JP2004520080A - 凝塊蛋白に結合するための組成物および方法 - Google Patents
凝塊蛋白に結合するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Abstract
本明細書においてはアンプリボディ組成物および凝塊蛋白と相互作用を起こすために用いられる方法を開示する。本発明における組成物は凝塊蛋白の少なくとも１つに対して親和性を有するＤＮＡまたはＤＮＡ分子１つ以上を有する。核酸成分はヌクレオチド塩基２０個以上を有する天然または非天然の分子である。ＲＮＡについてはそのＲＮＡ分子のヌクレオチド配列部分少なくとも１つは凝塊ＲＮＡ結合蛋白中に存在するコンセンサス配列少なくとも１つに対して親和性を有する。凝塊蛋白に対して親和性を有するＲＮＡのヌクレオチド配列の部分は何れかのＲＮＡウイルスに由来する配列であり、そしてＲＮＡ凝塊蛋白は何れかのＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られる配列、またはこれらの組み合わせに由来する配列である。本明細書に開示する方法は本明細書に記載するアンプリボディ組成物を用いた試料マトリックスにおける凝塊蛋白１つ以上の存在を検出することに関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（関連出願）
本出願は２００１年５月３１日に出願された暫定出願６０／２９４，８２２２の利益を請求する。
【０００２】
本発明は蛋白と相互作用させるために用いる組成物および方法に関する。特に本発明は組織内の蛋白凝塊またはプラーク形成に関与すると推測される蛋白と相互作用させるために使用する組成物および方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
本質的に生細胞中に存在する核酸には２つの種類が存在する。１つはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、もう１つはリボ核酸（ＲＮＡ）である。正常な生理学的条件下では、これらの核酸分子の双方が蛋白と会合している。これらの蛋白にはスカフォールド蛋白、酵素、リガーゼ、テロメラーゼ等が包含される。このような核酸結合蛋白は正常な代謝および細胞／組織の生存性のために必要な機能を果たす。
【０００４】
ＲＮＡ結合蛋白（ＲＮＰ）の有意な部分が遺伝子発現の翻訳後の調節を媒介する。ヘテロ核酸ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）は蛋白コード遺伝子の一次転写物である。これらの転写物（ｈｎＲＮＡ）は真核生物の細胞の核内でプロセシングされ、このようなｈｎＲＮＡの少なくとも一部はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）となる。転写複合体からｈｎＲＮＡが出現した時点から、それらが核内にある時間を通じて、それらはｈｎＲＮＡ蛋白と称される蛋白と会合している。この蛋白ファミリーの構成員は、前ｍＲＮＡプロセシングおよびｍＲＮＡ局在化、翻訳および安定を含むｍＲＮＡの代謝の間の複数の段階に必要である。ＲＮＡと会合した蛋白の大部分はｈｎＲＮＡとｈｎＲＮＡ中のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡの複合体と会合していると考えられる。
【０００５】
しかしながら、幾つかの疾患の過程にはＲＮＡ媒介蛋白凝塊の形成が関与していると考えられる。このような凝塊は神経細胞死および脳の消耗病と関わりがあることが解かっている。特定の神経細胞死および脳消耗症候群に関与している場合が多い海綿状脳障害は切開により顕在化する蛋白プラークまたは凝塊を有するという特徴がある。海綿状脳障害においては、プリオンが病因物質であると考えられている。プリオン型の疾患は蛋白凝塊に関与する「感染性蛋白」によるものである。
【０００６】
これらの蛋白凝塊病は特定のＲＮＡ分子と関係があると考えられている。例えばウィルスＲＮＰおよびその付随するＲＮＡおよび蛋白の成分はウィルス病原性（例えばＨＩＶ、デングウィルス等）に関与する疾患過程の多くを特徴付ける。このことに鑑み、細菌およびウィルスのＲＮＰ複合体は興味深い診断標的であると考えられる。
【０００７】
病原性の凝塊過程に関与する蛋白の検出において用いることができる組成物および方法が現在必要とされている。
【０００８】
【発明が解決する課題】
本発明は蛋白と相互作用させるために用いる組成物および方法に関する。特に本発明は組織、特に脳組織内の蛋白凝塊またはプラーク形成に関与すると推測される蛋白と相互作用させるために用いる組成物および方法に関する。
【０００９】
【課題を解決する手段】
本発明の組成物は凝塊蛋白少なくとも１つに対して親和性を有する１つ以上の核酸分子、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含んでいる。ＲＮＡまたはＤＮＡ成分はヌクレオチド塩基２０個以上を有する天然または非天然の分子である。（「非天然」という用語は、自然にはあり得ない純度または工程において組成物が使用されることを指すべく意味するものとする。）この核酸分子のヌクレオチド配列の部分の少なくとも１つは凝塊核酸結合蛋白中に存在するコンセンサス配列少なくとも１つに対して親和性を有する。１つの実施態様においては、凝塊蛋白に対する親和性を有するＲＮＡの部分はＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られる配列、またはこれらの組み合わせに由来する配列である。
【００１０】
本発明のコンセンサス配列はヘアピンループ、バルジ（ｂｕｌｇｅ）ループ、内部ループ、または一重鎖領域のような一重鎖ＲＮＡの二次構造要素を認識する蛋白中に存在するＲＮＡ結合モチーフを指す。大部分のＲＮＡ結合蛋白（ＲＮＰ）はＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）１つ以上および他の蛋白との相互作用を媒介する別のドメインを有するモジュラー構造を有する。ＲＮＰモチーフの特質はアミノ酸約百〜数百個よりなるＲＢＤから約３０アミノ酸の位置にあるコンセンサス配列である。ＲＮＡ結合に関与するアミノ酸の大部分はβ−プリーツシート内に位置する。ＲＢＤのこのような構造要素はＲＮＡの結合相手となる露出したプラットホームを与えると考えられる。ＲＮＡは、結合時には（折り込み部やポケット部に埋没するのではなく）曝露された状態で残存し、他の細胞因子に接触可能となる。多くのＲＮＰが複数のＲＢＤを含んでおり、このため、１つより多いＲＮＡ分子に同時に結合できるのである。
【００１１】
本明細書においては、「親和性」という用語は誘引性または結合能力を示すという意味を有する。特異的親和性は分子の特定の性質または配列を指向した誘引性である。
【００１２】
本発明の方法は、試料マトリックス内の凝塊蛋白１つ以上の存在を検出することを意図している。親和性複合体はプローブ１つ以上に試料マトリックスを接触させることにより形成される。本実施態様のプローブは本発明の核酸組成物である。
【００１３】
本発明の方法のプローブは凝塊蛋白の少なくとも１つに対する親和性を有する核酸分子を１つ以上含む。ＲＮＡまたはＤＮＡ成分はヌクレオチド塩基２０個以上を有する天然または非天然の分子である。この核酸分子のヌクレオチド配列部分の少なくとも１つは凝塊核酸結合蛋白中に存在するコンセンサス配列少なくとも１つに対して親和性を有する。１つの実施態様によれば、凝塊蛋白に対して親和性を有するＲＮＡの部分はＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡＲ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られる配列、またはこれらの組み合わせに由来する。
【００１４】
本発明の方法は形成された何れかの親和性複合体の検出を含む。親和性複合体の検出はもとの試料マトリックス中に存在する凝塊蛋白１つ以上の存在を示す。
【００１５】
試料マトリックス内の凝塊蛋白の１つ以上の存在または非存在を調べるためのキットも本明細書に開示する。キットはプローブ１つ以上を含む。これらのプローブはヌクレオチド２０個以上を有する天然または非天然のＲＮＡおよび／またはＤＮＡを含み、ここでヌクレオチドの配列部分の少なくとも１つは凝塊蛋白の１つ以上に対する親和性を有する。１つの実施態様において、プローブの親和性配列部分はＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られるヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはこれらの組み合わせに由来する。本発明のキットは本発明の方法と組み合わせて使用することを意図している。
【００１６】
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は凝塊蛋白に対する親和性を有する増幅可能な核酸抗体に関する。本発明はまた本発明の組成物を用いてこのような蛋白と相互作用させるために用いる方法に関する。更にまた試料マトリックス中の凝塊蛋白の存在または非存在を検出するためのキットに関する。
【００１７】
蛋白は核酸、即ちＤＮＡまたはＲＮＡの何れかに結合する。この結合は核酸により推測される二次構造により促進される場合が多い。例えば、ヌクレオチドのループおよびバルジは蛋白結合に関与する場合が多い。蛋白凝塊はこのような核酸結合により促進することができる。凝塊蛋白に対する親和性を有する核酸の単離および定性は蛋白凝塊に関与する疾患を解明し、治療する際の助けとなる。本発明はこのことを目的としている。
【００１８】
ＲＮＡに結合する蛋白（以降、本明細書においてはＲＮＰと称する）は典型的にはＲＮＡ結合モチーフを有する。適切な条件下、ＲＮＰは特定のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列とは無関係に蛋白により認識される全体的な特徴を有する核酸に非特異的に結合する。核酸のこれ以上の高次構造は蛋白に結合認識を与えると一般的に考えられている。例えば、ＲＮＡはＲＮＰと結合するために用いる構造モチーフとして機能する二次構造様ループをプロセシングすることが解かっている。この考え方は、単に特定の蛋白に結合するＲＮＡ分子の一次ヌクレオチド配列を求め、ループのような特定の二次構造のヌクレオチド配列を変化させる事によりその構造をノックアウトし、突然変異したＲＮＡと蛋白との間の結合能力を測定することによる分析法と矛盾していない。
【００１９】
ストリンジェントなｉｎ ｖｉｔｒｏの試験によればヘテロ核ＲＮＡ結合蛋白（ｈｎＲＮＰ）は特定のＲＮＡ配列に対して様々な好適度を有することがわかっている。１つの試験では２Ｍ ＮａＣｌ条件下種々のＲＮＡへの種々のｈｎＲＮＡの結合を調べたところ、ｈｎＲＮＰはそれらが好適とするＲＮＡに対して照準設定（ｓｔｒｉｋｉｎｇ）能力を有することが判明した。これらの試験によれば、種々のｈｎＲＮＰおよび見かけ上は別のＲＮＰは種々のＲＮＡを識別できることが解かった。この識別特性は種々のグループのＲＮＰの単離、精製および分類において利用されている。
【００２０】
ＲＮＰの分子構造様式はｈｎＲＮＰを用いて詳細に研究されている。しかしながら、ｈｎＲＮＰ系を調べることにより得られる一般的な原理は他のＲＮＰにも適用される。大部分のＲＮＰはＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）１つ以上および他の蛋白との相互作用を媒介する特殊なドメインを有するモジュラー構造を有する。ＲＮＰにおけるＲＢＤの特質は約３０個のアミノ酸の列により相互に分断されている個々のコンセンサス配列である。ＲＮＡの結合に関与するアミノ酸の大部分はβプリーツシート中に位置している。ＲＢＤのこのような特定の構造を有する要素はＲＮＡ分子が結合できるプラットフォームとして機能することのできる露出した表面を与えると考えられる。ＲＮＡは結合時には（蛋白のポケット部に埋没するのではなく）曝露された状態で残存し、他の蛋白に接触可能となる。多くのＲＮＰが１つより多いＲＢＤを含んでおり、このため、同時に複数のＲＮＡ配列に結合したり、複数のＲＮＡ分子に対して相互作用を示すことができる。
【００２１】
ＲＮＡおよびＲＮＰとの間の相互作用は、それらの相互の親和性および特異性の点において、抗体とその対応する認識抗原との間の相互作用と類似していると考えられる。本発明はこの類似系に基づいている。本発明のＲＮＡ組成物はその親和性が凝塊蛋白１つ以上に対するものである抗体のように機能する。これらの抗体様ＲＮＡ組成物は本明細書においては「アンプリボディー」と称する。アンプリボディーは本質的には核酸抗体である。「アンプリボディー」という用語は同じ機能を有するＤＮＡ分子も指すものとする。これらのアンプリボディーは分子生物学で開発された方法により増幅可能である。これらの核酸抗体またはアンプリボディーは如何なる数の標的も指向することができる。例えば、アンプリボディーは海綿状脳障害のような神経学的疾患に関与するプリオン蛋白を指向することができる。アンプリボディーは当該分野でよく知られた方法により当業者が挿入することのできる人工、合成のヌクレオチド配列を含むことができる。
【００２２】
上記した通り、アンプリボディーはＲＮＡ依存性ＲＡＮポリメラーゼを用いて増幅することができる。本発明の１つの実施態様においては、ポリメラーゼはＱ−Ａｍｐである。Ｑ−ＡｍｐはＱ−ベータレプリカーゼ由来である。Ｑ−ベータレプリカーゼはＱ−ベータバクテリオファージから単離精製することができる。バクテリオファージはプラス鎖ＲＮＡを含む。このプラス鎖はウィルス蛋白合成のためのｍＲＮＡとして、および、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｑ−ベータレプリカーゼのための鋳型としての双方の機能を有する。プラス鎖および他のコファクターの存在下、酵素Ｑ−ベータレプリカーゼは相補的なマイナス鎖ＲＮＡを合成する。次にマイナス鎖はプラス鎖合成のための鋳型として機能する。Ｑ−ＡｍｐはＱ−ベータレプリカーゼ由来であり、真核生物伸長因子Ｔｓ（Ｅｆ−Ｔｓ）、真核生物伸長因子Ｔｕ（Ｅｆ−Ｔｕ）、Ｓ１ヌクレアーゼおよびレプリカーゼ成分を含む。（Ｑ−ＡｍｐはＱ−ＲＮＡ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋより入手可能である。）Ｑ−Ａｍｐは特異的なＲＮＡ鋳型を認識し、そして等温条件下１５分でそれらを指数的に、例えば１０億倍にまで増幅することができる。Ｑ−Ａｍｐのための鋳型は特異的な機能用途を有する配列インサート、例えばアンプリボディーと凝塊蛋白との間の結合性を増大させる配列を含むことができる。当業者の知るとおり、Ｑ−ＡｍｐおよびＱ−ベータレプリカーゼ以外のレプリカーゼも使用して良く、本発明の範囲に包含されるものとする。
【００２３】
本発明のアンプリボディー組成物は凝塊蛋白の少なくとも１つに対して親和性を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子１つ以上を含む。核酸組成物はヌクレオチド塩基２０個以上を有する天然または非天然の分子である。１つの実施態様において、コのＲＮＡ分子のヌクレオチド配列部分の少なくとも１つは凝塊ＲＮＡ結合蛋白中に存在するコンセンサス配列少なくとも１つに対して親和性を有する。本発明において「コンセンサス配列」とはヘアピンループ、バルジループ、内部ループ、または一重鎖領域のような一重鎖ＲＮＡの二次構造要素を認識する蛋白中に存在するＲＮＡ結合モチーフを指す。本発明の１つの実施態様において、凝塊蛋白に対して親和性を有するＲＮＡポリヌクレオチドの部分は、ＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られる配列、またはこれらの組み合わせに由来する配列である。
【００２４】
「ウィルス」および「ファージ」という用語は本開示全体を通じて互換に使用され、「ウィルスおよびファージ」の意味を有するものとする。本発明１つの特徴において、ＲＮＡウィルスはレトロウィルスである。ＲＮＡウィルスはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ポリオウィルス、インフルエンザウィルス、スモールポックスウィルス、水痘（ｃｈｉｃｋｉｎ ｐｏｘ）ウィルス、ヘルペスウィルス、水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ）ウィルス、エプスタイン・バーウィルス、サイトメガロウィルス、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される。
【００２５】
本発明のＲＮＡ鋳型はＱ−ベータレプリカーゼ、Ｑ−ＡｍｐおよびＤＮＡまたはＲＮＡの核酸レプリカーゼにより受け取られ増幅されることのできるＲＮＡである。当業者の知るとおり、本発明のアンプリボディーを増幅するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＮＡｐｏｌ）は本発明の範囲に包含される。本発明の１つの実施態様において、ＲＮＡ鋳型はミディ（ｍｉｄｉ）変異ＲＮＡ（ＭＤＶ ＲＮＡ）、ミニ（ｍｉｎｉ）変異ＲＮＡ（ＭＮＶ ＲＮＡ）、ＭＮＶ−ＡＰ１ ＲＮＡ、ＭＮＶＵＰ ＲＮＡ、ＭＮＶＬＯ ＲＡＮ、ＲＱ ＲＮＡおよびこれらの組み合わせよりなる群から選択される。
【００２６】
ＭＤＶ ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）は下記の通りである。
【００２７】
ＭＮＶ ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）は下記の通りである。
【００２８】
ＭＮＶ ＡＰ１ ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号３）は下記の通りである。
【００２９】
ＭＮＶＵＰ ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）は下記の通りである。
【００３０】
ＭＮＶＬＯ ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号５）は下記の通りである。
【００３１】
ＲＮＡ配列はＲＮＡ配列についてコードしているＤＮＡを用いて得ることができる。ＤＮＡを適切なベクター内に入れ、当業者の知る方法を用いてベクターを適切な宿主にトランスフェクトすることができる。その後転写物を当業者の知る方法で単離することができる。
【００３２】
本発明の１つの特徴において、ＲＮＡｐｏｌ（レプリカーゼ）のためのこのような鋳型は凝塊蛋白に対する親和性を有するオリヌケレオチド配列少なくとも１つを有する。例えば、ＭＤＶ、ＭＮＶおよびＲＱ ＲＮＡ鋳型は一連のグアニンヌクレオチドをその対応する配列内に組み込んでおくことができる。ＲＱ１１＋１２がこのような鋳型である。ＲＱ１１＋１２に対するＲＮＡ配列（配列番号６）は以下の通りである。
【００３３】
本発明のＲＮＡは好ましくは、非ワトソンクリック対を特徴とするループまたはバルジ１つ以上を有する（図１〜６参照）。非ワトソンクリック対とはヌクレオチドが対になっていないか、または対が従来型のワトソンクリック塩基対ではない領域が存在するという以外は正常なワトソンクリック型塩基対である領域を指す。例えば、ヌクレオチドは同じヌクレオチド（例えばプリン−プリンまたはピリミジン−ピリミジン）とともに近接して保持される。好ましいバルジまたはループは一連、例えば４個連続のグアニンヌクレオチドの群を有する。このグアニンの様相はＲＮＡｐｏｌ内の認識配列に相当する場合が多い。例えばＲＱ１１＋１２は一連のグアニンヌクレオチドを与えるＲｅｖ蛋白結合部位およびサルシン認識部位に由来する配列を含む。Ｉｗａｉ，Ｓ．等、ＮＡＲ２０（２４）：６４６５−６４７２，１９９２が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
関与するポリヌクレオチド配列については絶対長の条件がある。しかしながら、好ましい範囲は約２０〜約１０，０００ヌクレオチドである。本発明のＲＮＡアンプリボディーを使用するための適切な長さのヌクレオチド配列は当業者が決定することができる。本発明のポリヌクレオチド配列はより長い鎖の核酸の内部に包埋されるか、または他の分子と会合していることができる。
【００３５】
個々の塩基対の相補的塩基対形成は一般的にアデニンがウラシル（またはＤＮＡの場合はチミン）と対になり、そして、グアニンがシトシンと対になるというＣｈａｒｇａｆｆの法則に従う。しかしながら、非従来型の塩基対形成を説明する修飾された塩基が存在する。修飾された核酸とは、本明細書においては化学的に修飾されたヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子を意味するものとする。「核酸類縁体」とは本明細書においては、従来の核酸との塩基対形成相互作用に関与できる「ＰＮＡ」またはモルホリノのような非核酸分子を意味するものとする。このような修飾された塩基および核酸類縁体は本発明の範囲内に包含されるものとする。例えば、デアザグアニンおよびウラシル塩基を含むヌクレオチドはそれぞれグアニンおよびチミンの代わりに使用することができ、これによりプローブの熱安定性を低減することができる。同様に５−メチル−シトシンはより高い熱安定性が望まれる場合に複合体中でシトシンの代替となることができる。糖部分の修飾も可能であり、本発明の範囲に包含される。例えばＲＮＡ分子のヌクレアーゼ感受性を低減するために用いることができる２’−Ｏ−メチル基の付加によるリボース糖部分の修飾が挙げられる。核酸骨格の種々の部分を用いて行なわれる修飾もまた本発明の範囲内に包含される。例えば、メチルホスフェート、メチルホスホネートまたはホスホロチオエート結合を用いてホスホジエステル骨格から負電荷を除去することが可能である。
【００３６】
本発明者等は同じ凝塊蛋白上の複数の結合部位を示す実験を実施した。これらの部位は種々のＲＮＡポリヌクレオチド組成物に対する親和性を有することがわかっている。試験した凝塊蛋白はプリオン蛋白（ＰｒＰ）であり、Ｗｅｉｓｓ， Ｓ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９７，Ｎｏｖ：７１（１１）：８７９０−７が参照でき、その内容全体が参考により本明細書に組み込まれる。２つのＲＮＡポリヌクレオチドを試験したが、その１つはＭＮＶ ＲＮＡであり、もう１つはＡＰ１ ＲＮＡ配列をその内部にクローニングされたＭＮＶ ＲＮＡである（Ｗｅｉｓｓ等参照）。クローニングされたＭＮＶ ＲＮＡはＰｒＰアンプリボディー（ＰｒＰ−Ａｍｐ）と称する。
【００３７】
ＰｒＰ−Ａｍｐを増幅する能力をＱ−Ａｍｐを用いて調べた。増幅に適する条件下、ＭＮＶとＰｒＰ−Ａｍｐを個々にＱ−Ａｍｐに付した。図７はＭＮＶに添ってＰｒＰ−ＡｍｐをＱ−Ａｍｐレプリカーゼにより増幅できることを示すデータを示している。Ｑ−Ａｍｐ増幅のための適切なプロトコルの例は２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭジチオスレイトール、２００ μＭ ｒＮＴＰおよび２００ｎＭレプリカーゼを含有する８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５である。２０μＬの反応溶液中、ＲＮＡを添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。ある状況下では、１μＬ［α−Ｐ３２］ＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加することにより初期のＲＮＡを標識する。或いは増幅産物の検出はこれらをポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、例えばＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲより入手）を用いてゲル中の核酸を染色することにより行なう。
【００３８】
次にＰｒＰ−Ａｍｐの結合特異性を調べ、ＭＮＶと比較する。図８ａは結合データを示す。この図を十分理解するために、この実験において２つの膜を用いた理由に留意しなければならない。Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９７，Ｎｏｖ：７１（１１）：８７９０−８７９７が参照でき、その内容全体が参考により本明細書に組み込まれる。蛋白および結合ＲＮＡはＰＶＤＦ膜に結合させる。結合したＲＮＡは蛋白に結合するＲＮＡである。遊離または未結合のＲＮＡはＰＶＤＦ膜を通過し、ナイロン膜に結合する。従って、ＲＮＡが標識され、蛋白と結合しない場合、これはＰＶＤＦ膜を通過し、遊離の標識ＲＮＡが結合しているナイロン膜からシグナルが発せられる。逆に、標識されたＲＮＡが蛋白と結合すれば、シグナルはＰＶＦＤ膜から発せられる。ＰｒＰ−Ａｍｐに関しては、２つのシグナルがＰＶＤＦ膜上に観察され、このアンプリボディーがプリオン蛋白に結合することがわかり、さらにｔＲＮＡの存在がこの結合に影響しないこともわかる。ＰｒＰ−Ａｍｐと異なり、プリオン蛋白へのＭＮＶの結合はｔＲＮＡの存在に影響される。ｔＲＮＡの存在下、標識されたＭＮＶ ＲＮＡはＰＶＤＦ膜を通過し、ナイロン膜に至るので、ｔＲＮＡ存在下でプリオン蛋白への結合がないことが示される。図８ｂは図８ａに示したものと同じデータであるが、ただし図８ｂではグラフにより示した。表１に示した結合解離定数（ｋｄ）は（ａ）プリオン蛋白へのＰｒＰ−Ａｍｐの結合はｔＲＮＡの存在とは無関係であるが、ＭＮＶの結合はｔＲＮＡの存在下で劇的に減少したこと、および（ｂ）ＰｒＰ−Ａｍｐはプリオン蛋白に対して高い親和性を有することを定量的に示している。
表１
【００３９】
この表によれば明らかに、ＰｒＰ−Ａｍｐの結合は極めて安定であるのに対しＭＮＶの結合安定性はｔＲＮＡの存在または非存在に依存している。
【００４０】
上記の結合データはプリオン蛋白上の結合部位は少なくとも２つ存在することを示唆している。図９によれば、先ずｔＲＮＡ非存在下でＭＮＶが結合する低親和性部位が存在する。また、ＰｒＰ−Ａｍｐが結合する高親和性部位が存在する。
【００４１】
この複数の結合の理論について更に、競合試験により検討した。プリオン蛋白に対するＰｒＰ−Ａｍｐの結合をＡＰ１またはＭＮＶの何れかを用いて妨害した。図１０によれば、ＡＰ１は効果的にＰｒＰ−Ａｍｐ結合を抑制したが、ＭＮＶはＰｒＰ−Ａｍｐの結合に対しては僅かな作用を有するか、全く作用を有さなかった。即ちプリオン蛋白上には少なくとも二種のＲＮＡ結合部位があるはずである。
【００４２】
結合部位間の相違を明らかにするための道具としてｔＲＮＡを用いながら、他のＲＮＡがｔＲＮＡの存在下にプリオン蛋白に対して結合親和性を有するかどうか調べた。観察結果を表２にまとめた。
表２
【００４３】
ＲＱ１１＋１２に対する好ましいＫｄ値に基づいて、次に存在下または非存在下のプリオン蛋白に対する結合を調べた。表３はそのデータを示す。表３に示されたデータによれば、ｔＲＮＡ非存在下におけるプリオン蛋白へのＲＱ１１＋１２の結合はｔＲＮＡ存在下の結合と比較して約４倍堅固であることがわかる。
表３
【００４４】
ＲＱ１１＋１２の結合を更に調べるために、ＡＲ１ ＲＮＡを用いてＲＱ１１＋１２のプリオン蛋白への結合に競合させた。図１１はＡｐ１が効果的にＲＱ１１＋１２の結合を抑制することを示している。このデータはまたＲＱ１１＋１２がプリオン蛋白の高い親和性部位に結合していることを示している。
【００４５】
即ち更に呈示したデータによれば、高親和性部位への結合には特異的ＲＮＡ構造要素の存在が必要であることが示唆される。高親和性部位への安定な結合（ｔＲＮＡ存在下）のためのＲＮＡの構造要素を調べるために、発明者等はプリオン蛋白への他のＲＮＡの結合を調べた。ＭＮＶ由来のＲＮＡをこの実験のために選択した。ＭＮＶ誘導体は２０ヌクレオチドのランダムインサートを含んでいた。表４は実験で得られたデータを示している。データによれば、同じ長さであるが二次構造が異なるＲＮＡの間で高親和性部位への結合に大きな多様性があることが解かる。恐らくは、単一の幹部の構造における多様性が高親和性部位への結合の相違を説明できると思われる。従って、高親和性部位への堅固な結合を発生させている特異的ＲＮＡ構造要素が存在すると考えられる。
表４
【００４６】
本発明の方法は試料マトリックス内の凝塊蛋白の１つ以上の存在または非存在を検出することを目的としている。親和性複合体は本発明のプローブ１つ以上に試料マトリックスを接触させることにより形成する。「接触」という用語は本明細書においては混合物を形成することと矛盾しない方法において２種以上の物質を共存させることを意味するものとする。本実施態様のプローブは本発明のアンプリボディーを含む。
【００４７】
本明細書においては、「試料マトリックス」とは蛋白を含有するいかなる試料も包含する。例えば、血液、尿、他の体液、細胞、細胞抽出液、組織および組織抽出液（特に神経学的組織）が本発明の範囲に包含される。
【００４８】
本発明のアンプリボディープローブは凝塊蛋白の少なくとも１つに対して親和性を有する核酸アンプリボディー分子１つ以上を含む。１つの実施態様においてはＲＮＡポリヌクレオチド成分はリボヌクレオチド塩基２０個以上を有する天然または非天然の分子である。このＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも１つは凝塊ＲＮＡ結合蛋白の存在下コンセンサス配列の少なくとも１つに対して親和性を有する。本実施態様においては、凝塊蛋白に対する親和性を有するＲＮＡの部分はＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡＲ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られる配列、またはこれらの組み合わせに由来する配列である。
【００４９】
アンプリボディーの調製はアンプリボディーの均質な回収である。この均質な調製はモノクローナル抗体の調製と同様である。或いは、アンプリボディーの調製は抗体のポリクローナル調製と同様に異種であることができる。
【００５０】
本発明の方法はまたアンプリボディーの異種回収を用いることを包含する。この回収とは同じかまたは異なる凝塊蛋白上の種々の結合部位に対する親和性を有する種々のアンプリボディーを指す。アンプリボディーの異種回収物は試料マトリックスに導入される。親和性複合体は単一の凝塊蛋白と凝塊蛋白に添った種々の部位において結合した種々のアンプリボディーとの間に形成することができる。更にまた、親和性複合体は１つの試料マトリックス内に存在する種々のアンプリボディーと種々の凝塊蛋白との間に形成することもできる。
【００５１】
本発明の方法は形成された如何なる親和性複合体の検出も包含する。親和性複合体の検出はもとの試料マトリックス中に存在する凝塊蛋白の１つ以上の存在を示すものである。親和性複合体の検出は質量または密度の測定、質量スペクトル分析、プラズモン共鳴、光学的発光または吸光、蛍光、りん光、ルミネセンス、化学ルミネセンス、ポーラリゼーション、屈折率の変化、電気伝導度、放射能、粘度、濁度および旋光度よりなる群から選択される方法により行なわれる。
【００５２】
アンプリボディープローブの１つ以上を標識することができる。標識はイオン結合、共有結合または吸着を介して結合させることができる。好ましくは、標識は目的の配列を含むが凝塊蛋白への結合を妨害しないアンプリボディーポリヌクレオチドの何れかの領域に対して共有結合させる。標識としては、例えば、放射性同位体、例えば放射性リン原子、親和性試薬、例えばビオチン、インターカレーション蛍光染料またはアンプリボディーに結合した蛍光部分、りん光染料またはキレート、質量スペクトル分析で検出するための電子団（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ）、化学ルミネセンス発色団が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５３】
Ｐｈｏｔｏｄｙｏｄ Ａｒｒａｙ（ＰＤＡ）検出器を用いながら、如何なる標識自体も用いずにスペクトル分析を行うことができる。親和性複合体（並びにアンプリボディー）はＰＤＡ検出器を用いてその独特のスペクトル像によりモニタリングし、検出することができる。複合アンプリボディー（凝塊蛋白との複合体）からの遊離のアンプリボディーの分離は、当業者の知る方法を用いて、例えばサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー、濾過、電気泳動等を用いて行なうことができる。
【００５４】
本発明はまた固定化されたアンプリボディープローブの１つ以上を用いた試料マトリックス内の凝塊蛋白の１つ以上の検出方法に関する。本実施態様においては、ＲＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つを固相表面に固定化する。固定化されたポリヌクレオチドはアンプリボディーであることができるが、また、アンプリボディーである第２のＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズすることもできる。この方法はまた、異なる凝塊蛋白に対する親和性を有する各アンプリボディー、または、同じ凝塊蛋白上の異なる部位に対する親和性を有する各アンプリボディーまたはこれらの組み合わせであるアンプリボディーの異種回収も意図している。
【００５５】
本実施態様の１つの特徴において、第２のポリヌクレオチド（アンプリボディー）に対して適切な条件下でハイブリダイズするために十分な配列を有する第１のポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡの何れであることもできる）を表面に固定化する。米国出願０８／９７１，８４５；０６／０１６，７０８；および０８／８１２，１０５が参照でき、その内容は全て参考により本明細書に組み込まれる。固定化に用いる第１のポリヌクレオチドの部分は第２のポリヌクレオチド（またはアンプリボディー）にハイブリダイズさせるために用いる配列の領域とは異なる。本発明のこの特徴において方法は順次、または単一の段階として行なうことができる。第１に試料マトリックスをアンプリボディと凝塊蛋白の相互作用により親和性複合体が形成されるのに適する条件下、適切なアンプリボディー混合物、即ちアンプリボディーの同種または異種の混合物の何れかと試料マトリックスを混合する。この段階の後、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションに適する条件下、表面に固定化された第１のポリヌクレオチドと親和性複合体と推定されるものを混合することができる。第２に、第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第１のポリヌクレオチドから形成されたハイブリダイゼーション複合体と試料マトリックスを混合するが、その際第１のポリヌクレオチドは表面に固定化されている。このような条件下、親和性複合体の形成は固定化されたアンプリボディーと共に起こる。好ましくは、如何なる遊離の親和性複合体も、固定化された第１のポリヌクレオチドとの第２のポリヌクレオチド（アンプリボディー）凝塊複合体のハイブリダイゼーションにより、最終的には固定化される。
【００５６】
本実施態様の別の特徴において、固定化されたアンプリボディーは凝塊蛋白との相互作用のためのアンプリボディーの能力に影響しないポリヌクレオチドの領域を用いて表面に固定化される。凝塊蛋白は固定化されたアンプリボディーと親和性複合体を直接形成する。
【００５７】
表面支持体のような固相表面への核酸の結合手段は単なる吸着であることができる。好ましくは、結合は核酸と支持体表面に会合している何らかの化学的部分、例えばアミンまたはカルボキシル基またはアクリルアミドとの間の共有結合を介して行なわれる。化学的な交差結合を用いて核酸を表面に固定化することができる。このような化学的交差結合剤の例はカルボジイミド（例えば１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）であり、これは核酸の５’末端上のホスフェート基を支持体表面上のアミン基と結合するために用いることができる。更にまた、イオン相互作用もまた核酸のこのような固定化を促進することができる。結合は核酸と表面との間に直接、または、核酸と表面との間に中間分子を置くなど間接的に行なうことができる。中間分子は特に厳密な長さを有する必要はない。
【００５８】
親和性試薬はまた表面への核酸の固定化のために用いることもできる。例えば同属の部分を含む表面にアビジンまたはビオチン部分を運ぶ核酸はその表面に核酸を結合させる。親和性に基づいた固定化法を用いる別の例は親和性リガンド、例えばビオチンまたはアビジンに目的の核酸を同時広範囲に連結させることである。例えばビオチンがリガンドである場合はアビジンが同属受容体となる、リガンドに対する同属受容体は磁気粒子をそれに結合させて保有する。磁場が表面に適用されると、磁気粒子はそれに結合しているものと共に表面に固定化されるのである。
【００５９】
支持体マトリックスは、ビーズまたは粒子、棒、繊維、容器、薄層プレート、膜、ゲル様ポリアクリルアミド、澱粉、アガロース、セルロースまたは他の重合体ゲルの形態のクロマトグラフィー支持体であることができる。
【００６０】
試料マトリックス内の凝塊蛋白の１つ以上の存在または非存在を測定するためのキットも本明細書に開示する。キットはアンプリボディープローブの１つ以上を含む。これらのプローブはヌクレオチド２０個以上を有する非天然のＲＮＡを含み、個々でヌクレオチドの配列部分の少なくとも１つは凝塊蛋白に対する親和性を有する。１つの実施態様において、アンプリボディーの親和性配列部分はＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られるヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡＲ、またはこれらの組み合わせに由来する。実際は本キットは本発明の方法を用いる。
【００６１】
１つの実施態様において、キットは、各々が凝塊蛋白上の異なる部位に結合するアンプリボディーの少なくとも２つを有している。本実施態様におけるアンプリボディーの少なくとも１つは従来の方法により検出することのできる標識を有している。特定の特徴において、キットのアンプリボディーの１つは固相に固定化されている。この特定の特徴における別のアンプリボディーは凝塊蛋白に対する親和性を有することができ、固定化されたアンプリボディーにハイブリダイズする能力を有する。本発明のこの特定の特徴において、好ましくは遊離のアンプリボディーを標識する。
【００６２】
キットは更に、アンプリボディーの１つ以上および凝塊蛋白の少なくとも１つを含む親和性複合体を、遊離のアンプリボディーから分離するための手段を有する。分離手段にはサイズベースの膜、濾過ユニットなどが包含されるがこれらに限定されない。
【００６３】
伝染性海綿状脳障害（ＴＳＥ）は中枢神経系（ＣＮＳ）に罹患する神経変性性の感染性疾患である。ＴＳＥにはヒツジスクラピー、ウシにおけるウシ海綿状脳障害（ＢＳＥ）およびクロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、Ｇｕｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群（ＧＳＳ），ヒトにおけるクールー病および致命的家族性不眠症（ＦＦＩ）が包含される（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，１９８２）。全てのこれらの致命的疾患に共通なものは、インキュベーション期間が長くアミロイド様の棒状物およびスクラピー関連のフィブリル（ＳＡＦ）の蓄積である。ＳＡＦの形成は感染性を伴う内因性で無害のＰｒＰＣのイソフォームであるＰｒＰＳＣの広範なフィブリル化の結果である。可溶性ＰｒＰＣから不溶性のＰｒＰＳｃイソフォールへの構造的変換が臨床的プリオン疾患の発症と進行を決定する。
【００６４】
ＰｒＰＣをコードする遺伝子は高度に保存されており、３５ｋＤＡの糖蛋白としてｐｒｎＰ座に構成的に発現される（Ｃｈｅｓｅｂｒｏ等、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３１−３３；Ｏｅｓｃｈ等、１９８５，Ｃｅｌｌ．４０：７３５−４６が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。翻訳されたＰｒＰＣの約半分は細胞外膜にプロセシングされ、ここでＣ末端グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーにより原形質幕に係留される。しかしながら、ＰｒＰＣはまた２つの膜貫通型としても存在しており、その１つはＥＲ管腔の内部のＮ末端（ＰｒＰＮｔｍ；４０〜５０％）に、そしてもう１つはＥＲ管腔の内部のＣ末端（ＰｒＰＣｔｍ；１０％）に逆方向で存在する。これらのプロセシングの差がこれらのＰｒＰＣ型の機能的特性を反映しているかどうかは不明である。
【００６５】
ＰｒＰ蛋白は興味深い構造的特徴、特にその生来の野生型立体配座のＰｒＰＣから感染性のＰｒＰＳＣへの通常でない変換を有している。蛋白の構造における変化は感染性を伴うイソフォームのＣ末端ドメインのベータシートに富む領域へαへリックスリッチのＰｒＰＣからの遷移により特徴付けられる（Ｐａｎ等、１９９３， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ９０：１０９６２−６６が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。幾つかの生化学的特色、例えば生理学的溶液中のＰｒＰＳｃの不溶性およびプロテイナーゼＫによる消化に対するそのＣ末端ドメイン（アミノ酸９０〜２３１）の耐性がイソフォームを特徴付けている。ＰｒＰの非プロテアーゼ処理完全長Ｎ末端の構造は極めて可撓性に富み、ＮＭＲ構造解析によれば単一の安定な構造は有していない。従って、ＰｒＰのこの領域は細胞およびスクラピーイソフォームの間で最も識別困難である。
【００６６】
核酸へのＰｒＰの結合は精製された蛋白を用いた直接のｉｎ ｖｉｔｒｏの複合体形成の観察を通じて、感染組織から分離したスクラピー関連フィブリル（ＳＡＦ）由来の核酸の同時精製により多数が明らかにされている（Ｍｅｒｚ等、１９８１，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）５４（１）：６３−７４が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。例えばＩＡＰのウィルスＲＮＡゲノムの数千塩基を感染組織からＳＡＦと共に同時精製している（Ｍｕｒｄｏｃｈ等、１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４（４）：１４７７−８６；Ａｋｏｗｉｔｚ等、１９９４，ＮＡＲ ２２（６）：１１０１−０７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。このような観察は、このような遺伝子的な関連性は現在まで実験的に明らかにされていないものの、核酸がＴＳＥの伝染における必要な遺伝子成分であるという可能性を調べる研究に影響した。ＰｒＰとウィルス成分との間のｉｎ ｖｉｖｏの関連性の間接的証拠はＰｒＰＳｃ形成速度がモロニーネズミ白血病ウィルスに感染した細胞において加速されるという観察結果である（Ｃａｒｐ等、１９９９，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ ８０（Ｐｔ１）：５−１０が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。更にまたＥ．ｃｏｌｉ中で発現される組み換え哺乳類ＰｒＰ蛋白を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏの試験から、ＰｒＰとウィルス核酸との間の相互作用の証拠もある。シリアンゴールデンハムスター組み換えＰｒＰＣ（ｓｒＰｒＰ）は意外にもＨＩＶ由来のヌクレオカプシド蛋白（Ｎｃｐ７）とｉｎ ｖｉｔｒｏの活性の相同性を有している（Ｔａｎｃｈｏｕ等、１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５２：５６３−７１；Ｇａｂｕｓ等、２００１ａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７（４）：１０１１−２１；Ｇａｂｕｓ等、２００１ｂ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２２）：１９３０１−９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ｓｒＰｒＰはＤＮＡ鎖転移、核酸シャペロニング、ＨＩＶ−ＲＴプライミングおよび縮合蛋白／核酸構造の形成のプロセシングにおいてＮｃｐ７と実質的に同じレベルの活性を有している。２重鎖ＤＮＡもまた同様に縮合されたＰｒＰ構造の形成並びにプロテイナーゼＫ消化に対する耐性を誘発する（Ｎａｎｄｉ，１９９８，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４３（７）：１２５１−６３；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９ Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４４（９）：１７５１−６３；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｓｉｚａｒｅｔ，２００１，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４６：３２７−４５が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。最近２つの小型ＲＮＡアプタマーがＰｒＰ蛋白に結合するその能力に基づいて単離された。１つのアプタマー、ＡＰ１（２９ｎｔ）は組み換えｓｒＰｒＰを用いて単離され、ｓｒＰｒＰへの結合において重要であることが示唆されている構造である３つのスタッキングＧ４カルテットを含むコンパクト構造に折り込まれていると予測されている（図１２ａ；Ｗｅｉｓｓ等、１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１１）：８７９０−９７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。一連のｓｒＰｒＰ切断を用いることにより、著者等はアミノ酸２３〜３９内に可変性Ｎ末端へのＡＰ１の結合を局在化させている。
【００６７】
プリオンのフィブリル化の開始および進行の特定の機序は十分理解されていない。これまでの研究においてＲＮＡまたはＤＮＡがプリオン疾患の伝染において遺伝的役割を果たすかどうか検討されていた（Ａｋｏｗｉｔｚ等、１９９４；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９；Ｃｏｒｄｅｉｒｏ等、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（５２）：４９４００−０９；Ｎａｒａｎｇ，１９９８，Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．１４９（６）：３７５−８２；Ｎａｒａｎｇ，２００２，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２２７（１）：４−１９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。
【００６８】
本発明者等はｈｒＰｒＰへのＲＮＡの結合の物理的な相互作用と影響に着目した研究を実施した。実験は実施例において後述する。
【００６９】
本発明の特性および他の詳細は実施例においてより特定して記載し、明確化する。本発明の特定の実施態様は例示を目的としており、本発明を限定するものではない。本発明の原則的な特徴は本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の実施態様において用いることができる。
【００７０】
（実施例）
プリオンのフィブリル化の開始および進行の特定の機序は十分理解されていない。これまでの研究においてＲＮＡまたはＤＮＡがプリオン疾患の伝染において遺伝的役割を果たすかどうか検討されていた（Ａｋｏｗｉｔｚ等、１９９４，ＮＡＲ，２２（６）：１１０１−０７；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９，Ａｒｃｈ．Ｖｉｏｌ．１４４（９）：１７５１−１７６３；Ｃｏｒｄｅｉｒｏ等、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（５２）：４９４００−０９；Ｎａｒａｎｇ，１９９８，Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．１４９（６）：３７５−８２；Ｎａｒａｎｇ，２００２，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２２７（１）：４−１９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。本試験においては発明者等はプリオンの伝染の遺伝的特徴ではなくｈｒＰｒＰへのＲＮＡの結合の物理的な相互作用と影響に着目した。このためｉｎ ｖｉｔｒｏの組み換えヒトＰｒＰ（ｈｒＰｒＰ）のＲＮＡ結合活性を特性化するために配列の明らかにされている小型ＲＮＡを使用した。得られた結果によれば、ｈｒＰｒＰはアミノ酸２３〜９０（Ｎ末端）に残存する小型ＲＮＡ分子種に対して高い親和性を有することが解かる。ＰｒＰとＲＮＡとの間の複合体形成の程度はＲＮａｓｅＡによる分解からＲＮＡ分子種を保護することにより明らかにされる。更にまた、非特異的競合物質であるＲＮＡの大過剰量の存在下でＨｒＰｒＰに堅固に結合するＲＮＡのクラスが発見されている。このクラスに属するものとして新たに報告されたＲＮＡであるＲＱ１１＋１２もまたマウス脳ホモジネート中の内因性ＰｒＰに特異的に結合してＲＮＡ−ＰｒＰ複合体を生成するする能力を示している。
【００７１】
本試験において使用される転写試薬（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ｒＮＴＰ、緩衝液）はＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）またはＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ）の何れかより入手した。Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＢＳＡおよびＮｕｃ−ＡｗａｙスピンカラムはやはりＡｍｂｉｏｎから、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｅｕｌｌ ０．４５μＢＡ８５ニトロセルロース膜はＶＷＲ（Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ，ＮＪ）より入手した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ （Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）からＰＶＤＦおよびＮｙｌｏｎ膜と放射性同位体を入手した。分析とＲＮＡ定量のために使用した核酸挿入染料ＲｉｂｏＧｒｅｅｎおよびＳＹＢＲ ＧｏｌｄはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｖｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）より入手した。一般的な塩類、緩衝液および電気泳動用製品はＶＷＲおよびＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。（組み換えヒトＰｒＰ２３−２３１、ＰｒＰ２３−１４４、ＰｒＰ９０−２３１はＭａｎ−Ｓｕｎ Ｓｙ，Ｃａｓｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより寄贈された。） ホモジネートはマウス全脳から調製した。野生マウスおよびＰｒＰノックアウトマウス（ＰｒＰ０／０）由来の１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の脳ホモジネートは以下に記載の通り調製した。脳を０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を添加したＰＢＳ９容量中でホモゲナイズした。遠心分離（１２０００ｘｇ、３０分）の後、上澄みを小分けにし、−７０℃で保存した。蛋白の濃度はＶＷＲから入手したＰｉｅｒｃｅ試薬を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ試験により測定した。
【００７２】
ＲＮＡの構築：
ＲＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ発生ＤＮＡ鋳型を用いて合成した。ＰＣＲ鋳型は５’末端にＴ７ポリメラーゼプロモーターを付加し、ランオフ転写により３’末端が定義されているプライマーを用いて配列決定されているプラスミドまたは合成のオリゴヌクレオチドの何れかから作成した。プラスミド鋳型の調製において用いた全てのＤＮＡクローニング工程は標準的な分子生物学の手法に従った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｖｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹが参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ＤＮＡクローニングでは典型的には合成オリゴヌクレオチドのアニーリング、次いでそれらの連結およびｐＵＣ１９へのクローニングを行なった。内部標識されたＲＮＡは用途に応じて種々の比活性で［α−３２Ｐ］ＧＴＰまたはＣＴＰを取り込むことにより行なった。本試験で使用したＲＮＡは全て、１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素変性ゲルからゲル精製し、その後ＩＢＩ Ｖ−チャンネル電子溶離装置を用いてＲＮＡを回収した。ゲル精製前、放射標識転写反応をＮｕｃ−Ａｗａｙスピンカラム（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行ない、一方未標識反応はフェノール：クロロホルム抽出、エタノール沈殿およびＴＥ中の再懸濁（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１ｍＭ ＥＤＴＡ）により行なった。ＲＮＡの濃度はＢｉｏＳｃａｎ ＸＥＲ−２００による同位体取り込み量の関数として、または、Ｓｅｑｕｏｉａ−Ｔｕｒｎｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４５０蛍光光度計を用いたＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）蛍光結合試験により、測定した。
【００７３】
ＭＤＶ、ＭＮＶ（Ｐｒｅｕｓｓ等、１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｏｃｔ．３１，２７３（３）：６００−１３ が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）およびＡＰ１（Ｗｅｉｓｓ等、１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｎｏｖ．７１（１１）：８７９０−８７９７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）のヌクレオチド配列および予測される二次構造は報告されている。５’→３’の方向に示した下記のＲＮＡは今回始めて報告するものである。
（１）ＡＰ４６（Ｇカルテット１つが除去されたＡＰ１）（配列番号７）
（２）ＡＰ４９−（Ｇカルテット１つが置きかえられたＡＰ１）（配列番号８）
（非特異的ＲＮＡ；以下の（３）の配列を含む）
（３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ２３ＳｒＲＮＡの１５７７領域；Ａｓｈ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９２（配列番号９）
（４）ＲＱＴ１５７（Ｑ−ベータレプリカーゼベクターＲＮＡ）（配列番号１０）
（５）ＲＱ１１＋１２（ＨＩＶ−Ｒｅｖ結合要素（下線部）（Ｉｗａｉ等、１９９２）およびＳａｒｃｉｎ／Ｒｉｃｉｎ切断ドメイン（斜体）（Ｅｎｄｏ ａｎｄ Ｗｏｏｌ，１９８２）を含むＱ−ベータレプリカーゼ鋳型）
（６）ＭＮＶ：ＡＰ１（ＭＮＶベクターＲＮＡ中のＡＰ１（斜体））
（７）ＭＮＶＬＯ（Ｑ−ベータレプリカーゼ鋳型ＲＮＡ）
（８）ＭＮＶＵＰ（Ｑ−ベータレプリカーゼ鋳型ＲＮＡ）
【００７４】
フィルター結合試験：
種々のＲＮＡリガンドに対するｈｒＰｒＰの結合親和性を本質的には文献記載の２フィルター結合法により測定した（Ｌｏｃｈｒｉｅ等、１９９７，ＮＡＲ ２５（１４）：２９０２−１０；Ｂａｔｔｌｅ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， ２００１， ＲＮＡ ７：１２３−３２が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。蛋白濃度（典型的には５０ｐＭ）より常に少なくとも１０倍低値の濃度の内部標識されたＲＮＡを、３７℃で３０分間、結合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ，ｐＨ７．５，２ｍＭ ＭｇＣｌ２，２５０ｍＭ ＮａＣｌ，１μｇ／μＬ ＢＳＡおよび２ｍＭ ＤＴＴ）中２０μＬ〜１００μＬの反応系において漸増量のｈｒＰｒＰとともにインキュベートした。ｔＲＮＡを存在させる場合は濃度は１０ｎｇ／μＬ（〜４００ｎＭ）とした。未標識のＲＮＡ（ｔＲＮＡ、競合体ＲＮＡ）はｈｒＰｒＰと共に１５分間インキュベートした後に、何れかの標識ＲＮＡを添加した。蛋白へのＲＮＡの結合の後、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｍｉｎｉｆｏｌｄ ＩＩ Ｓｌｏｔ Ｂｌｏｔハイブリダイゼーション装置を用いて、反応系を蛋白結合膜（ＰＶＤＦまたはニトロセルロース）、次いで核酸結合膜（陽荷電Ｎｙｌｏｎ）で真空濾過した。蛋白非含有の反応系もインキュベートして濾過することにより蛋白非存在下でフィルターに結合するＲＮＡの量を測定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ ８２０リン画像化装置およびプログラムであるＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてフィルターを画像化した。バックグラウンド値を差し引いた後、蛋白依存的にＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に結合したＲＮＡの存在を両方のフィルターのシグナル強度の合計で蛋白結合フィルターのシグナル強度を割ることにより求めた。結合したインプットＲＮＡの％を各ｈｒＰｒＰ濃度において少なくとも３回の測定の平均値として計算した。平均の標準偏差は常時インプットＲＮＡの２％未満であった。蛋白に結合したＲＮＡの％をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを用いて蛋白濃度に対してプロットした。見かけのＫｄ値は最大ＲＮＡ結合の５０％が起こる蛋白濃度として定義される。
【００７５】
ゲルシフト試験：
ｔＲＮＡゲルシフト実験は３０分間３７℃で結合緩衝液中で行なった。上記した通り、競合体ｔＲＮＡをｈｒＰｒＰを含有する反応系中で１５分間前インキュベートした。試料緩衝液（３０％グリセロール、０．０１％キシレンシアノール／ブロモフェノールブルー）２μＬを各試料に添加した後に４℃キャビネット中で泳動させる６％ポリアクリルアミド／ＴＢＥゲル上に適用した。ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【００７６】
マウス抽出液試験を用いたゲルシフト実験は遅延緩衝液（０．０５％デオキシコール酸および０．０５％ＮＰ−４０中、５０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．４，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＬｉＣＩ，１ｍＭ ＤＴＴ，１μｇ ｔＲＮＡおよび１μＬウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中総容量２０μＬ中で３２Ｐ標識ゲル精製ＭＮＶまたはＲＱ１１＋１２の何れか５０フェムトモルをインキュベートすることにより実施した。ＲＮＡおよび緩衝液に対し、ｈｒＰｒＰ、野生型マウスの脳抽出液、またはＰｒＰ０／０ノックアウトマウスの脳抽出液のいずれかを添加した。反応混合物を室温で２０分間インキュベートし、次に試料を４Ｍ尿素含有６％ポリアクリルアミドゲルに適用した。電気泳動はＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、ｐＨ８．３，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中室温で３５分間行なった。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに露光し、リン画像化分析により分析した。
【００７７】
ＲＮａｓｅＡ保護試験：
反応混合物（２０μＬ）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ中３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＮＡの濃度は５００ｐＭ、ｈｒＰｒＰの濃度は２０ｎＭであった。３０分後、反応混合物の濃度を１ｐｇ／μＬ ＲＮａｓｅＡに調節した。３７℃で更に１５分の後、等容量の泳動用緩衝液を添加し（９４％ホルムアルデヒド、４０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００１％ブロモフェノールブルー／キシレンシアノール）、即座に試料を加熱して９５℃で３分間保持し、その後即座に６％ＰＡ／７Ｍ尿素・ＴＢＥ変性ゲル上で分離した。画像の分析はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ ８２０ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒにより行なった。
【００７８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの小型ＲＮＡのｈｒＰｒＰへの結合：
ＰｒＰ蛋白と核酸との間の安定な複合体の形成はｉｎ ｖｉｔｒｏで組み換えおよび天然のＰｒＰＣの両方を用いたもの（Ｎａｎｄｉ，１９９８，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４３（７）：１２５１−６３；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９ Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４４（９）：１７５１−６３；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｓｉｚａｒｅｔ，２００１，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４６：３２７−４５；Ｗｅｉｓｓ等、１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｎｏｖ．７１（１１）：８７９０−９７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）およびｉｎ ｖｉｖｏでＰｒＰＳｃを用いたもの（Ｍｅｒｚ等、１９８１，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（Ｂｅｒｌ）．５４（１）：６３−７４；Ｍｕｒｄｏｃｈ等、１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４（４）：１４７７−８６；Ａｋｏｗｉｔｚ等，１９９４，ＮＡＲ ２２（６）：１１０１−０７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）が多数報告されている。この試験においては、小型の人工ＲＮＡ（５６〜２４２ｎｔ）収集物を用いてｈｒＰｒＰのＲＮＡ結合活性を更に特性化している。結合試験そのものに直接関係ないが、これらのＲＮＡのいくつかはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｑ−ベータレプリカーゼによる指数的増幅のための可変鋳型に加工されている（Ｐｒｅｕｓｓ等、１９９７， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２７３（３）：６００−１３が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。
【００７９】
ＲＮＡとｈｒＰｒＰとの間の見かけの解離定数（Ｋｄ）を２フィルター結合試験により求めた（Ｌｏｃｈｒｉｅ等、１９９７，ＮＡＲ ２５（１４）：２９０２−１０；Ｂａｔｔｌｅ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ，２００１，ＲＮＡ ７：１２３−３２が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ゲル精製されたＲＮＡおよびｈｒＰｒＰを、組み換えシリアンゴールデンハムスターＰｒＰＣ（ｓｒＰｒＰ）（ｗｅｉｓｓ等、１９９７）に対する親和性を有するランダムライブラリからのＲＮＡアプタマーの選択において用いるものと同様の高塩濃度緩衝液（結合緩衝液Ａ；２ｍＭ ＭｇＣｌ２，２５０ｍＭ ＮａＣｌ）中３７℃でインキュベートした。これらの実験により３つのスタッキングしたＧカルテットにより同定される特異的なＰｒＰ結合ＲＮＡのファミリーが得られた。特に、アプタマーＡＰ１（図１２ａ）はｓｒＰｒＰに特異的に結合する能力を示し、相互作用は更に１６Ｎ末端アミノ酸（２３〜３９）に局在化していた。発明者等はまたＡＰ１を構築し、これを陽性対照として使用することにより我々の収集物のＲＮＡ分子種を評価した。独自に開発された系を用いたところ、ｈｒＰｒＰに対するＡＰ１の見かけの解離定数（Ｋｄ）は５．０ｎＭであった（表５）。
表５
【００８０】
次にかなりの量の二次構造を含んでいることが各々推測されているｈｒＰｒＰと小型ＲＮＡ収集物との間のＫｄを求めた（図１２）。反応系は３０分間インキュベートすることにより確実に平衡に達するようにした（データ示さず）。意外にも試験したＲＮＡの各々はかなりの親和性をｈｒＰｒＰに対して示した（表５）。ＡＰ４６はＡＰ１マイナス１個のＧカルテットであり、ＡＰ４９は配列ＧＡＡＡによりＡＰ１の最初のＧカルテットが置きかえられている。ＭＤＶおよびＭＮＶ、構造が既に発表されているＲＮＡ、はＱ−ベータレプリカーゼの鋳型ＲＮＡである（Ｐｒｅｕｓｓ等、１９９７）。ＭＮＶＵおよびＭＮＶＬＯはＭＮＶの５’ループに挿入されている２０個のランダムヌクレオチドを含むライブラリより得る。ＢＳ１５７７はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの１５７７ｒＲＮＡ領域を含む小型ＲＮＡである（Ａｓｈ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９２ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，９４：７５−８０が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。最も堅固に結合しているＲＮＡ、ＭＮＶ：ＡＰ１は３．８ｎＭのＫｄを有し、Ｑ−ベータレプリカーゼ鋳型ＲＮＡ ＭＮＶにクローニングされたＡＰ１アプタマーを含む複合ＲＮＡである。ＭＮＶ：ＡＰ１はｈｒＰｒＰに対する特異性を有する増幅可能なＲＮＡとしてのその用途を調べるために開発された。大型であることからＡＰ１よりも生成が容易である。Ｑ−ベータレプリカーゼにより増幅することができ、ｈｒＰｒＰに堅固に結合するその他のＲＮＡはＲＱ１１＋１２である。ＲＱ１１＋１２は本来ＲＮＡ切断植物毒素サルシンによる２分割プローブへのプロセシング後のＨＩＶ−１ Ｒｅｖ蛋白の検出において使用するために設計された（Ｚｅｉｌｅｒ等、２０００、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＳＰＩＥ Ａｅｒｏｓｅｎｓｅ ２０００，４０３６：１０３−１４が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。このような理由のため、ＲＱ１１＋１２の幹ループ構造の１つは植物毒素サルシンおよびリシン（Ｓ／Ｒ）に対するコンセンサス切断部位（図１２ｄ）（Ｅｎｄｏ ａｎｄ Ｗｏｏｌ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７（１５）：９０５４−６０が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）に隣接するＨＩＶ−１ Ｒｅｖ結合要素（ＲＢＥ）に対するコンセンサス配列を含んでいる（Ｉｗａｉ等、１９９２、ＮＡＲ２０（２４）：６４６５−７２が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。これらの付加的な配列がｈｒＰｒＰへの結合親和性の上昇と関連性があると考えられる理由は、本質的にＲＢＥおよびＳ／Ｒドメインを含む幹ループを有さないＲＱ１１＋１２であるＲＱＴ１５７が５６ｎＭという特徴的な見かけのＫｄ値を有しているにも関わらずｈｒＰｒＰと最も安定性の低い複合体を形成したためである。そしてＲＱＴ１５７は、ＲＱ１３５、即ちＱ−ベータレプリカーゼにより効率的に複製されるＲＮＡに由来するものである（Ｍｕｎｉｓｈｋｉｎ等、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２１（２）：４６３−７２が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。
【００８１】
ｈｒＰｒＰ結合特異性のｔＲＮＡによる示差：
ＲＮＡの全てが１００ｎＭより小さいｈｒＰｒＰとの見かけの解離定数を有していたことから、本発明者等は結合相互作用には特異性が欠けているという仮説を立てた。この観察結果に対抗するため、非特異的結合部位を封鎖するためにＲＮＡ結合試験において用いられる場合のある精製されたｔＲＮＡの存在下にｈｒＰｒＰに対する収集物中のＲＮＡの結合親和性を試験した（Ｂａｔｔｌｅ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ，２００１）。しかしながら、ｔＲＮＡのアンチコドンの間の相互作用は相補ＲＮＡと極めて安定な複合体を形成できることがわかっている（Ｇｒｏｓｊｅａｎ等、１９７６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４９９−５１９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。従って、先ず、ＲＮＡを封鎖することによって、ｔＲＮＡが我々の被験ＲＮＡに直接結合せず、そしてＲＮＡによるｈｒＰｒＰへのその結合を妨害しないということを明らかにする必要があった。
【００８２】
複合体がｔＲＮＡとそのＲＮＡ収集物のサブセットとの間に形成されるかどうか調べるためにゲルシフト試験を用いた（図１３）。結合緩衝液 Ａ中３７℃で３０分間インキュベートした後、ＭＮＶ：ＡＰ１は主に単一のバンドとして非変性ゲル上を移行する（レーン１）。インキュベーションに１０ｎｇ／μＬまたは１００ｎｇ／μＬのｔＲＮＡを添加してもＭＮＶ：ＡＰ１の電気泳動上の泳動性は変化しなかった（レーン２および３）。しかしながらｔＲＮＡ濃度を１μｇ／μＬに上昇させるとＭＮＶ：ＡＰ１の移行のパターンは変化し、存在するＲＮＡの少なくとも半分を含む２番目のより遅く移行するバンドが出現した（レーン４）。このバンド形成パターンはｔＲＮＡが１μｇ／μＬの濃度で存在する場合にｔＲＮＡとＭＮＶ：ＡＰ１との間に複合体が形成されることを示唆している。これとは対照的に、ＲＱ１１＋１２およびＭＮＶは如何なるｔＲＮＡ濃度でも複合体を形成しなかった（図１３ｂおよびｃ）。ｔＲＮＡの濃度がより低くなると相互作用は観察されないことから、発明者等は非特異的ＲＮＡ相互作用の抑制剤として１０ｎｇ／μＬの濃度で作業を行なうこととした。この濃度はｔＲＮＡの約４００ｎＭの濃度に相当し、これは実施中の試験の如何なるＲＮＡよりも大モル過剰量であるが、結合の抑制がＲＮＡの封鎖によるものではないことを確保しておくために十分低値である。
【００８３】
種々のＲＮＡ分子種の結合をｔＲＮＡの存在下に再度検討したところ、結合親和性のより大きい相違が観察された（表５、コラム２）。非特異的阻害剤の存在下、測定されたＫｄ値は１２ｎＭ〜２５００ｎＭであった。ｔＲＮＡの存在による影響が最小限であり１００ｎＭ未満のＫｄ値を維持していたＲＮＡにはＡＰ１、対照ＲＮＡ、並びにＭＮＶ：ＡＰ１およびＲＱ１１＋１２が含まれていた。残りのＲＮＡはより強くｔＲＮＡの影響を受けており、一部では２桁を超える差が認められた。これらのＲＮＡの数種はマイクロモル範囲で測定される乖離定数（Ｋｄ）を有している。競合的結合のデータによれば、ｈｒＰｒＰへのＲＮＡの結合の特異性の水準は極めて変動性が高い。ただしＲＱ１１＋１２およびＭＮＶ：ＡＰ１のような明らかに異なる構造を有するＲＮＡに対してこのような水準の特異性を示すものが何かという問題の解決手段はほとんどない。少なくとも、この分析により非特異的競合体ＲＮＡの大過剰量の存在下でのｈｒＰｒＰへの安定した結合を予測する因子としてはＲＮＡの長さと全体的な熱力学的安定性は除外できる。ｈｒＰｒＰ親和性に対するＲＮＡの二次構造の作用は、小型の幹ループ構造のみ異なるにもかかわらずそのＫｄ値は７倍を超えた差があるＭＮＶＬＯおよびＭＮＶＵＰにより裏付けられている（図１２ｂおよびｃ）。
【００８４】
ｈｒＰｒＰへの高い親和性と特異的結合をもたらすＲＮＡファミリー：
高い親和性と特異性を有するｈｒＰｒＰにより結合されることが必要なＲＮＡにおける条件を解明する試みにおいて、発明者等はヌクレオチド組成の異なる４種のＲＮＡのサブセットを分析し、その構造様式を予測した。ＡＰ１を選択した理由はそれがＮ末端ＰｒＰに結合するためである（Ｗｅｉｓｓ等、１９９７）。ＭＮＶの選択理由もまた、その親和性がｔＲＮＡの存在により大きく影響され、従って非差別的態様でｈｒＰｒＰに結合するＲＮＡとなるためである。従って、この試験の初期に使用したｔＲＮＡは異種の集団であり、ｈｒＰｒＰへの結合における各ＲＮＡ分子種の作用は不明瞭であったため、競合実験においては非特異的ｔＲＮＡに等価なものとしてＭＮＶを使用する。特に、ｈｒＰｒＰはｔＲＮＡＬｙｓと相互作用する能力を有することがわかっている（Ｇａｂｕｓ等、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１ｂ，Ｊｕｎ １，２７６（２２）：１９３０１−９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ＭＮＶ：ＡＰ１およびＲＱ１１＋１２は、両ＲＮＡがＱ−ベータレプリカーゼにより増幅可能であり、高い親和性でｈｒＰｒＰに特異的に結合し、そしてｔＲＮＡによる影響が最小であることから選択した。
【００８５】
これらのＲＮＡ分子種の結合特異性を、放射標識ＲＮＡおよび未標識の競合体ＲＮＡを用いる競合実験において対抗させた（図１４）。標識されたＭＮＶ：ＡＰ１（５０ｐＭ）のｈｒＰｒＰ（５０ｎＭ）への結合は濃度５ｎＭ〜１２０ｎＭの範囲に渡り競合体ＲＮＡであるＡＰ１またはＭＮＶの存在下で測定した。競合体ＲＮＡがｈｒＰｒＰと相互作用する機会を確保するために、常時、標識ＲＮＡよりも１５分前に反応系に添加するようにした。３０分のインキュベートの後、結合の範囲を２フィルター試験で調べた。上記条件下、ＡＰ１は効果的にＭＮＶ：ＡＰ１の結合を抑制した。１２０ｎＭのＡＰ１の濃度において、ＭＮＶ：ＡＰ１の結合は２５％未満に低下した。これとは対照的に、競合体ＭＮＶが１２０ｎＭの濃度で存在する場合は、ＭＮＶ：ＡＰ１のｈｒＰｒＰへの結合はわずか５％しか低下しない。この観察結果は、ＭＮＶ：ＡＰ１のｈｒＰｒＰへの結合の９５％がＡＰ１配列を介して起こったモデルの場合と合致している。これらの結果はまた、ＡＰ１配列はｈｒＰｒＰへの特異的な高い親和性での結合に関与しているが、ＭＮＶはそうではないことを示唆している。この結論はｔＲＮＡ存在下にＭＮＶおよびＡＰ１について測定されたＫｄ値と合致している（表５）。
【００８６】
ＲＱ１１＋１２のｈｒＰｒＰへの結合を同じ実験方法を用いて調べた。同じＭＮＶおよびＡＰ１競合体を用いたｈｒＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の結合の抑制のパターンはＭＮＶ：ＡＰ１の場合とほぼ同様である。ＭＮＶおよびＡＰ１は共に、それらがｈｒＰｒＰへのＭＮＶ：ＡＰ１の結合に対して示したより僅かに高度にｈｒＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の結合を抑制する。この観察結果はＭＮＶ：ＡＰ１と比較した場合のｈｒＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の親和性が僅かに低値であることと合致している。この競合データは、ＲＱ１１＋１２およびＭＮＶ：ＡＰ１がｈｒＰｒＰへの結合の共通の様式を有していることを証明するわけではないが、その可能性を示唆しているといえる。
【００８７】
ｈｒＰｒＰのアミノ末端へのＲＮＡの結合：
ｈｒＰｒＰに対して十分高い親和性で結合し、ｔＲＮＡまたはＭＮＶによる非特異的競合に対して耐性を示すことから、ＲＱ１１＋１２を用いて更に特性化を行なった。更に、ＲＱ１１＋１２はＭＮＶ：ＡＰ１とは異なり、高濃度（４０μＭまで）においてもｔＲＮＡと相互作用を示さない。またＲＱ１１＋１２はＱ−ベータレプリカーゼにより急速に増幅される。数種の緩衝液を試験した後、ｔＲＮＡ非存在下のｈｒＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の結合は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ，ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＤＴＴ（緩衝液Ｂ；データ示さず）中でほぼ１０倍（Ｋｄ＝２．２ｎＭ）向上することが解かった。ｈｒＰｒＰへの結合はまた緩衝液Ｂ中でＭＮＶについても向上した（２．６ｎＭ）。興味深いことに、緩衝液Ｂ中ではＲＱ１１＋１２とＭＮＶはｔＲＮＡ非存在下で同様のＫｄ値を有している。
【００８８】
切断されたｈｒＰｒＰ蛋白を用いてＲＮＡ結合活性の物理的位置を調べた。完全長の組み換え蛋白ｈｒＰｒＰ２３−２３１のほかに、本発明者等はまたｔＲＮＡの存在下、結合緩衝液Ｂ中、フィルター結合試験を用いてＮ末端部分（ｈｒＰｒＰ２３−１４４）およびＣ末端部分（ＰｒＰ９０−２３１）を調べた（図１５）。競合実験の結果から推定された通り、ＲＱ１１＋１２とＭＮＶ：ＡＰ１は共に完全長ｈｒＰｒＰおよびＮ末端切断部にのみ結合した（図１６ｂ）。蛋白濃度はこのセットの実験では２０ｎＭであったため、ＭＮＶは１０ｎｇ／μＬのｔＲＮＡの存在下でｈｒＰｒＰに結合できなかった。しかしながら、ｔＲＮＡを結合緩衝液から除去するとＭＮＶの結合はＰｒＰの完全長またはＮ末端部分の何れに対しても起こった。Ｃ末端切断部であるＰｒＰ９０−２３１に対してはどのＲＮＡの結合も検出できなかった。このデータはアミノ酸２３〜９０内のｈｒＰｒＰのＮ末端中に残存するｈｒＰｒＰの差別的または非差別的なＲＮＡ結合活性の双方を示している。
【００８９】
ＲＮａｓｅＡ分解からの保護と結合との相関：
リボヌクレアーゼ保護試験を用いてｈｒＰｒＰとＲＮＡとの間の相互作用の性質を調べた。ｈｒＰｒＰがＲＮＡ構造と最小限しか相互作用を示さず、ＲＮＡ構造をそれほど封鎖しない場合、ＲＮＡはリボヌクレアーゼによる分解を受けやすいはずである。しかしながら、ＲＮＡ／蛋白複合体が全体のＲＮＡ分子を含んでおりｈｒＰｒＰとの相互作用がＲＮＡの大部分を封鎖する場合、リボヌクレアーゼによる分解に対抗してＲＮＡを安定化させなければならない。
【００９０】
ｈｒＰｒＰ／ＲＮＡ複合体を調べるために、ＲＱ１１＋１２およびＭＮＶを過剰のｈｒＰｒＰと共にインキュベートし、３０分間相互作用を起こさせた。ＲＱ１１＋１２は代表的な差別的結合として選択し、ＭＮＶは非差別的結合として選択した。次にＲＮａｓｅＡを添加し、更に１５分間継続してインキュベートした（図１６）。この処理の後、ＲＮＡのほぼ半分がｈｒＰｒＰを含有する試料中に残存したのに対し、ＲＮＡのみを含有する試料中ではＲＮＡの９５％を超える量が分解した。ｔＲＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）を初期のインキュベーションに含めるとｈｒＰｒＰにより付与されるＭＮＶの保護の水準はｔＲＮＡ非存在下の約半分となるのに対し、ＲＱ１１＋１２の保護の水準は不変である。ＲＱ１１＋１２およびＭＮＶの保護のパターンはｈｒＰｒＰへのそれらの結合パターンと直接相関しており、ｈｒＰｒＰとの複合体の形成が結合ＲＮＡを保護することが示唆される。
【００９１】
ＰｒＰに特異的に結合するＲＱ１１＋１２：
生物学的複雑性の漸増する溶液中における結合試験を用いてＰｒＰへのＲＱ１１＋１２結合の特異性を調べた。ｈｒＰｒＰ２３−２３１の理論的等電点は９．３９（ＥｘＰＡＳｙ分子生物学サーバー、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ）であり、従って蛋白は結合試験の条件下では陽電荷を有している。そのヌクレオチド組成の結果として、ＲＱ１１＋１２は負荷電されている。従って、ｈｒＰｒＰの陽電荷およびＲＱ１１＋１２の負電荷は、ＲＱ１１＋１２とｈｒＰｒＰの間の結合が電荷に基づいている可能性を生じさせている。この可能性に対抗するために、その理論的ｐＩが９．９（ＥｘＰＡＳｙ）であり、試験条件下で陽荷電しているはずであることから、蛋白リソシームをＲＱ１１＋１２との結合試験において使用した（図１７ａ）。試験条件はＲＮＡ（２ｎＭ）および蛋白（２０ｎＭ）の濃度がＲＱ１１＋１２の広範な結合は可能とするがＮＭＶに対してはそうならないように調節した（表５の結果に基づく）（１０ｎｇ／μＬのｔＲＮＡの存在下の結合緩衝液Ａ）。全ての場合において、ＭＮＶの結合はバックグラウンド値であった。ｈｒＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の結合は約９０％であったのに対し、ＢＳＡおよびリゾチームへの結合はバックグラウンド値であった。これらの結果は、ＲＱ１１＋１２が陽荷電されたリゾシーム蛋白と非特異的に相互作用しないことを示している。
【００９２】
ＰｒＰに対するＲＱ１１＋１２の特異性は更にゲルシフト試験を用いたマウス脳抽出液中での結合を調べることにより確認した。抽出液は生理学的に多様な蛋白類が含まれており、これによりＰｒＰに対するＲＱ１１＋１２の特異性のストリンジェントな試験が可能となる。ｈｒＰｒＰ４０ｎｇと共にインキュベートした後、標識されたＲＱ１１＋１２の移行は電気泳動の間ポリアクリルアミドゲルを通過させながら遅延させ、一方ＭＮＶの移行には影響がないようにする（図１７ｂ、レーン５および６ｖｓ１および２）。ＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の特異性は野生型マウス脳抽出液またはマウスＰｒＰノックアウト脳抽出液の何れかの等量（２０μｇ）と共にインキュベートした後に明らかにされる（レーン７および８）。野生型マウスにおいてのみシフトが観察され、レーン７で観察されたシフトは野生型抽出液中に存在する内因性ＰｒＰの存在のみによるものであることが示唆される。レーン６よりもレーン７においてＲＱ１１＋１２の遅延が大きいことは、恐らくは天然のＰｒＰには存在するがｈｒＰｒＰには存在しない翻訳後の修飾、宿主蛋白とのＰｒＰＣの会合またはｉｎ ｖｉｖｏで形成されるが精製された組み換えｐｒＰ中では形成されないＰｒＰの２量体の存在の何れかによるものと考えらえる（Ｙｅｈｅｉｌｙ１等、１９９７，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ３：３３９−３５５；Ｍｅｙｅｒ等、２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｄｅｃ．１，２７５（４８）：３８０８１−７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。抽出液中の天然のマウスＰｒＰとＲＮＡとの間の相互作用のパターンはＲＱ１１＋１２が高い特異性を示したがＭＮＶは示さなかったｔＲＮＡ存在下に実施したフィルター結合実験を想到させる。
【００９３】
ＲＱ１１＋１２によるｈｒＰｒＰのフィブリル化の促進：
最近発表された研究において、ＤＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏで組み換えＰｒＰのフィブリル化を誘発することができることが報告された（Ｎａｎｄｉ ａｎｄ ＬｅＣｌｅｒｃ，１９９９）。この実験において、Ｇ−Ｃ塩基対（ｇｃＤＮＡ）を全体的に保有する１５００ｎｔの２重鎖ＤＮＡを精製された組み換え蛋白と共に低いｐＨ（５．０）でインキュベートしている。凝集特異的染料であるコンゴレッドを用いることにより、本発明者等はＤＮＡ依存性のフィブリル化を明らかにした。更にまた、このＰｒＰ／ＤＮＡ凝集物はＰｒＰＣ構造転換の特質であるプロテイナーゼＫによる消化に対する耐性を有していた。
【００９４】
本発明者等はＲＱ１１＋１２が同じ能力を有するとしたら興味深いと考えた。Ｎａｎｄｉの研究において使用されたｇｃＤＮＡとは異なり、ＲＱ１１＋１２は自己凝集しないため、電子顕微鏡観察によりｈｒＰｒＰ／ＲＱ１１＋１２複合体形成の結果を明らかにするために選択した（図１８）。Ｎａｎｄｉの酸性条件を用いる代わりに、生理学的ｐＨの緩衝液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．５，０．１μｇ／μＬｔＲＮＡ，８μｇ／μＬウシ血清、０．０５％ＮＰ−４０／デオキシコール酸）を選択した。室温で１６時間インキュベートした後、８．９ｐｍｏｌのｈｒＰｒＰは識別可能な上層構造を形成しなかった（図１８ａ）。しかしながら、０．１６ｐｍｏｌのＲＱ１１＋１２が反応系に存在する場合、凝集構造を観察することができる（図１８ｂ）。個々の棒状の構造を形成するスクラピー感染組織から回収されるＳＡＦとは対照的に、ｈｒＰｒＰ間に形成される上層構造は格子様の凝集物を形成すると考えられるが、ｈｒＰｒＰ凝集に対するＲＱ１１＋１２の作用は明らかで顕在化している。
【００９５】
この試験はリボ核酸が組み換えＰｒＰに結合するという以前に報告された観察結果を確認し、拡張するものである。本明細書に記載した結果は、ｈｒＰｒＰが数種類のＲＮＡと極めて安定した複合体を形成でき、その解離定数は低いナノモル領域にあることを明らかにしている。２つのＲＮＡ、ＲＱ１１＋１２とＭＮＶ：ＡＰ１はきわめて堅固にｈｒＰｒＰに結合し、他のＲＮＡからの競合に対して耐性を示し、これによりその試験群中の他のＲＮＡの一部と比較して結合活性が顕著に異なっていた。更にまた、ＲＱ１１＋１２は恐らくは全マウス脳抽出液中の内因性ＰｒＰＣに特異的に結合した。ＭＮＶ：ＡＰ１とＲＱ１１＋１２との間にはｈｒＰｒＰへの特異的結合を説明する明らかな類似性は少ないものの、両者は共に蛋白結合ＲＮＡに共通な特徴である熱力学的に安定な非規範的な塩基対を含む二次構造要素を有することが推測される。非ワトソンクリック型の塩基対はＲＮＡの深溝を拡張することができ、これにより拡大した蛋白ドメインとの相互作用に適応し、蛋白リガンド結合特異性において役割を果たすと考えられる別の水素結合基を露出させることができる（Ｙｅ等、１９９９，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３（１２）：１０２６−３３；Ｊｉａｎｇ等、１９９９，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ．７（１２）：１４６１−７２；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｅｓｔｈｏｆ，１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６（１２）：Ｒ３３５−４３；Ｐａｔｅｌ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９（１）：７４−８７；Ｐｕｇｌｉｓｉ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，１９９９，ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ，ＲＦ Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，ＴＲ Ｃｅｃｈ，ＪＦ Ａｔｋｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２ｎｄ，１９９９，ｐｐ４０３−２５；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７（５４５４）：８２０−５が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。以前に記載したＭＮＶ：ＡＰ１中のＡＰ１構造は３つのスタッキングしたｇカルテットを有している（Ｗｅｉｓｓ等、１９９７）のに対し、ＲＱ１１＋１２は非ワトソンクリック型塩基対であるＲｅｖ結合要素（ＲＢＥ）および１８Ｓ ｒＲＮＡに由来するサリシン／リシン切断ドメインを含むことが解かっている２つのＲＮＡドメインを含んでいる（図１２ｄ）（Ｉｗａｉ等、１９９２；Ｅｎｄｏ ａｎｄ Ｗｏｏｌ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１５）：９０５４−６０が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。これらのＲＮＡの二次構造により与えられる熱力学的安定性はｈｒＰｒＰの可変Ｎ末端とのより広範な相互作用を可能とする場合がある。非構造性ペプチドはその立体配座を安定なＲＮＡの構造様式に変化させることにより、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ蛋白に由来するペプチドとそのＲＮＡアプタマーとの間の結合の場合と同様、安定な複合体を形成する場合がある（Ｙｅ等、１９９６；Ｙｅ等、１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６（９）：６５７−６９；Ｔａｎ等、１９９３，Ｃｅｌｌ ７３（５）：１０３１−４０が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。
【００９６】
ＤＮＡはＤＮＡ／蛋白複合体の形成を通じてＰｒＰ中間体を安定化させることによりＰｒＰＳｃへのＰｒＰＣの変換における活性化エネルギーを低下させることができる。本試験においては、発明者等はＲＮＡ様ＲＱ１１＋１２の同様の役割を示唆すると考えられるデータを呈示する。これによれば、ＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の結合は、競合体ＲＮＡの大モル過剰量の存在下、極めて低濃度で高い親和性および特異性で起こる。ｈｒＰｒＰへの結合はまたＲＮａｓｅＡによる分解からＲＱ１１＋１２を保護している。これらの結果は、ｈｒＰｒＰとのＲＱ１１＋１２の相互作用により特徴付けられる特異的なＲＮＡの相互作用がＲＮＡ／ＰｒＰ複合体の形成を開始させ、さらにＰｒＰ凝凝塊の形成をも触媒するモデルを与えるものである。このような凝凝塊はフィブリル性であり不溶性であると予測される。このような凝凝塊の形成は図１６のレーン３および４中の変性ゲル中の原点に蓄積している試料の量を説明すると考えらえる。このことはまた、ＲＱ１１＋１２はｈｒＰｒＰへのそれ自体の結合にために競合する際に、ＭＮＶがそれ自体の結合のために競合するよりも効率的である自己競合結合実験の結果も説明している（図１６ｂ）。ＰｒＰのＲＮＡに対する比率が、１個より多いｈｒＰｒＰの分子にＲＱ１１＋１２が結合している場合に予測される１：１に近いほど作用はより顕著になる。以前に、核酸により触媒されるＰｒＰの凝凝塊のｉｎ ｖｉｔｒｏの形成を酸性条件下ＤＮＡを用いて明らかにされている（Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｓｉｚａｒｅｔ，２００１；Ｃｏｒｄｅｉｒｏ等、２００１，Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（５２）：４９４００−０９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ＲＱ１１＋１２がＲＮＡ／ＰｒＰ凝凝塊の形成を触媒すると示唆することは興味深い。作用は速度論的であり、即ち、ＲＱ１１＋１２のようなＲＮＡは構造転換を効率的に触媒できる極めて特別な方法においてＰｒＰと相互作用することができる。相互作用の特異性のため、低い濃度でも起こり得る。この活性はＲＱ１１＋１２のようなＲＮＡとＭＮＶのようなＲＮＡとの間の結合活性の相違に関係していると考えられる。
【００９７】
プリオン疾患の伝染の複雑性のために、幾つかの最近の研究はプリオン疾患の発症または進行を助けるコファクターが存在する可能性に着目している（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６７９−８３が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ＰｒＰＣからプリオン疾患の特質であるＰｒＰＳｃへの転換を触媒する「ファクターＸ」蛋白の検索は幾つかの可能性のある蛋白の候補を明らかにしている（Ｙｅｈｉｅｌｙ等、１９９７）。最近、ＤＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏでＰｒＰに結合し、特殊な条件下でフィブリル化を誘発することができることがわかった（Ｎａｎｄｉ，１９９８；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｓｉｚａｒｅｔ，２００１；Ｃｏｒｄｅｉｒｏ等、２００１）。この観察結果によりＤＮＡがプリオン疾患の進行に関与している可能性があることが示唆される。本データはＲＱ１１＋１２のようなＲＮＡがプリオン疾患に関与するより可能性の高い候補であることを示唆している。ｈｒＰｒＰに対するＲＱ１１＋１２のＫｄはｄｓＤＮＡについて測定したものよりも３桁低値であり、結合は生理的条件下に起き、ＲＮＡは原形質内の細網構造内部にそのＮ末端が延びているＰｒＰＮｔｍと相互作用する機会が与えられる（Ｈｅｄｇｅ等、１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９（５３５２）：８２７−３４が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ＰｒＰの凝集の誘導のためのモデルは特異的ＲＮＡリガンド結合時にＰｒＰのＮ末端が起こす構造的変化の周囲に形成することができる。Ｎ末端の新しい立体配座は、ＰｒＰの保存されたアミロイド形成性の領域（アミノ酸１０６〜１２６）のフィブリル化活性を、その溶媒曝露により活性化させる。内部の４２個のアミノ酸β−アミロイドペプチドがＡＰＰから切り出され溶媒曝露された後にのみ凝集する９０ｋＤａのアミロイド前駆蛋白（ＡＰＰ）のフィブリル化も同様の機序に従う（Ｒｏｃｈｅｔ ａｎｄ Ｌａｎｓｂｕｒｙ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：６０−８が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。このモデルが正しい場合、この結果はＲＮＡ分子がプリオン疾患においてフィブリルの形成を誘発ないしは加速することができることを示唆している。
【００９８】
プリオン疾患におけるＰｒＰの結合の機序や特異的ＲＮＡの役割とは無関係に発明者等はＲＮＡであるＲＱ１１＋１２がＰｒＰ蛋白に対する有用なプローブであることを明らかにする。更にまた、ＲＱ１１＋１２はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｑ−ベータレプリカーゼに対する強力な鋳型である。この新しい種類の２官能性のＲＮＡ分子またはアンプリボディーは蛋白標的に特異的に結合し、Ｑ−ベータレプリカーゼにより直接増幅される能力を有している。ＲＱ１１＋１２のような分子はプリオンの生物学を研究する際のみならず、より新しくより感度の高い診断方法を開発する際にも有用である。
【００９９】
本発明をより理解するために、多くの用語および表現を以下の通り定義する。
【０１００】
本明細書においては、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類縁体の何れかである如何なる長さのヌクレオチドの重合体型も包含するものとする。ポリヌクレオチドは何らかの３次元構造を有し、既知または未知の何らかの機能を果たす。非限定的なポリヌクレオチドの例としては、以下のもの、即ち：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド 、プラスミド、ベクター、何れかの配列の単離ＤＮＡ、何れかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドの類縁体も包含する。あり得る場合は、重合体の組み立ての前後にヌクレオチド構造を修飾することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていても良い。ポリヌクレオチドは標識成分とのコンジュゲート形成によるなどして重合後に更に修飾されても良い。この用語はまた二重鎖および一重鎖のヌクレオチド両方を包含する。特段の記載や条件が無い限り、ポリヌクレオチドである本発明の如何なる実施態様も二重鎖型および二重鎖型を形成することが解かっているか予測される２つの相補的一重鎖型の組み合わせの双方を包含する。
【０１０１】
ポリヌクレオチドはヌクレオチド塩基４種、即ち、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）および、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合は値にンに対してウラシル（Ｕ）の特異的配列よりなる。即ち、「ポリヌクレオチド配列」という用語はポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は中央処理装置を有するコンピューターのデータベースに入力し、機能的ゲノミックスおよびホモロジーの検索のようなバイオインフォマティクス用途に使用することができる。
【０１０２】
「遺伝子」とは転写され翻訳された後に特定のポリペプチドまたは蛋白をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを包含する。本明細書に記載したポリヌクレオチド配列の何れも、それらが会合している遺伝子のより大きいフラグメントまたは完全長のコード配列を同定するために使用して良い。より大きいフラグメントの配列を単離する方法は当業者のよく知るとおりであり、その一部を本明細書に記載する。
【０１０３】
「遺伝子産物」とは遺伝子が転写され、次に翻訳された場合に発生するアミノ酸、例えばペプチドまたはポリペプチドを包含する。
【０１０４】
「プライマー」は標的とハイブリダイズし、その後標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進することにより、対象となる試料中に存在する標的または「鋳型」と結合する遊離の３’−ＯＨ基を一般的に有する短いポリヌクレオチドを包含する。「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」とは「上流」および「下流」のプライマーよりなる「プライマー対」または「プライマーセット」および重合触媒、例えばＤＮＡポリメラーゼ、典型的には熱的に安定なポリメラーゼ酵素を用いて標的ポリヌクレオチドから複製コピーを作成する反応である。ＰＣＲの方法は当該分野でよく知られており、例えばＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ等のＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）に記載されている。ＰＣＲや遺伝子クローニングのようなポリヌクレオチドの複製コピーを作成する全ての方法はここではまとめて「複製」と称する。プライマーはまたサザンブロットまたはノーザンブロット分析のようなハイブリダイゼーション反応におけるプローブとしても使用できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９が参照できる）。
【０１０５】
「ｃＤＮＡ」という用語は逆転写酵素のような酵素でｃＤＮＡとすることができる細胞または生物中に存在する相補ＤＮＡ、即ちｍＲＮＡ分子を含む。「ｃＤＮＡライブラリ」とは、酵素である逆転写酵素によりｃＤＮＡ分子に変換され、次に「ベクター」（外来ＤＮＡ添加後に複製を継続できる他のＤＮＡ分子）に挿入される、細胞または生物中に存在するｍＲＮＡ分子の収集物を包含する。ライブラリのためのベクターの例はバクテリオファージ、細菌感染ウィルス、例えばλファージを包含する。次に目的の特定のｃＤＮＡ（そしてすなわちｍＲＮＡ）に対してライブラリをプローブすることができる。
【０１０６】
「デリバリーベヒクル」とは宿主細胞に内にポリヌクレオチド１つ以上を挿入する事のできる分子を包含する。デリバリーベヒクルの例はリポソーム、生体適合性重合体、例えば天然の重合体および合成の重合体；リポ蛋白；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工のウィルスエンベロープ；金属粒子；および細菌、ウィルスおよびウィルスベクター、例えばバキュロウィルス、アデノウィルスおよびレトロウィルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、カビベクターおよび種々の真核生物および原核生物の宿主中で複製および／または発現することが解かっている当該分野で典型的に使用されている他の組み換えベヒクルである。デリバリーベヒクルは挿入ポリヌクレオチドの複製、遺伝子治療並びに単にポリペプチドと蛋白の発現のために使用して良い。
【０１０７】
「ベクター」とは挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞内および／または宿主細胞間に転移させる自己複製可能な核酸分子を包含する。用語には細胞への核酸分子の挿入のために主に機能するベクター、核酸の複製のために主に機能する複製ベクターおよびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを包含するものとする。更にまた、上記機能の１つより多くを与えるベクターも意図している。
【０１０８】
「宿主細胞」とはベクターのための、または、外来性核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／または蛋白の取り込みのためのレシピエントとなり得るか、レシピエントであった何れかの個々の細胞または細胞培養物を包含するものとする。更にまた単細胞の子孫も包含する。子孫は天然、偶発的または意図的な突然変異により元の親細胞と（形態学的またはゲノムまたは全ＤＮＡ相補物において）完全に同一である必要はない。細胞は細菌細胞を含む原核生物であってよい。
【０１０９】
「遺伝子的に修飾された」という用語は、細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を修飾する外来性遺伝子または核酸の配列を含む、そして／または発現する細胞を包含する。この用語は細胞の内因性ヌクレオチドの如何なる付加、欠失または破壊も包含する。
【０１１０】
本明細書においては「発現」とはポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白に翻訳される過程を包含する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来するものである場合、適切な真核生物の宿主を選択するとすれば発現はｍＲＮＡのスプライシングを包含する。発現に必要な調節要素はＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列を包含する。例えば、細菌の発現ベクターにはｌａｃプロモーターのようなプロモーター転写開始のためのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列および開始コドンＡＵＧが包含される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。同様に、真核生物の発現ベクターにはＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種または同種のプロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧおよびリボソームの脱着のための終止コドンが包含される。このようなベクターは市販のものを用いるか、または、当該分野でよく知られている方法、例えば、一般的にベクターを構築するための後述する方法に記載されている配列番号により組み立てることができる。
【０１１１】
「示差的に発現される」とは遺伝子に適用した場合は遺伝子から転写されるｍＲＮＡまたは遺伝子によりコードされる蛋白産物の示差的生産を含む。示差的に発現された遺伝子は正常または対照の細胞の発現濃度と比較して過剰発現または過少発現される。１つの特徴において、それは対照試料中に検出される発現濃度よりも２．５倍、好ましくは５倍または好ましくは１０倍、高値または低値となる差を包含する。「示差的に発現される」とはまた、対照細胞ではサイレントであるが発現される、または、対照細胞では発現されるが発現されない細胞または組織中のヌクレオチド配列を包含する。
【０１１２】
「ポリペプチド」という用語は２個以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類縁体またはペプチド擬似物の化合物である。サブユニットはペプチド結合により連結される。別の実施態様においては、サブユニットは他の結合、例えばエステル、エーテル等を解して連結される。本明細書においては、「アミノ酸」とはグリシンおよびＤまたはＬの双方の光学異性体およびアミノ酸類縁体およびペプチド擬似物を包含する何れかの天然および／または非天然または合成のアミノ酸を包含する。アミノ酸３個以上のペプチドを一般的にオリゴペプチドと称する。３個より多いかそれ以上のアミノ酸のペプチド鎖はポリペプチドまたは蛋白と称する。
【０１１３】
「ハイブリダイゼーション」はポリヌクレオチド１つ以上が反応することによりヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を包含する。水素結合はワトソンクリック型塩基対形成、フーグスティーン型結合によるか、または何らか別の配列番号特異的態様において起こる。複合体は２重らせん構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖またはこれらの組み合わせの何れかを含む。ハイブリダイゼーション反応はＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のようなより広範な過程における段階を構成する。
【０１１４】
ハイブリダイゼーション反応は異なる「ストリンジェンシー」の条件下に行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーには何れかの２個の核酸分子が相互にハイブリダイズする際の困難度が包含される。ストリンジェントな条件下では、相互に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％同一である核酸分子が相互にハイブリダイズされた状態で残存し、低い同一性の分子はハイブリダイズされた状態では残存できない。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中４５℃、次いで０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄１回以上を５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、更に好ましくは６５℃で行なうハイブリダイゼーションである。
【０１１５】
２つの一重鎖ポリヌクレオチドの間で逆平行の立体配置においてハイブリダイゼーションが起こる場合、反応は「アニーリング」と称され、これらのポリヌクレオチドは「相補的」と記載される。二重鎖ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの鎖の一方と第２のものとの間にハイブリダイゼーションが起こり得る場合には、もう一方のポリヌクレオチドに対して「相補的」または「相同」であることができる。「相補性」または「相同性」（１つのポリヌクレオチドがもう１つと相補的である程度）は一般的に許容されている塩基対形成規則に従って相互に水素結合すると予測される対向する鎖内の塩基の比率に基づいて定量される。
【０１１６】
本明細書においては、「核酸分子」という用語はＤＮＡ分子、例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ，およびＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡおよびヌクレオチド類縁体を用いて発生したＤＮＡまたはＲＮＡの類縁体を包含するものとする。核酸分子は一重鎖または二重鎖であることができるが、好ましくは二重鎖ＤＮＡである。
【０１１７】
「単離された核酸分子」とは核酸の天然の原料中に存在する他の核酸分子から分離される核酸分子を包含する。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、「単離された」という用語はゲノムＤＮＡが本来会合している染色体から分離される核酸分子を包含する。好ましくは、「単離された」核酸は核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸を天然に切断している配列（即ち核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施態様において、本発明の単離されたマーカー核酸分子、または本発明のポリペプチドマーカーをコードする核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子を天然に切断している約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂより小さいヌクレオチド配列を含むことができる。更にまた、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組み換え技術により製造された場合は他の細胞内物質または培地を実質的に含有せず、或いは、化学合成された場合は化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含有しない。
【０１１８】
本発明の核酸分子、例えば配列番号１〜１０のヌクレオチド配列またはその部分を有する核酸分子は、標準的な分子生物学の手法および本明細書に記載する配列の情報を用いて単離することができる。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１〜１０の核酸配列の全てまたは一部を用いながら、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載の標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を用いて配列番号１〜１０を有する分子を単離することができる。
【０１１９】
本発明の核酸は標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。このようにして増幅された核酸は適切なベクター内にクローニング、ＤＮＡ配列分析により同定することができる。更にまた、マーカーヌクレオチド配列または本発明のマーカーをコードするヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドは標準的な合成方法、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを用いるなどして調製することができる。
【０１２０】
別の実施態様においては、本発明の単離された核酸分子は配列番号１〜１０のヌクレオチド配列またはその部分に相補的な核酸分子を包含する。そのようなヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、それがそのヌクレオチド配列にハイブリダイズできる程度に十分そのヌクレオチド配列番号に対して相補的であり、これにより安定な二重らせんを形成するものである。
【０１２１】
本発明の核酸分子は更に、プローブまたはプライマーとして使用することのできる、本発明の配列番号１〜１０の核酸配列の僅か一部、またはフラグメントを包含する。プローブ／プライマーは典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。
【０１２２】
配列番号１〜１０をコードする核酸分子のヌクレオチド配列に基づいたプローブは凝塊蛋白を検出するために使用することができる。別の実施態様において、プローブはそこに連結される標識基を含み、例えば、標識基は放射性同位体、蛍光物質、酵素または酵素コファクターであることができる。このようなプローブは、本発明のポリペプチドを誤発現、例えば過剰発現または過少発現するか、または、本発明の遺伝子のより多いまたは少ないコピーを有する細胞または組織を同定するための診断用試験キットの一部として用いることができる。
【０１２３】
本明細書においては、「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする」とは、相互に少なくとも６０％の相同性であるヌクレオチド配列が典型的には相互にハイブリダイズされた状態で残存するハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を指すものとする。好ましくは、条件は、相互に少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、更に好ましくは少なくとも８５％または９０％の相同性である配列が典型的には相互にハイブリダイズされた状態で残存するようなものである。このようなストリンジェントな条件は当業者が知るとおりであり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃、次いで０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄１回以上を５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、更に好ましくは６５℃で行なうハイブリダイゼーションである。好ましくは、配列番号１〜１０の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子である。本明細書においては「天然の」核酸分子とは自然界に存在する、例えば天然の蛋白をコードするヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を包含する。
【０１２４】
他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは例えばｉｎ ｖｉｖｏの宿主細胞受容体をターゲティングするためのペプチド、または細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒ等、（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ等、（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４：６４８−６５２；ＰＣＴ出願公開ＷＯ８８／０９８１０参照）または脳血管関門（例えばＰＣＴ出願公開ＷＯ８９／１０１３４参照）を通過する輸送を促進する物質のような、他の付随的物質群も包含できる。更にまた、オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション誘発切断試薬（例えばＫｒｏｌ等、（１９８８），Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６参照）または挿入試薬（例えばＺｏｎ，（１９８８），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，５：５３９：５４９参照）を用いて修飾することができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発交差結合剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発切断剤とコンジュゲートしてよい。最後にオリゴヌクレオチドは、検出可能に標識され、それによりその標識が別の試薬、例えば酵素標識に対する基質の添加により検出されるか、または、ヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に即座に検出される、例えば放射標識または蛍光標識、例えば米国特許５８７６９３０に記載の分子ビーコンとしてよい。
【０１２５】
本発明の別の特徴は、本発明のマーカー蛋白（またはその蛋白）をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書においては「ベクター」という用語はそれが連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を包含する。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これには別のＤＮＡ断片をライゲーションすることができる環状二重鎖ＤＮＡループも包含される。ベクターのもう１つの種類は別のＤＮＡ断片をウィルスゲノム内にライゲーションすることができるウィルスベクターである。特定のベクターはそれらが導入されている宿主細胞、例えば複製の細菌性の起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類細胞において自律複製できる。その他のベクター、例えば非エピソーム哺乳類ベクターは宿主への導入によりその宿主のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。更にまた、特定のベクターはそれらが支配可能に連結されている遺伝子の発現を意図することができる。このようなベクターは本明細書では「発現ベクター」と称する。一般的に組み換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターはプラスミドの形態である場合が多い。プラスミドは最も一般的に使用されている形態のベクターであることから、本明細書においては、「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用できるものとする。
【０１２６】
本発明の組み換え発現ベクターは宿主中の核酸の発現に適する形態の本発明の核酸を含み、このことは組み換え発現ベクターには発現すべき核酸配列に支配可能に連結されている発現のために用いるべき宿主に基づいて選択された調節配列１つ以上が含まれることを意味する。組み換え発現ベクター内部において、「支配可能に連結された」とは、対象となるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能とする態様で、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳系内、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞で調節配列に連結されていることを意味するものとする。「調節配列」という用語はプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素、例えばポリアデニル化シグナルを包含するものとする。このような調節配列は例えばＧｏｅｄｄｅｌのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列は宿主細胞の多くの種類におけるヌクレオチド配列の構成的な発現を意図するもの、および、特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列、例えば組織特異的調節配列の発現を意図するものを包含する。当業者の知るとおり、発現ベクターの設計は転写されるべき宿主細胞の選択、所望の蛋白の発現濃度等のような要因により異なる。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより本明細書に記載した核酸によりコードされる融合蛋白またはペプチドを含む蛋白またはペプチド、例えば、マーカー蛋白、マーカー蛋白の突然変異型、融合蛋白等を生産することができる。
【０１２７】
本発明の組み換え発現ベクターは原核細胞または真核細胞におけるマーカー蛋白の発現のために設計することができる。例えば、蛋白はＥ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウィルス発現ベクター使用）、酵母細胞または哺乳類細胞中で発現することができる。適切な宿主細胞は更に、ＧｏｅｄｄｅｌのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。或いは、組み換え発現ベクターは例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳することができる。
【０１２８】
原核生物における蛋白の発現は融合蛋白または非融合蛋白の何れかの発現を意図した構成または誘導プロモーターを含むベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて最も頻繁に行なわれている。融合ベクターは、多くのアミノ酸をそこにコードされる蛋白に対し、通常は組み換え蛋白のアミノ末端に対して付加する。このような融合ベクターは典型的には３つの目的、即ち、１）組み換え蛋白の発現を増大させるため、２）組み換え蛋白の溶解度を増大させるため、および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組み換え蛋白の精製に寄与するために機能する。多くの場合、融合発現ベクターにおいては、原核細胞の切断部位が融合部分と組み換え蛋白との接合部において導入され、これにより融合蛋白の精製の後の融合部分からの組み換え蛋白の分離が可能となる。このような酵素およびその同属認識配列はＸａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。典型的な融合発現ベクターにはｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８），Ｇｅｎｅ，６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が包含され、これらはそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白または蛋白Ａを標的組み換え蛋白に融合させる。
【０１２９】
精製された融合蛋白はマーカー活性試験、例えば後に詳述する直接試験または競合試験において、或いは、例えばマーカー蛋白に特異的な抗体を生成するために利用することができる。
【０１３０】
適切な誘導非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ等、（１９８８），Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ等、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９）が包含される。ＰＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現はハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存している。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は同時発現ウィルスＲＮＡポリメラーゼにより媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーター（Ｔ７ｇｎｌ）からの転写に依存している。このウィルスポリメラーゼはＬａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にＴ７ｇｎｌ遺伝子を与えるレジデントプロファージから宿主細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により与えられる。
【０１３１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組み換え蛋白の発現を最大限とするための１つの方法は組み換え蛋白を蛋白分解的に切断する能力が損なわれている宿主細菌において蛋白を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０），１１９−１２８）。別の方法は、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を、各アミノ酸に対する個別のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて好適に利用されるように変化させることである（Ｗａｄａ等、（１９９２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。このような本発明の核酸配列の変化は標準的なＤＮＡ合成方法により行なうことができる。
【０１３２】
本発明の別の特徴は、組み換え発現ベクター内に本発明の核酸分子を導入された宿主細胞、または、宿主細胞のゲノムの特定の部位に相同的に組み込むことを可能とする配列を含む本発明の核酸分子に関する。「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」とは、本明細書では互換に使用する。このような用語は特定の対象となる細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すものとする。特定の修飾は突然変異または環境の影響により連続した世代において起こる場合があるため、このような子孫は実際は、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用する用語の範囲にはなお包含されるものとする。
【０１３３】
宿主細胞は原核細胞または真核細胞の何れであることもできる。好ましくは、宿主細胞は原核細胞である。例えば、本発明はＥ．ｃｏｌｉのような細菌細胞中で発現させることができる。他の適切な宿主細胞は当業者の知るとおりである。
【０１３４】
ベクターＤＮＡは従来の形質転換法またはトランスフェクション法により宿主細胞に導入することができる。本明細書においては「形質転換」と「トランスフェクション」という用語は外来の核酸、例えばＤＮＡを宿主細胞に導入するための当該分野で知られた種々の方法を指すものとし、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム同時沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを包含する。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションのための適切な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）および他の実験マニュアルに記載されている。
【０１３５】
培養における宿主細胞のような本発明の宿主細胞は組み換え蛋白の製造、即ち発現のために使用できる。従って、本発明は更に本発明の宿主細胞を用いて蛋白を製造するための方法を提供する。１つの実施態様において、方法は、本発明の蛋白が製造されるような適切な培地中で本発明の宿主細胞（蛋白をコードする組み換え発現ベクターが導入されているもの）を培養することを包含する。別の実施態様においては、方法は更に培地または宿主細胞から蛋白を単離することを包含する。
【０１３６】
当然ながら、当業者は上記した実施態様に基づいて本発明の別の特徴や利点を知ることができる。従って本発明は、請求項により示されたものを除き、特に提示または記載したものにより制限されないものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）はＭＤＶ ＲＮＡの二次構造の１つの実施態様を示し、（ｂ）はＭＤＶ ＲＮＡの二次構造の第２の実施態様を示す。
【図２】ＭＮＶ ＲＮＡの二次構造を示す。
【図３】ＭＮＶ：ＡＰ１ ＲＮＡの二次構造を示す。
【図４】ＭＮＶ−１ ＲＮＡの二次構造を示す。
【図５】ＭＮＶ−２ ＲＮＡの二次構造を示す。
【図６】ＲＱ１１＋１２ＲＮＡの二次構造を示す。
【図７】ＭＮＶおよびＰｒＰ−Ａｍｐの増幅を示すゲルである。
【図８】（ａ）はＭＮＶおよびプリオン蛋白に結合するＰｒＰ−Ａｍｐの特異性を示すゲルであり、（ｂ）は同じ結合データをグラフで示したものである。
【図９】プリオン蛋白の２つの結合部位を示す模式図である。
【図１０】ＰｒＰ−ＡｍｐとＡＰ１またはＭＮＶの何れかとの間の競合的結合データを示すグラフである。
【図１１】ＲＱ１１＋１２とＡＰ１十間の競合的結合データを示すグラフである。
【図１２】（ａ）ＡＰ１、（ｂ）ＭＮＶＬＯのヌクレオチド２２〜５３。（ｃ）ＭＮＶＵＰ，（ｄ）ＢＳ１５７７、（ｅ）ＭＮＶ、（ｆ）ＲＱＴ１５７、および（ｇ）ＲＱ１１＋１２の二次構造を示す。
【図１３】ＲＮＡ−ＲＮＡゲルシフトである。
【図１４】ＡＰ１およびＮＭＶによるｈｒＰｒＰに結合するＭＮＶ：ＡＰ１およびＲＱ１１＋１２の競合的試験の結果を示すグラフである。
【図１５】（ａ）はｈｒＰｒＰのトポロジー、（ｂ）は切断されたｈｒＰｒＰへのＲＮＡの結合のデータのグラフである。
【図１６】ＲｎａｓｅＡ保護試験の結果である。
【図１７】ＲＱ１１＋１２がＰｒＰに特異的に結合することを示すデータであり、（ａ）はフィルター結合試験の結果であり、（ｂ）はゲルシフト試験の結果である。
【図１８】（ａ）ｈｒＰｒＰ、（ｂ）ｈｒＰｒＰおよびＲＱ１１＋１２ＲＮＡを有した場合の電子顕微鏡写真を示す。
【発明の属する技術分野】
（関連出願）
本出願は２００１年５月３１日に出願された暫定出願６０／２９４，８２２２の利益を請求する。
【０００２】
本発明は蛋白と相互作用させるために用いる組成物および方法に関する。特に本発明は組織内の蛋白凝塊またはプラーク形成に関与すると推測される蛋白と相互作用させるために使用する組成物および方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
本質的に生細胞中に存在する核酸には２つの種類が存在する。１つはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、もう１つはリボ核酸（ＲＮＡ）である。正常な生理学的条件下では、これらの核酸分子の双方が蛋白と会合している。これらの蛋白にはスカフォールド蛋白、酵素、リガーゼ、テロメラーゼ等が包含される。このような核酸結合蛋白は正常な代謝および細胞／組織の生存性のために必要な機能を果たす。
【０００４】
ＲＮＡ結合蛋白（ＲＮＰ）の有意な部分が遺伝子発現の翻訳後の調節を媒介する。ヘテロ核酸ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）は蛋白コード遺伝子の一次転写物である。これらの転写物（ｈｎＲＮＡ）は真核生物の細胞の核内でプロセシングされ、このようなｈｎＲＮＡの少なくとも一部はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）となる。転写複合体からｈｎＲＮＡが出現した時点から、それらが核内にある時間を通じて、それらはｈｎＲＮＡ蛋白と称される蛋白と会合している。この蛋白ファミリーの構成員は、前ｍＲＮＡプロセシングおよびｍＲＮＡ局在化、翻訳および安定を含むｍＲＮＡの代謝の間の複数の段階に必要である。ＲＮＡと会合した蛋白の大部分はｈｎＲＮＡとｈｎＲＮＡ中のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡの複合体と会合していると考えられる。
【０００５】
しかしながら、幾つかの疾患の過程にはＲＮＡ媒介蛋白凝塊の形成が関与していると考えられる。このような凝塊は神経細胞死および脳の消耗病と関わりがあることが解かっている。特定の神経細胞死および脳消耗症候群に関与している場合が多い海綿状脳障害は切開により顕在化する蛋白プラークまたは凝塊を有するという特徴がある。海綿状脳障害においては、プリオンが病因物質であると考えられている。プリオン型の疾患は蛋白凝塊に関与する「感染性蛋白」によるものである。
【０００６】
これらの蛋白凝塊病は特定のＲＮＡ分子と関係があると考えられている。例えばウィルスＲＮＰおよびその付随するＲＮＡおよび蛋白の成分はウィルス病原性（例えばＨＩＶ、デングウィルス等）に関与する疾患過程の多くを特徴付ける。このことに鑑み、細菌およびウィルスのＲＮＰ複合体は興味深い診断標的であると考えられる。
【０００７】
病原性の凝塊過程に関与する蛋白の検出において用いることができる組成物および方法が現在必要とされている。
【０００８】
【発明が解決する課題】
本発明は蛋白と相互作用させるために用いる組成物および方法に関する。特に本発明は組織、特に脳組織内の蛋白凝塊またはプラーク形成に関与すると推測される蛋白と相互作用させるために用いる組成物および方法に関する。
【０００９】
【課題を解決する手段】
本発明の組成物は凝塊蛋白少なくとも１つに対して親和性を有する１つ以上の核酸分子、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含んでいる。ＲＮＡまたはＤＮＡ成分はヌクレオチド塩基２０個以上を有する天然または非天然の分子である。（「非天然」という用語は、自然にはあり得ない純度または工程において組成物が使用されることを指すべく意味するものとする。）この核酸分子のヌクレオチド配列の部分の少なくとも１つは凝塊核酸結合蛋白中に存在するコンセンサス配列少なくとも１つに対して親和性を有する。１つの実施態様においては、凝塊蛋白に対する親和性を有するＲＮＡの部分はＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られる配列、またはこれらの組み合わせに由来する配列である。
【００１０】
本発明のコンセンサス配列はヘアピンループ、バルジ（ｂｕｌｇｅ）ループ、内部ループ、または一重鎖領域のような一重鎖ＲＮＡの二次構造要素を認識する蛋白中に存在するＲＮＡ結合モチーフを指す。大部分のＲＮＡ結合蛋白（ＲＮＰ）はＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）１つ以上および他の蛋白との相互作用を媒介する別のドメインを有するモジュラー構造を有する。ＲＮＰモチーフの特質はアミノ酸約百〜数百個よりなるＲＢＤから約３０アミノ酸の位置にあるコンセンサス配列である。ＲＮＡ結合に関与するアミノ酸の大部分はβ−プリーツシート内に位置する。ＲＢＤのこのような構造要素はＲＮＡの結合相手となる露出したプラットホームを与えると考えられる。ＲＮＡは、結合時には（折り込み部やポケット部に埋没するのではなく）曝露された状態で残存し、他の細胞因子に接触可能となる。多くのＲＮＰが複数のＲＢＤを含んでおり、このため、１つより多いＲＮＡ分子に同時に結合できるのである。
【００１１】
本明細書においては、「親和性」という用語は誘引性または結合能力を示すという意味を有する。特異的親和性は分子の特定の性質または配列を指向した誘引性である。
【００１２】
本発明の方法は、試料マトリックス内の凝塊蛋白１つ以上の存在を検出することを意図している。親和性複合体はプローブ１つ以上に試料マトリックスを接触させることにより形成される。本実施態様のプローブは本発明の核酸組成物である。
【００１３】
本発明の方法のプローブは凝塊蛋白の少なくとも１つに対する親和性を有する核酸分子を１つ以上含む。ＲＮＡまたはＤＮＡ成分はヌクレオチド塩基２０個以上を有する天然または非天然の分子である。この核酸分子のヌクレオチド配列部分の少なくとも１つは凝塊核酸結合蛋白中に存在するコンセンサス配列少なくとも１つに対して親和性を有する。１つの実施態様によれば、凝塊蛋白に対して親和性を有するＲＮＡの部分はＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡＲ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られる配列、またはこれらの組み合わせに由来する。
【００１４】
本発明の方法は形成された何れかの親和性複合体の検出を含む。親和性複合体の検出はもとの試料マトリックス中に存在する凝塊蛋白１つ以上の存在を示す。
【００１５】
試料マトリックス内の凝塊蛋白の１つ以上の存在または非存在を調べるためのキットも本明細書に開示する。キットはプローブ１つ以上を含む。これらのプローブはヌクレオチド２０個以上を有する天然または非天然のＲＮＡおよび／またはＤＮＡを含み、ここでヌクレオチドの配列部分の少なくとも１つは凝塊蛋白の１つ以上に対する親和性を有する。１つの実施態様において、プローブの親和性配列部分はＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られるヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはこれらの組み合わせに由来する。本発明のキットは本発明の方法と組み合わせて使用することを意図している。
【００１６】
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は凝塊蛋白に対する親和性を有する増幅可能な核酸抗体に関する。本発明はまた本発明の組成物を用いてこのような蛋白と相互作用させるために用いる方法に関する。更にまた試料マトリックス中の凝塊蛋白の存在または非存在を検出するためのキットに関する。
【００１７】
蛋白は核酸、即ちＤＮＡまたはＲＮＡの何れかに結合する。この結合は核酸により推測される二次構造により促進される場合が多い。例えば、ヌクレオチドのループおよびバルジは蛋白結合に関与する場合が多い。蛋白凝塊はこのような核酸結合により促進することができる。凝塊蛋白に対する親和性を有する核酸の単離および定性は蛋白凝塊に関与する疾患を解明し、治療する際の助けとなる。本発明はこのことを目的としている。
【００１８】
ＲＮＡに結合する蛋白（以降、本明細書においてはＲＮＰと称する）は典型的にはＲＮＡ結合モチーフを有する。適切な条件下、ＲＮＰは特定のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列とは無関係に蛋白により認識される全体的な特徴を有する核酸に非特異的に結合する。核酸のこれ以上の高次構造は蛋白に結合認識を与えると一般的に考えられている。例えば、ＲＮＡはＲＮＰと結合するために用いる構造モチーフとして機能する二次構造様ループをプロセシングすることが解かっている。この考え方は、単に特定の蛋白に結合するＲＮＡ分子の一次ヌクレオチド配列を求め、ループのような特定の二次構造のヌクレオチド配列を変化させる事によりその構造をノックアウトし、突然変異したＲＮＡと蛋白との間の結合能力を測定することによる分析法と矛盾していない。
【００１９】
ストリンジェントなｉｎ ｖｉｔｒｏの試験によればヘテロ核ＲＮＡ結合蛋白（ｈｎＲＮＰ）は特定のＲＮＡ配列に対して様々な好適度を有することがわかっている。１つの試験では２Ｍ ＮａＣｌ条件下種々のＲＮＡへの種々のｈｎＲＮＡの結合を調べたところ、ｈｎＲＮＰはそれらが好適とするＲＮＡに対して照準設定（ｓｔｒｉｋｉｎｇ）能力を有することが判明した。これらの試験によれば、種々のｈｎＲＮＰおよび見かけ上は別のＲＮＰは種々のＲＮＡを識別できることが解かった。この識別特性は種々のグループのＲＮＰの単離、精製および分類において利用されている。
【００２０】
ＲＮＰの分子構造様式はｈｎＲＮＰを用いて詳細に研究されている。しかしながら、ｈｎＲＮＰ系を調べることにより得られる一般的な原理は他のＲＮＰにも適用される。大部分のＲＮＰはＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）１つ以上および他の蛋白との相互作用を媒介する特殊なドメインを有するモジュラー構造を有する。ＲＮＰにおけるＲＢＤの特質は約３０個のアミノ酸の列により相互に分断されている個々のコンセンサス配列である。ＲＮＡの結合に関与するアミノ酸の大部分はβプリーツシート中に位置している。ＲＢＤのこのような特定の構造を有する要素はＲＮＡ分子が結合できるプラットフォームとして機能することのできる露出した表面を与えると考えられる。ＲＮＡは結合時には（蛋白のポケット部に埋没するのではなく）曝露された状態で残存し、他の蛋白に接触可能となる。多くのＲＮＰが１つより多いＲＢＤを含んでおり、このため、同時に複数のＲＮＡ配列に結合したり、複数のＲＮＡ分子に対して相互作用を示すことができる。
【００２１】
ＲＮＡおよびＲＮＰとの間の相互作用は、それらの相互の親和性および特異性の点において、抗体とその対応する認識抗原との間の相互作用と類似していると考えられる。本発明はこの類似系に基づいている。本発明のＲＮＡ組成物はその親和性が凝塊蛋白１つ以上に対するものである抗体のように機能する。これらの抗体様ＲＮＡ組成物は本明細書においては「アンプリボディー」と称する。アンプリボディーは本質的には核酸抗体である。「アンプリボディー」という用語は同じ機能を有するＤＮＡ分子も指すものとする。これらのアンプリボディーは分子生物学で開発された方法により増幅可能である。これらの核酸抗体またはアンプリボディーは如何なる数の標的も指向することができる。例えば、アンプリボディーは海綿状脳障害のような神経学的疾患に関与するプリオン蛋白を指向することができる。アンプリボディーは当該分野でよく知られた方法により当業者が挿入することのできる人工、合成のヌクレオチド配列を含むことができる。
【００２２】
上記した通り、アンプリボディーはＲＮＡ依存性ＲＡＮポリメラーゼを用いて増幅することができる。本発明の１つの実施態様においては、ポリメラーゼはＱ−Ａｍｐである。Ｑ−ＡｍｐはＱ−ベータレプリカーゼ由来である。Ｑ−ベータレプリカーゼはＱ−ベータバクテリオファージから単離精製することができる。バクテリオファージはプラス鎖ＲＮＡを含む。このプラス鎖はウィルス蛋白合成のためのｍＲＮＡとして、および、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｑ−ベータレプリカーゼのための鋳型としての双方の機能を有する。プラス鎖および他のコファクターの存在下、酵素Ｑ−ベータレプリカーゼは相補的なマイナス鎖ＲＮＡを合成する。次にマイナス鎖はプラス鎖合成のための鋳型として機能する。Ｑ−ＡｍｐはＱ−ベータレプリカーゼ由来であり、真核生物伸長因子Ｔｓ（Ｅｆ−Ｔｓ）、真核生物伸長因子Ｔｕ（Ｅｆ−Ｔｕ）、Ｓ１ヌクレアーゼおよびレプリカーゼ成分を含む。（Ｑ−ＡｍｐはＱ−ＲＮＡ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋより入手可能である。）Ｑ−Ａｍｐは特異的なＲＮＡ鋳型を認識し、そして等温条件下１５分でそれらを指数的に、例えば１０億倍にまで増幅することができる。Ｑ−Ａｍｐのための鋳型は特異的な機能用途を有する配列インサート、例えばアンプリボディーと凝塊蛋白との間の結合性を増大させる配列を含むことができる。当業者の知るとおり、Ｑ−ＡｍｐおよびＱ−ベータレプリカーゼ以外のレプリカーゼも使用して良く、本発明の範囲に包含されるものとする。
【００２３】
本発明のアンプリボディー組成物は凝塊蛋白の少なくとも１つに対して親和性を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子１つ以上を含む。核酸組成物はヌクレオチド塩基２０個以上を有する天然または非天然の分子である。１つの実施態様において、コのＲＮＡ分子のヌクレオチド配列部分の少なくとも１つは凝塊ＲＮＡ結合蛋白中に存在するコンセンサス配列少なくとも１つに対して親和性を有する。本発明において「コンセンサス配列」とはヘアピンループ、バルジループ、内部ループ、または一重鎖領域のような一重鎖ＲＮＡの二次構造要素を認識する蛋白中に存在するＲＮＡ結合モチーフを指す。本発明の１つの実施態様において、凝塊蛋白に対して親和性を有するＲＮＡポリヌクレオチドの部分は、ＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られる配列、またはこれらの組み合わせに由来する配列である。
【００２４】
「ウィルス」および「ファージ」という用語は本開示全体を通じて互換に使用され、「ウィルスおよびファージ」の意味を有するものとする。本発明１つの特徴において、ＲＮＡウィルスはレトロウィルスである。ＲＮＡウィルスはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ポリオウィルス、インフルエンザウィルス、スモールポックスウィルス、水痘（ｃｈｉｃｋｉｎ ｐｏｘ）ウィルス、ヘルペスウィルス、水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ）ウィルス、エプスタイン・バーウィルス、サイトメガロウィルス、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される。
【００２５】
本発明のＲＮＡ鋳型はＱ−ベータレプリカーゼ、Ｑ−ＡｍｐおよびＤＮＡまたはＲＮＡの核酸レプリカーゼにより受け取られ増幅されることのできるＲＮＡである。当業者の知るとおり、本発明のアンプリボディーを増幅するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＮＡｐｏｌ）は本発明の範囲に包含される。本発明の１つの実施態様において、ＲＮＡ鋳型はミディ（ｍｉｄｉ）変異ＲＮＡ（ＭＤＶ ＲＮＡ）、ミニ（ｍｉｎｉ）変異ＲＮＡ（ＭＮＶ ＲＮＡ）、ＭＮＶ−ＡＰ１ ＲＮＡ、ＭＮＶＵＰ ＲＮＡ、ＭＮＶＬＯ ＲＡＮ、ＲＱ ＲＮＡおよびこれらの組み合わせよりなる群から選択される。
【００２６】
ＭＤＶ ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）は下記の通りである。
ＭＮＶ ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）は下記の通りである。
ＭＮＶ ＡＰ１ ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号３）は下記の通りである。
ＭＮＶＵＰ ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）は下記の通りである。
ＭＮＶＬＯ ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号５）は下記の通りである。
ＲＮＡ配列はＲＮＡ配列についてコードしているＤＮＡを用いて得ることができる。ＤＮＡを適切なベクター内に入れ、当業者の知る方法を用いてベクターを適切な宿主にトランスフェクトすることができる。その後転写物を当業者の知る方法で単離することができる。
【００３２】
本発明の１つの特徴において、ＲＮＡｐｏｌ（レプリカーゼ）のためのこのような鋳型は凝塊蛋白に対する親和性を有するオリヌケレオチド配列少なくとも１つを有する。例えば、ＭＤＶ、ＭＮＶおよびＲＱ ＲＮＡ鋳型は一連のグアニンヌクレオチドをその対応する配列内に組み込んでおくことができる。ＲＱ１１＋１２がこのような鋳型である。ＲＱ１１＋１２に対するＲＮＡ配列（配列番号６）は以下の通りである。
本発明のＲＮＡは好ましくは、非ワトソンクリック対を特徴とするループまたはバルジ１つ以上を有する（図１〜６参照）。非ワトソンクリック対とはヌクレオチドが対になっていないか、または対が従来型のワトソンクリック塩基対ではない領域が存在するという以外は正常なワトソンクリック型塩基対である領域を指す。例えば、ヌクレオチドは同じヌクレオチド（例えばプリン−プリンまたはピリミジン−ピリミジン）とともに近接して保持される。好ましいバルジまたはループは一連、例えば４個連続のグアニンヌクレオチドの群を有する。このグアニンの様相はＲＮＡｐｏｌ内の認識配列に相当する場合が多い。例えばＲＱ１１＋１２は一連のグアニンヌクレオチドを与えるＲｅｖ蛋白結合部位およびサルシン認識部位に由来する配列を含む。Ｉｗａｉ，Ｓ．等、ＮＡＲ２０（２４）：６４６５−６４７２，１９９２が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
関与するポリヌクレオチド配列については絶対長の条件がある。しかしながら、好ましい範囲は約２０〜約１０，０００ヌクレオチドである。本発明のＲＮＡアンプリボディーを使用するための適切な長さのヌクレオチド配列は当業者が決定することができる。本発明のポリヌクレオチド配列はより長い鎖の核酸の内部に包埋されるか、または他の分子と会合していることができる。
【００３５】
個々の塩基対の相補的塩基対形成は一般的にアデニンがウラシル（またはＤＮＡの場合はチミン）と対になり、そして、グアニンがシトシンと対になるというＣｈａｒｇａｆｆの法則に従う。しかしながら、非従来型の塩基対形成を説明する修飾された塩基が存在する。修飾された核酸とは、本明細書においては化学的に修飾されたヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子を意味するものとする。「核酸類縁体」とは本明細書においては、従来の核酸との塩基対形成相互作用に関与できる「ＰＮＡ」またはモルホリノのような非核酸分子を意味するものとする。このような修飾された塩基および核酸類縁体は本発明の範囲内に包含されるものとする。例えば、デアザグアニンおよびウラシル塩基を含むヌクレオチドはそれぞれグアニンおよびチミンの代わりに使用することができ、これによりプローブの熱安定性を低減することができる。同様に５−メチル−シトシンはより高い熱安定性が望まれる場合に複合体中でシトシンの代替となることができる。糖部分の修飾も可能であり、本発明の範囲に包含される。例えばＲＮＡ分子のヌクレアーゼ感受性を低減するために用いることができる２’−Ｏ−メチル基の付加によるリボース糖部分の修飾が挙げられる。核酸骨格の種々の部分を用いて行なわれる修飾もまた本発明の範囲内に包含される。例えば、メチルホスフェート、メチルホスホネートまたはホスホロチオエート結合を用いてホスホジエステル骨格から負電荷を除去することが可能である。
【００３６】
本発明者等は同じ凝塊蛋白上の複数の結合部位を示す実験を実施した。これらの部位は種々のＲＮＡポリヌクレオチド組成物に対する親和性を有することがわかっている。試験した凝塊蛋白はプリオン蛋白（ＰｒＰ）であり、Ｗｅｉｓｓ， Ｓ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９７，Ｎｏｖ：７１（１１）：８７９０−７が参照でき、その内容全体が参考により本明細書に組み込まれる。２つのＲＮＡポリヌクレオチドを試験したが、その１つはＭＮＶ ＲＮＡであり、もう１つはＡＰ１ ＲＮＡ配列をその内部にクローニングされたＭＮＶ ＲＮＡである（Ｗｅｉｓｓ等参照）。クローニングされたＭＮＶ ＲＮＡはＰｒＰアンプリボディー（ＰｒＰ−Ａｍｐ）と称する。
【００３７】
ＰｒＰ−Ａｍｐを増幅する能力をＱ−Ａｍｐを用いて調べた。増幅に適する条件下、ＭＮＶとＰｒＰ−Ａｍｐを個々にＱ−Ａｍｐに付した。図７はＭＮＶに添ってＰｒＰ−ＡｍｐをＱ−Ａｍｐレプリカーゼにより増幅できることを示すデータを示している。Ｑ−Ａｍｐ増幅のための適切なプロトコルの例は２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭジチオスレイトール、２００ μＭ ｒＮＴＰおよび２００ｎＭレプリカーゼを含有する８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５である。２０μＬの反応溶液中、ＲＮＡを添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。ある状況下では、１μＬ［α−Ｐ３２］ＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加することにより初期のＲＮＡを標識する。或いは増幅産物の検出はこれらをポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、例えばＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲより入手）を用いてゲル中の核酸を染色することにより行なう。
【００３８】
次にＰｒＰ−Ａｍｐの結合特異性を調べ、ＭＮＶと比較する。図８ａは結合データを示す。この図を十分理解するために、この実験において２つの膜を用いた理由に留意しなければならない。Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９７，Ｎｏｖ：７１（１１）：８７９０−８７９７が参照でき、その内容全体が参考により本明細書に組み込まれる。蛋白および結合ＲＮＡはＰＶＤＦ膜に結合させる。結合したＲＮＡは蛋白に結合するＲＮＡである。遊離または未結合のＲＮＡはＰＶＤＦ膜を通過し、ナイロン膜に結合する。従って、ＲＮＡが標識され、蛋白と結合しない場合、これはＰＶＤＦ膜を通過し、遊離の標識ＲＮＡが結合しているナイロン膜からシグナルが発せられる。逆に、標識されたＲＮＡが蛋白と結合すれば、シグナルはＰＶＦＤ膜から発せられる。ＰｒＰ−Ａｍｐに関しては、２つのシグナルがＰＶＤＦ膜上に観察され、このアンプリボディーがプリオン蛋白に結合することがわかり、さらにｔＲＮＡの存在がこの結合に影響しないこともわかる。ＰｒＰ−Ａｍｐと異なり、プリオン蛋白へのＭＮＶの結合はｔＲＮＡの存在に影響される。ｔＲＮＡの存在下、標識されたＭＮＶ ＲＮＡはＰＶＤＦ膜を通過し、ナイロン膜に至るので、ｔＲＮＡ存在下でプリオン蛋白への結合がないことが示される。図８ｂは図８ａに示したものと同じデータであるが、ただし図８ｂではグラフにより示した。表１に示した結合解離定数（ｋｄ）は（ａ）プリオン蛋白へのＰｒＰ−Ａｍｐの結合はｔＲＮＡの存在とは無関係であるが、ＭＮＶの結合はｔＲＮＡの存在下で劇的に減少したこと、および（ｂ）ＰｒＰ−Ａｍｐはプリオン蛋白に対して高い親和性を有することを定量的に示している。
表１
この表によれば明らかに、ＰｒＰ−Ａｍｐの結合は極めて安定であるのに対しＭＮＶの結合安定性はｔＲＮＡの存在または非存在に依存している。
【００４０】
上記の結合データはプリオン蛋白上の結合部位は少なくとも２つ存在することを示唆している。図９によれば、先ずｔＲＮＡ非存在下でＭＮＶが結合する低親和性部位が存在する。また、ＰｒＰ−Ａｍｐが結合する高親和性部位が存在する。
【００４１】
この複数の結合の理論について更に、競合試験により検討した。プリオン蛋白に対するＰｒＰ−Ａｍｐの結合をＡＰ１またはＭＮＶの何れかを用いて妨害した。図１０によれば、ＡＰ１は効果的にＰｒＰ−Ａｍｐ結合を抑制したが、ＭＮＶはＰｒＰ−Ａｍｐの結合に対しては僅かな作用を有するか、全く作用を有さなかった。即ちプリオン蛋白上には少なくとも二種のＲＮＡ結合部位があるはずである。
【００４２】
結合部位間の相違を明らかにするための道具としてｔＲＮＡを用いながら、他のＲＮＡがｔＲＮＡの存在下にプリオン蛋白に対して結合親和性を有するかどうか調べた。観察結果を表２にまとめた。
表２
ＲＱ１１＋１２に対する好ましいＫｄ値に基づいて、次に存在下または非存在下のプリオン蛋白に対する結合を調べた。表３はそのデータを示す。表３に示されたデータによれば、ｔＲＮＡ非存在下におけるプリオン蛋白へのＲＱ１１＋１２の結合はｔＲＮＡ存在下の結合と比較して約４倍堅固であることがわかる。
表３
ＲＱ１１＋１２の結合を更に調べるために、ＡＲ１ ＲＮＡを用いてＲＱ１１＋１２のプリオン蛋白への結合に競合させた。図１１はＡｐ１が効果的にＲＱ１１＋１２の結合を抑制することを示している。このデータはまたＲＱ１１＋１２がプリオン蛋白の高い親和性部位に結合していることを示している。
【００４５】
即ち更に呈示したデータによれば、高親和性部位への結合には特異的ＲＮＡ構造要素の存在が必要であることが示唆される。高親和性部位への安定な結合（ｔＲＮＡ存在下）のためのＲＮＡの構造要素を調べるために、発明者等はプリオン蛋白への他のＲＮＡの結合を調べた。ＭＮＶ由来のＲＮＡをこの実験のために選択した。ＭＮＶ誘導体は２０ヌクレオチドのランダムインサートを含んでいた。表４は実験で得られたデータを示している。データによれば、同じ長さであるが二次構造が異なるＲＮＡの間で高親和性部位への結合に大きな多様性があることが解かる。恐らくは、単一の幹部の構造における多様性が高親和性部位への結合の相違を説明できると思われる。従って、高親和性部位への堅固な結合を発生させている特異的ＲＮＡ構造要素が存在すると考えられる。
表４
本発明の方法は試料マトリックス内の凝塊蛋白の１つ以上の存在または非存在を検出することを目的としている。親和性複合体は本発明のプローブ１つ以上に試料マトリックスを接触させることにより形成する。「接触」という用語は本明細書においては混合物を形成することと矛盾しない方法において２種以上の物質を共存させることを意味するものとする。本実施態様のプローブは本発明のアンプリボディーを含む。
【００４７】
本明細書においては、「試料マトリックス」とは蛋白を含有するいかなる試料も包含する。例えば、血液、尿、他の体液、細胞、細胞抽出液、組織および組織抽出液（特に神経学的組織）が本発明の範囲に包含される。
【００４８】
本発明のアンプリボディープローブは凝塊蛋白の少なくとも１つに対して親和性を有する核酸アンプリボディー分子１つ以上を含む。１つの実施態様においてはＲＮＡポリヌクレオチド成分はリボヌクレオチド塩基２０個以上を有する天然または非天然の分子である。このＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも１つは凝塊ＲＮＡ結合蛋白の存在下コンセンサス配列の少なくとも１つに対して親和性を有する。本実施態様においては、凝塊蛋白に対する親和性を有するＲＮＡの部分はＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡＲ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られる配列、またはこれらの組み合わせに由来する配列である。
【００４９】
アンプリボディーの調製はアンプリボディーの均質な回収である。この均質な調製はモノクローナル抗体の調製と同様である。或いは、アンプリボディーの調製は抗体のポリクローナル調製と同様に異種であることができる。
【００５０】
本発明の方法はまたアンプリボディーの異種回収を用いることを包含する。この回収とは同じかまたは異なる凝塊蛋白上の種々の結合部位に対する親和性を有する種々のアンプリボディーを指す。アンプリボディーの異種回収物は試料マトリックスに導入される。親和性複合体は単一の凝塊蛋白と凝塊蛋白に添った種々の部位において結合した種々のアンプリボディーとの間に形成することができる。更にまた、親和性複合体は１つの試料マトリックス内に存在する種々のアンプリボディーと種々の凝塊蛋白との間に形成することもできる。
【００５１】
本発明の方法は形成された如何なる親和性複合体の検出も包含する。親和性複合体の検出はもとの試料マトリックス中に存在する凝塊蛋白の１つ以上の存在を示すものである。親和性複合体の検出は質量または密度の測定、質量スペクトル分析、プラズモン共鳴、光学的発光または吸光、蛍光、りん光、ルミネセンス、化学ルミネセンス、ポーラリゼーション、屈折率の変化、電気伝導度、放射能、粘度、濁度および旋光度よりなる群から選択される方法により行なわれる。
【００５２】
アンプリボディープローブの１つ以上を標識することができる。標識はイオン結合、共有結合または吸着を介して結合させることができる。好ましくは、標識は目的の配列を含むが凝塊蛋白への結合を妨害しないアンプリボディーポリヌクレオチドの何れかの領域に対して共有結合させる。標識としては、例えば、放射性同位体、例えば放射性リン原子、親和性試薬、例えばビオチン、インターカレーション蛍光染料またはアンプリボディーに結合した蛍光部分、りん光染料またはキレート、質量スペクトル分析で検出するための電子団（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ）、化学ルミネセンス発色団が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５３】
Ｐｈｏｔｏｄｙｏｄ Ａｒｒａｙ（ＰＤＡ）検出器を用いながら、如何なる標識自体も用いずにスペクトル分析を行うことができる。親和性複合体（並びにアンプリボディー）はＰＤＡ検出器を用いてその独特のスペクトル像によりモニタリングし、検出することができる。複合アンプリボディー（凝塊蛋白との複合体）からの遊離のアンプリボディーの分離は、当業者の知る方法を用いて、例えばサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー、濾過、電気泳動等を用いて行なうことができる。
【００５４】
本発明はまた固定化されたアンプリボディープローブの１つ以上を用いた試料マトリックス内の凝塊蛋白の１つ以上の検出方法に関する。本実施態様においては、ＲＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つを固相表面に固定化する。固定化されたポリヌクレオチドはアンプリボディーであることができるが、また、アンプリボディーである第２のＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズすることもできる。この方法はまた、異なる凝塊蛋白に対する親和性を有する各アンプリボディー、または、同じ凝塊蛋白上の異なる部位に対する親和性を有する各アンプリボディーまたはこれらの組み合わせであるアンプリボディーの異種回収も意図している。
【００５５】
本実施態様の１つの特徴において、第２のポリヌクレオチド（アンプリボディー）に対して適切な条件下でハイブリダイズするために十分な配列を有する第１のポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡの何れであることもできる）を表面に固定化する。米国出願０８／９７１，８４５；０６／０１６，７０８；および０８／８１２，１０５が参照でき、その内容は全て参考により本明細書に組み込まれる。固定化に用いる第１のポリヌクレオチドの部分は第２のポリヌクレオチド（またはアンプリボディー）にハイブリダイズさせるために用いる配列の領域とは異なる。本発明のこの特徴において方法は順次、または単一の段階として行なうことができる。第１に試料マトリックスをアンプリボディと凝塊蛋白の相互作用により親和性複合体が形成されるのに適する条件下、適切なアンプリボディー混合物、即ちアンプリボディーの同種または異種の混合物の何れかと試料マトリックスを混合する。この段階の後、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションに適する条件下、表面に固定化された第１のポリヌクレオチドと親和性複合体と推定されるものを混合することができる。第２に、第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第１のポリヌクレオチドから形成されたハイブリダイゼーション複合体と試料マトリックスを混合するが、その際第１のポリヌクレオチドは表面に固定化されている。このような条件下、親和性複合体の形成は固定化されたアンプリボディーと共に起こる。好ましくは、如何なる遊離の親和性複合体も、固定化された第１のポリヌクレオチドとの第２のポリヌクレオチド（アンプリボディー）凝塊複合体のハイブリダイゼーションにより、最終的には固定化される。
【００５６】
本実施態様の別の特徴において、固定化されたアンプリボディーは凝塊蛋白との相互作用のためのアンプリボディーの能力に影響しないポリヌクレオチドの領域を用いて表面に固定化される。凝塊蛋白は固定化されたアンプリボディーと親和性複合体を直接形成する。
【００５７】
表面支持体のような固相表面への核酸の結合手段は単なる吸着であることができる。好ましくは、結合は核酸と支持体表面に会合している何らかの化学的部分、例えばアミンまたはカルボキシル基またはアクリルアミドとの間の共有結合を介して行なわれる。化学的な交差結合を用いて核酸を表面に固定化することができる。このような化学的交差結合剤の例はカルボジイミド（例えば１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）であり、これは核酸の５’末端上のホスフェート基を支持体表面上のアミン基と結合するために用いることができる。更にまた、イオン相互作用もまた核酸のこのような固定化を促進することができる。結合は核酸と表面との間に直接、または、核酸と表面との間に中間分子を置くなど間接的に行なうことができる。中間分子は特に厳密な長さを有する必要はない。
【００５８】
親和性試薬はまた表面への核酸の固定化のために用いることもできる。例えば同属の部分を含む表面にアビジンまたはビオチン部分を運ぶ核酸はその表面に核酸を結合させる。親和性に基づいた固定化法を用いる別の例は親和性リガンド、例えばビオチンまたはアビジンに目的の核酸を同時広範囲に連結させることである。例えばビオチンがリガンドである場合はアビジンが同属受容体となる、リガンドに対する同属受容体は磁気粒子をそれに結合させて保有する。磁場が表面に適用されると、磁気粒子はそれに結合しているものと共に表面に固定化されるのである。
【００５９】
支持体マトリックスは、ビーズまたは粒子、棒、繊維、容器、薄層プレート、膜、ゲル様ポリアクリルアミド、澱粉、アガロース、セルロースまたは他の重合体ゲルの形態のクロマトグラフィー支持体であることができる。
【００６０】
試料マトリックス内の凝塊蛋白の１つ以上の存在または非存在を測定するためのキットも本明細書に開示する。キットはアンプリボディープローブの１つ以上を含む。これらのプローブはヌクレオチド２０個以上を有する非天然のＲＮＡを含み、個々でヌクレオチドの配列部分の少なくとも１つは凝塊蛋白に対する親和性を有する。１つの実施態様において、アンプリボディーの親和性配列部分はＲＮＡウィルス、ＲＮＡファージ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られるヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡＲ、またはこれらの組み合わせに由来する。実際は本キットは本発明の方法を用いる。
【００６１】
１つの実施態様において、キットは、各々が凝塊蛋白上の異なる部位に結合するアンプリボディーの少なくとも２つを有している。本実施態様におけるアンプリボディーの少なくとも１つは従来の方法により検出することのできる標識を有している。特定の特徴において、キットのアンプリボディーの１つは固相に固定化されている。この特定の特徴における別のアンプリボディーは凝塊蛋白に対する親和性を有することができ、固定化されたアンプリボディーにハイブリダイズする能力を有する。本発明のこの特定の特徴において、好ましくは遊離のアンプリボディーを標識する。
【００６２】
キットは更に、アンプリボディーの１つ以上および凝塊蛋白の少なくとも１つを含む親和性複合体を、遊離のアンプリボディーから分離するための手段を有する。分離手段にはサイズベースの膜、濾過ユニットなどが包含されるがこれらに限定されない。
【００６３】
伝染性海綿状脳障害（ＴＳＥ）は中枢神経系（ＣＮＳ）に罹患する神経変性性の感染性疾患である。ＴＳＥにはヒツジスクラピー、ウシにおけるウシ海綿状脳障害（ＢＳＥ）およびクロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、Ｇｕｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群（ＧＳＳ），ヒトにおけるクールー病および致命的家族性不眠症（ＦＦＩ）が包含される（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，１９８２）。全てのこれらの致命的疾患に共通なものは、インキュベーション期間が長くアミロイド様の棒状物およびスクラピー関連のフィブリル（ＳＡＦ）の蓄積である。ＳＡＦの形成は感染性を伴う内因性で無害のＰｒＰＣのイソフォームであるＰｒＰＳＣの広範なフィブリル化の結果である。可溶性ＰｒＰＣから不溶性のＰｒＰＳｃイソフォールへの構造的変換が臨床的プリオン疾患の発症と進行を決定する。
【００６４】
ＰｒＰＣをコードする遺伝子は高度に保存されており、３５ｋＤＡの糖蛋白としてｐｒｎＰ座に構成的に発現される（Ｃｈｅｓｅｂｒｏ等、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３１−３３；Ｏｅｓｃｈ等、１９８５，Ｃｅｌｌ．４０：７３５−４６が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。翻訳されたＰｒＰＣの約半分は細胞外膜にプロセシングされ、ここでＣ末端グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーにより原形質幕に係留される。しかしながら、ＰｒＰＣはまた２つの膜貫通型としても存在しており、その１つはＥＲ管腔の内部のＮ末端（ＰｒＰＮｔｍ；４０〜５０％）に、そしてもう１つはＥＲ管腔の内部のＣ末端（ＰｒＰＣｔｍ；１０％）に逆方向で存在する。これらのプロセシングの差がこれらのＰｒＰＣ型の機能的特性を反映しているかどうかは不明である。
【００６５】
ＰｒＰ蛋白は興味深い構造的特徴、特にその生来の野生型立体配座のＰｒＰＣから感染性のＰｒＰＳＣへの通常でない変換を有している。蛋白の構造における変化は感染性を伴うイソフォームのＣ末端ドメインのベータシートに富む領域へαへリックスリッチのＰｒＰＣからの遷移により特徴付けられる（Ｐａｎ等、１９９３， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ９０：１０９６２−６６が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。幾つかの生化学的特色、例えば生理学的溶液中のＰｒＰＳｃの不溶性およびプロテイナーゼＫによる消化に対するそのＣ末端ドメイン（アミノ酸９０〜２３１）の耐性がイソフォームを特徴付けている。ＰｒＰの非プロテアーゼ処理完全長Ｎ末端の構造は極めて可撓性に富み、ＮＭＲ構造解析によれば単一の安定な構造は有していない。従って、ＰｒＰのこの領域は細胞およびスクラピーイソフォームの間で最も識別困難である。
【００６６】
核酸へのＰｒＰの結合は精製された蛋白を用いた直接のｉｎ ｖｉｔｒｏの複合体形成の観察を通じて、感染組織から分離したスクラピー関連フィブリル（ＳＡＦ）由来の核酸の同時精製により多数が明らかにされている（Ｍｅｒｚ等、１９８１，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）５４（１）：６３−７４が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。例えばＩＡＰのウィルスＲＮＡゲノムの数千塩基を感染組織からＳＡＦと共に同時精製している（Ｍｕｒｄｏｃｈ等、１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４（４）：１４７７−８６；Ａｋｏｗｉｔｚ等、１９９４，ＮＡＲ ２２（６）：１１０１−０７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。このような観察は、このような遺伝子的な関連性は現在まで実験的に明らかにされていないものの、核酸がＴＳＥの伝染における必要な遺伝子成分であるという可能性を調べる研究に影響した。ＰｒＰとウィルス成分との間のｉｎ ｖｉｖｏの関連性の間接的証拠はＰｒＰＳｃ形成速度がモロニーネズミ白血病ウィルスに感染した細胞において加速されるという観察結果である（Ｃａｒｐ等、１９９９，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ ８０（Ｐｔ１）：５−１０が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。更にまたＥ．ｃｏｌｉ中で発現される組み換え哺乳類ＰｒＰ蛋白を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏの試験から、ＰｒＰとウィルス核酸との間の相互作用の証拠もある。シリアンゴールデンハムスター組み換えＰｒＰＣ（ｓｒＰｒＰ）は意外にもＨＩＶ由来のヌクレオカプシド蛋白（Ｎｃｐ７）とｉｎ ｖｉｔｒｏの活性の相同性を有している（Ｔａｎｃｈｏｕ等、１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５２：５６３−７１；Ｇａｂｕｓ等、２００１ａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７（４）：１０１１−２１；Ｇａｂｕｓ等、２００１ｂ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２２）：１９３０１−９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ｓｒＰｒＰはＤＮＡ鎖転移、核酸シャペロニング、ＨＩＶ−ＲＴプライミングおよび縮合蛋白／核酸構造の形成のプロセシングにおいてＮｃｐ７と実質的に同じレベルの活性を有している。２重鎖ＤＮＡもまた同様に縮合されたＰｒＰ構造の形成並びにプロテイナーゼＫ消化に対する耐性を誘発する（Ｎａｎｄｉ，１９９８，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４３（７）：１２５１−６３；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９ Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４４（９）：１７５１−６３；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｓｉｚａｒｅｔ，２００１，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４６：３２７−４５が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。最近２つの小型ＲＮＡアプタマーがＰｒＰ蛋白に結合するその能力に基づいて単離された。１つのアプタマー、ＡＰ１（２９ｎｔ）は組み換えｓｒＰｒＰを用いて単離され、ｓｒＰｒＰへの結合において重要であることが示唆されている構造である３つのスタッキングＧ４カルテットを含むコンパクト構造に折り込まれていると予測されている（図１２ａ；Ｗｅｉｓｓ等、１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１１）：８７９０−９７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。一連のｓｒＰｒＰ切断を用いることにより、著者等はアミノ酸２３〜３９内に可変性Ｎ末端へのＡＰ１の結合を局在化させている。
【００６７】
プリオンのフィブリル化の開始および進行の特定の機序は十分理解されていない。これまでの研究においてＲＮＡまたはＤＮＡがプリオン疾患の伝染において遺伝的役割を果たすかどうか検討されていた（Ａｋｏｗｉｔｚ等、１９９４；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９；Ｃｏｒｄｅｉｒｏ等、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（５２）：４９４００−０９；Ｎａｒａｎｇ，１９９８，Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．１４９（６）：３７５−８２；Ｎａｒａｎｇ，２００２，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２２７（１）：４−１９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。
【００６８】
本発明者等はｈｒＰｒＰへのＲＮＡの結合の物理的な相互作用と影響に着目した研究を実施した。実験は実施例において後述する。
【００６９】
本発明の特性および他の詳細は実施例においてより特定して記載し、明確化する。本発明の特定の実施態様は例示を目的としており、本発明を限定するものではない。本発明の原則的な特徴は本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の実施態様において用いることができる。
【００７０】
（実施例）
プリオンのフィブリル化の開始および進行の特定の機序は十分理解されていない。これまでの研究においてＲＮＡまたはＤＮＡがプリオン疾患の伝染において遺伝的役割を果たすかどうか検討されていた（Ａｋｏｗｉｔｚ等、１９９４，ＮＡＲ，２２（６）：１１０１−０７；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９，Ａｒｃｈ．Ｖｉｏｌ．１４４（９）：１７５１−１７６３；Ｃｏｒｄｅｉｒｏ等、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（５２）：４９４００−０９；Ｎａｒａｎｇ，１９９８，Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．１４９（６）：３７５−８２；Ｎａｒａｎｇ，２００２，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２２７（１）：４−１９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。本試験においては発明者等はプリオンの伝染の遺伝的特徴ではなくｈｒＰｒＰへのＲＮＡの結合の物理的な相互作用と影響に着目した。このためｉｎ ｖｉｔｒｏの組み換えヒトＰｒＰ（ｈｒＰｒＰ）のＲＮＡ結合活性を特性化するために配列の明らかにされている小型ＲＮＡを使用した。得られた結果によれば、ｈｒＰｒＰはアミノ酸２３〜９０（Ｎ末端）に残存する小型ＲＮＡ分子種に対して高い親和性を有することが解かる。ＰｒＰとＲＮＡとの間の複合体形成の程度はＲＮａｓｅＡによる分解からＲＮＡ分子種を保護することにより明らかにされる。更にまた、非特異的競合物質であるＲＮＡの大過剰量の存在下でＨｒＰｒＰに堅固に結合するＲＮＡのクラスが発見されている。このクラスに属するものとして新たに報告されたＲＮＡであるＲＱ１１＋１２もまたマウス脳ホモジネート中の内因性ＰｒＰに特異的に結合してＲＮＡ−ＰｒＰ複合体を生成するする能力を示している。
【００７１】
本試験において使用される転写試薬（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ｒＮＴＰ、緩衝液）はＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）またはＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ）の何れかより入手した。Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＢＳＡおよびＮｕｃ−ＡｗａｙスピンカラムはやはりＡｍｂｉｏｎから、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｅｕｌｌ ０．４５μＢＡ８５ニトロセルロース膜はＶＷＲ（Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ，ＮＪ）より入手した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ （Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）からＰＶＤＦおよびＮｙｌｏｎ膜と放射性同位体を入手した。分析とＲＮＡ定量のために使用した核酸挿入染料ＲｉｂｏＧｒｅｅｎおよびＳＹＢＲ ＧｏｌｄはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｖｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）より入手した。一般的な塩類、緩衝液および電気泳動用製品はＶＷＲおよびＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。（組み換えヒトＰｒＰ２３−２３１、ＰｒＰ２３−１４４、ＰｒＰ９０−２３１はＭａｎ−Ｓｕｎ Ｓｙ，Ｃａｓｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより寄贈された。） ホモジネートはマウス全脳から調製した。野生マウスおよびＰｒＰノックアウトマウス（ＰｒＰ０／０）由来の１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の脳ホモジネートは以下に記載の通り調製した。脳を０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を添加したＰＢＳ９容量中でホモゲナイズした。遠心分離（１２０００ｘｇ、３０分）の後、上澄みを小分けにし、−７０℃で保存した。蛋白の濃度はＶＷＲから入手したＰｉｅｒｃｅ試薬を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ試験により測定した。
【００７２】
ＲＮＡの構築：
ＲＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ発生ＤＮＡ鋳型を用いて合成した。ＰＣＲ鋳型は５’末端にＴ７ポリメラーゼプロモーターを付加し、ランオフ転写により３’末端が定義されているプライマーを用いて配列決定されているプラスミドまたは合成のオリゴヌクレオチドの何れかから作成した。プラスミド鋳型の調製において用いた全てのＤＮＡクローニング工程は標準的な分子生物学の手法に従った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｖｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹが参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ＤＮＡクローニングでは典型的には合成オリゴヌクレオチドのアニーリング、次いでそれらの連結およびｐＵＣ１９へのクローニングを行なった。内部標識されたＲＮＡは用途に応じて種々の比活性で［α−３２Ｐ］ＧＴＰまたはＣＴＰを取り込むことにより行なった。本試験で使用したＲＮＡは全て、１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素変性ゲルからゲル精製し、その後ＩＢＩ Ｖ−チャンネル電子溶離装置を用いてＲＮＡを回収した。ゲル精製前、放射標識転写反応をＮｕｃ−Ａｗａｙスピンカラム（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行ない、一方未標識反応はフェノール：クロロホルム抽出、エタノール沈殿およびＴＥ中の再懸濁（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１ｍＭ ＥＤＴＡ）により行なった。ＲＮＡの濃度はＢｉｏＳｃａｎ ＸＥＲ−２００による同位体取り込み量の関数として、または、Ｓｅｑｕｏｉａ−Ｔｕｒｎｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４５０蛍光光度計を用いたＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）蛍光結合試験により、測定した。
【００７３】
ＭＤＶ、ＭＮＶ（Ｐｒｅｕｓｓ等、１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｏｃｔ．３１，２７３（３）：６００−１３ が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）およびＡＰ１（Ｗｅｉｓｓ等、１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｎｏｖ．７１（１１）：８７９０−８７９７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）のヌクレオチド配列および予測される二次構造は報告されている。５’→３’の方向に示した下記のＲＮＡは今回始めて報告するものである。
（１）ＡＰ４６（Ｇカルテット１つが除去されたＡＰ１）（配列番号７）
（３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ２３ＳｒＲＮＡの１５７７領域；Ａｓｈ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９２（配列番号９）
フィルター結合試験：
種々のＲＮＡリガンドに対するｈｒＰｒＰの結合親和性を本質的には文献記載の２フィルター結合法により測定した（Ｌｏｃｈｒｉｅ等、１９９７，ＮＡＲ ２５（１４）：２９０２−１０；Ｂａｔｔｌｅ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， ２００１， ＲＮＡ ７：１２３−３２が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。蛋白濃度（典型的には５０ｐＭ）より常に少なくとも１０倍低値の濃度の内部標識されたＲＮＡを、３７℃で３０分間、結合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ，ｐＨ７．５，２ｍＭ ＭｇＣｌ２，２５０ｍＭ ＮａＣｌ，１μｇ／μＬ ＢＳＡおよび２ｍＭ ＤＴＴ）中２０μＬ〜１００μＬの反応系において漸増量のｈｒＰｒＰとともにインキュベートした。ｔＲＮＡを存在させる場合は濃度は１０ｎｇ／μＬ（〜４００ｎＭ）とした。未標識のＲＮＡ（ｔＲＮＡ、競合体ＲＮＡ）はｈｒＰｒＰと共に１５分間インキュベートした後に、何れかの標識ＲＮＡを添加した。蛋白へのＲＮＡの結合の後、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｍｉｎｉｆｏｌｄ ＩＩ Ｓｌｏｔ Ｂｌｏｔハイブリダイゼーション装置を用いて、反応系を蛋白結合膜（ＰＶＤＦまたはニトロセルロース）、次いで核酸結合膜（陽荷電Ｎｙｌｏｎ）で真空濾過した。蛋白非含有の反応系もインキュベートして濾過することにより蛋白非存在下でフィルターに結合するＲＮＡの量を測定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ ８２０リン画像化装置およびプログラムであるＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてフィルターを画像化した。バックグラウンド値を差し引いた後、蛋白依存的にＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に結合したＲＮＡの存在を両方のフィルターのシグナル強度の合計で蛋白結合フィルターのシグナル強度を割ることにより求めた。結合したインプットＲＮＡの％を各ｈｒＰｒＰ濃度において少なくとも３回の測定の平均値として計算した。平均の標準偏差は常時インプットＲＮＡの２％未満であった。蛋白に結合したＲＮＡの％をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを用いて蛋白濃度に対してプロットした。見かけのＫｄ値は最大ＲＮＡ結合の５０％が起こる蛋白濃度として定義される。
【００７５】
ゲルシフト試験：
ｔＲＮＡゲルシフト実験は３０分間３７℃で結合緩衝液中で行なった。上記した通り、競合体ｔＲＮＡをｈｒＰｒＰを含有する反応系中で１５分間前インキュベートした。試料緩衝液（３０％グリセロール、０．０１％キシレンシアノール／ブロモフェノールブルー）２μＬを各試料に添加した後に４℃キャビネット中で泳動させる６％ポリアクリルアミド／ＴＢＥゲル上に適用した。ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【００７６】
マウス抽出液試験を用いたゲルシフト実験は遅延緩衝液（０．０５％デオキシコール酸および０．０５％ＮＰ−４０中、５０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．４，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＬｉＣＩ，１ｍＭ ＤＴＴ，１μｇ ｔＲＮＡおよび１μＬウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中総容量２０μＬ中で３２Ｐ標識ゲル精製ＭＮＶまたはＲＱ１１＋１２の何れか５０フェムトモルをインキュベートすることにより実施した。ＲＮＡおよび緩衝液に対し、ｈｒＰｒＰ、野生型マウスの脳抽出液、またはＰｒＰ０／０ノックアウトマウスの脳抽出液のいずれかを添加した。反応混合物を室温で２０分間インキュベートし、次に試料を４Ｍ尿素含有６％ポリアクリルアミドゲルに適用した。電気泳動はＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、ｐＨ８．３，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中室温で３５分間行なった。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに露光し、リン画像化分析により分析した。
【００７７】
ＲＮａｓｅＡ保護試験：
反応混合物（２０μＬ）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ中３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＮＡの濃度は５００ｐＭ、ｈｒＰｒＰの濃度は２０ｎＭであった。３０分後、反応混合物の濃度を１ｐｇ／μＬ ＲＮａｓｅＡに調節した。３７℃で更に１５分の後、等容量の泳動用緩衝液を添加し（９４％ホルムアルデヒド、４０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００１％ブロモフェノールブルー／キシレンシアノール）、即座に試料を加熱して９５℃で３分間保持し、その後即座に６％ＰＡ／７Ｍ尿素・ＴＢＥ変性ゲル上で分離した。画像の分析はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ ８２０ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒにより行なった。
【００７８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの小型ＲＮＡのｈｒＰｒＰへの結合：
ＰｒＰ蛋白と核酸との間の安定な複合体の形成はｉｎ ｖｉｔｒｏで組み換えおよび天然のＰｒＰＣの両方を用いたもの（Ｎａｎｄｉ，１９９８，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４３（７）：１２５１−６３；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９ Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４４（９）：１７５１−６３；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｓｉｚａｒｅｔ，２００１，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４６：３２７−４５；Ｗｅｉｓｓ等、１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｎｏｖ．７１（１１）：８７９０−９７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）およびｉｎ ｖｉｖｏでＰｒＰＳｃを用いたもの（Ｍｅｒｚ等、１９８１，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（Ｂｅｒｌ）．５４（１）：６３−７４；Ｍｕｒｄｏｃｈ等、１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４（４）：１４７７−８６；Ａｋｏｗｉｔｚ等，１９９４，ＮＡＲ ２２（６）：１１０１−０７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）が多数報告されている。この試験においては、小型の人工ＲＮＡ（５６〜２４２ｎｔ）収集物を用いてｈｒＰｒＰのＲＮＡ結合活性を更に特性化している。結合試験そのものに直接関係ないが、これらのＲＮＡのいくつかはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｑ−ベータレプリカーゼによる指数的増幅のための可変鋳型に加工されている（Ｐｒｅｕｓｓ等、１９９７， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２７３（３）：６００−１３が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。
【００７９】
ＲＮＡとｈｒＰｒＰとの間の見かけの解離定数（Ｋｄ）を２フィルター結合試験により求めた（Ｌｏｃｈｒｉｅ等、１９９７，ＮＡＲ ２５（１４）：２９０２−１０；Ｂａｔｔｌｅ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ，２００１，ＲＮＡ ７：１２３−３２が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ゲル精製されたＲＮＡおよびｈｒＰｒＰを、組み換えシリアンゴールデンハムスターＰｒＰＣ（ｓｒＰｒＰ）（ｗｅｉｓｓ等、１９９７）に対する親和性を有するランダムライブラリからのＲＮＡアプタマーの選択において用いるものと同様の高塩濃度緩衝液（結合緩衝液Ａ；２ｍＭ ＭｇＣｌ２，２５０ｍＭ ＮａＣｌ）中３７℃でインキュベートした。これらの実験により３つのスタッキングしたＧカルテットにより同定される特異的なＰｒＰ結合ＲＮＡのファミリーが得られた。特に、アプタマーＡＰ１（図１２ａ）はｓｒＰｒＰに特異的に結合する能力を示し、相互作用は更に１６Ｎ末端アミノ酸（２３〜３９）に局在化していた。発明者等はまたＡＰ１を構築し、これを陽性対照として使用することにより我々の収集物のＲＮＡ分子種を評価した。独自に開発された系を用いたところ、ｈｒＰｒＰに対するＡＰ１の見かけの解離定数（Ｋｄ）は５．０ｎＭであった（表５）。
表５
次にかなりの量の二次構造を含んでいることが各々推測されているｈｒＰｒＰと小型ＲＮＡ収集物との間のＫｄを求めた（図１２）。反応系は３０分間インキュベートすることにより確実に平衡に達するようにした（データ示さず）。意外にも試験したＲＮＡの各々はかなりの親和性をｈｒＰｒＰに対して示した（表５）。ＡＰ４６はＡＰ１マイナス１個のＧカルテットであり、ＡＰ４９は配列ＧＡＡＡによりＡＰ１の最初のＧカルテットが置きかえられている。ＭＤＶおよびＭＮＶ、構造が既に発表されているＲＮＡ、はＱ−ベータレプリカーゼの鋳型ＲＮＡである（Ｐｒｅｕｓｓ等、１９９７）。ＭＮＶＵおよびＭＮＶＬＯはＭＮＶの５’ループに挿入されている２０個のランダムヌクレオチドを含むライブラリより得る。ＢＳ１５７７はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの１５７７ｒＲＮＡ領域を含む小型ＲＮＡである（Ａｓｈ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９２ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，９４：７５−８０が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。最も堅固に結合しているＲＮＡ、ＭＮＶ：ＡＰ１は３．８ｎＭのＫｄを有し、Ｑ−ベータレプリカーゼ鋳型ＲＮＡ ＭＮＶにクローニングされたＡＰ１アプタマーを含む複合ＲＮＡである。ＭＮＶ：ＡＰ１はｈｒＰｒＰに対する特異性を有する増幅可能なＲＮＡとしてのその用途を調べるために開発された。大型であることからＡＰ１よりも生成が容易である。Ｑ−ベータレプリカーゼにより増幅することができ、ｈｒＰｒＰに堅固に結合するその他のＲＮＡはＲＱ１１＋１２である。ＲＱ１１＋１２は本来ＲＮＡ切断植物毒素サルシンによる２分割プローブへのプロセシング後のＨＩＶ−１ Ｒｅｖ蛋白の検出において使用するために設計された（Ｚｅｉｌｅｒ等、２０００、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＳＰＩＥ Ａｅｒｏｓｅｎｓｅ ２０００，４０３６：１０３−１４が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。このような理由のため、ＲＱ１１＋１２の幹ループ構造の１つは植物毒素サルシンおよびリシン（Ｓ／Ｒ）に対するコンセンサス切断部位（図１２ｄ）（Ｅｎｄｏ ａｎｄ Ｗｏｏｌ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７（１５）：９０５４−６０が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）に隣接するＨＩＶ−１ Ｒｅｖ結合要素（ＲＢＥ）に対するコンセンサス配列を含んでいる（Ｉｗａｉ等、１９９２、ＮＡＲ２０（２４）：６４６５−７２が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。これらの付加的な配列がｈｒＰｒＰへの結合親和性の上昇と関連性があると考えられる理由は、本質的にＲＢＥおよびＳ／Ｒドメインを含む幹ループを有さないＲＱ１１＋１２であるＲＱＴ１５７が５６ｎＭという特徴的な見かけのＫｄ値を有しているにも関わらずｈｒＰｒＰと最も安定性の低い複合体を形成したためである。そしてＲＱＴ１５７は、ＲＱ１３５、即ちＱ−ベータレプリカーゼにより効率的に複製されるＲＮＡに由来するものである（Ｍｕｎｉｓｈｋｉｎ等、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２１（２）：４６３−７２が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。
【００８１】
ｈｒＰｒＰ結合特異性のｔＲＮＡによる示差：
ＲＮＡの全てが１００ｎＭより小さいｈｒＰｒＰとの見かけの解離定数を有していたことから、本発明者等は結合相互作用には特異性が欠けているという仮説を立てた。この観察結果に対抗するため、非特異的結合部位を封鎖するためにＲＮＡ結合試験において用いられる場合のある精製されたｔＲＮＡの存在下にｈｒＰｒＰに対する収集物中のＲＮＡの結合親和性を試験した（Ｂａｔｔｌｅ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ，２００１）。しかしながら、ｔＲＮＡのアンチコドンの間の相互作用は相補ＲＮＡと極めて安定な複合体を形成できることがわかっている（Ｇｒｏｓｊｅａｎ等、１９７６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４９９−５１９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。従って、先ず、ＲＮＡを封鎖することによって、ｔＲＮＡが我々の被験ＲＮＡに直接結合せず、そしてＲＮＡによるｈｒＰｒＰへのその結合を妨害しないということを明らかにする必要があった。
【００８２】
複合体がｔＲＮＡとそのＲＮＡ収集物のサブセットとの間に形成されるかどうか調べるためにゲルシフト試験を用いた（図１３）。結合緩衝液 Ａ中３７℃で３０分間インキュベートした後、ＭＮＶ：ＡＰ１は主に単一のバンドとして非変性ゲル上を移行する（レーン１）。インキュベーションに１０ｎｇ／μＬまたは１００ｎｇ／μＬのｔＲＮＡを添加してもＭＮＶ：ＡＰ１の電気泳動上の泳動性は変化しなかった（レーン２および３）。しかしながらｔＲＮＡ濃度を１μｇ／μＬに上昇させるとＭＮＶ：ＡＰ１の移行のパターンは変化し、存在するＲＮＡの少なくとも半分を含む２番目のより遅く移行するバンドが出現した（レーン４）。このバンド形成パターンはｔＲＮＡが１μｇ／μＬの濃度で存在する場合にｔＲＮＡとＭＮＶ：ＡＰ１との間に複合体が形成されることを示唆している。これとは対照的に、ＲＱ１１＋１２およびＭＮＶは如何なるｔＲＮＡ濃度でも複合体を形成しなかった（図１３ｂおよびｃ）。ｔＲＮＡの濃度がより低くなると相互作用は観察されないことから、発明者等は非特異的ＲＮＡ相互作用の抑制剤として１０ｎｇ／μＬの濃度で作業を行なうこととした。この濃度はｔＲＮＡの約４００ｎＭの濃度に相当し、これは実施中の試験の如何なるＲＮＡよりも大モル過剰量であるが、結合の抑制がＲＮＡの封鎖によるものではないことを確保しておくために十分低値である。
【００８３】
種々のＲＮＡ分子種の結合をｔＲＮＡの存在下に再度検討したところ、結合親和性のより大きい相違が観察された（表５、コラム２）。非特異的阻害剤の存在下、測定されたＫｄ値は１２ｎＭ〜２５００ｎＭであった。ｔＲＮＡの存在による影響が最小限であり１００ｎＭ未満のＫｄ値を維持していたＲＮＡにはＡＰ１、対照ＲＮＡ、並びにＭＮＶ：ＡＰ１およびＲＱ１１＋１２が含まれていた。残りのＲＮＡはより強くｔＲＮＡの影響を受けており、一部では２桁を超える差が認められた。これらのＲＮＡの数種はマイクロモル範囲で測定される乖離定数（Ｋｄ）を有している。競合的結合のデータによれば、ｈｒＰｒＰへのＲＮＡの結合の特異性の水準は極めて変動性が高い。ただしＲＱ１１＋１２およびＭＮＶ：ＡＰ１のような明らかに異なる構造を有するＲＮＡに対してこのような水準の特異性を示すものが何かという問題の解決手段はほとんどない。少なくとも、この分析により非特異的競合体ＲＮＡの大過剰量の存在下でのｈｒＰｒＰへの安定した結合を予測する因子としてはＲＮＡの長さと全体的な熱力学的安定性は除外できる。ｈｒＰｒＰ親和性に対するＲＮＡの二次構造の作用は、小型の幹ループ構造のみ異なるにもかかわらずそのＫｄ値は７倍を超えた差があるＭＮＶＬＯおよびＭＮＶＵＰにより裏付けられている（図１２ｂおよびｃ）。
【００８４】
ｈｒＰｒＰへの高い親和性と特異的結合をもたらすＲＮＡファミリー：
高い親和性と特異性を有するｈｒＰｒＰにより結合されることが必要なＲＮＡにおける条件を解明する試みにおいて、発明者等はヌクレオチド組成の異なる４種のＲＮＡのサブセットを分析し、その構造様式を予測した。ＡＰ１を選択した理由はそれがＮ末端ＰｒＰに結合するためである（Ｗｅｉｓｓ等、１９９７）。ＭＮＶの選択理由もまた、その親和性がｔＲＮＡの存在により大きく影響され、従って非差別的態様でｈｒＰｒＰに結合するＲＮＡとなるためである。従って、この試験の初期に使用したｔＲＮＡは異種の集団であり、ｈｒＰｒＰへの結合における各ＲＮＡ分子種の作用は不明瞭であったため、競合実験においては非特異的ｔＲＮＡに等価なものとしてＭＮＶを使用する。特に、ｈｒＰｒＰはｔＲＮＡＬｙｓと相互作用する能力を有することがわかっている（Ｇａｂｕｓ等、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１ｂ，Ｊｕｎ １，２７６（２２）：１９３０１−９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ＭＮＶ：ＡＰ１およびＲＱ１１＋１２は、両ＲＮＡがＱ−ベータレプリカーゼにより増幅可能であり、高い親和性でｈｒＰｒＰに特異的に結合し、そしてｔＲＮＡによる影響が最小であることから選択した。
【００８５】
これらのＲＮＡ分子種の結合特異性を、放射標識ＲＮＡおよび未標識の競合体ＲＮＡを用いる競合実験において対抗させた（図１４）。標識されたＭＮＶ：ＡＰ１（５０ｐＭ）のｈｒＰｒＰ（５０ｎＭ）への結合は濃度５ｎＭ〜１２０ｎＭの範囲に渡り競合体ＲＮＡであるＡＰ１またはＭＮＶの存在下で測定した。競合体ＲＮＡがｈｒＰｒＰと相互作用する機会を確保するために、常時、標識ＲＮＡよりも１５分前に反応系に添加するようにした。３０分のインキュベートの後、結合の範囲を２フィルター試験で調べた。上記条件下、ＡＰ１は効果的にＭＮＶ：ＡＰ１の結合を抑制した。１２０ｎＭのＡＰ１の濃度において、ＭＮＶ：ＡＰ１の結合は２５％未満に低下した。これとは対照的に、競合体ＭＮＶが１２０ｎＭの濃度で存在する場合は、ＭＮＶ：ＡＰ１のｈｒＰｒＰへの結合はわずか５％しか低下しない。この観察結果は、ＭＮＶ：ＡＰ１のｈｒＰｒＰへの結合の９５％がＡＰ１配列を介して起こったモデルの場合と合致している。これらの結果はまた、ＡＰ１配列はｈｒＰｒＰへの特異的な高い親和性での結合に関与しているが、ＭＮＶはそうではないことを示唆している。この結論はｔＲＮＡ存在下にＭＮＶおよびＡＰ１について測定されたＫｄ値と合致している（表５）。
【００８６】
ＲＱ１１＋１２のｈｒＰｒＰへの結合を同じ実験方法を用いて調べた。同じＭＮＶおよびＡＰ１競合体を用いたｈｒＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の結合の抑制のパターンはＭＮＶ：ＡＰ１の場合とほぼ同様である。ＭＮＶおよびＡＰ１は共に、それらがｈｒＰｒＰへのＭＮＶ：ＡＰ１の結合に対して示したより僅かに高度にｈｒＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の結合を抑制する。この観察結果はＭＮＶ：ＡＰ１と比較した場合のｈｒＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の親和性が僅かに低値であることと合致している。この競合データは、ＲＱ１１＋１２およびＭＮＶ：ＡＰ１がｈｒＰｒＰへの結合の共通の様式を有していることを証明するわけではないが、その可能性を示唆しているといえる。
【００８７】
ｈｒＰｒＰのアミノ末端へのＲＮＡの結合：
ｈｒＰｒＰに対して十分高い親和性で結合し、ｔＲＮＡまたはＭＮＶによる非特異的競合に対して耐性を示すことから、ＲＱ１１＋１２を用いて更に特性化を行なった。更に、ＲＱ１１＋１２はＭＮＶ：ＡＰ１とは異なり、高濃度（４０μＭまで）においてもｔＲＮＡと相互作用を示さない。またＲＱ１１＋１２はＱ−ベータレプリカーゼにより急速に増幅される。数種の緩衝液を試験した後、ｔＲＮＡ非存在下のｈｒＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の結合は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ，ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＤＴＴ（緩衝液Ｂ；データ示さず）中でほぼ１０倍（Ｋｄ＝２．２ｎＭ）向上することが解かった。ｈｒＰｒＰへの結合はまた緩衝液Ｂ中でＭＮＶについても向上した（２．６ｎＭ）。興味深いことに、緩衝液Ｂ中ではＲＱ１１＋１２とＭＮＶはｔＲＮＡ非存在下で同様のＫｄ値を有している。
【００８８】
切断されたｈｒＰｒＰ蛋白を用いてＲＮＡ結合活性の物理的位置を調べた。完全長の組み換え蛋白ｈｒＰｒＰ２３−２３１のほかに、本発明者等はまたｔＲＮＡの存在下、結合緩衝液Ｂ中、フィルター結合試験を用いてＮ末端部分（ｈｒＰｒＰ２３−１４４）およびＣ末端部分（ＰｒＰ９０−２３１）を調べた（図１５）。競合実験の結果から推定された通り、ＲＱ１１＋１２とＭＮＶ：ＡＰ１は共に完全長ｈｒＰｒＰおよびＮ末端切断部にのみ結合した（図１６ｂ）。蛋白濃度はこのセットの実験では２０ｎＭであったため、ＭＮＶは１０ｎｇ／μＬのｔＲＮＡの存在下でｈｒＰｒＰに結合できなかった。しかしながら、ｔＲＮＡを結合緩衝液から除去するとＭＮＶの結合はＰｒＰの完全長またはＮ末端部分の何れに対しても起こった。Ｃ末端切断部であるＰｒＰ９０−２３１に対してはどのＲＮＡの結合も検出できなかった。このデータはアミノ酸２３〜９０内のｈｒＰｒＰのＮ末端中に残存するｈｒＰｒＰの差別的または非差別的なＲＮＡ結合活性の双方を示している。
【００８９】
ＲＮａｓｅＡ分解からの保護と結合との相関：
リボヌクレアーゼ保護試験を用いてｈｒＰｒＰとＲＮＡとの間の相互作用の性質を調べた。ｈｒＰｒＰがＲＮＡ構造と最小限しか相互作用を示さず、ＲＮＡ構造をそれほど封鎖しない場合、ＲＮＡはリボヌクレアーゼによる分解を受けやすいはずである。しかしながら、ＲＮＡ／蛋白複合体が全体のＲＮＡ分子を含んでおりｈｒＰｒＰとの相互作用がＲＮＡの大部分を封鎖する場合、リボヌクレアーゼによる分解に対抗してＲＮＡを安定化させなければならない。
【００９０】
ｈｒＰｒＰ／ＲＮＡ複合体を調べるために、ＲＱ１１＋１２およびＭＮＶを過剰のｈｒＰｒＰと共にインキュベートし、３０分間相互作用を起こさせた。ＲＱ１１＋１２は代表的な差別的結合として選択し、ＭＮＶは非差別的結合として選択した。次にＲＮａｓｅＡを添加し、更に１５分間継続してインキュベートした（図１６）。この処理の後、ＲＮＡのほぼ半分がｈｒＰｒＰを含有する試料中に残存したのに対し、ＲＮＡのみを含有する試料中ではＲＮＡの９５％を超える量が分解した。ｔＲＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）を初期のインキュベーションに含めるとｈｒＰｒＰにより付与されるＭＮＶの保護の水準はｔＲＮＡ非存在下の約半分となるのに対し、ＲＱ１１＋１２の保護の水準は不変である。ＲＱ１１＋１２およびＭＮＶの保護のパターンはｈｒＰｒＰへのそれらの結合パターンと直接相関しており、ｈｒＰｒＰとの複合体の形成が結合ＲＮＡを保護することが示唆される。
【００９１】
ＰｒＰに特異的に結合するＲＱ１１＋１２：
生物学的複雑性の漸増する溶液中における結合試験を用いてＰｒＰへのＲＱ１１＋１２結合の特異性を調べた。ｈｒＰｒＰ２３−２３１の理論的等電点は９．３９（ＥｘＰＡＳｙ分子生物学サーバー、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ）であり、従って蛋白は結合試験の条件下では陽電荷を有している。そのヌクレオチド組成の結果として、ＲＱ１１＋１２は負荷電されている。従って、ｈｒＰｒＰの陽電荷およびＲＱ１１＋１２の負電荷は、ＲＱ１１＋１２とｈｒＰｒＰの間の結合が電荷に基づいている可能性を生じさせている。この可能性に対抗するために、その理論的ｐＩが９．９（ＥｘＰＡＳｙ）であり、試験条件下で陽荷電しているはずであることから、蛋白リソシームをＲＱ１１＋１２との結合試験において使用した（図１７ａ）。試験条件はＲＮＡ（２ｎＭ）および蛋白（２０ｎＭ）の濃度がＲＱ１１＋１２の広範な結合は可能とするがＮＭＶに対してはそうならないように調節した（表５の結果に基づく）（１０ｎｇ／μＬのｔＲＮＡの存在下の結合緩衝液Ａ）。全ての場合において、ＭＮＶの結合はバックグラウンド値であった。ｈｒＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の結合は約９０％であったのに対し、ＢＳＡおよびリゾチームへの結合はバックグラウンド値であった。これらの結果は、ＲＱ１１＋１２が陽荷電されたリゾシーム蛋白と非特異的に相互作用しないことを示している。
【００９２】
ＰｒＰに対するＲＱ１１＋１２の特異性は更にゲルシフト試験を用いたマウス脳抽出液中での結合を調べることにより確認した。抽出液は生理学的に多様な蛋白類が含まれており、これによりＰｒＰに対するＲＱ１１＋１２の特異性のストリンジェントな試験が可能となる。ｈｒＰｒＰ４０ｎｇと共にインキュベートした後、標識されたＲＱ１１＋１２の移行は電気泳動の間ポリアクリルアミドゲルを通過させながら遅延させ、一方ＭＮＶの移行には影響がないようにする（図１７ｂ、レーン５および６ｖｓ１および２）。ＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の特異性は野生型マウス脳抽出液またはマウスＰｒＰノックアウト脳抽出液の何れかの等量（２０μｇ）と共にインキュベートした後に明らかにされる（レーン７および８）。野生型マウスにおいてのみシフトが観察され、レーン７で観察されたシフトは野生型抽出液中に存在する内因性ＰｒＰの存在のみによるものであることが示唆される。レーン６よりもレーン７においてＲＱ１１＋１２の遅延が大きいことは、恐らくは天然のＰｒＰには存在するがｈｒＰｒＰには存在しない翻訳後の修飾、宿主蛋白とのＰｒＰＣの会合またはｉｎ ｖｉｖｏで形成されるが精製された組み換えｐｒＰ中では形成されないＰｒＰの２量体の存在の何れかによるものと考えらえる（Ｙｅｈｅｉｌｙ１等、１９９７，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ３：３３９−３５５；Ｍｅｙｅｒ等、２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｄｅｃ．１，２７５（４８）：３８０８１−７が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。抽出液中の天然のマウスＰｒＰとＲＮＡとの間の相互作用のパターンはＲＱ１１＋１２が高い特異性を示したがＭＮＶは示さなかったｔＲＮＡ存在下に実施したフィルター結合実験を想到させる。
【００９３】
ＲＱ１１＋１２によるｈｒＰｒＰのフィブリル化の促進：
最近発表された研究において、ＤＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏで組み換えＰｒＰのフィブリル化を誘発することができることが報告された（Ｎａｎｄｉ ａｎｄ ＬｅＣｌｅｒｃ，１９９９）。この実験において、Ｇ−Ｃ塩基対（ｇｃＤＮＡ）を全体的に保有する１５００ｎｔの２重鎖ＤＮＡを精製された組み換え蛋白と共に低いｐＨ（５．０）でインキュベートしている。凝集特異的染料であるコンゴレッドを用いることにより、本発明者等はＤＮＡ依存性のフィブリル化を明らかにした。更にまた、このＰｒＰ／ＤＮＡ凝集物はＰｒＰＣ構造転換の特質であるプロテイナーゼＫによる消化に対する耐性を有していた。
【００９４】
本発明者等はＲＱ１１＋１２が同じ能力を有するとしたら興味深いと考えた。Ｎａｎｄｉの研究において使用されたｇｃＤＮＡとは異なり、ＲＱ１１＋１２は自己凝集しないため、電子顕微鏡観察によりｈｒＰｒＰ／ＲＱ１１＋１２複合体形成の結果を明らかにするために選択した（図１８）。Ｎａｎｄｉの酸性条件を用いる代わりに、生理学的ｐＨの緩衝液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．５，０．１μｇ／μＬｔＲＮＡ，８μｇ／μＬウシ血清、０．０５％ＮＰ−４０／デオキシコール酸）を選択した。室温で１６時間インキュベートした後、８．９ｐｍｏｌのｈｒＰｒＰは識別可能な上層構造を形成しなかった（図１８ａ）。しかしながら、０．１６ｐｍｏｌのＲＱ１１＋１２が反応系に存在する場合、凝集構造を観察することができる（図１８ｂ）。個々の棒状の構造を形成するスクラピー感染組織から回収されるＳＡＦとは対照的に、ｈｒＰｒＰ間に形成される上層構造は格子様の凝集物を形成すると考えられるが、ｈｒＰｒＰ凝集に対するＲＱ１１＋１２の作用は明らかで顕在化している。
【００９５】
この試験はリボ核酸が組み換えＰｒＰに結合するという以前に報告された観察結果を確認し、拡張するものである。本明細書に記載した結果は、ｈｒＰｒＰが数種類のＲＮＡと極めて安定した複合体を形成でき、その解離定数は低いナノモル領域にあることを明らかにしている。２つのＲＮＡ、ＲＱ１１＋１２とＭＮＶ：ＡＰ１はきわめて堅固にｈｒＰｒＰに結合し、他のＲＮＡからの競合に対して耐性を示し、これによりその試験群中の他のＲＮＡの一部と比較して結合活性が顕著に異なっていた。更にまた、ＲＱ１１＋１２は恐らくは全マウス脳抽出液中の内因性ＰｒＰＣに特異的に結合した。ＭＮＶ：ＡＰ１とＲＱ１１＋１２との間にはｈｒＰｒＰへの特異的結合を説明する明らかな類似性は少ないものの、両者は共に蛋白結合ＲＮＡに共通な特徴である熱力学的に安定な非規範的な塩基対を含む二次構造要素を有することが推測される。非ワトソンクリック型の塩基対はＲＮＡの深溝を拡張することができ、これにより拡大した蛋白ドメインとの相互作用に適応し、蛋白リガンド結合特異性において役割を果たすと考えられる別の水素結合基を露出させることができる（Ｙｅ等、１９９９，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３（１２）：１０２６−３３；Ｊｉａｎｇ等、１９９９，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ．７（１２）：１４６１−７２；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｅｓｔｈｏｆ，１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６（１２）：Ｒ３３５−４３；Ｐａｔｅｌ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９（１）：７４−８７；Ｐｕｇｌｉｓｉ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，１９９９，ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ，ＲＦ Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，ＴＲ Ｃｅｃｈ，ＪＦ Ａｔｋｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２ｎｄ，１９９９，ｐｐ４０３−２５；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７（５４５４）：８２０−５が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。以前に記載したＭＮＶ：ＡＰ１中のＡＰ１構造は３つのスタッキングしたｇカルテットを有している（Ｗｅｉｓｓ等、１９９７）のに対し、ＲＱ１１＋１２は非ワトソンクリック型塩基対であるＲｅｖ結合要素（ＲＢＥ）および１８Ｓ ｒＲＮＡに由来するサリシン／リシン切断ドメインを含むことが解かっている２つのＲＮＡドメインを含んでいる（図１２ｄ）（Ｉｗａｉ等、１９９２；Ｅｎｄｏ ａｎｄ Ｗｏｏｌ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１５）：９０５４−６０が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。これらのＲＮＡの二次構造により与えられる熱力学的安定性はｈｒＰｒＰの可変Ｎ末端とのより広範な相互作用を可能とする場合がある。非構造性ペプチドはその立体配座を安定なＲＮＡの構造様式に変化させることにより、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ蛋白に由来するペプチドとそのＲＮＡアプタマーとの間の結合の場合と同様、安定な複合体を形成する場合がある（Ｙｅ等、１９９６；Ｙｅ等、１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６（９）：６５７−６９；Ｔａｎ等、１９９３，Ｃｅｌｌ ７３（５）：１０３１−４０が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。
【００９６】
ＤＮＡはＤＮＡ／蛋白複合体の形成を通じてＰｒＰ中間体を安定化させることによりＰｒＰＳｃへのＰｒＰＣの変換における活性化エネルギーを低下させることができる。本試験においては、発明者等はＲＮＡ様ＲＱ１１＋１２の同様の役割を示唆すると考えられるデータを呈示する。これによれば、ＰｒＰへのＲＱ１１＋１２の結合は、競合体ＲＮＡの大モル過剰量の存在下、極めて低濃度で高い親和性および特異性で起こる。ｈｒＰｒＰへの結合はまたＲＮａｓｅＡによる分解からＲＱ１１＋１２を保護している。これらの結果は、ｈｒＰｒＰとのＲＱ１１＋１２の相互作用により特徴付けられる特異的なＲＮＡの相互作用がＲＮＡ／ＰｒＰ複合体の形成を開始させ、さらにＰｒＰ凝凝塊の形成をも触媒するモデルを与えるものである。このような凝凝塊はフィブリル性であり不溶性であると予測される。このような凝凝塊の形成は図１６のレーン３および４中の変性ゲル中の原点に蓄積している試料の量を説明すると考えらえる。このことはまた、ＲＱ１１＋１２はｈｒＰｒＰへのそれ自体の結合にために競合する際に、ＭＮＶがそれ自体の結合のために競合するよりも効率的である自己競合結合実験の結果も説明している（図１６ｂ）。ＰｒＰのＲＮＡに対する比率が、１個より多いｈｒＰｒＰの分子にＲＱ１１＋１２が結合している場合に予測される１：１に近いほど作用はより顕著になる。以前に、核酸により触媒されるＰｒＰの凝凝塊のｉｎ ｖｉｔｒｏの形成を酸性条件下ＤＮＡを用いて明らかにされている（Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｓｉｚａｒｅｔ，２００１；Ｃｏｒｄｅｉｒｏ等、２００１，Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（５２）：４９４００−０９が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ＲＱ１１＋１２がＲＮＡ／ＰｒＰ凝凝塊の形成を触媒すると示唆することは興味深い。作用は速度論的であり、即ち、ＲＱ１１＋１２のようなＲＮＡは構造転換を効率的に触媒できる極めて特別な方法においてＰｒＰと相互作用することができる。相互作用の特異性のため、低い濃度でも起こり得る。この活性はＲＱ１１＋１２のようなＲＮＡとＭＮＶのようなＲＮＡとの間の結合活性の相違に関係していると考えられる。
【００９７】
プリオン疾患の伝染の複雑性のために、幾つかの最近の研究はプリオン疾患の発症または進行を助けるコファクターが存在する可能性に着目している（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６７９−８３が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ＰｒＰＣからプリオン疾患の特質であるＰｒＰＳｃへの転換を触媒する「ファクターＸ」蛋白の検索は幾つかの可能性のある蛋白の候補を明らかにしている（Ｙｅｈｉｅｌｙ等、１９９７）。最近、ＤＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏでＰｒＰに結合し、特殊な条件下でフィブリル化を誘発することができることがわかった（Ｎａｎｄｉ，１９９８；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｌｅｃｌｅｒｃ，１９９９；Ｎａｎｄｉ ａｎｄ Ｓｉｚａｒｅｔ，２００１；Ｃｏｒｄｅｉｒｏ等、２００１）。この観察結果によりＤＮＡがプリオン疾患の進行に関与している可能性があることが示唆される。本データはＲＱ１１＋１２のようなＲＮＡがプリオン疾患に関与するより可能性の高い候補であることを示唆している。ｈｒＰｒＰに対するＲＱ１１＋１２のＫｄはｄｓＤＮＡについて測定したものよりも３桁低値であり、結合は生理的条件下に起き、ＲＮＡは原形質内の細網構造内部にそのＮ末端が延びているＰｒＰＮｔｍと相互作用する機会が与えられる（Ｈｅｄｇｅ等、１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９（５３５２）：８２７−３４が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。ＰｒＰの凝集の誘導のためのモデルは特異的ＲＮＡリガンド結合時にＰｒＰのＮ末端が起こす構造的変化の周囲に形成することができる。Ｎ末端の新しい立体配座は、ＰｒＰの保存されたアミロイド形成性の領域（アミノ酸１０６〜１２６）のフィブリル化活性を、その溶媒曝露により活性化させる。内部の４２個のアミノ酸β−アミロイドペプチドがＡＰＰから切り出され溶媒曝露された後にのみ凝集する９０ｋＤａのアミロイド前駆蛋白（ＡＰＰ）のフィブリル化も同様の機序に従う（Ｒｏｃｈｅｔ ａｎｄ Ｌａｎｓｂｕｒｙ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：６０−８が参照でき、その内容は参考により本明細書に組み込まれる）。このモデルが正しい場合、この結果はＲＮＡ分子がプリオン疾患においてフィブリルの形成を誘発ないしは加速することができることを示唆している。
【００９８】
プリオン疾患におけるＰｒＰの結合の機序や特異的ＲＮＡの役割とは無関係に発明者等はＲＮＡであるＲＱ１１＋１２がＰｒＰ蛋白に対する有用なプローブであることを明らかにする。更にまた、ＲＱ１１＋１２はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｑ−ベータレプリカーゼに対する強力な鋳型である。この新しい種類の２官能性のＲＮＡ分子またはアンプリボディーは蛋白標的に特異的に結合し、Ｑ−ベータレプリカーゼにより直接増幅される能力を有している。ＲＱ１１＋１２のような分子はプリオンの生物学を研究する際のみならず、より新しくより感度の高い診断方法を開発する際にも有用である。
【００９９】
本発明をより理解するために、多くの用語および表現を以下の通り定義する。
【０１００】
本明細書においては、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類縁体の何れかである如何なる長さのヌクレオチドの重合体型も包含するものとする。ポリヌクレオチドは何らかの３次元構造を有し、既知または未知の何らかの機能を果たす。非限定的なポリヌクレオチドの例としては、以下のもの、即ち：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド 、プラスミド、ベクター、何れかの配列の単離ＤＮＡ、何れかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドの類縁体も包含する。あり得る場合は、重合体の組み立ての前後にヌクレオチド構造を修飾することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていても良い。ポリヌクレオチドは標識成分とのコンジュゲート形成によるなどして重合後に更に修飾されても良い。この用語はまた二重鎖および一重鎖のヌクレオチド両方を包含する。特段の記載や条件が無い限り、ポリヌクレオチドである本発明の如何なる実施態様も二重鎖型および二重鎖型を形成することが解かっているか予測される２つの相補的一重鎖型の組み合わせの双方を包含する。
【０１０１】
ポリヌクレオチドはヌクレオチド塩基４種、即ち、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）および、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合は値にンに対してウラシル（Ｕ）の特異的配列よりなる。即ち、「ポリヌクレオチド配列」という用語はポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は中央処理装置を有するコンピューターのデータベースに入力し、機能的ゲノミックスおよびホモロジーの検索のようなバイオインフォマティクス用途に使用することができる。
【０１０２】
「遺伝子」とは転写され翻訳された後に特定のポリペプチドまたは蛋白をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを包含する。本明細書に記載したポリヌクレオチド配列の何れも、それらが会合している遺伝子のより大きいフラグメントまたは完全長のコード配列を同定するために使用して良い。より大きいフラグメントの配列を単離する方法は当業者のよく知るとおりであり、その一部を本明細書に記載する。
【０１０３】
「遺伝子産物」とは遺伝子が転写され、次に翻訳された場合に発生するアミノ酸、例えばペプチドまたはポリペプチドを包含する。
【０１０４】
「プライマー」は標的とハイブリダイズし、その後標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進することにより、対象となる試料中に存在する標的または「鋳型」と結合する遊離の３’−ＯＨ基を一般的に有する短いポリヌクレオチドを包含する。「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」とは「上流」および「下流」のプライマーよりなる「プライマー対」または「プライマーセット」および重合触媒、例えばＤＮＡポリメラーゼ、典型的には熱的に安定なポリメラーゼ酵素を用いて標的ポリヌクレオチドから複製コピーを作成する反応である。ＰＣＲの方法は当該分野でよく知られており、例えばＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ等のＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）に記載されている。ＰＣＲや遺伝子クローニングのようなポリヌクレオチドの複製コピーを作成する全ての方法はここではまとめて「複製」と称する。プライマーはまたサザンブロットまたはノーザンブロット分析のようなハイブリダイゼーション反応におけるプローブとしても使用できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９が参照できる）。
【０１０５】
「ｃＤＮＡ」という用語は逆転写酵素のような酵素でｃＤＮＡとすることができる細胞または生物中に存在する相補ＤＮＡ、即ちｍＲＮＡ分子を含む。「ｃＤＮＡライブラリ」とは、酵素である逆転写酵素によりｃＤＮＡ分子に変換され、次に「ベクター」（外来ＤＮＡ添加後に複製を継続できる他のＤＮＡ分子）に挿入される、細胞または生物中に存在するｍＲＮＡ分子の収集物を包含する。ライブラリのためのベクターの例はバクテリオファージ、細菌感染ウィルス、例えばλファージを包含する。次に目的の特定のｃＤＮＡ（そしてすなわちｍＲＮＡ）に対してライブラリをプローブすることができる。
【０１０６】
「デリバリーベヒクル」とは宿主細胞に内にポリヌクレオチド１つ以上を挿入する事のできる分子を包含する。デリバリーベヒクルの例はリポソーム、生体適合性重合体、例えば天然の重合体および合成の重合体；リポ蛋白；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工のウィルスエンベロープ；金属粒子；および細菌、ウィルスおよびウィルスベクター、例えばバキュロウィルス、アデノウィルスおよびレトロウィルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、カビベクターおよび種々の真核生物および原核生物の宿主中で複製および／または発現することが解かっている当該分野で典型的に使用されている他の組み換えベヒクルである。デリバリーベヒクルは挿入ポリヌクレオチドの複製、遺伝子治療並びに単にポリペプチドと蛋白の発現のために使用して良い。
【０１０７】
「ベクター」とは挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞内および／または宿主細胞間に転移させる自己複製可能な核酸分子を包含する。用語には細胞への核酸分子の挿入のために主に機能するベクター、核酸の複製のために主に機能する複製ベクターおよびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを包含するものとする。更にまた、上記機能の１つより多くを与えるベクターも意図している。
【０１０８】
「宿主細胞」とはベクターのための、または、外来性核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／または蛋白の取り込みのためのレシピエントとなり得るか、レシピエントであった何れかの個々の細胞または細胞培養物を包含するものとする。更にまた単細胞の子孫も包含する。子孫は天然、偶発的または意図的な突然変異により元の親細胞と（形態学的またはゲノムまたは全ＤＮＡ相補物において）完全に同一である必要はない。細胞は細菌細胞を含む原核生物であってよい。
【０１０９】
「遺伝子的に修飾された」という用語は、細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を修飾する外来性遺伝子または核酸の配列を含む、そして／または発現する細胞を包含する。この用語は細胞の内因性ヌクレオチドの如何なる付加、欠失または破壊も包含する。
【０１１０】
本明細書においては「発現」とはポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白に翻訳される過程を包含する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来するものである場合、適切な真核生物の宿主を選択するとすれば発現はｍＲＮＡのスプライシングを包含する。発現に必要な調節要素はＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列を包含する。例えば、細菌の発現ベクターにはｌａｃプロモーターのようなプロモーター転写開始のためのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列および開始コドンＡＵＧが包含される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。同様に、真核生物の発現ベクターにはＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種または同種のプロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧおよびリボソームの脱着のための終止コドンが包含される。このようなベクターは市販のものを用いるか、または、当該分野でよく知られている方法、例えば、一般的にベクターを構築するための後述する方法に記載されている配列番号により組み立てることができる。
【０１１１】
「示差的に発現される」とは遺伝子に適用した場合は遺伝子から転写されるｍＲＮＡまたは遺伝子によりコードされる蛋白産物の示差的生産を含む。示差的に発現された遺伝子は正常または対照の細胞の発現濃度と比較して過剰発現または過少発現される。１つの特徴において、それは対照試料中に検出される発現濃度よりも２．５倍、好ましくは５倍または好ましくは１０倍、高値または低値となる差を包含する。「示差的に発現される」とはまた、対照細胞ではサイレントであるが発現される、または、対照細胞では発現されるが発現されない細胞または組織中のヌクレオチド配列を包含する。
【０１１２】
「ポリペプチド」という用語は２個以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類縁体またはペプチド擬似物の化合物である。サブユニットはペプチド結合により連結される。別の実施態様においては、サブユニットは他の結合、例えばエステル、エーテル等を解して連結される。本明細書においては、「アミノ酸」とはグリシンおよびＤまたはＬの双方の光学異性体およびアミノ酸類縁体およびペプチド擬似物を包含する何れかの天然および／または非天然または合成のアミノ酸を包含する。アミノ酸３個以上のペプチドを一般的にオリゴペプチドと称する。３個より多いかそれ以上のアミノ酸のペプチド鎖はポリペプチドまたは蛋白と称する。
【０１１３】
「ハイブリダイゼーション」はポリヌクレオチド１つ以上が反応することによりヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を包含する。水素結合はワトソンクリック型塩基対形成、フーグスティーン型結合によるか、または何らか別の配列番号特異的態様において起こる。複合体は２重らせん構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖またはこれらの組み合わせの何れかを含む。ハイブリダイゼーション反応はＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のようなより広範な過程における段階を構成する。
【０１１４】
ハイブリダイゼーション反応は異なる「ストリンジェンシー」の条件下に行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーには何れかの２個の核酸分子が相互にハイブリダイズする際の困難度が包含される。ストリンジェントな条件下では、相互に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％同一である核酸分子が相互にハイブリダイズされた状態で残存し、低い同一性の分子はハイブリダイズされた状態では残存できない。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中４５℃、次いで０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄１回以上を５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、更に好ましくは６５℃で行なうハイブリダイゼーションである。
【０１１５】
２つの一重鎖ポリヌクレオチドの間で逆平行の立体配置においてハイブリダイゼーションが起こる場合、反応は「アニーリング」と称され、これらのポリヌクレオチドは「相補的」と記載される。二重鎖ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの鎖の一方と第２のものとの間にハイブリダイゼーションが起こり得る場合には、もう一方のポリヌクレオチドに対して「相補的」または「相同」であることができる。「相補性」または「相同性」（１つのポリヌクレオチドがもう１つと相補的である程度）は一般的に許容されている塩基対形成規則に従って相互に水素結合すると予測される対向する鎖内の塩基の比率に基づいて定量される。
【０１１６】
本明細書においては、「核酸分子」という用語はＤＮＡ分子、例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ，およびＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡおよびヌクレオチド類縁体を用いて発生したＤＮＡまたはＲＮＡの類縁体を包含するものとする。核酸分子は一重鎖または二重鎖であることができるが、好ましくは二重鎖ＤＮＡである。
【０１１７】
「単離された核酸分子」とは核酸の天然の原料中に存在する他の核酸分子から分離される核酸分子を包含する。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、「単離された」という用語はゲノムＤＮＡが本来会合している染色体から分離される核酸分子を包含する。好ましくは、「単離された」核酸は核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸を天然に切断している配列（即ち核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施態様において、本発明の単離されたマーカー核酸分子、または本発明のポリペプチドマーカーをコードする核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子を天然に切断している約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂより小さいヌクレオチド配列を含むことができる。更にまた、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組み換え技術により製造された場合は他の細胞内物質または培地を実質的に含有せず、或いは、化学合成された場合は化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含有しない。
【０１１８】
本発明の核酸分子、例えば配列番号１〜１０のヌクレオチド配列またはその部分を有する核酸分子は、標準的な分子生物学の手法および本明細書に記載する配列の情報を用いて単離することができる。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１〜１０の核酸配列の全てまたは一部を用いながら、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載の標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を用いて配列番号１〜１０を有する分子を単離することができる。
【０１１９】
本発明の核酸は標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。このようにして増幅された核酸は適切なベクター内にクローニング、ＤＮＡ配列分析により同定することができる。更にまた、マーカーヌクレオチド配列または本発明のマーカーをコードするヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドは標準的な合成方法、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを用いるなどして調製することができる。
【０１２０】
別の実施態様においては、本発明の単離された核酸分子は配列番号１〜１０のヌクレオチド配列またはその部分に相補的な核酸分子を包含する。そのようなヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、それがそのヌクレオチド配列にハイブリダイズできる程度に十分そのヌクレオチド配列番号に対して相補的であり、これにより安定な二重らせんを形成するものである。
【０１２１】
本発明の核酸分子は更に、プローブまたはプライマーとして使用することのできる、本発明の配列番号１〜１０の核酸配列の僅か一部、またはフラグメントを包含する。プローブ／プライマーは典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。
【０１２２】
配列番号１〜１０をコードする核酸分子のヌクレオチド配列に基づいたプローブは凝塊蛋白を検出するために使用することができる。別の実施態様において、プローブはそこに連結される標識基を含み、例えば、標識基は放射性同位体、蛍光物質、酵素または酵素コファクターであることができる。このようなプローブは、本発明のポリペプチドを誤発現、例えば過剰発現または過少発現するか、または、本発明の遺伝子のより多いまたは少ないコピーを有する細胞または組織を同定するための診断用試験キットの一部として用いることができる。
【０１２３】
本明細書においては、「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする」とは、相互に少なくとも６０％の相同性であるヌクレオチド配列が典型的には相互にハイブリダイズされた状態で残存するハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を指すものとする。好ましくは、条件は、相互に少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、更に好ましくは少なくとも８５％または９０％の相同性である配列が典型的には相互にハイブリダイズされた状態で残存するようなものである。このようなストリンジェントな条件は当業者が知るとおりであり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃、次いで０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄１回以上を５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、更に好ましくは６５℃で行なうハイブリダイゼーションである。好ましくは、配列番号１〜１０の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子である。本明細書においては「天然の」核酸分子とは自然界に存在する、例えば天然の蛋白をコードするヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を包含する。
【０１２４】
他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは例えばｉｎ ｖｉｖｏの宿主細胞受容体をターゲティングするためのペプチド、または細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒ等、（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ等、（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４：６４８−６５２；ＰＣＴ出願公開ＷＯ８８／０９８１０参照）または脳血管関門（例えばＰＣＴ出願公開ＷＯ８９／１０１３４参照）を通過する輸送を促進する物質のような、他の付随的物質群も包含できる。更にまた、オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション誘発切断試薬（例えばＫｒｏｌ等、（１９８８），Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６参照）または挿入試薬（例えばＺｏｎ，（１９８８），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，５：５３９：５４９参照）を用いて修飾することができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発交差結合剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発切断剤とコンジュゲートしてよい。最後にオリゴヌクレオチドは、検出可能に標識され、それによりその標識が別の試薬、例えば酵素標識に対する基質の添加により検出されるか、または、ヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に即座に検出される、例えば放射標識または蛍光標識、例えば米国特許５８７６９３０に記載の分子ビーコンとしてよい。
【０１２５】
本発明の別の特徴は、本発明のマーカー蛋白（またはその蛋白）をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書においては「ベクター」という用語はそれが連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を包含する。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これには別のＤＮＡ断片をライゲーションすることができる環状二重鎖ＤＮＡループも包含される。ベクターのもう１つの種類は別のＤＮＡ断片をウィルスゲノム内にライゲーションすることができるウィルスベクターである。特定のベクターはそれらが導入されている宿主細胞、例えば複製の細菌性の起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類細胞において自律複製できる。その他のベクター、例えば非エピソーム哺乳類ベクターは宿主への導入によりその宿主のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。更にまた、特定のベクターはそれらが支配可能に連結されている遺伝子の発現を意図することができる。このようなベクターは本明細書では「発現ベクター」と称する。一般的に組み換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターはプラスミドの形態である場合が多い。プラスミドは最も一般的に使用されている形態のベクターであることから、本明細書においては、「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用できるものとする。
【０１２６】
本発明の組み換え発現ベクターは宿主中の核酸の発現に適する形態の本発明の核酸を含み、このことは組み換え発現ベクターには発現すべき核酸配列に支配可能に連結されている発現のために用いるべき宿主に基づいて選択された調節配列１つ以上が含まれることを意味する。組み換え発現ベクター内部において、「支配可能に連結された」とは、対象となるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能とする態様で、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳系内、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞で調節配列に連結されていることを意味するものとする。「調節配列」という用語はプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素、例えばポリアデニル化シグナルを包含するものとする。このような調節配列は例えばＧｏｅｄｄｅｌのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列は宿主細胞の多くの種類におけるヌクレオチド配列の構成的な発現を意図するもの、および、特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列、例えば組織特異的調節配列の発現を意図するものを包含する。当業者の知るとおり、発現ベクターの設計は転写されるべき宿主細胞の選択、所望の蛋白の発現濃度等のような要因により異なる。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより本明細書に記載した核酸によりコードされる融合蛋白またはペプチドを含む蛋白またはペプチド、例えば、マーカー蛋白、マーカー蛋白の突然変異型、融合蛋白等を生産することができる。
【０１２７】
本発明の組み換え発現ベクターは原核細胞または真核細胞におけるマーカー蛋白の発現のために設計することができる。例えば、蛋白はＥ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウィルス発現ベクター使用）、酵母細胞または哺乳類細胞中で発現することができる。適切な宿主細胞は更に、ＧｏｅｄｄｅｌのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。或いは、組み換え発現ベクターは例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳することができる。
【０１２８】
原核生物における蛋白の発現は融合蛋白または非融合蛋白の何れかの発現を意図した構成または誘導プロモーターを含むベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて最も頻繁に行なわれている。融合ベクターは、多くのアミノ酸をそこにコードされる蛋白に対し、通常は組み換え蛋白のアミノ末端に対して付加する。このような融合ベクターは典型的には３つの目的、即ち、１）組み換え蛋白の発現を増大させるため、２）組み換え蛋白の溶解度を増大させるため、および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組み換え蛋白の精製に寄与するために機能する。多くの場合、融合発現ベクターにおいては、原核細胞の切断部位が融合部分と組み換え蛋白との接合部において導入され、これにより融合蛋白の精製の後の融合部分からの組み換え蛋白の分離が可能となる。このような酵素およびその同属認識配列はＸａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。典型的な融合発現ベクターにはｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８），Ｇｅｎｅ，６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が包含され、これらはそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白または蛋白Ａを標的組み換え蛋白に融合させる。
【０１２９】
精製された融合蛋白はマーカー活性試験、例えば後に詳述する直接試験または競合試験において、或いは、例えばマーカー蛋白に特異的な抗体を生成するために利用することができる。
【０１３０】
適切な誘導非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ等、（１９８８），Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ等、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９）が包含される。ＰＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現はハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存している。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は同時発現ウィルスＲＮＡポリメラーゼにより媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーター（Ｔ７ｇｎｌ）からの転写に依存している。このウィルスポリメラーゼはＬａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にＴ７ｇｎｌ遺伝子を与えるレジデントプロファージから宿主細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により与えられる。
【０１３１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組み換え蛋白の発現を最大限とするための１つの方法は組み換え蛋白を蛋白分解的に切断する能力が損なわれている宿主細菌において蛋白を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０），１１９−１２８）。別の方法は、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を、各アミノ酸に対する個別のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて好適に利用されるように変化させることである（Ｗａｄａ等、（１９９２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。このような本発明の核酸配列の変化は標準的なＤＮＡ合成方法により行なうことができる。
【０１３２】
本発明の別の特徴は、組み換え発現ベクター内に本発明の核酸分子を導入された宿主細胞、または、宿主細胞のゲノムの特定の部位に相同的に組み込むことを可能とする配列を含む本発明の核酸分子に関する。「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」とは、本明細書では互換に使用する。このような用語は特定の対象となる細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すものとする。特定の修飾は突然変異または環境の影響により連続した世代において起こる場合があるため、このような子孫は実際は、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用する用語の範囲にはなお包含されるものとする。
【０１３３】
宿主細胞は原核細胞または真核細胞の何れであることもできる。好ましくは、宿主細胞は原核細胞である。例えば、本発明はＥ．ｃｏｌｉのような細菌細胞中で発現させることができる。他の適切な宿主細胞は当業者の知るとおりである。
【０１３４】
ベクターＤＮＡは従来の形質転換法またはトランスフェクション法により宿主細胞に導入することができる。本明細書においては「形質転換」と「トランスフェクション」という用語は外来の核酸、例えばＤＮＡを宿主細胞に導入するための当該分野で知られた種々の方法を指すものとし、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム同時沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを包含する。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションのための適切な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）および他の実験マニュアルに記載されている。
【０１３５】
培養における宿主細胞のような本発明の宿主細胞は組み換え蛋白の製造、即ち発現のために使用できる。従って、本発明は更に本発明の宿主細胞を用いて蛋白を製造するための方法を提供する。１つの実施態様において、方法は、本発明の蛋白が製造されるような適切な培地中で本発明の宿主細胞（蛋白をコードする組み換え発現ベクターが導入されているもの）を培養することを包含する。別の実施態様においては、方法は更に培地または宿主細胞から蛋白を単離することを包含する。
【０１３６】
当然ながら、当業者は上記した実施態様に基づいて本発明の別の特徴や利点を知ることができる。従って本発明は、請求項により示されたものを除き、特に提示または記載したものにより制限されないものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）はＭＤＶ ＲＮＡの二次構造の１つの実施態様を示し、（ｂ）はＭＤＶ ＲＮＡの二次構造の第２の実施態様を示す。
【図２】ＭＮＶ ＲＮＡの二次構造を示す。
【図３】ＭＮＶ：ＡＰ１ ＲＮＡの二次構造を示す。
【図４】ＭＮＶ−１ ＲＮＡの二次構造を示す。
【図５】ＭＮＶ−２ ＲＮＡの二次構造を示す。
【図６】ＲＱ１１＋１２ＲＮＡの二次構造を示す。
【図７】ＭＮＶおよびＰｒＰ−Ａｍｐの増幅を示すゲルである。
【図８】（ａ）はＭＮＶおよびプリオン蛋白に結合するＰｒＰ−Ａｍｐの特異性を示すゲルであり、（ｂ）は同じ結合データをグラフで示したものである。
【図９】プリオン蛋白の２つの結合部位を示す模式図である。
【図１０】ＰｒＰ−ＡｍｐとＡＰ１またはＭＮＶの何れかとの間の競合的結合データを示すグラフである。
【図１１】ＲＱ１１＋１２とＡＰ１十間の競合的結合データを示すグラフである。
【図１２】（ａ）ＡＰ１、（ｂ）ＭＮＶＬＯのヌクレオチド２２〜５３。（ｃ）ＭＮＶＵＰ，（ｄ）ＢＳ１５７７、（ｅ）ＭＮＶ、（ｆ）ＲＱＴ１５７、および（ｇ）ＲＱ１１＋１２の二次構造を示す。
【図１３】ＲＮＡ−ＲＮＡゲルシフトである。
【図１４】ＡＰ１およびＮＭＶによるｈｒＰｒＰに結合するＭＮＶ：ＡＰ１およびＲＱ１１＋１２の競合的試験の結果を示すグラフである。
【図１５】（ａ）はｈｒＰｒＰのトポロジー、（ｂ）は切断されたｈｒＰｒＰへのＲＮＡの結合のデータのグラフである。
【図１６】ＲｎａｓｅＡ保護試験の結果である。
【図１７】ＲＱ１１＋１２がＰｒＰに特異的に結合することを示すデータであり、（ａ）はフィルター結合試験の結果であり、（ｂ）はゲルシフト試験の結果である。
【図１８】（ａ）ｈｒＰｒＰ、（ｂ）ｈｒＰｒＰおよびＲＱ１１＋１２ＲＮＡを有した場合の電子顕微鏡写真を示す。
Claims (24)
- 凝塊蛋白１つ以上に対する親和性を有する組成物であって、下記成分：
ヌクレオチド２０個以上を有する非天然のＲＮＡ、ただし該ヌクレオチドの配列部分の少なくとも１つは該凝塊蛋白１つ以上に対して親和性を有し、該ヌクレオチドの配列部分の該少なくとも１つは下記成分：
（ａ）ＲＮＡウィルスに由来するヌクレオチド配列、
（ｂ）ＲＮＡファージに由来するヌクレオチド配列、
（ｃ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られるヌクレオチド配列、
（ｄ）メッセンジャーＲＮＡに由来するヌクレオチド配列、
（ｅ）リボソームＲＮＡに由来するヌクレオチド配列、
（ｆ）転移ＲＮＡに由来するヌクレオチド配列、および、
（ｇ）これらの組み合わせ、
よりなる群から選択されるもの、
を含む上記組成物。 - 該非天然のＲＮＡは一連のグアニンヌクレオチドの少なくとも３つを有するループを少なくとも１つは有する請求項１記載の組成物。
- 凝塊蛋白の該１つ以上に対して親和性を有する該ヌクレオチドの配列部分の該少なくとも１つが約２０〜約１０，０００のヌクレオチド長である請求項１記載の組成物。
- 該ＲＮＡウィルスがレトロウィルスである請求項１記載の組成物。
- 該ウィルスがヒト免疫不全ウィルス、ポリオウィルス、インフルエンザウィルス、スモールポックスウィルス、水痘（ｃｈｉｃｋｉｎ ｐｏｘ）ウィルス、ヘルペスウィルス、水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ）ウィルス、エプスタイン・バーウィルス、サイトメガロウィルス、ネコ白血病ウィルス、ヒトＴ細胞白血病ウィルス、サル免疫不全ウィルス、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される請求項１記載の組成物。
- 該ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＱ−ベータレプリカーゼおよびＱ−Ａｍｐよりなる群から選択される請求項１記載の組成物。
- ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られる該ヌクレオチド配列がミディ（ｍｉｄｉ）変異ＲＮＡ、ミニ（ｍｉｎｉ）変異ＲＮＡ、ＲＱＲＮＡおよびこれらの組み合わせよりなる群から選択される請求項１記載の組成物。
- 該ＲＱＲＮＡがＲＱ１１＋１２ＲＮＡである請求項７記載の組成物。
- 試料中の凝塊蛋白の検出方法であって、下記工程：
該試料をプローブに接触させることにより親和性複合体を形成すること、ただしここで該プローブはヌクレオチド２０個以上を有する非天然のＲＮＡであるものであり、該ヌクレオチドの配列部分の少なくとも１つは該凝塊蛋白１つ以上に対して親和性を有し、そして該ヌクレオチドの配列部分の該少なくとも１つは下記成分：
（ａ）ＲＮＡウィルスに由来するヌクレオチド配列、
（ｂ）ＲＮＡファージに由来するヌクレオチド配列、
（ｃ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られるヌクレオチド配列、
（ｄ）メッセンジャーＲＮＡに由来するヌクレオチド配列、
（ｅ）リボソームＲＮＡに由来するヌクレオチド配列、
（ｆ）転移ＲＮＡに由来するヌクレオチド配列、および、
（ｇ）これらの組み合わせ、
よりなる群から選択されるものであること、
および、
該親和性複合体を検出すること、ただしここで該親和性複合体の該検出は該試料中に存在する凝塊蛋白１つ以上を示すものであること、
を包含する上記検出方法。 - 該試料をプローブの少なくとも２つと接触させ、そして、各プローブは凝塊蛋白の該１つ以上の異なる結合座に結合する、請求項９記載の方法。
- プローブの該少なくとも２つは第１のプローブを有し、該第１のプローブは固相上に固定化されている請求項１０記載の方法。
- 該固相がゲル、ガラス、プラスチック、セルロース、磁気ビーズ、膜、ラテックスビーズ、シリカ、クロマトグラフィー支持体、重合体物質およびワックス系のものよりなる群から選択される請求項１１記載の方法。
- 該ゲルがポリアクリルアミド、澱粉およびアガロースよりなる群から選択される請求項１２記載の方法。
- プローブの該少なくとも２つのうち少なくとも１つが標識されている請求項１１記載の方法。
- 該標識が放射性同位体、親和性試薬、例えばビオチン、インターカレーション蛍光染料、親和性組成物に結合した蛍光部分、りん光染料、電子団（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ）、化学ルミネセンス発色団およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される請求項１４記載の方法。
- 該親和性複合体の該検出が、質量または密度の測定、質量スペクトル分析、プラズモン共鳴、光学的発光または吸光、蛍光、りん光、ルミネセンス、化学ルミネセンス、ポーラリゼーション、屈折率の変化、電気伝導度、放射能、粘度、濁度および旋光度よりなる群から選択される検出方法により行なわれる請求項１０記載の方法。
- 凝塊蛋白の該１つ以上に対する親和性を有する該ヌクレオチドの配列部分の該少なくとも１つが約２０〜約１０，０００ヌクレオチド長である請求項１０記載の方法。
- 試料中の凝塊蛋白１つ以上の存在または非存在を測定するためのキットであって、下記成分、
プローブ１つ以上、ただしここでプローブの該１つ以上はヌクレオチド２０個以上を有する非天然のＲＮＡであるものであり、該ヌクレオチドの配列部分の少なくとも１つは該凝塊蛋白１つ以上に対して親和性を有し、そして該ヌクレオチドの配列部分の該少なくとも１つは下記成分：
（ａ）ＲＮＡウィルスに由来するヌクレオチド配列、
（ｂ）ＲＮＡファージに由来するヌクレオチド配列、
（ｃ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１つ以上により鋳型として受け取られるヌクレオチド配列、
（ｄ）メッセンジャーＲＮＡに由来するヌクレオチド配列、
（ｅ）リボソームＲＮＡに由来するヌクレオチド配列、
（ｆ）転移ＲＮＡに由来するヌクレオチド配列、および、
（ｇ）これらの組み合わせ、
よりなる群から選択されるもの、
を含む上記キット。 - プローブの該１つ以上のうちの少なくとも１つが標識されている請求項１８記載のキット。
- 該キットがプローブの少なくとも２つを含む請求項１８記載のキット。
- 親和性プローブの該少なくとも２つのうちの少なくとも１つが標識されている請求項２０記載のキット。
- プローブの該少なくとも２つの各々が異なる部位において凝塊蛋白１つ以上と結合する請求項２０記載のキット。
- プローブの該少なくとも２つが第１のプローブを有し、該第１のプローブが固相に固定化されている請求項２０記載のキット。
- 凝塊蛋白の該１つ以上に対する親和性を有する該ヌクレオチドの配列部分の該少なくとも１つが約２０〜約１０，０００ヌクレオチド長である請求項１８記載の組成物。
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