐性な種である、プリオン蛋白ＰrＰ２７−３０であることが判明し(プルシナー等、1981；プルシナー等、1983)、これはプリオン調製物中の小伸長物であることも見出されている(プルシナー等、1983)。アミノ末端の６７アミノ酸を欠くＰrＰ２７−３０は、プロテイナーゼＫ消化により(プルシナー等、19 84；シュタール等、1993)、またはリソソームプロテアーゼ消化により(コーゲイ等、1991)、ＰrＰ^Scから生成する。プリオン調製物中のＰrＰ^ScおよびＰrＰ２７ −３０の分布は、プロテアーゼの存在または不在に応じて異なる。これまでの所プリオン調製物中に特定の核酸は検出されておらず(ケリングズ等、1992)、この事は、プリオンが感染性であり、核酸の不在下で複製できることを示唆している(プルシナー、1982)。蛋白単独仮説（プルシナー、1982）によれば、外因性ＰrＰ^Sc／ＰrＰ２７−３０は、遍在する細胞イソ型ＰrＰ^cをＰr Ｐ^Sc／ＰrＰ２７−３０に変換することができるのであろう。このプロセスにはシャペロンが関与していると思われる(エデンホーファー等、1996)。ＰrＰ^Sc／ＰrＰ２７−３０は単量体として(プルシナー、1982)、またはＰrＰ^Sc／ＰrＰ２７−３０オリゴマーから成る核形成体もしくは結晶の種として（ランスバリーおよびコーゲイ、1995）現れ得る。ＰrＰ^cはその二次構造の点でのみＰrＰ２７− ３０と相違する：ＰrＰ^cのαヘリックスおよびβシート含有量はそれぞれ４２％および３％である(パン等、1993)。対照的に、ＰrＰ２７−３０のαヘリックスおよびβシート含有量はそれぞれ２１％および５４％であることがわかった(パン等、1993)。これらの結果は、ＰrＰ^cのＰrＰ^Sc／ＰrＰ２７−３０への変換が、恐らくはプリオン蛋白の二次構造の極端な変化を相伴うという事を示している。もはやＰrＰ^cを発現しないノックアウトマウスを使用する一連の実験は、細胞プリオン蛋白が幾つかの細胞プロセスで重要な役割を果たしていることを示唆してはいるが(コリンジ等、1994；サカグチ等、1996；トブラー等、1996)、ＰrＰ^c の正確な生理学的役割は依然として推測の域を出ない。しかしながら、ＰrＰ^cは伝達性海綿状脳症の進行に必要であることが判明している(ビューラー等、1993 ；ブランドナー等、1996)。スクレイピーに感染したシリアゴールデンハムスター由来のmＲＮＡの翻訳は、ＮＨ₂末端の２２アミノ酸シグナルペプチドおよびカルボキシ末端の２３アミノ酸シグナル配列を含む２５４アミノ酸蛋白を導いた(オエシュ等、1985；バスラー等、1986)。成熟蛋白ＰrＰ^cおよびスクレイピーのイソ型ＰrＰ^Scは２３ないし２３１のアミノ酸を含んでいる。ＰrＰ^Scのみが、１４２のアミノ酸から成るプロテイナーゼＫ耐性イソ型ＰrＰ２７−３０（アミノ酸９０−２３１）へとプロセシングされ得る(プルシナー等、1984)。この性質を使用して、プリオン蛋白に関連する疾病の診断検定が設計されているが、その場合、全ＰrＰ^cを減成するためプローブをプロテイナーゼＫで処理し、次いでプリオン蛋白に対する抗体と反応させる(グロシュプ等、1994)。しかし、この検定は、ＰrＰ^cのプロテイナーゼＫ消化が不完全であり、故に偽陽性結果が導かれるという事実により、感受性が障害され得るという不利な面がある。さらに、プロテイナーゼＫ消化という余分な工程は時間を消費する。ＰrＰ^cおよび／またはＰrＰ^Scの存在または不在が直接検定できるためには、これら二つのイソ型を識別する事のできる抗体が必要になる。しかし、これまでの所、細胞イソ型ＰrＰ^cおよびイソ型ＰrＰ^Sc、ならびに末端切除型ＰrＰ２７−３０を識別できる抗体を得ようとする試みは失敗してきた( グロシュプ等、1994およびその参考文献)。したがって現在まで、伝達性海綿状脳症の単純且つ信頼し得る診断方法の必要条件である、免疫学的またはその他の手段によるプリオン蛋白のイソ型ＰrＰ^cおよびＰrＰ^Scの識別は不可能であった。故に、本発明の基礎をなす技術的課題は、プリオン蛋白のイソ型ＰrＰ^cおよびＰrＰ^ScまたはＰrＰ２７−３０を識別することができ、そして伝達性海綿状脳症の診断および治療のための有用な手段である、分子の同定および分離のための方法を提供する事である。この技術的課題の解決は、請求の範囲により特徴付けられる態様の規定によって達成される。したがって、本発明は、伝達性海綿状脳症に関係するプリオン蛋白のイソ型Ｐ rＰ^cおよびＰrＰ^ScまたはＰrＰ２７−３０を識別することのできる核酸分子の同定および分離のための方法であって、（ｉ）プリオン蛋白イソ型またはこのプリオン蛋白イソ型のペプチドフラグメントもしくは誘導体を、種々の配列を含む核酸分子のプールとインキュベートし；（ii）当該プリオン蛋白イソ型またはそのフラグメントもしくは誘導体と結合することのできる核酸分子を選択および分離し；（iii）所望により、その分離された核酸分子を増幅し、そして工程（ｉ）および（ii）を反復し；そして、（iv）分離された核酸分子の、プリオン蛋白のＰrＰ^cおよびＰrＰ^ScまたはＰr Ｐ２７−３０イソ型に対する結合特異性を決定する、という工程を含む方法に関するものである。本発明に係る方法は、「インビトロ選択」と呼ばれる方法に基づいている。この方法は、ランダム化された核酸分子の大きな集団から、定められた標的分子と高い親和性で結合する核酸分子(ＲＮＡ、修飾されたＲＮＡ、ssＤＮＡまたはds ＤＮＡ)の同定を可能にする(トゥエルクおよびゴールド、1990；ファミュロックおよびスゾスタック、1992)。この方法を使用して、ＨＩＶ−１逆転写酵素(トゥエルク等、1992)、ＨＩＶ−１インテグラーゼ(アレン等、1995)、ヒトα−トロンビン(キュビック等、1994)およびショウジョウバエの性致死蛋白（サカシタおよびサカモト、1994）を包含する様々な蛋白標的を特異的に認識する核酸を分離することができた。しかし現在の所、この方法によってプリオン蛋白の二つのイソ型ＰrＰ^cおよびＰrＰ^Scを識別できる核酸分子を提供することはできていない。本発明の範囲において、ＰrＰ^cという語は、供給源となった生物の如何に拘わらず、このプリオン蛋白の細胞イソ型ならびにそのフラグメントおよび誘導体を含む。ＰrＰ^Scという語は、種々の伝達性海綿状脳症に関連するプリオン蛋白のイソ型を含む。この語はさらに、このプリオン蛋白イソ型のフラグメント、例えばイソ型ＰrＰ^Scの末端切除種であるプリオン蛋白ＰrＰ２７−３０（これはプリオンの主要成分である）を包含する。特にこの語は、ハムスター、マウスまたはその他の脊椎動物に当てはまるものを包含する種々のスクレイピー株のＰrＰ^Sc 蛋白をも包含する。プリオン蛋白イソ型ＰrＰ^Scの誘導体もまた包含される。この語の誘導体は、プリオン蛋白イソ型ＰrＰ^cおよびＰrＰ^Scの化学的に修飾された種、ならびにこれらの蛋白の突然変異体、即ちアミノ酸配列中１またはそれ以上の位置で天然に存在するプリオン蛋白と異なっている蛋白、および天然に存在するプリオン蛋白イソ型と比較して欠失または挿入を示す蛋白を包含する。このような突然変異体は組換えＤＮＡ技術により生成することができ、または天然に存在する突然変異体であり得る。この語の誘導体はさらに、修飾されたアミノ酸を含む蛋白、またはグリコシル化、燐酸化等により修飾されている蛋白をも包含する。本発明によれば、核酸分子として、一本鎖または二本鎖核酸分子、例えばＲＮＡ、修飾されたＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡを使用することが可能である。プリオン蛋白のイソ型の一つと特異的に結合する核酸分子が選択される元である出発物質を構成する核酸分子のプールは、種々の配列の核酸分子の混合物として定義される。このプールは核酸分子の任意の混合物であってよいが、好ましくはランダム化された分子のプールである。好ましくはこのプールの核酸分子は化学合成され、またはインビトロ転写により生成される。ＲＮＡ分子の場合、プリオン蛋白のイソ型の一つと特異的に結合する分子についてスクリーニングされるＲＮＡプールは、好ましくはファミュロック(Famulok ，1994)において記載されるＲＮＡプールＭ１１１.１である。このプールは、７４の位置でランダム化された１１１ヌクレオチドのＲＮＡ分子から成り、対応するＤＮＡ配列の転写から生成される。プールＭ１１１.１は、およそ１ｘ１０¹⁵ の異なる配列のＲＮＡ分子を含んでいる。本発明に係る方法は、羊のスクレイピー、子牛のウシ海綿状脳症(ＢＳＥ)、ミンクの伝達性ミンク脳症(ＴＭＥ)、人間の場合のクールー病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群(ＧＳＳ)、致死性家族性不眠症(ＦＦＩ)、クロイツフェルト−ヤコブ病(ＣＪＤ)、ラバ、シカおよびエルクの慢性消耗病（ＣＷＤ）またはネコのネコ海綿状脳症（ＦＳＥ）のような伝達性海綿状脳症に関係するプリオン蛋白の二つのイソ型ＰrＰ^cおよびＰrＰ^Scを識別できる核酸分子の同定および分離に使用することができる。伝達性海綿状脳症はまた、ニアラ、ゲムズボック、アラビアオリックス、グレータークーズー、エランド、アンコール、ムフロン、ピューマ、チータ、シミターホーンドオリックス、オセロットおよびトラでも知られている。核酸分子のプールをプリオン蛋白と共にインキュベートする工程は、種々の方法で実施することができる。本発明の一つの好ましい態様では、蛋白を、例えばクロマトグラフィー用のゲルまたは樹脂のようなマトリックス上に固定化する。固定化は当業者に知られる手段によって達成することができる。例えば、蛋白をマトリックスに共有結合させ、またはマトリックス上に存在する基と、この基を特異的に認識する蛋白のドメインとの間の特異的相互作用によって蛋白をマトリックスに結合させることができる。このようなドメインは、下に述べるような組換えＤＮＡ技術によってプリオン蛋白に融合させることができる。プリオン蛋白が固定化されると、プリオン蛋白に結合しない核酸分子は、適当な緩衝液による洗浄により、インキュベーション後に除去することができる。その後、プリオン蛋白に結合しているこの核酸分子は、例えば８Ｍ尿素により、固定化された蛋白から溶離し、さらに例えばフェノール抽出および沈澱化により精製することができる。もう一つの好ましい態様においては、プリオン蛋白は溶液状態である。この場合、プリオン蛋白に結合している核酸分子は、例えばゲル遅延検定を実施し蛋白／核酸複合体を分離することにより分離することができる。その後この核酸分子を複合体から分離し既知の方法によってさらに精製することができる。本発明によれば、例えばインビトロ転写、逆転写またはポリメラーゼ連鎖反応またはこれらの技術の組み合わせにより、工程(i)および(ii)により得られる核酸分子を増幅し、そして工程(i)および(ii)を反復することが可能である。この事により、使用されたプリオン蛋白に特異的に結合する核酸分子のさらなる選択および増幅が導かれる。もしこの方法の工程(i)ないし(iii)を数サイクル実施するならば、１またはそれ以上のサイクルに固定化された蛋白を、そして１またはそれ以上のサイクルに溶液の蛋白を使用することが可能である。溶液状態の蛋白が使用されるサイクルは、固定化された蛋白が結合しているマトリックスに結合している核酸分子の除去を可能にする。この方法に用いられるプリオン蛋白は、任意の既知のプリオン蛋白イソ型または係る蛋白のフラグメントもしくは誘導体であってよい。好ましい態様において、プリオン蛋白は、プリオン中に存在するイソ型ＰrＰＳ^cである。特に好ましい態様においては、ＰrＰ^ScのＮ末端切除種であるＰrＰ２７−３０が使用される。この文脈中、ＰrＰ^ScおよびＰrＰ２７−３０とは、伝達性海綿状脳症に罹患している生物中に見出し得るこれらのイソ型の任意のものを指す。さらなる好ましい態様において、この方法で用いられるプリオン蛋白は、細胞イソ型ＰrＰ^c、最も好ましくはＰrＰ^cのアミノ酸２３ないし２３１を含むプロセシングされた型ＰrＰ^c２３−２３１である。別の好ましい態様において、この方法で用いられるプリオン蛋白は組換え蛋白である。これは、当該蛋白が組換えＤＮＡ技術、即ちクローニングされたＤＮＡ配列からの発現により生成されることを意味する。より好ましくは、プリオン蛋白は融合蛋白の一部である。このような融合蛋白は、プリオン蛋白以外に、蛋白、またはその融合蛋白に特異的結合能を付与する蛋白ドメインを含むことができる。例えば、このようなドメインは、オリゴヒスチジン(ルグリス等、1990)、カルモジュリン結合ペプチド(ＣＢＰ)(カー等、199 1)、Ｓ−ペプチド(リボヌクレアーゼＡ)(キムおよびレインズ、1993)、ＦＬＡＧ (カワセ等、1995)、緑色蛍光蛋白(ＧＦＰ)(ハンプトン等、1996)、Ｂタグ(ワング等、1996)、またはマルトース結合蛋白(ＭＢＰ)(アイトケン等、1994、リチャーズおよびウィコフ、1971)であってよい。このようなドメインを含む蛋白は、例えばＩＭＡＣ−Ｎi²⁺、カルモジュリン、Ｓ−蛋白１０４aa(キムおよびレインズ、1993)、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＧＦＰ抗体、Ｂタグ抗体またはマルトース上に固定化することができる。次いで当分野で良く知られる方法により溶出が達成できる。好ましい態様において、プリオン蛋白はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合させる。係る融合蛋白はグルタチオンに対して高い親和性を持ち、したがってグルタチオンを含むマトリックス、例えばグルタチオン−セファロース上に固定化することができる。本発明に係る方法の最終工程では、分離された核酸分子を、プリオン蛋白の異なるイソ型ＰrＰ^cおよびＰrＰ^Scとの結合について試験する。イソ型の一方とのみ特異結合する核酸分子を選択する。したがって、本発明に係る方法は、プリオン蛋白のイソ型またはそのフラグメントもしくは誘導体の一方と特異結合する核酸分子の同定および分離を可能にし、それにより異なるイソ型の識別を可能にする。故にこれらの核酸分子は思いがけなくも高い特異性を示し、それは、プリオン蛋白のイソ型を識別できないポリまたはモノクローナル抗体の特異性を上回るものである。本発明方法を実施して、シリアゴールデンハムスター由来のイソ型ＰrＰ^c２３ −２３１およびＰrＰ２７−３０を識別できるＲＮＡ分子をうまく分離することができた。この場合、イソ型は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合させた組換え蛋白（ＧＳＴ::ＰrＰ^c２３−２３１およびＧＳＴ::rＰrＰ２７−３０）であった。組換えrＰrＰ２７−３０蛋白は天然ＰrＰ２７−３０蛋白と配列が同一であるが、天然イソ型とは対照的にプロテイナーゼＫ感受性を示す。さらに、本発明は、本発明に係る方法により取得可能な核酸分子、即ち、プリオン蛋白のイソ型の一方に結合するＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ分子に関するものである。これらは、細胞イソ型ＰrＰ^c、即ちプロセシングされた型ＰrＰ^c２３−２３１、またはイソ型ＰrＰ^Sc、即ち末端切除種ＰrＰ２７−３０、またはこれらの蛋白の誘導体に、特異的に結合する核酸分子を包含する。好ましい態様において、本発明に係る核酸分子は、４および７ヌクレオチドの間の長さの一本鎖領域により隔てられた、連続する３個のグアノシン残基を４箇所含んでいる。より好ましくは、当該核酸分子は、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含んでいる。別の好ましい態様において、４箇所のグアノシン部分を含む領域は、主としてワトソン−クリック共変異の二つの可変領域が両端に隣接している。特に、該核酸分子は、好ましくは配列番号１ないし１３のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列、そしてより好ましくは配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含んでいる。好ましい態様において本発明に係る核酸分子は、それらの安定性を増し、そして／またはそれらの生化学的および／または生物物理学的性質を改変するため、１またはそれ以上の位置でさらに修飾される。本発明はさらに、本発明に係る核酸分子を含む医薬組成物に関するものである。係る組成物は所望により製薬上許容し得る担体を含むことができる。これらの組成物は、例えば上に列挙されたような伝達性海綿状脳症の治療に有用であり得る。例えば、ＰrＰ^cに特異結合する核酸分子を適用することにより、イソ型ＰrＰ^cからプリオン関連イソ型ＰrＰ^Scへの変換を抑制することが可能となり得る。さらに、本発明は、本発明に係る核酸分子を含む診断用組成物に関するものである。係る組成物は、診断目的のために一般的に用いられる添加物を含有してよい。本発明に係る核酸分子および診断用組成物は、伝達性海綿状脳症の診断のための方法で使用することができる。係る方法は、例えば、身体から取得したプローブを、本発明に係る核酸分子の少なくとも１種類と共にインキュベートし、その後、該核酸分子とプリオン蛋白のイソ型ＰrＰ^cおよびＰrＰ^Scとの相互作用を測定することを含む。伝達性海綿状脳症に罹患中は、イソ型ＰrＰ^Scの量が増加し、細胞イソ型ＰrＰ^c の総量は減少するため、原則として二つのイソ型の一方または他方と結合する核酸分子を診断に使用することが可能である。一方で、プローブ中のプリオン蛋白の少なくとも一つのイソ型の量を定量するため、本発明に係る核酸分子の少なくとも１種類を使用することが可能である。他方では、プローブ中のイソ型の絶対量および／または相対量を測定するため、ＰrＰ^cイソ型に特異結合する核酸分子をＰrＰ^Scイソ型に特異結合する核酸分子と組み合わせて使用することが可能である。好ましい態様において、プローブは様々な臓器、好ましくは組織から、例えば脳、扁桃、回腸、皮質、硬膜、プルキニエ細胞、リンパ節、神経細胞、脾臓、筋肉細胞、胎盤、膵臓、眼球、脊髄またはパイエル板から、例えば薄い切片の形で取得することができる。別法としてプローブは、体液、好ましくは血液、脳脊髄液、乳または精液から取得することができる。脳をプローブとして使用する場合、診断は殆どの場合死後に実施する。例外的に脳生検を生きている生物に実施することができる。脳は、伝達性海綿状脳症に罹患し得る任意の生物、例えば羊、子牛、マウス、ネコ、ハムスター、ラバ、シカ、エルクもしくは人間、またはＴＳＥに罹患し得る上記のようなその他の生物に源を発することができる。脳は、ＰrＰ^0/0(ノックアウト)、ＰrＰ^Sc（感染した）およびＰrＰ^c（野生型）または未知のＰｒＰ状態である生物を供給源とすべきである。血液、乳、脳脊髄液、精液または上に述べたその他の臓器由来の組織をプローブとして使用する場合は、生きている個体に対する診断が可能である。さらに、本発明に係る核酸分子を使用して、プリオン蛋白イソ型の特異結合に必要な三次元構造を同定することができる。この情報の助けにより、プリオン蛋白イソ型と特異結合できる他の化合物を分離または合成することができる。したがって、本発明はさらに、本発明に係る核酸分子の三次元構造から導かれる情報に基づき無機または有機化合物、好ましくは糖類、アミノ酸、蛋白または炭水化物より成る群から選ばれる、核酸分子以外の化合物に関するものである。図１Ａ：固定化された融合蛋白ＧＳＴ::rＰrＰ^c（ＧＳＴ::rＰrＰ２３−２３１）に特異結合するＲＮＡ分子のインビトロ選択のための方法を模式的に示している(ＧＳＴ＝グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応)。下記の事柄において、（ｒ）ＰrＰ^cはrＰrＰ２３−２３１を表す。さらに、r ＰrＰ２７−３０はrＰrＰ９０−２３１を表す(シリアゴールデンハムスター)。図１Ｂ：溶液状態のＧＳＴ::rＰrＰ^cおよびゲルシフト分析を用いた、ＧＳＴ: :rＰrＰ^cに特異結合するＲＮＡ分子のインビトロ選択におけるさらなる工程を模式的に示している。図２：インビトロ転写によるランダム化されたＲＮＡプールＭ１１１.１の組み立てを模式的に示している(ファミュロック、1994)(Ntes＝ヌクレオチド)。図３：実施例１に記載される方法の各サイクル後の固定化されたＧＳＴ::rＰr Ｐ^c２３−２３１に結合するＲＮＡのパーセンテージを示している。上清除去後のＧＳＴ::rＰrＰ^cビーズに伴う放射能を１００％と定めた。４回の洗浄工程の後に保持されている放射能がＲＮＡ結合のパーセンテージを表す。図４Ａ：選択されたＲＮＡおよび選択されなかったＲＮＡの、ＧＳＴ、ＧＳＴ ::rＰrＰ^cおよびＧＳＴ:rＰrＰ２７−３０に対する結合を示している。５'標識されたＲＮＡを当該蛋白の存在下にインキュベートし、ミリポアスロットブロット装置上のＢＡ８５ニトロセルロースで濾過した。保持された放射能をセレンコフ計数により定量した。図４Ｂ：実施例１のインビトロ選択されたＲＮＡ分子がシリアゴールデンハムスター由来のＰrＰ^cおよびrＰrＰ２７−３０を識別することを示している。ゲルａ：９サイクル後の５'標識されたＲＮＡ分子をＧＳＴ、ＧＳＴ::ＰrＰ^cおよびＧＳＴ::rＰrＰ２７−３０の存在下にインキュベートし、そして０.７％非変性アガロースゲル上で分析した。ゲルは５％ＴＣＡにより固定し、乾燥し、オートラジオグラフィーに付した。第９サイクルからのＧＳＴ::rＰrＰ^c／ＲＮＡ複合体をゲルから切り取り、ＲＮＡ抽出し、逆転写し、ＰＣＲ増幅しそしてインビトロ転写した(図１Ｂを参照されたい)。この操作をサイクル１０および１１について２回反復した。ゲルｂ：１１サイクル後の５'標識されたＲＮＡをやはりＧＳＴ、ＧＳＴ::ＰrＰ^cおよびＧＳＴ::rＰrＰ２７−３０の存在下にインキュベートし、上記のように分析した。図５：ハムスター由来のＧＳＴに融合させたrＰrＰ^c２３−２３１に対して作製された、インビトロ選択により選択されたＲＮＡアプタマーの配列。このアプタマーは幾つかの分子群に属する。(A)群（モチーフＩ）および(B)群（モチーフ II）のＲＮＡアプタマーはＧの四つ組モチーフを有し、rＰrＰ２３−２３１（r ＰrＰ^c）およびrＰrＰ９０−２３１（rＰrＰ２７−３０）を識別する。(C)群のＲＮＡアプタマー（モチーフIII）もまたＧの四つ組を持ち得るが、rＰrＰ２３ −２３１（rＰrＰ^c）およびｒＰrＰ９０−２３１（rＰrＰ２７−３０）と相互作用する。(D)アプタマーはユニークなＧの四つ組を有する（６個のうち５個のアプタマーが示されている）。(E)群のアプタマーはＧの四つ組モチーフを欠き、ＧＳＴに結合する（６個のうち１個のアプタマーが示されている）。図６：ＲＮＡアプタマーのモチーフＩおよびIIは、ハムスターおよび子牛由来の組換えプリオン蛋白イソ型rＰrＰ２３−２３１（rＰrＰ^c）およびrＰrＰ９０ −２３１（rＰrＰ２７−３０）を識別する。（Ａ）４pMolの標識化ＲＮＡＡp１（モチーフＩ；１−３列）を、シリアゴールデンハムスター由来の組換えＧＳＴ ::rＰrＰ２３−２３１(rＰrＰ^c)(２列)およびＧＳＴ::rＰrＰ９０−２３１(rＰr Ｐ２７−３０)(３列)各４０pMolの存在下にインキュベートした。（Ｂ）４p Molの標識化ＲＮＡＡp１（モチーフＩ；１−３列）を、子牛由来の組換えＧＳＴ::bov−rＰrＰ２５−２４２(rＰrＰ^c)(２列)およびＧＳＴ::bov−rＰrＰ９３ −２４２(rＰrＰ２７−３０＋１オクタリピート)(３列)各４０pMolの存在下にインキュベートした。（Ｃ）４pMolの標識化ＲＮＡモチーフII（１−３列）を、ハムスター由来のＧＳＴ::rＰrＰ２３−２３１(rＰrＰ^c)(２列)およびＧＳＴ::rＰ rＰ９０−２３１(rＰrＰ２７−３０)(３列)の存在下にインキュベートした。反応の検定は０.７％アガロースゲル上で分析した。（Ｄ）４pMolの標識化ＲＮＡＡp２（モチーフII；１−３列）を、子牛由来の組換えＧＳＴ::bov−rＰrＰ２５ −２４２(rＰrＰ^c)(２列)およびＧＳＴ::bov−rＰrＰ９３−２４２(rＰrＰ２７ −３０＋１オクタリピート)(３列)各４０pMolの存在下にインキュベートした。追加の牛オクタリピートはaa９３から１０１まで延びている。図７：ハムスターおよび子牛のＲＮＡアプタマー−ＰrＰ相互作用部位のマッピング。（Ａ）標識化されたＲＮＡアプタマーモチーフＩ（１−９列）４pMolおよび（Ｂ）標識化されたＲＮＡアプタマーモチーフII（１−９列）４pMolを、ハムスター由来のＧＳＴ::rＰrＰ２３−２３１(rＰrＰ^c)(８列)、ＧＳＴ::rＰrＰ９０−２３１(rＰrＰ２７−３０)(９列)各４０pMol、およびＧＳＴ::Ｐ_23-52(２列)、ＧＳＴ::Ｐ_55-93(３列)、ＧＳＴ::Ｐ_90-109(４列)、ＧＳＴ::Ｐ_129-175(５列)、ＧＳＴ::Ｐ_218-231（６列）およびＧＳＴ::Ｐ_180-210（７列）各２０pMol の存在下でインキュベートした。反応の検定を０.７％アガロースゲル上で分析した。（最上部）ハムスターＰrＰ領域の模式的表示。斜線付きの囲みはアプタマーと相互作用するＰrＰ領域である。中空の囲みはアプタマーと相互作用しないＰrＰ領域である。（Ｃ）標識化されたＲＮＡアプタマーモチーフII（１−４列）４pMolを、ウシＧＳＴ::bovＰ_25-92(２列)、ＧＳＴ::bovＰ_93-120（３列）各４０pMolおよびウシＧＳＴ::bov−rＰrＰ９３−２４２（rＰrＰ２７−３０＋１オクタリピート；１列）およびハムスターＧＳＴ::Ｐ_23-89（４列）各２０pMo lの存在下でインキュベートした。実施例により本発明を説明する。実施例１ＧＳＴ::rＰrＰ^c２３−２３１と特異結合するＲＮＡ分子のインビトロ選択ＧＳＴに融合させたシリアゴールデンハムスター由来の組換えＰrＰ２３−２３１(rＰrＰ^c)(ワイス等、1995)およびＲＮＡプールＭ１１１.１（ファミュロック、1994）を用いてインビトロ選択法（図１ＡおよびＢに模式的に概説した）を実施した。１−９サイクル：５'[γ−³²Ｐ]−ＡＴＰ標識された（１サイクル）または[α −³²Ｐ]−ＵＴＰ標識された（２−１０サイクル）ＲＮＡＭ１１１.１(ファミュロック、1994)(6.8nMol(初回)、1.82nMol(第２回)、914pMol(第３回)、665pMol( 第４回)、2.07nMol(第５回)、831pMol(第６回)、2.7nMol(第７回)、1.94nMol(第８回および第９回目のサイクル)）を、８mＭＮa₂ＨＰＯ₄、0.87mＭＫＨ₂ＰＯ₄ 、136mＭＮaＣl、112.6mＭＫＣl、2mＭＤＴＴおよび2mＭＭgＣl₂より成る結合緩衝液中で、バキュロウイルス系（ワイス、1995）で合成された固定化されたＧＳＴ（185pMol）の存在下でインキュベートした(図１Ａ)。インキュベーションはオーバーヘッドインキュベーター中３７℃で行った。１−７サイクル：６０分後に７００ｇ１０分間でビーズを集めた。８−９サイクル：固定化されたＧＳＴと共に、上記のごとくインキュベーションを３０分間行った。引き続きビーズを遠心により除去し、新たに固定化したＧＳＴと共に上清をさらに３０分間インキュベートした。１−９サイクル：プレ選択からの上清を、上記のようにバキュロウイルス系（ワイス等、1995）で合成された固定化ＧＳＴ::rＰrＰ^c２３−２３１（53pMol）と共にインキュベートした。６０分後、ビーズを結合緩衝液で４回洗浄し、１００mＭクエン酸ナトリウム（pH8.0）および３mＭＥＤＴＡ中８Ｍ尿素の存在下にＲＮＡを溶出した。このＲＮＡをフェノール(pH5.0)／クロロホルム抽出し、２Ｍ酢酸アンモニウムの存在下にＥtＯＨ沈澱させた(図１Ａ)。９−１１サイクル：選択されたＲＮＡ（９サイクルでは４０pMol；１０および１１サイクルでは各々４pMol）を５'標識し、可溶性ＧＳＴ::rＰrＰ^c２３−２３１（ワイス等、1995；９サイクルでは１４０pMol、１０および１１サイクルでは４０pMol）と共に結合緩衝液中３７℃で６０分間インキュベートし、そして０. ７％未変性アガロースゲル上でのゲルシフト分析により、記載のように（ワイス等、1992）分析した。電気泳動後、ＲＮＡ／ＧＳＴ::ＰrＰ^c２３−２３１複合体を切り取り、キアエックス抽出キット（キアゲン）を使用することにより抽出した。１−１１サイクル：抽出されたＲＮＡの各５０％を、スーパースクリプト逆転写酵素キット（ギブコ、ＢＲＬ）に従い逆転写反応に付した。得られたｃＤＮＡの５０％を、図２Ｂに示されるプライマーを用いてサイキ等、１９８８に従いＰＣＲにより増幅した。増幅されたｃＤＮＡの５０％を記載のように（ワイス等、 1992）インビトロ転写した。ニトロセルロース結合検定：５'標識された（サムブルック等、1989）ＲＮＡ４pMolを結合緩衝液の存在下に蛋白０ないし５００nＭの存在下で６０分間３７ ℃でインキュベートした。インキュベーション混合物をミリポアスロットブロット装置中でＢＡ８５ニトロセルロースメンブレンで濾過し、フィルターをインキュベーション緩衝液４mＬで洗浄し、切り取り、セレンコフ計数により測定した。ゲルシフト分析：ＲＮＡおよび蛋白を上記のようにインキュベートし、反応混合物を記載のように（ワイス等、1992）０.７％未変性アガロースゲルにロードした。電気泳動の後、ゲルを５％ＴＣＡにより固定し、乾燥しそしてオートラジオグラフィーに付した。ＲＮＡプールＭ１１１.１：このＲＮＡプールは、記載のように（ファミュロック、1994）ＤＮＡプール（１３８塩基）からインビトロ転写によって作製した。簡潔に述べると、Ｍ１１１.１は、７４のランダム化された配列、塩基の順列４７４＝３.５６ｘ１０⁴⁴分子、分子量３６６３０ダルトンを示す。合成により１７５μg（4.76nMol）のＲＮＡが生成した。これは６ｘ１０²³（アボガドロ）ｘ４.７６ｘ１０^-9＝２.８６ｘ１０¹⁵分子である。合成されたssＤＮＡプールの３６％がＰＣＲにより伸長可能であり、その結果およそ１.０３ｘ１０¹⁵の異なる配列と１.０３ｘ１０¹⁵の複雑度を有するプールが生成したが、これは一つのプールのコピーに相当する(即ち、各々一つ一つのＲＮＡ分子がプール内で一重に表される)。詳細には、ＲＮＡプールＭ１１１.１の技術的特徴は以下の通りである：固定領域１のヌクレオチド配列５'ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＧＣ（配列番号１９）固定領域２のヌクレオチド配列５'ＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＣＣ（配列番号２０）ランダム化された配列＝７４ヌクレオチド塩基順列４⁷⁴＝３.５６ｘ１０⁴⁴；ＮＷ＝３６６３０；１nＭ＝３６．６３μg；１７５μg（４.７６nMol）が合成された；即ち６ｘ１０²³ｘ４.７６ｘ１０^-9 ＝２.８６ｘ１０¹⁵分子３６％伸長可能プールの複雑度＝１.０３ｘ１０¹⁵分子＝１プールコピー、即ち各々一つ一つのＲＮＡ分子がプール内で一重に表されるＲＮＡプールＭ１１１.１の模式図を図２に示す。固定領域１のヌクレオチド配列５'−ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号１９のヌクレオチド１ないし２５）は、転写されていないため、ＤＮＡプールにのみ属する。９巡の選択の後、ＧＳＴ::rＰrＰ^c２３−２３１に結合した選択されたＲＮＡの７.２％がグルタチオン−セファロース４Ｂ上に固定化された（第１表および図３）。ＲＮＡ結合のパーセンテージは以下のように決定した：上清除去後のＧＳＴ:: rＰrＰ^cビーズに付随する放射能を１００％と設定した。４回の洗浄工程後に保持された放射能がＲＮＡ結合のパーセンテージを表す。 *ＲＮＡ結合のパーセンテージは図３に対する説明に記載のようにして測定した。可溶性ＧＳＴ、ＧＳＴ::ＰrＰ^c２３−２３１およびＧＳＴ::rＰrＰ２７−３０を用いた結合検定は、９サイクル由来の濃縮されたＲＮＡの２％がＧＳＴ::Ｐr Ｐ^c２３−２３１に結合するが、一方ＧＳＴ::rＰrＰ２７−３０およびＧＳＴには１.１％しか結合しないことを明らかにした(図４Ａ)。この結果は、ＲＮＡの〜５％が、マトリックス、即ちグルタチオン−セファロース４Ｂに結合したことを示している。６巡の選択の後、わずか１％のＲＮＡが固定化されたＧＳＴ::Ｐ rＰ^c２３−２３１に、そして０.７％がＧＳＴに結合したに過ぎなかった(図４Ａ )。９サイクルの選択の後に分離されたＲＮＡによるゲルシフト分析は、ＲＮＡの２％がモル比１０：１（蛋白：ＲＮＡ）でＧＳＴ::ＰrＰ^c２３−２３１に結合した（図４Ｂ、ａ図、６列）が、一方ＧＳＴ::rＰrＰ２７−３０（９列）およびＧＳＴ（３列）の場合、同一条件下で結合が起こらないことを確認している。ＧＳＴ::ＰrＰ^c２３−２３１に特異結合しているＲＮＡを濃縮し、マトリックスに結合しているＲＮＡ分子を除去するため、本発明者等は、ＲＮＡ／ＧＳＴ:: ＰrＰ^c２３−２３１複合体を切り取り、このＲＮＡを抽出および増幅し(図１Ｂ) 、そしてそれをさらに２回のゲルシフト分析に付した。図４Ｂに示されるように、計１１サイクルの後(ｂ図)、本発明者等は、ＲＮＡの１０倍のモル過剰蛋白でＧＳＴ::ＰrＰ^c２３−２３１に特異結合するＲＮＡを分離した(図４Ｂ、ｂ図、６列)。ＧＳＴ::rＰrＰ２７−３０（９列）およびＧＳＴ（３列）の存在下では結合は起こらない。より詳細な結合分析は、ＧＳＴ::ＰrＰ^c２３−２３１に対するＲＮＡの結合が１：１および５：１の間のモル比（ＲＮＡ：蛋白）で起こることを明らかにした。これらの発見は、ＧＳＴ::ＰrＰ^c２３−２３１およびＧＳＴ:: rＰrＰ２７−３０を識別できるＲＮＡの選択を証明している。これらの結果は、ＧＳＴに融合した細胞プリオン蛋白イソ型ＰrＰ^c２３−２３１に特異結合するＲＮＡアプタマー（aptus＝適合させる）をインビトロ選択によって分離することが可能であることを証明している。このＲＮＡは、ＧＳＴに融合した組換えプリオン蛋白rＰrＰ２７−３０には結合せず、またＧＳＴにも結合しない。故に、ＰrＰ^c２３−２３１およびrＰrＰ２７−３０を識別できるＲＮＡが選択された。組換えＰrＰ２７−３０はスクレイピーのプリオン調製物（プルシナー等、１９８４）に存在する天然ＰrＰ２７−３０に比較して同じアミノ酸配列を持っているが、この天然イソ型とは対照的に、プロテイナーゼＫ感受性を示す。ＰrＰ^c２３−２３１およびrＰrＰ２７−３０を識別できるＲＮＡアプタマーは、ただ一つのＰrＰイソ型を特異的に認識するポリおよびモノクローナルＰrＰ抗体を作製することはできない（グロシュプ等、1984およびその引用文献）という問題を克服し、伝達性海綿状脳症の信頼し得る診断のための好適な手段を提供するものである。実施例２同定されたＲＮＡ分子の配列の決定１１サイクルの増幅および選択の後に同定されたＲＮＡ分子の配列を決定するため、これらのＲＮＡ分子をcＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲ（サムブルック等、198 9）により増幅した。得られたcＤＮＡをＥcoＲＩおよびＢamＨＩで制限消化し、 pＧＥＭ−３−Ｚf（−）中にサブクローニングし、cＤＮＡクローンpＧＥＭ−Ａ p１ないし２０の異なる２０の配列をサンガー等（1977）に従って決定した。同定された１４のＲＮＡ分子の配列を図５（配列番号１ないし１４）に示す。得られたモノクローナルＲＮＡは、Ｇ四つ組のモチーフを含んでいるかも知れない配列を示した。３つのクラスのＧ四つ組モチーフ（第II表；図５Ａ、Ｂ、Ｃ）を、１以上のモノクローナルＲＮＡを用いて同定することができた。配列決定されたＤＮＡ分子の３０％がＧ四つ組をも含み得るユニークなＲＮＡ分子をコードしており(図５Ｄ)、選択されたＲＮＡアプタマーの３０％がＧ四つ組モチーフを含まなかった(図５Ｅ)。２０個の配列決定されたクローンの詳細な分析により、７０％のクローンが、４および７ヌクレオチドの間の長さの一本鎖領域により隔てられている高度に保存された連続する３個のグアノシン残基を４組含んでいることが明らかとなった。これらのグアノシンに富む共通モチーフは、主としてワトソン−クリック変異の二つの可変領域が両端に隣接している(図６を参照されたい)。グアノシンのつながりを４組含むこの分子の一次配列は、それらの二次構造が３層のＧ四つ組モチーフを含んでいることを強く示唆している(図６を参照されたい)。選択されたＲＮＡの４０％において、３クラスのアプタマーモチーフが、３個の一本鎖ループ領域内のそれらの関係に基づいて同定された(図６を参照されたい)。同定された各クラスの個々の成員は、推定のＧ四つ組およびループ領域内で同一であったものの、それらはワトソン−クリックヘリックスにおいて有意な共変異を示した。このようなＧ四つ組モチーフは、他の幾つかの選択された核酸分子中で既に同定されており(例えばボック等、1992；ワング等、1993；マカヤ等、1993；ローホンおよびスゾスタク、1995；フイゼンガおよびスゾスタク、1995；ハラダおよびフランケル、1995)、高い特異性でリガンドに結合する核酸分子において重要な特徴をなしているように思われる。さらに、Ｇ四つ組は、テトラヒメナのような種のテロメアＤＮＡ配列に対して示唆されている(サンドキストおよびクルッグ、1989；ウィリアムソン等、1989；総説についてはウィリアムソン、1993) 。Ｇ四つ組を形成し得る富グアニン配列は、免疫グロブリンスイッチ領域中に、遺伝子プロモーター中に、および、４個のホモローガスな染色分体を減数分裂の間一緒にしておき、ＤＮＡの減成を防ぐと考えられる染色体テロメア中に見出された(センおよびギルバート、1988)。Ｇ四つ組はさらに、感染性ビリオンの生成にとって必須条件である、レトロウイルスゲノムＲＮＡの二量体化プロセスにおいて役割を果たしているとも論じられている(ワイス等、1993)。Ｇ四つ組は、窒素または酸素および水素の間の水素結合を介してフーグスティーン型塩基対によってまとめられている(センおよびギルバート、1988)。プリオン蛋白に対する選択されたＲＮＡアプタマーは、相互に積み重ねられた３個のＧ四つ組を含み(図６)、２個の８配位子キレートケージを形成し得る。軸方向のチャンネル内部に位置するカリウムのようなアルカリ金属イオンは、上部のＧ四つ組の４個の酸素と、そして下部のＧ四つ組の４個の酸素と複合体形成することができる。この極めてコンパクトな構造の故に、Ｇ四つ組は非常に安定であり、著しくＲＮアーゼ耐性なのである。実施例３Ｇ四つ組モチーフIおよびIIを有するモノクローナルＲＮＡアプタマーはハムスター由来のrＰrＰ２３−２３１（rＰrＰ^c）および子牛由来のrＰrＰ２５−２４２（rＰrＰ^c）に特異結合するモチーフＩ（Ａp１；図６Ａ、Ｂ）およびII（Ａｐ２；図６Ｃ、Ｄ）を表すモノクローナルＲＮＡアプタマーは、いずれもＧＳＴと融合させたシリアゴールデンハムスター由来のrＰrＰ２３−２３１(rＰrＰ^c)(図６Ａ、Ｃ；２列)および牛由来のrＰrＰ２５−２４２(rＰrＰ^c)(図６Ｂ、Ｄ；２列)と特異的に相互作用する。ハムスターおよび牛由来のプリオン蛋白は、８８％の配列相同性を示す。ウシＰrＰは、ウシprn-p cＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞中で合成された(ヨシモト等、１９９２)。ＲＮＡアプタマーがＢＳＥの診断手段の開発に適当であるか否かを証明するため、ウシＰrＰに対するこのアプタマーの結合が研究された。いずれのアプタマーも、ハムスター由来のＧＳＴ融合プリオン蛋白rＰrＰ９０−２３１(rＰrＰ２７−３０)(図６、Ａ、Ｃ；３列)および牛由来のrＰrＰ９３−２４２(rＰrＰ２７−３０＋１オクタリピート、アミノ酸９３−１０１)(図６、Ｂ、Ｄ；３列)と結合せず、この事は、当該分子が両方の種由来のrＰrＰ^cおよびrＰrＰ２７−３０を識別することを立証するものである。III群のＲＮＡアプタマーはrＰrＰ^cと相互作用し、rＰrＰ２７−３０と弱い相互作用を示す。Ｇ四つ組モチーフを欠く、選択された幾つかのＲＮＡアプタマーは、ＧＳＴと相互作用する（データは示されていない）。さらに、図５に示されるようなモチーフＩを含むアプタマーに基づき６０ヌクレオチドから成るアプタマーが組み立てられたが、これはプライマー結合部位とランダム化領域の１４ヌクレオチドとを欠失していた。この六十量体は図６Ａ／Ｂに示されるモチーフＩを示すアプタマーの一方の一部と正確に対応し、全長のアプタマーと同じ結合特性を示した。この六十量体の配列を配列番号１８に示す。この分子は以下の方法により分離された：二つの適当なプライマーを使用することにより、Ｔ７プロモーターが隣接するＲＮＡモチーフＩをコードしている６０ヌクレオチドを含むＤＮＡ（図５Ａ、＃II；配列番号１８）を、以下の条件の下でＰＣＲ（サムブルック等、1989）により増幅した：９４℃１分間、５２℃１分間および７２℃２分間で２５サイクル。増幅された８０ヌクレオチドのcＤＮＡ生成物をＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写反応（サムブルック等、1989）に付し、６０ヌクレオチドから成るＲＮＡアプタマー（モチーフＩ、図６Ａ、Ｂ）を導いた。このＲＮＡをゲル精製した後、ゲルシフト分析に使用した。この六十量体は、平衡結合定数の決定にも使用した。この目的のためには、５ 'γ−³²Ｐ−ＡＴＰ標識したおよびα−³²Ｐ−ＵＴＰ標識したＲＮＡアプタマーモチーフＩ（配列番号１８）４pMolを、０、４、２０、２８、４０、６０、８０、１０８pMolのＧＳＴ::rＰrＰ２３−２３１の存在下に、上記の検定条件の下で３７℃で６０分間インキュベートした。ＲＮＡ／蛋白複合体をゲルシフト分析（ワイス等、1992）により分析した。ゲルを５％ＴＣＡにより固定し、乾燥し、そして１２時間のオートラジオグラフィーに付した。シグナルの強度を燐の画像化（イメージクアント(商標)、ストローム８６０、モレキュラー・ダイナミクス）により測定した。平衡結合定数の算出のために、ＲＮＡおよび蛋白間の二分子反応を想定した。平衡状態のＲＮＡ／蛋白複合体の濃度［ｃ］は、シフトした位置での放射能の量およびＲＮＡの既知の比放射能から決定することができる。平衡結合定数（ＫＤ）の算出には以下の式が使用された(マイステレムスト等、1988；シェレンバーガー等、1989)：Ｒ_o＝Ｒ_eq＋[ＲＰ]_eq；Ｐ_eq＝Ｐ_o−[ＲＰ]_eq；Ｒ＝ＲＮＡアプタマーモチーフＩ（六十量体）Ｐ＝ＧＳＴ::rＰrＰ２３−２３１(ＧＳＴ::rＰrＰ^c)；ＲＮＡアプタマー(六十量体)およびＧＳＴ::rＰrＰ２３−２３１(ＧＳＴ::Ｐ rＰ^c)の複合体に対する以下の平衡結合定数(Ｋ_D)は、前もってＫ_D＝８ｘ１０^-7 Ｍと計算された。二分子結合反応に基づかない他のモデルを適用すると、Ｋ_D値は＜８ｘ１０^-7Ｍと予想される。実施例４ハムスターおよびウシＰrＰ／アプタマー結合部位のマッピングＲＮＡアプタマー１および２に対するシリアゴールデンハムスターＰrＰ^cの相互作用部位をマッピングするため、本発明者等は一連の組換えプリオンペプチド（ワイス等、1995；図７、Ａ、Ｂ）を使用した。ペプチドＰ_23-52のみがＲＮＡアプタマーＡp１および２と相互作用し(図７、Ａ、Ｂ)、この事は、両アプタマーによる認識のためには、シリアゴールデンハムスターのプリオン蛋白のアミノ末端残基aa２３ないしaa５２で十分であることを証明している。rＰrＰ２７−３０はアミノ末端の６７アミノ酸残基を欠くため、この分子に対するアプタマーの結合はできなかった。ＲＮＡアプタマーのモチーフIIに対するウシＰrＰ^cの相互作用部位をマッピングするため、ウシＰrＰ由来のプリオンペプチドＰ_25-92およびＰ_93-120（図７Ｃ、３列）を合成した。Ｐ_25-92のみ（図７Ｃ、２列）がＲＮＡアプタマーモチーフII（Ａp２）と結合したが、この事は、これがアプタマーにより認識される牛プリオン蛋白のアミノ末端である事を立証するものである。ハムスターのペプチドＰ_23-89（図７Ｃ、４列）もまたアプタマーＡp２と相互作用し、このハムスタープリオン蛋白のアミノ末端とアプタマーモチーフIIとの相互作用が確認された。引用文献 R．アイトケン、J．ギルクリストおよびM.C．シンクレア。大腸菌のマルトース結合蛋白に対する翻訳的融合の創出を促進するベクター。Gene、144(1994)、6 9-73。 P．アレン、S．ウォーランドおよびL．ゴールド：ランダムプールからのＨＩＶ−１インテグラーゼに対する高親和性ＲＮＡリガンドの分離。Virology、209( 1995)、327-336。 K．バスラー、B．オエシュ、M．スコット、D．ウェスタウェイ、M．ウェルクリ、D.F．グロス、M.P．マクキンレイ、S.B．プルシナーおよびC．ワイスマン：スクレイピーおよび細胞ＰrＰイソ型は同じ染色体の遺伝子によりコードされている。Cell、46(1986)、417-428。 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ファミュロック，ミヒャエルドイツ連邦共和国デー−81245ミュンヘン、シュメーデルシュトラーセ28番

Claims

【特許請求の範囲】１．伝達性海綿状脳症に関係するプリオン蛋白のイソ型ＰrＰ^cおよびＰrＰ^Sc を識別することのできる核酸分子の同定および分離のための方法であって、（ｉ）プリオン蛋白イソ型またはこのプリオン蛋白イソ型のペプチドフラグメントもしくは誘導体を、種々の配列を含む核酸分子のプールとインキュベートし；（ii）当該プリオン蛋白イソ型またはそのフラグメントもしくは誘導体と結合することのできる核酸分子を選択および分離し；（iii）所望により、その分離された核酸分子を増幅し、そして工程（ｉ）および（ii）を反復し；そして、（iv）分離された核酸分子の、プリオン蛋白のＰrＰ^cおよびＰrＰ^Scイソ型に対する結合特異性を決定する、という工程を含む方法。２．該核酸分子がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。３．核酸分子のプールがランダム化されたＲＮＡプールである、請求項１または２に記載の方法。４．核酸分子のプールがファミュロック（J.Am.Chem.Soc．116(1994)、1698-1 706）に記載のＲＮＡプールＭ１１１.１である、請求項３に記載の方法。５．核酸分子がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。６．ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである、請求項５に記載の方法。７．ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである、請求項５に記載の方法。８．核酸分子のプールがランダム化されたＤＮＡプールである、請求項５ないし７のいずれか１項に記載の方法。９．伝達性海綿状脳症が、スクレイピー、ウシ海綿状脳症(ＢＳＥ)、クロイツフェルト−ヤコブ病(ＣＪＤ)、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群(ＧＳＳ)、クールー、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）または伝達性ミンク脳症(ＴＭＥ)、ネコ海綿状脳症（ＦＳＥ）または慢性消耗病（ＣＷＤ）である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。１０．プリオン蛋白イソ型またはそのフラグメントもしくは誘導体が固定化されている、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。１１．プリオン蛋白イソ型またはそのフラグメントもしくは誘導体が溶液状態にある、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。１２．プリオン蛋白イソ型がイソ型ＰrＰ^Scまたはこのイソ型のフラグメントもしくは誘導体である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。１３．プリオン蛋白が誘導体ＰrＰ２７−３０またはそのフラグメントである、請求項１２に記載の方法。１４．プリオン蛋白イソ型がイソ型ＰrＰ^cまたはこのイソ型のフラグメントもしくは誘導体である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。１５．プリオン蛋白がプロセシングされた型ＰrＰ^c２３−２３１である、請求項１４に記載の方法。１６．プリオン蛋白が組換え蛋白である、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の方法。１７．プリオン蛋白が融合蛋白の一部である、請求項１６に記載の方法。１８．プリオン蛋白が、オリゴヒスチジン、カルモジュリン結合蛋白、Ｓ−ペプチド、ＦＬＡＧ、緑色蛍光蛋白、Ｂタグ、マルトース結合蛋白またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを伴う融合蛋白の一部である、請求項１７に記載の方法。１９．請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の方法により取得できる核酸分子。２０．請求項１０ないし１５のいずれか１項に定義されるプリオン蛋白のイソ型またはそのフラグメントもしくは誘導体に特異的に結合する、請求項１９に記載の核酸分子。２１．ＲＮＡ分子である、請求項１９または２０に記載の核酸分子。２２．ＤＮＡ分子である、請求項１９または２０に記載の核酸分子。２３．４および７ヌクレオチドの間の長さの領域により隔てられている３個の連続するグアノシン残基を４箇所含む、請求項１９ないし２２のいずれか１項に記載の核酸分子。２４．配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の核酸分子。２５．配列番号１ないし配列番号１３のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１９ないし２３のいずれか１項に記載の核酸分子。２６．配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１９ないし２２のいずれか１項に記載の核酸分子。２７．その安定性を増大させるために、そして／またはその生物物理学的および／または生化学的性質を改変するために１またはそれ以上の位置が修飾されている、請求項１９ないし２６のいずれか１項に記載の核酸分子。２８．請求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の核酸分子および所望により製薬上許容し得る担体を含む医薬組成物。２９．請求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む診断用組成物。３０．請求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の核酸分子の少なくとも一つをプローブとインキュベートし、そしてこの核酸分子と、プリオン蛋白のＰr Ｐ^cもしくはＰrＰ^Scイソ型またはこれらのイソ型のフラグメントもしくは誘導体との間の相互作用を測定する、伝達性海綿状脳症のインビトロ診断のための方法。３１．請求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の核酸分子のうち少なくとも一つを使用して、プリオン蛋白の少なくとも一つのイソ型またはそのフラグメントもしくは誘導体の、プローブ中の量を定量する、請求項３０に記載の方法。３２．細胞イソ型ＰrＰ^cまたはそのフラグメントもしくは誘導体に特異的に結合する核酸分子を、イソ型ＰrＰ^Scまたはそのフラグメントもしくは誘導体と特異的に結合する核酸分子と組み合わせて使用し、そしてプローブ中のイソ型Ｐr Ｐ^cおよびＰrＰ^Scの絶対的および／または相対的量を決定する、請求項３１に記載の方法。３３．プローブが臓器の組織由来である、請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載の方法。３４．臓器の組織が脳、扁桃、回腸、皮質、硬膜、プルキニエ細胞、リンパ節、神経細胞、脾臓、筋肉細胞、胎盤、膵臓、眼球、脊髄またはパイエル板由来である、請求項３２の方法。３５．プローブが体液由来である、請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載の方法。３６．体液が血液、脳脊髄液、乳または精液である、請求項３５に記載の方法。３７．請求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の核酸分子の三次元構造から誘導される情報に基づく、無機または有機化合物より成る群から選ばれる、核酸分子以外の化合物。３８．糖、アミノ酸、蛋白または炭水化物である、請求項３７に記載の化合物。