JP2001120282A - ポリクローナルおよびモノクローナルオリゴ体（合成オリゴヌクレオチドに基づく抗体様試薬）およびオリゴ体の作成方法 - Google Patents
ポリクローナルおよびモノクローナルオリゴ体（合成オリゴヌクレオチドに基づく抗体様試薬）およびオリゴ体の作成方法Info
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- JP2001120282A JP2001120282A JP2000252476A JP2000252476A JP2001120282A JP 2001120282 A JP2001120282 A JP 2001120282A JP 2000252476 A JP2000252476 A JP 2000252476A JP 2000252476 A JP2000252476 A JP 2000252476A JP 2001120282 A JP2001120282 A JP 2001120282A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】抗体と同等の用途に有用なオリゴ体試薬とその
作成法の提供。 【解決手段】高親和性でなく高特異性に基づく方法によ
り選択される天然又は誘導体化オリゴヌクレオチドを含
んでなる、合成オリゴヌクレオチドに基づく抗体様試薬
又はオリゴ体であって、多くの用途で天然のポリクロナ
ール又はモノクロナール抗体のように作用するユニーク
な能力を有し、未変性及び／又は変性タンパク質の両方
の認識に関与するするすべての用途（例えば、ウエスタ
ンブロット、免疫沈降、免疫組織染色、放射免疫定量
法、ＥＬＩＳＡ、疾患のための薬剤、診断のためのミク
ロトレイなど）に有用である。
作成法の提供。 【解決手段】高親和性でなく高特異性に基づく方法によ
り選択される天然又は誘導体化オリゴヌクレオチドを含
んでなる、合成オリゴヌクレオチドに基づく抗体様試薬
又はオリゴ体であって、多くの用途で天然のポリクロナ
ール又はモノクロナール抗体のように作用するユニーク
な能力を有し、未変性及び／又は変性タンパク質の両方
の認識に関与するするすべての用途（例えば、ウエスタ
ンブロット、免疫沈降、免疫組織染色、放射免疫定量
法、ＥＬＩＳＡ、疾患のための薬剤、診断のためのミク
ロトレイなど）に有用である。
Description
【０００１】（関連出願への相互参照）本出願は、２０
００年５月１９日に出願の米国仮出願第６０／２０５，
２３８号（１９９９年８月２６日出願のアルゼンチン出
願第９９０１０４２７２号に基づく）に基づく優先権を
主張する。
００年５月１９日に出願の米国仮出願第６０／２０５，
２３８号（１９９９年８月２６日出願のアルゼンチン出
願第９９０１０４２７２号に基づく）に基づく優先権を
主張する。
【０００２】（発明の分野）本発明は、合成抗体様試薬
（以降「オリゴ体」と呼ぶ）およびこれを効率的に調製
するための方法に関する。この試薬は、未変性または変
性タンパク質に対して非常に高い特異性を有する、オリ
ゴヌクレオチドの組合せライブラリーから選択される２
本鎖または１本鎖オリゴヌクレオチドにより構成され
る。この試薬は、先行技術において既知のどの合成試薬
にも存在しない特徴である、免疫ブロッティング、免疫
組織染色および免疫沈降のような種々の用途において、
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の代替物とし
ての効力が証明された。
（以降「オリゴ体」と呼ぶ）およびこれを効率的に調製
するための方法に関する。この試薬は、未変性または変
性タンパク質に対して非常に高い特異性を有する、オリ
ゴヌクレオチドの組合せライブラリーから選択される２
本鎖または１本鎖オリゴヌクレオチドにより構成され
る。この試薬は、先行技術において既知のどの合成試薬
にも存在しない特徴である、免疫ブロッティング、免疫
組織染色および免疫沈降のような種々の用途において、
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の代替物とし
ての効力が証明された。
【０００３】（発明の背景）タンパク質の検出、単離お
よび精製では、タンパク質を未変性または変性型のいず
れかで認識する抗体の能力が利用される。しかし、必要
な抗体、特にモノクローナル抗体は、これらの抗体の入
手および精製のための方法が一般に時間と費用がかかる
ために、必ずしも容易に利用できるとは限らない。さら
に、抗体を開発するために、免疫系に認識させるべき分
子は、「抗原性」である必要があり、すなわち外来タン
パク質として免疫系に認識される必要があり、これはよ
くある状況ではない。一方抗体はかさ高く、これは組織
へのこれらの拡散および腫瘍のような標的へのこれらの
利用可能性に影響するだけでなく、免疫原性反応の引き
金になりうる性質である。これらの要因は、特に、抗体
の治療的応用に影響しこれを限定する。
よび精製では、タンパク質を未変性または変性型のいず
れかで認識する抗体の能力が利用される。しかし、必要
な抗体、特にモノクローナル抗体は、これらの抗体の入
手および精製のための方法が一般に時間と費用がかかる
ために、必ずしも容易に利用できるとは限らない。さら
に、抗体を開発するために、免疫系に認識させるべき分
子は、「抗原性」である必要があり、すなわち外来タン
パク質として免疫系に認識される必要があり、これはよ
くある状況ではない。一方抗体はかさ高く、これは組織
へのこれらの拡散および腫瘍のような標的へのこれらの
利用可能性に影響するだけでなく、免疫原性反応の引き
金になりうる性質である。これらの要因は、特に、抗体
の治療的応用に影響しこれを限定する。
【０００４】したがって、「合成抗体」、すなわちウェ
スタンブロット、免疫組織染色、免疫沈降などのような
測定法において抗体のように作用することができる、動
物、哺乳動物細胞、免疫系などを必要とせずに得られる
合成分子を開発できれば、非常に有益である。研究と診
断の重要な道具であること以外に、これらの分子はさら
に、癌または自己免疫過程のような疾患における免疫療
法のための方法の効率を改善する助けとなろう。
スタンブロット、免疫組織染色、免疫沈降などのような
測定法において抗体のように作用することができる、動
物、哺乳動物細胞、免疫系などを必要とせずに得られる
合成分子を開発できれば、非常に有益である。研究と診
断の重要な道具であること以外に、これらの分子はさら
に、癌または自己免疫過程のような疾患における免疫療
法のための方法の効率を改善する助けとなろう。
【０００５】高い親和性でタンパク質を認識する試薬を
調製するために、最近いくつかの方法が着想および応用
されている。これらの方法は、オリゴヌクレオチドでは
ない標的（例えばタンパク質、低分子、代謝物）に結合
するある種のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）の能力に基づいている。これらの試薬は、ランダム
配列の領域を含む組合せ合成から誘導される配列を有す
る、１本鎖の集団から構成され、４つの塩基（Ａ、Ｃ、
Ｇ、およびＴ）の混合物を合成の各工程に添加すること
により得られる。このように、数十億の異なるコンホメ
ーション（約１０ 14個）を有しており、そのいくつか
は、高い親和性で標的に結合することができる、１本鎖
オリゴヌクレオチドのライブラリーまたはコレクション
が得られる。この領域における最初の研究は、ツエルク
（Tuerk）とゴールド（Gold）（ツエルク（Tuerk）とゴ
ールド（Gold）（1990）「指数関数的濃縮によるリガン
ドの系統的進化：バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼに対するＲＮＡリガンド」, Science, 249:505
-10）、エリントン（Ellington）とゾスタック（Szosta
k）（エリントン（Ellington）とゾスタック（Szosta
k）（1990）「特異的リガンドに結合するＲＮＡ分子の
インビトロ選択」, Nature, 346:818-22）およびブラッ
クウェル（Blackwell）とヴァイントラウプ（Weintrau
b）（ブラックウェル（Blackwell）とヴァイントラウプ
（Weintraub）（1990）「結合部位選択により現れるＭ
ｙｏＤおよびＥ２Ａタンパク質複合体のＤＮＡ結合優先
における差と類似性」, Science, 250:1104-10）により
行われた。
調製するために、最近いくつかの方法が着想および応用
されている。これらの方法は、オリゴヌクレオチドでは
ない標的（例えばタンパク質、低分子、代謝物）に結合
するある種のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）の能力に基づいている。これらの試薬は、ランダム
配列の領域を含む組合せ合成から誘導される配列を有す
る、１本鎖の集団から構成され、４つの塩基（Ａ、Ｃ、
Ｇ、およびＴ）の混合物を合成の各工程に添加すること
により得られる。このように、数十億の異なるコンホメ
ーション（約１０ 14個）を有しており、そのいくつか
は、高い親和性で標的に結合することができる、１本鎖
オリゴヌクレオチドのライブラリーまたはコレクション
が得られる。この領域における最初の研究は、ツエルク
（Tuerk）とゴールド（Gold）（ツエルク（Tuerk）とゴ
ールド（Gold）（1990）「指数関数的濃縮によるリガン
ドの系統的進化：バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼに対するＲＮＡリガンド」, Science, 249:505
-10）、エリントン（Ellington）とゾスタック（Szosta
k）（エリントン（Ellington）とゾスタック（Szosta
k）（1990）「特異的リガンドに結合するＲＮＡ分子の
インビトロ選択」, Nature, 346:818-22）およびブラッ
クウェル（Blackwell）とヴァイントラウプ（Weintrau
b）（ブラックウェル（Blackwell）とヴァイントラウプ
（Weintraub）（1990）「結合部位選択により現れるＭ
ｙｏＤおよびＥ２Ａタンパク質複合体のＤＮＡ結合優先
における差と類似性」, Science, 250:1104-10）により
行われた。
【０００６】ある標的に対して親和性を有するこれらの
ライブラリーのメンバーを選択するための方法を、ラリ
ー・ゴールド（Larry Gold）と共同研究者達（ツエルク
（Tuerk）とゴールド（Gold）（1990）「指数関数的濃
縮によるリガンドの系統的進化：バクテリオファージＴ
４ ＤＮＡポリメラーゼに対するＲＮＡリガンド」,Sci
ence, 249:505-10）は、セレックス（SELEX）と呼び；
一方エリントン（Ellington）と共同研究者達（エリン
トン（Ellington）とゾスタック（Szostak）（1990）
「特異的リガンドに結合するＲＮＡ分子のインビトロ選
択」, Nature, 346:818-22）は、これらの試薬を「アプ
タマー（aptamers）」と呼んだ。簡単に述べると、ラン
ダムコア配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を、
一般には固体支持体に結合した標的分子で刺激する。標
的に親和性を有するこれらのオリゴヌクレオチドの結合
後、洗浄工程を利用して、低親和性または親和性のない
オリゴヌクレオチドを廃棄することにより、高い親和性
を有するものを選択および分離することができる。次に
結合した高い親和性のオリゴヌクレオチドを標的から分
離して、ライブラリーの５’および３’末端両方の固定
配列に対して相補的な配列を含む前進および逆進プライ
マーを用いることによりＰＣＲ増幅する。この方法によ
って、２本鎖オリゴヌクレオチドの多数のコピーが得ら
れる。次にこれらの鎖は、いくつかの異なる方法を使用
することにより分離して、多数のコンホメーションの１
本鎖分子として標的に再度結合させることができる。こ
のサイクルを数回繰り返すことにより、各工程において
標的に対する高い親和性を有するアプタマーの量を増大
させることができる。この一般法のいくつかの変法が、
引用文献に言及される。
ライブラリーのメンバーを選択するための方法を、ラリ
ー・ゴールド（Larry Gold）と共同研究者達（ツエルク
（Tuerk）とゴールド（Gold）（1990）「指数関数的濃
縮によるリガンドの系統的進化：バクテリオファージＴ
４ ＤＮＡポリメラーゼに対するＲＮＡリガンド」,Sci
ence, 249:505-10）は、セレックス（SELEX）と呼び；
一方エリントン（Ellington）と共同研究者達（エリン
トン（Ellington）とゾスタック（Szostak）（1990）
「特異的リガンドに結合するＲＮＡ分子のインビトロ選
択」, Nature, 346:818-22）は、これらの試薬を「アプ
タマー（aptamers）」と呼んだ。簡単に述べると、ラン
ダムコア配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を、
一般には固体支持体に結合した標的分子で刺激する。標
的に親和性を有するこれらのオリゴヌクレオチドの結合
後、洗浄工程を利用して、低親和性または親和性のない
オリゴヌクレオチドを廃棄することにより、高い親和性
を有するものを選択および分離することができる。次に
結合した高い親和性のオリゴヌクレオチドを標的から分
離して、ライブラリーの５’および３’末端両方の固定
配列に対して相補的な配列を含む前進および逆進プライ
マーを用いることによりＰＣＲ増幅する。この方法によ
って、２本鎖オリゴヌクレオチドの多数のコピーが得ら
れる。次にこれらの鎖は、いくつかの異なる方法を使用
することにより分離して、多数のコンホメーションの１
本鎖分子として標的に再度結合させることができる。こ
のサイクルを数回繰り返すことにより、各工程において
標的に対する高い親和性を有するアプタマーの量を増大
させることができる。この一般法のいくつかの変法が、
引用文献に言及される。
【０００７】しかしセレックス（SELEX）により得られ
る結果は、未だ満足のいくものではない。最初の研究の
１０年後でさえ、約１５０種の異なる分子に対する限ら
れた量のアプタマーしか得られていない。例としては、
トロンビン（ボック（Bock）ら（1992）「ヒトトロンビ
ンに結合してこれを阻害する１本鎖ＤＮＡ分子の選
択」, Nature, 355:564-6）、セレクチンＰ（ジェニソ
ン（Jenison）ら（1998）「Ｐ−セレクチン−依存性好
中球−血小板接着のオリゴヌクレオチドインヒビタ
ー」, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 8:265-7
9）、ＶＥＧＦ（ジェリネック（Jellinek）ら（1994）
「血管内皮増殖因子に対する高親和性ＲＮＡリガンドに
よる受容体結合の阻害」, Biochemistry, 33:10450-6；
ラックマン（Ruckman）ら（1998）「１６５アミノ酸型
の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ１６５）に対する２’−
フルオロピリミジンＲＮＡに基づくアプタマー。エクソ
ン７がコードするドメインを必要とする相互作用によ
る、受容体結合およびＶＥＧＦ誘導性血管透過性の阻
害」, J. Biol. Chem., 273:20556-67）；インターフェ
ロンγ（バラスブラマニアン（Balasubramanian）ら（1
998）「インターフェロン−ガンマ−阻害性オリゴデオ
キシヌクレオチドはインターフェロン−ガンマのコンホ
メーションを変化させる」, Mol. Pharmacol., 53:926-
32；リー（Lee）ら（1996）「オリゴヌクレオチドはイ
ンターフェロン−ガンマのシグナル伝達をブロックす
る」, Transplantation, 62:1297-301；クービック（Ku
bik）ら（1997）「受容体結合を阻害する、ヒトＩＦＮ
−ガンマに対する２’−フルオロ−、２’−アミノ−、
および２’−フルオロ−／アミノ−修飾ＲＮＡリガンド
の単離と性状解析」,J. Immunol., 159:259-67）；ＣＤ
４（デイヴィス（Davis）ら（1998）「フローサイトメ
トリーのための２’−Ｆ−ピリミジン−含有ＲＮＡアプ
タマーによる細胞表面ヒトＣＤ４の染色」, Nucleic Ac
ids Res., 26:3915-24；クラウス（Kraus）ら（1998）
「ＣＤ４抗原に結合してＣＤ４＋Ｔリンパ球機能を阻害
することができる新規なＲＮＡリガンド」, J. Immuno
l., 160:5209-12）；ズブチリシン（タケノ（Takeno）
ら（1999）「ズブチリシンのプロテアーゼ活性を特異的
に阻害するＲＮＡ分子の選択」, J. Biochem., 125:111
5-9）；肝炎からのプロテアーゼＮＳ３（クマール（Kum
ar）ら（1997）「相補的ランダムＲＮＡのプールからの
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質に特異的なＲＮＡ
アプタマーの単離」, Virology, 237:270-82；アーヴィ
ル（Urvil）ら（1997)「Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロ
テアーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの選
択」, Eur. J. Biochem., 248:130-8）；エラスターゼ
（デイヴィス（Davis）ら（1996）「フローサイトメト
リーにおける高親和性ＤＮＡリガンドの使用」, Nuclei
c Acid Res.,24:702-6；チャールトン（Charlton）ら
（1997）「ヒト好中球エラスターゼのアプタマーインヒ
ビターを使用する炎症のインビボイメージング」, Che
m. Biol., 4:809-16；ブレス（Bless）ら（1997）「肺
炎症性損傷における好中球エラスターゼのアプタマーイ
ンヒビターの保護作用」, Curr. Biol., 7:877-80）；
ＨＩＶ−１ウイルスのいくつかのタンパク質（ボイジア
ウ（Boiziau）ら（1997）「ＨＩＶ−１ ＴＡＲ成分の
インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型に対するアプタマー
の同定」, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7:369-
80；アレン（Allen）ら（1996）「特異的なＲＮＡ構造
モチーフはＨＩＶ−１ヌクレオキャプシドタンパク質
（ＮＣｐ７）による高親和性結合を仲介する」, Virolo
gy, 225:306-15；バーグランド（Berglund）ら（1997）
「ＨＩＶ−１ヌクレオキャプシドタンパク質に関する高
親和性結合部位」, Nucleic Acid Res., 25:1042-9；ボ
イジアウ（Boiziau）ら（1999）「ＨＩＶ−１トランス
−活性化−応答性ＲＮＡ成分に対して選択されたＤＮＡ
アプタマーはＲＮＡ−ＤＮＡキッシング複合体を形成す
る」, J. Biol. Chem., 274:12730-7；ギヴァー（Give
r）ら（1993）「ＨＩＶ−１Ｒｅｖに対する高親和性Ｒ
ＮＡリガンドの選択と設計」, Gene, 137:19-24；ジェ
ンセン（Jensen）ら（1994）「ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタン
パク質に対するインビトロで選択したＲＮＡリガンドの
性状解析」, J. Mol. Biol., 235:237-47；マロッツィ
（Marozzi）ら（1998）「Ｔａｔタンパク質によるＨＩ
Ｖ−１ ＴＡＲ変種のインビトロ選択」, J. Biotechno
l., 61:117-28；シュナイダー（Schneider）ら（1995）
「１型ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素の高親和性ｓ
ｓＤＮＡインヒビター」, Biochemistry, 34:9599-61
0；ツエルク（Tuerk）とマクドガル−ウォー（MacDouga
l-Waugh）（1993）「機能性核酸のインビトロ進化：Ｈ
ＩＶ−１タンパク質の高親和性ＲＮＡリガンド」, Gen
e, 137:33-9）；低分子、例えばアデノシン（バーク（B
urke）とゴールド（Gold）（1997）「Ｓ−アデノシルメ
チオニンのアデノシン残基に対するＲＮＡアプタマー：
セレックス（SELEX）の主題と再現性における変化から
の構造の推理」, Nucleic Acids Res., 25:2020-4；ヒ
ュイゼンガ（Huizenga）とゾスタック（Szostak）（199
5）「アデノシンとＡＴＰに結合するＤＮＡアプタマ
ー」, Biochemistry, 34:656-65）、ドーパミン（マニ
ロニ（Mannironi）ら（1997）「ドーパミンＲＮＡリガ
ンドのインビトロ選択」, Biochemistry, 36:9726-34）
などを含む。
る結果は、未だ満足のいくものではない。最初の研究の
１０年後でさえ、約１５０種の異なる分子に対する限ら
れた量のアプタマーしか得られていない。例としては、
トロンビン（ボック（Bock）ら（1992）「ヒトトロンビ
ンに結合してこれを阻害する１本鎖ＤＮＡ分子の選
択」, Nature, 355:564-6）、セレクチンＰ（ジェニソ
ン（Jenison）ら（1998）「Ｐ−セレクチン−依存性好
中球−血小板接着のオリゴヌクレオチドインヒビタ
ー」, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 8:265-7
9）、ＶＥＧＦ（ジェリネック（Jellinek）ら（1994）
「血管内皮増殖因子に対する高親和性ＲＮＡリガンドに
よる受容体結合の阻害」, Biochemistry, 33:10450-6；
ラックマン（Ruckman）ら（1998）「１６５アミノ酸型
の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ１６５）に対する２’−
フルオロピリミジンＲＮＡに基づくアプタマー。エクソ
ン７がコードするドメインを必要とする相互作用によ
る、受容体結合およびＶＥＧＦ誘導性血管透過性の阻
害」, J. Biol. Chem., 273:20556-67）；インターフェ
ロンγ（バラスブラマニアン（Balasubramanian）ら（1
998）「インターフェロン−ガンマ−阻害性オリゴデオ
キシヌクレオチドはインターフェロン−ガンマのコンホ
メーションを変化させる」, Mol. Pharmacol., 53:926-
32；リー（Lee）ら（1996）「オリゴヌクレオチドはイ
ンターフェロン−ガンマのシグナル伝達をブロックす
る」, Transplantation, 62:1297-301；クービック（Ku
bik）ら（1997）「受容体結合を阻害する、ヒトＩＦＮ
−ガンマに対する２’−フルオロ−、２’−アミノ−、
および２’−フルオロ−／アミノ−修飾ＲＮＡリガンド
の単離と性状解析」,J. Immunol., 159:259-67）；ＣＤ
４（デイヴィス（Davis）ら（1998）「フローサイトメ
トリーのための２’−Ｆ−ピリミジン−含有ＲＮＡアプ
タマーによる細胞表面ヒトＣＤ４の染色」, Nucleic Ac
ids Res., 26:3915-24；クラウス（Kraus）ら（1998）
「ＣＤ４抗原に結合してＣＤ４＋Ｔリンパ球機能を阻害
することができる新規なＲＮＡリガンド」, J. Immuno
l., 160:5209-12）；ズブチリシン（タケノ（Takeno）
ら（1999）「ズブチリシンのプロテアーゼ活性を特異的
に阻害するＲＮＡ分子の選択」, J. Biochem., 125:111
5-9）；肝炎からのプロテアーゼＮＳ３（クマール（Kum
ar）ら（1997）「相補的ランダムＲＮＡのプールからの
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質に特異的なＲＮＡ
アプタマーの単離」, Virology, 237:270-82；アーヴィ
ル（Urvil）ら（1997)「Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロ
テアーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの選
択」, Eur. J. Biochem., 248:130-8）；エラスターゼ
（デイヴィス（Davis）ら（1996）「フローサイトメト
リーにおける高親和性ＤＮＡリガンドの使用」, Nuclei
c Acid Res.,24:702-6；チャールトン（Charlton）ら
（1997）「ヒト好中球エラスターゼのアプタマーインヒ
ビターを使用する炎症のインビボイメージング」, Che
m. Biol., 4:809-16；ブレス（Bless）ら（1997）「肺
炎症性損傷における好中球エラスターゼのアプタマーイ
ンヒビターの保護作用」, Curr. Biol., 7:877-80）；
ＨＩＶ−１ウイルスのいくつかのタンパク質（ボイジア
ウ（Boiziau）ら（1997）「ＨＩＶ−１ ＴＡＲ成分の
インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型に対するアプタマー
の同定」, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7:369-
80；アレン（Allen）ら（1996）「特異的なＲＮＡ構造
モチーフはＨＩＶ−１ヌクレオキャプシドタンパク質
（ＮＣｐ７）による高親和性結合を仲介する」, Virolo
gy, 225:306-15；バーグランド（Berglund）ら（1997）
「ＨＩＶ−１ヌクレオキャプシドタンパク質に関する高
親和性結合部位」, Nucleic Acid Res., 25:1042-9；ボ
イジアウ（Boiziau）ら（1999）「ＨＩＶ−１トランス
−活性化−応答性ＲＮＡ成分に対して選択されたＤＮＡ
アプタマーはＲＮＡ−ＤＮＡキッシング複合体を形成す
る」, J. Biol. Chem., 274:12730-7；ギヴァー（Give
r）ら（1993）「ＨＩＶ−１Ｒｅｖに対する高親和性Ｒ
ＮＡリガンドの選択と設計」, Gene, 137:19-24；ジェ
ンセン（Jensen）ら（1994）「ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタン
パク質に対するインビトロで選択したＲＮＡリガンドの
性状解析」, J. Mol. Biol., 235:237-47；マロッツィ
（Marozzi）ら（1998）「Ｔａｔタンパク質によるＨＩ
Ｖ−１ ＴＡＲ変種のインビトロ選択」, J. Biotechno
l., 61:117-28；シュナイダー（Schneider）ら（1995）
「１型ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素の高親和性ｓ
ｓＤＮＡインヒビター」, Biochemistry, 34:9599-61
0；ツエルク（Tuerk）とマクドガル−ウォー（MacDouga
l-Waugh）（1993）「機能性核酸のインビトロ進化：Ｈ
ＩＶ−１タンパク質の高親和性ＲＮＡリガンド」, Gen
e, 137:33-9）；低分子、例えばアデノシン（バーク（B
urke）とゴールド（Gold）（1997）「Ｓ−アデノシルメ
チオニンのアデノシン残基に対するＲＮＡアプタマー：
セレックス（SELEX）の主題と再現性における変化から
の構造の推理」, Nucleic Acids Res., 25:2020-4；ヒ
ュイゼンガ（Huizenga）とゾスタック（Szostak）（199
5）「アデノシンとＡＴＰに結合するＤＮＡアプタマ
ー」, Biochemistry, 34:656-65）、ドーパミン（マニ
ロニ（Mannironi）ら（1997）「ドーパミンＲＮＡリガ
ンドのインビトロ選択」, Biochemistry, 36:9726-34）
などを含む。
【０００８】多少異なる方策を用いて、スー（Xu）とエ
リントン（Ellington）は、タンパク質Ｒｅｖの断片に
対応する合成ペプチドにセレックス（SELEX）を応用し
た（スー（Xu）とエリントン（Ellington）（1996）
「抗−ペプチドアプタマーはアミノ酸配列を認識してタ
ンパク質エピトープに結合する」, Proc. Natl. Acad.S
ci. USA., 93:7475-80）。１０サイクルの選択後、タン
パク質Ｒｅｖに結合できるＲＮＡが得られた。しかし、
このタンパク質は天然にＲＮＡに結合するため、この結
果が一般化できるかどうかを知ることは困難であった。
さらに、特異性は納得のゆくように証明されなかった。
ゲルシフト測定法を使用して特異性を証明したが、タン
パク質の混合物（例えば核抽出物、細胞質ゾルなど）で
はなく、ゲルシフトで通常行われるようにわずかな他の
純粋なタンパク質を使用して行った。さらに、ウェスタ
ンブロットは行わなかった。したがって、使用した方法
は、納得のゆくように特異性を証明しなかった。ここ
で、このことがアプタマーまたはセレックス（SELEX）
に関するどの研究にも共通の、非常に重大な限界である
ことに注意することが重要である。すなわちタンパク質
に対して選択された試薬の特異性は、抗体のための適切
な方法（例えば、総タンパク質の混合物を使用して準備
されたウェスタンブロット、または免疫組織染色または
免疫沈降）では明白に証明されていない。
リントン（Ellington）は、タンパク質Ｒｅｖの断片に
対応する合成ペプチドにセレックス（SELEX）を応用し
た（スー（Xu）とエリントン（Ellington）（1996）
「抗−ペプチドアプタマーはアミノ酸配列を認識してタ
ンパク質エピトープに結合する」, Proc. Natl. Acad.S
ci. USA., 93:7475-80）。１０サイクルの選択後、タン
パク質Ｒｅｖに結合できるＲＮＡが得られた。しかし、
このタンパク質は天然にＲＮＡに結合するため、この結
果が一般化できるかどうかを知ることは困難であった。
さらに、特異性は納得のゆくように証明されなかった。
ゲルシフト測定法を使用して特異性を証明したが、タン
パク質の混合物（例えば核抽出物、細胞質ゾルなど）で
はなく、ゲルシフトで通常行われるようにわずかな他の
純粋なタンパク質を使用して行った。さらに、ウェスタ
ンブロットは行わなかった。したがって、使用した方法
は、納得のゆくように特異性を証明しなかった。ここ
で、このことがアプタマーまたはセレックス（SELEX）
に関するどの研究にも共通の、非常に重大な限界である
ことに注意することが重要である。すなわちタンパク質
に対して選択された試薬の特異性は、抗体のための適切
な方法（例えば、総タンパク質の混合物を使用して準備
されたウェスタンブロット、または免疫組織染色または
免疫沈降）では明白に証明されていない。
【０００９】したがって、タンパク質−オリゴヌクレオ
チド高親和性に基づく先行技術の方法では、未変性また
は変性された任意の標的タンパク質に対して抗体と同等
な試薬は産生されていないし、また、このようなアプタ
マーの特異性も納得のゆく証明がされていない。さら
に、これまで報告された方法は、時間と手間がかかり、
一般に１０サイクル〜２５サイクルの選択／増幅を必要
とし、選択の方法中にセンス鎖とアンチセンス鎖の分離
を必要とする。さらに、セレックス（SELEX）方法後に
これらの試薬を得るためには、純粋で未変性型の標的タ
ンパク質を持つ必要があり、そして最終産物は、未変性
タンパク質のみを認識する（ヴァイス（Weiss）ら（199
7）「ＲＮＡアプタマーはプリオンタンパク質ＰｒＰと
特異的に相互作用する」, J. Virol., 71:8790-7）必要
があり、このことが別の重大な限界である。全体とし
て、セレックス（SELEX）法の有効性は、１０年後にな
っても、セレックス（SELEX）方法により得られた試薬
は、非常に要求の厳しい抗体市場を侵略はおろか探索さ
えしていないという事実により充分に明らかになってい
る。
チド高親和性に基づく先行技術の方法では、未変性また
は変性された任意の標的タンパク質に対して抗体と同等
な試薬は産生されていないし、また、このようなアプタ
マーの特異性も納得のゆく証明がされていない。さら
に、これまで報告された方法は、時間と手間がかかり、
一般に１０サイクル〜２５サイクルの選択／増幅を必要
とし、選択の方法中にセンス鎖とアンチセンス鎖の分離
を必要とする。さらに、セレックス（SELEX）方法後に
これらの試薬を得るためには、純粋で未変性型の標的タ
ンパク質を持つ必要があり、そして最終産物は、未変性
タンパク質のみを認識する（ヴァイス（Weiss）ら（199
7）「ＲＮＡアプタマーはプリオンタンパク質ＰｒＰと
特異的に相互作用する」, J. Virol., 71:8790-7）必要
があり、このことが別の重大な限界である。全体とし
て、セレックス（SELEX）法の有効性は、１０年後にな
っても、セレックス（SELEX）方法により得られた試薬
は、非常に要求の厳しい抗体市場を侵略はおろか探索さ
えしていないという事実により充分に明らかになってい
る。
【００１０】（発明の要約）先行技術の問題点は、合成
ペプチド、合成オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ、および最
も重要なことに「標的スイッチング」と命名された方策
（これは、主として親和性よりむしろ特異性に基づく選
択を意味する）の利用を組合せる本発明により克服され
る。こうして産生された試薬は、そのオリゴヌクレオチ
ドの性質とその抗体としての挙動のために「オリゴ体」
と呼ばれる。利点の１つは、本発明は一般にわずかに４
サイクルまたは５サイクルの選択／増幅しか必要としな
いことである。さらに、得られる試薬は、非常に高い特
異性が証明されており、これはウェスタンブロット、免
疫組織染色および免疫沈降を用いて、初めて検証されて
いる。増幅後にＤＮＡ鎖の分離を必要とせず、そして合
成ペプチドを使用するため、最終的な標的を純粋な形で
得る必要がない。さらに、本法は免疫系とは独立してい
るため、「抗原性」領域を必要とすることなくタンパク
質の異なる領域に対して「モノクローナルオリゴ体」ま
たは「ポリクローナルオリゴ体」を産生することが可能
である。本発明のオリゴ体が標的タンパク質の「抗原
性」領域に限定されないという事実は、従来の抗体にま
さる重要な利点である。対応するペプチドを合成しかつ
標的タンパク質に対するオリゴ体を調製することが可能
であるためには、タンパク質（またはＡＤＮまたはＡＲ
Ｎ）の一部の配列を知ることが必要なだけである。オリ
ゴ体は、放射性同位体またはビオチンの結合のようなオ
リゴヌクレオチドを標識するための任意の従来法で標識
することができる。
ペプチド、合成オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ、および最
も重要なことに「標的スイッチング」と命名された方策
（これは、主として親和性よりむしろ特異性に基づく選
択を意味する）の利用を組合せる本発明により克服され
る。こうして産生された試薬は、そのオリゴヌクレオチ
ドの性質とその抗体としての挙動のために「オリゴ体」
と呼ばれる。利点の１つは、本発明は一般にわずかに４
サイクルまたは５サイクルの選択／増幅しか必要としな
いことである。さらに、得られる試薬は、非常に高い特
異性が証明されており、これはウェスタンブロット、免
疫組織染色および免疫沈降を用いて、初めて検証されて
いる。増幅後にＤＮＡ鎖の分離を必要とせず、そして合
成ペプチドを使用するため、最終的な標的を純粋な形で
得る必要がない。さらに、本法は免疫系とは独立してい
るため、「抗原性」領域を必要とすることなくタンパク
質の異なる領域に対して「モノクローナルオリゴ体」ま
たは「ポリクローナルオリゴ体」を産生することが可能
である。本発明のオリゴ体が標的タンパク質の「抗原
性」領域に限定されないという事実は、従来の抗体にま
さる重要な利点である。対応するペプチドを合成しかつ
標的タンパク質に対するオリゴ体を調製することが可能
であるためには、タンパク質（またはＡＤＮまたはＡＲ
Ｎ）の一部の配列を知ることが必要なだけである。オリ
ゴ体は、放射性同位体またはビオチンの結合のようなオ
リゴヌクレオチドを標識するための任意の従来法で標識
することができる。
【００１１】本発明は「オリゴ体」を説明し、そしてこ
れらを組合せライブラリーから効率的に入手するための
方法を含む。オリゴ体はその特異性と応用に関して抗体
と類似した性質を有する。本発明で説明されるオリゴ体
を入手するための方法は、純粋なタンパク質を必要とし
ない。さらに本方法はまた、データベースから得られる
対応するＤＮＡまたはＲＮＡ配列からの部分的コード配
列を知ることまたは単に推測すること、そしてそのタン
パク質を発現する組織の非常に粗い調製物を有すること
で充分であるため、目的のタンパク質が精製されていな
い状況にも応用可能である。
れらを組合せライブラリーから効率的に入手するための
方法を含む。オリゴ体はその特異性と応用に関して抗体
と類似した性質を有する。本発明で説明されるオリゴ体
を入手するための方法は、純粋なタンパク質を必要とし
ない。さらに本方法はまた、データベースから得られる
対応するＤＮＡまたはＲＮＡ配列からの部分的コード配
列を知ることまたは単に推測すること、そしてそのタン
パク質を発現する組織の非常に粗い調製物を有すること
で充分であるため、目的のタンパク質が精製されていな
い状況にも応用可能である。
【００１２】本発明の方策は、「一時的標的」として標
的タンパク質の断片に対応する合成ペプチドを使用する
こと、およびこの合成ペプチドを認識できるオリゴヌク
レオチドの最初の選択を行うことである。次に検出可能
な結合が得られた後（これは、通常わずか１または２サ
イクルの選択／ＰＣＲ増幅後に起こる）、合成ペプチド
（一時的標的）を「最終標的」（これは、好ましくはタ
ンパク質の非常に粗い調製物として存在する）で置き換
える。この方策は、「標的スイッチング」と呼ばれるよ
うに、標的タンパク質に特異的なオリゴ体を入手するた
めに非常に重要である。必要であれば、特異性の改善が
もはや得られなくなるまで、最終標的で新しいサイクル
の選択が繰り返されるが、これは通常わずか２または３
選択サイクル後に起こる。こうしてオリゴ体（すなわ
ち、抗体と非常に類似した挙動を示す試薬）は、合成ペ
プチドと、最終的標的タンパク質を含むタンパク質混合
物を使用することにより得られる。さらに本発明によ
り、ＣＰＤ１についての図４および例４に示されるよう
に、そのＡＤＮ配列の断片から推測されるタンパク質に
対する「オリゴ体」を調製することができる。タンパク
質ＣＰＤ１は、これまで実験室で精製されておらず、従
って良好なモデル系である（ジーンバンク（GenBank）
受け入れ番号Ｕ８９３４５）。
的タンパク質の断片に対応する合成ペプチドを使用する
こと、およびこの合成ペプチドを認識できるオリゴヌク
レオチドの最初の選択を行うことである。次に検出可能
な結合が得られた後（これは、通常わずか１または２サ
イクルの選択／ＰＣＲ増幅後に起こる）、合成ペプチド
（一時的標的）を「最終標的」（これは、好ましくはタ
ンパク質の非常に粗い調製物として存在する）で置き換
える。この方策は、「標的スイッチング」と呼ばれるよ
うに、標的タンパク質に特異的なオリゴ体を入手するた
めに非常に重要である。必要であれば、特異性の改善が
もはや得られなくなるまで、最終標的で新しいサイクル
の選択が繰り返されるが、これは通常わずか２または３
選択サイクル後に起こる。こうしてオリゴ体（すなわ
ち、抗体と非常に類似した挙動を示す試薬）は、合成ペ
プチドと、最終的標的タンパク質を含むタンパク質混合
物を使用することにより得られる。さらに本発明によ
り、ＣＰＤ１についての図４および例４に示されるよう
に、そのＡＤＮ配列の断片から推測されるタンパク質に
対する「オリゴ体」を調製することができる。タンパク
質ＣＰＤ１は、これまで実験室で精製されておらず、従
って良好なモデル系である（ジーンバンク（GenBank）
受け入れ番号Ｕ８９３４５）。
【００１３】本発明の方法において、「一時的標的」と
して合成ペプチドを使用することによるライブラリーサ
ブセットの最初の選択、およびこれに続く「標的スイッ
チング」は非常に重要である。合成ペプチドを使用する
ことにより選択されるサブセットは、標的のスイッチン
グ後、未変性、変性または両方の形の「最終標的」を認
識することができる。これは、液相または固相において
多数のコンホメーションを取る合成ペプチドの能力によ
り促進される（クロダ（Kuroda）ら（1994）「モンテカ
ルロ（Monte-Carlo）シミュレーションにより試験した
水溶液中のエンドセリン−１のＣ末端のコンホメーショ
ン」, FEBS Lett., 355:263-6；リー（Li）ら（1995）
「環境および／または１次配列の微調整によるペプチド
コンホメーションの操作」, Biopolymers, 35:667-75）
が、これらのいくつかは、未変性または変性標的タンパ
ク質に存在するコンホメーションを有する。特異性は、
この新しいサブセットから、標的のスイッチング後、数
千のタンパク質の混合物と一緒の最終標的の存在のため
に得られる（ウェスタンブロット、ゲルシフトなど
で）。
して合成ペプチドを使用することによるライブラリーサ
ブセットの最初の選択、およびこれに続く「標的スイッ
チング」は非常に重要である。合成ペプチドを使用する
ことにより選択されるサブセットは、標的のスイッチン
グ後、未変性、変性または両方の形の「最終標的」を認
識することができる。これは、液相または固相において
多数のコンホメーションを取る合成ペプチドの能力によ
り促進される（クロダ（Kuroda）ら（1994）「モンテカ
ルロ（Monte-Carlo）シミュレーションにより試験した
水溶液中のエンドセリン−１のＣ末端のコンホメーショ
ン」, FEBS Lett., 355:263-6；リー（Li）ら（1995）
「環境および／または１次配列の微調整によるペプチド
コンホメーションの操作」, Biopolymers, 35:667-75）
が、これらのいくつかは、未変性または変性標的タンパ
ク質に存在するコンホメーションを有する。特異性は、
この新しいサブセットから、標的のスイッチング後、数
千のタンパク質の混合物と一緒の最終標的の存在のため
に得られる（ウェスタンブロット、ゲルシフトなど
で）。
【００１４】本発明は、タンパク質を認識するための試
薬の製造において重要な革新を導入し、未変性および変
性タンパク質の両方の認識を初めて可能にする。さら
に、ウェスタンブロット、免疫組織染色および免疫沈降
のような、以前は合成試薬に対して予め除外されており
抗体だけに制限されていた方法を使用することにより、
本発明のオリゴ体の特異性が初めて明瞭に証明された。
薬の製造において重要な革新を導入し、未変性および変
性タンパク質の両方の認識を初めて可能にする。さら
に、ウェスタンブロット、免疫組織染色および免疫沈降
のような、以前は合成試薬に対して予め除外されており
抗体だけに制限されていた方法を使用することにより、
本発明のオリゴ体の特異性が初めて明瞭に証明された。
【００１５】何らかの型の最終標的を認識できるオリゴ
体を産生する必要に応じて、最終標的は、未変性または
変性型の形で存在しなければならない。あるいは、両方
の形が認識できる試薬が開発されるなら、両方の形の混
合物により構成されていてもよい。合成ペプチドの使用
も重要である。また標的のコンホメーションの空間が、
セレックス（SELEX）のように、未変性タンパク質に許
されるほとんど暴露されない適切なコンホメーションに
制限されていないため、これにより純粋なタンパク質の
必要性が回避され、試薬の入手に成功する確率が増大す
る。当然ながら、未変性タンパク質中で合成ペプチドの
配列が塞がれているならば、オリゴ体は変性タンパク質
だけを認識し未変性タンパク質を認識しない可能性もあ
る。このため、表面に暴露されるであろう標的タンパク
質中の領域を同定または予測することができるある種の
コンピュータプログラムを使用すること、および「一時
的標的」として対応する合成ペプチドを使用することが
推奨される。
体を産生する必要に応じて、最終標的は、未変性または
変性型の形で存在しなければならない。あるいは、両方
の形が認識できる試薬が開発されるなら、両方の形の混
合物により構成されていてもよい。合成ペプチドの使用
も重要である。また標的のコンホメーションの空間が、
セレックス（SELEX）のように、未変性タンパク質に許
されるほとんど暴露されない適切なコンホメーションに
制限されていないため、これにより純粋なタンパク質の
必要性が回避され、試薬の入手に成功する確率が増大す
る。当然ながら、未変性タンパク質中で合成ペプチドの
配列が塞がれているならば、オリゴ体は変性タンパク質
だけを認識し未変性タンパク質を認識しない可能性もあ
る。このため、表面に暴露されるであろう標的タンパク
質中の領域を同定または予測することができるある種の
コンピュータプログラムを使用すること、および「一時
的標的」として対応する合成ペプチドを使用することが
推奨される。
【００１６】一方、本方法にはさらに別の利点がある。
例えば、ペプチド中の抗原性領域は必要とされないた
め、本方策は免疫系とは独立である。その代わり、オリ
ゴ体は、標的タンパク質中の特異的領域に対して、また
はあるファミリーのタンパク質を同定しようとするなら
ばコンセンサス配列に対して、またはユニークな配列な
どに対して得ることができる。
例えば、ペプチド中の抗原性領域は必要とされないた
め、本方策は免疫系とは独立である。その代わり、オリ
ゴ体は、標的タンパク質中の特異的領域に対して、また
はあるファミリーのタンパク質を同定しようとするなら
ばコンセンサス配列に対して、またはユニークな配列な
どに対して得ることができる。
【００１７】さらに本発明の１つの変法では、各サイク
ルにおいて一時的にせよ鎖を分離する必要なく、特異的
結合領域を得ることができる。このための方策は、結合
後に抽出される産物の最初の指数関数的増幅の実施、続
いて標識ヌクレオチドの存在下での線状増幅（または１
つだけのプライマーを使用する不斉ＰＣＲ）である。こ
の方法を使用することにより、センスおよびアンチセン
ス鎖を分離する面倒な方法を回避しながら、１つの標識
鎖のみを得ることができる。
ルにおいて一時的にせよ鎖を分離する必要なく、特異的
結合領域を得ることができる。このための方策は、結合
後に抽出される産物の最初の指数関数的増幅の実施、続
いて標識ヌクレオチドの存在下での線状増幅（または１
つだけのプライマーを使用する不斉ＰＣＲ）である。こ
の方法を使用することにより、センスおよびアンチセン
ス鎖を分離する面倒な方法を回避しながら、１つの標識
鎖のみを得ることができる。
【００１８】あるいは、鎖は、迅速な加熱と冷却により
一時的に分離することができる。しかし時に、選択され
るオリゴヌクレオチドの高い解離温度（Ｔｍ）が、この
単純な操作の利用を妨害する。
一時的に分離することができる。しかし時に、選択され
るオリゴヌクレオチドの高い解離温度（Ｔｍ）が、この
単純な操作の利用を妨害する。
【００１９】本発明はまた、別の非常に重要な変法を含
む。最初の増幅／選択サイクル後に高分子量種の形成が
観察された。これらの種は、各サイクルにおいてサイズ
が大きくなり、最終的には選択が不可能になる。この問
題は、指数関数的増幅後、アガロースゲルにおける分離
を使用して、各サイクルにおいて得られる産物を精製す
ることにより克服されている。次に、以後のＰＣＲ増幅
ではさらなるポリマー形成は観察されないが、未だ理由
は不明であるが、分子量は時に最初のライブラリーサイ
ズの１倍または２倍増大する。しかし、サイズが１倍ま
たは２倍大きいこれらの種は、結合に関しては完全に能
力がある。
む。最初の増幅／選択サイクル後に高分子量種の形成が
観察された。これらの種は、各サイクルにおいてサイズ
が大きくなり、最終的には選択が不可能になる。この問
題は、指数関数的増幅後、アガロースゲルにおける分離
を使用して、各サイクルにおいて得られる産物を精製す
ることにより克服されている。次に、以後のＰＣＲ増幅
ではさらなるポリマー形成は観察されないが、未だ理由
は不明であるが、分子量は時に最初のライブラリーサイ
ズの１倍または２倍増大する。しかし、サイズが１倍ま
たは２倍大きいこれらの種は、結合に関しては完全に能
力がある。
【００２０】望ましくない高分子量ポリマーの形成を回
避するための代替方策は、ＰＣＲ増幅工程で使用される
前進および逆進プライマーのサイズを増大させることで
ある（最初のライブラリーにおいて、これは必要でな
い）。３２量体（前進）プライマーおよび３８量体（逆
進）プライマーによって、高分子量ポリマーがうまく回
避されることが証明された。別の代替法は、エンド／エ
キソヌクレアーゼ活性を回避するために、配列中に誘導
体化オリゴヌクレオチドを使用することであり、この方
策は、未だ理由は不明であるが、ＰＣＲ増幅中の望まし
くないポリマーの形成を阻害する（結果は示していな
い）。
避するための代替方策は、ＰＣＲ増幅工程で使用される
前進および逆進プライマーのサイズを増大させることで
ある（最初のライブラリーにおいて、これは必要でな
い）。３２量体（前進）プライマーおよび３８量体（逆
進）プライマーによって、高分子量ポリマーがうまく回
避されることが証明された。別の代替法は、エンド／エ
キソヌクレアーゼ活性を回避するために、配列中に誘導
体化オリゴヌクレオチドを使用することであり、この方
策は、未だ理由は不明であるが、ＰＣＲ増幅中の望まし
くないポリマーの形成を阻害する（結果は示していな
い）。
【００２１】言及した種々の方策の中で最も重要なもの
（これは本発明の成功への鍵である）は、高親和性より
むしろ高特異性に基づく選択の使用であった。従来他の
研究者が使用した方法は、特異性は当然高親和性に至る
ことを仮定して、主として多数回の選択を実施して非常
に親和性の高いサブセットを探索することである（イー
トン（Eaton）ら（1995）「特異的なものを獲得しよ
う：特異性と親和性の間の関係」, Chem. Biol., 2:633
-8、を参照のこと）。しかしこの先行技術の仮定は、正
しくない。例えば、アプタマーは低分子を認識すること
ができるため、ペプチド鎖中のアミノ酸アルギニンを非
常に高い親和性で認識するオリゴヌクレオチドを単離す
ることができる。しかし、このオリゴヌクレオチドは、
表面に暴露されたアルギニンを有する大部分のタンパク
質、および混合物中のほぼ全ての変性タンパク質を認識
することは間違いない。したがってこのアプタマーはア
ルギニンに対する高い親和性を有するであろうが、非常
に非特異的でもある。一方本発明は、中程度の親和性で
タンパク質に結合するオリゴヌクレオチドでも非常に特
異的でありうるという事実を利用する。実際このこと
は、多数のモノクローナル抗体について起こり、これら
は中程度の親和性であるが高い特異性を有する。こうい
う理由で、本発明において使用される主要な方策は、最
初の工程で親和性にあまり注目することなく、可能な限
り即座に、非常に特異的な種を捜す選択を行うことであ
る。従って、検出可能なシグナルを有するのに充分な最
小数のサイクルを一時的標的で実施し、選択標的を即座
に、タンパク質の混合物中に存在する最終標的にスイッ
チングして、親和性ではなく主として特異性に関して選
択する。特異的結合が得られて初めて親和性に注目し
て、特異性の高いクローンから検出目的に充分な親和性
を有するクローンを選択する。すなわち、本発明の方策
は、セレックス（SELEX）または類似の方法で利用され
たものとはちょうど逆であり、後者では高親和性種を捜
し、多数回のサイクルの選択／増幅を実施する。このよ
うな選択が一旦行われると、ライブラリー（および性
質）の最も重要な特色である多様性が、小さくなるかま
たは消失する。そこで、高親和性を示すもののサブセッ
トから特異的な試薬を捜すことは既に遅すぎる。親和性
よりむしろ特異性に関する選択という本発明の方策によ
り我々は、１０年以上の間他の研究者にも非常に大きな
困難を克服する合成（オリゴヌクレオチドに基づく）抗
体または「オリゴ体」を初めて作りだすことが可能にな
ったため、この方策は非常に重要である。
（これは本発明の成功への鍵である）は、高親和性より
むしろ高特異性に基づく選択の使用であった。従来他の
研究者が使用した方法は、特異性は当然高親和性に至る
ことを仮定して、主として多数回の選択を実施して非常
に親和性の高いサブセットを探索することである（イー
トン（Eaton）ら（1995）「特異的なものを獲得しよ
う：特異性と親和性の間の関係」, Chem. Biol., 2:633
-8、を参照のこと）。しかしこの先行技術の仮定は、正
しくない。例えば、アプタマーは低分子を認識すること
ができるため、ペプチド鎖中のアミノ酸アルギニンを非
常に高い親和性で認識するオリゴヌクレオチドを単離す
ることができる。しかし、このオリゴヌクレオチドは、
表面に暴露されたアルギニンを有する大部分のタンパク
質、および混合物中のほぼ全ての変性タンパク質を認識
することは間違いない。したがってこのアプタマーはア
ルギニンに対する高い親和性を有するであろうが、非常
に非特異的でもある。一方本発明は、中程度の親和性で
タンパク質に結合するオリゴヌクレオチドでも非常に特
異的でありうるという事実を利用する。実際このこと
は、多数のモノクローナル抗体について起こり、これら
は中程度の親和性であるが高い特異性を有する。こうい
う理由で、本発明において使用される主要な方策は、最
初の工程で親和性にあまり注目することなく、可能な限
り即座に、非常に特異的な種を捜す選択を行うことであ
る。従って、検出可能なシグナルを有するのに充分な最
小数のサイクルを一時的標的で実施し、選択標的を即座
に、タンパク質の混合物中に存在する最終標的にスイッ
チングして、親和性ではなく主として特異性に関して選
択する。特異的結合が得られて初めて親和性に注目し
て、特異性の高いクローンから検出目的に充分な親和性
を有するクローンを選択する。すなわち、本発明の方策
は、セレックス（SELEX）または類似の方法で利用され
たものとはちょうど逆であり、後者では高親和性種を捜
し、多数回のサイクルの選択／増幅を実施する。このよ
うな選択が一旦行われると、ライブラリー（および性
質）の最も重要な特色である多様性が、小さくなるかま
たは消失する。そこで、高親和性を示すもののサブセッ
トから特異的な試薬を捜すことは既に遅すぎる。親和性
よりむしろ特異性に関する選択という本発明の方策によ
り我々は、１０年以上の間他の研究者にも非常に大きな
困難を克服する合成（オリゴヌクレオチドに基づく）抗
体または「オリゴ体」を初めて作りだすことが可能にな
ったため、この方策は非常に重要である。
【００２２】セレックス（SELEX）方法に内在するもう
１つの困難さは、得られた高親和性化合物は必ずコンホ
メーションが非常に限定されており、このため標的のコ
ンホメーションの小さな変更でも結合が破壊されてしま
うことである。セレックス（SELEX）方法が未変性タン
パク質または小さな硬直した低分子だけに有用であった
のは、恐らくこのためであろう。
１つの困難さは、得られた高親和性化合物は必ずコンホ
メーションが非常に限定されており、このため標的のコ
ンホメーションの小さな変更でも結合が破壊されてしま
うことである。セレックス（SELEX）方法が未変性タン
パク質または小さな硬直した低分子だけに有用であった
のは、恐らくこのためであろう。
【００２３】１．要約すると、本発明の利点は下記を含
む：（１）非常に少数回のサイクルの選択／増幅しか必
要としない：通常合成ペプチドでは２回、そしてタンパ
ク質の混合物では２回か３回。すなわち、先行技術の方
法で通常必要とされる１０回〜２５回に比較して、最大
４回か５回のサイクルしが必要でない。（２）標的タン
パク質は純粋である必要がない。それどころか、好まし
くは非常に粗調製物として使用するのがよい。この性質
により、たとえ標的タンパク質が未だ精製されていない
としても、データベースから推測される配列を持つタン
パク質に対してオリゴ体を作ることができる。また、こ
の方法を使用して、３つの可能性ある枠に対するオリゴ
体を合成し、次にどれが実際に天然に存在するかを決定
することにより、正しい読み枠を求めることが可能であ
る。（３）各増幅工程後、鎖を永久に分離させることを
必要としない。単に加熱／冷却またはｐＨ変更と中和に
より一時的に分離を行うか、あるいは鎖の一方を過剰に
得るための線状増幅を行うことを要するだけである。こ
のことは、選択中にも、さらには最終産物についても真
である。しかし試料の加熱後の希釈は、再結合を回避す
るために注意深く試験すべきであり、そしてＴｍは適切
である必要がある。Ｔｍが高すぎると、鎖を分離するた
めの異なる方法が必要となる。（４）モノクローナル抗
体に比較して、「オリゴ体」は、迅速な設計と製造、低
コスト、高親和性（nM範囲）、免疫系からの独立（標的
が抗原性である必要がない）および良好な拡散性（天然
の抗体より少なくとも５倍小さい）という利点がある。
この最後の性質は、モノクローナル抗体では標的への近
づきやすさが限定されているために失敗してきた腫瘍や
他の疾患の治療において、うまく使用できる確率を改善
する。オリゴ体は、その抗原性には無関係に、標的タン
パク質の異なる領域に対して、容易に製造することがで
きる。（５）診断、遺伝子発現研究などにおいて使用す
るため、ＤＮＡについて使用されるものと同様なチップ
を容易に製造することができる。
む：（１）非常に少数回のサイクルの選択／増幅しか必
要としない：通常合成ペプチドでは２回、そしてタンパ
ク質の混合物では２回か３回。すなわち、先行技術の方
法で通常必要とされる１０回〜２５回に比較して、最大
４回か５回のサイクルしが必要でない。（２）標的タン
パク質は純粋である必要がない。それどころか、好まし
くは非常に粗調製物として使用するのがよい。この性質
により、たとえ標的タンパク質が未だ精製されていない
としても、データベースから推測される配列を持つタン
パク質に対してオリゴ体を作ることができる。また、こ
の方法を使用して、３つの可能性ある枠に対するオリゴ
体を合成し、次にどれが実際に天然に存在するかを決定
することにより、正しい読み枠を求めることが可能であ
る。（３）各増幅工程後、鎖を永久に分離させることを
必要としない。単に加熱／冷却またはｐＨ変更と中和に
より一時的に分離を行うか、あるいは鎖の一方を過剰に
得るための線状増幅を行うことを要するだけである。こ
のことは、選択中にも、さらには最終産物についても真
である。しかし試料の加熱後の希釈は、再結合を回避す
るために注意深く試験すべきであり、そしてＴｍは適切
である必要がある。Ｔｍが高すぎると、鎖を分離するた
めの異なる方法が必要となる。（４）モノクローナル抗
体に比較して、「オリゴ体」は、迅速な設計と製造、低
コスト、高親和性（nM範囲）、免疫系からの独立（標的
が抗原性である必要がない）および良好な拡散性（天然
の抗体より少なくとも５倍小さい）という利点がある。
この最後の性質は、モノクローナル抗体では標的への近
づきやすさが限定されているために失敗してきた腫瘍や
他の疾患の治療において、うまく使用できる確率を改善
する。オリゴ体は、その抗原性には無関係に、標的タン
パク質の異なる領域に対して、容易に製造することがで
きる。（５）診断、遺伝子発現研究などにおいて使用す
るため、ＤＮＡについて使用されるものと同様なチップ
を容易に製造することができる。
【００２４】したがって、本発明は、オリゴ体、これら
を入手するための方法、およびこれまで抗体が使用され
てきた用途におけるオリゴ体の使用に関する。（発明の
詳細な説明）
を入手するための方法、およびこれまで抗体が使用され
てきた用途におけるオリゴ体の使用に関する。（発明の
詳細な説明）
【００２５】本発明は、天然のまたは変性型のタンパク
質を非常に特異的に認識するユニークな能力と、測定法
（ウェスタンブロット、免疫組織染色、および免疫沈降
を含むが、これらに限定されない）で抗体として挙動す
るユニークな能力を有する分子を含んでなる、ランダム
配列のオリゴヌクレオチドのライブラリーを使用して得
られる「オリゴ体」すなわち結合試薬を得る方法であっ
て、
質を非常に特異的に認識するユニークな能力と、測定法
（ウェスタンブロット、免疫組織染色、および免疫沈降
を含むが、これらに限定されない）で抗体として挙動す
るユニークな能力を有する分子を含んでなる、ランダム
配列のオリゴヌクレオチドのライブラリーを使用して得
られる「オリゴ体」すなわち結合試薬を得る方法であっ
て、
【００２６】ｉ）ランダムコア配列を含有するオリゴヌ
クレオチドのライブラリーを合成し、このライブラリー
を前進プライマーと逆進プライマーを使用してＰＣＲに
より指数関数的に増幅し（合成中に現れる末端切断型を
最少にする方法）；次に、増幅したライブラリーを精製
し、精製した生成物を１つのプライマーのみを使用する
線状または不斉ＰＣＲ増幅に供し； ii）工程ｉ）で得られた線状に増幅した生成物を、標的
タンパク質の領域に対応する合成ペプチドで作成した
「一時的標的」とともにインキュベートする。好ましく
は合成ペプチドは固体マトリックスに結合しているが、
液相への結合も使用でき、次に当該分野で公知のいくつ
かの方法のうち任意のものを使用して結合種と遊離種と
を分離する； iii）標的に結合したオリゴヌクレオチドを洗浄し、次
に溶出して、一時的標的に特異的に結合するオリゴヌク
レオチドを選択し； iv）次に、工程iii）で選択したオリゴヌクレオチドを
ＰＣＲにより指数関数的に増幅し、増幅した生成物を精
製し、そして次に、精製した生成物を、標識物質の存在
下で１つのプライマーのみを使用する線状ＰＣＲ増幅に
供し； ｖ）検出可能な結合が得られるまで工程ii）、iii）お
よびiv）を繰り返して、一時的標的に結合した選択され
たオリゴヌクレオチドを回収する。典型的には工程i
i）、iii）およびiv）は、１回または２回のみ繰り返せ
ばよい； vi）「最終標的」を含有するタンパク質の混合物により
合成ペプチドまたは「一時的標的」を変化させ（標的ス
イッチング）、工程ｖで回収したオリゴヌクレオチドを
最終標的とともにインキュベートし、最終標的に特異的
に結合するオリゴヌクレオチドを選択し； vii）工程Vi）で選択したオリゴヌクレオチドをＰＣＲ
により指数関数的に増幅し、増幅生成物を精製し、そし
て次に、精製した生成物を１つのプライマーのみを使用
する線状ＰＣＲ増幅に供し、線状増幅されたオリゴヌク
レオチドを回収し； viii）標的分子について特異的結合がもはや得られなく
なるまで工程vi）とvii）を繰り返し、得られた特異的
に結合したオリゴヌクレオチド（これは、「ポリクロー
ナルオリゴ体」を構成する）を採取する；これらの特異
的結合オリゴヌクレオチドまたはポリクローナルオリゴ
体はＰＣＲ増幅することができ、ベクター−Ｔ（プロメ
ガ社（Promega Corp.））のような適当なベクターに連
結し、クローン化し、スクリーニングし、精製して、一
定の規定配列を有する「モノクローナルオリゴ体」を得
ることができる。このモノクローナルオリゴ体は、次に
ＰＣＲ増幅、プラスミド消化、またはオリゴヌクレオチ
ド合成機を使用する完全な化学合成により、有用な量で
得ることができる。
クレオチドのライブラリーを合成し、このライブラリー
を前進プライマーと逆進プライマーを使用してＰＣＲに
より指数関数的に増幅し（合成中に現れる末端切断型を
最少にする方法）；次に、増幅したライブラリーを精製
し、精製した生成物を１つのプライマーのみを使用する
線状または不斉ＰＣＲ増幅に供し； ii）工程ｉ）で得られた線状に増幅した生成物を、標的
タンパク質の領域に対応する合成ペプチドで作成した
「一時的標的」とともにインキュベートする。好ましく
は合成ペプチドは固体マトリックスに結合しているが、
液相への結合も使用でき、次に当該分野で公知のいくつ
かの方法のうち任意のものを使用して結合種と遊離種と
を分離する； iii）標的に結合したオリゴヌクレオチドを洗浄し、次
に溶出して、一時的標的に特異的に結合するオリゴヌク
レオチドを選択し； iv）次に、工程iii）で選択したオリゴヌクレオチドを
ＰＣＲにより指数関数的に増幅し、増幅した生成物を精
製し、そして次に、精製した生成物を、標識物質の存在
下で１つのプライマーのみを使用する線状ＰＣＲ増幅に
供し； ｖ）検出可能な結合が得られるまで工程ii）、iii）お
よびiv）を繰り返して、一時的標的に結合した選択され
たオリゴヌクレオチドを回収する。典型的には工程i
i）、iii）およびiv）は、１回または２回のみ繰り返せ
ばよい； vi）「最終標的」を含有するタンパク質の混合物により
合成ペプチドまたは「一時的標的」を変化させ（標的ス
イッチング）、工程ｖで回収したオリゴヌクレオチドを
最終標的とともにインキュベートし、最終標的に特異的
に結合するオリゴヌクレオチドを選択し； vii）工程Vi）で選択したオリゴヌクレオチドをＰＣＲ
により指数関数的に増幅し、増幅生成物を精製し、そし
て次に、精製した生成物を１つのプライマーのみを使用
する線状ＰＣＲ増幅に供し、線状増幅されたオリゴヌク
レオチドを回収し； viii）標的分子について特異的結合がもはや得られなく
なるまで工程vi）とvii）を繰り返し、得られた特異的
に結合したオリゴヌクレオチド（これは、「ポリクロー
ナルオリゴ体」を構成する）を採取する；これらの特異
的結合オリゴヌクレオチドまたはポリクローナルオリゴ
体はＰＣＲ増幅することができ、ベクター−Ｔ（プロメ
ガ社（Promega Corp.））のような適当なベクターに連
結し、クローン化し、スクリーニングし、精製して、一
定の規定配列を有する「モノクローナルオリゴ体」を得
ることができる。このモノクローナルオリゴ体は、次に
ＰＣＲ増幅、プラスミド消化、またはオリゴヌクレオチ
ド合成機を使用する完全な化学合成により、有用な量で
得ることができる。
【００２７】オリゴ体を得る方法を図１に要約する。こ
の方法の異なる工程を調節するために、線状ＰＣＲ増幅
工程の間、32Ｐ標識ヌクレオチドを使用してオリゴヌク
レオチドを標識する。オリゴヌクレオチドはまた、ビオ
チン化のような他の方法により問題無く標識することも
できる。こうして最後の工程で得られるポリクローナル
オリゴ体は、ウェスタンブロット、ドットブロット、免
疫組織染色、および免疫沈降（後者では、例えばビオチ
ン標識を使用する）のために直接使用することができ
る。あるいは、選択方法の最後に、オリゴヌクレオチド
プローブを標識するために通常使用される任意の他の方
法（例えば、ビオチン化し、ジゴキシゲニンまたは蛍光
性化合物に結合した塩基で、ターミナルトランスフエラ
ーゼを使用し、２次プローブでハイブリダイゼーション
など）によりオリゴ体を標識することができる。ビオチ
ン標識は、免疫沈降、親和性カラム、疾患の治療などに
特に有用である。当該分野で公知の他に多くの標識法が
ある。図７は、最後の増幅工程でビオチン化プライマー
（前進プライマー）を加えて標識したモノクローナルオ
リゴ体の例を示す。
の方法の異なる工程を調節するために、線状ＰＣＲ増幅
工程の間、32Ｐ標識ヌクレオチドを使用してオリゴヌク
レオチドを標識する。オリゴヌクレオチドはまた、ビオ
チン化のような他の方法により問題無く標識することも
できる。こうして最後の工程で得られるポリクローナル
オリゴ体は、ウェスタンブロット、ドットブロット、免
疫組織染色、および免疫沈降（後者では、例えばビオチ
ン標識を使用する）のために直接使用することができ
る。あるいは、選択方法の最後に、オリゴヌクレオチド
プローブを標識するために通常使用される任意の他の方
法（例えば、ビオチン化し、ジゴキシゲニンまたは蛍光
性化合物に結合した塩基で、ターミナルトランスフエラ
ーゼを使用し、２次プローブでハイブリダイゼーション
など）によりオリゴ体を標識することができる。ビオチ
ン標識は、免疫沈降、親和性カラム、疾患の治療などに
特に有用である。当該分野で公知の他に多くの標識法が
ある。図７は、最後の増幅工程でビオチン化プライマー
（前進プライマー）を加えて標識したモノクローナルオ
リゴ体の例を示す。
【００２８】一時的標的として使用される合成ペプチド
を設計するために、標的タンパク質の一部の断片がわか
っていなければならない。読みとり枠（読みとり枠）も
公知であることが好ましいが、必ずしも必要ではない。
読みとり枠が不明なら、３つの読みとり枠に対応するペ
プチドを合成し、それぞれ別々に試験することが必要で
あろう。対応する配列が入手できないなら、一時的標的
として純粋なタンパク質を使用しなければならないであ
ろう。
を設計するために、標的タンパク質の一部の断片がわか
っていなければならない。読みとり枠（読みとり枠）も
公知であることが好ましいが、必ずしも必要ではない。
読みとり枠が不明なら、３つの読みとり枠に対応するペ
プチドを合成し、それぞれ別々に試験することが必要で
あろう。対応する配列が入手できないなら、一時的標的
として純粋なタンパク質を使用しなければならないであ
ろう。
【００２９】未変性のタンパク質を認識できるオリゴ体
を開発することが目的であり、充分な配列情報が入手で
きるなら、抗原性部位を予測するのに有用な任意のソフ
トウェアを使用して、一時的標的として使用される断片
を選択することが便利である。こうして、オリゴ体に認
識される未変性のタンパク質の確率を上昇させることが
できる。これは、予測された「抗原性領域」が通常分子
の表面にあるためであり、これらが「抗原性」であるた
めではない。というのは、前記したように、本発明の方
法は免疫系とは独立しているため抗原性が必要ないから
である。抗原性領域を予測するために適したコンピュー
タープログラムの例の１つは、ジェニティックコンピュ
ーターグループ（Genetic Computer Group）（オックス
フォードモレキュラー（Oxford Molecular）、www.gcg.
com）のＧＣＧパッケージである。一時的標的ペプチド
は、最近のペプチド合成機の古典的固相法を使用して合
成することが好ましい。
を開発することが目的であり、充分な配列情報が入手で
きるなら、抗原性部位を予測するのに有用な任意のソフ
トウェアを使用して、一時的標的として使用される断片
を選択することが便利である。こうして、オリゴ体に認
識される未変性のタンパク質の確率を上昇させることが
できる。これは、予測された「抗原性領域」が通常分子
の表面にあるためであり、これらが「抗原性」であるた
めではない。というのは、前記したように、本発明の方
法は免疫系とは独立しているため抗原性が必要ないから
である。抗原性領域を予測するために適したコンピュー
タープログラムの例の１つは、ジェニティックコンピュ
ーターグループ（Genetic Computer Group）（オックス
フォードモレキュラー（Oxford Molecular）、www.gcg.
com）のＧＣＧパッケージである。一時的標的ペプチド
は、最近のペプチド合成機の古典的固相法を使用して合
成することが好ましい。
【００３０】例１ 実験法 オリゴ体を得るための方法を図１に要約する。
【００３１】オリゴヌクレオチドライブラリーの合成と
増幅 一般に、ＰＣＲ増幅ライブラリーを得るために３つのオ
リゴヌクレオチドが必要である。１つは前進プライマー
であり、これは約２０〜４０塩基の非ランダム配列を含
有する。第２は、逆進プライマーであり、これもまた、
同様の非ランダム配列を含有する。第３は、組合せライ
ブラリー（combinatorial library）であり、これは、
前進プライマーに対応する配列と、その後に長さが異な
る（通常３０〜８０塩基）ランダムコア配列と、その後
に逆進プライマーに相補的な別の非ランダム配列を含有
する。前進（または逆進）プライマーは、随時ビオチン
に結合して、鎖の分離を促進したり、またはオリゴヌク
レオチドの標識を促進する。本例で使用したオリゴヌク
レオチドは、以下のものである：
増幅 一般に、ＰＣＲ増幅ライブラリーを得るために３つのオ
リゴヌクレオチドが必要である。１つは前進プライマー
であり、これは約２０〜４０塩基の非ランダム配列を含
有する。第２は、逆進プライマーであり、これもまた、
同様の非ランダム配列を含有する。第３は、組合せライ
ブラリー（combinatorial library）であり、これは、
前進プライマーに対応する配列と、その後に長さが異な
る（通常３０〜８０塩基）ランダムコア配列と、その後
に逆進プライマーに相補的な別の非ランダム配列を含有
する。前進（または逆進）プライマーは、随時ビオチン
に結合して、鎖の分離を促進したり、またはオリゴヌク
レオチドの標識を促進する。本例で使用したオリゴヌク
レオチドは、以下のものである：
【００３２】 オリゴ１（前進プライマー、領域５’）：５’−ＣＴＧ
ＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴ−３’（配列番号
１） オリゴ２（逆進プライマー、領域３’）：５−ＧＣＣＡ
ＣＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＡＧＡ−３’
（配列番号２） オリゴ３（ライブラリー）：５−ＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣ
ＧＧＧＧＡＴＣＣＮ56ＴＣＴＡＧＴＣＧＡＡＴＴＡＣＡ
ＡＧＣＴＴ ＡＧＴＧＧＣ−３（配列番号３）、 ここで、Ｎ56はランダムポリヌクレオチドコアライブラ
リー配列である。もちろんこれらのオリゴヌクレオチド
は、単なる例であり、誘導体化オリゴヌクレオチドやプ
ライマー配列を使用して、本発明から逸脱することな
く、その長さまたは組成を変更することができる。興味
深いことに誘導体化オリゴヌクレオチドは、例えばビオ
チン化を使用すると、理由は不明であるが、好ましくな
い高分子量ポリマーの形成を避けることが観察された
（結果は示していない）。まだ誰も、これらの好ましく
ない高分子量ポリマーの形成を報告していないことに注
目されたい。
ＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴ−３’（配列番号
１） オリゴ２（逆進プライマー、領域３’）：５−ＧＣＣＡ
ＣＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＡＧＡ−３’
（配列番号２） オリゴ３（ライブラリー）：５−ＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣ
ＧＧＧＧＡＴＣＣＮ56ＴＣＴＡＧＴＣＧＡＡＴＴＡＣＡ
ＡＧＣＴＴ ＡＧＴＧＧＣ−３（配列番号３）、 ここで、Ｎ56はランダムポリヌクレオチドコアライブラ
リー配列である。もちろんこれらのオリゴヌクレオチド
は、単なる例であり、誘導体化オリゴヌクレオチドやプ
ライマー配列を使用して、本発明から逸脱することな
く、その長さまたは組成を変更することができる。興味
深いことに誘導体化オリゴヌクレオチドは、例えばビオ
チン化を使用すると、理由は不明であるが、好ましくな
い高分子量ポリマーの形成を避けることが観察された
（結果は示していない）。まだ誰も、これらの好ましく
ない高分子量ポリマーの形成を報告していないことに注
目されたい。
【００３３】合成後、プライマーのみがＨＰＬＣで精製
される。１００量体（またはこれより長い）オリゴヌク
レオチドが選択されているため、合成中の収率は低い。
生成物の大部分は、末端切断型副産物からなり、ＰＣＲ
増幅前の未成熟ＨＰＬＣ精製は、末端切断型のみを生じ
るであろう。不純物を除去するために、対応するプライ
マー（オリゴ１とオリゴ２）でＰＣＲを使用して、ライ
ブラリーを増幅することが必要である。この増幅工程と
その後のアガロースゲルでの精製を使用して、最終ライ
ブラリーが得られる。
される。１００量体（またはこれより長い）オリゴヌク
レオチドが選択されているため、合成中の収率は低い。
生成物の大部分は、末端切断型副産物からなり、ＰＣＲ
増幅前の未成熟ＨＰＬＣ精製は、末端切断型のみを生じ
るであろう。不純物を除去するために、対応するプライ
マー（オリゴ１とオリゴ２）でＰＣＲを使用して、ライ
ブラリーを増幅することが必要である。この増幅工程と
その後のアガロースゲルでの精製を使用して、最終ライ
ブラリーが得られる。
【００３４】ライブラリー増幅と標識 元々のライブラリーを増幅するために我々は以下のプロ
トコールを使用した：
トコールを使用した：
【００３５】元々のライブラリーを増幅するために以下
のプロトコールを使用した。元々の凍結乾燥オリゴヌク
レオチドを、ＤＮＡｓｅを含有しない水の中で最終濃度
１００μＭに溶解した。
のプロトコールを使用した。元々の凍結乾燥オリゴヌク
レオチドを、ＤＮＡｓｅを含有しない水の中で最終濃度
１００μＭに溶解した。
【００３６】プライマー、オリゴ１：２５μＭのストッ
ク溶液４．８μｌ（最終濃度１．２μＭ） プライマー、オリゴ２：２５μＭのストック溶液４．８
μｌ（最終濃度１．２μＭ） Ｔａｑポリメラーゼ：５U/μlのストック溶液１μｌ
（最終濃度０．０５U/μl） 鋳型、オリゴ３：１０μＭのストック溶液１０μｌ（最
終濃度５μＭ） 緩衝液：緩衝液１０×（ＫＣｌ ５００ｍＭ、トリス−
塩酸 １００ｍＭ ２５℃でｐＨ９．０、トリトン−Ｘ
１００ １％）１０μｌ ＭｇＣｌ2：２５ｍＭのストック溶液６μｌ（最終濃度
１．５ｍＭ） ＤＮＡｓｅを含有しない水、６３．５μｌ（最終容量１
００μｌ） 塩基（ＤＮＴＰｓ）：２５ｍＭのストック溶液１．０μ
ｌ（各ＤＮＴＰの最終濃度０．２５ｍＭ） 標識物：１．５×１０6cpm（（α−32Ｐ）ｄＣＴＰ、３
０００Ci/mmol、ＮＥＧ５１３Ｈ、ＮＥＮ）。
ク溶液４．８μｌ（最終濃度１．２μＭ） プライマー、オリゴ２：２５μＭのストック溶液４．８
μｌ（最終濃度１．２μＭ） Ｔａｑポリメラーゼ：５U/μlのストック溶液１μｌ
（最終濃度０．０５U/μl） 鋳型、オリゴ３：１０μＭのストック溶液１０μｌ（最
終濃度５μＭ） 緩衝液：緩衝液１０×（ＫＣｌ ５００ｍＭ、トリス−
塩酸 １００ｍＭ ２５℃でｐＨ９．０、トリトン−Ｘ
１００ １％）１０μｌ ＭｇＣｌ2：２５ｍＭのストック溶液６μｌ（最終濃度
１．５ｍＭ） ＤＮＡｓｅを含有しない水、６３．５μｌ（最終容量１
００μｌ） 塩基（ＤＮＴＰｓ）：２５ｍＭのストック溶液１．０μ
ｌ（各ＤＮＴＰの最終濃度０．２５ｍＭ） 標識物：１．５×１０6cpm（（α−32Ｐ）ｄＣＴＰ、３
０００Ci/mmol、ＮＥＧ５１３Ｈ、ＮＥＮ）。
【００３７】増幅は、以下のようにプログラムしたサイ
クルを使用して行った： 最初のサイクル：９４℃で５分 ３５サイクル：９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２
℃で６０秒 最後の伸長：７２℃で５分
クルを使用して行った： 最初のサイクル：９４℃で５分 ３５サイクル：９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２
℃で６０秒 最後の伸長：７２℃で５分
【００３８】これらのパラメータは、元々のライブラリ
ーの長さ（すなわち、省略される最終長さなど）に従っ
て最適化することができる。
ーの長さ（すなわち、省略される最終長さなど）に従っ
て最適化することができる。
【００３９】こうして、ランダム配列を含む２本鎖が得
られた。これらの鎖は、他の研究者が記載したように、
最初の測定法で永久分離を行った。以後、一般に鎖の永
久分離は必要ではないことが発見され、従って、しばし
ば一時的分離のみを使用した（図５と６を参照）。最後
に、線状（不斉）増幅を使用すると、この場合ＰＣＲ産
物は１つの鎖のみを有するため、鎖の一時的分離は必要
ないことが観察された。従って、これは増幅に使用する
のに好適な方法であった。
られた。これらの鎖は、他の研究者が記載したように、
最初の測定法で永久分離を行った。以後、一般に鎖の永
久分離は必要ではないことが発見され、従って、しばし
ば一時的分離のみを使用した（図５と６を参照）。最後
に、線状（不斉）増幅を使用すると、この場合ＰＣＲ産
物は１つの鎖のみを有するため、鎖の一時的分離は必要
ないことが観察された。従って、これは増幅に使用する
のに好適な方法であった。
【００４０】はじめに、鎖を分離するために、ボック
（Bock）ら（ボック（Bock）ら（１９９２）「ヒトトロ
ンビンに結合してこれを阻害する１本鎖ＤＮＡ分子の選
択」,Nature, 355:564-6）が記載した方法を若干変更し
て行った。ビオチン化プライマー２の存在下でＰＣＲ増
幅と標識後、２つの鎖を、ストレプトアビジンマグネス
フィア（MagneSphere）常磁性ビーズ（プロメガ社（Pro
mega Corp.））を使用して分離した。２本鎖は、ビオチ
ン化プライマーを含有する末端を介してアビジンに結合
する。次に他の鎖を、０．１５Ｎ ＮａＯＨを使用して
溶出する。詳細な方法は以下の通りである。
（Bock）ら（ボック（Bock）ら（１９９２）「ヒトトロ
ンビンに結合してこれを阻害する１本鎖ＤＮＡ分子の選
択」,Nature, 355:564-6）が記載した方法を若干変更し
て行った。ビオチン化プライマー２の存在下でＰＣＲ増
幅と標識後、２つの鎖を、ストレプトアビジンマグネス
フィア（MagneSphere）常磁性ビーズ（プロメガ社（Pro
mega Corp.））を使用して分離した。２本鎖は、ビオチ
ン化プライマーを含有する末端を介してアビジンに結合
する。次に他の鎖を、０．１５Ｎ ＮａＯＨを使用して
溶出する。詳細な方法は以下の通りである。
【００４１】８５μｌのＰＣＲ増幅産物を、８５μｌの
水（蒸留し、オートクレーブで滅菌した）と８５μｌの
ストレプトアビジンマグネスフィア（MagneSphere）常
磁性ビーズとに混合した。スラリーを室温で１０分イン
キュベートした。次に、磁性ラック（プロメガ社（Prom
ega Corp.））を使用して、ビーズを溶液から分離し、
上清を廃棄した。ビーズを２２０μｌずつの０．１％Ｓ
ＳＣで数回洗浄した。最後にビーズを７３μｌの０．１
５Ｎ ＮａＯＨに再懸濁し、１分後再度分離し、上清を
回収した。０．１５Ｎ ＮａＯＨによる抽出をもう一度
繰り返し、４６μｌの０．２Ｍ ＮａＡｃを加えて上清
を中和した。こうして１本鎖オリゴヌクレオチドが得ら
れ、次にこれを、最初に「一時的標的」を含有するニト
ロセルロース膜と、次に「最終標的」を含有するニトロ
セルロース膜とインキュベートした。
水（蒸留し、オートクレーブで滅菌した）と８５μｌの
ストレプトアビジンマグネスフィア（MagneSphere）常
磁性ビーズとに混合した。スラリーを室温で１０分イン
キュベートした。次に、磁性ラック（プロメガ社（Prom
ega Corp.））を使用して、ビーズを溶液から分離し、
上清を廃棄した。ビーズを２２０μｌずつの０．１％Ｓ
ＳＣで数回洗浄した。最後にビーズを７３μｌの０．１
５Ｎ ＮａＯＨに再懸濁し、１分後再度分離し、上清を
回収した。０．１５Ｎ ＮａＯＨによる抽出をもう一度
繰り返し、４６μｌの０．２Ｍ ＮａＡｃを加えて上清
を中和した。こうして１本鎖オリゴヌクレオチドが得ら
れ、次にこれを、最初に「一時的標的」を含有するニト
ロセルロース膜と、次に「最終標的」を含有するニトロ
セルロース膜とインキュベートした。
【００４２】本発明のオリゴヌクレオチドの選択をスト
レプトアビジンマグネスフィア（MagneSphere）常磁性
ビーズを使用して説明したが、両方の鎖を分離するのに
他の方法を使用できることも理解されたい。例えばｃＤ
ＮＡをプラスミド中に挿入し、次にＲＮＡに翻訳し、ｃ
ＤＮＡに逆転写して、続いてＲＮＡａｓｅで処理して１
本鎖ｃＤＮＡを遊離させる。他の方法を用いることも可
能であり、当該分野で公知である。しかし、両方の鎖の
永久的分離は不要なことが多いことがわかり、これは操
作を大幅に単純化する。多くの場合、以下の方法の鎖の
一時的分離が必要である。
レプトアビジンマグネスフィア（MagneSphere）常磁性
ビーズを使用して説明したが、両方の鎖を分離するのに
他の方法を使用できることも理解されたい。例えばｃＤ
ＮＡをプラスミド中に挿入し、次にＲＮＡに翻訳し、ｃ
ＤＮＡに逆転写して、続いてＲＮＡａｓｅで処理して１
本鎖ｃＤＮＡを遊離させる。他の方法を用いることも可
能であり、当該分野で公知である。しかし、両方の鎖の
永久的分離は不要なことが多いことがわかり、これは操
作を大幅に単純化する。多くの場合、以下の方法の鎖の
一時的分離が必要である。
【００４３】ＤＮＡ鎖の一時的分離 前記したように、初期ＰＣＲ増幅後に鎖の永久的分離は
必要ないことが観察されている。こうしてこの方法は大
幅に簡略化された。これはまた、追加の利点を有する：
両方の鎖が存在するために、存在するライブラリーのメ
ンバーの数は２倍になり、有用な化合物を得る可能性が
増加する。さらに試薬は２本鎖として保存でき使用直前
に分離され、これはこれらの安定性を大幅に上昇させ
る。例外的に鎖の永久的分離が必要な場合がある：例え
ば、標的に結合する高親和性種が存在しない時、および
アンチセンス鎖との競合が重要な時、または選択された
オリゴヌクレオチドのＴｍが非常に高い時。鎖を分離す
るための好適な方法は非常に簡単である：ＰＣＲ産物を
９０℃で５分加熱し、次に氷上で急速に冷却する。他の
方法も可能である：例えば、０．１Ｎ ＮａＯＨを加
え、次に急速に中和する。
必要ないことが観察されている。こうしてこの方法は大
幅に簡略化された。これはまた、追加の利点を有する：
両方の鎖が存在するために、存在するライブラリーのメ
ンバーの数は２倍になり、有用な化合物を得る可能性が
増加する。さらに試薬は２本鎖として保存でき使用直前
に分離され、これはこれらの安定性を大幅に上昇させ
る。例外的に鎖の永久的分離が必要な場合がある：例え
ば、標的に結合する高親和性種が存在しない時、および
アンチセンス鎖との競合が重要な時、または選択された
オリゴヌクレオチドのＴｍが非常に高い時。鎖を分離す
るための好適な方法は非常に簡単である：ＰＣＲ産物を
９０℃で５分加熱し、次に氷上で急速に冷却する。他の
方法も可能である：例えば、０．１Ｎ ＮａＯＨを加
え、次に急速に中和する。
【００４４】線状（または不斉増幅） 前記したように、各選択サイクルで初期の指数関数的Ｐ
ＣＲ後に、線状（または不斉）増幅が行われるなら、鎖
の一時的分離でさえ不要であることが見いだされた。す
なわち放射能標識せずに初期ＰＣＲ増幅後、生成物をア
ガロースゲルにかけて精製して、プライマーおよび可能
なポリマー性副産物を除去し、最後に１つのプライマー
のみを使用して不斉ＰＣＲを行う。このＰＣＲは、指数
関数的（正常）ＰＣＲについて前記したものと同じ条件
下で行うが、これは１つだけのプライマーの存在下でか
つ放射能標識下で行われる。好ましくは、使用されるプ
ライマーは前進プライマーであり、すなわち５’領域に
対応するプライマーである。ｃＤＮＡバンドを含有する
ゲルの領域は臭化エチジウムを使用して視覚化され、ゲ
ルからの精製は視覚化領域を切り出し、次にワットマン
１ろ紙を使用して調製したセルロースの層に１２，００
０×ｇで１０分遠心分離して溶出する（チャン（Chuan
g）とブラットナー（Blattner）（１９９４）「ペーパ
ースラリーを介する遠心分離によるアガロースからウル
トラファスト（Ultrafast）ＤＮＡ回収」，Biotechniqu
es, 17: 634, 636）。ジンクリーン（GenClean）は、短
いｃＤＮＡ断片の収率が低いため便利ではない。
ＣＲ後に、線状（または不斉）増幅が行われるなら、鎖
の一時的分離でさえ不要であることが見いだされた。す
なわち放射能標識せずに初期ＰＣＲ増幅後、生成物をア
ガロースゲルにかけて精製して、プライマーおよび可能
なポリマー性副産物を除去し、最後に１つのプライマー
のみを使用して不斉ＰＣＲを行う。このＰＣＲは、指数
関数的（正常）ＰＣＲについて前記したものと同じ条件
下で行うが、これは１つだけのプライマーの存在下でか
つ放射能標識下で行われる。好ましくは、使用されるプ
ライマーは前進プライマーであり、すなわち５’領域に
対応するプライマーである。ｃＤＮＡバンドを含有する
ゲルの領域は臭化エチジウムを使用して視覚化され、ゲ
ルからの精製は視覚化領域を切り出し、次にワットマン
１ろ紙を使用して調製したセルロースの層に１２，００
０×ｇで１０分遠心分離して溶出する（チャン（Chuan
g）とブラットナー（Blattner）（１９９４）「ペーパ
ースラリーを介する遠心分離によるアガロースからウル
トラファスト（Ultrafast）ＤＮＡ回収」，Biotechniqu
es, 17: 634, 636）。ジンクリーン（GenClean）は、短
いｃＤＮＡ断片の収率が低いため便利ではない。
【００４５】合成ペプチドの固体マトリックスへの結合 「一時的標的」に結合するライブラリーのメンバー（す
なわち、合成ペプチド）を単離するために、分離法が必
要である。原理的には固相または液相法が使用できる
が、簡便さから固相法が好ましい。異なる固相法の中
で、以下の実験についてはニトロセルロースへの吸着が
選択された。約０．２５ｍ2のニトロセルロース断片
を、飽和濃度の一時的標的ペプチドを含有する溶液に加
えた。約２時間平衡化後、膜を風乾する。遊離のペプチ
ドを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して各回５分で３回
洗浄した。
なわち、合成ペプチド）を単離するために、分離法が必
要である。原理的には固相または液相法が使用できる
が、簡便さから固相法が好ましい。異なる固相法の中
で、以下の実験についてはニトロセルロースへの吸着が
選択された。約０．２５ｍ2のニトロセルロース断片
を、飽和濃度の一時的標的ペプチドを含有する溶液に加
えた。約２時間平衡化後、膜を風乾する。遊離のペプチ
ドを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して各回５分で３回
洗浄した。
【００４６】ある場合には、初期選択をするためにまた
は後で標的スイッチングをすることができるように、合
成ペプチドをＢＳＡに架橋することが必要であった（例
２と３は、ＰＰ２ＡとＰＰ２Ｂに架橋した合成ペプチド
で作成した）。初期選択での失敗は、ニトロセルロース
への結合が弱いことを意味し、これはＢＳＡへの架橋に
より促進される。架橋していないペプチドを使用する標
的スイッチングの間の失敗は、タンパク質鎖中の実際の
コンフォメーションを模倣するコンフォメーションでペ
プチドを固定することを、おそらく架橋法が助けている
ことを示唆する。しかし架橋が必要な正確な理由は不明
である。当該分野で公知のいくつかの可能性があり、こ
れらはしばしば、ウサギで抗体を産生するのに応用され
る。
は後で標的スイッチングをすることができるように、合
成ペプチドをＢＳＡに架橋することが必要であった（例
２と３は、ＰＰ２ＡとＰＰ２Ｂに架橋した合成ペプチド
で作成した）。初期選択での失敗は、ニトロセルロース
への結合が弱いことを意味し、これはＢＳＡへの架橋に
より促進される。架橋していないペプチドを使用する標
的スイッチングの間の失敗は、タンパク質鎖中の実際の
コンフォメーションを模倣するコンフォメーションでペ
プチドを固定することを、おそらく架橋法が助けている
ことを示唆する。しかし架橋が必要な正確な理由は不明
である。当該分野で公知のいくつかの可能性があり、こ
れらはしばしば、ウサギで抗体を産生するのに応用され
る。
【００４７】オリゴ体の選択 最初の工程は、一時的標的（合成ペプチド）または最終
標的（タンパク質）を封じ込めるのに使用されるマトリ
ックス（ニトロセルロース、活性化セファロースなど）
中の非特異的部位をブロックするために使用される固相
マトリックスまたはタンパク質に結合するライブラリー
からの、オリゴヌクレオチドの前吸着である。以下の実
験では、ニトロセルロースをマトリックスとして使用し
たが、結合および遊離種を分離するための任意の他の固
相または液相法を使用してもよい。ニトロセルロース
（ペプチド無し、０．２５ｃｍ2）をまず、カゼイン５
％（乾燥、無脂肪ミルク）を使用して３０分ブロックし
た。次に７０μｌのＰＣＲ増幅／標識オリゴヌクレオチ
ドライブラリーを、ニトロセルロースマトリックスとと
もにカゼイン（ＰＢＳ緩衝液中５０mg/ml）を含有する
溶液２００μｌ中に加え、一晩インキュベートして前吸
着を行った。いったん前吸着が完了すると、残りのオリ
ゴヌクレオチドを、標的ペプチド（一時的標的）を含有
するマトリックスとともに一晩インキュベートし、次に
前記したように工程ｉ）〜viii）を行った。
標的（タンパク質）を封じ込めるのに使用されるマトリ
ックス（ニトロセルロース、活性化セファロースなど）
中の非特異的部位をブロックするために使用される固相
マトリックスまたはタンパク質に結合するライブラリー
からの、オリゴヌクレオチドの前吸着である。以下の実
験では、ニトロセルロースをマトリックスとして使用し
たが、結合および遊離種を分離するための任意の他の固
相または液相法を使用してもよい。ニトロセルロース
（ペプチド無し、０．２５ｃｍ2）をまず、カゼイン５
％（乾燥、無脂肪ミルク）を使用して３０分ブロックし
た。次に７０μｌのＰＣＲ増幅／標識オリゴヌクレオチ
ドライブラリーを、ニトロセルロースマトリックスとと
もにカゼイン（ＰＢＳ緩衝液中５０mg/ml）を含有する
溶液２００μｌ中に加え、一晩インキュベートして前吸
着を行った。いったん前吸着が完了すると、残りのオリ
ゴヌクレオチドを、標的ペプチド（一時的標的）を含有
するマトリックスとともに一晩インキュベートし、次に
前記したように工程ｉ）〜viii）を行った。
【００４８】ある場合には、この前吸着工程は不要であ
った。飽和濃度で存在するペプチドとともにニトロセル
ロースに結合したペプチドで選択工程を１回または２回
行い、次に標的が未変性のタンパク質なら標的タンパク
質とともにドットブロットを行い、標的が変性タンパク
質なら標的タンパク質とともにウェスタンブロットを行
い、（カゼインでブロックされたニトロセルロースを用
いて）、そして次に、前記したように得られる生成物を
クローン化することで充分である。一時的標的から最終
標的にスイッチする時は、適切な選択法を使用すること
が非常に重要である。未変性のタンパク質を認識するこ
とができるオリゴ体を単離することが目的であるなら、
ドットブロット、液相での分離、免疫組織染色、ゲルシ
フト、カラム分離または他の非変性法などを、選択に使
用すべきである。すなわち、標的タンパク質をできるだ
け未変性の状態に維持する分離法を選択すべきである。
これは、未変性のタンパク質に対するオリゴ体は、コン
フォメーションの変化に対して非常に感受性であるかも
知れないためである。一方、変性標的タンパク質を認識
することができるオリゴ体を単離することが目的である
なら、こうして標的を維持する方法（例えば、ウェスタ
ンブロット）を使用すべきである。しかし時に、天然の
抗体で起きるように、変性標的に対して作成されたオリ
ゴ体が未変性のタンパク質も認識することがあり、その
逆もある。これは確かに、以下の例でＣＰＤ１で起きて
いるが、必ずしもいつもこうではない。
った。飽和濃度で存在するペプチドとともにニトロセル
ロースに結合したペプチドで選択工程を１回または２回
行い、次に標的が未変性のタンパク質なら標的タンパク
質とともにドットブロットを行い、標的が変性タンパク
質なら標的タンパク質とともにウェスタンブロットを行
い、（カゼインでブロックされたニトロセルロースを用
いて）、そして次に、前記したように得られる生成物を
クローン化することで充分である。一時的標的から最終
標的にスイッチする時は、適切な選択法を使用すること
が非常に重要である。未変性のタンパク質を認識するこ
とができるオリゴ体を単離することが目的であるなら、
ドットブロット、液相での分離、免疫組織染色、ゲルシ
フト、カラム分離または他の非変性法などを、選択に使
用すべきである。すなわち、標的タンパク質をできるだ
け未変性の状態に維持する分離法を選択すべきである。
これは、未変性のタンパク質に対するオリゴ体は、コン
フォメーションの変化に対して非常に感受性であるかも
知れないためである。一方、変性標的タンパク質を認識
することができるオリゴ体を単離することが目的である
なら、こうして標的を維持する方法（例えば、ウェスタ
ンブロット）を使用すべきである。しかし時に、天然の
抗体で起きるように、変性標的に対して作成されたオリ
ゴ体が未変性のタンパク質も認識することがあり、その
逆もある。これは確かに、以下の例でＣＰＤ１で起きて
いるが、必ずしもいつもこうではない。
【００４９】クローニング：前記方法で得られた「オリ
ゴ体」は、ランダムコンフォマーのライブラリーに由来
するため、ポリクローナルである。しかし前記の方法に
より選択されたライブラリーの異なるメンバーはまた、
モノクローナル型で得ることもできる。モノクローナル
「オリゴ体」を得るために、ふつうの非ビオチン化プラ
イマーを使用して最終ポリクローナルオリゴ体のＰＣＲ
増幅後に、オリゴヌクレオチドを、ベクター−Ｔ（プロ
メガ社（Promega Corp.））または他のベクターのよう
な適当なベクターに連結し、製造業者の説明書に従って
コンピタントな細菌中にトランスフェクトする。トラン
スフェクション後、いくつかのクローンを単離し、「コ
ロニー−ＰＣＲ」法を使用して挿入体を増幅する。次に
標的タンパク質に結合した各挿入体の能力を、ウェスタ
ンブロットを使用して解析する。こうして例５のモノク
ローナルオリゴ体が得られ、これは次に、例６〜１０の
出発物質として使用した。
ゴ体」は、ランダムコンフォマーのライブラリーに由来
するため、ポリクローナルである。しかし前記の方法に
より選択されたライブラリーの異なるメンバーはまた、
モノクローナル型で得ることもできる。モノクローナル
「オリゴ体」を得るために、ふつうの非ビオチン化プラ
イマーを使用して最終ポリクローナルオリゴ体のＰＣＲ
増幅後に、オリゴヌクレオチドを、ベクター−Ｔ（プロ
メガ社（Promega Corp.））または他のベクターのよう
な適当なベクターに連結し、製造業者の説明書に従って
コンピタントな細菌中にトランスフェクトする。トラン
スフェクション後、いくつかのクローンを単離し、「コ
ロニー−ＰＣＲ」法を使用して挿入体を増幅する。次に
標的タンパク質に結合した各挿入体の能力を、ウェスタ
ンブロットを使用して解析する。こうして例５のモノク
ローナルオリゴ体が得られ、これは次に、例６〜１０の
出発物質として使用した。
【００５０】特異性を決定するためのオリゴ体の性状解
析 小脳から単離した総タンパク質から作成したウェスタン
ブロット（図２〜８）を使用して、オリゴ体の特異性を
決定した。この結果はまた、免疫沈降（例８と図８）と
免疫組織染色（例９と図９）を使用して確認した。
析 小脳から単離した総タンパク質から作成したウェスタン
ブロット（図２〜８）を使用して、オリゴ体の特異性を
決定した。この結果はまた、免疫沈降（例８と図８）と
免疫組織染色（例９と図９）を使用して確認した。
【００５１】化学合成したオリゴ体：モノクローナルオ
リゴ体がいったん選択され、クローン化され、配列決定
されると、その配列を使用して、オリゴヌクレオチド合
成機により完全な化学合成オリゴ体を作製することがで
きる。そのような試薬を使用して現像させたウェスタン
ブロットを図１０に示す。これは、ウェスタンブロット
で抗体のように挙動できる最初の化学合成試薬である。
リゴ体がいったん選択され、クローン化され、配列決定
されると、その配列を使用して、オリゴヌクレオチド合
成機により完全な化学合成オリゴ体を作製することがで
きる。そのような試薬を使用して現像させたウェスタン
ブロットを図１０に示す。これは、ウェスタンブロット
で抗体のように挙動できる最初の化学合成試薬である。
【００５２】得られた試薬の有用性 得られたオリゴ体は、モノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体が使用されるすべての用途に有用である。
さらに図７に示すように、モノクローナル抗体またはポ
リクローナル抗体で通常行われるように、ビオチンで誘
導体化したプライマー１を使用して、オリゴ体を標識す
ることが可能である。誘導体化は結果に影響を与えな
い。さらなる詳細については例７を参照されたい。オリ
ゴ体はまた、図８に示すように免疫沈降に有用であり、
これは、沈降法の間タンパク質が未変性型で維持される
ため、ある場合にはオリゴ体が未変性タンパク質と変性
タンパク質の両方を認識することができることを意味す
る（例８）。さらに図９に示すように、オリゴ体はま
た、免疫組織染色の試薬として有用である（例９を参
照）。
ローナル抗体が使用されるすべての用途に有用である。
さらに図７に示すように、モノクローナル抗体またはポ
リクローナル抗体で通常行われるように、ビオチンで誘
導体化したプライマー１を使用して、オリゴ体を標識す
ることが可能である。誘導体化は結果に影響を与えな
い。さらなる詳細については例７を参照されたい。オリ
ゴ体はまた、図８に示すように免疫沈降に有用であり、
これは、沈降法の間タンパク質が未変性型で維持される
ため、ある場合にはオリゴ体が未変性タンパク質と変性
タンパク質の両方を認識することができることを意味す
る（例８）。さらに図９に示すように、オリゴ体はま
た、免疫組織染色の試薬として有用である（例９を参
照）。
【００５３】これらの結果は、診断検査、免疫組織染
色、免疫沈降などの用途で、オリゴ体が天然のモノクロ
ーナル抗体またはポリクローナル抗体に置き換わること
ができることを証明している。ビオチンによる標識はほ
んの一例である。蛍光性化合物を使用してオリゴ体を標
識し、これらを他のタンパク質に担体として結合し、お
よび／またはこれらを治療薬などの担体として使用する
こともできる。従って、本発明のオリゴ体は、ほとんど
すべての用途においてモノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体に置き換わることができ、前記したように
天然の抗体に対して重要な利点を有する。クローン化お
よび配列決定後、これらのオリゴヌクレオチドは、診断
または他の同様の用途に使用されるチップまたは他の固
相マトリックス上で容易に合成される。
色、免疫沈降などの用途で、オリゴ体が天然のモノクロ
ーナル抗体またはポリクローナル抗体に置き換わること
ができることを証明している。ビオチンによる標識はほ
んの一例である。蛍光性化合物を使用してオリゴ体を標
識し、これらを他のタンパク質に担体として結合し、お
よび／またはこれらを治療薬などの担体として使用する
こともできる。従って、本発明のオリゴ体は、ほとんど
すべての用途においてモノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体に置き換わることができ、前記したように
天然の抗体に対して重要な利点を有する。クローン化お
よび配列決定後、これらのオリゴヌクレオチドは、診断
または他の同様の用途に使用されるチップまたは他の固
相マトリックス上で容易に合成される。
【００５４】例２ ＰＰ２Ａに対するポリクローナルオリゴ体の産生 固定した既知の配列が両側に位置するコアランダム領域
を含有する合成オリゴヌクレオチドを用いて、１本鎖Ｄ
ＮＡ分子のライブラリーを作成した。このライブラリー
を、５’末端と３’末端に対応するプライマーを使用し
てＰＣＲにより増幅した。逆進プライマーをビオチン化
した。次にストレプトアビジンビーズへの結合と、Ｎａ
ＯＨによる溶出および中和を使用して、鎖を分離した。
オリゴヌクレオチド混合物を、一時的標的として合成ペ
プチドとともにインキュベートし、これをニトロセルロ
ースに結合させた。合成ペプチドは標的タンパク質の断
片に対応した。この場合、ペプチドは、タンパク質ホス
ファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の触媒性サブユニットＣの
残基２９８−３０９（Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）（配列番号４）に対応し、これをＢＳ
Ａに架橋させた。ペプチドに結合したオリゴヌクレオチ
ドを選択し、放射能標識を使用してＰＣＲにより増幅し
た。鎖の「永久的」分離法を使用して２本鎖を分離し、
得られたオリゴヌクレオチドを、ニトロセルロースに結
合したペプチドで再度インキュベートした。結合したオ
リゴヌクレオチドの量（cpm）を、ドットブロット定量
により定量した。対照と比較して充分な結合が検出され
るまで、サイクルを繰り返した。この場合３サイクルが
必要であった。結果を表１に要約するが、これは、選択
／増幅の初期サイクルの間に一時的標的として使用した
合成ペプチドに結合したオリゴヌクレオチドの量の定量
の例である。表１の第２および第３のカラム中の数値
は、ドットブロット測定法により測定した最初の３つの
連続サイクルの間の、合成ペプチドに結合したcpmと対
応する対照に結合したcpmである。
を含有する合成オリゴヌクレオチドを用いて、１本鎖Ｄ
ＮＡ分子のライブラリーを作成した。このライブラリー
を、５’末端と３’末端に対応するプライマーを使用し
てＰＣＲにより増幅した。逆進プライマーをビオチン化
した。次にストレプトアビジンビーズへの結合と、Ｎａ
ＯＨによる溶出および中和を使用して、鎖を分離した。
オリゴヌクレオチド混合物を、一時的標的として合成ペ
プチドとともにインキュベートし、これをニトロセルロ
ースに結合させた。合成ペプチドは標的タンパク質の断
片に対応した。この場合、ペプチドは、タンパク質ホス
ファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の触媒性サブユニットＣの
残基２９８−３０９（Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）（配列番号４）に対応し、これをＢＳ
Ａに架橋させた。ペプチドに結合したオリゴヌクレオチ
ドを選択し、放射能標識を使用してＰＣＲにより増幅し
た。鎖の「永久的」分離法を使用して２本鎖を分離し、
得られたオリゴヌクレオチドを、ニトロセルロースに結
合したペプチドで再度インキュベートした。結合したオ
リゴヌクレオチドの量（cpm）を、ドットブロット定量
により定量した。対照と比較して充分な結合が検出され
るまで、サイクルを繰り返した。この場合３サイクルが
必要であった。結果を表１に要約するが、これは、選択
／増幅の初期サイクルの間に一時的標的として使用した
合成ペプチドに結合したオリゴヌクレオチドの量の定量
の例である。表１の第２および第３のカラム中の数値
は、ドットブロット測定法により測定した最初の３つの
連続サイクルの間の、合成ペプチドに結合したcpmと対
応する対照に結合したcpmである。
【００５５】
【００５６】「標的スイッチング」工程に従った。この
工程では、前工程で選択したオリゴヌクレオチドの混合
物を使用して、オリゴヌクレオチド混合物が正常な放射
能標識抗体であるかのように、ウェスタンブロットを現
像させた。同時に、ＰＰ２Ａに対応するスポットを市販
の抗体を使用して同定した。このスポットに結合したオ
リゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅を使用して、さらなる選
択を行った。新しいウェスタンブロットで得られた結果
を、市販のウサギ抗体を使用して得られた結果と比較し
た。図１から明らかなように、結果は同一である。
工程では、前工程で選択したオリゴヌクレオチドの混合
物を使用して、オリゴヌクレオチド混合物が正常な放射
能標識抗体であるかのように、ウェスタンブロットを現
像させた。同時に、ＰＰ２Ａに対応するスポットを市販
の抗体を使用して同定した。このスポットに結合したオ
リゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅を使用して、さらなる選
択を行った。新しいウェスタンブロットで得られた結果
を、市販のウサギ抗体を使用して得られた結果と比較し
た。図１から明らかなように、結果は同一である。
【００５７】例３：ＰＰ２Ｂ、触媒性サブユニット（サ
ブユニットα）に対するポリクローナルオリゴ体の産生 例２と同じ方法に従い、タンパク質ホスファターゼ２Ｂ
（ＰＰ２Ｂ）のサブユニットαに対するポリクローナル
オリゴ体を得た。オリゴ体を調製するのに使用した合成
ペプチドは、ウサギで作成した市販の抗体をブロックす
る同じ市販のものであり、アミノ酸２６８−２８０（Ａ
ｒｇ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓ
ｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌ
ａ）（配列番号５）に対応した。これをまた、ＢＳＡに
架橋させた。ポリクローナルオリゴ体で得られた結果
（オートラジオグラフィーで現像させた）を市販の抗体
で得られた結果（アルカリホスファターゼを含有する２
次抗体として現像させた）と比較すると、図３から明ら
かなように同じであった。
ブユニットα）に対するポリクローナルオリゴ体の産生 例２と同じ方法に従い、タンパク質ホスファターゼ２Ｂ
（ＰＰ２Ｂ）のサブユニットαに対するポリクローナル
オリゴ体を得た。オリゴ体を調製するのに使用した合成
ペプチドは、ウサギで作成した市販の抗体をブロックす
る同じ市販のものであり、アミノ酸２６８−２８０（Ａ
ｒｇ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓ
ｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌ
ａ）（配列番号５）に対応した。これをまた、ＢＳＡに
架橋させた。ポリクローナルオリゴ体で得られた結果
（オートラジオグラフィーで現像させた）を市販の抗体
で得られた結果（アルカリホスファターゼを含有する２
次抗体として現像させた）と比較すると、図３から明ら
かなように同じであった。
【００５８】例４：ＣＰＤ１（ｃＤＮＡ配列から推定さ
れるタンパク質、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＭＭ
Ｕ８９３４５）に対するポリクローナルオリゴ体の産生 ＣＰＤ１の断片に対応する、ＢＳＡに架橋していない合
成ペプチド（Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
Ａｓｎ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ−Ｌｙｓ）（配列番号６）を使用
して、例２の方法に従って、ポリクローナルオリゴ体を
得た。得られたオリゴ体は、グルタルアルデヒドを使用
してＢＳＡに架橋した同じペプチドによりウサギで得ら
れた天然のポリクローナル抗体と、全く同様に挙動し
た。結果を図４に示す。
れるタンパク質、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＭＭ
Ｕ８９３４５）に対するポリクローナルオリゴ体の産生 ＣＰＤ１の断片に対応する、ＢＳＡに架橋していない合
成ペプチド（Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
Ａｓｎ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ−Ｌｙｓ）（配列番号６）を使用
して、例２の方法に従って、ポリクローナルオリゴ体を
得た。得られたオリゴ体は、グルタルアルデヒドを使用
してＢＳＡに架橋した同じペプチドによりウサギで得ら
れた天然のポリクローナル抗体と、全く同様に挙動し
た。結果を図４に示す。
【００５９】例５：ＣＰＤ１に対するモノクローナルオ
リゴ体の産生 例４で得られたポリクローナルオリゴ体をＰＣＲ増幅
し、ベクター−Ｔ（プロメガ社（Promega Corp.））に
連結し、クローン化した。いくつかのクローンを単離
し、その挿入体を、ミニウェスタンブロットを使用し
て、ＣＰＤ１に結合する能力について試験した。１つの
クローンを選択し、ＰＣＲ増幅し、鎖を分離し、抗体様
活性について試験した。図５に示すように、すでにモノ
クローナルであるこのオリゴ体は、例４で得られたポリ
クローナルオリゴ体と全く同様に挙動した。
リゴ体の産生 例４で得られたポリクローナルオリゴ体をＰＣＲ増幅
し、ベクター−Ｔ（プロメガ社（Promega Corp.））に
連結し、クローン化した。いくつかのクローンを単離
し、その挿入体を、ミニウェスタンブロットを使用し
て、ＣＰＤ１に結合する能力について試験した。１つの
クローンを選択し、ＰＣＲ増幅し、鎖を分離し、抗体様
活性について試験した。図５に示すように、すでにモノ
クローナルであるこのオリゴ体は、例４で得られたポリ
クローナルオリゴ体と全く同様に挙動した。
【００６０】モノクローナルオリゴ体を配列決定し、以
下の配列を有することがわかった：５’−ＣＴＧＣＡＧ
ＣＣＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴｇｇｔｔａｇｃｃｃｃｇａ
ｇｇａｃｔｇｇｔｔｔｇｃａｃｔｇａｃａｔｇｃｇｃｇ
ｔｇｔｇｇｔｔｇｇｃｔａｃｔｃｇＴＣＴＡＧＴＣＧＡ
ＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＴＧＧＣ−３’（配列番号
７）。このオリゴヌクレオチドは、タンパク質ＣＰＤ１
に特異的な多くの可能なオリゴ体のほんの一例である。
下の配列を有することがわかった：５’−ＣＴＧＣＡＧ
ＣＣＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴｇｇｔｔａｇｃｃｃｃｇａ
ｇｇａｃｔｇｇｔｔｔｇｃａｃｔｇａｃａｔｇｃｇｃｇ
ｔｇｔｇｇｔｔｇｇｃｔａｃｔｃｇＴＣＴＡＧＴＣＧＡ
ＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＴＧＧＣ−３’（配列番号
７）。このオリゴヌクレオチドは、タンパク質ＣＰＤ１
に特異的な多くの可能なオリゴ体のほんの一例である。
【００６１】例６：ＣＰＤ１に対する２本鎖モノクロー
ナルオリゴ体の産生 例５で産生されたオリゴ体の２本鎖を、一時的分離した
後、９０℃で５分加熱してインキュベートし、次に氷で
急速に冷却した。あるいはこの一時的分離は、いくつか
の方法で行った：例えば、ＮａＯＨでｐＨを変化させ、
次に緩衝液で急速に中和した。冷却後、オリゴヌクレオ
チドを使用して、図６に示すようにウェスタンブロット
を現像させた。図６から明らかなように、鎖の永久的分
離無しで使用される、ＰＣＲ増幅後に得られた２本鎖モ
ノクローナルオリゴ体は、両方の鎖の永久的分離後に使
用されるものと同様に有効であった（図４と図５を比較
されたい）。本例は、最終産物の選択プロセスの間また
は結合反応の間、２本鎖を分離することが必要ではない
ことを証明している。
ナルオリゴ体の産生 例５で産生されたオリゴ体の２本鎖を、一時的分離した
後、９０℃で５分加熱してインキュベートし、次に氷で
急速に冷却した。あるいはこの一時的分離は、いくつか
の方法で行った：例えば、ＮａＯＨでｐＨを変化させ、
次に緩衝液で急速に中和した。冷却後、オリゴヌクレオ
チドを使用して、図６に示すようにウェスタンブロット
を現像させた。図６から明らかなように、鎖の永久的分
離無しで使用される、ＰＣＲ増幅後に得られた２本鎖モ
ノクローナルオリゴ体は、両方の鎖の永久的分離後に使
用されるものと同様に有効であった（図４と図５を比較
されたい）。本例は、最終産物の選択プロセスの間また
は結合反応の間、２本鎖を分離することが必要ではない
ことを証明している。
【００６２】例７：ビオチンによるモノクローナルオリ
ゴ体の標識 例５で得られたオリゴ体をビオチンを使用して標識し
た。標識は、最後のＰＣＲ増幅の間ビオチン化前進プラ
イマーを使用して行った。図７から明らかなように、結
果は放射能標識により以前に得られたものと同一であっ
たため、ビオチン化はオリゴ体の結合性に影響を与えな
かった。本例は、放射能標識以外に、オリゴヌクレオチ
ドまたは抗体をを標識するために典型的に使用された他
の方法を、本発明のオリゴヌクレオチドを標識するのに
使用できることを証明している。
ゴ体の標識 例５で得られたオリゴ体をビオチンを使用して標識し
た。標識は、最後のＰＣＲ増幅の間ビオチン化前進プラ
イマーを使用して行った。図７から明らかなように、結
果は放射能標識により以前に得られたものと同一であっ
たため、ビオチン化はオリゴ体の結合性に影響を与えな
かった。本例は、放射能標識以外に、オリゴヌクレオチ
ドまたは抗体をを標識するために典型的に使用された他
の方法を、本発明のオリゴヌクレオチドを標識するのに
使用できることを証明している。
【００６３】例８：ＣＰＤ１に対するモノクローナルオ
リゴ体によるウェスタンブロットと免疫沈降 新たに単離した小脳を、プロテイナーゼインヒビターの
カクテルを含有するＰＢＳ中でホモジナイズした（最終
濃度：ＥＤＴＡ １０ｍＭ、フェナントロリン１０ｍ
Ｍ、Ｅ−６４ １０μＭ、ロイペプチン １００μＭ、
アプロチニン１０mg/ml、ペプスタチンＡ １０μＭ）
（シグマ社（Sigma Co.）、セントルイス、ミズーリ
州）。１００μｇのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけ、ニトロセルロース膜に移し、ＰＢＳ＋５％Ｂ
ＳＡでブロックし、４℃でウサギポリクローナル抗体を
使用してインキュベートして前記したように２次抗体で
現像させたか、またはビオチン化モノクローナルオリゴ
体を使用してＰＢＳ＋５％ＢＳＡで室温で１時間インキ
ュベートしストレプトアビジン−ＡＰで現像させた。免
疫沈降のために、ラドリッザニ（Radrizzani）と共同研
究者らが発表した方法（ラドリッザニ（Radrizzani）ら
（１９９５）「マウス小脳中のＴｈｙ１．２合成速度の
進化的制御」, J. Neurosci. Res., 42: 220-7）を若干
変更して行った。簡単に説明すると、マウス小脳の小断
片を35Ｓ−メチオニンの存在下でインキュベートし、タ
ンパク質を抽出し、そしてビオチン化上流プライマーの
存在下でＰＣＲ増幅を使用してビオチンで標識したモノ
クローナルオリゴ体およびストレプトアビジン常磁性ビ
ーズ（プロメガ社（Promega Corp.））を使用して、免
疫沈降を行った。前例で記載したように、ＣＰＤ１オリ
ゴ体に対応する挿入体を、ビオチン化プライマーを使用
してＰＣＲ増幅した。ウェスタンブロットを再度行い、
結果をＣＰＤ１の免疫沈降と比較した。図８から明らか
なように、モノクローナルオリゴ体はウェスタンブロッ
ト中で、同じ合成ペプチドを使用してウサギ中で現像さ
せたポリクローナルオリゴ体と全く同様に挙動する。観
察された唯一の差は、ポリクローナル抗体を使用した
時、免疫前血清に対応するバンドが存在することであ
る。ノーザンブロットでは、ＣＰＤ１は小脳中で２つの
アイソフォーム（ＣＰＤ１hとＣＰＤ１l）で発現される
タンパク質である（結果は示してない）。ポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体で現像させた小脳から
のウェスタンブロットはまた、２つのアイソフォームを
示し、これらは生後５〜１７日（Ｐ５からＰ１７）の成
長の間に差別的に発現され、３４Ｋｄのアイソフォーム
が最も多かった。これらの結果は、クローニング後にオ
リゴ体をビオチンで標識して得られ、従って標的を認識
するオリゴ体の能力に影響を与えることなくビオチン標
識が可能であることを再確認している。ＰＣＲ増幅中に
32Ｐ−ｄＣＴＰでオリゴヌクレオチドを標識して、同様
の結果が得られた。これは、少なくともこの場合、前進
プライマーと逆進プライマー配列に対応するオリゴ体の
末端は、おそらく結合に関与しないことを示す。興味深
いことに、ビオチンで標識したオリゴ体はまた、ＣＰＤ
１を「免疫沈降」するのに有用であった（図８Ｄを参
照）。これは、オリゴ体が、ＧＣＧコンピュータープロ
グラムで予測されるように、未変性および変性ＣＰＤ１
の両方を認識することができることを示す。これらの結
果は、オリゴ体が、未変性タンパク質（例えば、免疫沈
降中）と変性タンパク質（例えば、ウェスタンブロット
中）の両方を認識できること、および合成抗体様試薬で
作成した特異的「免疫沈降」の最初の例であることを示
す。
リゴ体によるウェスタンブロットと免疫沈降 新たに単離した小脳を、プロテイナーゼインヒビターの
カクテルを含有するＰＢＳ中でホモジナイズした（最終
濃度：ＥＤＴＡ １０ｍＭ、フェナントロリン１０ｍ
Ｍ、Ｅ−６４ １０μＭ、ロイペプチン １００μＭ、
アプロチニン１０mg/ml、ペプスタチンＡ １０μＭ）
（シグマ社（Sigma Co.）、セントルイス、ミズーリ
州）。１００μｇのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけ、ニトロセルロース膜に移し、ＰＢＳ＋５％Ｂ
ＳＡでブロックし、４℃でウサギポリクローナル抗体を
使用してインキュベートして前記したように２次抗体で
現像させたか、またはビオチン化モノクローナルオリゴ
体を使用してＰＢＳ＋５％ＢＳＡで室温で１時間インキ
ュベートしストレプトアビジン−ＡＰで現像させた。免
疫沈降のために、ラドリッザニ（Radrizzani）と共同研
究者らが発表した方法（ラドリッザニ（Radrizzani）ら
（１９９５）「マウス小脳中のＴｈｙ１．２合成速度の
進化的制御」, J. Neurosci. Res., 42: 220-7）を若干
変更して行った。簡単に説明すると、マウス小脳の小断
片を35Ｓ−メチオニンの存在下でインキュベートし、タ
ンパク質を抽出し、そしてビオチン化上流プライマーの
存在下でＰＣＲ増幅を使用してビオチンで標識したモノ
クローナルオリゴ体およびストレプトアビジン常磁性ビ
ーズ（プロメガ社（Promega Corp.））を使用して、免
疫沈降を行った。前例で記載したように、ＣＰＤ１オリ
ゴ体に対応する挿入体を、ビオチン化プライマーを使用
してＰＣＲ増幅した。ウェスタンブロットを再度行い、
結果をＣＰＤ１の免疫沈降と比較した。図８から明らか
なように、モノクローナルオリゴ体はウェスタンブロッ
ト中で、同じ合成ペプチドを使用してウサギ中で現像さ
せたポリクローナルオリゴ体と全く同様に挙動する。観
察された唯一の差は、ポリクローナル抗体を使用した
時、免疫前血清に対応するバンドが存在することであ
る。ノーザンブロットでは、ＣＰＤ１は小脳中で２つの
アイソフォーム（ＣＰＤ１hとＣＰＤ１l）で発現される
タンパク質である（結果は示してない）。ポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体で現像させた小脳から
のウェスタンブロットはまた、２つのアイソフォームを
示し、これらは生後５〜１７日（Ｐ５からＰ１７）の成
長の間に差別的に発現され、３４Ｋｄのアイソフォーム
が最も多かった。これらの結果は、クローニング後にオ
リゴ体をビオチンで標識して得られ、従って標的を認識
するオリゴ体の能力に影響を与えることなくビオチン標
識が可能であることを再確認している。ＰＣＲ増幅中に
32Ｐ−ｄＣＴＰでオリゴヌクレオチドを標識して、同様
の結果が得られた。これは、少なくともこの場合、前進
プライマーと逆進プライマー配列に対応するオリゴ体の
末端は、おそらく結合に関与しないことを示す。興味深
いことに、ビオチンで標識したオリゴ体はまた、ＣＰＤ
１を「免疫沈降」するのに有用であった（図８Ｄを参
照）。これは、オリゴ体が、ＧＣＧコンピュータープロ
グラムで予測されるように、未変性および変性ＣＰＤ１
の両方を認識することができることを示す。これらの結
果は、オリゴ体が、未変性タンパク質（例えば、免疫沈
降中）と変性タンパク質（例えば、ウェスタンブロット
中）の両方を認識できること、および合成抗体様試薬で
作成した特異的「免疫沈降」の最初の例であることを示
す。
【００６４】例９：ＣＰＤ１に対するモノクローナルオ
リゴ体を使用する「免疫組織染色」 抗体として挙動するオリゴ体の特異性と能力をさらに証
明するために、免疫組織染色を行った。生後７日目のマ
ウスの小脳（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）を解剖し、アル
コール／酸（９５％エタノール：５％酢酸、−２０℃で
４時間）で固定し、脱水し、パラフィン包埋した。５μ
ｍの組織切片を、シラン化処理（シラン、シグマ（Sigm
a Co.）、セントルイス、ミズーリ州）したカバーガラ
スでマウントし、脱パラフィンを行い、再度水を加え、
ＰＢＳ−５％ＢＳＡを使用して１時間ブロックした。切
片を、アフィニティ精製したウサギポリクローナル抗体
に４℃で一晩暴露し、ＰＢＳで２回リンスし、２次抗体
（ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ １：１０００）で１
時間インキュベートし、ＤＡＢ（ギブコビーアールエル
（Gibco BRL）、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）
で現像させた。モノクローナルオリゴ体を使用する免疫
組織染色のために、５’−ビオチン化プライマーをＰＣ
Ｒ反応物に加えることにより、ビオチン化モノクローナ
ルオリゴ体を作成した（５’−Ｂｉｏｔ−ＣＴＧＣＡＧ
ＣＣＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴ−３’）（配列番号８）。
ＰＣＲ増幅後、ｃＤＮＡ鎖を加熱（９４℃、５分）によ
り分離し、ＰＢＳ−５％ＢＳＡで１０倍希釈した。スラ
イドをＰＢＳ−５％ＢＳＡでインキュベートして非特異
部位をブロックした後、オリゴ体を組織と室温で１時間
インキュベートし、次にストレプトアビジン−ペルオキ
シダーゼ（プロメガ社（Promega Corporation）、マジ
ソン、ウィスコンシン州）で現像させた。オリゴ体を過
剰のブロックペプチドと４℃で一晩プレインキュベート
し、次に前記したように現像させて、対照試料を作成し
た。図９に示すように、ウサギで作成したアフィニティ
精製したポリクローナル抗体を使用して得られた結果
（図９Ａ）は、モノクローナルオリゴ体で得られた結果
（図９Ｂ）と区別できなかった。モノクローナルオリゴ
体を、ＣＰＤ１に対応する合成ペプチドとプレインキュ
ベートして作成した対照は、染色を示さなかった(図９
Ｃ）。ＣＰＤ１の染色は顆粒細胞とプルキンエ細胞で観
察され、ここで核膜と原形質膜染色が存在した。これ
は、合成抗体様試薬を使用して作成した「免疫組織染
色」の最初の例である。
リゴ体を使用する「免疫組織染色」 抗体として挙動するオリゴ体の特異性と能力をさらに証
明するために、免疫組織染色を行った。生後７日目のマ
ウスの小脳（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）を解剖し、アル
コール／酸（９５％エタノール：５％酢酸、−２０℃で
４時間）で固定し、脱水し、パラフィン包埋した。５μ
ｍの組織切片を、シラン化処理（シラン、シグマ（Sigm
a Co.）、セントルイス、ミズーリ州）したカバーガラ
スでマウントし、脱パラフィンを行い、再度水を加え、
ＰＢＳ−５％ＢＳＡを使用して１時間ブロックした。切
片を、アフィニティ精製したウサギポリクローナル抗体
に４℃で一晩暴露し、ＰＢＳで２回リンスし、２次抗体
（ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ １：１０００）で１
時間インキュベートし、ＤＡＢ（ギブコビーアールエル
（Gibco BRL）、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）
で現像させた。モノクローナルオリゴ体を使用する免疫
組織染色のために、５’−ビオチン化プライマーをＰＣ
Ｒ反応物に加えることにより、ビオチン化モノクローナ
ルオリゴ体を作成した（５’−Ｂｉｏｔ−ＣＴＧＣＡＧ
ＣＣＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴ−３’）（配列番号８）。
ＰＣＲ増幅後、ｃＤＮＡ鎖を加熱（９４℃、５分）によ
り分離し、ＰＢＳ−５％ＢＳＡで１０倍希釈した。スラ
イドをＰＢＳ−５％ＢＳＡでインキュベートして非特異
部位をブロックした後、オリゴ体を組織と室温で１時間
インキュベートし、次にストレプトアビジン−ペルオキ
シダーゼ（プロメガ社（Promega Corporation）、マジ
ソン、ウィスコンシン州）で現像させた。オリゴ体を過
剰のブロックペプチドと４℃で一晩プレインキュベート
し、次に前記したように現像させて、対照試料を作成し
た。図９に示すように、ウサギで作成したアフィニティ
精製したポリクローナル抗体を使用して得られた結果
（図９Ａ）は、モノクローナルオリゴ体で得られた結果
（図９Ｂ）と区別できなかった。モノクローナルオリゴ
体を、ＣＰＤ１に対応する合成ペプチドとプレインキュ
ベートして作成した対照は、染色を示さなかった(図９
Ｃ）。ＣＰＤ１の染色は顆粒細胞とプルキンエ細胞で観
察され、ここで核膜と原形質膜染色が存在した。これ
は、合成抗体様試薬を使用して作成した「免疫組織染
色」の最初の例である。
【００６５】例１０：化学合成したオリゴ体を使用して
作成したウェスタンブロット 例５に記載のように得られた配列（配列番号７）を使用
しオリゴヌクレオチド合成機（ベックマン（Beckman）
オリゴ１０００Ｍ）を使用して、ＣＰＤ１に対して化学
合成オリゴ体を作成した。この試薬は、完全に化学合成
により作成した最初の合成抗体様試薬である。図（図１
０）から明らかなように、合成オリゴ体は、小脳抽出物
中に存在するすべてのタンパク質の混合物で作成したウ
ェスタンブロット中のＣＰＤ１を、非常に特異的に認識
する。実験の前面に追加のスポットが１つだけ見られ
る。これはまた、他の例に記載される結果（ＰＣＲ増幅
産物が使用された）を確認している。
作成したウェスタンブロット 例５に記載のように得られた配列（配列番号７）を使用
しオリゴヌクレオチド合成機（ベックマン（Beckman）
オリゴ１０００Ｍ）を使用して、ＣＰＤ１に対して化学
合成オリゴ体を作成した。この試薬は、完全に化学合成
により作成した最初の合成抗体様試薬である。図（図１
０）から明らかなように、合成オリゴ体は、小脳抽出物
中に存在するすべてのタンパク質の混合物で作成したウ
ェスタンブロット中のＣＰＤ１を、非常に特異的に認識
する。実験の前面に追加のスポットが１つだけ見られ
る。これはまた、他の例に記載される結果（ＰＣＲ増幅
産物が使用された）を確認している。
【００６６】本発明は、一時的標的の使用、「標的スイ
ッチング」法、および最も重要なことは、親和性ではな
く特異性に基づいた選択により、従来技術とは区別され
る。本発明はまた、必要な工程の数が少ないことにより
特徴付けられる。得られるオリゴ体は、ウェスタンブロ
ット、免疫組織染色、および免疫沈降により初めて証明
されるように、その挙動と特異性が従来の抗体と同一で
ある。さらに、未変性のタンパク質と変性タンパク質の
両方に特異的結合を示す、合成抗体様試薬（オリゴ体）
が初めて得られる。これらのユニークな性質は、通常抗
体を使用する方法に、これらの試薬が適するものとして
いる。
ッチング」法、および最も重要なことは、親和性ではな
く特異性に基づいた選択により、従来技術とは区別され
る。本発明はまた、必要な工程の数が少ないことにより
特徴付けられる。得られるオリゴ体は、ウェスタンブロ
ット、免疫組織染色、および免疫沈降により初めて証明
されるように、その挙動と特異性が従来の抗体と同一で
ある。さらに、未変性のタンパク質と変性タンパク質の
両方に特異的結合を示す、合成抗体様試薬（オリゴ体）
が初めて得られる。これらのユニークな性質は、通常抗
体を使用する方法に、これらの試薬が適するものとして
いる。
【００６７】前記説明と例は、オリゴ体が、非常に特異
的に、未変性または変性タンパク質を認識する能力にお
いて、抗体と同一の挙動をすることを単に例示するため
に提示したものであり、オリゴ体は、未変性または変性
タンパク質の認識に関与するすべての用途（例えば、ウ
ェスタンブロット、免疫沈降、免疫組織染色、放射免疫
定量法、ＥＬＩＳＡ、疾患の治療ための薬剤、診断ため
のミクロトレイなど）において抗体を置換できることが
明らかであるため、決して限定するものではない。当業
者は、本発明の精神と実体を取り込んだ開示した実施態
様の変更を思いつくであろうが、本発明は、本発明およ
び添付の請求項ならびにその相当物の範囲のすべての変
更を含むものと広く解釈される。
的に、未変性または変性タンパク質を認識する能力にお
いて、抗体と同一の挙動をすることを単に例示するため
に提示したものであり、オリゴ体は、未変性または変性
タンパク質の認識に関与するすべての用途（例えば、ウ
ェスタンブロット、免疫沈降、免疫組織染色、放射免疫
定量法、ＥＬＩＳＡ、疾患の治療ための薬剤、診断ため
のミクロトレイなど）において抗体を置換できることが
明らかであるため、決して限定するものではない。当業
者は、本発明の精神と実体を取り込んだ開示した実施態
様の変更を思いつくであろうが、本発明は、本発明およ
び添付の請求項ならびにその相当物の範囲のすべての変
更を含むものと広く解釈される。
【００６８】文献 ツエルク（Tuerk）とゴールド（Gold）（ツエルク（Tue
rk）とゴールド（Gold）（1990）「指数関数的濃縮によ
るリガンドの系統的進化：バクテリオファージＴ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼに対するＲＮＡリガンド」, Science,
249:505-10）。エリントン（Ellington）とゾスタック
（Szostak）（エリントン（Ellington）とゾスタック
（Szostak）（1990）「特異的リガンドに結合するＲＮ
Ａ分子のインビトロ選択」, Nature, 346:818-22。ブラ
ックウェル（Blackwell）とヴァイントラウプ（Weintra
ub）（ブラックウェル（Blackwell）とヴァイントラウ
プ（Weintraub）（1990）「結合部位選択により現れる
ＭｙｏＤおよびＥ２Ａタンパク質複合体のＤＮＡ結合優
先における差と類似性」, Science, 250:1104-10。ボッ
ク（Bock）ら（1992）「ヒトトロンビンに結合してこれ
を阻害する１本鎖ＤＮＡ分子の選択」, Nature, 355:56
4-6。ジェニソン（Jenison）ら（1998）「Ｐ−セレクチ
ン−依存性好中球−血小板接着のオリゴヌクレオチドイ
ンヒビター」, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 8:
265-79。ジェリネック（Jellinek）ら（1994）「血管内
皮増殖因子に対する高親和性ＲＮＡリガンドによる受容
体結合の阻害」, Biochemistry, 33:10450-6。ラックマ
ン（Ruckman）ら（1998）「１６５アミノ酸型の血管内
皮増殖因子（ＶＥＧＦ１６５）に対する２’−フルオロ
ピリミジンＲＮＡに基づくアプタマー。エクソン７がコ
ードするドメインを必要とする相互作用による、受容体
結合およびＶＥＧＦ誘導性血管透過性の阻害」, J. Bio
l. Chem., 273:20556-67。バラスブラマニアン（Balasu
bramanian）ら（1998）「インターフェロン−ガンマ−
阻害性オリゴデオキシヌクレオチドはインターフェロン
−ガンマのコンホメーションを変化させる」, Mol. Pha
rmacol., 53:926-32。リー（Lee）ら（1996）「オリゴ
ヌクレオチドはインターフェロン−ガンマのシグナル伝
達をブロックする」, Transplantation, 62:1297-301。
クービック（Kubik）ら（1997）「受容体結合を阻害す
る、ヒトＩＦＮ−ガンマに対する２’−フルオロ−、
２’−アミノ−、および２’−フルオロ−／アミノ−修
飾ＲＮＡリガンドの単離と性状解析」, J. Immunol., 1
59:259-67。デイヴィス（Davis）ら（1998）「フローサ
イトメトリーのための２’−Ｆ−ピリミジン−含有ＲＮ
Ａアプタマーによる細胞表面ヒトＣＤ４の染色」, Nucl
eic Acids Res., 26:3915-24。クラウス（Kraus）ら（1
998）「ＣＤ４抗原に結合してＣＤ４＋Ｔリンパ球機能
を阻害することができる新規なＲＮＡリガンド」, J. I
mmunol., 160:5209-12。タケノ（Takeno）ら（1999）
「ズブチリシンのプロテアーゼ活性を特異的に阻害する
ＲＮＡ分子の選択」, J. Biochem., 125:1115-9。クマ
ール（Kumar）ら（1997）「相補的ランダムＲＮＡのプ
ールからのＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質に特異
的なＲＮＡアプタマーの単離」, Virology, 237:270-8
2。アーヴィル（Urvil）ら（1997)「Ｃ型肝炎ウイルス
のＮＳ３プロテアーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタ
マーの選択」, Eur. J. Biochem., 248:130-8。デイヴ
ィス（Davis）ら（1996）「フローサイトメトリーにお
ける高親和性ＤＮＡリガンドの使用」, Nucleic Acid R
es., 24:702-6。チャールトン（Charlton）ら（1997）
「ヒト好中球エラスターゼのアプタマーインヒビターを
使用する炎症のインビボイメージング」, Chem. Biol.,
4:809-16。ブレス（Bless）ら（1997）「肺炎症性損傷
における好中球エラスターゼのアプタマーインヒビター
の保護作用」, Curr. Biol., 7:877-80。ボイジアウ（B
oiziau）ら（1997）「ＨＩＶ−１ ＴＡＲ成分のインビ
トロ転写のためのＤＮＡ鋳型に対するアプタマーの同
定」, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7:369-80。
アレン（Allen）ら（1996）「特異的なＲＮＡ構造モチ
ーフはＨＩＶ−１ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ
ｐ７）による高親和性結合を仲介する」, Virology, 22
5:306-15。バーグランド（Berglund）ら（1997）「ＨＩ
Ｖ−１ヌクレオキャプシドタンパク質に関する高親和性
結合部位」, Nucleic Acid Res., 25:1042-9。ボイジア
ウ（Boiziau）ら（1999）「ＨＩＶ−１トランス−活性
化−応答性ＲＮＡ成分に対して選択されたＤＮＡアプタ
マーはＲＮＡ−ＤＮＡキッシング複合体を形成する」,
J. Biol. Chem., 274:12730-7。ギヴァー（Giver）ら
（1993）「ＨＩＶ−１ Ｒｅｖに対する高親和性ＲＮＡ
リガンドの選択と設計」, Gene, 137:19-24。ジェンセ
ン（Jensen）ら（1994）「ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパク
質に対するインビトロで選択したＲＮＡリガンドの性状
解析」, J. Mol. Biol., 235:237-47。マロッツィ（Mar
ozzi）ら（1998）「Ｔａｔタンパク質によるＨＩＶ−１
ＴＡＲ変種のインビトロ選択」, J. Biotechnol., 6
1:117-28。シュナイダー（Schneider）ら（1995）「１
型ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素の高親和性ｓｓＤ
ＮＡインヒビター」, Biochemistry, 34:9599-610。ツ
エルク（Tuerk）とマクドガル−ウォー（MacDougal-Wau
gh）（1993）「機能性核酸のインビトロ進化：ＨＩＶ−
１タンパク質の高親和性ＲＮＡリガンド」,Gene, 137:3
3-9。バーク（Burke）とゴールド（Gold）（1997）「Ｓ
−アデノシルメチオニンのアデノシン残基に対するＲＮ
Ａアプタマー：セレックス（SELEX）の主題と再現性に
おける変化からの構造の推理」, Nucleic Acids Res.,
25:2020-4。ヒュイゼンガ（Huizenga）とゾスタック（S
zostak）（1995）「アデノシンとＡＴＰに結合するＤＮ
Ａアプタマー」, Biochemistry, 34:656-65。マニロニ
（Mannironi）ら（1997）「ドーパミンＲＮＡリガンド
のインビトロ選択」, Biochemistry, 36:9726-34。スー
（Xu）とエリントン（Ellington）は、タンパク質Ｒｅ
ｖの断片に対応する合成ペプチドにセレックス（SELE
X）を応用した（スー（Xu）とエリントン（Ellington）
（1996）「抗−ペプチドアプタマーはアミノ酸配列を認
識してタンパク質エピトープに結合する」, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA., 93:7475-80。ヴァイス（Weiss）
ら（1997）「ＲＮＡアプタマーはプリオンタンパク質Ｐ
ｒＰと特異的に相互作用する」, J. Virol., 71:8790-
7。クロダ（Kuroda）ら（1994）「モンテカルロ（Monte
-Carlo）シミュレーションにより試験した水溶液中のエ
ンドセリン−１のＣ末端のコンホメーション」,FEBS Le
tt., 355:263-6。リー（Li）ら（1995）「環境および／
または１次配列の微調整によるペプチドコンホメーショ
ンの操作」, Biopolymers, 35:667-75。イートン（Eato
n）ら（1995）「特異的なものを獲得しよう：特異性と
親和性の間の関係」, Chem. Biol., 2:633-8。チャン
（Chuang）とブラットナー（Blattner）（１９９４）
「ペーパースラリーを介する遠心分離によるアガロース
からウルトラファスト（Ultrafast）ＤＮＡの回収」，B
iotechniques, 17: 634, 636。ラドリッザニ（Radrizza
ni）と共同研究者らの方法（ラドリッザニ（Radrizzan
i）ら（１９９５）「マウス小脳中のＴｈｙ１．２合成
速度の進化的制御」, J.Neurosci. Res., 42: 220-7。
rk）とゴールド（Gold）（1990）「指数関数的濃縮によ
るリガンドの系統的進化：バクテリオファージＴ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼに対するＲＮＡリガンド」, Science,
249:505-10）。エリントン（Ellington）とゾスタック
（Szostak）（エリントン（Ellington）とゾスタック
（Szostak）（1990）「特異的リガンドに結合するＲＮ
Ａ分子のインビトロ選択」, Nature, 346:818-22。ブラ
ックウェル（Blackwell）とヴァイントラウプ（Weintra
ub）（ブラックウェル（Blackwell）とヴァイントラウ
プ（Weintraub）（1990）「結合部位選択により現れる
ＭｙｏＤおよびＥ２Ａタンパク質複合体のＤＮＡ結合優
先における差と類似性」, Science, 250:1104-10。ボッ
ク（Bock）ら（1992）「ヒトトロンビンに結合してこれ
を阻害する１本鎖ＤＮＡ分子の選択」, Nature, 355:56
4-6。ジェニソン（Jenison）ら（1998）「Ｐ−セレクチ
ン−依存性好中球−血小板接着のオリゴヌクレオチドイ
ンヒビター」, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 8:
265-79。ジェリネック（Jellinek）ら（1994）「血管内
皮増殖因子に対する高親和性ＲＮＡリガンドによる受容
体結合の阻害」, Biochemistry, 33:10450-6。ラックマ
ン（Ruckman）ら（1998）「１６５アミノ酸型の血管内
皮増殖因子（ＶＥＧＦ１６５）に対する２’−フルオロ
ピリミジンＲＮＡに基づくアプタマー。エクソン７がコ
ードするドメインを必要とする相互作用による、受容体
結合およびＶＥＧＦ誘導性血管透過性の阻害」, J. Bio
l. Chem., 273:20556-67。バラスブラマニアン（Balasu
bramanian）ら（1998）「インターフェロン−ガンマ−
阻害性オリゴデオキシヌクレオチドはインターフェロン
−ガンマのコンホメーションを変化させる」, Mol. Pha
rmacol., 53:926-32。リー（Lee）ら（1996）「オリゴ
ヌクレオチドはインターフェロン−ガンマのシグナル伝
達をブロックする」, Transplantation, 62:1297-301。
クービック（Kubik）ら（1997）「受容体結合を阻害す
る、ヒトＩＦＮ−ガンマに対する２’−フルオロ−、
２’−アミノ−、および２’−フルオロ−／アミノ−修
飾ＲＮＡリガンドの単離と性状解析」, J. Immunol., 1
59:259-67。デイヴィス（Davis）ら（1998）「フローサ
イトメトリーのための２’−Ｆ−ピリミジン−含有ＲＮ
Ａアプタマーによる細胞表面ヒトＣＤ４の染色」, Nucl
eic Acids Res., 26:3915-24。クラウス（Kraus）ら（1
998）「ＣＤ４抗原に結合してＣＤ４＋Ｔリンパ球機能
を阻害することができる新規なＲＮＡリガンド」, J. I
mmunol., 160:5209-12。タケノ（Takeno）ら（1999）
「ズブチリシンのプロテアーゼ活性を特異的に阻害する
ＲＮＡ分子の選択」, J. Biochem., 125:1115-9。クマ
ール（Kumar）ら（1997）「相補的ランダムＲＮＡのプ
ールからのＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質に特異
的なＲＮＡアプタマーの単離」, Virology, 237:270-8
2。アーヴィル（Urvil）ら（1997)「Ｃ型肝炎ウイルス
のＮＳ３プロテアーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタ
マーの選択」, Eur. J. Biochem., 248:130-8。デイヴ
ィス（Davis）ら（1996）「フローサイトメトリーにお
ける高親和性ＤＮＡリガンドの使用」, Nucleic Acid R
es., 24:702-6。チャールトン（Charlton）ら（1997）
「ヒト好中球エラスターゼのアプタマーインヒビターを
使用する炎症のインビボイメージング」, Chem. Biol.,
4:809-16。ブレス（Bless）ら（1997）「肺炎症性損傷
における好中球エラスターゼのアプタマーインヒビター
の保護作用」, Curr. Biol., 7:877-80。ボイジアウ（B
oiziau）ら（1997）「ＨＩＶ−１ ＴＡＲ成分のインビ
トロ転写のためのＤＮＡ鋳型に対するアプタマーの同
定」, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7:369-80。
アレン（Allen）ら（1996）「特異的なＲＮＡ構造モチ
ーフはＨＩＶ−１ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ
ｐ７）による高親和性結合を仲介する」, Virology, 22
5:306-15。バーグランド（Berglund）ら（1997）「ＨＩ
Ｖ−１ヌクレオキャプシドタンパク質に関する高親和性
結合部位」, Nucleic Acid Res., 25:1042-9。ボイジア
ウ（Boiziau）ら（1999）「ＨＩＶ−１トランス−活性
化−応答性ＲＮＡ成分に対して選択されたＤＮＡアプタ
マーはＲＮＡ−ＤＮＡキッシング複合体を形成する」,
J. Biol. Chem., 274:12730-7。ギヴァー（Giver）ら
（1993）「ＨＩＶ−１ Ｒｅｖに対する高親和性ＲＮＡ
リガンドの選択と設計」, Gene, 137:19-24。ジェンセ
ン（Jensen）ら（1994）「ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパク
質に対するインビトロで選択したＲＮＡリガンドの性状
解析」, J. Mol. Biol., 235:237-47。マロッツィ（Mar
ozzi）ら（1998）「Ｔａｔタンパク質によるＨＩＶ−１
ＴＡＲ変種のインビトロ選択」, J. Biotechnol., 6
1:117-28。シュナイダー（Schneider）ら（1995）「１
型ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素の高親和性ｓｓＤ
ＮＡインヒビター」, Biochemistry, 34:9599-610。ツ
エルク（Tuerk）とマクドガル−ウォー（MacDougal-Wau
gh）（1993）「機能性核酸のインビトロ進化：ＨＩＶ−
１タンパク質の高親和性ＲＮＡリガンド」,Gene, 137:3
3-9。バーク（Burke）とゴールド（Gold）（1997）「Ｓ
−アデノシルメチオニンのアデノシン残基に対するＲＮ
Ａアプタマー：セレックス（SELEX）の主題と再現性に
おける変化からの構造の推理」, Nucleic Acids Res.,
25:2020-4。ヒュイゼンガ（Huizenga）とゾスタック（S
zostak）（1995）「アデノシンとＡＴＰに結合するＤＮ
Ａアプタマー」, Biochemistry, 34:656-65。マニロニ
（Mannironi）ら（1997）「ドーパミンＲＮＡリガンド
のインビトロ選択」, Biochemistry, 36:9726-34。スー
（Xu）とエリントン（Ellington）は、タンパク質Ｒｅ
ｖの断片に対応する合成ペプチドにセレックス（SELE
X）を応用した（スー（Xu）とエリントン（Ellington）
（1996）「抗−ペプチドアプタマーはアミノ酸配列を認
識してタンパク質エピトープに結合する」, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA., 93:7475-80。ヴァイス（Weiss）
ら（1997）「ＲＮＡアプタマーはプリオンタンパク質Ｐ
ｒＰと特異的に相互作用する」, J. Virol., 71:8790-
7。クロダ（Kuroda）ら（1994）「モンテカルロ（Monte
-Carlo）シミュレーションにより試験した水溶液中のエ
ンドセリン−１のＣ末端のコンホメーション」,FEBS Le
tt., 355:263-6。リー（Li）ら（1995）「環境および／
または１次配列の微調整によるペプチドコンホメーショ
ンの操作」, Biopolymers, 35:667-75。イートン（Eato
n）ら（1995）「特異的なものを獲得しよう：特異性と
親和性の間の関係」, Chem. Biol., 2:633-8。チャン
（Chuang）とブラットナー（Blattner）（１９９４）
「ペーパースラリーを介する遠心分離によるアガロース
からウルトラファスト（Ultrafast）ＤＮＡの回収」，B
iotechniques, 17: 634, 636。ラドリッザニ（Radrizza
ni）と共同研究者らの方法（ラドリッザニ（Radrizzan
i）ら（１９９５）「マウス小脳中のＴｈｙ１．２合成
速度の進化的制御」, J.Neurosci. Res., 42: 220-7。
以後、本発明を以下の添付図面を参照してさらに詳細に
説明する。
説明する。
【図１】図１は、オリゴ体を入手するために使用される
方法の概略図を示す。
方法の概略図を示す。
【図２】図２は、タンパク質ＰＰ２Ａに特異的なポリク
ローナル抗体で染色した小脳からの総タンパク質のウェ
スタンブロットを示す。ここで、「Ａ」は、アルカリホ
スファターゼに結合した２次抗体で現像させた、市販の
ポリクローナル抗体で得られたウェスタンブロット（対
照）であり、そして「Ｂ」は、32Ｐで標識した「オリゴ
体」を使用し、オートラジオグラフィーにより現像させ
て得られた「ウェスタンブロット」である。
ローナル抗体で染色した小脳からの総タンパク質のウェ
スタンブロットを示す。ここで、「Ａ」は、アルカリホ
スファターゼに結合した２次抗体で現像させた、市販の
ポリクローナル抗体で得られたウェスタンブロット（対
照）であり、そして「Ｂ」は、32Ｐで標識した「オリゴ
体」を使用し、オートラジオグラフィーにより現像させ
て得られた「ウェスタンブロット」である。
【図３】図３は、タンパク質ＰＰ２Ｂαに対するポリク
ローナル抗体で現像させた、小脳からの総タンパク質の
ウェスタンブロットを示す。ここで、「Ａ」は、ＰＰ２
Ｂαに対する市販のポリクローナル抗体を使用して得ら
れ、アルカリホスファターゼに結合した２次抗体で現像
させたウェスタンブロット（対照）であり、そして
「Ｂ」は、32Ｐで標識したポリクローナル「オリゴ体」
を使用し、オートラジオグラフィーにより現像させて得
られた「ウェスタンブロット」である。
ローナル抗体で現像させた、小脳からの総タンパク質の
ウェスタンブロットを示す。ここで、「Ａ」は、ＰＰ２
Ｂαに対する市販のポリクローナル抗体を使用して得ら
れ、アルカリホスファターゼに結合した２次抗体で現像
させたウェスタンブロット（対照）であり、そして
「Ｂ」は、32Ｐで標識したポリクローナル「オリゴ体」
を使用し、オートラジオグラフィーにより現像させて得
られた「ウェスタンブロット」である。
【図４】図４は、タンパク質ＣＰＤ１に対するポリクロ
ーナル抗体を使用することにより現像させた、小脳から
の総タンパク質のウェスタンブロットを示す。ここで、
「Ａ」は、ＣＰＤ１に対応する合成ペプチドの注射によ
りウサギで産生したポリクローナル抗体を使用して得ら
れ、アルカリホスファターゼに結合した２次抗体で現像
させたウェスタンブロット（対照）であり、そして
「Ｂ」は、32Ｐで標識した、同じ合成ペプチドで得られ
たポリクローナル「オリゴ体」を使用し、オートラジオ
グラフィーにより現像させて得られた「ウェスタンブロ
ット」である。両方の抗体ともＣＰＤ１の多数のアイソ
フォームを認識する。
ーナル抗体を使用することにより現像させた、小脳から
の総タンパク質のウェスタンブロットを示す。ここで、
「Ａ」は、ＣＰＤ１に対応する合成ペプチドの注射によ
りウサギで産生したポリクローナル抗体を使用して得ら
れ、アルカリホスファターゼに結合した２次抗体で現像
させたウェスタンブロット（対照）であり、そして
「Ｂ」は、32Ｐで標識した、同じ合成ペプチドで得られ
たポリクローナル「オリゴ体」を使用し、オートラジオ
グラフィーにより現像させて得られた「ウェスタンブロ
ット」である。両方の抗体ともＣＰＤ１の多数のアイソ
フォームを認識する。
【図５】図５は、ＣＰＤ１に対する抗体を使用すること
により現像させた、小脳からの総タンパク質のウェスタ
ンブロットを示す。ここで、「Ａ」は、ＣＰＤ１に対応
する合成ペプチドを利用してウサギで製造したポリクロ
ーナル抗体を使用して得られ、アルカリホスファターゼ
に結合した２次抗体で現像させたウェスタンブロット
（対照）であり、そして「Ｂ」は、32Ｐで標識したモノ
クローナル「オリゴ体」を使用し、オートラジオグラフ
ィーにより現像させて得られたウェスタンブロットであ
る。
により現像させた、小脳からの総タンパク質のウェスタ
ンブロットを示す。ここで、「Ａ」は、ＣＰＤ１に対応
する合成ペプチドを利用してウサギで製造したポリクロ
ーナル抗体を使用して得られ、アルカリホスファターゼ
に結合した２次抗体で現像させたウェスタンブロット
（対照）であり、そして「Ｂ」は、32Ｐで標識したモノ
クローナル「オリゴ体」を使用し、オートラジオグラフ
ィーにより現像させて得られたウェスタンブロットであ
る。
【図６】図６は、タンパク質ＣＰＤ１に対する32Ｐ標識
２本鎖モノクローナル「オリゴ体」を使用して現像させ
た、生後日数の異なる（Ｐ７、Ｐ１３、およびＰ１７）
小脳からの総タンパク質のウェスタンブロットを示す。
使用直前にオリゴ体溶液を９５℃に加熱して、鎖を分離
し、オートラジオグラフィーによりブロットを現像させ
た。ウサギポリクローナル抗体（図６参照）を使用して
検出した同じアイソフォームが観察される。
２本鎖モノクローナル「オリゴ体」を使用して現像させ
た、生後日数の異なる（Ｐ７、Ｐ１３、およびＰ１７）
小脳からの総タンパク質のウェスタンブロットを示す。
使用直前にオリゴ体溶液を９５℃に加熱して、鎖を分離
し、オートラジオグラフィーによりブロットを現像させ
た。ウサギポリクローナル抗体（図６参照）を使用して
検出した同じアイソフォームが観察される。
【図７】図７は、タンパク質ＣＰＤ１に対する抗体を使
用することにより現像させた、生後日数の異なる（Ｐ
５、Ｐ７、Ｐ１３、およびＰ１７）小脳からの総タンパ
ク質のウェスタンブロットを示す。ここで、「Ａ」は、
ＣＰＤ１ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を
使用して得られ、アルカリホスファターゼに結合した２
次抗体で現像させたウェスタンブロット（対照）であ
り、そして「Ｂ」は、ＰＣＲ増幅の間にビオチン化され
た２本鎖モノクローナル「オリゴ体」で得られ、アビジ
ン−アルカリホスファターゼにより現像させたウェスタ
ンブロットである。両方の抗体で同じアイソフォームが
得られる。
用することにより現像させた、生後日数の異なる（Ｐ
５、Ｐ７、Ｐ１３、およびＰ１７）小脳からの総タンパ
ク質のウェスタンブロットを示す。ここで、「Ａ」は、
ＣＰＤ１ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を
使用して得られ、アルカリホスファターゼに結合した２
次抗体で現像させたウェスタンブロット（対照）であ
り、そして「Ｂ」は、ＰＣＲ増幅の間にビオチン化され
た２本鎖モノクローナル「オリゴ体」で得られ、アビジ
ン−アルカリホスファターゼにより現像させたウェスタ
ンブロットである。両方の抗体で同じアイソフォームが
得られる。
【図８】図８は、ＣＰＤ１に対するモノクローナルオリ
ゴ体を使用した「ウェスタンブロット」と「免疫沈降」
を示し、生後５〜１７日（Ｐ５、Ｐ７、Ｐ１、およびＰ
１７）のマウスから新に単離した新鮮な小脳をホモジナ
イズし、１００μｇのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に移し、ＰＢＳ−ＢＳ
Ａ ５％でブロックした。図中、「Ａ」は、ウサギポリ
クローナル１次抗体で４℃で一晩インキュベートし、次
に２次抗体で室温で１時間インキュベートし、ヤギ抗ウ
サギアルカリホスファターゼ結合体とＮＴＢ／ＢＣＩＰ
を使用して現像させたウェスタンブロットである。
「Ｂ」は、免疫前ウサギ血清を使用してＡのように得ら
れた結果である。「Ｃ」は、ビオチン化モノクローナル
オリゴ体を使用して、ＰＢＳ−５％ＢＳＡ中で室温で１
時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、ストレプ
トアビジン−ＰＡで現像させて得られた結果である。
「Ｄ」は、Ｐ７でのウェスタンブロットと35Ｓ−ＣＰＤ
１の「免疫沈降」の比較であり、ここでカラム「１」
は、免疫前ウサギ血清を使用した生後７日のウェスタン
ブロットであり、カラム「２」は、ウサギポリクローナ
ル抗体を使用したウェスタンブロットであり、カラム
「３」は、モノクローナルオリゴ体を使用したウェスタ
ンブロットであり、カラム「４」は、モノクローナルオ
リゴ体と35Ｓで標識したタンパク質を使用したウェスタ
ンブロットである。「ｈ」と「ｌ」の文字は、高分子量
および低分子量アイソフォームを意味し、灰色の矢印
は、免疫前血清に対応するバンドである。
ゴ体を使用した「ウェスタンブロット」と「免疫沈降」
を示し、生後５〜１７日（Ｐ５、Ｐ７、Ｐ１、およびＰ
１７）のマウスから新に単離した新鮮な小脳をホモジナ
イズし、１００μｇのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に移し、ＰＢＳ−ＢＳ
Ａ ５％でブロックした。図中、「Ａ」は、ウサギポリ
クローナル１次抗体で４℃で一晩インキュベートし、次
に２次抗体で室温で１時間インキュベートし、ヤギ抗ウ
サギアルカリホスファターゼ結合体とＮＴＢ／ＢＣＩＰ
を使用して現像させたウェスタンブロットである。
「Ｂ」は、免疫前ウサギ血清を使用してＡのように得ら
れた結果である。「Ｃ」は、ビオチン化モノクローナル
オリゴ体を使用して、ＰＢＳ−５％ＢＳＡ中で室温で１
時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、ストレプ
トアビジン−ＰＡで現像させて得られた結果である。
「Ｄ」は、Ｐ７でのウェスタンブロットと35Ｓ−ＣＰＤ
１の「免疫沈降」の比較であり、ここでカラム「１」
は、免疫前ウサギ血清を使用した生後７日のウェスタン
ブロットであり、カラム「２」は、ウサギポリクローナ
ル抗体を使用したウェスタンブロットであり、カラム
「３」は、モノクローナルオリゴ体を使用したウェスタ
ンブロットであり、カラム「４」は、モノクローナルオ
リゴ体と35Ｓで標識したタンパク質を使用したウェスタ
ンブロットである。「ｈ」と「ｌ」の文字は、高分子量
および低分子量アイソフォームを意味し、灰色の矢印
は、免疫前血清に対応するバンドである。
【図９】図９は、ＣＰＤ１の免疫組織染色であり、ここ
でマウス小脳（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）は生後７日目
に解剖し、アルコール／酸（９５％エタノール：５％酢
酸、−２０℃で４時間）で固定し、脱水し、パラフィン
に包埋した。５μｍの組織切片を、シラン化処理（シラ
ン、シグマ（Sigma Co.）、セントルイス、ミズーリ
州）したカバーガラスでマウントし、脱パラフィンを行
い、再度水を加え、ＰＢＳ−５％ＢＳＡを使用して１時
間ブロックした。図中、「Ａ」は、アフィニティ精製し
たウサギポリクローナル抗体に４℃で一晩暴露し、ＰＢ
Ｓで２回リンスし、２次抗体（ヤギ抗ウサギペルオキシ
ダーゼ １：１０００）で１時間インキュベートし、Ｄ
ＡＢ（ギブコビーアールエル（Gibco BRL）、ゲーサー
ズバーグ、メリーランド州）で現像させた切片である。
「Ｂ」は、ビオチン化モノクローナルオリゴ体を用いて
得られた「免疫組織染色」である。試薬は、５’−ビオ
チン化プライマーをＰＣＲ反応物に加えることにより作
成した（５’−Ｂｉｏｔ−ＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧ
ＧＡＴＣＣＴ−３’）。ＰＣＲ増幅後、ｃＤＮＡ鎖を加
熱（９４℃、５分）により分離し、ＰＢＳ−５％ＢＳＡ
で１０倍希釈した。スライドをＰＢＳ−５％ＢＳＡでイ
ンキュベートして非特異部位をブロックした後、オリゴ
体を組織と室温で１時間インキュベートし、次にストレ
プトアビジン−ペルオキシダーゼ（プロメガ社（Promeg
a Corporation）、マジソン、ウィスコンシン州）で現
像させた。ビオチン化−オリゴ体で染色したウェスタン
ブロットで得られたバンドは、32Ｐ標識オリゴ体を使用
して現像させたものと同一（結果は示してない）である
ため、ビオチンの存在は、ＰＣＲ増幅や標的への結合に
影響を与えない。「Ｃ」は、オリゴ体を過剰のブロッキ
ングペプチドとプレインキュベート（４℃で一晩）し、
次に「Ｂ」に記載したようにインキュベートして現像さ
せた対照試料である。
でマウス小脳（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）は生後７日目
に解剖し、アルコール／酸（９５％エタノール：５％酢
酸、−２０℃で４時間）で固定し、脱水し、パラフィン
に包埋した。５μｍの組織切片を、シラン化処理（シラ
ン、シグマ（Sigma Co.）、セントルイス、ミズーリ
州）したカバーガラスでマウントし、脱パラフィンを行
い、再度水を加え、ＰＢＳ−５％ＢＳＡを使用して１時
間ブロックした。図中、「Ａ」は、アフィニティ精製し
たウサギポリクローナル抗体に４℃で一晩暴露し、ＰＢ
Ｓで２回リンスし、２次抗体（ヤギ抗ウサギペルオキシ
ダーゼ １：１０００）で１時間インキュベートし、Ｄ
ＡＢ（ギブコビーアールエル（Gibco BRL）、ゲーサー
ズバーグ、メリーランド州）で現像させた切片である。
「Ｂ」は、ビオチン化モノクローナルオリゴ体を用いて
得られた「免疫組織染色」である。試薬は、５’−ビオ
チン化プライマーをＰＣＲ反応物に加えることにより作
成した（５’−Ｂｉｏｔ−ＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧ
ＧＡＴＣＣＴ−３’）。ＰＣＲ増幅後、ｃＤＮＡ鎖を加
熱（９４℃、５分）により分離し、ＰＢＳ−５％ＢＳＡ
で１０倍希釈した。スライドをＰＢＳ−５％ＢＳＡでイ
ンキュベートして非特異部位をブロックした後、オリゴ
体を組織と室温で１時間インキュベートし、次にストレ
プトアビジン−ペルオキシダーゼ（プロメガ社（Promeg
a Corporation）、マジソン、ウィスコンシン州）で現
像させた。ビオチン化−オリゴ体で染色したウェスタン
ブロットで得られたバンドは、32Ｐ標識オリゴ体を使用
して現像させたものと同一（結果は示してない）である
ため、ビオチンの存在は、ＰＣＲ増幅や標的への結合に
影響を与えない。「Ｃ」は、オリゴ体を過剰のブロッキ
ングペプチドとプレインキュベート（４℃で一晩）し、
次に「Ｂ」に記載したようにインキュベートして現像さ
せた対照試料である。
【図１０】図１０は、図１に示すオリゴ体配列を使用し
てオリゴヌクレオチド合成機中で作成した、ＣＰＤ１に
対する合成オリゴ体を用いて得られたウェスタンブロッ
トを示す。この試薬は、完全に化学合成により作成した
最初の合成抗体様試薬であり、天然の抗体のようにウェ
スタンブロット中のタンパク質を認識することができ
る。
てオリゴヌクレオチド合成機中で作成した、ＣＰＤ１に
対する合成オリゴ体を用いて得られたウェスタンブロッ
トを示す。この試薬は、完全に化学合成により作成した
最初の合成抗体様試薬であり、天然の抗体のようにウェ
スタンブロット中のタンパク質を認識することができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Claims (31)
- 【請求項１】 高親和性ではなく高特異性に基づく方法
により選択される天然または誘導体化オリゴヌクレオチ
ドを含んでなる、合成オリゴヌクレオチドに基づく抗体
様試薬または「オリゴ体」であって、多くの用途で天然
のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のように作
用するユニークな能力を有して、未変性および／または
変性タンパク質の両方を非常に特異的に認識する上記試
薬。 - 【請求項２】 オリゴ体を得る方法であって、 均一な、プライマー結合５’末端配列と３’末端配列、
および間にランダムなコア配列を有する、オリゴヌクレ
オチドのライブラリーを提供する工程；オリゴヌクレオ
チドライブラリーを、最終標的分子（これに対してオリ
ゴ体が得られる）の一部に対応する合成一時的標的と一
緒に、一時的標的に対する特異的結合を示すライブラリ
ーからオリゴヌクレオチドを結合させるのに充分な時間
インキュベートする工程；未結合オリゴヌクレオチドを
一時的標的から分離し、次にインキュベーション中に一
時的標的に結合するオリゴヌクレオチドを溶出および採
取することにより、一時的標的に特異的に結合するオリ
ゴヌクレオチドを選択する工程；採取したオリゴヌクレ
オチドを増幅する工程；検出可能な結合が得られるま
で、一時的標的とのインキュベーション、選択および増
幅工程を繰り返す工程；次に、検出可能な結合を示す採
取および増幅したオリゴヌクレオチドを、他の分子との
混合物中に最終標的分子を含む標的混合物と一緒に、採
取および増幅したオリゴヌクレオチドからオリゴヌクレ
オチドを最終標的分子に結合させるのに充分な時間イン
キュベートする工程；最終標的から未結合オリゴヌクレ
オチドを分離し、続いて上昇した特異性で最終標的に結
合するオリゴヌクレオチドを溶出および採取することに
より、上昇した特異性で最終標的に結合するオリゴヌク
レオチドを選択する工程；最終標的から採取した、上昇
した特異性で結合するオリゴヌクレオチドを増幅する工
程；および最終標的に対する結合特異性の上昇がもはや
観察されなくなるまで、最終標的分子を含む標的混合物
とのインキュベーション、選択および増幅工程を繰り返
す工程を含んでなる、上記方法。 - 【請求項３】 最終標的分子はタンパク質であり、かつ
一時的標的は該タンパク質の断片に対応する合成ペプチ
ドである、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 合成ペプチドは、該タンパク質の抗原性
断片に対応する、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 増幅は、オリゴヌクレオチドライブラリ
ーからのオリゴヌクレオチドの均一な５’および３’末
端部分に結合するプライマーを使用する、ポリメラーゼ
連鎖反応により行われる、請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】 増幅は、標的に結合する採取したオリゴ
ヌクレオチドを指数関数的ＰＣＲ増幅に供し；指数関数
的に増幅したオリゴヌクレオチドを精製して、末端切断
型オリゴヌクレオチドとポリマーを除去し；そして次
に、精製したオリゴヌクレオチドを、１つだけのプライ
マーを使用する線状ＰＣＲ増幅に供して１本鎖オリゴヌ
クレオチドを得ることにより行われる、請求項５に記載
の方法。 - 【請求項７】 増幅したオリゴヌクレオチドが標識され
た型で得られるように、線状ＰＣＲ増幅は標識物の存在
下で行われる、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 標識物は、放射性標識物、ビオチンおよ
び蛍光標識物よりなる群から選択される、請求項７に記
載の方法。 - 【請求項９】 一時的標的は固体マトリックスに結合し
ている、請求項２に記載の方法。 - 【請求項１０】 固体マトリックスはニトロセルロース
紙である、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 固体マトリックスは、非特異的結合部
位をブロックするために前処理される、請求項９に記載
の方法。 - 【請求項１２】 分離は、固体マトリックスから未結合
オリゴヌクレオチドを洗浄することにより行われる、請
求項９に記載の方法。 - 【請求項１３】 インキュベーションは、一時的標的と
一緒に２回または３回だけ、そして最終標的と一緒に２
回または３回だけ行われる、請求項２に記載の方法。 - 【請求項１４】 インキュベーションサイクルの総数は
５回を超えない、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 結合特異性の上昇がもはや観察されな
くなった後に採取したオリゴヌクレオチドを、適切なベ
クターに連結し、クローン化し、スクリーニングし、精
製し、配列決定して、モノクローナルオリゴ体を得る、
請求項２に記載の方法。 - 【請求項１６】 ＰＣＲ増幅、プラスミド消化または化
学合成（天然または誘導体化オリゴヌクレオチドを使用
する）により、得られるモノクローナルオリゴ体を大量
に産生することをさらに含んでなる、請求項１５に記載
の方法。 - 【請求項１７】 最終標的は、未変性タンパク質であ
り、そして上昇した特異性で最終標的に結合するオリゴ
ヌクレオチドの選択は、ドットブロット、液相分離、免
疫組織染色、ゲルシフトおよびカラム分離よりなる群か
ら選択される、最終標的タンパク質を天然のコンホメー
ションに維持する非変性法により行われる、請求項２に
記載の方法。 - 【請求項１８】 請求項２に記載の方法により得られ
る、標的タンパク質に特異的に結合するオリゴヌクレオ
チドを含んでなるオリゴ体。 - 【請求項１９】 請求項１５に記載の方法により得られ
る、標的タンパク質に特異的に結合するオリゴヌクレオ
チドを含んでなるモノクローナルオリゴ体。 - 【請求項２０】 オリゴヌクレオチドは、未変性および
／または変性タンパク質を認識する、請求項１８に記載
のオリゴ体。 - 【請求項２１】 標的タンパク質に特異的に結合するオ
リゴヌクレオチドからなるオリゴ体を結合させた固体マ
トリックスを含んでなる製造品。 - 【請求項２２】 ２本鎖または１本鎖の核酸から作られ
る生成物を含んでなるオリゴ体。 - 【請求項２３】 天然または修飾化学基を有するリボ核
酸を含んでなるオリゴ体。 - 【請求項２４】 天然または修飾化学基を含む、デオキ
シリボ核酸を含んでなるオリゴ体。 - 【請求項２５】 バイオテクノロジー、研究または臨床
に重要な任意のポリマー（タンパク質、炭水化物、オリ
ゴヌクレオチドなど）または分子であってよい、最終標
的の断片を一時的標的として使用することにより得られ
るオリゴ体。 - 【請求項２６】 修飾合成ペプチド（例えば、リン酸
化、イソプレニル化、グリコシル化）を一時的標的とし
て使用して得られるオリゴ体。 - 【請求項２７】 薬物の担体（吸着または共有結合）と
して、または生理学的方法のインヒビター／アクチベー
ターとして使用されるか、あるいは工業的または商業的
に重要な研究または他の用途に使用されるオリゴ体。 - 【請求項２８】 ウェスタンブロット、免疫組織染色、
免疫沈降、放射免疫定量法、ＥＬＩＳＡなどのような、
診断のために抗体が使用される種々の用途に使用される
オリゴ体。 - 【請求項２９】 タンパク質精製、親和性クロマトグラ
フィー、ライブラリースクリーニング、細胞選別、およ
び共焦点顕微鏡法のような、種々のバイオテクノロジー
の用途に使用されるオリゴ体。 - 【請求項３０】 種々の疾患の診断のためのキットに使
用されるオリゴ体。 - 【請求項３１】 疾患の治療のための製剤としてのオリ
ゴ体。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AR990104272 | 1999-08-26 | ||
| AR9904272 | 1999-08-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001120282A true JP2001120282A (ja) | 2001-05-08 |
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ID=3461184
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000252476A Pending JP2001120282A (ja) | 1999-08-26 | 2000-08-23 | ポリクローナルおよびモノクローナルオリゴ体（合成オリゴヌクレオチドに基づく抗体様試薬）およびオリゴ体の作成方法 |
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| JP (1) | JP2001120282A (ja) |
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| EP3604554A1 (en) * | 2018-08-02 | 2020-02-05 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | A method of identifying or producing an aptamer for a denatured peptide or protein |
| CN114107307B (zh) * | 2020-08-27 | 2023-08-18 | 首都师范大学 | 一种体外筛选pd-l1的dna核酸适配体的方法及其应用 |
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2000
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- 2000-08-23 JP JP2000252476A patent/JP2001120282A/ja active Pending
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