JP6041373B2 - ＴＮＦ−αに結合するアプタマー分子 - Google Patents

Description

本発明は、腫瘍壊死因子−α（Tumor Necrosis Factor−α：ＴＮＦ−α）に結合するアプタマー分子に関する。特には、本発明は、ヒトＴＮＦ−αに結合するＲＮＡアプタマー分子に関する。

ヒトＴＮＦ−αは、１５７アミノ酸残基、分子量１７ｋＤａのタンパク質であり、一般に、ヒトＴＮＦ−αはホモ３量体を形成し、血液中を循環する。ＴＮＦ−αは、細胞外サイトカインであり、サイトカインや免疫調節分子の産生、細胞増殖および分化、アポトーシスなどを誘起する生物作用を示す。その他に、ヒトＴＮＦ−αが関与する生理作用として、胸腺細胞の増殖促進、Ｂ細胞の抗体産生促進、マクロファージの活性化、破骨細胞の活性化などが知られている。

ＴＮＦ−αは、細胞表面にあるＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）への結合を介して、その生物活性を発揮する。ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）には、分子量５５ｋＤのＴＮＦ−ＲＩと、分子量が７５ｋＤのＴＮＦ−ＲIIの二種が存在している。ＴＮＦ−ＲＩとＴＮＦ−ＲIIの二種の受容体は、いずれも、ＴＮＦ−αに対する高い親和性を有している。

ＴＮＦ−αと構造的な類似性を有する、ＴＮＦファミリーに含まれるタンパク質として、ＴＮＦ−βが存在している。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βファミリー内の配列同一性は、それぞれ７１％および６１％である。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β間の配列同一性は２９％であり、類似性は低いが、ＴＮＦ−βは、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）に、ＴＮＦ−αと同等の親和性で結合する。従って、ＴＮＦ−βは、ＴＮＦ−αと類似した生物活性を発揮できる。

免疫応答や炎症反応が生じていない、健康な個体では、ＴＮＦ−αの血液中濃度は、５ｐｇ／ｍｌ未満である。ＴＮＦ−αホモ３量体の過剰発現は、敗血症ショック、リウマチ関節炎などの疾患の発症を引き起こす。クローン病に関連した、炎症性大腸炎、潰瘍性大腸炎、デュシュンヌ型筋ジストロフィーなどの病態では、低濃度のＴＮＦ−αホモの上昇が起こる。その他、ＴＮＦ−αは、破骨細胞の活性化に関与することから、骨粗鬆症との関連が示唆されている。

ＴＮＦ−αは、敗血症ショック、リウマチ関節炎、移植拒絶反応、ＡＩＤＳ、カヘキシー（悪液質）、パーキンソン病などの病態に深く関与することが知られている。すなわち、ＴＮＦ−αが深く関与する各種の病態について、その診断を進める際、ＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度の測定が不可欠である。一方、クローン病に関連した、炎症性大腸炎、潰瘍性大腸炎、デュシュンヌ型筋ジストロフィーなどの病態では、ＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度の上昇は起こるが、その濃度上昇は、通常、低濃度領域に留まっている。具体的には、敗血症ショックを誘起するＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度レベルと比較し、有意に低い濃度レベルに留まっている。従って、各種の病態について、その診断を進める際、ヒトＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度を、５ｐｇ／ｍｌ（ホモ３量体換算濃度０．１ｐＭ）程度の低い濃度でも高い定量性で測定可能な、高感度の測定手段が望まれている。

ヒトＴＮＦ−αは、ホモ３量体の形状で産生細胞から放出される。このヒトＴＮＦ−αホモ３量体は、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）に結合可能であるが、ヒトＴＮＦ−αの単量体は、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）に結合することができない。従って、血液中に含有されている、ヒトＴＮＦ−αの単量体とホモ３量体を合計したタンパク質濃度ではなく、ヒトＴＮＦ−αホモ３量体の濃度を高い定量性で測定可能な、高感度の測定手段が望まれている。

例えば、敗血症ショックを引き起こす、ヒトＴＮＦ−αホモ３量体の過剰発現が生じると、ヒトＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度は、少なくとも、１０００ｐｇ／ｍｌの水準（ホモ３量体換算濃度２０ｐＭ）に達する。従って、ヒトＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度に関して、少なくとも、５ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲（ホモ３量体換算濃度 ０．１ｐＭ〜２０ｐＭの範囲）において、高い定量性で濃度の測定可能な、高感度の測定手段が望まれている。

各種のタンパク質分子の高感度測定は、検出対象のタンパク質分子に対して、特異的で高い結合能を有する分子を利用することで達成できる。例えば、検出対象のタンパク質分子に対して、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子を利用して、アプタマー分子と検出対象のタンパク質分子の複合体を形成させ、検出対象のタンパク質分子の濃度を測定する手段が望まれている。すなわち、前記の目的に利用可能な、ＴＮＦ−αに対して、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子の提供が望まれている。

特に、上述のＴＮＦ−αが発揮する生理作用は、ＴＮＦ−αのホモ３量体のＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）への結合を介して発揮されるため、血液中に存在するＴＮＦ−αのホモ３量体の濃度の検出に利用可能な、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子の提供が望まれている。

例えば、血液試料から調製される血漿試料中には、ホモ３量体型のＴＮＦ−α以外に、種々の可溶性タンパク質や脂質分子が含まれている。その際、ホモ３量体型のＴＮＦ−α以外の、種々の可溶性タンパク質や脂質分子に対しては、実質的に結合能を有さず、ホモ３量体型のＴＮＦ−αに対して、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子を利用することで、ホモ３量体型のＴＮＦ−αを高感度で測定することが可能となる。

具体的には、ホモ３量体型のＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子とを組み合わせることで、所謂、ＥＬＩＳＡ法と同様なホモ３量体型のＴＮＦ−αの定量的な検出系を構成することができる。例えば、ホモ３量体型のＴＮＦ−αに対する、平衡解離定数Ｋ_D≦１ｐＭの特異的なモノクローナル抗体を利用して、ホモ３量体型のＴＮＦ−αを固定化した上で、固定化されたホモ３量体型のＴＮＦ−αに、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子を結合させる。固定化されたホモ３量体型のＴＮＦ−αと結合しているアプタマー分子の量を測定することで、固定化されたホモ３量体型のＴＮＦ−αの量の定量が可能となる。

さらには、ホモ３量体型のＴＮＦ−αに対して、結合部位が相違する、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子二種を組み合わせることで、所謂、ＥＬＩＳＡ法と同様なホモ３量体型のＴＮＦ−αの定量的な検出系を構成することもできる。

本発明は、上記の課題を解決するものである。すなわち、本発明の目的は、検出対象のＴＮＦ−αの濃度、特には、ヒトＴＮＦ−αホモ３量体の濃度を高い感度で測定する際に利用可能な、ＴＮＦ−α、なかでも、ヒトＴＮＦ−αに対して、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子を提供することにある。特には、本発明の目的は、ヒトＴＮＦ−αホモ３量体に対して、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子を提供することにある。

本発明者らは、前記の課題を解決すべく、まず、ヒトＴＮＦ−αに対して、一定水準以上の結合能を示す「ヒトＴＮＦ−αに対するＲＮＡアプタマー分子」が実際に存在するか否かに関して、選別を行った。さらに、仮に、一定水準以上の結合能を示す「ヒトＴＮＦ−αに対するＲＮＡアプタマー分子」が存在する際には、その「ヒトＴＮＦ−αに対するＲＮＡアプタマー分子」を構成する一本鎖核酸分子の塩基配列を特定することを試みた。

一般に、対象分子に対する「ＲＮＡアプタマー分子」の探索には、「ランダム一本鎖核酸分子ライブラリー」を作製し、対象分子に対する結合能に関して、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングが利用される。

ヒトＴＮＦ−αは、１５７アミノ酸残基からなるタンパク質であり、そのホモ３量体と複合体を形成可能な「ＲＮＡアプタマー分子」は、５’末端の固定領域と、３’末端の固定領域との間に、ランダムな塩基配列を有する、５１塩基長の部分（Ｎ₅₁）が挿入されている形態の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」中に存在していると予測した。

本発明者らは、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングに利用する、５’末端の固定領域と、３’末端の固定領域との間に、ランダムな塩基配列を有する、５１塩基長の部分（Ｎ₅₁）が挿入されている形態の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」として、
５’末端の固定領域：GGAAGACCAG CCUUAAGAGGG；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGUAUCCG GAACGUGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
を具える、全長９０塩基長の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を選択した。

対象タンパク質として、市販のRecombinant Human TNF-α(PeproTech #300-01A)を利用して、該タンパク質に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を探索した。

ＳＥＬＥＸ・スクリーニング・ラウンドを延べ１０ラウンド繰り返し、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の選別を行った。

各ラウンドでは、バインディング・バッファ溶液として、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl₂ + 5 mM KClを用いて、該タンパク質・ＲＮＡ分子の複合体形成を行っている。タンパク質ならびに形成された複合体の回収は、ニトロセルロースフィルターを用いたＦｉｌｔｅｒ分離法を利用した。ニトロセルロースフィルター上に回収されているタンパク質・ＲＮＡ分子の複合体から、一本鎖ＲＮＡ分子を、次の溶出条件で溶出させる。該ニトロセルロースフィルターを組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 7M Ureaの溶出バッファ溶液中に浸漬し、９０℃で５分間加熱し、一本鎖ＲＮＡ分子の“unfolding”処理を施す。該“unfolding”処理によって、一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造、ならびに三次構造は解消される結果、該一本鎖ＲＮＡ分子は、変性剤の尿素の高濃度溶液中に溶出される。

前記１０ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群から、逆転写によって調製されるｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入して、クローン化を行った。取得した各クローンについて、前記ｃＤＮＡの塩基配列を特定した。各クローンについて、導入されているｃＤＮＡを鋳型として「ＲＮＡアプタマー分子」を調製し、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能の評価を行った。少なくとも、前記バインディング・バッファ溶液中における解離定数Ｋ_Dが、Ｋ_D≦１０ｎＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」を選択した。さらに、前記の選択条件を満足する「ＲＮＡアプタマー分子」について、その塩基配列を解析した。

その結果、Ｋ_D≦１０ｎＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」として、選別された一群の「ＲＮＡアプタマー分子」中には、Ｋ_D≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」も存在することが判明した。

前記１０ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群から、作製した一群のクローンにおいて、その「ランダムな塩基配列」部分が一致しているクローン数が２以上存在する、クローン・ファミリーを選別した。選別されたクローン・ファミリー中には、Ｋ_D≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」から作製されたクローンのファミリーも含まれている。このＫ_D≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」から作製されたクローンのファミリーの一つは、下記の塩基配列を有しており、そのｃＤＮＡを保持するクローンに、識別のための名称をTNF-130と付した。

Clone：TNF-130中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TCCCATATGGATCCCTTTTCACCGGTACCAATAGCAAATACCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号：１３）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-130：
5’−GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC−3’ （配列番号：１）
さらに、前記１０ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群に対して、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能に関して、追加の２ラウンドのスクリーニングを行った。その際、ＲＮＡ鎖を構成する各リボ核酸の２'−位のヒドロキシル基（−ＯＨ）をフッ素原子（−Ｆ）で置き換える修飾が施されている、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型のアプタマー分子を作製した。追加の２ラウンドでは、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型のアプタマー分子の一群をスクリーニングの対象としている。この追加の２ラウンドを含め、合計１２ラウンドの選別を行った、Recombinant Human TNF-αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の群を回収した。

前記合計１２ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群についても、逆転写によって調製されるｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入して、クローン化を行った。取得した各クローンについて、前記ｃＤＮＡの塩基配列を特定した。各クローンについて、導入されているｃＤＮＡを鋳型として「ＲＮＡアプタマー分子」を調製し、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能の評価を行った。

その結果、前記合計１２ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群から、作製した一群のクローンにおいても、その「ランダムな塩基配列」部分が一致しているクローン数が２以上存在する、クローン・ファミリーを選別した。選別されたクローン・ファミリー中には、Ｋ_D≦１０ｎＭと見積もられる、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型「ＲＮＡアプタマー分子」の鋳型のｃＤＮＡを保持するクローンのファミリーも含まれている。このＫ_D≦１０ｎＭと見積もられる、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型「ＲＮＡアプタマー分子」の鋳型のｃＤＮＡを保持するクローンのファミリーは、下記の塩基配列を有しており、そのｃＤＮＡを保持するクローンに、それぞれ、識別のための名称を、TNF-458、TNF-505、TNF-508、TNF-510と付した。

Clone：TNF-458中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TGAGATATCGCTCCATTTTCAAATTTATCTATACAAACACTTTGATTCG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１４）
TNF-485 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
Clone：TNF-505中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TACAATATCTATCACCTTTTACTGGCTACGAGGAGCAAGTACCCAGACATG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１５）
「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-505 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
Clone：TNF-508中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
CTCCATATGGATCTCTGTTCCCCGCACCTGAGAGCCAATACCTTGACATC
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１６）
「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-508 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
Clone：TNF-510中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TCACATATGGATCCCTTTTCAACGGTACCAATAGCTTGCAGTTAAATACA
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１７）
「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-510 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
なお、前記の各クローンのファミリーを鋳型として作製される「ＲＮＡアプタマー分子」も、合計１０ラウンドの選別を経ており、前記２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型「ＲＮＡアプタマー分子」と同様に、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有すると、判断される。

「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-458：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:２）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-505：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:３）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-508：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:４）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-510：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:５）
前記合計１２ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群について、逆転写によって調製されるｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入して、クローン化を行った際、TNF-130と、上記のTNF-458、TNF-505、TNF-508、TNF-510は、いずれも、複数個のクローンを与えている。換言すると、前記合計１２ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群中に、相当の比率で、これらの「ＲＮＡアプタマー分子」が含まれていることを示している。

本発明者らは、Ｋ_D≦１０ｎＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」である、TNF-130において、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成に関与する立体構造上の特徴を推定するため、先ず、その二次構造の推定を行った。図２に示す、TNF-130の推定された二次構造において、中心部に、内部ループ様の構造が構成されている点に着目した。TNF-130の「ランダム配列」領域において、この内部ループ様の構造の構成に関与している部分として、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の二つの領域に着目した。

一方、本発明者らは、選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群中に、相当の比率で含有されている「ＲＮＡアプタマー分子」は、そのRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能は、一定水準を超えたものであると判断した。本発明者らは、選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群について、そのｃＤＮＡの群を調製し、その塩基配列解析の結果に基づき、相当の比率で含有されている「ＲＮＡアプタマー分子」の有無を調べた。前記ｃＤＮＡの群を対象とする、塩基配列解析は、Genome sequencer FLX systemを応用した、高速シークエンス解析を利用している。

その結果、実際に、上記の選別条件を満たす「クローン・ファミリー」を構成していたTNF-130は、解析されたｃＤＮＡの群中に、「28／3153」程度の頻度で含有されていることが確認された。

前記合計１２ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群中に、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えている「ＲＮＡアプタマー分子」が、他にも含まれているか、否かを調査した。その結果、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を具え、解析されたｃＤＮＡの群中に、「32／3153」の頻度で含有されている「ｃＤＮＡ」として、下記の「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100のｃＤＮＡが見出された。この「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100のｃＤＮＡを、大腸菌に導入して、クローン化を行った。

Clone：TNF-100中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
ATAAGTTCGGATCACCGGCCCAAAGCCTAGACCTAGGGGCTATAAATAC
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:２１）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-100：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:９）
「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100は、上記バインディング・バッファ溶液中における解離定数Ｋ_Dが、Ｋ_D≦１０ｎＭの条件は満たしていないが、その解離定数Ｋ_Dが、Ｋ_D≦２０ｎＭの範囲である。

二種の「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100について、その推定される二次構造を比較すると、図３に示すように、中心部に、内部ループ様の構造が構成されているという共通性が見出された。この内部ループ様の構造の構成に関与する部分塩基配列を対比したところ、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と、TNF-100中の「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」との間で、明確な類似性が見出された。

前記合計１２ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群中に、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えている「ＲＮＡアプタマー分子」が、他にも含まれていた。

また、先の高速シークエンス解析を行ったｃＤＮＡの群中に、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えているものが、TNF-100のｃＤＮＡ以外にも、下記の三種：TNF-673,TNF-674,TNF-675が見出された。解析されたｃＤＮＡの群中に、それぞれ、TNF-673は、「4/3153」の頻度で、TNF-674は、「2/3153」の頻度で、TNF-675は、「1/3153」の頻度で含まれていた。この三種のｃＤＮＡも、大腸菌に導入して、クローン化を行った。

Clone：TNF-673中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
CCGACATCCGGTCTTCTTCACCGGTAGAGTATATATAACCGCCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１８）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-673：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CCGACAUCCGGTCTTCUUCACCGGUAGAGUAUAUAUAACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:６）
Clone：TNF-674中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
CGTTAAATCCTAAGCGGATGGCCCCTTCACCGATCATAGGATCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１９）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-674：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:７）
Clone：TNF-675中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TCGAAATATTACCCTTTTCACCGGCGAAAGTCGCATGACCGCCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:２０）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-675：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:８）
本発明者らは、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100の推定される二次構造において、共通して見出される、中心部に形成される、内部ループ様の構造が、実際に、Recombinant Human TNF-αとの複合体形成に関与することの検証を行った。すなわち、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100に基づき、その中心部に形成される、内部ループ様の構造の構成が可能な部分塩基配列からなる、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013を設計し、該TNF-m013のRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を測定した。図４に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013の推定される二次構造を、TNF-100の推定される二次構造と対比して示す。

実際には、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013の３’末端にPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)₂₄を作製した。ビオチン化PolydUを、SAセンサ・チップ上に固定化されているStreptavidinタンパク質との結合を介してチップ上に固定化し、このビオチン化PolydUに、作製されたTNF-m013+(A)₂₄のPolyA鎖をハイブリダイズさせ、固定化する。この固定化されたTNF-m013+(A)₂₄と、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成・解離過程における、平衡解離定数Ｋ_Dの測定を行った。また、TNF-100の３’末端に、ビオチン化PolydU鎖とハイブリダイズ可能なPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型ＲＮＡ分子：TNF-100+(A)₂₄を作製した。ビオチン化PolydUを、SAセンサ・チップ上に固定化されているStreptavidinタンパク質との結合を介してチップ上に固定化し、このビオチン化PolydUに、作製されたTNF-100+(A)₂₄をのPolyA鎖をハイブリダイズさせ、固定化する。この固定化されたTNF-100+(A)₂₄と、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成・解離過程における、平衡解離定数Ｋ_Dの測定を行った。

その結果、TNF-m013+(A)₂₄と、TNF-100+(A)₂₄で測定された、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成・解離過程における、結合速度定数ｋ_a、解離速度定数ｋ_d、平衡解離定数Ｋ_D＝ｋ_d/ｋ_aは、ほぼ等しい値であることが確認される。従って、TNF-m013と、TNF-100は、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成に関与する立体構造は、本質的に同じであると判断される。すなわち、TNF-m013と、TNF-100は、図４に示す推定二次構造、特には、その中心部に形成される、内部ループ様の構造を形成することで、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成を可能としていると、判断される。また、図３に示す推定二次構造を考慮すると、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100においては、共通して見出される、中心部に形成される、内部ループ様の構造を構成することで、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成を可能としていると、推断された。

本発明者らは、以上に述べた一連の検討の結果に基づき、本発明を完成するに至った。

本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーは、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のI-1〜I-5の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
(I-1) TNF-130
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：１）
(I-2) TNF-485
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
ことを特徴とするアプタマーである。

さらには、本発明の第一の形態は、ＲＮＡ鎖を構成する各リボ核酸の２’−位のヒドロキシル基（−ＯＨ）をフッ素原子（−Ｆ）で置き換える修飾が施されている、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型のアプタマーをも包含している。

本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型のアプタマーは、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、各リボ核酸の２’−位のヒドロキシル基（−ＯＨ）をフッ素原子（−Ｆ）で置き換える修飾が施されている、下記のI-2〜I-5の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖修飾ＲＮＡ分子である
(I-2) TNF-485 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
ことを特徴とするアプタマーである。

本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーの一例は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のII-2〜II-4の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
(II-2) TNF-674
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：７）
(II-3) TNF-675
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：８）
(II-4) TNF-100
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
ことを特徴とするアプタマーである。

また、本発明の第二の形態は、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子に対して、その３’末端にPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型のアプタマーをも包含している。すなわち、付加されている３’末端PolyA鎖と、固相表面に固定化されている、PolydU鎖との間でハイブリッド体を形成した状態で、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子も包含している。

本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、３’末端PolyA鎖付加型のアプタマーの一例は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、3’−末端にPolyA配列が付加された、下記のII-4’の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
(II-4’) TNF-100+(A)₂₄
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC
AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3’ （配列番号：１１）
ことを特徴とするアプタマーである。

本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーの一例は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のIIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
(III) TNF-m013
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3’ （配列番号：１０）
ことを特徴とするアプタマーである。

また、本発明の第三の形態は、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子に対して、その３’末端にPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型のアプタマーをも包含している。すなわち、付加されている３’末端PolyA鎖と、固相表面に固定化されている、PolydU鎖との間でハイブリッド体を形成した状態で、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子も包含している。

本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、３’末端PolyA鎖付加型のアプタマーの一例は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、3’−末端にPolyA配列が付加された、下記のIII’の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
(III’) TNF-m013+(A)₂₄
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC
AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3’ （配列番号：１２）
ことを特徴とするアプタマーである。

加えて、本発明は、上記の本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用する方法の発明を提供している。

本発明にかかる、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用する方法の発明の一例は、下記のヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法である。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第一の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法であって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを具えており、
前記モノクローナル抗体を利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：１）
(I-2) TNF-485
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：７）
(II-3) TNF-675
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：８）
(II-4) TNF-100
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3’ （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する
ことを特徴とするアプタマーの使用方法である。

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第二の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法であって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを具えており、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記モノクローナル抗体を反応させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αと反応し、抗原抗体複合体を形成した、前記モノクローナル抗体を検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する
ことを特徴とするアプタマーの使用方法である。

その際、例えば、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該アプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第三の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法であって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αの固定化に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第一のＲＮＡアプタマーと、
固定化されたヒトＴＮＦ−αの検出に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第二のＲＮＡアプタマーを具えており、
前記第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記第二のＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、前記第二のＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する
ことを特徴とするアプタマーの使用方法である。

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第二のＲＮＡアプタマーは、
該第二のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第四の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法であって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αの固定化に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第一のＲＮＡアプタマーと、
固定化されたヒトＴＮＦ−αの検出に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第二のＲＮＡアプタマーを具えており、
前記第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記第二のＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、前記第一のＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する
ことを特徴とするアプタマーの使用方法である。

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第一のＲＮＡアプタマーは、
該第一のアプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該第一のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。

また、本発明にかかる、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用する方法の発明の他の一例は、上記の本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットの発明である。

本発明にかかる、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットの発明の一例として、下記のヒトＴＮＦ−αの検出用キットを例示することができる。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第一の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットであって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを具えており、
前記モノクローナル抗体を利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：１）
(I-2) TNF-485
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：７）
(II-3) TNF-675
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：８）
(II-4) TNF-100
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3’ （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーである
ことを特徴とする検出用キットである。

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第二の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットであって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを具えており、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記モノクローナル抗体を反応させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αと反応し、抗原抗体複合体を形成した、前記モノクローナル抗体を検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーである
ことを特徴とする検出用キットである。

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該アプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第三の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットであって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αの固定化に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第一のＲＮＡアプタマーと、
固定化されたヒトＴＮＦ−αの検出に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第二のＲＮＡアプタマーを具えており、
前記第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記第二のＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、前記第二のＲＮＡアプタマーは、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーである
ことを特徴とする検出用キットである。

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第二のＲＮＡアプタマーは、
該第二のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第四の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットであって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αの固定化に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第一のＲＮＡアプタマーと、
固定化されたヒトＴＮＦ−αの検出に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第二のＲＮＡアプタマーを具えており、
前記第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記第二のＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、前記第一のＲＮＡアプタマーは、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーである
ことを特徴とする検出用キットである。

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第一のＲＮＡアプタマーは、
該第一のアプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該第一のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。

本発明者らは、図２に示す、TNF-130の推定された二次構造において、中心部に、内部ループ様の構造が構成されている点に着目した。TNF-130の「ランダム配列」領域において、この内部ループ様の構造の構成に関与している部分として、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の二つの領域に着目した。

さらに、本発明者らは、上述の二種の「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100について、その推定される二次構造を比較すると、図３に示すように、中心部に、内部ループ様の構造が構成されているという共通性が見出されることに着目した。この内部ループ様の構造の構成に関与する部分塩基配列を対比したところ、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と、TNF-100中の「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」との間で、明確な類似性が見出されることに着目した。

本発明者らは、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングに利用する、
５’末端の固定領域：GGAAGACCAG CCUUAAGAGGG；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGUAUCCG GAACGUGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
を具える、全長９０塩基長の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」中から、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製し、この第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーに対して、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、スクリーニングを行うことで、より効率的に、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされることに想到した。

すなわち、上記の第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’を利用することで、予めスクリーニング対象の絞り込みを行うことで、より効率的なスクリーニングを行うことが可能となることに想到した。

あるいは、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製し、この第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーに対して、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、スクリーニングを行うことで、より効率的に、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされることに想到した。

すなわち、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の形態は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法であって、
該選別方法は、下記の工程１と工程２とを具えており、
（工程１）
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
（工程２）
前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
該選別方法によって、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる
ことを特徴とするアプタマーの選別方法である。

その際、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。

また、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第二の形態は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法であって、
該選別方法は、下記の工程１と工程２とを具えており、
（工程１）
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
（工程２）
前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
該選別方法によって、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる
ことを特徴とするアプタマーの選別方法である。

その際、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。

また、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。

加えて、本発明は、上述する「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」において利用される、「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の発明を提供している。

すなわち、本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第一の形態は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別に利用される、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーであって、
該部分ライブラリーは、
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである
ことを特徴とする候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーである。

その際、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである形態を選択することができる。

本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第二の形態は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別に利用される、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーであって、
該部分ライブラリーは、
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである
ことを特徴とする候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーである。

その際、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである形態を選択することができる。

さらに、本発明者らは、上述の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」を適用することで、下記の「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」を選別することは可能であることに想到した。

すなわち、本発明は、その塩基配列中に含まれる、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成され、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの発明をも提供する。また、本発明は、その塩基配列中に含まれる、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成され、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの発明をも提供する。

すなわち、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第一の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記５１塩基長の配列部分中に、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。

その際、
前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第一の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記５１塩基長の配列部分中に、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。

その際、
前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

さらには、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第二の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記中間領域の配列部分中に、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。

その際、
前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第二の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記中間領域の配列部分中に、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。

その際、
前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

さらに、本発明者らは、後述する、図４に示すRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−ｍ０１３と「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１００の推定される二次構造の対比結果に着目した。具体的には、その塩基配列中に含まれる、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成されると、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を発揮できることに想到した。また、その塩基配列中に含まれる、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成されると、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を発揮できることに想到した。

すなわち、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第三の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでなる塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。

その際、
前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第三の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでなる塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。

その際、
前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、循環血液中に含まれる、ヒトＴＮＦ−αのホモ３量体と特異的な複合体形成が可能である。従って、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、ホモ３量体型のヒトＴＮＦ−αが関与する各種の疾患の診断を進める際、該疾患の病態の指標となる、ヒトＴＮＦ−αのホモ３量体の循環血液中の濃度について、特異的な複合体形成を利用して、高い感度で定量する目的に応用可能である。

図１は、本発明の第一の実施態様にかかる、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１３０に関して、Recombinant Human TNF-αとの複合体形成過程の速度定数ｋａ、該複合体の解離過程の速度定数ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図２は、本発明の第一の実施態様にかかる、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１３０に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。 図３は、本発明の第二の実施態様にかかる、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１００の推定される二次構造と、図２に示す「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１３０の推定される二次構造を対比して示す図である。 図４は、本発明の第三の実施態様にかかる、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−ｍ０１３の推定される二次構造と、図３に示す「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１００の推定される二次構造を対比して示す図である。 図５は、本発明の第三の実施態様にかかる、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−ｍ０１３に関して、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程の速度定数ｋａ、該複合体の解離過程の速度定数ｋｄ、ならびに、解離定数Ｋ_D＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。

本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」に関して、より詳細に説明する。

（第一の形態）
本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーは、水溶液中において、ホモ３量体を構成していると報告されている、Recombinant Human TNF-αを利用して、該Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子として、選別されたものである。

具体的には、下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長の「ランダム配列部分（Ｎ₅₁）」を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成される「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）」から、ＳＥＬＥＸ法を適用して、前記Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子として、選択されたものである。

５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
ＳＥＬＥＸ法を適用した、前記Recombinant Human TNF-αのホモ３量体との複合体形成能に基づく、スクリーニング工程では、該Recombinant Human TNF-αのホモ３量体との複合体形成、ならびに、形成された複合体の解離は、下記の条件を採用している。

（ｉ） 「初回ラウンド」用の「ＲＮＡプール」の調製
上記の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）」を構成する一本鎖ＲＮＡ分子は、下記の「ランダム二本鎖ＤＮＡ分子ライブライー」を構成する、二本鎖ＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。

「ランダム二本鎖ＤＮＡ分子ライブライー」を構成する、各二本鎖ＤＮＡ分子は、下記の「Ｔ７プロモーター領域」、５’末端の固定領域、３０塩基長のランダム配列部分、３’末端の固定領域からなる塩基配列Ｒ_candidate0を有している。

５’末端の「Ｔ７プロモーター領域」：GATAATACGACTCACTATA；（１９塩基） （配列番号：２６）
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２４）
Ｎ₅₁ランダム配列部分：NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN N；
３’末端の固定領域：CTAGT ATCCG GAACG TGAC；（１９塩基） （配列番号：２５）
そのＮ₅₁ランダム配列部分は、ＧＣの含有比率は、５０％に選択されている。

（ii） Recombinant Human TNF-αのホモ３量体との複合体形成条件
フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、下記の組成のバインディング・バッファ溶液中において、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に一本鎖ＲＮＡ分子を作用させ、該Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と一本鎖ＲＮＡ分子との複合体を形成させる。この複合体形成反応で使用されるバインディング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl₂ + 5 mM KClである。また、液温度は、通常、２５℃（室温）に選択されている。

前記バインディング・バッファ溶液中では、対象タンパク質のRecombinant Human TNF-αは、含有濃度が１０ｎＭ（１７０ｎｇ/ｍｌ）以上である場合、２５℃（室温）では、通常、ホモ３量体を形成した状態で、溶解している。

なお、Recombinant Human TNF-αでも、ホモ３量体とモノマーの間には、解離平衡が存在している。その解離平衡によって、Recombinant Human TNF-αの含有濃度が１ｎＭ（１７ｎｇ/ｍｌ）未満になると、含有濃度の低下とともに、ホモ３量体の解離が進む傾向があるという報告もある。

一方、該バインディング・バッファ溶液中に溶解している、一本鎖ＲＮＡ分子は、作製後、一旦、加熱処理を施し、分子内の二本鎖構造を解消する“denaturing”処理を行い、その後、冷却して、三次構造を形成させる、“folding”処理を施す。すなわち、各一本鎖ＲＮＡ分子は、その塩基配列に従って、内在する「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造を含む、二次構造の形成、ならびに、全体として、三次構造の形成がなされた状態とする。通常、“folding”処理を施すことにより、一本鎖ＲＮＡ分子の鎖間における、「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造は解消され、各一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、鎖内で形成される二本鎖構造のみを内在する、三次構造を有するものとなっている。

なお、“folding”処理中、三次構造を形成する過程において、一本鎖ＲＮＡ分子は、場合によっては、該バインディング・バッファ溶液中に存在する二価の金属カチオン種：Ｍｇ²⁺に対して、「ヌクレオチド錯体」型の配位結合を形成することもある。すなわち、“folding”処理で形成される一本鎖ＲＮＡ分子の三次構造中に、二価の金属カチオン種：Ｍｇ²⁺に対して、「ヌクレオチド錯体」型の配位結合が形成されている部位が内在されていることもある。

“folding”処理を施した一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体を含む反応溶液を、所定の時間Incubation処理することで、複合体形成を行わせる。

複合体形成反応を行った後、該反応溶液中に含まれる、対象タンパク質のRecombinant Human TNF-αのホモ３量体、ならびに、該Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と一本鎖ＲＮＡ分子との複合体は、ニトロセルロースフィルターにより濾別する。濾別後、ニトロセルロースフィルターは、前記バインディング・バッファ溶液所定量で洗浄することにより、該ニトロセルロースフィルターの表面に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子を除去する。

（iii） Recombinant Human TNF-αのホモ３量体との複合体の解離条件
フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、該ニトロセルロースフィルターにより濾別されている、該Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体を形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を回収するため、下記の条件で、該複合体の解離を行う。

該ニトロセルロースフィルター上に濾別されている、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体を形成している一本鎖ＲＮＡ分子が“denaturing”する条件を採用する。具体的には、下記の加熱処理を施すことで、一本鎖ＲＮＡ分子の有する二次構造、ならびに三次構造を解消することで、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と一本鎖ＲＮＡ分子との複合体の解離を行っている。

前記洗浄処理を終えたニトロセルロースフィルターを、組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 7M Ureaの溶出バッファ溶液の所定量中の浸漬し、９０℃で５分間加熱し、一本鎖ＲＮＡ分子の“denaturing”処理を施す。該“denaturing”処理によって、一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造、ならびに三次構造は解消される結果、該一本鎖ＲＮＡ分子は、変性剤の尿素の高濃度溶液中に溶出される。

溶出された、一本鎖ＲＮＡ分子を含有する溶出バッファ溶液は、ニトロセルロースフィルターと固液分離され、回収される。この回収された溶出バッファ溶液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、例えば、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。

（iv） 表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の分離条件
フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを繰り返した後、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」が濃縮されたＲＮＡプールから、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、センサ・チップ上に固定化されている、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を下記の条件で分離する。

使用した表面プラズモン共鳴装置は、BIACORE 3000（Biacore）である。該表面プラズモン共鳴装置用のセンサ・チップ ＣＭ４（Biacore）表面に予め固定化されている、カルボキシルメチル基置換デキストランを利用して、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体を固定化する。

このセンサ・チップ上に固定化された、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」が濃縮されたＲＮＡプールを作用させる。その結果、該ＲＮＡプール中に含まれる、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、固定化されているRecombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体を形成する。該ＲＮＡプール自体は、前記バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を溶解したものであり、前記「ＲＮＡアプタマー分子」と、固定化されているRecombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体形成は、該バインディング・バッファ溶液中において進行する。

複合体形成過程を終えた後、ＲＮＡを含まないバインディング・バッファ溶液をセンサ・チップ上に流し、ＲＮＡプール液を流し出す。このＲＮＡを含まないバインディング・バッファ溶液を用いた洗浄過程の間に、固定化されているRecombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体形成している、前記「ＲＮＡアプタマー分子」の一部も解離するが、大部分の「ＲＮＡアプタマー分子」は、複合体を形成した状態を維持している。

洗浄過程の終了後、下記の組成の溶出液をセンサ・チップ上に流し、固定化されているRecombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体形成している、前記「ＲＮＡアプタマー分子」を溶出させる。この溶出過程で使用されるＥＤＴＡ溶出液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTAである。

該ＥＤＴＡ溶出液は、キレート剤ＥＤＴＡを含んでいるため、固定化されているRecombinant Human TNF-αのホモ３量体と「ＲＮＡアプタマー分子」との複合体中に含まれる、Ｍｇ²⁺カチオンの除去がなされる。Ｍｇ²⁺カチオンの除去に伴って、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体との結合能が低下する一本鎖ＲＮＡ分子は、該ＥＤＴＡ溶出液中に溶出される。すなわち、Ｍｇ²⁺カチオン依存的な複合体形成を行っている、「ＲＮＡアプタマー分子」が選択的に溶出される。一方、Ｍｇ²⁺カチオン非依存的な複合体形成を行っている、「ＲＮＡアプタマー分子」は、ＥＤＴＡ溶出液中に極く僅かに溶出するが、実質的には、該ＥＤＴＡ溶出液中には回収されない。

センサ・チップ上から該ＥＤＴＡ溶出液を回収し、該回収されたＥＤＴＡ溶出液から、含有されている「ＲＮＡアプタマー分子」は、例えば、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。

（v） ニトロセルロースフィルターに対して、非選択的な結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の除去条件
フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、濾別に利用するニトロセルロースフィルターに対する、非選択的な結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮も、不可避的に進行する。

Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の濃縮を行う際、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を回避するため、「Pre-selection操作」を利用する。

該「Pre-selection操作」は、フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドで利用するＲＮＡプール溶液を、ニトロセルロースフィルターに予め作用させる操作である。ニトロセルロースフィルターに作用させると、該ＲＮＡプール溶液中に含まれる、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は、該ニトロセルロースフィルター自体に結合される。その結果、該ニトロセルロースフィルターと固液分離され、回収される、ＲＮＡプール溶液中に残余する、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃度は、大幅に低減されている。

該「Pre-selection操作」を予め施した、ＲＮＡプール溶液を利用して、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを行うと、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は濃縮を受けるが、予め、ＲＮＡプール溶液中の含有濃度を低減している結果、回収される溶出バッファ溶液中に含まれる「一本鎖ＲＮＡ分子」中における、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の比率は、相対的に低い水準となっている。

従って、該「Pre-selection操作」を利用することで、フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを繰り返しても、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を実質的に回避することが可能となる。

（vi） 「２回ラウンド」以降で利用する「ＲＮＡプール」の調製
「２回ラウンド」以降で利用する「ＲＮＡプール」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」より調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。

回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する工程では、下記のForward Primer とReverse Primerを利用して、RT-PCR法を適用する。

Forward Primer：（配列番号：２２）
5'- GATAATACGACTCACTATA GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G -3'
Reverse Primer：（配列番号：２３）
5'- GTCA CGTTC CGGAT ACTAG-3'
前記Reverse Primerは、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の３’末端の固定領域と相補的な塩基配列である。

5'- CUAGU AUCCG GAACG UGAC -3' （配列番号：３０）
3'- GATCA TAGGC CTTGC ACTG -5' （配列番号：２３）
前記Forward Primerは、「Ｔ７プロモーター領域」として利用可能な塩基配列と、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の５’末端の固定領域に相当する部分とで構成されている。

「Ｔ７プロモーター領域」：5'- GATAATACGACTCACTATA -3' （配列番号：２６）
５’末端の固定領域に相当する部分：5'- GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G -3' （配列番号：２４）
その結果、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子の塩基配列は、５’末端にForward Primerに起因する領域、３’末端にReverse Primerに相補的な領域、その間に、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」の５’末端の固定領域の一部：AUUCと「ランダム配列部分」に由来する領域とで構成されている。

Forward Primerに起因する領域：（配列番号：２２）
GATAATACGACTCACTATA GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G
「ランダム配列部分(Ｎ₅₁)」に由来する領域：
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN N
Reverse Primerに相補的な領域：（配列番号：２５）
CTAGT ATCCG GAACG TGAC
調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により調製される「一本鎖ＲＮＡ分子」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」とは、その「ランダム配列部分」の頻度分布は、本質的に同じ分布を示すものとなっている。

調製された「一本鎖ＲＮＡ分子」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応溶液から回収し、上記のバインディング・バッファ溶液中に、所定の濃度で溶解して、次段ラウンドで利用する「ＲＮＡプール」とする。なお、「一本鎖ＲＮＡ分子」に対して、“folding”処理を施す。その結果、一本鎖ＲＮＡ分子の鎖間における、「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造は解消され、各一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、鎖内で形成される二本鎖構造のみを内在する、三次構造を有するものとなっている。

（vii） 表面プラズモン共鳴装置用のセンサ・チップに対して、非選択的な結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の除去条件
表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、センサ・チップ上に固定化されている、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を選別する際、センサ・チップ ＣＭ４の表面に非選択的に結合する一本鎖ＲＮＡ分子も不可避的に分取される。

このセンサ・チップ ＣＭ４の表面に非選択的に結合する一本鎖ＲＮＡ分子の混入比率を低減するため、「Pre-selection操作」を利用する。

該「Pre-selection操作」は、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する選択ラウンドで利用するＲＮＡプール溶液を、センサ・チップ ＣＭ４に予め作用させる操作である。センサ・チップ ＣＭ４に作用させると、該ＲＮＡプール溶液中に含まれる、センサ・チップ ＣＭ４の表面に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は、該センサ・チップ ＣＭ４の表面自体に結合される。その結果、該センサ・チップ ＣＭ４と固液分離され、回収される、ＲＮＡプール溶液中に残余する、センサ・チップ ＣＭ４自体に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃度は、大幅に低減されている。

該「Pre-selection操作」を予め施した、ＲＮＡプール溶液を利用して、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する選択ラウンドを行うと、センサ・チップ ＣＭ４に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は濃縮を受けるが、予め、ＲＮＡプール溶液中の含有濃度を低減している結果、回収される溶出バッファ溶液中に含まれる「一本鎖ＲＮＡ分子」中における、センサ・チップ ＣＭ４に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の比率は、相対的に低い水準となっている。

従って、該「Pre-selection操作」を利用することで、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する選択ラウンドを繰り返しても、センサ・チップ ＣＭ４に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を実質的に回避することが可能となる。

（第一の実施態様）
第一の実施態様では、本発明の第一の形態にかかるRecombinant Human TNF-αに対する結合能を有するアプタマーを選別する一連の工程の一例を以下に説明する。

第一の実施態様では、フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ法を適用し、下記の表１に記載する条件を採用して、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有するアプタマーの選別を行っている。

表１に示す選択条件では、フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを１０ラウンド繰り返し、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子の濃縮を行っている。なお、第一の実施態様では、市販されているRecombinant Human TNF-α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，３００−０１Ａ）を使用している。

各ラウンドにおいて、回収された溶出液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、RT-PCR法を応用して、次段のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」の作製に利用される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写用テンプレートとなる、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する。

従って、各ラウンドにおいて、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する工程では、上記のForward Primer とReverse Primerを利用して、RT-PCR法を適用する。

２回目のラウンド以降では、利用するニトロセルロースフィルターを用いる「Pre-selection操作」を実施することで、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を回避している。

ラウンドが進むとともに、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は、徐々に濃縮される傾向がある。従って、３回目のラウンド以降では、「Pre-selection操作」の回数を３回として、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の除去効率を高く設定している。

なお、「Pre-selection操作」を実施する際も、その液温度は、２５℃とし、各回の「ＲＮＡプール」とニトロセルロースフィルターの接触時間は、前記「Incubation Time」と等しい時間を選択している。

各回のラウンドにおける、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と「ＲＮＡプール」を接触させる際、その液温度は、２５℃とし、その時間：「Incubation Time」は、表１に示す。表１に示すように、Recombinant Human TNF-αの濃度は１０ｎＭ以上の範囲に選択されており、Recombinant Human TNF-αは、ホモ３量体として存在している。

４回目のラウンド以降では、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と「ＲＮＡプール」を接触させる際、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対して、選択的な結合能を有していない「tRNA」を、反応溶液中に添加している。該「tRNA」は、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に非選択的に付着する機能を有するので、「ＲＮＡプール」中に含まれる、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に非選択的に付着可能な一本鎖ＲＮＡ分子と競合する。すなわち、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に非選択的に付着可能な一本鎖ＲＮＡ分子の、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面への付着は、添加されている「tRNA」によって、競争的に阻害される。結果的に、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対して、選択的な結合能を示す「一本鎖ＲＮＡ分子」の回収効率が相対的に増す。換言するならば、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に存在する、非選択的な付着が可能な領域を、添加されている「tRNA」を利用して、blockingすることに相当している。

一方、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対して、選択的、かつ、高い結合能を示す「一本鎖ＲＮＡ分子」は、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に存在する、該「一本鎖ＲＮＡ分子」の結合部位に対して、安定な複合体形成するため、添加されている「tRNA」に因って、その複合体形成過程は、実質的な影響を受けない。

各回のラウンドでは、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と「ＲＮＡプール」を接触させ、インキュベーションした後、濾過マニフォールド（ミリポア社）を使用して、１３ｍｍφニトロセルロースフィルターにより、反応溶液中に含まれる、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体、ならびに一本鎖ＲＮＡ分子／Recombinant Human TNF-αのホモ３量体複合体を濾別する。次いで、該ニトロセルロースフィルター上に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子を洗浄除去するため、洗浄工程を設けている。該洗浄工程では、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を利用して、その液温度は、２５℃としている。表１に記載する、液量を用いて、洗浄を行っている。該洗浄工程では、ニトロセルロースフィルター上に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子の脱着に加えて、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子の脱着も進行する。従って、該洗浄工程が終了した時点では、ニトロセルロースフィルター上に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子の大半が除去される。

さらに、４回目のラウンド以降では、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と「ＲＮＡプール」を接触させる際、反応溶液中に含有される、「ＲＮＡプール」のＲＮＡ濃度の総和に対する、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の濃度の比率を段階的に低下させている。４回目のラウンドでは、「ＲＮＡプール」のＲＮＡ濃度の総和：Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の濃度の比率は、１：０．６２であるが、１０回目のラウンドでは、１：０２０まで低下させている。その結果、ラウンドを重ねる毎に、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と選択的に複合体形成して、フィルターにより濾別される、「一本鎖ＲＮＡ分子」中において、その複合体の解離定数Ｋ_Dがより小さな値を示すものの比率が増す。すなわち、複合体の解離定数Ｋ_Dがより小さな値を示すものがより効率的に濃縮される。

１０回目のラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、同様に、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する。

調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を溶解する液の一部を使用して、含有される二本鎖ｃＤＮＡ分子を、市販のＴＡクローニング・キット（プロメガ株式会社）を利用して、クローニングする。具体的には、当該キットに添付される標準プロトコルに従って、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物（二本鎖ＤＮＡ分子）群を、クローニングベクター；ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ へ、ライゲーションする。このライゲーション後、クローニングベクターにより、大腸菌株Ｍａｃｈ１（インビトロジェン）を形質転換させる。

次いで、前記クローニングベクター由来の選択マーカーを利用し、定法に従って、クローニングベクターを保持する形質転換株をコロニー選別する。コロニー選別された、多数の形質転換株中から、３４株を無作為に選択し、当該クローン株が保持する、ｃＤＮＡ分子の塩基配列を解析した。その結果、前記３４株のクローン中、同じｃＤＮＡを保持するクローンが複数存在する、クローン・ファミリーが含まれることが確認された。

具体的には、下記の表２に示す、一本鎖ＲＮＡ分子をコードする部分の塩基配列を有するｃＤＮＡを保持するクローン：TNF-130は、前記３４株のクローン中、３クローン存在している。

該クローン：TNF-130が保持するｃＤＮＡがコードしている、一本鎖ＲＮＡ分子について、実際に、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有することを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。

具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ：Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＡチップ上のStreptavidinタンパク質による結合を介して、ｂｉｏｔｉｎ修飾したポリｄＵを１０００ＲＵ固定化する。３’末端にポリＡが付加されている、一本鎖ＲＮＡ分子を、該ポリＡ部分をチップ上に固定化されているポリｄＵとハイブリダイズさせ、２０００ＲＵ固定化する。

バインディング・バッファ溶液中にRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を、３７．５ｎＭ、１８．８ｎＭ、２５．０ｎＭ、１２．５ｎＭ含有している、４種類のRecombinant Human TNF-α溶液を調製する。センサ・チップ上に、このRecombinant Human TNF-α溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、固定化されている一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上にRecombinant Human TNF-α溶液を流通させる時間は、２ｍｉｎとしている。

次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで、３ｍｉｎ流し、センサ・チップ上のRecombinant Human TNF-α溶液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl₂ + 5 mM KCl + 0.005% Tween20である。

図１に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130について、センサ・チップ上に固定化されている３’末端ポリＡ鎖付加型の一本鎖ＲＮＡ分子とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した結果の一例を示す。液温度２５℃における、該一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130に対する測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl₂ + 5 mM KClの条件において、固定化された一本鎖ＲＮＡ分子とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aを算出した。算出された値は、ｋ_a＝1.01×１０⁵ (Ｍ^-1ｓ^-1)、ｋ_d＝2.75×１０^-7 (ｓ^-1)、Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_a=2.74（ｐＭ）であった。

なお、チップ上にRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を固定した状態において、測定される複合体形成の速度定数：ｋ_a、複合体の解離の速度定数：ｋ_dから算出される解離定数Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aも、Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_a=2.74（ｐＭ）であった。

一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130は、下記表３に示す塩基配列を有しており、その推定される二次構造を、図２に示す。なお、この一本鎖ＲＮＡ分子における、二次構造の推定には、特開２００８−２８３９４３号公報に開示される手法を適用し、二次構造推定プログラム：ＶＡＬＦＯＬＤを利用した。

一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130の推定される二次構造では、その中心部に、ループ様の構造が構成されている。

固定化された一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl)で洗浄した後、センサ・チップ上に、組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTAのＥＤＴＡ溶出液を注入し、２ｍｉｎ保持すると、完全に解離される。すなわち、形成された複合体は、Ｍｇ²⁺カチオンを含有しており、キレート剤ＥＤＴＡを作用させ、Ｍｇ²⁺カチオンを除去すると、該複合体は速やかに解離している。従って、固定化された一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）は、Ｍｇ²⁺カチオン依存性の複合体を形成していると、判断される。

前記１０回目のラウンドで分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子の一群に対して、さらに、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを２回追加している。具体的には、この追加の選択ラウンドでは、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ ＣＭ４の表面上に、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を固定化し、該固定化されたRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）と複合体を形成する一本鎖ＲＮＡ分子を選別している。

この追加の選択ラウンドは、表４に示す条件を使用している。

上述するように、１０回目のラウンドにおいて分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製している。調製される二本鎖ｃＤＮＡ分子をテンプレートとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写を行い、１１回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液を作製する。

１１回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液は、バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を１μＭ含有している。１１回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液に対して、下記の「Pre-selection」処理を３回施す。「Pre-selection」処理では、センサ・チップ ＣＭ４自体を利用して、該「ＲＮＡプール」液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、前記センサ・チップ ＣＭ４の表面に、非選択的に結合する一本鎖ＲＮＡ分子を結合させる。「Pre-selection」処理において、流出する液中では、センサ・チップ ＣＭ４の表面に対して、非選択的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子の濃度が低減されている。該「Pre-selection」処理を３回繰り返すことで、最終的に得られる「ＲＮＡプール」液中には、センサ・チップ ＣＭ４の表面に対して、非選択的で高い結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子が実質的に含有していない状態となる。

１１回目の選択ラウンドでは、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）が固定化されているセンサ・チップ ＣＭ４上に、該「ＲＮＡプール」液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、固定化されているRecombinant Human TNF-αと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡプール」液を流通させる時間は、５ｍｉｎとしている。

洗浄過程では、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで、５ｍｉｎ流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡプール」液を除去する。該洗浄過程において、その液温度は、２５℃としている。

洗浄過程の終了後、下記の組成のＥＤＴＡ溶出液をセンサ・チップ上に満たし、インキュベーションすることで、固定化されているRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）と複合体形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を溶出させる。この溶出過程で使用されるＥＤＴＡ溶出液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTAである。

該溶出過程では、該溶出液２μＬを、センサ・チップ上に満たし、５ｍｉｎインキュベーションする間に、Ｍｇ²⁺カチオンをＥＤＴＡ錯体として除去する。その結果、Ｍｇ²⁺カチオン依存的にRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）と複合体形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択的に解離させている。すなわち、該ＥＤＴＡ溶出液中には、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対して、Ｍｇ²⁺カチオン依存的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子が回収されている。

１１回目の選択ラウンドにおいて分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製している。調製される二本鎖ｃＤＮＡ分子をテンプレートとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写を行い、１２回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液を作製する。

１２回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液は、バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を５μＭ含有している。１２回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液に対しても、上記条件で「Pre-selection」処理を３回施す。

１２回目の選択ラウンドにおける操作は、前記１１回目の選択ラウンドにおける操作と同じである。

１２回目の選択ラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、同様に、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する。

調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を溶解する液の一部を使用して、含有される二本鎖ｃＤＮＡ分子を、市販のＴＡクローニング・キット（プロメガ株式会社）を利用して、クローニングする。当該キットに添付される標準プロトコルに従って、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物（二本鎖ＤＮＡ分子）群を、クローニングベクター；ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ へ、ライゲーションする。このライゲーション後、クローニングベクターにより、大腸菌株Ｍａｃｈ１（インビトロジェン）を形質転換させる。

次いで、前記クローニングベクター由来の選択マーカーを利用し、定法に従って、クローニングベクターを保持する形質転換株をコロニー選別する。コロニー選別された、多数の形質転換株中から、４２株を無作為に選択し、当該クローン株が保持する、ｃＤＮＡ分子の塩基配列を解析した。その結果、前記４２株のクローン中、同じｃＤＮＡを保持するクローンが複数存在する、クローン・ファミリーが含まれることが確認された。

具体的には、下記の表５に示す、一本鎖ＲＮＡ分子をコードする部分の塩基配列を有するｃＤＮＡを保持するクローン：TNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510は、前記４２株のクローン中、２クローン以上存在している。

該クローン：TNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510が保持するｃＤＮＡがコードしている、一本鎖ＲＮＡ分子について、実際に、Recombinant Human TNF-αに対する結合能を有することを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。この検証では、評価する一本鎖ＲＮＡ分子として、ＲＮＡ鎖を構成する各リボ核酸の２’−位のヒドロキシル基（−ＯＨ）をフッ素原子（−Ｆ）で置き換える修飾が施されている、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子を使用している。

具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ：Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ４上に、Recombinant Human TNF-αを、１０，０００ＲＵ固定化する。なお、固定化されているRecombinant Human TNF-αは、ホモ３量体の形状を保持していると推断される。

バインディング・バッファ溶液中に、該２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子を所定の濃度で含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡ試料」液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、固定化されているRecombinant Human TNF-αと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡ試料」液を流通させる時間は、２ｍｉｎとしている。

次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで、９ｍｉｎ流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡ試料」液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl₂ + 5 mM KCl + 0.005% Tween20である。

液温度２５℃における、該センサ・チップ上に固定化されているRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定する。測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl₂ + 5 mM KClの条件において、固定化されたRecombinant Human TNF-αと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋ_a、複合体の解離の速度定数：ｋ_dを決定し、解離定数Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aを算出した。

TNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510に由来する２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子について、算出された解離定数Ｋ_Dを、表６に示す。

また、TNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510に由来する２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子について、決定された複合体形成の速度定数：ｋ_a、複合体の解離の速度定数：ｋ_dを、表７に示す。

これらTNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510に由来する２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子も、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130と同様に、Ｍｇ²⁺カチオン依存的なRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体を形成している。

TNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510に由来する２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）の複合体の解離の速度定数ｋ_dは、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）の複合体の解離の速度定数ｋ_dと比較すると、約１０⁴倍となっている。すなわち、形成された複合体の安定性に、顕著な差異があると判断される。

（第二の形態）
本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーは、Recombinant Human TNF-α（ホモ三量体）と複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子の一群中から、上記「ＲＮＡアプタマー」TNF-130に特徴的は塩基配列、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」のモチーフと類似する塩基配列を具えるものとして、選別されたものである。

具体的には、上記のＳＥＬＥＸ法を適用して、選択されたRecombinant Human TNF-α（ホモ三量体）と複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子の一群中において、上記「ＲＮＡアプタマー」TNF-130において、複合体形成に関与すると推定される構造的特徴と、類似する構造を示す可能性が高い一本鎖ＲＮＡ分子を、前記の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」のモチーフと類似する塩基配列の有無の判定によって、選別したものである。

（第二の実施態様）
第二の実施態様では、本発明の第二の形態にかかるRecombinant Human TNF-α（ホモ三量体）に対する結合能を有するアプタマーを選別する工程の一例を以下に説明する。

上記の第一の実施態様においは、１２回目の選択ラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、同様に、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製している。

この二本鎖ｃＤＮＡ分子の一群中は、先にクローニングした、４３株のクローン以外に、塩基配列が異なる多数種のｃＤＮＡ分子が含まれている。

本第二の実施態様では、これら塩基配列が異なる多数種のｃＤＮＡ分子に関して、Genome sequencer FLX systemを応用した、高速シークエンス解析を利用して、その塩基配列解析を実施した。解析された３１５３のｃＤＮＡ分子中には、同一の塩基配列を有するｃＤＮＡ分子が複数存在する「ファミリー」が相当数存在していた。

ＳＥＬＥＸ法を適用する「ＲＮＡアプタマー」の選択工程では、選択ラウンドを重ねる毎に、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子の一群中では、解離定数Ｋ_Dの値が小さな一本鎖ＲＮＡ分子の含有比率が上昇する。従って、上記の塩基配列解析がなされた３１５３のｃＤＮＡ分子の一群中に、高い頻度で存在している「クローン・ファミリー」に由来する一本鎖ＲＮＡ分子が示す解離定数Ｋ_Dの値は、相対的に小さな値となっている。

実際、第一の実施態様において、１０回目のラウンドが終了した時点において、Ｋ_D≦１０ｐＭの「クローン・ファミリー」として選別されている、クローン：TNF-130と同じ塩基配列を有するｃＤＮＡ分子は、28/3153の頻度で存在していることが確認された。

図２に示す「ＲＮＡアプタマー」TNF-130の推定二次構造は、その中心部に、ループ様の構造を含むという特徴を示す。そのループ様の構造の構成には、５’末端側の固定領域：5'- GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G -3'の“AG CCU”と“A AGAGG G”の部分が、それぞれＲＮＡ二本鎖を形成する配置を採ることを利用している。換言しますと、TNF-130中のランダム配列部分に存在する、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の部分が、関与している。

TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えている「ＲＮＡアプタマー分子」は、その中心部に、ループ様の構造を含む二次構造を示す可能性が高いと推断される。上記の塩基配列解析がなされた３１５３のｃＤＮＡ分子の一群中に、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えている「ＲＮＡアプタマー分子」が、他にも含まれているか、否かを調査した。その結果、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を具え、解析されたｃＤＮＡの群中に、「32／3153」の頻度で含有されている「ｃＤＮＡ」として、下記の「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100のｃＤＮＡが見出された。この「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100のｃＤＮＡを、大腸菌に導入して、クローン化を行った。

Clone：TNF-100中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
ATAAGTTCGGATCACCGGCCCAAAGCCTAGACCTAGGGGCTATAAATAC
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号：２１）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-100：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100について、推定される二次構造を、「ＲＮＡアプタマー」TNF-130の推定二次構造と対比させて、図３に示す。「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100のランダム配列部分に見出された、「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」は、その推定二次構造中において、その中心部の、ループ様の構造の構成に関与している。

また、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100は、上記バインディング・バッファ溶液中における解離定数Ｋ_Dが、Ｋ_D≦１０ｎＭの条件は満たしていないが、その解離定数Ｋ_Dが、Ｋ_D≦２０ｎＭの範囲であった。

塩基配列解析を行った３１５３のｃＤＮＡの群中に、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えているものが、TNF-100のｃＤＮＡ以外にも、下記の三種：TNF-673,TNF-674,TNF-675が見出された。この三種のｃＤＮＡも、大腸菌に導入して、クローン化を行った。表８に、三種のクローン：TNF-673,TNF-674,TNF-675と、クローン：TNF-100、ならびに、クローン：TNF-130に関して、一本鎖ＲＮＡ分子をコードする塩基配列を対比して示す。表８に、各クローンについて、３１５３のｃＤＮＡの群中における存在頻度（重複度）も記載している。

クローン：TNF-673のランダム配列部分に見出された、「５’−TCTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」は、クローン：TNF-130中の「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と、その相対的な位置も高い類似性を有している。また、クローン：TNF-675のランダム配列部分に見出された、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」は、クローン：TNF-130中の「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と、その相対的な位置も高い類似性を有している。

一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100に関して、そのRecombinant Human TNF-αに対する結合能を有することを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した。

表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップＳＡ上に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100を、約２，０００ＲＵ固定化する。実際には、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100の３’末端にPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型ＲＮＡ分子：TNF-100+(A)₂₄を作製する。該TNF-100+(A)₂₄のPolyA鎖を利用して、センサ・チップＳＡ上に固定化されているStreptavidinタンパク質と結合している、ｂｉｏｔｉｎ修飾したPolydU鎖とハイブリダイズさせることで、固定化する。

バインディング・バッファ溶液中にRecombinant Human TNF-αを、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭの２倍希釈系列で含有している、３種類の「ターゲット・タンパク質」溶液を調製する。センサ・チップ上に、この「ターゲット・タンパク質」溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、固定化されている一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100+(A)₂₄とRecombinant Human TNF-αの複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ターゲット・タンパク質」溶液を流通させる時間は、２ｍｉｎとしている。

次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、Recombinant Human TNF-αを含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで、３ｍｉｎ流し、センサ・チップ上の「ターゲット・タンパク質」溶液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。Recombinant Human TNF-αを含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl₂ + 5 mM KCl + 0.005% Tween20である。

センサ・チップ上に固定化されている、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100+(A)₂₄について、Recombinant Human TNF-αとの複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定する。液温度２５℃における、該一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100+(A)₂₄に対する測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl₂ + 5 mM KClの条件において、固定化された該一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成の速度定数：ｋ_a、複合体の解離の速度定数：ｋ_d、ならびに、解離定数Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aを算出した。

一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100に加えて、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-674、TNF-675、ならびに、TNF-130に関しても、同様にセンサ・チップＳＡ上に固定化した上で、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定する。液温度２５℃における、当該一本鎖ＲＮＡ分子に対する測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl₂ + 5 mM KClの条件において、固定化された当該一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成の速度定数：ｋ_a、複合体の解離の速度定数：ｋ_d、ならびに、解離定数Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aを算出した。

表９に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100、TNF-674、TNF-675、ならびに、TNF-130について、上記の条件における測定結果に基づき、算出した解離定数Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aの値を示す。

また、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100、TNF-674、TNF-675、ならびに、TNF-130について、上記の条件における測定結果に基づき、決定された複合体形成の速度定数：ｋ_a、複合体の解離の速度定数：ｋ_dを、表１０に示す。

これら一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100、TNF-674、TNF-675も、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130と同様に、Ｍｇ²⁺カチオン依存的なRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体を形成している。

一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100、TNF-674、TNF-675とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）の複合体の解離の速度定数ｋ_dは、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）の複合体の解離の速度定数ｋ_dと比較すると、１０²倍以上となっている。すなわち、形成された複合体の安定性に、顕著な差異があると判断される。

（第三の形態）
本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーは、上記の一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130、TNF-100の推定二次構造における、特徴的な構造を保持しつつ、小型化を図るため、第一の形態、第二の形態にかかる「ＲＮＡアプタマー」に基づき、設計された小型化「ＲＮＡアプタマー」である。

具体的には、第一の形態、第二の形態にかかる「ＲＮＡアプタマー」の塩基配列と、推定される二次構造を参照し、上記の一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130、TNF-100の推定二次構造における、特徴的な構造を構成する上で必須でない部分塩基配列を除去し、小型化を図ったものである。前記の設計指針に基づき、例えば、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100を基礎として設計された、小型化「ＲＮＡアプタマー」TNF-m0113は、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100の示す二次構造を保持することで、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能も保持したものとなっている。

（第三の実施態様）
第三の実施態様では、本発明の第三の形態にかかるRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有するアプタマーを作製する工程を以下に説明する。

図３に示す、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130とTNF-100の推定される二次構造において、共通して見出される、中心部に形成される、ループ様の構造が、実際に、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成に関与することの検証を行った。すなわち、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100に基づき、その中心部に形成される、ループ様の構造の構成が可能な部分塩基配列からなる、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013を設計し、該TNF-m013のRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を測定した。図４に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013の推定される二次構造を、TNF-100の推定される二次構造と対比して示す。

実際には、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013の３’末端にPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)₂₄を作製した。作製されたTNF-m013+(A)₂₄のPolyA鎖を利用して、センサ・チップＳＡ上に固定化されているStreptavidinタンパク質と結合している、ｂｉｏｔｉｎ修飾したPolydU鎖とハイブリダイズさせることで、固定化する。

表１１に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013とTNF-m013+(A)₂₄、ならびに、TNF-100とTNF-100+(A)₂₄の塩基配列を対比して示す。

バインディング・バッファ溶液中にRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭの２倍希釈系列で含有している、３種類の「ターゲット・タンパク質」溶液を調製する。センサ・チップ上に、この「ターゲット・タンパク質」溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、固定化されている一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)₂₄とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ターゲット・タンパク質」溶液を流通させる時間は、２ｍｉｎとしている。

次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、Recombinant Human TNF-αを含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで、３ｍｉｎ流し、センサ・チップ上の「ターゲット・タンパク質」溶液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。Recombinant Human TNF-αを含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl₂ + 5 mM KCl + 0.005% Tween20である。

センサ・チップ上に固定化されている、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)₂₄について、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定する。液温度２５℃における、該一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)₂₄に対する測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl₂ + 5 mM KClの条件において、固定化された該一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成の速度定数：ｋ_a、複合体の解離の速度定数：ｋ_d、ならびに、解離定数Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aを算出した。

図５に、センサ・チップ上に固定化されている、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)₂₄について、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した結果を示す。

表１２に、固定化された一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)₂₄ならびに、TNF-100+(A)₂₄について、上記の条件における測定結果に基づき、決定された複合体形成の速度定数：ｋ_a、複合体の解離の速度定数：ｋ_d、ならびに、算出した解離定数Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aの値を対比して示す。

その結果、固定化された一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)₂₄と、TNF-100+(A)₂₄で測定された、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成・解離過程における、結合速度定数ｋ_a、解離速度定数ｋ_d、平衡解離定数Ｋ_D＝ｋ_d/ｋ_aは、ほぼ等しい値であることが確認される。従って、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013と、TNF-100は、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成に関与する立体構造は、本質的に同じであると判断される。すなわち、TNF-m013と、TNF-100は、図４に示す推定二次構造、特には、その中心部に形成される、ループ様の構造を形成することで、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成を可能としていると、判断される。また、図２に示す推定二次構造を考慮すると、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100においては、共通して見出される、中心部に形成される、ループ様の構造を構成することで、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成を可能としていると、推断された。

勿論、第三の形態にかかるRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有するアプタマーの一例である、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013は、その設計の基となっている、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100と全く同じ形態で、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体を形成していることが判る。

本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用する方法に関して、より詳細に説明する。

上記の本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーは、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出に利用することが可能である。

例えば、血液中に含まれる目標タンパク質の検出を行う場合、血液中に含まれる種々の可溶性タンパク質や、脂質分子の影響を排除する必要がある。例えば、目標タンパク質に対する特異的なモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡ法による検出方法では、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法が利用される。すなわち、固相表面に捕獲用モノクローナル抗体を固定化し、目標タンパク質に対する該捕獲用モノクローナル抗体の特異的反応性を利用して、固定化された捕獲用モノクローナル抗体に目標タンパク質を選択的に結合させる。その後、捕獲用モノクローナル抗体に結合されている、目標タンパク質に検出用モノクローナル抗体を反応させる。この目標タンパク質に結合している検出用モノクローナル抗体を検出することで、間接的に目標タンパク質を検出している。

このＳａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法をヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出に適用する場合、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、捕獲用モノクローナル抗体と、検出用モノクローナル抗体を利用する。

前記のＳａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法を適用するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出に利用される、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、捕獲用モノクローナル抗体と、検出用モノクローナル抗体の一方に代えて、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することで、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法に類似するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出を行うことが可能である。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第一の態様は、前記検出用モノクローナル抗体に代えて、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することで、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法に類似するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出用の検出用キットを構成する形態に相当している。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、捕獲用モノクローナル抗体と、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用している、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製する方法に相当している。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第一の態様では、
作製する該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、捕獲用モノクローナル抗体と利用する、ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを組み合わせている。

対応する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第一の態様は、
捕獲用モノクローナル抗体として利用する、ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、検出用「ＲＮＡアプタマー」として利用する、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを組み合わせて、検出用キットを構成している。

該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを利用して、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出する際、
前記モノクローナル抗体を利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを検出する方式を採用する。

検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：１）
(I-2) TNF-485
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：７）
(II-3) TNF-675
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：８）
(II-4) TNF-100
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3’ （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する。

なお、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、その検出に利用可能な標識を付した形態とすることが好ましい。例えば、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。

検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する場合、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と該ＲＮＡアプタマーで形成される複合体の解離定数Ｋ_Dは、少なくとも、Ｋ_D≦１００ｎＭ、通常、Ｋ_D≦１０ｎＭの範囲であることが好ましい。特には、Ｋ_D≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが、より好ましい。

実際の検出操作では、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を結合させた後、結合していない検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を洗浄により、除去する。また、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に結合している検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を検出する際には、通常、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を含まない液中に浸された状態とされる。この洗浄工程、あるいは、検出工程中、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離が進行する。このヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離は、該複合体の解離の速度定数：ｋ_dにより支配される。従って、複合体の解離の速度定数：ｋ_dが、ｋ_d≧１０^-3 ｓ^-1である場合、洗浄工程と検出工程に要する時間が１０００秒間に達すると、形成された複合体の（１−1/e）は、その間に解離することになる。

洗浄工程と検出工程の要する時間に進行する、複合体の解離を無視できる水準（例えば、1/10以下）に留めるためには、複合体の解離の速度定数：ｋ_dが、通常、ｋ_d≦２×１０^-4 ｓ^-1の範囲、より好ましくは、ｋ_d≦１０^-4 ｓ^-1の範囲である、「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが望ましい。

すなわち、複合体の解離定数Ｋ_Dは、Ｋ_D≦１０ｎＭの範囲であり、複合体の解離の速度定数：ｋ_dは、ｋ_d≦１０^-4 ｓ^-1の範囲であるという二つの条件を満足する、「ＲＮＡアプタマー分子」を、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用することが、好ましい。

勿論、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用モノクローナル抗体と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と、選択的に結合する必要がある。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用モノクローナル抗体との結合によって、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対する結合能が阻害を受けないことが必要である。加えて、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用モノクローナル抗体に対して、結合能を示さないことも必要である。

また、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用モノクローナル抗体と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対して、定量的に結合する必要がある。すなわち、捕獲用モノクローナル抗体と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに結合する、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の分子数の比率は、一定であることが望ましい。具体的には、捕獲用モノクローナル抗体と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」が一分子結合する比率であることが望ましい。

その他、固体表面に捕獲用モノクローナル抗体を固定化する際に利用される、抗体の定常領域に結合性を有するタンパク質、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇなどに対して、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、高い結合能を有するものでないことも必要である。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第二の態様は、上記の捕獲用モノクローナル抗体に代えて、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することで、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法に類似するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出用の検出用キットを構成する形態に相当している。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、検出用モノクローナル抗体と、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用している、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製する方法に相当している。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第二の態様では、
作製する該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、検出用モノクローナル抗体として利用する、ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを組み合わせている。

対応する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第二の態様は、
検出用モノクローナル抗体として利用する、ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、捕獲用「ＲＮＡアプタマー」として利用する、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを組み合わせて、検出用キットを構成している。

該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを利用して、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を検出する際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記モノクローナル抗体を反応させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αと反応し、抗原抗体複合体を形成した、前記モノクローナル抗体を検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う方式を採用する。

捕獲用「ＲＮＡアプタマー」として、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する。

その際、捕獲用「ＲＮＡアプタマー」を固体表面に固定化するため、例えば、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該アプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。すなわち、固体表面に、予め、PolydU鎖を固定化しておき、一本鎖核酸の3’−末端に連結されているPolyA鎖とハイブリダイズさせ、形成される核酸二本鎖によって、ＲＮＡアプタマーの固定化を行うことができる。付加されるPolyA鎖の塩基長は、２０塩基以上、３０塩基以下の範囲に選択することが望ましい。

捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する場合、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と該ＲＮＡアプタマーで形成される複合体の解離定数Ｋ_Dは、少なくとも、Ｋ_D≦１００ｎＭ、通常、Ｋ_D≦１０ｎＭの範囲であることが好ましい。特には、Ｋ_D≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが、より好ましい。

実際の検出操作では、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」を結合させた後、結合していないヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を洗浄により、除去する。次いで、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合させた、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に、検出用モノクローナル抗体を反応させる。さらに、結合していない検出用モノクローナル抗体を洗浄により、除去する。

また、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に結合している検出用「モノクローナル抗体」を検出する工程でも、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を含まない液中に浸された状態とされる。

捕獲操作後の洗浄工程、あるいは、検出工程中、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離が進行する。このヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離は、該複合体の解離の速度定数：ｋ_dにより支配される。従って、複合体の解離の速度定数：ｋ_dが、ｋ_d≧１０^-3 ｓ^-1である場合、捕獲操作後の洗浄工程と検出工程に要する時間が１０００秒間に達すると、形成された複合体の（１−1/e）は、その間に解離することになる。

捕獲操作後の洗浄工程と検出工程の要する時間に進行する、複合体の解離を無視できる水準（例えば、1/10以下）に留めるためには、複合体の解離の速度定数：ｋ_dが、通常、ｋ_d≦２×１０^-4 ｓ^-1の範囲、より好ましくは、ｋ_d≦１０^-4 ｓ^-1の範囲である、「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが望ましい。

すなわち、複合体の解離定数Ｋ_Dは、Ｋ_D≦１０ｎＭの範囲であり、複合体の解離の速度定数：ｋ_dは、ｋ_d≦１０^-4 ｓ^-1の範囲であるという二つの条件を満足する、「ＲＮＡアプタマー分子」を、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用することが、好ましい。

勿論、検出用モノクローナル抗体は、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と、選択的に結合する必要がある。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」との結合によって、検出用「モノクローナル抗体」のヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対する結合能が阻害を受けないことが必要である。加えて、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」は、検出用モノクローナル抗体に対して、高い結合能を有するものでないことも必要である。

また、検出用「モノクローナル抗体」は、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対して、定量的に結合する必要がある。すなわち、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに結合する、検出用「モノクローナル抗体」の分子数の比率は、一定であることが望ましい。具体的には、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに、検出用「モノクローナル抗体」が一分子結合する比率であることが望ましい。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第三の態様は、上記の捕獲用モノクローナル抗体と検出用モノクローナル抗体に代えて、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することで、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法に類似するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出用の検出用キットを構成する際、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用する形態に相当している。すなわち、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用し、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と組み合わせることで、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製する方法に相当している。その際、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」とは異なる、ヒトＴＮＦ−αに対する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することができる。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第三の態様では、
作製する該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」である、第一のＲＮＡアプタマーと、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」である、第二のＲＮＡアプタマーを組み合わせており、その第二のＲＮＡアプタマーとして、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を利用する。

対応する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第三の態様は、
検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」と、捕獲用「ＲＮＡアプタマー」として利用する、別の「ヒトＴＮＦ−αに対する特異的な結合能を有するＲＮＡアプタマー」を組み合わせて、検出用キットを構成している。

該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを利用して、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を検出する際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、第二のＲＮＡアプタマーを反応させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αと結合して、複合体を形成した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う方式を採用する。

検出用「ＲＮＡアプタマー」である、第二のＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する。

なお、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、その検出に利用可能な標識を付した形態とすることが好ましい。例えば、該第二のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。

検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する場合、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と該第二のＲＮＡアプタマーで形成される複合体の解離定数Ｋ_Dは、少なくとも、Ｋ_D≦１００ｎＭ、通常、Ｋ_D≦１０ｎＭの範囲であることが好ましい。特には、Ｋ_D≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが、より好ましい。

実際の検出操作では、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を結合させた後、結合していない検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を洗浄により、除去する。また、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に結合している検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を検出する際には、通常、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を含まない液中に浸された状態とされる。この洗浄工程、あるいは、検出工程中、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離が進行する。このヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離は、該複合体の解離の速度定数：ｋ_dにより支配される。従って、複合体の解離の速度定数：ｋ_dが、ｋ_d≧１０^-3 ｓ^-1である場合、洗浄工程と検出工程に要する時間が１０００秒間に達すると、形成された複合体の（１−1/e）は、その間に解離することになる。

洗浄工程と検出工程の要する時間に進行する、複合体の解離を無視できる水準（例えば、1/10以下）に留めるためには、複合体の解離の速度定数：ｋ_dが、通常、ｋ_d≦２×１０^-4 ｓ^-1の範囲、より好ましくは、ｋ_d≦１０^-4 ｓ^-1の範囲である、「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが望ましい。

すなわち、複合体の解離定数Ｋ_Dは、Ｋ_D≦１０ｎＭの範囲であり、複合体の解離の速度定数：ｋ_dは、ｋ_d≦１０^-4 ｓ^-1の範囲であるという二つの条件を満足する、「ＲＮＡアプタマー分子」を、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用することが、好ましい。

勿論、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と、選択的に結合する必要がある。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」との結合によって、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対する結合能が阻害を受けないことが必要である。

また、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対して、定量的に結合する必要がある。すなわち、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに結合する、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の分子数の比率は、一定であることが望ましい。具体的には、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」が一分子結合する比率であることが望ましい。

また、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」を利用することもできる。その際、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」のうちから、互いに異なる部位に結合する「ＲＮＡアプタマー分子」を選択して、組み合わせる。

また、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」は、該アプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。すなわち、固体表面に、予め、PolydU鎖を固定化しておき、一本鎖核酸の3’−末端に連結されているPolyA鎖とハイブリダイズさせ、形成される核酸二本鎖によって、ＲＮＡアプタマーの固定化を行うことができる。付加されるPolyA鎖の塩基長は、２０塩基以上、３０塩基以下の範囲に選択することが望ましい。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第四の態様は、上記の捕獲用モノクローナル抗体と検出用モノクローナル抗体に代えて、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することで、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法に類似するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出用の検出用キットを構成する際、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用する形態に相当している。すなわち、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用し、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」と組み合わせることで、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製する方法に相当している。その際、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」とは異なる、ヒトＴＮＦ−αに対する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することができる。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第四の態様では、
作製する該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」である、第一のＲＮＡアプタマーと、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」である、第二のＲＮＡアプタマーを組み合わせており、その第一のＲＮＡアプタマーとして、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を利用する。

対応する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第四の態様は、
捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」と、検出用「ＲＮＡアプタマー」として利用する、別の「ヒトＴＮＦ−αに対する特異的な結合能を有するＲＮＡアプタマー」を組み合わせて、検出用キットを構成している。

該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを利用して、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出する際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、第二のＲＮＡアプタマーを反応させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αと結合して、複合体を形成した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う方式を採用する。

捕獲用「ＲＮＡアプタマー」である、第一のＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する。

その際、捕獲用「ＲＮＡアプタマー」を固体表面に固定化するため、例えば、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該アプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。すなわち、固体表面に、予め、PolydU鎖を固定化しておき、一本鎖核酸の3’−末端に連結されているPolyA鎖とハイブリダイズさせ、形成される核酸二本鎖によって、ＲＮＡアプタマーの固定化を行うことができる。付加されるPolyA鎖の塩基長は、２０塩基以上、３０塩基以下の範囲に選択することが望ましい。

捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する場合、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と該ＲＮＡアプタマーで形成される複合体の解離定数Ｋ_Dは、少なくとも、Ｋ_D≦１００ｎＭ、通常、Ｋ_D≦１０ｎＭの範囲であることが好ましい。特には、Ｋ_D≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが、より好ましい。

実際の検出操作では、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」を結合させた後、結合していないヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を洗浄により、除去する。次いで、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合させた、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を反応させる。さらに、結合していない検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を洗浄により、除去する。

また、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に結合している検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を検出する工程でも、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を含まない液中に浸された状態とされる。

捕獲操作後の洗浄工程、あるいは、検出工程中、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離が進行する。このヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離は、該複合体の解離の速度定数：ｋ_dにより支配される。従って、複合体の解離の速度定数：ｋ_dが、ｋ_d≧１０^-3 ｓ^-1である場合、捕獲操作後の洗浄工程と検出工程に要する時間が１０００秒間に達すると、形成された複合体の（１−1/e）は、その間に解離することになる。

捕獲操作後の洗浄工程と検出工程の要する時間に進行する、複合体の解離を無視できる水準（例えば、1/10以下）に留めるためには、複合体の解離の速度定数：ｋ_dが、通常、ｋ_d≦２×１０^-4 ｓ^-1の範囲、より好ましくは、ｋ_d≦１０^-4 ｓ^-1の範囲である、「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが望ましい。

すなわち、複合体の解離定数Ｋ_Dは、Ｋ_D≦１０ｎＭの範囲であり、複合体の解離の速度定数：ｋ_dは、ｋ_d≦１０^-4 ｓ^-1の範囲であるという二つの条件を満足する、「ＲＮＡアプタマー分子」を、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用することが、好ましい。

勿論、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と、選択的に結合する必要がある。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」との結合によって、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対する結合能が阻害を受けないことが必要である。

また、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対して、定量的に結合する必要がある。すなわち、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに結合する、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の分子数の比率は、一定であることが望ましい。具体的には、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」が一分子結合する比率であることが望ましい。

また、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」を利用することもできる。その際、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」のうちから、互いに異なる部位に結合する「ＲＮＡアプタマー分子」を選択して、組み合わせる。

なお、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する、第一のＲＮＡアプタマーは、その検出に利用可能な標識を付した形態とすることが好ましい。例えば、該第一のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。

次に、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」に関して、より詳細に説明する。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」は、下記の着想に基づき、「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能」の発揮に関与する部位（例えば、内部ループ様の構造）の構成に、特定のモチーフ配列を利用すると推定される「ＲＮＡアプタマー」を効率的に選別する方法に相当している。

まず、図２に示す、TNF-130の推定された二次構造において、中心部に、内部ループ様の構造が構成されている点、特に、TNF-130の「ランダム配列」領域において、この内部ループ様の構造の構成に関与している部分として、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の二つの領域に着目した。

さらに、上述の二種の「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100について、その推定される二次構造を比較すると、図３に示すように、中心部に、内部ループ様の構造が構成されているという共通性が見出されることに着目した。この内部ループ様の構造の構成に関与する部分塩基配列を対比したところ、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と、TNF-100中の「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」との間で、明確な類似性が見出されることに着目した。

なお、図３に示すように、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100の推定される二次構造において、その中心部に見出される、内部ループ様の構造では、三つの二本鎖構造によって、該内部ループ様の構造が保持されていると推断される。

通常、一本鎖ＲＮＡが二本鎖構造を形成すると、該二本鎖構造を構成する二つの部分に挟まれる領域は、何らかのループ構造を構成する。従って、内部ループ様の構造の形成に付随する、三つの二本鎖構造のうち、二つは、その先端部に、ループ構造を含む二次構造に由来する必要がある。「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100の推定される二次構造においては、その内部ループ様の構造中に、「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」が含まれ、その間に、ループ構造を含む二次構造の形成に関与する領域が存在している。特に、「５’−CUAGAC−３’」の５’末端側に、「５’−UCACCGG−３’」が存在することで、「５’−CUAGAC−３’」の５’末端のＣと、「５’−UCACCGG−３’」の３’末端のＧの間で、塩基対の形成が可能となっている。

その点を考慮すると、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100の推定される二次構造において、その中心部に見出される、内部ループ様の構造を形成する上で、前記の相対配置と、ループ構造を含む二次構造の形成に関与する領域の存在の二つの条件を満たすことが望ましい。

具体的には、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の二つの領域に相当する部分塩基配列を有し、その部分塩基配列を利用して、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130の推定された二次構造において、中心部に見出される、内部ループ様の構造と同等の構造が形成されると、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130と類似する結合部位を具える「ＲＮＡアプタマー分子」である可能性が高いと推断した。

例えば、クローン：TNF-673のランダム配列部分に見出された、「５’−TCTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」は、クローン：TNF-130中の「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と、その相対的な位置も高い類似性を有している。また、クローン：TNF-675のランダム配列部分に見出された、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」は、クローン：TNF-130中の「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と、その相対的な位置も高い類似性を有している。

また、「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」と同じ部分塩基配列を有し、その部分塩基配列を利用して、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100の推定された二次構造において、中心部に見出される、内部ループ様の構造と同等の構造が形成されると、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100と類似する結合部位を具える「ＲＮＡアプタマー分子」である可能性が高いと推断した。

例えば、表８に示す、三種のクローン：TNF-673,TNF-674,TNF-675と、クローン：TNF-100、ならびに、クローン：TNF-130に関して、何れも、「５’−TCACCGG−３’」と「５’−CTAGAC−３’」と同じ部分塩基配列を内在している。

例えば、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングに利用する、
５’末端の固定領域：GGAAGACCAG CCUUAAGAGGG；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGUAUCCG GAACGUGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
を具える、全長９０塩基長の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」中から、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製し、この第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーに対して、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、スクリーニングを行うことで、より効率的に、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされることに想到した。

すなわち、上記の第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’を利用することで、予めスクリーニング対象の絞り込みを行うことで、より効率的なスクリーニングを行うことが可能となることに想到した。

あるいは、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製し、この第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーに対して、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、スクリーニングを行うことで、より効率的に、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされることに想到した。

従って、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の形態は、上記の第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’を利用することで、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の二つの領域が、TNF-130の推定された二次構造において、中心部に存在する内部ループ様の構造を構成する可能性を有する一本鎖ＲＮＡ分子の集団に、予めスクリーニング対象の絞り込みを行うことで、より効率的なスクリーニングを行う方法に相当している。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の形態は、例えば、下記の工程１と工程２とを具える選別方法とすることができる。

（工程１）
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
（工程２）
前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
該選別方法においては、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる。

図２に示す、TNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造が、選別されるＲＮＡアプタマーの予測される二次構造中に存在するためには、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列との間に、ヘアピン・ループ構造を形成可能な領域が存在することが好ましい。

ヘアピン・ループ構造を形成可能な領域は、８塩基以上の塩基長である必要がある。その点を考慮すると、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが好ましい。

また、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、図２に示す、TNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造を構成する上では、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在していることが望ましいと考えられる。すなわち、内部ループ様の構造の一部に、５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG Gの一部が利用される態様では、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在していることが望ましい。その点を考慮すると、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが望ましい。

また、本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第一の形態は、上記の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の形態で利用される「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」に相当している。

すなわち、本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第一の形態は、下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである。

図２に示す、TNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造が、予測される二次構造中に存在する、候補一本鎖ＲＮＡ分子を高い頻度で含むためには、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列との間に、ループ構造を形成可能な領域が存在することが好ましい。

ヘアピン・ループ構造を形成可能な領域は、８塩基以上の塩基長である必要がある。その点を考慮すると、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが好ましい。

また、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、図２に示す、TNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造を構成する上では、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在していることが望ましいと考えられる。すなわち、内部ループ様の構造の一部に、５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG Gの一部が利用される態様では、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在していることが望ましい。その点を考慮すると、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが望ましい。

また、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第二の形態は、上記の第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’を利用することで、「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」の二つの領域が、TNF-100、あるいは、TNF-130の推定された二次構造において、中心部に存在する内部ループ様の構造を構成する可能性を有する一本鎖ＲＮＡ分子の集団に、予めスクリーニング対象の絞り込みを行うことで、より効率的なスクリーニングを行う方法に相当している。

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第二の形態は、例えば、下記の工程１と工程２とを具える選別方法とすることができる。

（工程１）
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
（工程２）
前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
該選別方法によって、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる。

図３に示す、TNF-100やTNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造が、選別されるＲＮＡアプタマーの予測される二次構造中に存在するためには、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’に相当する、第四の部分塩基配列との間に、ループ構造を形成可能な領域が存在することが好ましい。

ヘアピン・ループ構造を形成可能な領域は、８塩基以上の塩基長である必要がある。その点を考慮すると、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが好ましい。

さらに、「ＲＮＡアプタマー」TNF-673,TNF-674,TNF-675、ならびに、TNF-100、TNF-130に相当する「候補一本鎖ＲＮＡ分子」を含むものとするためには、上述する第一の形態と同様に、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。

また、本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第二の形態は、上記の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第二の形態で利用される「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」に相当している。

すなわち、本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第二の形態は、下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ₅₁）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’に相当する、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである。

図３に示す、TNF-100やTNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造が、選別されるＲＮＡアプタマーの予測される二次構造中に存在するためには、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’に相当する、第四の部分塩基配列との間に、ループ構造を形成可能な領域が存在することが好ましい。

ヘアピン・ループ構造を形成可能な領域は、８塩基以上の塩基長である必要がある。その点を考慮すると、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが好ましい。

さらに、「ＲＮＡアプタマー」TNF-673,TNF-674,TNF-675、ならびに、TNF-100、TNF-130に相当する「候補一本鎖ＲＮＡ分子」を含むものとするためには、上述する第一の形態と同様に、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ₅₁）中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。

さらに、本発明者らは、上述の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」を適用することで、下記の「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」を選別することは可能であることに想到した。

すなわち、その塩基配列中に含まれる、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成され、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーである。あるいは、その塩基配列中に含まれる、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成され、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーである。

すなわち、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第一の態様は、上述の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の態様を適用することで選別されるＲＮＡアプタマーである。

該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記５１塩基長の配列部分中に、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。

その際、
前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第一の態様は、上述の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第二の態様を適用することで選別されるＲＮＡアプタマーである。

該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記５１塩基長の配列部分中に、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。

その際、
前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

上述の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の態様、第二の態様では、利用される「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」では、前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子の集合となっている。その５１塩基長の配列部分の塩基長を若干変更し、前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子の集合を、「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」として利用することでも、同様な「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の選別が可能であることに想到した。

すなわち、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第二の態様は、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の態様に準じて、前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子の集合を、「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」として利用することで選別されるＲＮＡアプタマーに相当している。

該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記中間領域の配列部分中に、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。

その際、
前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

なお、上記中間領域の配列部分の塩基長は、通常、４０塩基〜６０塩基の範囲、好ましくは、４５塩基〜５５塩基の範囲に選択することが望ましい。

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第二の態様は、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の態様に準じて、前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子の集合を、「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」として利用することで選別されるＲＮＡアプタマーに相当している。

該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記中間領域の配列部分中に、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。

その際、
前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

なお、上記中間領域の配列部分の塩基長は、通常、４０塩基〜６０塩基の範囲、好ましくは、４５塩基〜５５塩基の範囲に選択することが望ましい。

さらに、図４に示すRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−ｍ０１３と「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１００の推定される二次構造の対比結果に着目した。具体的には、その塩基配列中に含まれる、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成されると、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を発揮できることに想到した。また、その塩基配列中に含まれる、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成されると、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を発揮できることに想到した。

すなわち、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第三の態様は、下記の構成を有する「ＲＮＡアプタマー分子」である。

該ＲＮＡアプタマーは、
第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでなる塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。

その際、
前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

なお、上記のＲＮＡアプタマーの塩基長は、通常、１２０塩基以下の範囲、好ましくは、１００塩基以下の範囲に選択することが望ましい。

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第三の態様は、下記の構成を有する「ＲＮＡアプタマー分子」である。

該ＲＮＡアプタマーは、
第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでなる塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。

その際、
前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。

さらに、前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。

なお、上記のＲＮＡアプタマーの塩基長は、通常、１２０塩基以下の範囲、好ましくは、１００塩基以下の範囲に選択することが望ましい。

本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、ホモ３量体を構成している、ヒトＴＮＦ−αタンパク質について、その循環血液中の濃度を定量する目的に利用可能である。

Claims (10)

1. ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
   該ＲＮＡアプタマーは、下記I-1の塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
   (I-1) TNF-130
   5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
   UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
   CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：１）
   ことを特徴とするＲＮＡアプタマー。
2. ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、５ｍＭのＭｇ^２＋カチオンの存在下における解離定数Ｋ_Ｄが、Ｋ_Ｄ≦１０ｎＭである、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
   該ＲＮＡアプタマーは、各リボ核酸の２’−位のヒドロキシル基（−ＯＨ）をフッ素原子（−Ｆ）で置き換える修飾が施されている、下記のI-2〜I-5の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖修飾ＲＮＡ分子である
   (I-2) TNF-485 (2’F)
   5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
   UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
   CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
   (I-3) TNF-505 (2’F)
   5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
   UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
   CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
   (I-4) TNF-508 (2’F)
   5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
   CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
   CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
   (I-5) TNF-510 (2’F)
   5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
   UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
   CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
   ことを特徴とするＲＮＡアプタマー。
3. ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
   該ＲＮＡアプタマーは、下記のII-3、II-4の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
   (II-3) TNF-675
   5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
   UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
   CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：８）
   (II-4) TNF-100
   5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
   AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
   CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
   ことを特徴とするＲＮＡアプタマー。
4. ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
   該ＲＮＡアプタマーは、下記のIIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
   (III) TNF-m013
   5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
   CUAGUAUCC-3’ （配列番号：１０）
   ことを特徴とするＲＮＡアプタマー。
5. ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、５ｍＭのＭｇ^２＋カチオンの存在下における解離定数Ｋ_Ｄが、Ｋ_Ｄ≦２０ｎＭである、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
   該ＲＮＡアプタマーは、3’−末端にPolyA配列が付加された、下記のII-4’の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
   (II-4’) TNF-100+(A)₂₄
   5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
   AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
   CUAGUAUCCGGAACGUGAC
   AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3’ （配列番号：１１）
   ことを特徴とするＲＮＡアプタマー。
6. ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
   該ＲＮＡアプタマーは、3’−末端にPolyA配列が付加された、下記のIII’の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
   (III’) TNF-m013+(A)₂₄
   5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
   CUAGUAUCC
   AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3’ （配列番号：１２）
   ことを特徴とするＲＮＡアプタマー。
7. ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法であって、
   該選別方法は、下記の工程１と工程２とを具えており、
   （工程１）
   下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ_５１）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
   ５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
   ５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ_５１）；
   ３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
   前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ_５１）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と同じ、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’と同じ、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
   （工程２）
   前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
   該選別方法によって、前記第一のモチーフ配列、第二のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる
   ことを特徴とするＲＮＡアプタマーの選別方法。
8. ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法であって、
   該選別方法は、下記の工程１と工程２とを具えており、
   （工程１）
   下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ_５１）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
   ５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
   ５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ_５１）；
   ３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
   前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ_５１）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
   （工程２）
   前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
   該選別方法によって、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる
   ことを特徴とするＲＮＡアプタマーの選別方法。
9. ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別に利用される、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーであって、
   該部分ライブラリーは、
   下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ_５１）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
   ５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
   ５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ_５１）；
   ３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
   前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ_５１）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と同じ、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’と同じ、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである
   ことを特徴とする候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー。
10. ホモ三量体型の可溶性ヒトＴＮＦ−αに対して、Ｍｇ^２＋カチオン依存性の結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別に利用される、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーであって、
    該部分ライブラリーは、
    下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ_５１）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
    ５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
    ５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ_５１）；
    ３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
    前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ_５１）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである
    ことを特徴とする候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー。