WO2018052063A1 - ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法 - Google Patents

ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法 Download PDF

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nucleic acid
acid molecule
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polynucleotide
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宏貴 皆川
克紀 堀井
穣 秋冨
金子　直人
巌 和賀
正靖 ▲桑▼原
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Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社
国立大学法人群馬大学
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    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a nucleoside derivative or a salt thereof, a polynucleotide synthesis reagent, a method for producing a polynucleotide, a polynucleotide, and a method for producing a bound nucleic acid molecule.
  • binding molecule that binds to the target In order to analyze the target in the sample, a binding molecule that binds to the target is used.
  • binding nucleic acid molecules that bind to targets such as aptamers are also used as binding molecules that bind to the target (Patent Document 1).
  • SELEX Systematic Evolution of Lands by Exponential
  • An Enrichment method and the like are known.
  • a modified nucleoside molecule obtained by modifying the natural nucleoside molecule is also used in addition to the natural nucleoside molecule constituting the bound nucleic acid molecule.
  • an object of the present invention is to provide a new nucleoside derivative or salt thereof, a polynucleotide synthesis reagent, a polynucleotide production method, a polynucleotide, and a method for producing a binding nucleic acid molecule.
  • the nucleoside derivative or salt thereof of the present invention is represented by the following chemical formula (1).
  • Su is an atomic group having a sugar skeleton in a nucleoside residue or an atomic group having a sugar phosphate skeleton in a nucleotide residue, which may or may not have a protecting group
  • L 1 and L 2 are each independently a linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms
  • X 1 and X 2 are each independently an imino group (—NR 1 —), an ether group (—O—), or a thioether group (—S—)
  • R 1 is a hydrogen atom or a linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms.
  • the polynucleotide synthesis reagent of the present invention is characterized by comprising the nucleotide derivative or salt thereof containing the nucleoside derivative or salt thereof of the present invention.
  • the method for producing a polynucleotide of the present invention is characterized by including a synthesis step of synthesizing a polynucleotide using the nucleotide derivative or salt thereof containing the nucleoside derivative or salt thereof of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention is characterized in that it contains a nucleotide derivative containing the nucleoside derivative of the present invention or a salt thereof or a salt thereof as a structural unit.
  • the method for producing a binding nucleic acid molecule of the present invention includes a contact step of bringing a candidate polynucleotide into contact with a target, and a selection step of selecting the candidate polynucleotide bound to the target as a binding nucleic acid molecule that binds to the target.
  • the candidate polynucleotide is the polynucleotide of the present invention.
  • a new nucleoside derivative or a salt thereof can be provided.
  • FIG. 1 is a graph showing the binding ability of a secretory immunoglobulin A (sIgA) -binding nucleic acid molecule in Example 2 to sIgA.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding ability of ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecules to ⁇ -amylase in Example 2.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of capillary electrophoresis in Example 2.
  • FIG. 4 is a photograph showing the result of pull-down in Example 2.
  • FIG. 5 is a photograph showing the result of pull-down in Example 2.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding ability of C-reactive protein (CRP) -binding nucleic acid molecules in Example 3 to CRP.
  • CRP C-reactive protein
  • FIG. 7 is a graph showing the binding ability of ⁇ -defensin (BDN) 4A-binding nucleic acid molecule to BDN4A in Example 3.
  • FIG. 8 is a graph showing the binding ability of lysozyme-binding nucleic acid molecules to lysozyme in Example 3.
  • FIG. 9 is a photograph showing the result of pull-down in Example 3.
  • FIG. 10 is a photograph showing the result of pull-down in Example 3.
  • FIG. 11 is a photograph showing the result of pull-down in Example 3.
  • FIG. 12 is a graph showing the binding ability of ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecules to ⁇ -amylase in Example 4.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of capillary electrophoresis in Example 4.
  • FIG. 14 is a photograph showing the result of pull-down in Example 4.
  • FIG. 15 is a graph showing the ability of a lactate dehydrogenase (LDH) 5 binding nucleic acid molecule in Example 5 to bind to LDH5.
  • FIG. 16 is a graph showing the binding ability of chromogranin A (CgA) -binding nucleic acid molecules in Example 5 to CgA.
  • FIG. 17 is a graph showing the binding ability of CgA-binding nucleic acid molecules in Example 5 to CgA.
  • FIG. 18 is a graph showing the binding ability of interleukin (IL) -6-binding nucleic acid molecule to IL-6 in Example 5.
  • FIG. IL interleukin
  • FIG. 19 is a graph showing the relative value of the amount of each LDH5-binding nucleic acid molecule bound to LDH5 in Example 5.
  • FIG. 20 is a graph showing the relative value of the binding amount of each CgA-binding nucleic acid molecule to CgA in Example 5.
  • FIG. 21 is a graph showing the relative value of the binding amount of each IL-6 binding nucleic acid molecule to IL-6 in Example 5.
  • FIG. 22 is a photograph showing the result of pull-down in Example 5.
  • FIG. 23 is a photograph showing the result of pull-down in Example 5.
  • the nucleoside derivative or salt thereof of the present invention is represented by the following chemical formula (1).
  • Su is an atomic group having a sugar skeleton in a nucleoside residue or an atomic group having a sugar phosphate skeleton in a nucleotide residue, which may or may not have a protecting group
  • L 1 and L 2 are each independently a linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms
  • X 1 and X 2 are each independently an imino group (—NR 1 —), an ether group (—O—), or a thioether group (—S—)
  • R 1 is a hydrogen atom or a linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms.
  • the nucleoside derivative of the present invention includes a purine ring-like structure in addition to the pyrimidine ring. Therefore, the nucleoside derivative of the present invention has, for example, a relatively larger number of atoms capable of interacting within a molecule or between molecules than a nucleoside derivative containing one pyrimidine ring structure. For this reason, the binding nucleic acid molecule containing the nucleoside derivative of the present invention has an improved ability to bind to a target as compared with a nucleoside derivative containing one pyrimidine ring structure, for example. For this reason, according to the nucleoside derivative of the present invention, for example, a bound nucleic acid molecule exhibiting excellent binding ability to a target can be produced.
  • L 1 and L 2 are each independently a linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms.
  • the lower limit of the carbon number of L 1 is 2, the upper limit thereof is 10, preferably 8, 6, and the range thereof is, for example, 2-8, 2-6.
  • L 1 preferably has 2 carbon atoms.
  • the lower limit of the carbon number of L 2 is 2, the upper limit is 10, preferably 8, 6, and the range is, for example, 2-8, 2-6.
  • L2 preferably has 2 carbon atoms.
  • L 1 and L 2 include, for example, an ethylene group (—CH 2 —CH 2 —), a vinylene group (—CH ⁇ CH—), a propylene group (—CH 2 —CH 2 —CH 2 —), Isopropylene group (—CH 2 —CH (CH 3 ) —), butylene group (—CH 2 —CH 2 —CH 2 —CH 2 —), methylbutylene group (—CH 2 —CH (CH 3 ) —CH 2 —CH 2 —), dimethylbutylene group (—CH 2 —CH (CH 3 ) —CH (CH 3 ) —CH 2 —), ethylbutylene group (—CH 2 —CH (C 2 H 5 ) —CH 2 — CH 2 —), pentylene group (—CH 2 —CH 2 —CH 2 —CH 2 —), hexylene group (—CH 2 —CH 2 —CH 2 —CH 2 —CH 2 —),
  • L 1 is preferably a vinylene group (—CH ⁇ CH—).
  • L 2 is preferably an ethylene group (—CH 2 —CH 2 —).
  • L 1 and L 2 may be the same hydrocarbon group or different hydrocarbon groups. As a specific example of the latter, L 1 is a vinylene group (—CH ⁇ CH—), and L 2 is an ethylene group (—CH 2 —CH 2 —) is preferred.
  • X 1 and X 2 are each independently an imino group (—NR 1 —), an ether group (—O—), or a thioether group (—S—).
  • R 1 is a hydrogen atom or a linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms, preferably a hydrogen atom.
  • L 1 and L 2 can be used.
  • X 1 is preferably an imino group (—NR 1 —).
  • X 2 is preferably an imino group (—NR 1 —).
  • X 1 and X 2 may be the same or different substituents.
  • X 1 and X 2 are preferably imino groups (—NR 1 —), more preferably NH groups.
  • the atomic group having a sugar skeleton in the nucleoside residue is not particularly limited, and examples thereof include an atomic group having a sugar skeleton in a known natural or artificial nucleoside residue.
  • the atomic group having a sugar skeleton in the natural nucleoside residue include an atomic group having a ribose skeleton in a ribonucleoside residue, an atomic group having a deoxyribose skeleton in a deoxyribonucleoside, and the like.
  • Examples of the atomic group having a sugar skeleton in the artificial nucleoside residue include an atomic group having a bicyclic sugar skeleton in the artificial nucleoside residue, and specific examples thereof include ENA (2′-O, 4′-C -Ethylene-bridged (Nucleic Acids), LNA (Locked Nucleic Acid), and the like include an atomic group having a ribose skeleton in which a 2'-position oxygen atom and a 4'-position carbon atom are bridged.
  • the atomic group having a sugar phosphate skeleton in the nucleotide residue is not particularly limited, and examples thereof include an atomic group having a sugar phosphate skeleton in a known natural or artificial nucleotide residue.
  • Examples of the atomic group having a sugar phosphate skeleton in the natural nucleotide residue include an atomic group having a ribose-phosphate skeleton in a ribonucleotide residue, an atomic group having a deoxyribose-phosphate skeleton in deoxyribonucleotide, and the like.
  • Examples of the atomic group having a sugar phosphate skeleton in the artificial nucleotide residue include an atomic group having a bicyclic sugar phosphate skeleton in the artificial nucleotide residue, and specific examples include ENA (2′-O, 4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids), LNA (Locked Nucleic ⁇ Acids), etc. have an atomic group having a ribose-phosphate skeleton in which the 2'-position oxygen atom and the 4'-position carbon atom are bridged can give.
  • the atomic group having a sugar skeleton in the nucleoside residue or the atomic group having a sugar phosphate skeleton in the nucleotide residue is preferably represented by the following chemical formula (2).
  • R 2 is a hydrogen atom, a protecting group, or a group represented by the following chemical formula (3)
  • R 3 is a hydrogen atom, a protecting group, or a phosphoramidite group
  • R 4 is a hydrogen atom, a fluorine atom, a hydroxyl group, an amino group, or a mercapto group
  • Y is an oxygen atom or a sulfur atom
  • Z is a hydroxyl group or an imidazole group
  • m is an integer of 1 to 10.
  • R 2 is a hydrogen atom, a protecting group, or a group represented by the chemical formula (3).
  • the protecting group is not particularly limited, and examples thereof include known hydroxyl protecting groups used in nucleic acid synthesis methods. Specific examples include DMTr group (4,4′-dimethoxy (triphenylmethyl) Group) and the like.
  • R 2 is a group represented by the chemical formula (3), the nucleoside derivative of the present invention can also be referred to as a nucleotide derivative, for example.
  • R 3 is a hydrogen atom, a protecting group, or a phosphoramidite group.
  • the protecting group is not particularly limited, and for example, the description for R 2 can be incorporated.
  • the phosphoramidite group is represented by the following chemical formula (5).
  • R 3 is a phosphoramidite group
  • the nucleoside derivative of the present invention can also be referred to as a phosphoramidite product of a nucleoside derivative, for example.
  • R 2 is a group represented by the chemical formula (3) and R 3 is a phosphoramidite group
  • the nucleoside derivative of the present invention can also be referred to as a phosphoramidite product of a nucleotide derivative, for example.
  • R 4 is a hydrogen atom, a fluorine atom, a hydroxyl group, an amino group, or a mercapto group, preferably a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • R 4 is a hydrogen atom
  • the nucleoside derivative of the present invention has a deoxyribose skeleton as a sugar skeleton, and can be used, for example, for DNA synthesis.
  • R 4 is a hydroxyl group
  • the nucleoside derivative of the present invention has a ribose skeleton as a sugar skeleton and can be used, for example, for RNA synthesis.
  • Y is an oxygen atom or a sulfur atom.
  • the polynucleotide containing the nucleoside derivative of the present invention as a constituent unit can also be referred to as a polynucleotide having a phosphodiester bond.
  • the polynucleotide containing the nucleoside derivative of the present invention as a constituent unit can also be referred to as a polynucleotide having a phosphorothioate bond.
  • Z is a hydroxyl group or an imidazole group.
  • imidazole group imidazole is bonded to a phosphate atom via a nitrogen atom at the 1-position, for example.
  • m is an integer of 1 to 10, preferably 1 to 3, 1 to 2, 1.
  • the nucleoside derivative of the present invention is preferably represented by the following chemical formula (4), (6), (7) or (8).
  • the nucleoside derivatives represented by the following chemical formulas (4), (6), (7), and (8) are also referred to as NG7, NG4, NG5, and NG6, respectively.
  • the nucleoside derivatives and salts thereof of the present invention may be enantiomers, tautomers, stereoisomers such as geometric isomers, conformers and optical isomers, and salts thereof.
  • the sugar skeleton is D-form, but the nucleoside derivative of the present invention is not limited to this, and the sugar skeleton may be L-form.
  • the salt of the nucleoside derivative of the present invention may be an acid addition salt or a base addition salt.
  • the acid forming the acid addition salt may be an inorganic acid or an organic acid
  • the base forming the base addition salt may be an inorganic base or an organic base.
  • the inorganic acid is not particularly limited, and examples thereof include sulfuric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, hypofluorite, hypochlorous acid, hypobromite, Hypoarousous acid, fluorinated acid, chlorous acid, bromic acid, iodic acid, fluoric acid, chloric acid, bromic acid, iodic acid, perfluoric acid, perchloric acid, perbromic acid, periodic acid, etc. Can be given.
  • the organic acid is not particularly limited, and examples thereof include p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, oxalic acid, p-bromobenzenesulfonic acid, carbonic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid, and acetic acid.
  • the inorganic base is not particularly limited, and examples thereof include ammonium hydroxide, alkali metal hydroxide, alkaline earth metal hydroxide, carbonate, bicarbonate, and the like. More specifically, for example, water Examples thereof include sodium oxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, calcium hydroxide and calcium carbonate.
  • the organic base is not particularly limited, and examples thereof include ethanolamine, triethylamine, and tris (hydroxymethyl) aminomethane.
  • the method for producing the nucleoside derivative of the present invention is not particularly limited, and can be produced by combining known synthetic methods.
  • the nucleoside derivative of the present invention includes, for example, a nucleoside derivative having an acrylic acid structure introduced therein and a substituent having an amino group at the end, as in the synthesis methods of the examples described later, and a hydrogen atom of the amino group.
  • a substituted guanine can be synthesized by an amidation reaction.
  • the polynucleotide synthesis reagent of the present invention (hereinafter also referred to as “synthesis reagent”) is characterized by containing the nucleotide derivative including the nucleoside derivative of the present invention or a salt thereof or a salt thereof.
  • the synthesis reagent of the present invention is characterized by containing the nucleoside derivative of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • the description of the nucleoside derivative of the present invention or a salt thereof can be cited.
  • the polynucleotide of the present invention described later can be synthesized.
  • the nucleoside derivative preferably contains, for example, at least one of the phosphoramidite product and the nucleotide derivative.
  • the synthesis reagent of the present invention may further contain other reagents used for polynucleotide synthesis, for example.
  • the method for producing a polynucleotide of the present invention is characterized by including a synthesis step of synthesizing a polynucleotide using the nucleotide derivative or salt thereof containing the nucleoside derivative or salt thereof of the present invention.
  • the method for producing a polynucleotide of the present invention is characterized in that, in the synthesis step, the nucleotide derivative or salt thereof containing the nucleoside derivative of the present invention or a salt thereof is used, and other steps and conditions are not particularly limited. .
  • the description of the nucleoside derivative of the present invention or a salt thereof and a synthesis reagent can be used.
  • the method for producing a polynucleotide of the present invention for example, the polynucleotide of the present invention described later can be produced.
  • the synthetic reagent of the present invention may be used as a nucleotide derivative containing the nucleoside derivative of the present invention or a salt thereof or a salt thereof.
  • the method for synthesizing the polynucleotide is not particularly limited, and can be performed by a known method for synthesizing polynucleotides.
  • the synthesis step can synthesize a polynucleotide by the phosphoramidite method.
  • the method for producing a polynucleotide of the present invention may include, for example, a purification step for purifying the polynucleotide obtained in the synthesis step.
  • the purification method in the purification step is not particularly limited and can be carried out by a known purification method such as column chromatography.
  • the polynucleotide of the present invention is characterized by containing the nucleotide derivative containing the nucleoside derivative of the present invention or a salt thereof or a salt thereof as a structural unit.
  • the polynucleotide of the present invention is characterized in that it contains a nucleotide derivative containing the nucleoside derivative of the present invention or a salt thereof or a salt thereof as a structural unit, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • the description of the nucleoside derivative of the present invention or a salt thereof, a polynucleotide synthesis reagent, and a method for producing the polynucleotide can be cited.
  • a bound nucleic acid molecule that binds to a target can be produced.
  • the structural unit is included as a part of the polynucleotide, for example.
  • the polynucleotide of the present invention includes, for example, a structure represented by the following chemical formula (9).
  • a structure represented by the following chemical formula (9) for example, the description of each substituent described above can be used.
  • the polynucleotide of the present invention may be, for example, a binding nucleic acid molecule that binds to a target.
  • the target is not particularly limited, and can be any target.
  • Specific examples include biomolecules.
  • the biomolecule include secretory immunoglobulin A (sIgA), amylase (eg, ⁇ -amylase), chromogranin A, ⁇ -defensin 2, ⁇ -defensin 4A, kallikrein, C-reactive protein (C-Reactive) Protein, CRP), calprotectin, Statherins, cortisol, melatonin, lysozyme, lactate dehydrogenase (LDH) 5, chromogranin A (CgA), interleukin (IL) -6 and the like.
  • the bound nucleic acid molecule can be produced, for example, by the method for producing a bound nucleic acid molecule of the present invention described later.
  • the polynucleotide of the present invention may contain, for example, other nucleotides in addition to the nucleotide derivative.
  • the nucleotide include deoxyribonucleotide and ribonucleotide.
  • examples of the polynucleotide of the present invention include DNA composed only of deoxyribonucleotides, DNA / RNA containing deoxyribonucleotides and ribonucleotides, RNA composed only of ribonucleotides, and the like.
  • the other nucleotide may be, for example, a modified nucleotide.
  • modified nucleotide examples include modified deoxyribonucleotide and modified ribonucleotide.
  • modified nucleotide include those in which the sugar in the nucleotide is modified.
  • sugar examples include deoxyribose and ribose.
  • the modification site in the nucleotide is not particularly limited, and examples thereof include the 2 'position and / or the 4' position of the sugar. Examples of the modification include methylation, fluorination, amination, and thiolation.
  • modified nucleotide examples include those in which a nucleotide having a pyrimidine base (pyrimidine nucleus) as a base is modified, or those in which a nucleotide having a purine base (purine nucleus) as a base is modified. is there.
  • a nucleotide having a pyrimidine base is referred to as a pyrimidine nucleotide
  • a modified pyrimidine nucleotide is referred to as a modified pyrimidine nucleotide
  • a nucleotide having a purine base is referred to as a purine nucleotide
  • a modified purine nucleotide is referred to as a modified purine nucleotide.
  • the pyrimidine nucleotides include uracil nucleotides having uracil, cytosine nucleotides having cytosine, and thymine nucleotides having thymine.
  • the base when the base is a pyrimidine base, for example, the 2'-position and / or the 4'-position of the sugar is preferably modified.
  • Specific examples of the modified nucleotide include, for example, 2′-methylated-uracil nucleotide, 2′-methylated-cytosine nucleotide, 2′-fluorinated-uracil nucleotide, 2′-modified at the 2 ′ position of ribose.
  • Fluorinated-cytosine nucleotides 2′-aminated-uracil nucleotides, 2′-aminated-cytosine nucleotides, 2′-thiolated-uracil nucleotides, 2′-thiolated-cytosine nucleotides, and the like.
  • the bases in the other nucleotides may be natural bases (non-artificial bases) such as adenine (A), cytosine (C), guanine (G), thymine (T) and uracil (U), or non-natural bases ( Artificial base).
  • natural bases such as adenine (A), cytosine (C), guanine (G), thymine (T) and uracil (U), or non-natural bases ( Artificial base).
  • Examples of the artificial base include a modified base and a modified base, and preferably have the same function as the natural base (A, C, G, T, or U).
  • the artificial base having the same function is, for example, an artificial base capable of binding to cytosine (C) instead of guanine (G), an artificial base capable of binding to guanine (G) instead of cytosine (C), Instead of adenine (A), an artificial base capable of binding to thymine (T) or uracil (U), instead of thymine (T), an artificial base capable of binding to adenine (A), instead of uracil (U) And an artificial base capable of binding to adenine (A).
  • the modified base include a methylated base, a fluorinated base, an aminated base, and a thiolated base.
  • the modified base include, for example, 2′-methyluracil, 2′-methylcytosine, 2′-fluorouracil, 2′-fluorocytosine, 2′-aminouracil, 2′-aminocytosine, 2′-thiouracil. And 2'-thiocytosine.
  • the bases represented by A, G, C, T, and U include the meaning of the artificial base having the same function as each of the natural bases in addition to the natural base.
  • the polynucleotide of the present invention may contain, for example, an artificial nucleic acid monomer in addition to the nucleotide derivative.
  • an artificial nucleic acid monomer include PNA (peptide nucleic acid), LNA, ENA and the like.
  • the base in the monomer residue is the same as described above, for example.
  • the length of the polynucleotide of the present invention is not particularly limited.
  • the lower limit is 10 bases, 20 bases, 25 bases
  • the upper limit is, for example, 150 bases, 100 bases, 70 bases.
  • the range is, for example, 10 to 150 bases, 20 to 100 bases, 25 to 70 bases.
  • the polynucleotide of the present invention may further have an additional sequence, for example.
  • the additional sequence is preferably bound to, for example, at least one of the 5 'end and the 3' end of the polynucleotide, and more preferably the 3 'end.
  • the additional sequence is not particularly limited, and the length is not particularly limited.
  • the polynucleotide of the present invention may further have a labeling substance, for example.
  • the labeling substance is preferably bound to at least one of the 5 'end and the 3' end of the polynucleotide, and more preferably the 5 'end.
  • the labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include fluorescent substances, dyes, isotopes and enzymes.
  • the fluorescent substance include fluorophores such as pyrene, TAMRA, fluorescein, Cy (registered trademark) 3 dye, Cy (registered trademark) 5 dye, FAM dye, rhodamine dye, Texas red dye, JOE, MAX, HEX, and TYE.
  • the dye include Alexa dyes such as Alexa (registered trademark) 488 and Alexa (registered trademark) 647.
  • the labeling substance may be linked directly to the nucleic acid molecule or indirectly via the additional sequence, for example.
  • the polynucleotide of the present invention can be used, for example, immobilized on a carrier.
  • a carrier for example, either the 5 'end or the 3' end is preferably immobilized, and more preferably the 3 'end.
  • the polynucleotide may be immobilized directly or indirectly on the carrier. In the latter case, for example, it is preferable to immobilize via the additional sequence.
  • the method for producing a binding nucleic acid molecule of the present invention comprises a contact step of bringing a candidate polynucleotide into contact with a target, and selecting the candidate polynucleotide bound to the target as a binding nucleic acid molecule that binds to the target.
  • the candidate polynucleotide is the polynucleotide of the present invention.
  • the method for producing a binding nucleic acid molecule of the present invention is characterized in that, for example, the candidate polynucleotide is the polynucleotide of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the candidate polynucleotide includes a nucleotide derivative containing the nucleoside derivative of the present invention or a salt thereof or a salt thereof as a structural unit. Therefore, according to the method for producing a bound nucleic acid molecule of the present invention, for example, a bound nucleic acid molecule exhibiting excellent binding ability to a target can be produced.
  • the contact step and the selection step can be performed based on, for example, the SELEX method.
  • the number of candidate polynucleotides in the contacting step is not particularly limited, and is, for example, 4 20 to 4 120 (about 10 12 to 10 72 ) types, 4 30 to 4 60 (about 10 18 to 10 36 ) types.
  • the candidate polynucleotide is brought into contact with the target. Then, by this contact, the candidate polynucleotide and the target are reacted to form a complex of the candidate polynucleotide and the target.
  • the target used in the contact step may be, for example, the target itself or a decomposition product of the target.
  • the binding conditions for the candidate polynucleotide and the target are not particularly limited, and can be carried out, for example, by incubating the both in a solvent for a certain time.
  • the solvent is not particularly limited, and for example, those that retain the binding between the two are preferable, and specific examples include various buffer solutions.
  • the candidate polynucleotide bound to the target is selected as a binding nucleic acid molecule that binds to the target.
  • the candidate polynucleotide that forms a complex with the target is recovered as the binding nucleic acid molecule.
  • the mixture of the candidate polynucleotide and the target after the contacting step includes, for example, a candidate polynucleotide that does not participate in the complex formation in addition to the complex. Therefore, for example, it is preferable to separate the complex and the unreacted candidate polynucleotide from the mixture.
  • the separation method is not particularly limited, and examples thereof include a method using a difference in adsorptivity between the target and the candidate polynucleotide and a method using a difference in molecular weight between the complex and the candidate polynucleotide.
  • a method of using a target immobilized on a carrier at the time of forming the complex can be mentioned. That is, the target is immobilized on a carrier in advance, and the carrier and the candidate polynucleotide are brought into contact with each other to form a complex of the immobilized target and the candidate polynucleotide. Then, after removing the unreacted candidate polynucleotide not bound to the immobilized target, the complex of the target and the candidate polynucleotide may be dissociated from the carrier.
  • the method for immobilizing the target on the carrier is not particularly limited, and can be carried out by a known method.
  • the carrier is not particularly limited, and a known carrier can be used.
  • the production method of the present invention may include, for example, a base sequence determination step for determining the base sequence of the selected binding nucleic acid molecule.
  • the method for determining the base sequence is not particularly limited, and can be performed by a known base sequence determination method.
  • one set of the contact step and the selection step may be performed as one cycle, and a total of two or more cycles may be performed. Specific examples include 3 to 15 cycles.
  • the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule of the present invention (hereinafter also referred to as “ ⁇ -amylase nucleic acid molecule”) is characterized by comprising the following polynucleotide (a).
  • a a polynucleotide of the following (a1)
  • a1 a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 2 and 14 to 16
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention can bind to ⁇ -amylase as described above.
  • the ⁇ -amylase is not particularly limited, and examples of its origin include humans and non-human animals. Examples of the non-human animal include mouse, rat, monkey, rabbit, dog, cat, horse, cow, pig and the like. Information on the amino acid sequence of human ⁇ -amylase is registered in, for example, UniProt (http://www.uniprot.org/) accession number P04745.
  • binding to ⁇ -amylase means, for example, having binding ability to ⁇ -amylase or having binding activity to ⁇ -amylase.
  • the binding between the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention and the ⁇ -amylase can be determined by, for example, surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance molecular interaction
  • ProteON trade name, BioRad
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention binds to ⁇ -amylase, it can be used, for example, for detection of ⁇ -amylase.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention contains the following polynucleotide (a).
  • a a polynucleotide of the following (a1)
  • a1 a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 2 and 14 to 16
  • ⁇ -Amylase-binding nucleic acid molecule 1 (SEQ ID NO: 2) 5'-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCCG TT G TTT CAACAGCAAA T G TT AGGCAA TT GAAAC T ACAA T GGGCGGGC TT A T C-3 ' ⁇ -Amylase-binding nucleic acid molecule 2 (SEQ ID NO: 14) 5'-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATC T GCCC T GAAGAAC TTT GA T CACG TT A TTTT GAAAC T ACAA T GGGCGGGC TT A T C-3 ' ⁇ -Amylase-binding nucleic acid molecule 3 (SEQ ID NO: 15) 5'-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCCCACAA TT G T AGC T A TT A TTT CA T GCG TT GGAAAC T ACAA T GGGCGGGC TT A T C-3 ' ⁇ -Amylase-binding nucleic acid
  • the polynucleotide (a) includes, for example, the meaning of the following polynucleotide (a2), (a3), or (a4).
  • A2 a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in any one of the nucleotide sequences of (a1), and which binds to ⁇ -amylase (a3) It consists of a base sequence having 80% or more identity to any of the base sequences of (a1), and a polynucleotide that binds to ⁇ -amylase (a4) of any of the base sequences of (a1)
  • “1 or several” may be, for example, within a range in which the polynucleotide of (a2) binds to ⁇ -amylase.
  • the “one or several” is, for example, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, 1 to 3, 1 or 2, or 1.
  • the numerical range of numbers such as the number of bases and the number of sequences, for example, discloses all positive integers belonging to the range. That is, for example, the description “1 to 5 bases” means all disclosures of “1, 2, 3, 4, 5 bases” (the same applies hereinafter).
  • identity may be, for example, within a range in which the polynucleotide of (a3) binds to ⁇ -amylase.
  • the identity is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • the identity can be calculated with default parameters using analysis software such as BLAST and FASTA (hereinafter the same).
  • the “hybridizable polynucleotide” is, for example, a polynucleotide that is completely or partially complementary to the polynucleotide of (a1), and is within a range that binds to ⁇ -amylase. I just need it.
  • the hybridization can be detected by, for example, various hybridization assays.
  • the hybridization assay is not particularly limited, for example, Zanburuku (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) ,” [Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like can also be employed.
  • the “stringent conditions” may be, for example, any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • Medium stringent conditions are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C.
  • the degree of stringency can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, probe concentration and length, ionic strength, time, and the like.
  • “Stringent conditions” are, for example, Zanburuku previously described (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) ,” [Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989)] etc. may be employed.
  • the structural unit of the polynucleotide is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the polynucleotide is, for example, DNA composed of deoxyribonucleotide residues, DNA containing deoxyribonucleotide residues and ribonucleotide residues, and may further contain non-nucleotide residues.
  • the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule of the present invention is hereinafter also referred to as an ⁇ -amylase aptamer, for example.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of any of the above polynucleotides or a molecule containing the above polynucleotides.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, two or more of any of the polynucleotides as described later.
  • the two or more polynucleotides may have the same sequence or different sequences.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention may further have, for example, a linker and / or an additional sequence described later.
  • the linker is, for example, a sequence between polynucleotides
  • the additional sequence is, for example, a sequence added to the end.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides are linked to form a single-stranded polynucleotide.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides may be directly linked to each other or indirectly linked via a linker.
  • the polynucleotide sequences are preferably linked directly or indirectly at the respective ends.
  • the number of the sequences is not particularly limited, and is, for example, 2 or more, 2 to 20, 2 to 10, 2 or 3.
  • the length of the linker is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 bases, 1 to 20 bases, 3 to 12 bases, 5 to 9 bases.
  • the structural unit of the linker is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the linker is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues.
  • linker examples include polydeoxythymine (poly dT), polydeoxyadenine (poly dA), poly dAdT which is a repeating sequence of A and T, and preferably poly dT and poly dAdT.
  • the polynucleotide is preferably a single-stranded polynucleotide.
  • the single-stranded polynucleotide is preferably capable of forming a stem structure and a loop structure by, for example, self-annealing.
  • the polynucleotide is preferably capable of forming a stem loop structure, an internal loop structure, and / or a bulge structure, for example.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, double stranded.
  • one single-stranded polynucleotide includes the polynucleotide (a), and the other single-stranded polynucleotide is not limited.
  • the other single-stranded polynucleotide include a polynucleotide containing a base sequence complementary to the polynucleotide (a).
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention is double-stranded, it is preferably dissociated into a single-stranded polynucleotide by denaturation or the like prior to use.
  • the dissociated single-stranded polynucleotide (a) preferably has, for example, a stem structure and a loop structure as described above.
  • the stem structure and the loop structure can be formed means, for example, that the stem structure and the loop structure are actually formed, and even if the stem structure and the loop structure are not formed, the stem structure depending on the conditions. And the ability to form a loop structure.
  • a stem structure and a loop structure can be formed includes, for example, both experimental confirmation and prediction by a computer simulation.
  • the structural unit of the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention is, for example, a nucleotide residue.
  • the nucleotide residue include deoxyribonucleotide residue and ribonucleotide residue.
  • Examples of the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention include DNA composed only of deoxyribonucleotide residues, DNA containing one or several ribonucleotide residues, and the like. In the latter case, “one or several” is not particularly limited.
  • the polynucleotide for example, 1 to 91, 1 to 30, 1 to 15, 1 to 7, 1 to 3 One or two.
  • the polynucleotide may contain a natural base or a modified base as a base in a nucleotide residue.
  • the natural base is not particularly limited, and examples thereof include a purine base having a purine skeleton and a pyrimidine base having a pyrimidine skeleton.
  • the purine base is not particularly limited, and examples thereof include adenine (A) and guanine (G).
  • the pyrimidine base is not particularly limited, and examples thereof include cytosine (C), thymine (T), uracil (U), and the like, preferably cytosine (C) and thymine (T).
  • the site and number are not particularly limited.
  • the polynucleotide (a) has the modified base
  • the polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2 and 14 to 16 for example, a part or all of the underlined thymine is modified. It is a base.
  • the underlined thymine is a modified base
  • the modified base is preferably a modified thymine modified with a thymine base.
  • the modified base is, for example, a base modified with a modifying group.
  • the base modified by the modifying group is, for example, the natural base.
  • Examples of the natural base include purine base and pyrimidine base.
  • the modified base is not particularly limited, and examples thereof include modified adenine, modified guanine, modified cytosine, modified thymine, and modified uracil.
  • the modified base may be directly modified with the modifying group, or the modified base may be indirectly modified with the modifying group.
  • the modified base is modified with the modifying group via a linker.
  • the linker is not particularly limited.
  • the modification site of the base to be modified by the modifying group is not particularly limited.
  • the base is a purine base
  • examples of the purine base modification site include the 7th and 8th positions of the purine skeleton, with the 7th position being preferred.
  • the modification site of the purine base is at the 7-position, the 7-position nitrogen atom is preferably substituted with a carbon atom.
  • examples of the modification site of the pyrimidine base include the 5th and 6th positions of the pyrimidine skeleton, and the 5th position is preferable.
  • thymine has a methyl group at the carbon at the 5-position.
  • the modifying group may be bonded directly or indirectly to the carbon at the 5-position.
  • the modifying group may be bonded directly or indirectly to the carbon of the methyl group bonded to the carbon at the 5-position.
  • modified uracil or modified thymine when “ ⁇ O” is bonded to carbon at position 4 and a group other than “—CH 3 ” or “—H” is bonded to carbon at position 5, it is called modified uracil or modified thymine. Can do.
  • the modifying group is preferably an adenine residue. That is, in the modified purine base, for example, the base is modified with the adenine residue.
  • the site where the adenine residue modifies the base to be modified is not particularly limited, and includes an amino group that binds to the 6-position carbon of the adenine residue. It is done.
  • the modified base to be modified with the adenine residue is not particularly limited.
  • a purine base is preferable, and an atom at the 7-position of the purine base is preferably modified with the adenine residue.
  • the modifying group is preferably an adenine residue or a guanine residue. That is, in the modified base, for example, the base is modified with the adenine residue or guanine residue.
  • the site where the adenine residue modifies the base to be modified is not particularly limited, and examples thereof include an amino group that binds to the 6-position carbon in the adenine residue.
  • the site where the guanine residue modifies the base to be modified is not particularly limited, and examples thereof include an amino group that binds to the carbon at the 2-position of the guanine residue.
  • the modified base modified with the adenine residue or the guanine residue is not particularly limited. For example, thymine is preferable, and the carbon of the methyl group bonded to the carbon at the 5-position of thymine is the adenine residue or It is preferably modified with the guanine residue.
  • the modified base is preferably modified with the modifying group via the linker.
  • the linker is not particularly limited.
  • the linker is represented by a formula between the nucleotide residue and the adenine residue or the guanine residue as follows, but is not limited thereto.
  • the numerical value of n in (CH 2 ) n is, for example, 1 to 10, 2 to 10, or 2.
  • thymidine nucleotide residue modified with the guanine residue in the polynucleotide include, for example, a residue represented by the following chemical formula (10) (hereinafter, also referred to as “NG7 nucleotide residue”).
  • NG7 nucleotide residue a residue represented by the following chemical formula (10)
  • the present invention is not limited to this.
  • the underlined thymine is more preferably the nucleotide residue of NG7.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention has, for example, the nucleotide residue of NG7, for example, the nucleotide triphosphate (hereinafter referred to as “NG7 monomer”) represented by the chemical formula (4) is used for the synthesis of the polynucleotide.
  • NG7 monomer the nucleotide triphosphate
  • the monomer molecule binds to another nucleotide triphosphate through a phosphodiester bond. A method for producing the NG7 monomer will be described later.
  • Examples of the modifying group include a methyl group, a fluoro group, an amino group, a thio group, a benzylaminocarbonyl group, a tryptaminocarbonyl group, and an isobutylaminocarbonyl group. It is done.
  • modified adenine examples include, for example, 7′-deazaadenine.
  • modified guanine examples include, for example, 7′-deazaguanine.
  • modified cytosine examples include, for example, 5′-methylcytosine (5-Me-dC) and the like.
  • modified thymine examples include, for example, 5′-benzylaminocarbonylthymine, 5′-tryptaminocarbonylthymine, 5′-isobutylamino.
  • modified uracil examples include 5′-benzylaminocarbonyluracil (BndU), 5′-tryptaminocarbonyluracil (TrpdU), 5′-isobutylaminocarbonyluracil, and the like. It is done.
  • the exemplified modified uracil can also be referred to as a modified base of thymine.
  • the polynucleotide may contain, for example, only one of the modified bases or two or more kinds of the modified bases.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, a modified nucleotide.
  • the modified nucleotide may be a nucleotide having the modified base described above, a nucleotide having a modified sugar in which a sugar residue is modified, or a nucleotide having the modified base and the modified sugar.
  • the sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include deoxyribose residue or ribose residue.
  • the modification site in the sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include the 2'-position and the 4'-position of the sugar residue, and both of them may be modified.
  • Examples of the modifying group of the modified sugar include a methyl group, a fluoro group, an amino group, and a thio group.
  • the base when the base is a pyrimidine base, for example, the 2'-position and / or the 4'-position of the sugar residue is preferably modified.
  • Specific examples of the modified nucleotide residue include, for example, a 2′-methylated-uracil nucleotide residue and a 2′-methylated-cytosine nucleotide residue in which the deoxyribose residue or the 2 ′ position of the ribose residue is modified.
  • the number of the modified nucleotides is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100, 1 to 90, 1 to 80, 1 to 70 in the polynucleotide.
  • the modified nucleotides in the full length of the nucleic acid molecule including the polynucleotide are not particularly limited, and are, for example, 1 to 91 or 1 to 78 in the same range as described above.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, one or several artificial nucleic acid monomer residues.
  • the “one or several” is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 30, or 1 to 10 in the polynucleotide.
  • Examples of the artificial nucleic acid monomer residue include PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), ENA (2'-O, 4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids) and the like.
  • the nucleic acid in the monomer residue is the same as described above, for example.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention is preferably resistant to nucleases, for example.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention preferably has, for example, the modified nucleotide residue and / or the artificial nucleic acid monomer residue for nuclease resistance. Since the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention is nuclease resistant, for example, several tens of kDa PEG (polyethylene glycol) or deoxythymidine may be bound to the 5 ′ end or the 3 ′ end.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention may further have an additional sequence, for example.
  • the additional sequence is preferably bound to, for example, at least one of the 5 'end and the 3' end of the nucleic acid molecule, and more preferably the 3 'end.
  • the additional sequence is not particularly limited.
  • the length of the additional sequence is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 bases long, 1 to 50 bases long, 1 to 25 bases long, or 18 to 24 bases long.
  • the structural unit of the additional sequence is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the additional sequence is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues. Specific examples of the additional sequence include poly dT and poly dA.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention can be used, for example, immobilized on a carrier.
  • a carrier for example, either the 5 ′ end or the 3 ′ end is preferably immobilized, and more preferably the 3 ′ end.
  • the nucleic acid molecule may be immobilized directly or indirectly on the carrier. In the latter case, for example, it is preferable to immobilize via the additional sequence.
  • the production method of the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited, and can be synthesized by a genetic engineering method such as a nucleic acid synthesis method using chemical synthesis, or a known method.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention exhibits binding properties to the ⁇ -amylase.
  • the use of the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited as long as it uses the binding property to the ⁇ -amylase.
  • the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention can be used in various methods, for example, instead of the antibody against the ⁇ -amylase.
  • the sensor for analyzing ⁇ -amylase of the present invention is a sensor for analyzing ⁇ -amylase and is characterized in that it contains the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the ⁇ -amylase analysis sensor of the present invention is not particularly limited as long as it contains the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule of the present invention. If the ⁇ -amylase analysis sensor of the present invention is used, for example, the ⁇ -amylase can be detected by binding the ⁇ -amylase nucleic acid molecule and the ⁇ -amylase.
  • the description of the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule of the present invention can be cited.
  • the ⁇ -amylase analysis sensor of the present invention further has a carrier, for example, and the nucleic acid molecule is arranged on the carrier.
  • the nucleic acid molecule is preferably immobilized on the carrier.
  • the immobilization of the nucleic acid molecule on the carrier is, for example, as described above.
  • the method for using the sensor for analyzing ⁇ -amylase of the present invention is not particularly limited, and the description of the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention and the method for analyzing ⁇ -amylase of the present invention described later can be used.
  • the method for analyzing ⁇ -amylase of the present invention comprises a step of contacting a sample with a nucleic acid molecule and detecting ⁇ -amylase in the sample, wherein the nucleic acid molecule is the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection step the ⁇ -amylase in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and the ⁇ -amylase in the sample is detected by the binding.
  • the analysis method of the present invention is characterized by using the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the ⁇ -amylase analysis sensor of the present invention may be used as the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention.
  • the description of the method for analyzing ⁇ -amylase of the present invention for example, the description of the sensor for analyzing ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule and ⁇ -amylase of the present invention can be cited.
  • ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to ⁇ -amylase, for example, by detecting the binding between ⁇ -amylase and the nucleic acid molecule, ⁇ -amylase can be specifically detected. Specifically, for example, since the presence or absence of ⁇ -amylase or the amount of ⁇ -amylase in a sample can be analyzed, it can be said that qualitative or quantitative determination is possible.
  • the sample is not particularly limited.
  • examples of the sample include saliva, urine, plasma and serum.
  • the sample may be, for example, a liquid sample or a solid sample.
  • the sample is preferably a liquid sample because it is easy to contact with the nucleic acid molecule and is easy to handle.
  • a mixed solution, an extract, a dissolved solution, and the like may be prepared using a solvent and used.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and buffer solution.
  • the detection step includes, for example, a contact step of bringing the sample and the nucleic acid molecule into contact with each other to bind ⁇ -amylase and the nucleic acid molecule in the sample, and binding between the ⁇ -amylase and the nucleic acid molecule.
  • the detection step further includes, for example, a step of analyzing the presence or amount of ⁇ -amylase in the sample based on the result of the binding detection step.
  • the method for contacting the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the contact between the sample and the nucleic acid molecule is preferably performed in a liquid, for example.
  • the liquid is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and buffer solution.
  • the contact condition between the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the contact temperature is, for example, 4 to 37 ° C. or 18 to 25 ° C.
  • the contact time is, for example, 10 to 120 minutes or 30 to 60 minutes.
  • the nucleic acid molecule may be, for example, an immobilized nucleic acid molecule immobilized on a carrier or an unfixed free nucleic acid molecule.
  • the sample is contacted in a container.
  • the nucleic acid molecule is preferably, for example, the immobilized nucleic acid molecule because of its excellent handleability.
  • the carrier is not particularly limited, and examples thereof include a substrate, a bead, and a container. Examples of the container include a microplate and a tube.
  • the nucleic acid molecule is immobilized as described above, for example.
  • the binding detection step is a step of detecting binding between ⁇ -amylase in the sample and the nucleic acid molecule as described above.
  • detecting the presence or absence of binding between the two for example, the presence or absence of ⁇ -amylase in the sample can be analyzed (qualitative), and by detecting the degree of binding (binding amount) between the two, for example, The amount of ⁇ -amylase in the sample can be analyzed (quantified).
  • ⁇ -amylase is not present in the sample.
  • the ⁇ -amylase is detected in the sample. It can be determined that amylase is present.
  • the method for analyzing the binding between the ⁇ -amylase and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • a conventionally known method for detecting binding between substances can be adopted, and specific examples thereof include the SPR described above.
  • the detection of the binding may be, for example, detection of a complex of the ⁇ -amylase and the nucleic acid molecule.
  • the ⁇ -amylase detection kit of the present invention comprises the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention is only required to contain the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not limited. If the detection kit of the present invention is used, the ⁇ -amylase can be detected, for example, as described above.
  • the description of the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule, the ⁇ -amylase analysis sensor, and the ⁇ -amylase analysis method of the present invention can be incorporated into the ⁇ -amylase detection kit of the present invention.
  • the ⁇ -amylase detection kit of the present invention may include, for example, the ⁇ -amylase analysis sensor of the present invention as the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention.
  • the ⁇ -amylase detection kit of the present invention may contain other components in addition to the ⁇ -amylase nucleic acid molecule of the present invention, for example. Examples of the component include the carrier, buffer solution, and instruction manual.
  • C-reactive protein (CRP) -binding nucleic acid molecule (hereinafter also referred to as “CRP nucleic acid molecule”) of the present invention is characterized by comprising the following polynucleotide (c).
  • C a polynucleotide of (c1) below
  • c1 a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 4 to 7
  • the CRP nucleic acid molecule of the present invention for example, unless otherwise specified, “ ⁇ -amylase” as “CRP”, “(a)” as “(c)”, and “(a1)” as “(c1)”. “(A2)” to “(c2)”, “(a3)” to “(c3)”, “(a4)” to “(c4)”, “SEQ ID NOs: 2 and 14 to 16” To “SEQ ID NOs: 4 to 7”, the description of the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule, the ⁇ -amylase analysis sensor, the ⁇ -amylase analysis method, and the ⁇ -amylase detection kit of the present invention can be used. This also applies to the explanation of the CRP analysis sensor, the CRP analysis method, and the CRP detection kit described later.
  • the CRP nucleic acid molecule of the present invention can bind to CRP as described above.
  • the CRP is not particularly limited, and its origin includes, for example, humans and non-human animals. Examples of the non-human animal include mouse, rat, monkey, rabbit, dog, cat, horse, cow, pig and the like. Information on the amino acid sequence of human CRP is registered in, for example, UniProt (http://www.uniprot.org/) accession number P02741.
  • binding to CRP means, for example, having binding ability to CRP or having binding activity to CRP.
  • the binding between the CRP nucleic acid molecule of the present invention and the CRP can be determined, for example, by surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance molecular interaction
  • ProteON trade name, BioRad
  • the CRP nucleic acid molecule of the present invention binds to CRP, it can be used, for example, for detection of CRP.
  • the CRP nucleic acid molecule of the present invention includes the following polynucleotide (c).
  • CRP-binding nucleic acid molecule 1 (SEQ ID NO: 4) 5'-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGC T AG TT C T GCC TT AA T A T GG T CGG TT AAGCGCA TT CGACAGGC T GGACA T A T C-3 ' CRP-binding nucleic acid molecule 2 (SEQ ID NO: 5) 5'-CGCACATCAGTTTAGC T AG TT C T GCC TT AA T A T GG T CGG TT AAGCGCA-3 ' CRP-binding nucleic acid molecule 3 (SEQ ID NO: 6) 5'-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGG T C T GAAA T CGC TTT CCGGA T CGGAC TT AAGCA TT CGACAGGC T GGACA T A T C-3 ' CRP-binding nucleic acid molecule 4 (SEQ ID NO: 7) 5'-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGAC T CAAG TT
  • the polynucleotide (c) includes, for example, the meaning of the following polynucleotide (c2), (c3), or (c4).
  • C2 a polynucleotide consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in any one of the base sequences of (c1), and binding to CRP
  • C3 a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 80% or more identity to any one of the nucleotide sequences of c1) and binding to CRP (c4) against a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of (c1) above
  • a sensor for analyzing C-reactive protein (CRP) of the present invention is a sensor for analyzing C-reactive protein (CRP) and includes the CRP-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the sensor for CRP analysis of the present invention only needs to contain the CRP-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not limited. If the sensor for CRP analysis of the present invention is used, for example, the CRP can be detected by binding the CRP nucleic acid molecule and the CRP.
  • the description of the CRP-binding nucleic acid molecule of the present invention can be cited.
  • the method for using the CRP analysis sensor of the present invention is not particularly limited, and the description of the CRP nucleic acid molecule of the present invention and the CRP analysis method of the present invention described later can be used.
  • the method for analyzing C-reactive protein (CRP) of the present invention comprises a step of contacting a sample with a nucleic acid molecule and detecting C-reactive protein (CRP) in the sample, wherein the nucleic acid molecule is A CRP-binding nucleic acid molecule, wherein, in the detection step, CRP in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and CRP in the sample is detected by the binding.
  • the analysis method of the present invention is characterized by using the CRP nucleic acid molecule of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the CRP analysis sensor of the present invention may be used as the CRP nucleic acid molecule of the present invention.
  • the description of the CRP analysis method of the present invention for example, the description of the CRP-binding nucleic acid molecule of the present invention and the CRP analysis sensor can be cited.
  • a C-reactive protein (CRP) detection kit of the present invention comprises the CRP-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention only needs to contain the CRP-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not limited. If the detection kit of the present invention is used, for example, the CRP can be detected as described above.
  • the description of the CRP-binding nucleic acid molecule, the sensor for CRP analysis, and the CRP analysis method of the present invention can be cited.
  • BDN4A nucleic acid molecule The ⁇ -defensin (BDN) 4A-binding nucleic acid molecule of the present invention (hereinafter also referred to as “BDN4A nucleic acid molecule”) is characterized by comprising the following polynucleotide (b).
  • B a polynucleotide of the following (b1)
  • b1 a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 8 to 10
  • the BDN4A nucleic acid molecule of the present invention for example, unless otherwise specified, “ ⁇ -amylase” as “BDN4A”, “(a)” as “(b)”, and “(a1)” as “(b1)”. “(A2)” to “(b2)”, “(a3)” to “(b3)”, “(a4)” to “(b4)”, “SEQ ID NOS: 2 and 14 to 16” To “SEQ ID NOs: 8 to 10”, the description of the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule, the ⁇ -amylase analysis sensor, the ⁇ -amylase analysis method, and the ⁇ -amylase detection kit of the present invention can be used. This also applies to the description of the BDN4A analysis sensor, the BDN4A analysis method, and the BDN4A detection kit described later.
  • the BDN4A nucleic acid molecule of the present invention can bind to BDN4A as described above.
  • the BDN4A is not particularly limited, and examples of its origin include humans and non-human animals. Examples of the non-human animal include mouse, rat, monkey, rabbit, dog, cat, horse, cow, pig and the like. Information on the amino acid sequence of human BDN4A is registered in, for example, UniProt (http://www.uniprot.org/) accession number O15263.
  • binding to BDN4A means, for example, having binding ability to BDN4A or having binding activity to BDN4A.
  • the binding between the BDN4A nucleic acid molecule of the present invention and the BDN4A can be determined by, for example, surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance molecular interaction
  • ProteON trade name, BioRad
  • the BDN4A nucleic acid molecule of the present invention binds to BDN4A, it can be used, for example, for detection of BDN4A.
  • the BDN4A nucleic acid molecule of the present invention includes the following polynucleotide (b) as described above.
  • (b1) a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 8 to 10
  • BDN4A binding nucleic acid molecule 1 (SEQ ID NO: 8) 5'-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAAC T C T CCCCACC T GCA T C T CCCCCC T CACCGCC TT C T GCACGGAGAG T CGGAAA T C-3 '
  • BDN4A binding nucleic acid molecule 2 (SEQ ID NO: 9) 5'-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAAC T C T CCCCACC T GCA T C T CCCC T CACCGCC TT C T GCACGGAGAG T -3 '
  • BDN4A binding nucleic acid molecule 3 (SEQ ID NO: 10) 5'-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAAC T C T CCCCACC T GCA T C T CCCC T CACCGCC TT C T GCA-3 '
  • the polynucleotide (b) includes, for example, the meaning of the following polynucleotide (b2), (b3), or (b4).
  • B2 a polynucleotide consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in any one of the base sequences of (b1), and binding to BDN4A
  • B3 a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 80% or more identity to any of the nucleotide sequences of b1) and binding to BDN4A (b4) against a polynucleotide of any of the nucleotide sequences of (b1) above
  • the ⁇ -defensin (BDN) 4A analytical sensor of the present invention is a sensor for analyzing ⁇ -defensin (BDN) 4A, and includes the BDN4A-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the BDN4A analysis sensor of the present invention only needs to contain the BDN4A-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not limited.
  • the BDN4A analysis sensor of the present invention for example, the BDN4A can be detected by binding the BDN4A nucleic acid molecule and the BDN4A.
  • the description of the BDN4A-binding nucleic acid molecule of the present invention can be used.
  • the method of using the BDN4A analysis sensor of the present invention is not particularly limited, and the description of the BDN4A nucleic acid molecule of the present invention and the BDN4A analysis method of the present invention described later can be cited.
  • the method for analyzing ⁇ -defensin (BDN) 4A of the present invention comprises a step of contacting a sample with a nucleic acid molecule and detecting ⁇ -defensin (BDN) 4A in the sample, wherein the nucleic acid molecule is the present invention.
  • the BDN4A-binding nucleic acid molecule is characterized in that, in the detection step, BDN4A in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and BDN4A in the sample is detected by the binding.
  • the analysis method of the present invention is characterized by using the BDN4A nucleic acid molecule of the present invention, and the other steps and conditions are not particularly limited.
  • the BDN4A analysis sensor of the present invention may be used as the BDN4A nucleic acid molecule of the present invention.
  • the description of the BDN4A analysis method of the present invention for example, the description of the BDN4A-binding nucleic acid molecule of the present invention and the BDN4A analysis sensor can be cited.
  • the ⁇ -defensin (BDN) 4A detection kit of the present invention comprises the BDN4A-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention only needs to contain the BDN4A-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not limited. If the detection kit of the present invention is used, for example, the detection of BDN4A can be performed as described above.
  • the BDN4A detection kit of the present invention can use the description of the BDN4A-binding nucleic acid molecule of the present invention, the BDN4A analysis sensor, and the analysis method of BDN4A.
  • the lysozyme-binding nucleic acid molecule of the present invention (hereinafter also referred to as “lysozyme nucleic acid molecule”) is characterized by including the following polynucleotide (l).
  • L a polynucleotide of (l1) below
  • l1 a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 11 and 12
  • the lysozyme nucleic acid molecule of the present invention is, for example, “ ⁇ -amylase” as “lysozyme”, “(a)” as “(l)”, and “(a1)” as “(l1)” unless otherwise specified. “(A2)” is changed to “(l2)”, “(a3)” is changed to “(l3)”, “(a4)” is changed to “(l4)”, “SEQ ID NOs: 2 and 14 to 16” Can be read as “SEQ ID NOs: 11 and 12”, and the description of the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule, the ⁇ -amylase analysis sensor, the ⁇ -amylase analysis method, and the ⁇ -amylase detection kit of the present invention can be used. This also applies to the description of the lysozyme analysis sensor, the lysozyme analysis method, and the lysozyme detection kit described later.
  • the lysozyme nucleic acid molecule of the present invention can bind to lysozyme as described above.
  • the lysozyme is not particularly limited, and its origin includes, for example, humans and non-human animals. Examples of the non-human animal include mouse, rat, monkey, rabbit, dog, cat, horse, cow, pig and the like. Information on the amino acid sequence of human lysozyme is registered in, for example, UniProt (http://www.uniprot.org/) accession number P61626.
  • binding to lysozyme means, for example, having binding ability to lysozyme or having binding activity to lysozyme.
  • the binding between the lysozyme nucleic acid molecule of the present invention and the lysozyme can be determined by, for example, surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance molecular interaction
  • ProteON trade name, BioRad
  • the lysozyme nucleic acid molecule of the present invention binds to lysozyme, it can be used, for example, for detection of lysozyme.
  • the lysozyme nucleic acid molecule of the present invention comprises the following polynucleotide (1).
  • Lysozyme-binding nucleic acid molecule 1 (SEQ ID NO: 11) 5'-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACCGCC T GC TT CA TT C T A T CC T GAAC T CAC T AC TT C T GCACGGAGAG T CGGAAA T C-3 ' Lysozyme-binding nucleic acid molecule 2 (SEQ ID NO: 12) 5'-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACCGCC T GC TT CA TT C T A T CC T GAAC T CAC T AC TT C T GCACGG-3 '
  • the polynucleotide (l) includes, for example, the meaning of the following polynucleotide (l2), (l3), or (l4).
  • (L2) a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of (l1), wherein one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added, and which binds to lysozyme
  • (l3) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 80% or more identity to any one of the nucleotide sequences of l1) and binding to lysozyme (14)
  • the sensor for analyzing lysozyme of the present invention is a sensor for analyzing lysozyme, characterized in that it contains the lysozyme-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the sensor for lysozyme analysis of the present invention only needs to contain the lysozyme-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • the lysozyme analysis sensor of the present invention for example, the lysozyme can be detected by binding the lysozyme nucleic acid molecule and the lysozyme.
  • the description of the lysozyme-binding nucleic acid molecule of the present invention can be cited.
  • the method of using the lysozyme analysis sensor of the present invention is not particularly limited, and the description of the lysozyme nucleic acid molecule of the present invention and the lysozyme analysis method of the present invention described later can be cited.
  • the method for analyzing lysozyme of the present invention comprises a step of contacting a sample with a nucleic acid molecule and detecting lysozyme in the sample, wherein the nucleic acid molecule is the lysozyme-binding nucleic acid molecule of the present invention, and in the detection step
  • the lysozyme in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and the lysozyme in the sample is detected by the binding.
  • the analysis method of the present invention is characterized by using the lysozyme nucleic acid molecule of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the lysozyme analysis sensor of the present invention may be used as the lysozyme nucleic acid molecule of the present invention.
  • the description of the lysozyme analysis method of the present invention for example, the description of the lysozyme-binding nucleic acid molecule of the present invention and the lysozyme analysis sensor can be cited.
  • the lysozyme detection kit of the present invention comprises the lysozyme-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention only needs to contain the lysozyme-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited. If the detection kit of the present invention is used, for example, the lysozyme can be detected as described above.
  • the description of the lysozyme-binding nucleic acid molecule, the lysozyme analysis sensor, and the lysozyme analysis method of the present invention can be cited.
  • LDH5 nucleic acid molecule The lactate dehydrogenase (LDH) 5-binding nucleic acid molecule (hereinafter also referred to as “LDH5 nucleic acid molecule”) of the present invention is characterized by comprising the following polynucleotide (d).
  • d polynucleotide of (d1) below
  • d1 a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 17 to 23
  • LDH5 nucleic acid molecule of the present invention for example, unless otherwise specified, “ ⁇ -amylase” as “LDH5”, “(a)” as “(d)”, and “(a1)” as “(d1)”.
  • “(A2)” to “(d2)”, “(a3)” to “(d3)”, “(a4)” to “(d4)”, “SEQ ID NOS: 2 and 14 to 16” Can be read as “SEQ ID NOs: 17 to 23”, and the description of the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule, the ⁇ -amylase analysis sensor, the ⁇ -amylase analysis method, and the ⁇ -amylase detection kit of the present invention can be used. This also applies to the description of the LDH5 analysis sensor, the LDH5 analysis method, and the LDH5 detection kit described later.
  • the LDH5 nucleic acid molecule of the present invention can bind to LDH5 as described above.
  • the LDH5 is not particularly limited, and examples of its origin include humans and non-human animals. Examples of the non-human animal include mouse, rat, monkey, rabbit, dog, cat, horse, cow, pig and the like. Information on the amino acid sequence of human LDH5 is registered in, for example, UniProt (http://www.uniprot.org/) accession number P00338.
  • binding to LDH5 also means, for example, having a binding ability to LDH5 or having a binding activity to LDH5.
  • the binding between the LDH5 nucleic acid molecule of the present invention and the LDH5 can be determined, for example, by surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance molecular interaction
  • ProteON trade name, BioRad
  • the LDH5 nucleic acid molecule of the present invention binds to LDH5, it can be used, for example, for detection of LDH5.
  • the LDH5 nucleic acid molecule of the present invention comprises the following polynucleotide (d).
  • LDH5-binding nucleic acid molecule 1 (SEQ ID NO: 17) 5'-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGCC T CCGC TT G T GGA T ACGA T GGAC T AG T GGCC T AAGGC T GGC T GGC T AC T A T AC-3 ' LDH5-binding nucleic acid molecule 2 (SEQ ID NO: 18) 5'-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGACC TT AGACACGG T AC TT ACCGACAC T AAACC T AAGGC T GGC T GGC T A T AC-3 ' LDH5-binding nucleic acid molecule 3 (SEQ ID NO: 19) 5'-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATG TT AGA T AC TT GGC T C T AC TT A TT GACAA T CCC T AAGGC T GGC T GGC T AC T A T AC-3 ' LDH5-binding nucleic acid molecule 4 (SEQ ID NO: 20) 5
  • the polynucleotide (d) includes, for example, the meaning of the following polynucleotide (d2), (d3), or (d4).
  • D2 a polynucleotide consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in any one of the base sequences of (d1), and binding to LDH5
  • d3 a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 80% or more identity to any nucleotide sequence of d1), and binding to LDH5 (d4) against a polynucleotide comprising any nucleotide sequence of (d1) above
  • the LDH5 analysis sensor of the present invention is an LDH5 analysis sensor, and includes the LDH5-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the LDH5 analysis sensor of the present invention only needs to contain the LDH5-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • the LDH5 analysis sensor of the present invention can be detected by binding the LDH5 nucleic acid molecule and the LDH5.
  • the description of the LDH5-binding nucleic acid molecule of the present invention can be cited.
  • the method of using the LDH5 analysis sensor of the present invention is not particularly limited, and the description of the LDH5 nucleic acid molecule of the present invention and the later-described analysis method of LDH5 of the present invention can be cited.
  • the method for analyzing LDH5 of the present invention comprises a step of contacting a sample with a nucleic acid molecule and detecting LDH5 in the sample, wherein the nucleic acid molecule is the LDH5-binding nucleic acid molecule of the present invention, and in the detection step, , LDH5 in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and LDH5 in the sample is detected by the binding.
  • the analysis method of the present invention is characterized by using the LDH5 nucleic acid molecule of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the LDH5 analysis sensor of the present invention may be used as the LDH5 nucleic acid molecule of the present invention.
  • the description of the LDH5 analysis method of the present invention for example, the description of the LDH5-binding nucleic acid molecule of the present invention and the LDH5 analysis sensor can be cited.
  • the LDH5 detection kit of the present invention comprises the LDH5-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention only needs to contain the LDH5-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited. If the detection kit of the present invention is used, the LDH5 can be detected, for example, as described above.
  • the description of the LDH5-binding nucleic acid molecule, the LDH5 analysis sensor, and the LDH5 analysis method of the present invention can be cited.
  • CgA nucleic acid molecule The chromogranin A (CgA) -binding nucleic acid molecule (hereinafter also referred to as “CgA nucleic acid molecule”) of the present invention is characterized by including the following polynucleotide (g).
  • G a polynucleotide of the following (g1)
  • g1 a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 24-33
  • the CgA5 nucleic acid molecule of the present invention is, for example, “ ⁇ -amylase” as “CgA”, “(a)” as “(g)”, and “(a1)” as “(g1)” unless otherwise specified.
  • “(A2)” to “(g2)”, “(a3)” to “(g3)”, “(a4)” to “(g4)”, “SEQ ID NOs: 2 and 14 to 16” Can be read as “SEQ ID NOs: 24-33”, and the description of the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule, ⁇ -amylase analysis sensor, ⁇ -amylase analysis method, and ⁇ -amylase detection kit of the present invention can be used. This also applies to the description of the CgA analysis sensor, the CgA analysis method, and the CgA detection kit described later.
  • the CgA nucleic acid molecule of the present invention can bind to CgA as described above.
  • the CgA is not particularly limited, and its origin includes, for example, humans and non-human animals. Examples of the non-human animal include mouse, rat, monkey, rabbit, dog, cat, horse, cow, pig and the like. Information on the amino acid sequence of human CgA is registered, for example, in UniProt (http://www.uniprot.org/) accession number P10645.
  • binding to CgA is, for example, also referred to as having binding ability to CgA or having binding activity to CgA.
  • the binding between the CgA nucleic acid molecule of the present invention and the CgA can be determined by, for example, surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance molecular interaction
  • ProteON trade name, BioRad
  • the CgA nucleic acid molecule of the present invention binds to CgA, it can be used, for example, for detection of CgA.
  • the CgA nucleic acid molecule of the present invention includes the following polynucleotide (g).
  • g polynucleotide of the following (g1)
  • g1 a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 24-33
  • CgA binding nucleic acid molecule 1 (SEQ ID NO: 24) 5'-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGAACG T GC T AAG TT CCCCG TT G T GCGCGC T GG T GAAGAACCCGC T CA TT GGAA TT G-3 ' CgA-binding nucleic acid molecule 2 (SEQ ID NO: 25) 5'-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAG TT C T G T C T CCCCGCC T CCC T ACCCCGAAACG T GAAGAACCCGC T CA TT GGAA TT G-3 ' CgA binding nucleic acid molecule 3 (SEQ ID NO: 26) 5'-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGCGCA T CA T AC TT G T CCCCCGACAGC T CGCAG T GAAGAACCCGC T CA TT GGAA TT G-3 ' CgA binding nucleic acid molecule 4 (SEQ ID NO: 27) 5'
  • the polynucleotide (g) includes, for example, the meaning of the following polynucleotide (g2), (g3), or (g4).
  • G2 a polynucleotide consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in any one of the base sequences of (g1), and binding to CgA
  • g3 a polynucleotide consisting of a base sequence having 80% or more identity to any of the base sequences of g1) and binding to CgA (g4) against a polynucleotide of any of the base sequences of (g1) above
  • the CgA analysis sensor of the present invention is a CgA analysis sensor, characterized by comprising the CgA-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the CgA analysis sensor of the present invention only needs to contain the CgA-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited. If the CgA analysis sensor of the present invention is used, for example, the CgA can be detected by binding the CgA nucleic acid molecule and the CgA.
  • the description of the CgA-binding nucleic acid molecule of the present invention can be cited for the CgA analysis sensor of the present invention.
  • the method for using the CgA analysis sensor of the present invention is not particularly limited, and the description of the CgA nucleic acid molecule of the present invention and the CgA analysis method of the present invention described later can be used.
  • the CgA analysis method of the present invention includes a step of contacting a sample with a nucleic acid molecule and detecting CgA in the sample, wherein the nucleic acid molecule is the CgA-binding nucleic acid molecule of the present invention, and in the detection step, The CgA in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and the CgA in the sample is detected by the binding.
  • the analysis method of the present invention is characterized by using the CgA nucleic acid molecule of the present invention, and other processes and conditions are not particularly limited.
  • the CgA analysis sensor of the present invention may be used as the CgA nucleic acid molecule of the present invention.
  • the description of the CgA analysis method of the present invention for example, the description of the CgA-binding nucleic acid molecule of the present invention and the CgA analysis sensor can be cited.
  • the CgA detection kit of the present invention comprises the CgA-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention only needs to contain the CgA-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited. If the detection kit of the present invention is used, for example, the detection of CgA can be performed as described above.
  • the CgA detection kit of the present invention can use the description of the CgA-binding nucleic acid molecule, the sensor for CgA analysis, and the CgA analysis method of the present invention.
  • the interleukin (IL) -6 binding nucleic acid molecule of the present invention (hereinafter also referred to as “IL-6 nucleic acid molecule”) is characterized by comprising the following polynucleotide (i). (I) a polynucleotide of the following (i1) (i1) a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 34 to 35
  • IL-6 nucleic acid molecule of the present invention for example, unless otherwise specified, “ ⁇ -amylase” as “IL-6”, “(a)” as “(i)”, “(a1)” as “ (I1) ”,“ (a2) ”in“ (i2) ”,“ (a3) ”in“ (i3) ”,“ (a4) ”in“ (i4) ”,“ SEQ ID NO: 2 and 14-16 ”is replaced with“ SEQ ID NOs: 34-35 ”, and the description of the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule, ⁇ -amylase analysis sensor, ⁇ -amylase analysis method, and ⁇ -amylase detection kit of the present invention is used. it can. This also applies to the IL-6 analysis sensor, IL-6 analysis method, and IL-6 detection kit described later.
  • the IL-6 nucleic acid molecule of the present invention can bind to IL-6 as described above.
  • the IL-6 is not particularly limited, and examples of its origin include humans and non-human animals. Examples of the non-human animal include mouse, rat, monkey, rabbit, dog, cat, horse, cow, pig and the like. Information on the amino acid sequence of human IL-6 is registered in, for example, UniProt (http://www.uniprot.org/) accession number P05231.
  • binding to IL-6 means, for example, having a binding ability to IL-6 or having a binding activity to IL-6.
  • the binding between the IL-6 nucleic acid molecule of the present invention and the IL-6 can be determined, for example, by surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance molecular interaction
  • ProteON trade name, BioRad
  • the IL-6 nucleic acid molecule of the present invention binds to IL-6, it can be used, for example, for detection of IL-6.
  • the IL-6 nucleic acid molecule of the present invention comprises the following polynucleotide (i).
  • i1 a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 34 to 35
  • the polynucleotide (i) includes, for example, the meaning of the following polynucleotide (i2), (i3), or (i4).
  • (I2) a polynucleotide consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in any one of the base sequences of (i1), and binding to IL-6 (i3) It consists of a base sequence having 80% or more identity to any base sequence of (i1) above, and a polynucleotide that binds to IL-6 (i4) consisting of any base sequence of (i1) above
  • a polynucleotide comprising a base sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide and binding to IL-6
  • the IL-6 analysis sensor of the present invention is an IL-6 analysis sensor, characterized by comprising the IL-6-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the sensor for IL-6 analysis of the present invention only needs to contain the IL-6 binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • the IL-6 analysis sensor of the present invention is used, for example, the IL-6 can be detected by binding the IL-6 nucleic acid molecule and the IL-6.
  • the description of the IL-6-binding nucleic acid molecule of the present invention can be cited.
  • the method for using the IL-6 analysis sensor of the present invention is not particularly limited, and the description of the IL-6 nucleic acid molecule of the present invention and the IL-6 analysis method of the present invention described later can be used.
  • the method for analyzing IL-6 of the present invention comprises a step of contacting a sample with a nucleic acid molecule and detecting IL-6 in the sample, wherein the nucleic acid molecule is the IL-6-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection step IL-6 in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and IL-6 in the sample is detected by the binding.
  • the analysis method of the present invention is characterized by using the IL-6 nucleic acid molecule of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the IL-6 analysis sensor of the present invention may be used as the IL-6 nucleic acid molecule of the present invention.
  • the description of the IL-6 analysis method of the present invention for example, the description of the sensor for analysis of IL-6 binding nucleic acid molecule of the present invention and IL-6 can be cited.
  • the IL-6 detection kit of the present invention comprises the IL-6 binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention only needs to contain the IL-6 binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited. If the detection kit of the present invention is used, for example, the detection of IL-6 can be performed as described above.
  • the description of the IL-6-binding nucleic acid molecule, the sensor for analyzing IL-6, and the analysis method of IL-6 of the present invention can be cited.
  • Electrospray ionization mass spectrometry was performed in positive ion mode or negative ion mode using a mass spectrometer (API2000, sold by Applied Biosystems).
  • 1 H NMR spectrum was acquired using a nuclear magnetic resonance apparatus (JNM-ECS400, manufactured by JEOL).
  • JNM-ECS400 nuclear magnetic resonance apparatus
  • the chemical shift is expressed as a relative value ⁇ (ppm) with respect to tetramethylsilane (Me 4 Si) which is an internal standard.
  • the ion exchange chromatograph was performed using a chromatographic system (ECONO system, manufactured by Bio-Rad). In the ion exchange chromatograph, a glass column ( ⁇ 25 ⁇ 500 mm) packed with diethylaminoethyl (DEAE) A-25-Sephadex (Amershambiosciences) was used.
  • NG1 (870 mg, 5.10 ⁇ 10 ⁇ 3 mol) and NH1 (3.281 g, 2.05 ⁇ 10 ⁇ 2 mol, 4 eq.) Were vacuum-dried and then replaced with Ar. NG1 was suspended in Methoxyethanol (5 mL), and NH1 was dissolved in Methoxyethanol (1 mL). The obtained NH1 solution was transferred to an eggplant flask containing NG1 and refluxed at 130 ° C. to carry out the reaction. After the reaction, the temperature was returned to room temperature and distilled off under reduced pressure. Furthermore, after reprecipitating with chloroform, suction filtration was performed, and the filtrate was collected to obtain NG2. The physical property values of NG2 are shown below.
  • NG2 (500 mg, 1.70 ⁇ 10 ⁇ 3 mol) was suspended in methanol (3 mL), trifluoroacetate (15 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for reaction. After the reaction, the reaction mixture was distilled off under reduced pressure, suspended in Ether, suction filtered, and the filtrate was collected to obtain NG3.
  • the physical property values of NG3 are shown below.
  • NG4 was obtained by collect
  • NG4 (101 mg, 2.13 ⁇ 10 ⁇ 4 mol) was vacuum-dried and then azeotroped twice with dry-pyridine (30 mL) under Ar. Next, after suspending in dry-trimetyl phosphate (21 mL), Phosphoryl chloride (400 ⁇ L, 4.29 ⁇ 10 ⁇ 3 mol, 20 eq.) was added in an ice bath and stirred for 2.5 hours. After the stirring, Phosphoryl chloride (200 ⁇ L, 2.15 ⁇ 10 ⁇ 3 mol, 10 eq.) was added and stirred for 8.5 hours. Thereafter, 10 mL of cold water was added to quench, and the mixture was stirred for 10 minutes.
  • TEA triethylamine, 2.7 mL, 1.94 ⁇ 10 ⁇ 2 mol, 90 eq.
  • Ether and MeCN acetonitrile
  • NG5 (78.65 ⁇ mol) was vacuum-dried, then azeotroped three times with dry-pyridine (5 mL), and further vacuum-dried overnight. After the drying, this was replaced with Ar, dissolved in dry-DMF (2 mL) and dry-TEA (72 ⁇ L, 5.19 ⁇ 10 ⁇ 4 mol, 4 eq.), And further, imidazole (24 mg, 3.53 ⁇ 10 6). -4 mol, 4 eq.), 2,2'-Dithiodipyridine (29 mg, 1.32 x 10 -4 mol, 1.6 eq.), And Triphenylphosphine (36 mg, 1.37 x 10 -4 mol, 1.6 eq.).
  • Example 2 It was confirmed that a binding nucleic acid molecule that binds to sIgA and a binding nucleic acid molecule that binds to human ⁇ -amylase can be obtained using NG7.
  • Binding nucleic acid molecule In addition to deoxyribonucleotides containing adenine, guanine, or cytosine (respectively dATP, dGTP, and dCTP), except that candidate polynucleotides prepared using NG7 as deoxyribonucleotides were used to target by SELEX method Binding nucleic acid molecules for were obtained. Specifically, sIgA (MP Biomedicals, LLC-Cappel Products) or human salivary amylase (Lee BioSolutions, Inc.), which is the target for beads (Dynabeads MyOne Carboxylic Acid, Invitrogen), is based on the attached protocol. And combined.
  • sIgA MP Biomedicals, LLC-Cappel Products
  • human salivary amylase Lee BioSolutions, Inc.
  • Target beads were prepared.
  • Complementary strand (forward (Fw) primer region-N30 (30 bases) -reverse (Rv) primer region) modified with biotin at the 5 'end, forward primer and DNA polymerase (KOD Dash, manufactured by Toyobo Co., Ltd.), dATP, dGTP , DCDNA and NG7 were used to prepare dsDNA in which NG7 was inserted.
  • ss (single strand) DNA was eluted with 0.02 mol / L NaOH aqueous solution.
  • the library of ssDNA was prepared by neutralizing with 0.08 mol / L hydrochloric acid aqueous solution.
  • a 20 pmol library was mixed with 250 ⁇ g of the target beads at 25 ° C. for 15 minutes, and then the beads were washed with the SB buffer. Then, the bead-bound ssDNA was eluted with a 7 mol / L urea aqueous solution.
  • the eluted ssDNA was amplified by PCR using the forward primer and the biotin-modified reverse primer.
  • deoxyribonucleotides containing thymine (dTTP), dATP, dGTP, and dCTP were used as deoxyribonucleotides.
  • NG7 was inserted by the above-described method using the magnetic beads having the complementary strand immobilized thereon, a forward primer and a DNA polymerase (KOD Dash, manufactured by Toyobo Co., Ltd.), dATP, dGTP, dCTP, and NG7.
  • dsDNA was prepared.
  • a library of ssDNA was prepared by eluting the forward strand with 0.02 mol / L NaOH aqueous solution, and this library was used in the next round.
  • PCR was performed using a forward primer and a reverse primer not modified with biotin after selection of a bound nucleic acid molecule that binds to sIgA or amylase. Then, the obtained nucleic acid molecules were sequenced by a sequencer (GS junior sequencer, manufactured by Roche).
  • a binding nucleic acid molecule having the base sequence of SEQ ID NO: 1 was obtained as a binding nucleic acid molecule to sIgA
  • a binding nucleic acid molecule having the base sequence of SEQ ID NO: 2 was obtained as a binding nucleic acid molecule to amylase.
  • T indicated by an underline is NG7.
  • sIgA binding nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 1) 5'-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATC T GC T GA T G TTT G T A TTT CAAA TT AGCCGCAGAAAC T ACAA T GGGCGGGC TT A T C-3 ' ⁇ -Amylase-binding nucleic acid molecule 1 (SEQ ID NO: 2) 5'-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCCG TT G TTT CAACAGCAAA T G TT AGGCAA TT GAAAC T ACAA T GGGCGGGC TT A T C-3 '
  • FIG. 1 shows the result of binding between the sIgA-binding nucleic acid molecule and sIgA
  • FIG. 2 shows the result of binding between the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule 1 and amylase.
  • FIG. 1 is a graph showing the binding ability of the sIgA-binding nucleic acid molecule to sIgA.
  • the horizontal axis represents the elapsed time after the ligand was injected
  • the vertical axis represents the relative value (RU) of the binding force.
  • the sIgA-binding nucleic acid molecule did not bind to BSA but bound to sIgA.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding ability of the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule 1 to amylase.
  • the horizontal axis indicates the elapsed time after the ligand is injected, and the vertical axis indicates the relative value (RU) of the binding force.
  • the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule 1 did not bind to BSA but bound to ⁇ -amylase.
  • NG7 which is a nucleoside derivative of the present invention.
  • the sIgA-binding nucleic acid molecule having 20-base polyA added to the 3 ′ end is used, and the concentration of sIgA as an analyte is 12.5, 25, 50, 100, Alternatively, the relative value (RU) of the binding force was measured in the same manner as (2) except that the concentration was 200 nmol / L.
  • the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule 1 having 20 base length polyA added to the 3 ′ end is used, and the concentration of the analyte ⁇ -amylase is 5, 10, 20, 40, or 80 nmol.
  • the relative value (RU) of the binding force was measured in the same manner as (2) except that / L was used. Then, based on the relative value (RU) of the binding force, the dissociation constant between the sIgA-binding nucleic acid molecule and sIgA and the dissociation constant between the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule 1 and the ⁇ -amylase were calculated. As a result, the dissociation constant between the sIgA-binding nucleic acid molecule and the sIgA was 11.8 nM, and the dissociation constant between the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule 1 and the ⁇ -amylase was 0.69 nM. From these results, it was found that any binding nucleic acid molecule has an extremely excellent ability to bind to a target.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of capillary electrophoresis.
  • the left side of the photograph shows the migration time, and each lane shows the results with control (without ⁇ -amylase) and with ⁇ -amylase from the left.
  • the electrophoretic time was longer in the case of ⁇ -amylase compared to the control without ⁇ -amylase. From these results, it was found that the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule 1 binds to ⁇ -amylase.
  • binding beads A and B1 are mixed with SB buffer containing saliva (saliva sample) or SB buffer containing sIgA or ⁇ -amylase (target sample), respectively, at room temperature (around 25 ° C.) for 60 minutes. Shake at 1000 rpm.
  • the binding beads A and B1 after shaking were washed with the SB buffer three times.
  • the sIgA and amylase bound to the binding beads A and B1 were eluted by treatment at 95 ° C. for 10 minutes in the presence of SDS buffer.
  • the composition of the SDS buffer was 62.5 mmol / L Tris, 2% SDS, 5% sucrose, 0.002% bromophenol blue, 1% 2-mercaptoethanol.
  • the obtained eluate was loaded onto a gel (PAGEEL C50L, manufactured by ATTO) and subjected to electrophoresis in the presence of an electrophoresis buffer.
  • the composition of the electrophoresis buffer was 25 mmol / L Tris, 192 mmol / L glycine, and 0.1% SDS.
  • the gel after electrophoresis was stained with a staining agent (Gel Code, manufactured by Thermo SCIENTIFIC, catalog number: # 24594), and photographed with ChemiDoc (BioRad).
  • Control 1 is the same except that a nucleic acid molecule (control nucleic acid molecule 1) that does not bind to biotin-modified ⁇ -amylase at the 5 ′ end is used, and control 2 uses only sIgA or only ⁇ -amylase. I took the photo in the same way except that.
  • Control nucleic acid molecule 1 SEQ ID NO: 3 5'-GGATACCTTAACGCCGCCTATTG-3 '
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of pull-down using the binding beads A.
  • (A) shows the result of the saliva sample
  • (B) shows the result of the target sample.
  • the number on the left side of the photograph indicates the molecular weight, and in each lane, from the left, the molecular weight marker (M), the saliva sample (1), the control 1 (C1), and the control 2 (IgA) Indicates.
  • the number on the left side of the photograph indicates the molecular weight, and each lane from the left is the molecular weight marker (M), the target sample (1), the control 1 (C1), and the control 2 ( IgA).
  • M molecular weight marker
  • FIG. 5 is a photograph showing the result of pull-down using the binding bead B1.
  • the number on the left side of the photograph indicates the molecular weight, and each lane indicates the molecular weight marker (M), the saliva sample (4), the control 1 (C1), and the control 2 (AMY) from the left.
  • M molecular weight marker
  • C1 control 1
  • AMY control 2
  • Example 3 Using NG7, it was confirmed that binding nucleic acid molecules that bind to human CRP, human ⁇ -defensin 4A, and binding nucleic acid molecules that bind to human lysozyme can be obtained.
  • Binding nucleic acid molecule A binding nucleic acid molecule that binds to human CRP, a binding nucleic acid molecule that binds to human ⁇ -defensin 4A, and a binding nucleic acid molecule that binds to human lysozyme are replaced with human CRP (Acris Antibodies) instead of sIgA as a target.
  • human CRP Acris Antibodies
  • GmBH catalog number: # P100-0
  • human ⁇ -defensin 4A Novoprotein Scientific Inc., catalog number: # C127
  • human lysozyme Novoprotein Scientific Inc., catalog number: # P61626
  • a binding nucleic acid molecule that binds to CRP a binding nucleic acid molecule having the base sequence of SEQ ID NOs: 4 to 7 shown below is obtained.
  • a binding nucleic acid molecule that binds to ⁇ -defensin (BDN) 4A As the binding nucleic acid molecule consisting of the base sequence to the lysozyme, the binding nucleic acid molecule consisting of the base sequences of SEQ ID NOS: 11 and 12 below was obtained.
  • T shown by the underline is NG7.
  • CRP-binding nucleic acid molecule 1 (SEQ ID NO: 4) 5'-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGC T AG TT C T GCC TT AA T A T GG T CGG TT AAGCGCA TT CGACAGGC T GGACA T A T C-3 ' CRP-binding nucleic acid molecule 2 (SEQ ID NO: 5) 5'-CGCACATCAGTTTAGC T AG TT C T GCC TT AA T A T GG T CGG TT AAGCGCA-3 ' CRP-binding nucleic acid molecule 3 (SEQ ID NO: 6) 5'-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGG T C T GAAA T CGC TTT CCGGA T CGGAC TT AAGCA TT CGACAGGC T GGACA T A T C-3 ' CRP-binding nucleic acid molecule 4 (SEQ ID NO: 7) 5'-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGAC T CAAG TT
  • ⁇ -amylase and bovine serum albumin BSA
  • BSA bovine serum albumin
  • FIG. 6 shows the result of binding between each CRP-binding nucleic acid molecule and CRP
  • FIG. 7 shows the result of binding between each BDN4A-binding nucleic acid molecule and BDN4A
  • FIG. 8 shows the result of binding between each lysozyme-binding nucleic acid molecule and lysozyme. Show.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding ability of each CRP-binding nucleic acid molecule to CRP.
  • (A) to (D) show the results of the CRP-binding nucleic acid molecules 1 to 4, respectively.
  • the horizontal axis represents the elapsed time after the ligand was injected, and the vertical axis represents the relative value (RU) of the binding force.
  • each CRP-binding nucleic acid molecule did not bind to ⁇ -amylase and BSA, but bound to CRP.
  • FIG. 7 is a graph showing the binding ability of each BDN4A-binding nucleic acid molecule to BDN4A.
  • (A) to (C) show the results of the BDN4A-binding nucleic acid molecules 1 to 3, respectively.
  • the horizontal axis indicates the elapsed time after the ligand is injected, and the vertical axis indicates the relative value (RU) of the binding force.
  • the BDN4A-binding nucleic acid molecule did not bind to ⁇ -amylase and BSA, but bound to BDN4A.
  • FIG. 8 is a graph showing the binding ability of each lysozyme-binding nucleic acid molecule to lysozyme.
  • (A) and (B) show the results of the lysozyme-binding nucleic acid molecules 1 and 2, respectively.
  • the horizontal axis indicates the elapsed time after the ligand is injected, and the vertical axis indicates the relative value (RU) of the binding force.
  • the lysozyme-binding nucleic acid molecule did not bind to ⁇ -amylase and BSA, but bound to lysozyme.
  • NG7 which is the nucleoside derivative of the present invention.
  • each CRP-binding nucleic acid molecule having a 20-base polyA added to the 3 ′ end was used, and the concentration of CRP as an analyte was 1.25, 2.5, 5,
  • the relative value (RU) of the binding force was measured in the same manner as in Example 3 (2) except that the amount was 10, 20 nmol / L, 50, 100, 200, 400, or 800 nmol / L.
  • each BDN4A-binding nucleic acid molecule having a 20-base polyA added to the 3 ′ end was used, and the concentration of BDN4A as an analyte was 100, 200, 400, 800, or 1600 nmol / L.
  • each lysozyme-binding nucleic acid molecule having 20 base length polyA added to the 3 ′ end is used, and the concentration of lysozyme as an analyte is 12.5, 25, 50, 100, or 200 nmol / L, or The relative value (RU) of the binding force was measured in the same manner as in Example 3 (2) except that the amount was 3.125, 6.25, or 12.5 nmol / L.
  • CRP binding nucleic acid molecule binding beads hereinafter also referred to as “binding beads C”
  • BDN4A binding nucleic acid molecule binding beads D BDN4A binding nucleic acid molecule binding beads
  • binding beads E lysozyme binding nucleic acid molecule binding beads
  • binding beads C to E were mixed with SB buffer (saliva sample) containing 90 (v / v)% saliva or SB buffer (target sample) containing CRP, BDN4A, or lysozyme, respectively.
  • SB buffer saliva sample
  • SB buffer target sample
  • control 1 was performed in the same manner except that the following control nucleic acid molecule 2 modified with biotin at the 5 ′ end was used, and control 2 was performed in the same manner except that only CRP, BDN4A, or lysozyme was used. did.
  • Control nucleic acid molecule 2 (SEQ ID NO: 13) 5'-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAAC-3 '
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of pull-down using the binding beads C.
  • lane 2 and lane C1 show the results of the target sample
  • lane 4 and lane C2 show the results of the saliva sample.
  • the number on the left side of the photograph indicates the molecular weight, and each lane from the left is lane M (marker), lane 2 (target sample), lane C1 (control 1), lane CRP (control 2), lane. 4 (saliva sample), lane C2 (control 1), and lane M (marker) are shown.
  • lane M marker
  • FIG. 10 is a photograph showing the result of pull-down using the binding beads D.
  • the number on the left side of the photograph indicates the molecular weight, and each lane from the left is lane M (marker), lane 3 (target sample), lane C1 (control 1), lane hBDN (control 2), lane. M (marker), lane 7 (saliva sample), lane C2 (control 1), and lane hBDN (control 2) are shown.
  • M marker
  • lane 7 saliva sample
  • lane C2 control 1
  • lane hBDN control 2
  • FIG. 11 is a photograph showing the result of pull-down using the binding beads E.
  • the number on the left side of the photograph indicates the molecular weight, and each lane from the left is lane M (marker), lane 1 (target sample), lane C1 (control 1), lane hLys (control 2), lane. M (marker), lane 3 (saliva sample), lane C2 (control 1), and lane hLys (control 2) are shown.
  • M marker
  • lane 1 target sample
  • lane C1 control 1
  • lane hLys control 2
  • M marker
  • lane 3 silica sample
  • lane C2 control 1
  • lane hLys control 2
  • Example 4 It was confirmed that a binding nucleic acid molecule that binds to human ⁇ -amylase can be obtained using NG7.
  • binding nucleic acid molecule that binds to human ⁇ -amylase was the same as in Example 2 (1) except that the above human ⁇ -amylase was used instead of sIgA as a target. I got it.
  • a binding nucleic acid molecule that binds to ⁇ -amylase a binding nucleic acid molecule consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 14 to 16 below was obtained.
  • the underlined T is NG7.
  • ⁇ -Amylase-binding nucleic acid molecule 2 (SEQ ID NO: 14) 5'-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATC T GCCC T GAAGAAC TTT GA T CACG TT A TTTT GAAAC T ACAA T GGGCGGGC TT A T C-3 ' ⁇ -Amylase-binding nucleic acid molecule 3 (SEQ ID NO: 15) 5'-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCCCACAA TT G T AGC T A TT A TTT CA T GCG TT GGAAAC T ACAA T GGGCGGGC TT A T C-3 ' ⁇ -Amylase-binding nucleic acid molecule 4 (SEQ ID NO: 16) 5'-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATC TT G T G T CCG TT A T GG T CCA TT GAA T CAAGAGAAAC T ACAA T GGGCGGGC TT A T C-3 '
  • FIG. 12 is a graph showing the binding ability of each ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule to ⁇ -amylase.
  • (A) to (C) show the results of the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecules 2 to 4, respectively.
  • the horizontal axis indicates the elapsed time after the ligand is injected, and the vertical axis indicates the relative value (RU) of the binding force.
  • each ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule did not bind to BSA but bound to ⁇ -amylase.
  • each ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule having 20 base length polyA added to the 3 ′ end was used.
  • the relative value (RU) of the binding force was measured in the same manner as in Example 4 (2) except that the concentration was 40 or 80 nmol / L. Based on the relative value (RU) of the binding force, the dissociation constant between each ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule and the ⁇ -amylase was calculated.
  • the dissociation constants of the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecules 2 to 4 and the ⁇ -amylase were 5.11, 1.29, and 1.64 nM, respectively. From these results, it was found that any binding nucleic acid molecule has an extremely excellent ability to bind to a target.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of capillary electrophoresis.
  • the left side of the photograph shows the migration time, and each lane has, from the left, the control of ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule 3 (without ⁇ -amylase) and ⁇ -amylase, and the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule.
  • 1 shows the results of control 1 (without amylase) and ⁇ -amylase, and control of ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule 4 (without ⁇ -amylase) and presence of ⁇ -amylase.
  • binding beads B3 ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule-binding beads 3 and 4 with biotin-modified 5 ′ ends with the beads modified with streptavidin, respectively.
  • binding beads B4 ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule-binding beads 4
  • Control 1 was the same except that a nucleic acid molecule that did not bind to ⁇ -amylase modified with biotin at the 5 ′ end (the control nucleic acid molecule 1) was used, and Control 2 except that only ⁇ -amylase was used. was taken in the same way.
  • FIG. 14 is a photograph showing the results of pull-down using the binding beads B1, B3 and B4.
  • the number on the left side of the photograph indicates the molecular weight, and each lane from the left is the molecular weight marker (M), the binding bead B3 (3), the binding bead B1 (4), and the binding bead B4 (5 ), Control 1 (C1), and control 2 (AMY).
  • M molecular weight marker
  • C1 Control 1
  • AY control 2
  • Example 5 It was confirmed that a binding nucleic acid molecule that binds to human LDH5, human CgA and human IL-6 can be obtained using NG7.
  • Binding nucleic acid molecule A binding nucleic acid molecule that binds to human LDH5, a binding nucleic acid molecule that binds to human CgA, and a binding nucleic acid molecule that binds to human IL-6 are replaced with human LDH5 (Meridian Life Science) instead of sIgA as a target. , Inc., catalog number: # A38558H-100), human CgA (Creative BioMart, catalog number: # CHGA-26904TH) or human IL-6 (MP Biomedicals, LLC-Cappel Products, catalog number: The sample was obtained in the same manner as in Example 2 (1) except that # 55905) was used.
  • a binding nucleic acid molecule that binds to LDH5 a binding nucleic acid molecule consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 17 to 23 shown below
  • a binding nucleic acid molecule that binds to CgA a binding nucleic acid molecule consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 24-33 below.
  • a binding nucleic acid molecule for IL-6 a binding nucleic acid molecule consisting of the following base sequences of SEQ ID NOs: 34 and 35 was obtained.
  • T indicated by underlining is NG7.
  • LDH5-binding nucleic acid molecule 1 (SEQ ID NO: 17) 5'-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGCC T CCGC TT G T GGA T ACGA T GGAC T AG T GGCC T AAGGC T GGC T GGC T AC T A T AC-3 ' LDH5-binding nucleic acid molecule 2 (SEQ ID NO: 18) 5'-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGACC TT AGACACGG T AC TT ACCGACAC T AAACC T AAGGC T GGC T GGC T A T AC-3 ' LDH5-binding nucleic acid molecule 3 (SEQ ID NO: 19) 5'-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATG TT AGA T AC TT GGC T C T AC TT A TT GACAA T CCC T AAGGC T GGC T GGC T AC T A T AC-3 ' LDH5-binding nucleic acid molecule 4 (SEQ ID NO: 20) 5
  • each LDH5-binding nucleic acid molecule and LDH5 the binding between each CgA-binding nucleic acid molecule and CgA, and the binding between each IL-6-binding nucleic acid molecule and IL-6 are the ligand 2 As described above, except that an LDH5-binding nucleic acid molecule, a CgA-binding nucleic acid molecule, or an IL-6-binding nucleic acid molecule having 20 base length poly dA added to its 3 ′ end was used, and the following protein was used as an analyte: It carried out like Example 2 (2).
  • LDH5 Lactate Dehydrogenase 5
  • Human Human (Meridian Life Science, Inc., catalog number: # A38558H-100)
  • CgA Recombinant full length Human Chromogranin A (Creative BioMart, catalog number: # CHGA-26904TH)
  • IL-6 IL-6, Human, Recombinant (PeproTech, catalog number: # 200-06)
  • Amylase ⁇ -Amylase (Lee Biosolutions, catalog number: # 120-10)
  • SIgA IgA (Secretory), Human (MP Biomedicals, LLC-Cappel Products, catalog number: # 55905)
  • FIG. 15 is a graph showing the binding ability of each LDH5-binding nucleic acid molecule to LDH5.
  • (A) to (G) show the results of the CRP-binding nucleic acid molecules 1 to 7, respectively.
  • the horizontal axis indicates the elapsed time after the ligand is injected, and the vertical axis indicates the relative value (RU) of the binding force.
  • each CRP-binding nucleic acid molecule did not bind to ⁇ -amylase and sIgA, but bound to LDH5.
  • FIGS. 16 and 17 are graphs showing the binding ability of each CgA-binding nucleic acid molecule to CgA.
  • (A) to (F) show the results of the CgA binding nucleic acid molecules 1 to 6, respectively.
  • FIG. 17, (A) to (D) show the CgA binding nucleic acid molecules 7 to 6, respectively.
  • Ten results are shown. 16 and 17, the horizontal axis indicates the elapsed time after the ligand is injected, and the vertical axis indicates the relative value (RU) of the binding force.
  • the CgA-binding nucleic acid molecule did not bind to ⁇ -amylase and sIgA but bound to CgA.
  • FIG. 18 is a graph showing the binding ability of each IL-6 binding nucleic acid molecule to IL-6.
  • (A) and (B) show the results of the IL-6 binding nucleic acid molecules 1 and 2, respectively.
  • the horizontal axis indicates the elapsed time after the ligand is injected, and the vertical axis indicates the relative value (RU) of the binding force.
  • the IL-6 binding nucleic acid molecule did not bind to ⁇ -amylase and sIgA but bound to IL-6.
  • the binding ability of each binding nucleic acid molecule was examined based on the amount of each binding nucleic acid molecule immobilized on the measurement chip and the binding amount between each nucleic acid molecule and the target. Specifically, the signal intensity (RU) after the injection of the ligand 2 is measured, and this is used as a signal indicating the amount of solidification of each nucleic acid molecule on the measurement chip. did. In parallel with analyte injection and buffer washing, signal intensity was measured. Then, the average value of the signal intensity between 115 and 125 seconds is determined with 0 seconds as the start of injection, and this is used as a signal indicating the amount of binding between each binding nucleic acid molecule and the target. did.
  • a value (B / A) obtained by dividing the target binding measurement value (B) by the nucleic acid molecule solidification measurement value (A) was obtained as a relative value (Relative Unit), and this was defined as binding ability.
  • the binding ability was confirmed in the same manner except that ⁇ -amylase and sIgA were used as the analyte.
  • results for each LDH5-binding nucleic acid molecule are shown in FIG. 19, the results for each CgA-binding nucleic acid molecule are shown in FIG. 20, and the results for each IL-6-binding nucleic acid molecule are shown in FIG.
  • FIG. 19 is a graph showing the relative value (Relative Unit) of the binding amount of each LDH5-binding nucleic acid molecule to LDH5.
  • the horizontal axis indicates the type of LDH5-binding nucleic acid molecule, and the vertical axis indicates the relative value.
  • binding could not be confirmed in the control using ⁇ -amylase or sIgA.
  • FIG. 20 is a graph showing the relative value of the amount of each CgA-binding nucleic acid molecule bound to CgA.
  • the horizontal axis indicates the type of CgA-binding nucleic acid molecule, and the vertical axis indicates the relative value.
  • binding could not be confirmed in the control using ⁇ -amylase or sIgA.
  • any CgA binding nucleic acid molecule bound to CgA could not be confirmed in the control using ⁇ -amylase or sIgA.
  • FIG. 21 is a graph showing the relative value of the amount of each IL-6-binding nucleic acid molecule bound to IL-6.
  • the horizontal axis indicates the type of IL-6 binding nucleic acid molecule, and the vertical axis indicates the relative value.
  • binding could not be confirmed in the control using ⁇ -amylase or sIgA.
  • any IL-6 binding nucleic acid molecule bound to IL-6 could not be confirmed in the control using ⁇ -amylase or sIgA.
  • NG7 which is a nucleoside derivative of the present invention.
  • each LDH5-binding nucleic acid molecule having a 20-base polyA added to the 3 ′ end was used, and the concentration of LDH5 as an analyte was set to 1.25, 2.5, 5,
  • the relative value (RU) of the binding force was set in the same manner as in Example 5 (2) except that it was 10 or 20 nmol / L, or 6.25, 12.5, 25, 50, or 100 nmol / L. It was measured.
  • each CgA-binding nucleic acid molecule having 20 base length polyA added to the 3 ′ end is used, and the concentration of CgA as an analyte is 12.5, 25, 50, 100, or 200 nmol / L, Alternatively, the relative value (RU) of the binding force was measured in the same manner as in Example 5 (2) except that 25, 50, 100, 200, or 400 nmol / L.
  • each IL-6 binding nucleic acid molecule having 20 base length polyA added to the 3 ′ end is used as the ligand 2, and the concentration of IL-6 as an analyte is 6.25, 12.5, 25, 50, Alternatively, the relative value (RU) of the binding force was measured in the same manner as in Example 5 (2) except that 100 nmol / L, or 12.5, 25, 50, 100, or 200 nmol / L.
  • any of the binding nucleic acid molecules has an extremely excellent ability to bind to the target.
  • LDH5-binding nucleic acid molecule 5 LDH5-binding nucleic acid molecule 6
  • binding beads L and CgA binding nucleic acid molecule binding beads
  • SB buffer saliva sample
  • SB buffer target sample
  • Example 2 SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 2 (5), and the gel was photographed.
  • Control 1 was photographed in the same manner except that the following control nucleic acid molecule 3 or 4 with biotin modification at the 5 ′ end was used, and control 2 was photographed in the same manner except that only LDH5 or CgA was used. .
  • the control nucleic acid molecules 3 and 4 were used as controls for LDH5-binding nucleic acid molecule 3 and CgA-binding nucleic acid molecule 1, respectively.
  • Control nucleic acid molecule 3 (SEQ ID NO: 36) 5'-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATG-3 '
  • Control nucleic acid molecule 4 (SEQ ID NO: 37) 5'-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAG-3 '
  • FIG. 22 shows the result using the binding beads L.
  • FIG. 22 is a photograph showing the result of pull-down using the binding beads L.
  • lane 1 and lane C1 show the result of the target sample
  • lane 2 and lane C2 show the result of the saliva sample.
  • the number on the left side of the photograph indicates the molecular weight, and each lane from the left is lane M (marker), lane 1 (target sample), lane C1 (control 1), lane LDH5 (control 2), lane. 2 (saliva sample) and lane C2 (control 1) are shown.
  • lane M marker
  • lane 1 target sample
  • lane C1 control 1
  • lane LDH5 control 2
  • lane. 2 saliva sample
  • lane C2 control 1
  • FIG. 23 is a photograph showing the result of pull-down using the binding beads G.
  • the number on the left side of the photograph indicates the molecular weight, and each lane from the left is lane M (marker), lane 1 (target sample), lane C1 (control 1), lane CgA (control 2), lane. 2 (saliva sample), lane C2 (control 1), and lane M (marker) are shown.
  • lane M marker
  • a nucleoside derivative represented by the following chemical formula (1) or a salt thereof is an atomic group having a sugar skeleton in a nucleoside residue or an atomic group having a sugar phosphate skeleton in a nucleotide residue, which may or may not have a protecting group
  • L 1 and L 2 are each independently a linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms
  • X 1 and X 2 are each independently an imino group (—NR 1 —), an ether group (—O—), or a thioether group (—S—);
  • R 1 is a hydrogen atom or a linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms.
  • (Appendix 2) The nucleoside derivative or the salt thereof according to appendix 1, wherein X 1 is an imino group (—NR 1 —).
  • (Appendix 3) The nucleoside derivative or a salt thereof according to appendix 1 or 2, wherein X 2 is an imino group (—NR 1 —).
  • (Appendix 4) The nucleoside derivative or a salt thereof according to appendix 2 or 3, wherein R 1 is a hydrogen atom.
  • (Appendix 5) The nucleoside derivative or a salt thereof according to any one of appendices 1 to 4, wherein L 1 is a vinylene group (—CH ⁇ CH—).
  • (Appendix 6) The nucleoside derivative or a salt thereof according to any one of appendices 1 to 5, wherein L 2 is an ethylene group (—CH 2 —CH 2 —).
  • (Appendix 7) The nucleoside according to any one of appendices 1 to 6, wherein the atomic group having a sugar skeleton in the nucleoside residue or the atomic group having a sugar phosphate skeleton in the nucleotide residue is represented by the following chemical formula (2): Derivatives or salts thereof.
  • R 2 is a hydrogen atom, a protecting group, or a group represented by the following chemical formula (3)
  • R 3 is a hydrogen atom, a protecting group, or a phosphoramidite group
  • R 4 is a hydrogen atom, a fluorine atom, a hydroxyl group, an amino group, or a mercapto group
  • Y is an oxygen atom or a sulfur atom
  • Z is a hydroxyl group or an imidazole group
  • m is an integer of 1 to 10.
  • (Appendix 8) The nucleoside derivative or the salt thereof according to any one of appendices 1 to 7, wherein the nucleoside derivative represented by the chemical formula (1) is a nucleoside derivative represented by the following chemical formula (4).
  • (Appendix 9) A polynucleotide synthesis reagent comprising the nucleotide derivative or salt thereof comprising the nucleoside derivative or salt thereof according to any one of appendices 1 to 8.
  • (Appendix 10) A method for producing a polynucleotide, comprising a synthesis step of synthesizing a polynucleotide using the nucleotide derivative or salt thereof containing the nucleoside derivative or salt thereof according to any one of appendices 1 to 8.
  • Appendix 11 A polynucleotide comprising the nucleotide derivative or salt thereof containing the nucleoside derivative or salt thereof according to any one of appendices 1 to 8, as a constituent unit.
  • Appendix 12 The polynucleotide according to appendix 11, wherein the polynucleotide is a binding nucleic acid molecule that binds to a target.
  • the target is from secretory immunoglobulin A, amylase, C-reactive protein (CRP), ⁇ -defensin 4A, lysozyme, lactate dehydrogenase (LDH) 5, chromogranin A (CgA), and interleukin (IL) -6
  • the method for producing a binding nucleic acid molecule wherein the candidate polynucleotide is the polynucleotide according to any one of appendices 11 to 13.
  • the target is from secretory immunoglobulin A, amylase, C-reactive protein (CRP), ⁇ -defensin 4A, lysozyme, lactate dehydrogenase (LDH) 5, chromogranin A (CgA), and interleukin (IL) -6 15.
  • (Appendix 21) Contacting the sample with a nucleic acid molecule and detecting ⁇ -amylase in the sample,
  • the nucleic acid molecule is the ⁇ -amylase-binding nucleic acid molecule according to any one of appendices 16 to 20, In the detection step, the ⁇ -amylase in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and the ⁇ -amylase in the sample is detected by the binding.
  • (Appendix 22) The method for analyzing ⁇ -amylase according to appendix 21, wherein the sample is at least one selected from the group consisting of saliva, urine, plasma, and serum.
  • a C-reactive protein (CRP) -binding nucleic acid molecule comprising the polynucleotide of (c) below.
  • C a polynucleotide of (c1) below (c1) a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 4 to 7 (Appendix 24) 24.
  • Appendix 26 26.
  • Appendix 27 The CRP-binding nucleic acid molecule according to any one of appendices 23 to 26, wherein the polynucleotide is DNA.
  • (Appendix 28) Contacting the sample with a nucleic acid molecule and detecting C-reactive protein (CRP) in the sample,
  • the nucleic acid molecule is the CRP-binding nucleic acid molecule according to any one of appendices 23 to 27, In the detection step, the CRP in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and the CRP in the sample is detected by the binding.
  • the CRP analysis method according to appendix 28, wherein the sample is at least one selected from the group consisting of saliva, urine, plasma, and serum.
  • a ⁇ -defensin (BDN) 4A-binding nucleic acid molecule comprising the polynucleotide of (b) below.
  • (B) The BDN4A-binding nucleic acid molecule according to appendix 30, wherein the nucleic acid molecule includes a modified base having a modified base.
  • (Appendix 35) Contacting the sample with a nucleic acid molecule and detecting ⁇ -defensin (BDN) 4A in the sample,
  • the nucleic acid molecule is the BDN4A-binding nucleic acid molecule according to any one of appendices 30 to 34,
  • the method for analyzing BDN4A wherein, in the detection step, BDN4A in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and BDN4A in the sample is detected by the binding.
  • (Appendix 36) 36 36.
  • the method for analyzing BDN4A according to appendix 35, wherein the sample is at least one selected from the group consisting of saliva, urine, plasma, and serum.
  • a lysozyme-binding nucleic acid molecule comprising the polynucleotide of (l) below: (L) a polynucleotide of the following (l1) (l1) a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 11 and 12 (Appendix 38) 38.
  • Appendix 40 40.
  • Appendix 41 41.
  • the nucleic acid molecule is a lysozyme-binding nucleic acid molecule according to any one of appendices 37 to 41, In the detection step, the lysozyme in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and the lysozyme in the sample is detected by the binding.
  • Appendix 43 44. The method for analyzing lysozyme according to appendix 42, wherein the sample is at least one selected from the group consisting of saliva, urine, plasma, and serum.
  • a lactate dehydrogenase (LDH) 5-binding nucleic acid molecule comprising the polynucleotide of (d) below: (D) a polynucleotide of (d1) below (d1) a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 17 to 23 (Appendix 45) 45.
  • the LDH5-binding nucleic acid molecule according to appendix 44, wherein the nucleic acid molecule includes a modified base having a modified base. (Appendix 46) 46.
  • Appendix 47 49.
  • Appendix 48 48.
  • (Appendix 49) Contacting a sample with a nucleic acid molecule and detecting lactate dehydrogenase (LDH) 5 in the sample,
  • the nucleic acid molecule is the LDH5-binding nucleic acid molecule according to any one of appendices 44 to 48,
  • LDH5 in the sample is bound to LDH5 and the nucleic acid molecule is detected, and LDH5 in the sample is detected by the binding.
  • (Appendix 50) 50 The method for analyzing LDH5 according to appendix 49, wherein the sample is at least one selected from the group consisting of saliva, urine, plasma, and serum.
  • (Appendix 51) A chromogranin A (CgA) -binding nucleic acid molecule comprising the polynucleotide (g): (G) a polynucleotide of the following (g1) (g1) a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 24-33 (Appendix 52) 52.
  • Appendix 54 54.
  • Appendix 55 55.
  • (Appendix 56) Contacting the sample with a nucleic acid molecule and detecting chromogranin A (CgA) in the sample,
  • the nucleic acid molecule is the CgA-binding nucleic acid molecule according to any one of appendices 51 to 55, In the detection step, CgA in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and CgA in the sample is detected by the binding.
  • the CgA analysis method according to appendix 56, wherein the sample is at least one selected from the group consisting of saliva, urine, plasma, and serum.
  • An interleukin (IL) -6 binding nucleic acid molecule comprising the polynucleotide of (i) below: (I) a polynucleotide of the following (i1) (i1) a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 34 to 35 (Appendix 59) 59.
  • (Appendix 60) The IL-6 binding nucleic acid molecule according to appendix 59, wherein the modified base is a modified thymine obtained by modifying a thymine base with a modifying group.
  • (Appendix 61) 61.
  • (Appendix 63) Contacting the sample with a nucleic acid molecule and detecting interleukin (IL) -6 in the sample,
  • the nucleic acid molecule is the IL-6 binding nucleic acid molecule according to any one of appendices 58 to 62, In the detection step, IL-6 in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and the IL-6 in the sample is detected by the binding.
  • the method for analyzing IL-6 according to appendix 63, wherein the sample is at least one selected from the group consisting of saliva, urine, plasma, and serum.
  • the nucleoside derivative of the present invention includes a purine ring-like structure in addition to the pyrimidine ring. Therefore, the nucleoside derivative of the present invention has, for example, a relatively larger number of atoms capable of interacting within a molecule or between molecules than a nucleoside derivative containing one pyrimidine ring structure. For this reason, the binding nucleic acid molecule containing the nucleoside derivative of the present invention has an improved ability to bind to a target as compared with a nucleoside derivative containing one pyrimidine ring structure, for example.
  • the nucleoside derivative of the present invention for example, a bound nucleic acid molecule exhibiting excellent binding ability to a target can be produced. Therefore, the present invention is extremely useful in fields such as the analysis field, the medical field, and the life science field.

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Abstract

新たなヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法を提供する。　本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩は、下記化学式（１）で表されることを特徴とする。 【化１】 前記化学式（１）中、 Ｓｕは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、 Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基であり、 Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（－ＮＲ１－）、エーテル基（－Ｏ－）、またはチオエーテル基（－Ｓ－）であり、 Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基である。

Description

ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法
　本発明は、ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法に関する。
　試料中のターゲットを分析するために、ターゲットと結合する結合分子が用いられている。また、前記ターゲットに結合する結合分子としては、抗体に加え、アプタマー等のターゲットに結合する結合核酸分子も用いられている（特許文献１）。
　前記結合核酸分子の取得方法としては、多数の候補ポリヌクレオチドと、ターゲットを接触させ、前記候補ポリヌクレオチドにおいて前記ターゲットと結合するポリヌクレオチドを前記結合核酸分子として選抜するＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法等が知られている。また、前記ＳＥＬＥＸ法により、結合核酸分子を取得する場合、前記結合核酸分子を構成する天然のヌクレオシド分子に加え、前記天然のヌクレオシド分子を修飾した、修飾ヌクレオシド分子も使用されている。
　しかしながら、公知の天然ヌクレオシドおよびその誘導体では、十分な結合能を有する結合核酸分子が得られないターゲットが存在する。このため、例えば、アプタマーの作製に使用可能な修飾ヌクレオシド誘導体が求められている。
特開２０１２－２００２０４号公報
　そこで、本発明は、新たなヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法の提供を目的とする。
　本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩は、下記化学式（１）で表されることを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 前記化学式（１）中、
Ｓｕは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（－ＮＲ１－）、エーテル基（－Ｏ－）、またはチオエーテル基（－Ｓ－）であり、
Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基である。
　本発明のポリヌクレオチドの合成試薬は、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする。
　本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする。
　本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする。
　本発明の結合核酸分子の製造方法は、候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および
前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、
前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることを特徴とする。
　本発明によれば、新たなヌクレオシド誘導体またはその塩を提供できる。
図１は、実施例２における分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）結合核酸分子のｓＩｇＡに対する結合能を示すグラフである。 図２は、実施例２におけるα－アミラーゼ結合核酸分子のα－アミラーゼに対する結合能を示すグラフである。 図３は、実施例２におけるキャピラリー電気泳動の結果を示す写真である。 図４は、実施例２におけるプルダウンの結果を示す写真である。 図５は、実施例２におけるプルダウンの結果を示す写真である。 図６は、実施例３におけるＣ反応タンパク質（ＣＲＰ）結合核酸分子のＣＲＰに対する結合能を示すグラフである。 図７は、実施例３におけるβ－ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ結合核酸分子のＢＤＮ４Ａに対する結合能を示すグラフである。 図８は、実施例３におけるリゾチーム結合核酸分子のリゾチームに対する結合能を示すグラフである。 図９は、実施例３におけるプルダウンの結果を示す写真である。 図１０は、実施例３におけるプルダウンの結果を示す写真である。 図１１は、実施例３におけるプルダウンの結果を示す写真である。 図１２は、実施例４におけるα－アミラーゼ結合核酸分子のα－アミラーゼに対する結合能を示すグラフである。 図１３は、実施例４におけるキャピラリー電気泳動の結果を示す写真である。 図１４は、実施例４におけるプルダウンの結果を示す写真である。 図１５は、実施例５における乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５結合核酸分子のＬＤＨ５に対する結合能を示すグラフである。 図１６は、実施例５におけるクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）結合核酸分子のＣｇＡに対する結合能を示すグラフである。 図１７は、実施例５におけるＣｇＡ結合核酸分子のＣｇＡに対する結合能を示すグラフである。 図１８は、実施例５におけるインターロイキン（ＩＬ）－６結合核酸分子のＩＬ－６に対する結合能を示すグラフである。 図１９は、実施例５における各ＬＤＨ５結合核酸分子のＬＤＨ５への結合量の相対値を示すグラフである。 図２０は、実施例５における各ＣｇＡ結合核酸分子のＣｇＡへの結合量の相対値を示すグラフである。 図２１は、実施例５における各ＩＬ－６結合核酸分子のＩＬ－６への結合量の相対値を示すグラフである。 図２２は、実施例５におけるプルダウンの結果を示す写真である。 図２３は、実施例５におけるプルダウンの結果を示す写真である。
＜ヌクレオシド誘導体またはその塩＞
　本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩は、前述のように、下記化学式（１）で表されることを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 前記化学式（１）中、
Ｓｕは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（－ＮＲ１－）、エーテル基（－Ｏ－）、またはチオエーテル基（－Ｓ－）であり、
Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基である。
　本発明のヌクレオシド誘導体は、ピリミジン環に加え、プリン環様の構造を含む。このため、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、分子内または分子間で相互作用可能な原子の数が、ピリミジン環の構造を１つ含むヌクレオシド誘導体より相対的に多い。このため、本発明のヌクレオシド誘導体を含む結合核酸分子は、例えば、ピリミジン環の構造を１つ含むヌクレオシド誘導体と比較して、ターゲットに対する結合能が向上する。このため、本発明のヌクレオシド誘導体によれば、例えば、ターゲットに対し優れた結合能を示す結合核酸分子を製造できる。
　前記化学式（１）において、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基である。Ｌ１の炭素数は、その下限が、２であり、その上限が、１０であり、好ましくは、８、６であり、その範囲が、例えば、２～８、２～６である。Ｌ１の炭素数は、２が好ましい。Ｌ２の炭素数は、その下限が、２であり、その上限が、１０であり、好ましくは、８、６であり、その範囲が、例えば、２～８、２～６である。Ｌ２の炭素数は、２が好ましい。Ｌ１およびＬ２の具体例としては、例えば、エチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－）、ビニレン基（－ＣＨ＝ＣＨ－）、プロピレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、イソプロピレン基（－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－）、ブチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、メチルブチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－）、ジメチルブチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＨ２－）、エチルブチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ（Ｃ２Ｈ5）－ＣＨ２－ＣＨ２－）、ペンチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、へキシレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、ヘプチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、オクチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）等があげられる。Ｌ１は、ビニレン基（－ＣＨ＝ＣＨ－）が好ましい。また、Ｌ２は、エチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－）が好ましい。Ｌ１およびＬ２は、同じ炭化水素基でもよいし、異なる炭化水素基でもよく、後者の具体例として、Ｌ１は、ビニレン基（－ＣＨ＝ＣＨ－）であり、Ｌ２は、エチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－）であることが好ましい。
　前記化学式（１）において、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（－ＮＲ１－）、エーテル基（－Ｏ－）、またはチオエーテル基（－Ｓ－）である。前記イミノ基において、Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基であり、水素原子が好ましい。前記直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基は、Ｌ１およびＬ２における説明を援用できる。Ｘ１は、イミノ基（－ＮＲ１－）が好ましい。また、Ｘ２は、イミノ基（－ＮＲ１－）が好ましい。Ｘ１およびＸ２は、同じ置換基でもよいし、異なる置換基でもよく、前者の具体例として、Ｘ１およびＸ２は、イミノ基（－ＮＲ１－）が好ましく、ＮＨ基がより好ましい。
　前記化学式（１）において、前記ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団は、特に制限されず、公知の天然または人工ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団があげられる。前記天然ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団は、例えば、リボヌクレオシド残基におけるリボース骨格を有する原子団、デオキシリボヌクレオシドにおけるデオキシリボース骨格を有する原子団等があげられる。前記人工ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団は、例えば、人工ヌクレオシド残基における二環式の糖骨格を有する原子団があげられ、具体例として、ＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）等における２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とが、架橋されたリボース骨格を有する原子団等があげられる。前記ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団は、特に制限されず、公知の天然または人工ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団があげられる。前記天然ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団は、例えば、リボヌクレオチド残基におけるリボース－リン酸骨格を有する原子団、デオキシリボヌクレオチドにおけるデオキシリボース－リン酸骨格を有する原子団等があげられる。前記人工ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団は、例えば、人工ヌクレオチド残基における二環式の糖リン酸骨格を有する原子団があげられ、具体例として、ＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）等における２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とが、架橋されたリボース－リン酸骨格を有する原子団等があげられる。
　前記化学式（１）において、前記ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団は、下記化学式（２）で表されることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 前記化学式（２）中、
Ｒ２は、水素原子、保護基、または下記化学式（３）で表される基であり、
Ｒ３は、水素原子、保護基、またはホスホロアミダイト基であり、
Ｒ４は、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 前記化学式（３）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｚは、ヒドロキシル基またはイミダゾール基であり、
ｍは、１～１０の整数である。
　前記化学式（２）において、Ｒ２は、水素原子、保護基、または前記化学式（３）で表される基である。前記保護基は、特に制限されず、例えば、核酸の合成方法において使用されている公知のヒドロキシル基の保護基があげられ、具体例として、ＤＭＴｒ基（４，４’－ジメトキシ（トリフェニルメチル）基）等があげられる。Ｒ２が前記化学式（３）で表される基である場合、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、ヌクレオチド誘導体ということもできる。
　前記化学式（２）において、Ｒ３は、水素原子、保護基、またはホスホロアミダイト基である。前記保護基は、特に制限されず、例えば、Ｒ２における説明を援用できる。前記ホスホロアミダイト基は、下記化学式（５）で表される。Ｒ３がホスホロアミダイト基である場合、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、ヌクレオシド誘導体のホスホロアミダイト化物ということもできる。また、Ｒ２が前記化学式（３）で表される基であり、Ｒ３がホスホロアミダイト基である場合、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、ヌクレオチド誘導体のホスホロアミダイト化物ということもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　前記化学式（２）において、Ｒ４は、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり、水素原子またはヒドロキシル基が好ましい。Ｒ４が水素原子の場合、本発明のヌクレオシド誘導体は、糖骨格として、デオキシリボース骨格を有し、例えば、ＤＮＡの合成に使用できる。また、Ｒ４がヒドロキシル基の場合、本発明のヌクレオシド誘導体は、糖骨格として、リボース骨格を有し、例えば、ＲＮＡの合成に使用できる。
　前記化学式（３）において、Ｙは、酸素原子または硫黄原子である。Ｙが酸素原子の場合、本発明のヌクレオシド誘導体を構成単位として含むポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を有するポリヌクレオチドということもできる。また、Ｙが硫黄原子の場合、本発明のヌクレオシド誘導体を構成単位として含むポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を有するポリヌクレオチドということもできる。
　前記化学式（３）において、Ｚは、ヒドロキシル基またはイミダゾール基である。前記イミダゾール基において、イミダゾールは、例えば、１位の窒素原子を介して、リン酸原子に結合している。
　前記化学式（３）において、ｍは、１～１０の整数であり、好ましくは、１～３、１～２、１である。
　本発明のヌクレオシド誘導体は、下記化学式（４）、（６）、（７）または（８）で表されることが好ましい。以下、下記化学式（４）、（６）、（７）および（８）で表されるヌクレオシド誘導体を、それぞれ、ＮＧ７、ＮＧ４、ＮＧ５、およびＮＧ６ともいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　本発明のヌクレオシド誘導体およびその塩は、その鏡像異性体、互変異性体、または幾何異性体、配座異性体および光学異性体等の立体異性体ならびにそれらの塩であってもよい。具体的に、前記化学式（１）および後述する化学式において、糖骨格は、Ｄ体としているが、本発明のヌクレオシド誘導体は、これに限定されず、糖骨格をＬ体としてもよい。
前記本発明のヌクレオシド誘導体の塩は、酸付加塩でもよいが、塩基付加塩でもよい。さらに、前記酸付加塩を形成する酸は無機酸でも有機酸でもよく、前記塩基付加塩を形成する塩基は無機塩基でも有機塩基でもよい。前記無機酸としては、特に制限されず、例えば、硫酸、リン酸、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、次亜フッ素酸、次亜塩素酸、次亜臭素酸、次亜ヨウ素酸、亜フッ素酸、亜塩素酸、亜臭素酸、亜ヨウ素酸、フッ素酸、塩素酸、臭素酸、ヨウ素酸、過フッ素酸、過塩素酸、過臭素酸、および過ヨウ素酸等があげられる。前記有機酸は、特に制限されず、例えば、ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ－ブロモベンゼンスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸等があげられる。前記無機塩基は、特に制限されず、例えば、水酸化アンモニウム、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩および炭酸水素塩等があげられ、より具体的には、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウム等があげられる。前記有機塩基は、特に制限されず、例えば、エタノールアミン、トリエチルアミンおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等があげられる。
　本発明のヌクレオシド誘導体の製造方法は、特に制限されず、公知の合成方法を組合せて製造することができる。具体例として、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、後述する実施例の合成方法のように、アクリル酸構造が導入されたヌクレオシド誘導体と、末端にアミノ基を有する置換基を、アミノ基の水素原子と置換したグアニンとのアミド化反応により合成することができる。
＜ポリヌクレオチドの合成試薬＞
　本発明のポリヌクレオチドの合成試薬（以下、「合成試薬」ともいう）は、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする。本発明の合成試薬は、前記本発明のヌクレオシド誘導体を含むことが特徴であり、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明の合成試薬は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩の説明を援用できる。本発明の合成試薬によれば、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを合成できる。
　本発明の合成試薬において、前記ヌクレオシド誘導体は、例えば、前記ホスホロアミダイト化物および前記ヌクレオチド誘導体の少なくとも一方を含むことが好ましい。
　本発明の合成試薬は、例えば、さらに、ポリヌクレオチドの合成に使用する他の試薬を含んでもよい。
＜ポリヌクレオチドの製造方法＞
　本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、前記合成工程において、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用いることが特徴であり、その他の工程および条件等は、特に制限されない。本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩および合成試薬の説明を援用できる。本発明のポリヌクレオチドの製造方法によれば、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを製造できる。
　本発明のポリヌクレオチドの製造方法において、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩として、前記本発明の合成試薬を用いてもよい。
　前記合成工程において、前記ポリヌクレオチドの合成方法は、特に制限されず、公知のポリヌクレオチドの合成方法により実施できる。前記ヌクレオチド誘導体またはその塩として、前記ホスホロアミダイト化物を用いる場合、前記合成工程は、ホスホロアミダイト法によりポリヌクレオチドを合成できる。
　本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、例えば、前記合成工程で得られたポリヌクレオチドを精製する精製工程を含んでもよい。前記精製工程における精製方法は、特に制限されず、カラムクロマトグラフ等の公知の精製方法により実施できる。
＜ポリヌクレオチド＞
　本発明のポリヌクレオチドは、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことが特徴であり、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、およびポリヌクレオチドの製造方法の説明を援用できる。本発明のポリヌクレオチドによれば、例えば、後述するように、ターゲットに結合する結合核酸分子を製造できる。本発明のポリヌクレオチドにおいて、前記構成単位は、例えば、ポリヌクレオチドの一部として含むことを意味する。
　本発明のポリヌクレオチドは、例えば、下記化学式（９）で表される構造を含む。下記化学式（９）における各置換基の説明は、例えば、前述の各置換基の説明を援用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ターゲットに結合する結合核酸分子であってもよい。前記ターゲットは、特に制限されず、任意のターゲットとでき、具体例として、生体分子があげられる。前記生体分子は、例えば、分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）、アミラーゼ（例えば、α－アミラーゼ）、クロモグラニンＡ、β－ディフェンシン（Defensin）２、β－ディフェンシン４Ａ、カリクレイン、Ｃ反応タンパク質（C-Reactive Protein、CRP）、カルプロテクチン、Statherins、コルチゾル、メラトニン、リゾチーム、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）、インターロイキン（ＩＬ）－６等があげられる。前記結合核酸分子は、例えば、後述する本発明の結合核酸分子の製造方法により製造できる。
　本発明のポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチド誘導体に加え、例えば、他のヌクレオチドを含んでもよい。前記ヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドがあげられる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチドのみから構成されるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含むＤＮＡ／ＲＮＡ、リボヌクレオチドのみから構成されるＲＮＡ等があげられる。前記他のヌクレオチドは、例えば、修飾ヌクレオチドでもよい。
　前記修飾ヌクレオチドは、例えば、修飾デオキシリボヌクレオチドおよび修飾リボヌクレオチドがあげられる。前記修飾ヌクレオチドは、例えば、前記ヌクレオチドにおける糖が修飾されたものがあげられる。前記糖は、例えば、デオキシリボースまたはリボースがあげられる。前記ヌクレオチドにおける修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖の２’位および／または４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾ヌクレオチドは、例えば、塩基としてピリミジン塩基（ピリミジン核）を有するヌクレオチドが修飾されたもの、または、塩基としてプリン塩基（プリン核）を有するヌクレオチドが修飾されたものがあげられ、好ましくは前者である。以下、ピリミジン塩基を有するヌクレオチドをピリミジンヌクレオチドといい、修飾されたピリミジンヌクレオチドを修飾ピリミジンヌクレオチドといい、プリン塩基を有するヌクレオチドをプリンヌクレオチドといい、修飾されたプリンヌクレオチドを修飾プリンヌクレオチドという。前記ピリミジンヌクレオチドは、例えば、ウラシルを有するウラシルヌクレオチド、シトシンを有するシトシンヌクレオチド、チミンを有するチミンヌクレオチド等があげられる。前記修飾ヌクレオチドにおいて、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチドの具体例は、例えば、リボースの２’位が修飾された、２’－メチル化－ウラシルヌクレオチド、２’－メチル化－シトシンヌクレオチド、２’－フルオロ化－ウラシルヌクレオチド、２’－フルオロ化－シトシンヌクレオチド、２’－アミノ化－ウラシルヌクレオチド、２’－アミノ化－シトシンヌクレオチド、２’－チオ化－ウラシルヌクレオチド、２’－チオ化－シトシンヌクレオチド等があげられる。
　前記他のヌクレオチドにおける塩基は、例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）の天然塩基（非人工塩基）でもよいし、非天然塩基（人工塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基および改変塩基等があげられ、前記天然塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（Ｇ）に代えて、シトシン（Ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（Ｃ）に代えて、グアニン（Ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（Ａ）に代えて、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（Ｔ）に代えて、アデニン（Ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（Ｕ）に代えて、アデニン（Ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’－メチルウラシル、２’－メチルシトシン、２’－フルオロウラシル、２’－フルオロシトシン、２’－アミノウラシル、２’－アミノシトシン、２’－チオウラシル、２’－チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
　本発明のポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチド誘導体に加え、例えば、人工核酸モノマーを含んでもよい。前記人工核酸モノマーは、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ、ＥＮＡ等があげられる。前記モノマー残基における塩基は、例えば、前述と同様である。
　本発明のポリヌクレオチドの長さは、特に制限されず、例えば、その下限は、１０塩基、２０塩基、２５塩基であり、その上限は、例えば、１５０塩基、１００塩基、７０塩基であり、その範囲は、例えば、１０～１５０塩基、２０～１００塩基、２５～７０塩基である。
　本発明のポリヌクレオチドは、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されず、また、その長さも特に制限されない。
　本発明のポリヌクレオチドは、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、例えば、前記ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは５’末端である。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ（登録商標）３色素、Ｃｙ（登録商標）５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ（登録商標）６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。
　前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、前記付加配列を介して、間接的に連結してもよい。
　本発明のポリヌクレオチドは、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明のポリヌクレオチドは、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明のポリヌクレオチドを固定化する場合、例えば、前記ポリヌクレオチドは、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
＜結合核酸分子の製造方法＞
　本発明の結合核酸分子の製造方法は、前述のように、候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることを特徴とする。本発明の結合核酸分子の製造方法は、例えば、前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることが特徴であり、その他の工程および条件等は、特に制限されない。本発明の結合核酸の製造方法は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩、合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、およびポリヌクレオチドの説明を援用できる。本発明の結合核酸分子の製造方法において、前記候補ポリヌクレオチドは、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含む。このため、本発明の結合核酸分子の製造方法によれば、例えば、ターゲットに対し優れた結合能を示す結合核酸分子を製造できる。
　本発明の結合核酸分子において、前記接触工程および前記選抜工程は、例えば、ＳＥＬＥＸ法に基づき実施できる。
　前記接触工程における候補ポリヌクレオチドの数は、特に制限されず、例えば、４２０～４１２０（約１０１２～１０７２）種類、４３０～４６０（約１０１８～１０３６）種類である。
　前記接触工程では、候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる。そして、この接触により、前記候補ポリヌクレオチドと前記ターゲットとを反応させ、前記候補ポリヌクレオチドと前記ターゲットとの複合体を形成する。前記接触工程において使用する前記ターゲットは、例えば、前記ターゲットそのものであってもよいし、前記ターゲットの分解物であってもよい。前記候補ポリヌクレオチドと前記ターゲットとの結合条件は、特に制限されず、例えば、前記両者を溶媒中で一定時間インキュベートすることで実施できる。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、前記両者の結合等が保持されるものが好ましく、具体例として、各種緩衝液があげられる。
　つぎに、前記選抜工程では、前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する。具体的には、前記ターゲットと複合体を形成した候補ポリヌクレオチドを、前記結合核酸分子として回収する。なお、前記接触工程後の前記候補ポリヌクレオチドと前記ターゲットとの混合物には、前記複合体の他に、例えば、前記複合体形成に関与しない候補ポリヌクレオチドが含まれる。このため、例えば、前記混合物から、前記複合体と、前記未反応の候補ポリヌクレオチドとを、分離することが好ましい。前記分離方法は、特に制限されず、例えば、前記ターゲットと前記候補ポリヌクレオチドとの吸着性の違いや、前記複合体と前記候補ポリヌクレオチドとの分子量の違いを利用する方法等があげられる。
　この他にも、例えば、前記複合体の形成時において、担体に固定化したターゲットを使用する方法もあげられる。すなわち、前記ターゲットを予め担体に固定化し、前記担体と前記候補ポリヌクレオチドとを接触させ、前記固定化ターゲットと候補ポリヌクレオチドとの複合体を形成させる。そして、前記固定化ターゲットに結合していない未反応の候補ポリヌクレオチドを除去した後、前記担体から、前記ターゲットと前記候補ポリヌクレオチドとの複合体を解離させればよい。前記ターゲットの担体への固定化方法は、特に制限されず、公知の方法により実施できる。前記担体は、特に制限されず、公知の担体が使用できる。
　このようにして、前記ターゲットに結合する結合核酸分子を製造できる。
　本発明の製造方法は、例えば、前記選抜された結合核酸分子の塩基配列を決定する塩基配列決定工程を含んでもよい。前記塩基配列の決定方法は、特に制限されず、公知の塩基配列の決定方法により実施できる。
　本発明の結合核酸分子の製造方法は、例えば、前記接触工程および前記選抜工程の１セットを１サイクルとして、合計２サイクル以上実施してもよく、具体例として、３～１５サイクルがあげられる。
＜α－アミラーゼ結合核酸分子＞
　本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子（以下、「α－アミラーゼ核酸分子」ともいう）は、下記（ａ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａ）下記（ａ１）のポリヌクレオチド
（ａ１）配列番号２および１４～１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、前述のようにα－アミラーゼに結合可能である。前記α－アミラーゼは、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトα－アミラーゼのアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ０４７４５に登録されている。
　本発明において、「α－アミラーゼに結合する」とは、例えば、α－アミラーゼに対する結合能を有している、または、α－アミラーゼに対する結合活性を有しているともいう。本発明のα－アミラーゼ核酸分子と前記α－アミラーゼとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、α－アミラーゼに結合することから、例えば、α－アミラーゼの検出に使用できる。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、前述のように、下記（ａ）のポリヌクレオチドを含む。
（ａ）下記（ａ１）のポリヌクレオチド
（ａ１）配列番号２および１４～１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
α－アミラーゼ結合核酸分子１（配列番号２）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCCGTTGTTTCAACAGCAAATGTTAGGCAATTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α－アミラーゼ結合核酸分子２（配列番号１４）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTGCCCTGAAGAACTTTGATCACGTTATTTTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α－アミラーゼ結合核酸分子３（配列番号１５）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCCCACAATTGTAGCTATTATTTCATGCGTTGGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α－アミラーゼ結合核酸分子４（配列番号１６）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTTGTGTCCGTTATGGTCCATTGAATCAAGAGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
　前記（ａ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ａ２）、（ａ３）、または（ａ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α－アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、α－アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
（ａ４）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、α－アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
　前記（ａ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ａ２）のポリヌクレオチドが、α－アミラーゼに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、例えば、１～１５個、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１または２個、１個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１～５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
　前記（ａ３）において、「同一性」は、例えば、前記（ａ３）のポリヌクレオチドが、α－アミラーゼに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
　前記（ａ４）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ１）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドであり、α－アミラーゼに結合する範囲であればよい。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Sambrook）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載されている方法を採用することもできる。
　前記（ａ４）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Sambrook）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載の条件を採用することもできる。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子において、前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子は、例えば、以下、α－アミラーゼアプタマーともいう。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、前記いずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、後述するように、前記いずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または後述する付加配列等を有してもよい。ここで、前記リンカーとは、例えば、ポリヌクレオチド間の配列であり、前記付加配列とは、例えば、末端に付加された配列である。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子が、例えば、複数の前記ポリヌクレオチドを含む場合、前記複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上、２～２０、２～１０、２または３である。
　前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長、１～２０塩基長、３～１２塩基長、５～９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）のポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明のα－アミラーゼ核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
　本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～９１個、１～３０個、１～１５個、１～７個、１～３個、１または２個である。
　前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド残基における塩基として、天然塩基を含んでもよいし、修飾塩基を含んでもよい。前記天然塩基（非人工塩基）は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）等があげられ、好ましくは、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）である。
　前記ポリヌクレオチドが前記修飾塩基を有する場合、その部位および個数は、特に制限されない。前記（ａ）のポリヌクレオチドが前記修飾塩基を有する場合、前記配列番号２および１４～１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいては、例えば、下線部のチミンの一部または全部が、修飾塩基である。前記下線部のチミンが修飾塩基の場合、前記修飾塩基は、チミン塩基が修飾された修飾チミンであることが好ましい。
　前記修飾塩基は、例えば、塩基が修飾基で修飾されたものである。前記修飾基により修飾される塩基（被修飾塩基）は、例えば、前記天然塩基である。前記天然塩基は、例えば、プリン塩基、ピリミジン塩基等があげられる。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、修飾ウラシルがあげられる。
　前記修飾塩基は、例えば、前記被修飾塩基が、直接、前記修飾基で修飾されてもよいし、前記被修飾塩基が、間接的に、前記修飾基で修飾されてもよい。後者の場合、例えば、前記被修飾塩基が、リンカーを介して、前記修飾基で修飾される形態があげられる。前記リンカーは、特に制限されない。
　前記被修飾塩基の前記修飾基による修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられ、７位が好ましい。前記プリン塩基の修飾部位が７位の場合、７位の窒素原子は、炭素原子に置換されていることが好ましい。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられ、５位が好ましい。前記ピリミジン塩基の５位が修飾される場合、チミンは、５位の炭素にメチル基を有することから、例えば、５位の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよいし、５位の炭素に結合したメチル基の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよい。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「－ＣＨ３」または「－Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
　前記修飾塩基が修飾プリン塩基である場合、前記修飾基は、アデニン残基が好ましい。すなわち、前記修飾プリン塩基は、例えば、塩基が前記アデニン残基で修飾されている。前記アデニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位（前記アデニン残基における被修飾塩基との結合部位）は、特に制限されず、前記アデニン残基における６位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記アデニン残基で修飾される前記被修飾塩基は、特に制限されないが、例えば、プリン塩基が好ましく、プリン塩基の７位の原子が、前記アデニン残基で修飾されていることが好ましい。前記修飾塩基が修飾チミンである場合、前記修飾基は、アデニン残基またはグアニン残基が好ましい。すなわち、前記修飾塩基は、例えば、塩基が前記アデニン残基またはグアニン残基で修飾されている。前記アデニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位は、特に制限されず、例えば、前記アデニン残基における６位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記グアニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位は、特に制限されず、例えば、前記グアニン残基における２位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記アデニン残基または前記グアニン残基で修飾される前記被修飾塩基は、特に制限されないが、例えば、チミンが好ましく、チミンの５位の炭素に結合したメチル基の炭素が、前記アデニン残基または前記グアニン残基で修飾されていることが好ましい。
　前記修飾基が前記アデニン残基または前記グアニン残基の場合、例えば、以下に示すように、前記リンカーを介して、前記修飾基により前記被修飾塩基が修飾されていることが好ましい。
　　［ヌクレオチド残基］－［リンカー］－［アデニン残基］
　　［ヌクレオチド残基］－［リンカー］－［グアニン残基］
　前記リンカーは、特に制限されず、例えば、以下のように、前記ヌクレオチド残基と前記アデニン残基または前記グアニン残基との間の式で表されるが、これには限定されない。下記式において、(CH2)nにおけるｎの数値は、例えば、１～１０、２～１０、２である。
　［ヌクレオチド残基］　=C-C(=O)-NH-(CH2)n-　［アデニン残基］
　［ヌクレオチド残基］　=C-C(=O)-NH-(CH2)n-　［グアニン残基］
　［ヌクレオチド残基］　-C=C-C(=O)-NH-(CH2)n-　［アデニン残基］
　［ヌクレオチド残基］　=C-C(=O)-NH-CH2-CH2-　［アデニン残基］
　［ヌクレオチド残基］　=C-C(=O)-NH-CH2-CH2-　［グアニン残基］
　［ヌクレオチド残基］　-C=C-C(=O)-NH-CH2-CH2-　［アデニン残基］
　前記式において、前記リンカーの一端［＝Ｃ］および［－Ｃ］は、例えば、ヌクレオチド残基における被修飾塩基の炭素と、それぞれ、二重結合または単結合を形成し、前記リンカーの他端［ＣＨ２－］は、例えば、グアニン残基またはアデニン残基のアミン（－ＮＨ）と結合している。
　前記ポリヌクレオチドにおける前記グアニン残基で修飾されたチミジンヌクレオチド残基の具体例として、例えば、下記化学式（１０）に示す残基（以下、「ＮＧ７のヌクレオチド残基」ともいう）があげられる。なお、本発明は、これには限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　前記配列番号２および１４～１６の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、下線部のチミンが、前記ＮＧ７のヌクレオチド残基であることがより好ましい。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子が、例えば、前記ＮＧ７のヌクレオチド残基を有する場合、前記ポリヌクレオチドの合成には、例えば、前記化学式（４）に示すヌクレオチド三リン酸（以下、「ＮＧ７モノマー」ともいう）を、モノマー分子として使用することができる。前記ポリヌクレオチドの合成において、例えば、前記モノマー分子は、ホスホジエステル結合により、他のヌクレオチド三リン酸と結合する。前記ＮＧ７モノマーの製造方法については、後述する。
　前記修飾基としては、この他に、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、ベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、トリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
　前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’－デアザアデニン等があげられ、前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’－デアザグアニン等があげられ、前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’－メチルシトシン（５－Ｍｅ－ｄＣ）等があげられ、前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルチミン、５’－トリプタミノカルボニルチミン、５’－イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられ、前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’－トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’－イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。例示した前記修飾ウラシルは、チミンの修飾塩基ということもできる。
　前記ポリヌクレオチドは、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
　前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
　前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’－メチル化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－メチル化－シトシンヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－アミノ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－アミノ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－チオ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－チオ化－シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
　前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～１００個、１～９０個、１～８０個、１～７０個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１～９１個または１～７８個、前述の範囲と同様である。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～１００個、１～５０個、１～３０個、１～１０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長、１～５０塩基長、１～２５塩基長、１８～２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明のα－アミラーゼ核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。
　本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、前述のように、前記α－アミラーゼに結合性を示す。このため、本発明のα－アミラーゼ核酸分子の用途は、前記α－アミラーゼへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明のα－アミラーゼ核酸分子は、例えば、前記α－アミラーゼに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
＜α－アミラーゼ分析用センサ＞
　本発明のα－アミラーゼ分析用センサは、α－アミラーゼの分析用センサであって、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のα－アミラーゼ分析用センサは、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のα－アミラーゼ分析用センサを使用すれば、例えば、前記α－アミラーゼ核酸分子と前記α－アミラーゼとを結合させることで、前記α－アミラーゼを検出できる。本発明のα－アミラーゼ分析用センサは、例えば、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子の説明を援用できる。
　本発明のα－アミラーゼ分析用センサは、例えば、さらに担体を有し、前記担体に前記核酸分子が配置されている。前記核酸分子は、前記担体に固定化されていることが好ましい。前記担体への前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。本発明のα－アミラーゼ分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のα－アミラーゼ核酸分子および後述の本発明のα－アミラーゼの分析方法の説明を援用できる。
＜α－アミラーゼの分析方法＞
　本発明のα－アミラーゼの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα－アミラーゼを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のα－アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα－アミラーゼを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のα－アミラーゼ核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のα－アミラーゼの分析方法は、前記本発明のα－アミラーゼ核酸分子として、前記本発明のα－アミラーゼ分析用センサを使用してもよい。本発明のα－アミラーゼの分析方法の説明は、例えば、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子、α－アミラーゼの分析用センサの説明を援用できる。
　本発明によれば、前記本発明のα－アミラーゼ核酸分子が、α－アミラーゼに特異的に結合することから、例えば、α－アミラーゼと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のα－アミラーゼを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のα－アミラーゼの有無またはα－アミラーゼの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。
　本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、唾液、尿、血漿および血清等があげられる。
　前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
　前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中のα－アミラーゼと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記α－アミラーゼと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のα－アミラーゼの有無または量を分析する工程を含む。
　前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
　前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４～３７℃、１８～２５℃であり、接触時間は、例えば、１０～１２０分、３０～６０分である。
　前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
　前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のα－アミラーゼと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のα－アミラーゼの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のα－アミラーゼの量を分析（定量）できる。
　そして、前記α－アミラーゼと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にα－アミラーゼは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にα－アミラーゼが存在すると判断できる。
　前記α－アミラーゼと前記核酸分子との結合の分析方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。また、前記結合の検出は、例えば、前記α－アミラーゼと前記核酸分子との複合体の検出でもよい。
＜α－アミラーゼ検出キット＞
　本発明のα－アミラーゼ検出キットは、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記α－アミラーゼの検出等を行うことができる。本発明のα－アミラーゼ検出キットは、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子、α－アミラーゼ分析用センサ、α－アミラーゼの分析方法の説明を援用できる。
　本発明のα－アミラーゼ検出キットは、例えば、前記本発明のα－アミラーゼ核酸分子として、前記本発明のα－アミラーゼ分析用センサを含んでもよい。また、前記本発明のα－アミラーゼ検出キットは、例えば、前記本発明のα－アミラーゼ核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、緩衝液、使用説明書等があげられる。
＜ＣＲＰ結合核酸分子＞
　本発明のＣ反応タンパク質（ＣＲＰ）結合核酸分子（以下、「ＣＲＰ核酸分子」ともいう）は、下記（ｃ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｃ）下記（ｃ１）のポリヌクレオチド
（ｃ１）配列番号４～７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
　本発明のＣＲＰ核酸分子は、例えば、特に言及しない限り、「α－アミラーゼ」を「ＣＲＰ」に、「（ａ）」を「（ｃ）」に、「（ａ１）」を「（ｃ１）」に、「（ａ２）」を「（ｃ２）」に、「（ａ３）」を「（ｃ３）」に、「（ａ４）」を「（ｃ４）」に、「配列番号２および１４～１６」を「配列番号４～７」に読み替えて、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子、α－アミラーゼ分析用センサ、α－アミラーゼの分析方法およびα－アミラーゼ検出キットの説明を援用できる。また、この点は、後述するＣＲＰ分析用センサ、ＣＲＰの分析方法およびＣＲＰ検出キットの説明においても同様である。
　本発明のＣＲＰ核酸分子は、前述のようにＣＲＰに結合可能である。前記ＣＲＰは、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトＣＲＰのアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ０２７４１に登録されている。
　本発明において、「ＣＲＰに結合する」とは、例えば、ＣＲＰに対する結合能を有している、または、ＣＲＰに対する結合活性を有しているともいう。本発明のＣＲＰ核酸分子と前記ＣＲＰとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のＣＲＰ核酸分子は、ＣＲＰに結合することから、例えば、ＣＲＰの検出に使用できる。
　本発明のＣＲＰ核酸分子は、前述のように、下記（ｃ）のポリヌクレオチドを含む。
（ｃ）下記（ｃ１）のポリヌクレオチド
（ｃ１）配列番号４～７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
ＣＲＰ結合核酸分子１（配列番号４）
5’-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGCTAGTTCTGCCTTAATATGGTCGGTTAAGCGCATTCGACAGGCTGGACATATC-3’
ＣＲＰ結合核酸分子２（配列番号５）
5’-CGCACATCAGTTTAGCTAGTTCTGCCTTAATATGGTCGGTTAAGCGCA-3’
ＣＲＰ結合核酸分子３（配列番号６）
5’-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGGTCTGAAATCGCTTTCCGGATCGGACTTAAGCATTCGACAGGCTGGACATATC-3’
ＣＲＰ結合核酸分子４（配列番号７）
5’-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGACTCAAGTTATGCTGGACTTCTTTACAAACGCATTCGACAGGCTGGACATATC-3’
　前記（ｃ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｃ２）、（ｃ３）、または（ｃ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ｃ２）前記（ｃ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＣＲＰに結合するポリヌクレオチド
（ｃ３）前記（ｃ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＲＰに結合するポリヌクレオチド
（ｃ４）前記（ｃ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＣＲＰに結合するポリヌクレオチド
＜ＣＲＰ分析用センサ＞
　本発明のＣ反応タンパク質（ＣＲＰ）分析用センサは、Ｃ反応タンパク質（ＣＲＰ）の分析用センサであって、前記本発明のＣＲＰ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のＣＲＰ分析用センサは、前記本発明のＣＲＰ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、制限されない。本発明のＣＲＰ分析用センサを使用すれば、例えば、前記ＣＲＰ核酸分子と前記ＣＲＰとを結合させることで、前記ＣＲＰを検出できる。本発明のＣＲＰ分析用センサは、例えば、前記本発明のＣＲＰ結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のＣＲＰ分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のＣＲＰ核酸分子および後述の本発明のＣＲＰの分析方法の説明を援用できる。
＜ＣＲＰの分析方法＞
　本発明のＣ反応タンパク質（ＣＲＰ）の分析方法は、、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＣ反応タンパク質（ＣＲＰ）を検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＣＲＰ結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＣＲＰと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＣＲＰを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のＣＲＰ核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のＣＲＰの分析方法は、前記本発明のＣＲＰ核酸分子として、前記本発明のＣＲＰ分析用センサを使用してもよい。本発明のＣＲＰの分析方法の説明は、例えば、前記本発明のＣＲＰ結合核酸分子、ＣＲＰの分析用センサの説明を援用できる。
＜ＣＲＰ検出キット＞
　本発明のＣ反応タンパク質（ＣＲＰ）検出キットは、前記本発明のＣＲＰ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のＣＲＰ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ＣＲＰの検出等を行うことができる。本発明のＣＲＰ検出キットは、前記本発明のＣＲＰ結合核酸分子、ＣＲＰ分析用センサ、ＣＲＰの分析方法の説明を援用できる。
＜ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子＞
　本発明のβ－ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ結合核酸分子（以下、「ＢＤＮ４Ａ核酸分子」ともいう）は、下記（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｂ）下記（ｂ１）のポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号８～１０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
　本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子は、例えば、特に言及しない限り、「α－アミラーゼ」を「ＢＤＮ４Ａ」に、「（ａ）」を「（ｂ）」に、「（ａ１）」を「（ｂ１）」に、「（ａ２）」を「（ｂ２）」に、「（ａ３）」を「（ｂ３）」に、「（ａ４）」を「（ｂ４）」に、「配列番号２および１４～１６」を「配列番号８～１０」に読み替えて、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子、α－アミラーゼ分析用センサ、α－アミラーゼの分析方法およびα－アミラーゼ検出キットの説明を援用できる。また、この点は、後述するＢＤＮ４Ａ分析用センサ、ＢＤＮ４Ａの分析方法およびＢＤＮ４Ａ検出キットの説明においても同様である。
　本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子は、前述のようにＢＤＮ４Ａに結合可能である。前記ＢＤＮ４Ａは、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトＢＤＮ４Ａのアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｏ１５２６３に登録されている。
　本発明において、「ＢＤＮ４Ａに結合する」とは、例えば、ＢＤＮ４Ａに対する結合能を有している、または、ＢＤＮ４Ａに対する結合活性を有しているともいう。本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子と前記ＢＤＮ４Ａとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子は、ＢＤＮ４Ａに結合することから、例えば、ＢＤＮ４Ａの検出に使用できる。
　本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子は、前述のように、下記（ｂ）のポリヌクレオチドを含む。
（ｂ）下記（ｂ１）のポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号８～１０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１（配列番号８）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACTCTCCCCACCTGCATCTCCCCCCTCACCGCCTTCTGCACGGAGAGTCGGAAATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子２（配列番号９）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACTCTCCCCACCTGCATCTCCCCCCTCACCGCCTTCTGCACGGAGAGT-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子３（配列番号１０）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACTCTCCCCACCTGCATCTCCCCCCTCACCGCCTTCTGCA-3’
　前記（ｂ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｂ２）、（ｂ３）、または（ｂ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ｂ２）前記（ｂ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＢＤＮ４Ａに結合するポリヌクレオチド
（ｂ３）前記（ｂ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＢＤＮ４Ａに結合するポリヌクレオチド
（ｂ４）前記（ｂ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＢＤＮ４Ａに結合するポリヌクレオチド
＜ＢＤＮ４Ａ分析用センサ＞
　本発明のβ－ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ分析用センサは、β－ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａの分析用センサであって、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、制限されない。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサを使用すれば、例えば、前記ＢＤＮ４Ａ核酸分子と前記ＢＤＮ４Ａとを結合させることで、前記ＢＤＮ４Ａを検出できる。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサは、例えば、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子および後述の本発明のＢＤＮ４Ａの分析方法の説明を援用できる。
＜ＢＤＮ４Ａの分析方法＞
　本発明のβ－ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のβ－ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＢＤＮ４Ａと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＢＤＮ４Ａを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のＢＤＮ４Ａの分析方法は、前記本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子として、前記本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサを使用してもよい。本発明のＢＤＮ４Ａの分析方法の説明は、例えば、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子、ＢＤＮ４Ａの分析用センサの説明を援用できる。
＜ＢＤＮ４Ａ検出キット＞
　本発明のβ－ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ検出キットは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ＢＤＮ４Ａの検出等を行うことができる。本発明のＢＤＮ４Ａ検出キットは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子、ＢＤＮ４Ａ分析用センサ、ＢＤＮ４Ａの分析方法の説明を援用できる。
＜リゾチーム結合核酸分子＞
　本発明のリゾチーム結合核酸分子（以下、「リゾチーム核酸分子」ともいう）は、下記（ｌ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｌ）下記（ｌ１）のポリヌクレオチド
（ｌ１）配列番号１１および１２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
　本発明のリゾチーム核酸分子は、例えば、特に言及しない限り、「α－アミラーゼ」を「リゾチーム」に、「（ａ）」を「（ｌ）」に、「（ａ１）」を「（ｌ１）」に、「（ａ２）」を「（ｌ２）」に、「（ａ３）」を「（ｌ３）」に、「（ａ４）」を「（ｌ４）」に、「配列番号２および１４～１６」を「配列番号１１および１２」に読み替えて、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子、α－アミラーゼ分析用センサ、α－アミラーゼの分析方法およびα－アミラーゼ検出キットの説明を援用できる。また、この点は、後述するリゾチーム分析用センサ、リゾチームの分析方法およびリゾチーム検出キットの説明においても同様である。
　本発明のリゾチーム核酸分子は、前述のようにリゾチームに結合可能である。前記リゾチームは、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトリゾチームのアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ６１６２６に登録されている。
　本発明において、「リゾチームに結合する」とは、例えば、リゾチームに対する結合能を有している、または、リゾチームに対する結合活性を有しているともいう。本発明のリゾチーム核酸分子と前記リゾチームとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のリゾチーム核酸分子は、リゾチームに結合することから、例えば、リゾチームの検出に使用できる。
　本発明のリゾチーム核酸分子は、前述のように、下記（ｌ）のポリヌクレオチドを含む。
（ｌ）下記（ｌ１）のポリヌクレオチド
（ｌ１）配列番号１１および１２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
リゾチーム結合核酸分子１（配列番号１１）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACCGCCTGCTTCATTCTATCCTGAACTCACTACTTCTGCACGGAGAGTCGGAAATC-3’
リゾチーム結合核酸分子２（配列番号１２）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACCGCCTGCTTCATTCTATCCTGAACTCACTACTTCTGCACGG-3’
　前記（ｌ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｌ２）、（ｌ３）、または（ｌ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ｌ２）前記（ｌ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、リゾチームに結合するポリヌクレオチド
（ｌ３）前記（ｌ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リゾチームに結合するポリヌクレオチド
（ｌ４）前記（ｌ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、リゾチームに結合するポリヌクレオチド
＜リゾチーム分析用センサ＞
　本発明のリゾチーム分析用センサは、リゾチームの分析用センサであって、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のリゾチーム分析用センサは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のリゾチーム分析用センサを使用すれば、例えば、前記リゾチーム核酸分子と前記リゾチームとを結合させることで、前記リゾチームを検出できる。本発明のリゾチーム分析用センサは、例えば、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のリゾチーム分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のリゾチーム核酸分子および後述の本発明のリゾチームの分析方法の説明を援用できる。
＜リゾチームの分析方法＞
　本発明のリゾチームの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のリゾチームを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のリゾチームと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のリゾチームを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のリゾチーム核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のリゾチームの分析方法は、前記本発明のリゾチーム核酸分子として、前記本発明のリゾチーム分析用センサを使用してもよい。本発明のリゾチームの分析方法の説明は、例えば、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子、リゾチームの分析用センサの説明を援用できる。
＜リゾチーム検出キット＞
　本発明のリゾチーム検出キットは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記リゾチームの検出等を行うことができる。本発明のリゾチーム検出キットは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子、リゾチーム分析用センサ、リゾチームの分析方法の説明を援用できる。
＜ＬＤＨ５結合核酸分子＞
　本発明の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５結合核酸分子（以下、「ＬＤＨ５核酸分子」ともいう）は、下記（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｄ）下記（ｄ１）のポリヌクレオチド
（ｄ１）配列番号１７～２３のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
　本発明のＬＤＨ５核酸分子は、例えば、特に言及しない限り、「α－アミラーゼ」を「ＬＤＨ５」に、「（ａ）」を「（ｄ）」に、「（ａ１）」を「（ｄ１）」に、「（ａ２）」を「（ｄ２）」に、「（ａ３）」を「（ｄ３）」に、「（ａ４）」を「（ｄ４）」に、「配列番号２および１４～１６」を「配列番号１７～２３」に読み替えて、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子、α－アミラーゼ分析用センサ、α－アミラーゼの分析方法およびα－アミラーゼ検出キットの説明を援用できる。また、この点は、後述するＬＤＨ５分析用センサ、ＬＤＨ５の分析方法およびＬＤＨ５検出キットの説明においても同様である。
　本発明のＬＤＨ５核酸分子は、前述のようにＬＤＨ５に結合可能である。前記ＬＤＨ５は、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトＬＤＨ５のアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ００３３８に登録されている。
　本発明において、「ＬＤＨ５に結合する」とは、例えば、ＬＤＨ５に対する結合能を有している、または、ＬＤＨ５に対する結合活性を有しているともいう。本発明のＬＤＨ５核酸分子と前記ＬＤＨ５との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のＬＤＨ５核酸分子は、ＬＤＨ５に結合することから、例えば、ＬＤＨ５の検出に使用できる。
　本発明のＬＤＨ５核酸分子は、前述のように、下記（ｄ）のポリヌクレオチドを含む。
（ｄ）下記（ｄ１）のポリヌクレオチド
（ｄ１）配列番号１７～２３のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
ＬＤＨ５結合核酸分子１（配列番号１７）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGCCTCCGCTTGTGGATACGATGGACTAGTGGCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子２（配列番号１８）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGACCTTAGACACGGTACTTACCGACACTAAACCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子３（配列番号１９）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGTTAGATACTTGGCTCTACTTATTGACAATCCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子４（配列番号２０）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGCACTCCTGATTGCTTAAGATCTTAGTTCGACCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子５（配列番号２１）
5’-ACCTCGCCGTTTATGCCTCCGCTTGTGGATACGATGGACTAGTGGCCTAAGGC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子６（配列番号２２）
5’-ACCTCGCCGTTTATGACCTTAGACACGGTACTTACCGACACTAAACCTAAGG-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子７（配列番号２３）
5’-ACCTCGCCGTTTATGTTAGATACTTGGCTCTACTTATTGACAATCCCTAAG-3’
　前記（ｄ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｄ２）、（ｄ３）、または（ｄ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ｄ２）前記（ｄ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＬＤＨ５に結合するポリヌクレオチド
（ｄ３）前記（ｄ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＬＤＨ５に結合するポリヌクレオチド
（ｄ４）前記（ｄ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＬＤＨ５に結合するポリヌクレオチド
＜ＬＤＨ５分析用センサ＞
　本発明のＬＤＨ５分析用センサは、ＬＤＨ５の分析用センサであって、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のＬＤＨ５分析用センサは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のＬＤＨ５分析用センサを使用すれば、例えば、前記ＬＤＨ５核酸分子と前記ＬＤＨ５とを結合させることで、前記ＬＤＨ５を検出できる。本発明のＬＤＨ５分析用センサは、例えば、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のＬＤＨ５分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のＬＤＨ５核酸分子および後述の本発明のＬＤＨ５の分析方法の説明を援用できる。
＜ＬＤＨ５の分析方法＞
　本発明のＬＤＨ５の分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＬＤＨ５を検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＬＤＨ５と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＬＤＨ５を検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のＬＤＨ５核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のＬＤＨ５の分析方法は、前記本発明のＬＤＨ５核酸分子として、前記本発明のＬＤＨ５分析用センサを使用してもよい。本発明のＬＤＨ５の分析方法の説明は、例えば、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子、ＬＤＨ５の分析用センサの説明を援用できる。
＜ＬＤＨ５検出キット＞
　本発明のＬＤＨ５検出キットは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ＬＤＨ５の検出等を行うことができる。本発明のＬＤＨ５検出キットは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子、ＬＤＨ５分析用センサ、ＬＤＨ５の分析方法の説明を援用できる。
＜ＣｇＡ結合核酸分子＞
　本発明のクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）結合核酸分子（以下、「ＣｇＡ核酸分子」ともいう）は、下記（ｇ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｇ）下記（ｇ１）のポリヌクレオチド
（ｇ１）配列番号２４～３３のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
　本発明のＣｇＡ５核酸分子は、例えば、特に言及しない限り、「α－アミラーゼ」を「ＣｇＡ」に、「（ａ）」を「（ｇ）」に、「（ａ１）」を「（ｇ１）」に、「（ａ２）」を「（ｇ２）」に、「（ａ３）」を「（ｇ３）」に、「（ａ４）」を「（ｇ４）」に、「配列番号２および１４～１６」を「配列番号２４～３３」に読み替えて、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子、α－アミラーゼ分析用センサ、α－アミラーゼの分析方法およびα－アミラーゼ検出キットの説明を援用できる。また、この点は、後述するＣｇＡ分析用センサ、ＣｇＡの分析方法およびＣｇＡ検出キットの説明においても同様である。
　本発明のＣｇＡ核酸分子は、前述のようにＣｇＡに結合可能である。前記ＣｇＡは、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトＣｇＡのアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ１０６４５に登録されている。
　本発明において、「ＣｇＡに結合する」とは、例えば、ＣｇＡに対する結合能を有している、または、ＣｇＡに対する結合活性を有しているともいう。本発明のＣｇＡ核酸分子と前記ＣｇＡとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のＣｇＡ核酸分子は、ＣｇＡに結合することから、例えば、ＣｇＡの検出に使用できる。
　本発明のＣｇＡ核酸分子は、前述のように、下記（ｇ）のポリヌクレオチドを含む。
（ｇ）下記（ｇ１）のポリヌクレオチド
（ｇ１）配列番号２４～３３のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
ＣｇＡ結合核酸分子１（配列番号２４）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGAACGTGCTAAGTTCCCCGTTGTGCGCGCTGGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子２（配列番号２５）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGTTCTGTCTCCCCGCCTCCCTACCCCGAAACGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子３（配列番号２６）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGCGCATCATACTTGTCCCCCGACAGCTCGCAGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子４（配列番号２７）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGGAGTATTTACTCGGATTTGTTACCATTACAGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子５（配列番号２９）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGCGGGACGCTCGCCTGTTCTCTACATCAATCGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子６（配列番号２９）
5’-GTCAGCCTCCTAAAGAACGTGCTAAGTTCCCCGTTGTGCGCGCTGGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子７（配列番号３０）
5’-GTCAGCCTCCTAAAGAACGTGCTAAGTTCCCCGTTGTGCGCGCTGGTGAAGAACC-3’
ＣｇＡ結合核酸分子８（配列番号３１）
5’-GTCAGCCTCCTAAAGTTCTGTCTCCCCGCCTCCCTACCCCGAAACGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子９（配列番号３２）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGCGGGACGCTCGCCTGTTCTCTACATCAATCGTGAAGAACCCGCT-3’
ＣｇＡ結合核酸分子１０（配列番号３３）
5’-GTCAGCCTCCTAAAGCGGGACGCTCGCCTGTTCTCTACATCAATCGTGAAGAACCCGCT-3’
　前記（ｇ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｇ２）、（ｇ３）、または（ｇ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ｇ２）前記（ｇ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＣｇＡに結合するポリヌクレオチド
（ｇ３）前記（ｇ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣｇＡに結合するポリヌクレオチド
（ｇ４）前記（ｇ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＣｇＡに結合するポリヌクレオチド
＜ＣｇＡ分析用センサ＞
　本発明のＣｇＡ分析用センサは、ＣｇＡの分析用センサであって、前記本発明のＣｇＡ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のＣｇＡ分析用センサは、前記本発明のＣｇＡ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のＣｇＡ分析用センサを使用すれば、例えば、前記ＣｇＡ核酸分子と前記ＣｇＡとを結合させることで、前記ＣｇＡを検出できる。本発明のＣｇＡ分析用センサは、例えば、前記本発明のＣｇＡ結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のＣｇＡ分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のＣｇＡ核酸分子および後述の本発明のＣｇＡの分析方法の説明を援用できる。
＜ＣｇＡの分析方法＞
　本発明のＣｇＡの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＣｇＡを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＣｇＡ結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＣｇＡと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＣｇＡを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のＣｇＡ核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のＣｇＡの分析方法は、前記本発明のＣｇＡ核酸分子として、前記本発明のＣｇＡ分析用センサを使用してもよい。本発明のＣｇＡの分析方法の説明は、例えば、前記本発明のＣｇＡ結合核酸分子、ＣｇＡの分析用センサの説明を援用できる。
＜ＣｇＡ検出キット＞
　本発明のＣｇＡ検出キットは、前記本発明のＣｇＡ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のＣｇＡ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ＣｇＡの検出等を行うことができる。本発明のＣｇＡ検出キットは、前記本発明のＣｇＡ結合核酸分子、ＣｇＡ分析用センサ、ＣｇＡの分析方法の説明を援用できる。
＜ＩＬ－６結合核酸分子＞
　本発明のインターロイキン（ＩＬ）－６結合核酸分子（以下、「ＩＬ－６核酸分子」ともいう）は、下記（ｉ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｉ）下記（ｉ１）のポリヌクレオチド
（ｉ１）配列番号３４～３５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
　本発明のＩＬ－６核酸分子は、例えば、特に言及しない限り、「α－アミラーゼ」を「ＩＬ－６」に、「（ａ）」を「（ｉ）」に、「（ａ１）」を「（ｉ１）」に、「（ａ２）」を「（ｉ２）」に、「（ａ３）」を「（ｉ３）」に、「（ａ４）」を「（ｉ４）」に、「配列番号２および１４～１６」を「配列番号３４～３５」に読み替えて、前記本発明のα－アミラーゼ結合核酸分子、α－アミラーゼ分析用センサ、α－アミラーゼの分析方法およびα－アミラーゼ検出キットの説明を援用できる。また、この点は、後述するＩＬ－６分析用センサ、ＩＬ－６の分析方法およびＩＬ－６検出キットの説明においても同様である。
　本発明のＩＬ－６核酸分子は、前述のようにＩＬ－６に結合可能である。前記ＩＬ－６は、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトＩＬ－６のアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ０５２３１に登録されている。
　本発明において、「ＩＬ－６に結合する」とは、例えば、ＩＬ－６に対する結合能を有している、または、ＩＬ－６に対する結合活性を有しているともいう。本発明のＩＬ－６核酸分子と前記ＩＬ－６との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のＩＬ－６核酸分子は、ＩＬ－６に結合することから、例えば、ＩＬ－６の検出に使用できる。
　本発明のＩＬ－６核酸分子は、前述のように、下記（ｉ）のポリヌクレオチドを含む。
（ｉ）下記（ｉ１）のポリヌクレオチド
（ｉ１）配列番号３４～３５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
ＩＬ－６結合核酸分子１（配列番号３４）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAGTCAATTTCCGCGTTTTCCGGAATTCGGGCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＩＬ－６結合核酸分子２（配列番号３５）
5’-ACCTCGCCGTTTATGAGTCAATTTCCGCGTTTTCCGGAATTCGGGCCTAAGGCTGGCTGG-3’
　前記（ｉ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｉ２）、（ｉ３）、または（ｉ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ｉ２）前記（ｉ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＩＬ－６に結合するポリヌクレオチド
（ｉ３）前記（ｉ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＩＬ－６に結合するポリヌクレオチド
（ｉ４）前記（ｉ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＩＬ－６に結合するポリヌクレオチド
＜ＩＬ－６分析用センサ＞
　本発明のＩＬ－６分析用センサは、ＩＬ－６の分析用センサであって、前記本発明のＩＬ－６結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のＩＬ－６分析用センサは、前記本発明のＩＬ－６結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のＩＬ－６分析用センサを使用すれば、例えば、前記ＩＬ－６核酸分子と前記ＩＬ－６とを結合させることで、前記ＩＬ－６を検出できる。本発明のＩＬ－６分析用センサは、例えば、前記本発明のＩＬ－６結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のＩＬ－６分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のＩＬ－６核酸分子および後述の本発明のＩＬ－６の分析方法の説明を援用できる。
＜ＩＬ－６の分析方法＞
　本発明のＩＬ－６の分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＩＬ－６を検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＩＬ－６結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＩＬ－６と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＩＬ－６を検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のＩＬ－６核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のＩＬ－６の分析方法は、前記本発明のＩＬ－６核酸分子として、前記本発明のＩＬ－６分析用センサを使用してもよい。本発明のＩＬ－６の分析方法の説明は、例えば、前記本発明のＩＬ－６結合核酸分子、ＩＬ－６の分析用センサの説明を援用できる。
＜ＩＬ－６検出キット＞
　本発明のＩＬ－６検出キットは、前記本発明のＩＬ－６結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のＩＬ－６結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ＩＬ－６の検出等を行うことができる。本発明のＩＬ－６検出キットは、前記本発明のＩＬ－６結合核酸分子、ＩＬ－６分析用センサ、ＩＬ－６の分析方法の説明を援用できる。
　以下に実施例を示して、本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
［実施例１］
　以下に示す合成例により、ＮＧ４～７を調製した。
　エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）は、質量分析装置（API2000、販売元：Applied Biosystems社製）を用い、ポジティブイオンモードまたはネガティイオンモードで実施した。1H　NMRスペクトルは、核磁気共鳴装置（JNM-ECS400、JEOL社製）を用い、取得した。化学シフトは、内部標準であるテトラメチルシラン（Ｍｅ４Ｓｉ）に対する相対値δ（ｐｐｍ）として表される。イオン交換クロマトグラフは、クロマトグラフシステム（ECONO system、Bio-Rad社製）を用いて実施した。前記イオン交換クロマトグラフでは、diethylaminoethyl（ＤＥＡＥ）A-25-Sephadex（Amershambiosciences社製）を充填したガラスカラム（φ２５×５００ｍｍ）を使用した。
（合成例１）ＮＨ１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　Ethylendiamine(７ｍＬ、１０５ｍｍｏｌ、１ｅｑ．)を溶かしたＣＨＣｌ３（１２０ｍＬ)に、tert-butyl　dicarbonate(５ｇ、２２．９ｍｍｏｌ、０．２ｅｑ．)を溶かしたＣＨＣｌ３（２０ｍＬ)を、撹拌しながら滴下した。前記滴下から２４時間後、吸引ろ過し、ろ液を減圧留去し、ＮＨ１を得た。ＮＨ１の物性値を以下に示す。
収量：３．５７３ｇ　収率：９７．４％
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 161.4, calculated for [(M+H)+] = 161.1
1HNMR(400 MHz, CDCl3) δ3.13 (2H, q) 2.76 (2H, t) 1.41 (9H, s)
（合成例２）ＮＧ１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　2,6-Dichloropurine（１０００ｍｇ、５．２９×１０－３ｍｏｌ、１．０ｅｑ．)をＡｒ（アルゴン）置換し、水酸化ナトリウム水溶液（１０．６ｍＬ、２．１２×１０－２ｍｏｌ、２Ｎ）に溶かした後、９０℃で還流させ、反応を行った。前記反応後、室温に戻し、吸引ろ過した。得られたろ物を回収し、最小量の水に溶かし、ｐＨを３～４に調整し、析出したろ物を吸引ろ過で回収することで、ＮＧ１を得た。ＮＧ１の物性値を以下に示す。
収量：７２０ｍｇ　収率：７９％
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 171.0, calculated for [(M+H)+] = 171.0
found = 193.1, calculated for [(M+Na)+] = 193.0
found = 209.1, calculated for [(M+K)+] = 209.0
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 169.0, calculated for [(M-H)-] = 518.0
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.29 (1H, s)
（合成例３）ＮＧ２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　ＮＧ１（８７０ｍｇ、５．１０×１０－３ｍｏｌ)およびＮＨ１(３．２８１ｇ、２．０５×１０－２ｍｏｌ, 4ｅｑ．)を、それぞれ真空乾燥させた後、Ａｒ置換した。ＮＧ１をＭｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ（５ｍＬ）で懸濁させ、ＮＨ１をＭｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ（１ｍＬ）に溶解させた。得られたＮＨ１の溶液をＮＧ１の入っているナスフラスコへ移し、１３０℃で還流させ、反応を行った。前記反応後、室温に戻し、減圧留去した。さらに、クロロホルムで再沈後、吸引ろ過し、ろ物を回収することで、ＮＧ２を得た。ＮＧ２の物性値を以下に示す。
収量：１．１１７ｍｇ　収率：７４％
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 171.0, calculated for [(M+H)+] = 171.0,
found = 193.1, calculated for [(M+Na)+] = 193.0,
found = 209.1, calculated for [(M+K)+] = 209.0,
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 169.0, calculated for [(M-H)-] = 518.0
1HNMR (400 MHz, CD3OD) δ7.73 (1H, s), 3.45 (2H, m), 3.30 (2H,s), 1.39 (9H, s)
（合成例４）ＮＧ３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　ＮＧ２（５００ｍｇ、１．７０×１０－３ｍｏｌ)を、メタノール（３ｍＬ）で懸濁し、Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ（１５ｍＬ）を加え、室温で撹拌し、反応を行った。前記反応後、減圧留去し、Ｅｔｈｅｒで懸濁させた後、吸引ろ過し、ろ物を回収することで、ＮＧ３を得た。ＮＧ３の物性値を以下に示す。
収量：４６７ｍｇ　収率：８９．１％
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 195.1, calculated for [(M+H)+] = 195.1,
found = 217.2, calculated for [(M+Na)+] = 217.1,
found = 233.0, calculated for [(M+K)+] = 233.1
1HNMR (400 MHz, D2O) δ7.83 (1H, s), 3.55 (2H, t), 3.11 (2H, t)
（合成例５）ＮＧ４の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　ナスフラスコＡに、（Ｅ）－５－（２－Ｃａｒｂｏｘｙｒｉｎｙｌ）－２’－deoxyuridine（１０１ｍｇ、３．３９×１０－４ｍｏｌ）と撹拌子とを入れた。また、ナスフラスコＢに、ＮＧ３（１７１ｍｇ、４．１２×１０－４ｍｏｌ、１．２ｅｑ．）と撹拌子とを入れた。そして、ナノフラスコＡおよびＢについて、それぞれ、真空乾燥させた。つぎに、ナスフラスコＡをＡｒ置換し、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（６８ｍｇ、４．４４×１０－４ｍｏｌ、１．３ｅｑ．）およびＰｙＢＯＰ（登録商標）（ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム、２２９ｍｇ、４．４０×１０－４ｍｏｌ、１．３ｅｑ．)を加え、ｄｒｙ－ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、１ｍＬ）で溶解した。さらに、ナスフラスコＢをＡｒ置換し、ｄｒｙ－ＤＭＦ（０．５ｍＬ）で溶かした。ナスフラスコＡおよびＢに、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ナスフラスコＡ：０．７９ｍＬ、４．５１×１０－３ｍｏｌ、１３．３ｅｑ．、ナスフラスコＢ：０．７９ｍＬ、４．５１×１０－３ｍｏｌ、６．７ｅｑ．）をそれぞれ加えた後、ナスフラスコＢの中身をナスフラスコＡに素早く加え、室温で撹拌し、反応を行った。前記反応後、減圧留去し、ＣＤＣｌ３（重水素化クロロホルム）で懸濁した。さらに、得られた懸濁液をソニケーションし、ろ過した。得られたろ物を回収後、ＭｅＯＨで懸濁し、さらに、ソニケーション後、ろ過した。得られたろ物を回収することで、ＮＧ４を得た。ＮＧ４の物性値を以下に示す。
収量：１４７ｍｇ　収率：９１％
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 475.1, calculated for [(M+H)+] = 475.2,
found = 497.2, calculated for [(M+Na)+] = 497.2,
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 473.1, calculated for [(M-H)-] = 473.2
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.27 (1H, s), 8.20 (1H, s), 7.10 (1H,s), 7.05 (1H, s), 6.13 (1H, t), 5.25 (1H, d), 5.16 (1H, m), 4.09 (1H, m), 3.79 (1H, m), 3.60 (2H, m), 3.16 (2H, d), 2.14 (2H, m)
（合成例６）ＮＧ５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　ＮＧ４（１０１ｍｇ、２．１３×１０－４ｍｏｌ）を真空乾燥後、Ａｒ下、ｄｒｙ－Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（３０ｍＬ）で２回共沸した。つぎに、ｄｒｙ－Trimetyl phosphate（２１ｍＬ）で懸濁後、氷浴下でＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ（４００μＬ、４．２９×１０－３ｍｏｌ、２０ｅｑ．）を加え、２．５時間撹拌した。前記撹拌後、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ（２００μＬ、２．１５×１０－３ｍｏｌ、１０ｅｑ．）を追加し、８．５時間撹拌した。その後、冷水１０ｍＬを加えクエンチし、１０分間撹拌した。ＴＥＡ（トリエチルアミン、２．７ｍＬ、１．９４×１０－２ｍｏｌ、９０ｅｑ．)を加え、１５分程撹拌した。そして、減圧留去後、ＥｔｈｅｒおよびＭｅＣＮ（アセトニトリル）で結晶化させ、ろ過することにより、黄色沈殿物を回収した。得られた黄色沈殿物を水に溶かし、陰イオン交換カラムクロマトグラフにより精製し、凍結乾燥させることでＮＧ５を得た。ＮＧ５の物性値を以下に示す。
収量：４１．４９μｍｏｌ　収率：１９．５％
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 553.1, calculated for [(M-H)-] = 553.1
（合成例７）ＮＧ６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　ＮＧ５（７８．６５μｍｏｌ）を真空乾燥後、ｄｒｙ－Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）で３回共沸し、さらに一晩真空乾燥させた。前記乾燥後、これをＡｒで置換し、ｄｒｙ－ＤＭＦ（２ｍＬ）およびｄｒｙ－ＴＥＡ（７２μＬ、５．１９×１０-４ｍｏｌ、４ｅｑ．）で溶かし、さらに、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（２４ｍｇ、３．５３×１０－４ｍｏｌ、４ｅｑ．）、２，２’－Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｙｒｉｄｉｎｅ（２９ｍｇ、１．３２×１０－４ｍｏｌ、１．６ｅｑ．)、およびＴｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（３６ｍｇ、１．３７×１０－４ｍｏｌ、１．６ｅｑ．）を加えて室温で撹拌した。前記攪拌開始後８時間において、反応液を、Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（９７ｍｇ、７．９２×１０－４ｍｏｌ、１０ｅｑ．）をｄｒｙ－Ａｃｅｔｏｎｅ（１８ｍＬ）、ｄｒｙ－Ｅｔｈｅｒ（２７ｍＬ）、およびｄｒｙ－ＴＥＡ（２ｍＬ）で溶かした溶液に入れ、４℃で３０分静置した。前記静置後、沈殿物をｄｒｙ－Ｅｔｈｅｒ（１２ｍＬ）で５回デカンテーションした。デカンテーション後の沈殿物を真空乾燥させ、ＮＧ６をクルードとして得た。
理論収量：７８．６５μｍｏｌ
（合成例８）ＮＧ７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　真空乾燥させたＮＧ６（７８．６５μｍｏｌ）を、Ａｒで置換し、ｄｒｙ－Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）で２回共沸した後、ｄｒｙ－ＤＭＦ（１ｍＬ）で懸濁した。つぎに、得られた懸濁液に、ｄｒｙ－ｎ－Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ（７５μＬ、３．１５×１０－４ｍｏｌ、４ｅｑ．）および０．５ｍｏｌ／Ｌ　ｎ－Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｎ　ＤＭＦ（０．８ｍＬ、３．９３×１０－４ｍｏｌ、５ｅｑ．）を加え、室温で撹拌した。前記攪拌開始後９時間において、１ｍｏｌ／Ｌ　ＴＥＡＢ（Triethylammonium bicarbonate）　ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＬ）を加えた後、３０分撹拌し、減圧留去した。これに水を加え、Ｅｔｈｅｒで２回分液後、水層を陰イオン交換カラムクロマトグラフおよび逆相カラムクロマトグラフを用いて精製し、凍結乾燥することで、ＮＧ７を得た。ＮＧ７の物性値を以下に示す。
収量：１９．５５μｍｏｌ　収率：２４．９％
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 712.9, calculated for [(M-H)-] = 713.1
［実施例２］
　ＮＧ７を用いて、ｓＩｇＡに結合する結合核酸分子およびヒトα－アミラーゼに結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
（１）結合核酸分子
　アデニン、グアニンまたはシトシンを含むデオキシリボヌクレオチド（それぞれ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ）に加え、デオキシリボヌクレオチドとしてＮＧ７を用いて作製した候補ポリヌクレオチドを用いた以外は、ＳＥＬＥＸ法によりターゲットに対する結合核酸分子を取得した。具体的には、ビーズ（Dynabeads MyOne Carboxylic Acid、Invitrogen社）にターゲットであるｓＩｇＡ（MP Biomedicals,LLC-Cappel Products社製）またはヒト唾液アミラーゼ（Lee BioSolutions, Inc社製）を、添付のプロトコルに基づいて結合させた。前記結合後、セレクションバッファー（ＳＢバッファー：４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．５）で洗浄し、ターゲットビーズを調製した。５’末端をビオチン修飾した相補鎖（フォワード（Ｆｗ）プライマー領域－Ｎ３０（３０塩基）－リバース（Ｒｖ）プライマー領域）と、フォワードプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（KOD Dash、東洋紡社製）と、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＮＧ７とを用いて、ＮＧ７が挿入されたｄｓＤＮＡを調製した。つぎに、前記ビーズ（Dynabeads MyOne Carboxylic Acid）に前記ｄｓＤＮＡを結合させた後、０．０２ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ水溶液によりｓｓ（single strand）ＤＮＡを溶出した。さらに、０．０８ｍｏｌ／Ｌ　塩酸水溶液で中和することで、ｓｓＤＮＡのライブラリを調製した。２０ｐｍｏｌのライブラリを２５０μｇの前記ターゲットビーズと２５℃、１５分の条件で混合後、前記ＳＢバッファーでビーズを洗浄した。そして、７ｍｏｌ／Ｌの尿素水溶液によりビーズ結合ｓｓＤＮＡを溶出した。溶出したｓｓＤＮＡを前記フォワードプライマーとビオチン修飾したリバースプライマーとを用いてＰＣＲにより増幅した。なお、前記ＰＣＲでは、デオキシリボヌクレオチドとして、チミンを含むデオキシリボヌクレオチド（ｄＴＴＰ）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰを用いた。得られたｄｓＤＮＡを磁気ビーズ（Dynabeads MyOne SA C1 magnetic beads、Invitrogen社製）に結合させた後、０．０２ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ水溶液によりフォワード鎖を溶出し、除去した。前記除去後、前記磁気ビーズを前記ＳＢバッファーで洗浄した。前記相補鎖が固相化された磁気ビーズと、フォワードプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（KOD Dash、東洋紡社製）と、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびＮＧ７とを用いて、前述の方法でＮＧ７が挿入されたｄｓＤＮＡを調製した。つぎに、０．０２ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ水溶液によりフォワード鎖を溶出することによりｓｓＤＮＡのライブラリを調製し、このライブラリを次のラウンドに使用した。同様の工程を８ラウンド実施することで、ｓＩｇＡまたはアミラーゼに結合する結合核酸分子をセレクション後、フォワードプライマーと、ビオチン修飾していないリバースプライマーを用いてＰＣＲを行なった。そして、シーケンサー（GS junior sequencer、Roche社製）により、得られた核酸分子のシーケンスを行った。
　この結果、ｓＩｇＡに対する結合核酸分子として、下記配列番号１の塩基配列からなる結合核酸分子が、アミラーゼに対する結合核酸分子として、下記配列番号２の塩基配列からなる結合核酸分子が得られた。下記配列番号１および２の塩基配列において、下線で示すＴが、ＮＧ７である。
ｓＩｇＡ結合核酸分子（配列番号１）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTGCTGATGTTTGTATTTCAAATTAGCCGCAGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α－アミラーゼ結合核酸分子１（配列番号２）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCCGTTGTTTCAACAGCAAATGTTAGGCAATTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
（２）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合の確認
　前記ｓＩｇＡ結合核酸分子とｓＩｇＡとの結合および前記α－アミラーゼ結合核酸分子１とα－アミラーゼとの結合を下記ＳＰＲ条件により測定した。なお、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子および前記α－アミラーゼ結合核酸分子１は、下記リガンド２として、その３’末端に２０塩基長のポリｄＡを付加したものを使用した。さらに、コントロールは、下記アナライトとして、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた以外は同様にして結合を確認した。
（ＳＰＲ測定条件）
測定装置：ProteOn（商標）XPR36（BioRad社製）
測定チップ：ProteOn（商標）NLC Sensor Chip（BioRad社製）
リガンド１：５’末端をビオチン修飾したｐｏｌｙｄＴ（２０塩基長)：５μｍｏｌ／Ｌ
バッファー：４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４)、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０
リガンド２：２００ｎｍｏｌ／Ｌの３’末端にｐｏｌｙＡ（２０塩基長）を付加した結合核酸分子を含むバッファー
Ligand Flow Rate：２５μＬ／ｍｉｎ、８０ｓｅｃ
アナライト（Analyte）：４００ｎｍｏｌ／Ｌのターゲットを含むバッファー
Analyte Flow Rate：５０μＬ／ｍｉｎ
Contact Time：１２０ｓｅｃ
Dissociation：３００ｓｅｃ
・sIgA： IgA (Secretory) ,Human（MP Biomedicals, LLC-Cappel Products社製、カタログ番号： #55905）
・アミラーゼ：α－アミラーゼ（Lee Biosolutions社製、カタログ番号：#120-10)
・BSA：Bovine Serum Albumin（SIGMA社製、カタログ番号：#A7906）
　前記ｓＩｇＡ結合核酸分子とｓＩｇＡとの結合の結果を図１に、前記α－アミラーゼ結合核酸分子１とアミラーゼとの結合の結果を図２に示す。図１は、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子のｓＩｇＡに対する結合能を示すグラフである。図１において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図１に示すように、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子は、ＢＳＡには結合せず、ｓＩｇＡに結合した。
　つぎに、図２は、前記α－アミラーゼ結合核酸分子１のアミラーゼに対する結合能を示すグラフである。図２において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図２に示すように、前記α－アミラーゼ結合核酸分子１は、ＢＳＡには結合せず、α－アミラーゼに結合した。
　これらのことから、本発明のヌクレオシド誘導体であるＮＧ７を用いて、ｓＩｇＡに結合する結合核酸分子およびα－アミラーゼに結合する結合核酸分子を取得できることがわかった。
（３）結合力の確認
　前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＡを付加した前記ｓＩｇＡ結合核酸分子を用い、アナライトであるｓＩｇＡの濃度を、１２．５、２５、５０、１００、または２００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。また、前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＡを付加した前記α－アミラーゼ結合核酸分子１を用い、アナライトであるα－アミラーゼの濃度を、５、１０、２０、４０、または８０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子と前記ｓＩｇＡとの解離定数、および前記α－アミラーゼ結合核酸分子１と前記α－アミラーゼとの解離定数を算出した。この結果、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子と前記ｓＩｇＡとの解離定数は、１１．８ｎＭであり、前記α－アミラーゼ結合核酸分子１と前記α－アミラーゼとの解離定数は、０．６９ｎＭであった。これらの結果から、いずれの結合核酸分子も極めて優れたターゲットとの結合能を有することがわかった。
（４）キャピラリー電気泳動による結合の確認
　前記α－アミラーゼ結合核酸分子１とα－アミラーゼとの結合を下記キャピラリー電気泳動条件により測定した。なお、前記α－アミラーゼ結合核酸分子１は、下記クローンとして、その５’末端を２０塩基長のＴＹＥ（商標）６６５で標識化したものを使用した。コントロールは、前記ターゲットにおいて、α－アミラーゼを添加しなかった以外は同様にして、測定した。
（キャピラリー電気泳動条件）
測定装置：SV1210形コスモアイ（日立ハイテクノロジー社）
測定チップ：i-チップ12（HitachiChemical社）
泳動ゲル：０．６％（Hydroxypropyl）methyl cellulose, viscosity 2.600-5,600（SIGMA社製、カタログ番号： #H7509）
ゲル溶解バッファー：４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２
クローン：２００ｎｍｏｌ／Ｌの５’末端をＴＹＥ（商標）６６５で標識化したα－アミラーゼ結合核酸分子１、４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２を含む溶液
ターゲット：４μｍｏｌ／Ｌのα－アミラーゼ（α-Amylase - High Purity ,Human 、Lee BioSolutions, Inc.社製、カタログ番号：#120-10）、４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２を含む溶液
Folding：９５℃、５ｍｉｎ後、Ｏｎ　ｉｃｅ　５ｍｉｎ
Mixing：ターゲットを添加後、室温（２５℃前後）、３０分間、１０００ｒｐｍ
Injection Voltage：６００V
Injection Time：１２０ｓｅｃ
Separation Voltage：３５０Ｖ
Separation Time：２６０ｓｅｃ
　この結果を図３に示す。図３は、キャピラリー電気泳動の結果を示す写真である。図３において、写真の左側は、泳動時間を示し、各レーンは、左から、コントロール（α－アミラーゼ無し）およびα－アミラーゼありの結果を示す。図３に示すように、α－アミラーゼ無しのコントロールと比較して、α－アミラーゼありの場合、泳動時間が長くなった。これらの結果から、前記α－アミラーゼ結合核酸分子１が、α－アミラーゼと結合することが分かった。
（５）プルダウンによる結合の確認
　５’末端をビオチン修飾したｓＩｇＡ結合核酸分子およびα－アミラーゼ結合核酸分子１を、それぞれ、ストレプトアビジンで修飾されたビーズ（Dynabeads MyOne SA C1 magnetic beads、Invitrogen社製）と接触させることにより、ｓＩｇＡ結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＡ」ともいう）およびα－アミラーゼ結合核酸分子結合ビーズ１（以下、「結合ビーズＢ１」ともいう）を調製した。つぎに、前記結合ビーズＡおよびＢ１を、それぞれ、唾液を含むＳＢバッファー（唾液サンプル）またはｓＩｇＡもしくはα－アミラーゼを含むＳＢバッファー（ターゲットサンプル）と混合し、室温（２５℃前後）で６０分間、１０００ｒｐｍで振盪した。
　つぎに、振盪後の結合ビーズＡおよびＢ１を、前記ＳＢバッファーで３回洗浄処理した。そして、ＳＤＳバッファーの存在下、９５℃で１０分間処理することで、前記結合ビーズＡおよびＢ１に結合したｓＩｇＡおよびアミラーゼを溶出した。前記ＳＤＳバッファーの組成は、６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ、２％ＳＤＳ、５％スクロース、０．００２％ブロモフェノールブルー、１％２－メルカプトエタノールとした。
　得られた溶出液をゲル（ＰＡＧＥＬ Ｃ５０Ｌ、ＡＴＴＯ社製）にロードし、泳動バッファーの存在下、電気泳動を行なった。前記泳動バッファーの組成は、２５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ、１９２ｍｍｏｌ／Ｌ　グリシン、０．１％ＳＤＳとした。つぎに、泳動後のゲルを染色剤（Ｇｅｌ　Ｃｏｄｅ、Thermo SCIENTIFIC社製、カタログ番号：#24594）で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（BioRad社製）で撮影した。また、コントロール１は、５’末端をビオチン修飾したα－アミラーゼに結合しない核酸分子（コントロールの核酸分子１）を使用した以外は同様にして、コントロール２は、ｓＩｇＡのみまたはα－アミラーゼのみを使用した以外は同様にして、撮影した。
コントロールの核酸分子１（配列番号３）
5’-GGATACCTTAACGCCGCCTATTG-3’
　前記結合ビーズＡを用いた結果を図４に示す。図４は、前記結合ビーズＡを用いたプルダウンの結果を示す写真である。図４において、（Ａ）は、前記唾液サンプルの結果を示し、（Ｂ）は、前記ターゲットサンプルの結果を示す。図４（Ａ）において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍ）、前記唾液サンプル（１）、コントロール１（Ｃ１）、およびコントロール２（ＩｇＡ）を示す。また、図４（Ｂ）において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍ）、前記ターゲットサンプル（１）、コントロール１（Ｃ１）、およびコントロール２（ＩｇＡ）を示す。図４（Ａ）および（Ｂ）に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約２５ｋＤａおよび約５０ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記唾液サンプルおよび前記ターゲットサンプルでは、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子とｓＩｇＡとの結合が確認された。これらの結果から、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子が、ｓＩｇＡと結合することが分かった。
　つぎに、前記結合ビーズＢ１を用いた結果を図５に示す。図５は、前記結合ビーズＢ１を用いたプルダウンの結果を示す写真である。図５において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍ）、前記唾液サンプル（４）、コントロール１（Ｃ１）、およびコントロール２（ＡＭＹ）を示す。図５に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約５０ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記唾液サンプルでは、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、前記α－アミラーゼ結合核酸分子１とα－アミラーゼとの結合が確認された。これらの結果から、前記α－アミラーゼ結合核酸分子１が、α－アミラーゼと結合することが分かった。
［実施例３］
　ＮＧ７を用いて、ヒトＣＲＰに結合する結合核酸分子、ヒトβ－ディフェンシン４Ａおよびヒトリゾチームに結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
（１）結合核酸分子
　ヒトＣＲＰに結合する結合核酸分子、ヒトβ－ディフェンシン４Ａに結合する結合核酸分子およびヒトリゾチームに結合する結合核酸分子は、ターゲットであるｓＩｇＡに代えて、ヒトＣＲＰ（Acris Antibodies GmBH社製、カタログ番号：#P100-0）、ヒトβ－ディフェンシン４Ａ（Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#C127）またはヒトリゾチーム（Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#P61626）を用いた以外は、前記実施例２（１）と同様にして、取得した。
　この結果、ＣＲＰに結合する結合核酸分子として、下記配列番号４～７の塩基配列からなる結合核酸分子が、β－ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａに結合する結合核酸分子として、下記配列番号８～１０の塩基配列からなる結合核酸分子が、リゾチームに対する結合核酸分子として、下記配列番号１１および１２の塩基配列からなる結合核酸分子が得られた。下記配列番号４～１２の塩基配列において、下線で示すＴが、ＮＧ７である。
ＣＲＰ結合核酸分子１（配列番号４）
5’-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGCTAGTTCTGCCTTAATATGGTCGGTTAAGCGCATTCGACAGGCTGGACATATC-3’
ＣＲＰ結合核酸分子２（配列番号５）
5’-CGCACATCAGTTTAGCTAGTTCTGCCTTAATATGGTCGGTTAAGCGCA-3’
ＣＲＰ結合核酸分子３（配列番号６）
5’-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGGTCTGAAATCGCTTTCCGGATCGGACTTAAGCATTCGACAGGCTGGACATATC-3’
ＣＲＰ結合核酸分子４（配列番号７）
5’-GGTTACGCCGCACATCAGTTTAGACTCAAGTTATGCTGGACTTCTTTACAAACGCATTCGACAGGCTGGACATATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１（配列番号８）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACTCTCCCCACCTGCATCTCCCCCCTCACCGCCTTCTGCACGGAGAGTCGGAAATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子２（配列番号９）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACTCTCCCCACCTGCATCTCCCCCCTCACCGCCTTCTGCACGGAGAGT-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子３（配列番号１０）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACTCTCCCCACCTGCATCTCCCCCCTCACCGCCTTCTGCA-3’
リゾチーム結合核酸分子１（配列番号１１）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACCGCCTGCTTCATTCTATCCTGAACTCACTACTTCTGCACGGAGAGTCGGAAATC-3’
リゾチーム結合核酸分子２（配列番号１２）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAACCGCCTGCTTCATTCTATCCTGAACTCACTACTTCTGCACGG-3’
（２）ＳＰＲによる結合の確認
　各ＣＲＰ結合核酸分子とＣＲＰとの結合、各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子とＢＤＮ４Ａとの結合、および各リゾチーム結合核酸分子とリゾチームとの結合は、前記リガンド２として、その３’末端に２０塩基長のポリｄＡを付加したＣＲＰ結合核酸分子、ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子、またはリゾチーム結合核酸分子を用い、アナライトとして、下記のタンパク質を用いた以外は、前記実施例２（２）と同様にして実施した。また、コントロールは、前記アナライトとして、α－アミラーゼおよび牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の少なくとも一方を用いた以外は同様にして結合を確認した。
・CRP：CRP, Human <C-Reactive Protein> (Acris Antibodies GmBH社製、カタログ番号：#P100-0)
・β-Defensin 4A：β-Defensin 4A ,Human (Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#C127) 
・human Lysozyme：Recombinant Human Lysozyme C (Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#P61626)
　各ＣＲＰ結合核酸分子とＣＲＰとの結合の結果を図６に、各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子とＢＤＮ４Ａとの結合の結果を図７に、各リゾチーム結合核酸分子とリゾチームとの結合の結果を図８に示す。
　図６は、各ＣＲＰ結合核酸分子のＣＲＰに対する結合能を示すグラフである。図６において、（Ａ）～（Ｄ）は、それぞれ、前記ＣＲＰ結合核酸分子１～４の結果を示す。図６において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図６に示すように、各ＣＲＰ結合核酸分子は、α－アミラーゼおよびＢＳＡには結合せず、ＣＲＰに結合した。
　つぎに、図７は、各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子のＢＤＮ４Ａに対する結合能を示すグラフである。図７において、（Ａ）～（Ｃ）は、それぞれ、前記ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１～３の結果を示す。図７において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図７に示すように、前記ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子は、α－アミラーゼおよびＢＳＡには結合せず、ＢＤＮ４Ａに結合した。
　つぎに、図８は、各リゾチーム結合核酸分子のリゾチームに対する結合能を示すグラフである。図８において、（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、前記リゾチーム結合核酸分子１および２の結果を示す。図８において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図８に示すように、前記リゾチーム結合核酸分子は、α－アミラーゼおよびＢＳＡには結合せず、リゾチームに結合した。
　これらのことから、本発明のヌクレオシド誘導体であるＮＧ７を用いて、ＣＲＰに結合する結合核酸分子、ＢＤＮ４Ａに結合する結合核酸分子、およびリゾチームに結合する結合核酸分子を取得できることがわかった。
（３）結合力の確認
　前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＡを付加した各ＣＲＰ結合核酸分子を用い、アナライトであるＣＲＰの濃度を、１．２５、２．５、５、１０、もしくは２０ｎｍｏｌ／Ｌ、または５０、１００、２００、４００、もしくは８００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例３（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。また、前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＡを付加した各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を用い、アナライトであるＢＤＮ４Ａの濃度を、１００、２００、４００、８００、または１６００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例３（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。さらに、前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＡを付加した各リゾチーム結合核酸分子を用い、アナライトであるリゾチームの濃度を１２．５、２５、５０、１００、もしくは２００ｎｍｏｌ／Ｌ、または３．１２５、６．２５、もしくは１２．５ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例３（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、各ＣＲＰ結合核酸分子とＣＲＰとの解離定数、各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子とＢＤＮ４Ａとの解離定数、および各リゾチーム結合核酸分子と前記リゾチームとの解離定数を算出した。これらの結果を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　前記表１に示すように、いずれの結合核酸分子も極めて優れたターゲットとの結合能を有することがわかった。
（４）プルダウンによる結合の確認
　５’末端をビオチン修飾したＣＲＰ結合核酸分子１、ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１、およびリゾチーム結合核酸分子１を、それぞれ、前記ストレプトアビジンで修飾されたビーズと接触させることにより、ＣＲＰ結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＣ」ともいう）、ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＤ」ともいう）およびリゾチーム結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＥ」ともいう）を調製した。つぎに、前記結合ビーズＣ～Ｅを、それぞれ、９０（ｖ／ｖ）％の唾液を含むＳＢバッファー（唾液サンプル）またはＣＲＰ、ＢＤＮ４Ａ、もしくはリゾチームを含むＳＢバッファー（ターゲットサンプル）と混合した以外は、前記実施例２（５）と同様にして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、ゲルを撮影した。また、コントロール１は、５’末端をビオチン修飾した下記のコントロールの核酸分子２を使用した以外は同様にして、コントロール２は、ＣＲＰ、ＢＤＮ４Ａ、またはリゾチームのみを使用した以外は同様にして、撮影した。
コントロールの核酸分子２（配列番号１３）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAAC-3’
　前記結合ビーズＣを用いた結果を図９に示す。図９は、前記結合ビーズＣを用いたプルダウンの結果を示す写真である。図９において、レーン２およびレーンＣ１は、前記ターゲットサンプルの結果を示し、レーン４およびレーンＣ２は、前記唾液サンプルの結果を示す。図９において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、レーンＭ（マーカー）、レーン２（ターゲットサンプル）、レーンＣ１（コントロール１）、レーンＣＲＰ（コントロール２）、レーン４（唾液サンプル）、レーンＣ２（コントロール１）、およびレーンＭ（マーカー）を示す。図９に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約２５ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記ターゲットサンプルおよび前記唾液サンプルでは、図中の矢印で示すように、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、前記ＣＲＰ結合核酸分子１とＣＲＰとの結合が確認された。これらの結果から、前記ＣＲＰ結合核酸分子が、ＣＲＰと結合することが分かった。
　つぎに、前記結合ビーズＤを用いた結果を図１０に示す。図１０は、前記結合ビーズＤを用いたプルダウンの結果を示す写真である。図１０において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、レーンＭ（マーカー）、レーン３（ターゲットサンプル）、レーンＣ１（コントロール１）、レーンｈＢＤＮ（コントロール２）、レーンＭ（マーカー）、レーン７（唾液サンプル）、レーンＣ２（コントロール１）、およびレーンｈＢＤＮ（コントロール２）を示す。図１０に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約１０ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記ターゲットサンプルおよび前記唾液サンプルでは、図中の矢印で示すように、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、前記ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１とＢＤＮ４Ａとの結合が確認された。これらの結果から、前記ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子が、ＢＤＮ４Ａと結合することが分かった。
　つぎに、前記結合ビーズＥを用いた結果を図１１に示す。図１１は、前記結合ビーズＥを用いたプルダウンの結果を示す写真である。図１１において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、レーンＭ（マーカー）、レーン１（ターゲットサンプル）、レーンＣ１（コントロール１）、レーンｈＬｙｓ（コントロール２）、レーンＭ（マーカー）、レーン３（唾液サンプル）、レーンＣ２（コントロール１）、およびレーンｈＬｙｓ（コントロール２）を示す。図１１に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約１５ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記ターゲットサンプルおよび前記唾液サンプルでは、図中の矢印で示すように、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、前記リゾチーム結合核酸分子１とリゾチームとの結合が確認された。これらの結果から、前記リゾチーム結合核酸分子が、リゾチームと結合することが分かった。
［実施例４］
　ＮＧ７を用いて、ヒトα－アミラーゼに結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
（１）結合核酸分子
　ヒトα－アミラーゼに結合する結合核酸分子は、ターゲットであるｓＩｇＡに代えて、前述のヒトα－アミラーゼを用いた以外は、前記実施例２（１）と同様にして、取得した。
　この結果、α－アミラーゼに結合する結合核酸分子として、下記配列番号１４～１６の塩基配列からなる結合核酸分子が得られた。下記配列番号１４～１６の塩基配列において、下線で示すＴが、ＮＧ７である。
α－アミラーゼ結合核酸分子２（配列番号１４）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTGCCCTGAAGAACTTTGATCACGTTATTTTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α－アミラーゼ結合核酸分子３（配列番号１５）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCCCACAATTGTAGCTATTATTTCATGCGTTGGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α－アミラーゼ結合核酸分子４（配列番号１６）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTTGTGTCCGTTATGGTCCATTGAATCAAGAGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
（２）ＳＰＲによる結合の確認
　各α－アミラーゼ結合核酸分子とα－アミラーゼとの結合は、前記実施例２（２）における前記α－アミラーゼ結合核酸分子１と同様にして、実施した。また、コントロールは、前記アナライトとして、ＢＳＡを用いた以外は同様にして結合を確認した。これらの結果を図１２に示す。
　図１２は、各α－アミラーゼ結合核酸分子のα－アミラーゼに対する結合能を示すグラフである。図１２において、（Ａ）～（Ｃ）は、それぞれ、前記α－アミラーゼ結合核酸分子２～４の結果を示す。図１２において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図１２に示すように、各α－アミラーゼ結合核酸分子は、ＢＳＡには結合せず、α－アミラーゼに結合した。
（３）結合力の確認
　前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＡを付加した各α－アミラーゼ結合核酸分子を用い、アナライトであるα－アミラーゼの濃度を、５、１０、２０、４０、または８０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例４（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、前記各α－アミラーゼ結合核酸分子と前記α－アミラーゼとの解離定数を算出した。この結果、前記α－アミラーゼ結合核酸分子２～４と前記α－アミラーゼとの解離定数は、それぞれ、５．１１、１．２９、および１．６４ｎＭであった。これらの結果から、いずれの結合核酸分子も極めて優れたターゲットとの結合能を有することがわかった。
（４）キャピラリー電気泳動による結合の確認
　前記α－アミラーゼ結合核酸分子１に加え、前記α－アミラーゼ結合核酸分子３および４を用いた以外は、前記実施例２（４）と同様にして、測定した。また、コントロールは、前記ターゲットにおいて、α－アミラーゼを添加しなかった以外は同様にして、測定した。
　この結果を図１３に示す。図１３は、キャピラリー電気泳動の結果を示す写真である。図１３において、写真の左側は、泳動時間を示し、各レーンは、左から、前記α－アミラーゼ結合核酸分子３のコントロール（α－アミラーゼ無し）およびα－アミラーゼあり、前記α－アミラーゼ結合核酸分子１のコントロール（アミラーゼ無し）およびα－アミラーゼあり、ならびに前記α－アミラーゼ結合核酸分子４のコントロール（α－アミラーゼ無し）およびα－アミラーゼありの結果を示す。図１３に示すように、各α－アミラーゼ結合核酸分子において、α－アミラーゼ無しのコントロールと比較して、α－アミラーゼありの場合、泳動時間が長くなった。これらの結果から、前記α－アミラーゼ結合核酸分子１、３および４が、α－アミラーゼと結合することが分かった。
（５）プルダウンによる結合の確認
　５’末端をビオチン修飾したα－アミラーゼ結合核酸分子３および４を、それぞれ、前記ストレプトアビジンで修飾されたビーズと接触させることにより、α－アミラーゼ結合核酸分子結合ビーズ３（以下、「結合ビーズＢ３」ともいう）およびα－アミラーゼ結合核酸分子結合ビーズ４（以下、「結合ビーズＢ４」ともいう）を調製した。そして、前記結合ビーズＢ１に加え、前記結合ビーズＢ３およびＢ４を用い、前記サンプルとして、α－アミラーゼを含むターゲットサンプルを用いた以外は、前記実施例２（５）と同様にして、撮影した。また、コントロール１は、５’末端をビオチン修飾したα－アミラーゼに結合しない核酸分子（前記コントロールの核酸分子１）を使用した以外は同様にして、コントロール２は、α－アミラーゼのみを使用した以外は同様にして、撮影した。
　これらの結果を図１４に示す。図１４は、前記結合ビーズＢ１、Ｂ３およびＢ４を用いたプルダウンの結果を示す写真である。図１４において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍ）、前記結合ビーズＢ３（３）、前記結合ビーズＢ１（４）、前記結合ビーズＢ４（５）、コントロール１（Ｃ１）、およびコントロール２（ＡＭＹ）を示す。図１４に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約５０ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記結合ビーズＢ１、Ｂ３およびＢ４では、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、α－アミラーゼ結合核酸分子１、３、および４とα－アミラーゼとの結合が確認された。これらの結果から、前記α－アミラーゼ結合核酸分子１、３、および４が、α－アミラーゼと結合することが分かった。
［実施例５］
　ＮＧ７を用いて、ヒトＬＤＨ５、ヒトＣｇＡおよびヒトＩＬ－６に結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
（１）結合核酸分子
　ヒトＬＤＨ５に結合する結合核酸分子、ヒトＣｇＡに結合する結合核酸分子およびヒトＩＬ－６に結合する結合核酸分子は、ターゲットであるｓＩｇＡに代えて、ヒトＬＤＨ５（Meridian Life Science, Inc.社製、カタログ番号：#A38558H-100)、ヒトＣｇＡ（Creative BioMart社製、カタログ番号：#CHGA-26904TH）またはヒトＩＬ－６（MP Biomedicals,LLC-Cappel Products社製、カタログ番号：#55905）を用いた以外は、前記実施例２（１）と同様にして、取得した。
　この結果、ＬＤＨ５に結合する結合核酸分子として、下記配列番号１７～２３の塩基配列からなる結合核酸分子が、ＣｇＡに結合する結合核酸分子として、下記配列番号２４～３３の塩基配列からなる結合核酸分子が、ＩＬ－６に対する結合核酸分子として、下記配列番号３４および３５の塩基配列からなる結合核酸分子が得られた。下記配列番号１７～３５の塩基配列において、下線で示すＴが、ＮＧ７である。
ＬＤＨ５結合核酸分子１（配列番号１７）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGCCTCCGCTTGTGGATACGATGGACTAGTGGCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子２（配列番号１８）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGACCTTAGACACGGTACTTACCGACACTAAACCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子３（配列番号１９）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGTTAGATACTTGGCTCTACTTATTGACAATCCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子４（配列番号２０）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGCACTCCTGATTGCTTAAGATCTTAGTTCGACCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子５（配列番号２１）
5’-ACCTCGCCGTTTATGCCTCCGCTTGTGGATACGATGGACTAGTGGCCTAAGGC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子６（配列番号２２）
5’-ACCTCGCCGTTTATGACCTTAGACACGGTACTTACCGACACTAAACCTAAGG-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子７（配列番号２３）
5’-ACCTCGCCGTTTATGTTAGATACTTGGCTCTACTTATTGACAATCCCTAAG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子１（配列番号２４）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGAACGTGCTAAGTTCCCCGTTGTGCGCGCTGGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子２（配列番号２５）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGTTCTGTCTCCCCGCCTCCCTACCCCGAAACGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子３（配列番号２６）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGCGCATCATACTTGTCCCCCGACAGCTCGCAGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子４（配列番号２７）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGGAGTATTTACTCGGATTTGTTACCATTACAGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子５（配列番号２９）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGCGGGACGCTCGCCTGTTCTCTACATCAATCGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子６（配列番号２９）
5’-GTCAGCCTCCTAAAGAACGTGCTAAGTTCCCCGTTGTGCGCGCTGGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子７（配列番号３０）
5’-GTCAGCCTCCTAAAGAACGTGCTAAGTTCCCCGTTGTGCGCGCTGGTGAAGAACC-3’
ＣｇＡ結合核酸分子８（配列番号３１）
5’-GTCAGCCTCCTAAAGTTCTGTCTCCCCGCCTCCCTACCCCGAAACGTGAAGAACCCGCTCATTGGAATTG-3’
ＣｇＡ結合核酸分子９（配列番号３２）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAGCGGGACGCTCGCCTGTTCTCTACATCAATCGTGAAGAACCCGCT-3’
ＣｇＡ結合核酸分子１０（配列番号３３）
5’-GTCAGCCTCCTAAAGCGGGACGCTCGCCTGTTCTCTACATCAATCGTGAAGAACCCGCT-3’
ＩＬ－６結合核酸分子１（配列番号３４）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAGTCAATTTCCGCGTTTTCCGGAATTCGGGCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＩＬ－６結合核酸分子２（配列番号３５）
5’-ACCTCGCCGTTTATGAGTCAATTTCCGCGTTTTCCGGAATTCGGGCCTAAGGCTGGCTGG-3’
（２）ＳＰＲによる結合の確認
　各ＬＤＨ５結合核酸分子とＬＤＨ５との結合、各ＣｇＡ結合核酸分子とＣｇＡとの結合、および各ＩＬ－６結合核酸分子とＩＬ－６との結合は、前記リガンド２として、その３’末端に２０塩基長のポリｄＡを付加したＬＤＨ５結合核酸分子、ＣｇＡ結合核酸分子、またはＩＬ－６結合核酸分子を用い、アナライトとして、下記のタンパク質を用いた以外は、前記実施例２（２）と同様にして実施した。また、コントロールは、前記アナライトとして、α－アミラーゼおよびｓＩｇＡを用いた以外は同様にして結合を確認した。
・LDH5：Lactate Dehydrogenase 5 ,Human (Meridian Life Science, Inc.社製、カタログ番号：#A38558H-100)
・CgA： Recombinant full length Human Chromogranin A (Creative BioMart社製、カタログ番号：#CHGA-26904TH)
・IL-6： IL-6, Human, Recombinant (PeproTech社製、カタログ番号：#200-06)
・アミラーゼ：α－アミラーゼ(Lee　Biosolutions社製、カタログ番号：#120-10)
・sIgA: IgA (Secretory) ,Human (MP Biomedicals,LLC-Cappel Products社製、カタログ番号：#55905)
　各ＬＤＨ５結合核酸分子とＬＤＨ５との結合の結果を図１５に、各ＣｇＡ結合核酸分子とＣｇＡとの結合の結果を図１６および１７に、各ＩＬ－６結合核酸分子とＩＬ－６との結合の結果を図１８に示す。
　図１５は、各ＬＤＨ５結合核酸分子のＬＤＨ５に対する結合能を示すグラフである。図１５において、（Ａ）～（Ｇ）は、それぞれ、前記ＣＲＰ結合核酸分子１～７の結果を示す。図１５において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図１５に示すように、各ＣＲＰ結合核酸分子は、α－アミラーゼおよびｓＩｇＡには結合せず、ＬＤＨ５に結合した。
　つぎに、図１６および１７は、各ＣｇＡ結合核酸分子のＣｇＡに対する結合能を示すグラフである。図１６において、（Ａ）～（Ｆ）は、それぞれ、前記ＣｇＡ結合核酸分子１～６の結果を示し、図１７において、（Ａ）～（Ｄ）は、それぞれ、前記ＣｇＡ結合核酸分子７～１０の結果を示す。図１６および１７において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図１６および１７に示すように、前記ＣｇＡ結合核酸分子は、α－アミラーゼおよびｓＩｇＡには結合せず、ＣｇＡに結合した。
　つぎに、図１８は、各ＩＬ－６結合核酸分子のＩＬ－６に対する結合能を示すグラフである。図１８において、（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、前記ＩＬ－６結合核酸分子１および２の結果を示す。図１８において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図１８に示すように、前記ＩＬ－６結合核酸分子は、α－アミラーゼおよびｓＩｇＡには結合せず、ＩＬ－６に結合した。
　つぎに、各結合核酸分子の測定チップへの固定化量と、各核酸分子とターゲットとの結合量に基づき、各結合核酸分子の結合能を検討した。具体的には、リガンド２のインジェクション後のシグナル強度（ＲＵ）を測定し、これを各核酸分子の測定チップへの固層化量を示すシグナルとして、核酸分子固層化測定値（Ａ）とした。また、アナライトのインジェクションおよびバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。そして、インジェクション開始を０秒として、１１５～１２５秒の間におけるシグナル強度の平均値を求め、これを、各結合核酸分子とターゲットとの結合量を示すシグナルとして、ターゲット結合測定値（Ｂ）とした。そして、ターゲット結合測定値（Ｂ）を核酸分子固層化測定値（Ａ）で割った値（Ｂ／Ａ）を、相対値（Relative　Unit）として求め、これを結合能とした。また、コントロールは、前記アナライトとして、α－アミラーゼおよびｓＩｇＡを用いた以外は同様にして結合能を確認した。
　各ＬＤＨ５結合核酸分子の結果を図１９に、各ＣｇＡ結合核酸分子の結果を図２０に、各ＩＬ－６結合核酸分子の結果を図２１に示す。
　図１９は、各ＬＤＨ５結合核酸分子のＬＤＨ５への結合量の相対値（Relative　Unit）を示すグラフである。図１９において、横軸は、ＬＤＨ５結合核酸分子の種類を示し、縦軸は、相対値を示す。図１９に示すように、α－アミラーゼまたはｓＩｇＡを用いたコントロールでは結合が確認できなかった。これに対し、いずれのＬＤＨ５結合核酸分子も、ＬＤＨ５に結合した。
　図２０は、各ＣｇＡ結合核酸分子のＣｇＡへの結合量の相対値を示すグラフである。図２０において、横軸は、ＣｇＡ結合核酸分子の種類を示し、縦軸は、相対値を示す。図２０に示すように、α－アミラーゼまたはｓＩｇＡを用いたコントロールでは結合が確認できなかった。これに対し、いずれのＣｇＡ結合核酸分子も、ＣｇＡに結合した。
　図２１は、各ＩＬ－６結合核酸分子のＩＬ－６への結合量の相対値を示すグラフである。図２１において、横軸は、ＩＬ－６結合核酸分子の種類を示し、縦軸は、相対値を示す。図２１に示すように、α－アミラーゼまたはｓＩｇＡを用いたコントロールでは結合が確認できなかった。これに対し、いずれのＩＬ－６結合核酸分子も、ＩＬ－６に結合した。
　これらのことから、本発明のヌクレオシド誘導体であるＮＧ７を用いて、ＬＤＨ５に結合する結合核酸分子、ＣｇＡに結合する結合核酸分子、およびＩＬ－６に結合する結合核酸分子を取得できることがわかった。
（３）結合力の確認
　前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＡを付加した各ＬＤＨ５結合核酸分子を用い、アナライトであるＬＤＨ５の濃度を、１．２５、２．５、５、１０、もしくは２０ｎｍｏｌ／Ｌ、または６．２５、１２．５、２５、５０、もしくは１００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例５（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。また、前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＡを付加した各ＣｇＡ結合核酸分子を用い、アナライトであるＣｇＡの濃度を、１２．５、２５、５０、１００、もしくは２００ｎｍｏｌ／Ｌ、または２５、５０、１００、２００、もしくは４００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例５（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。さらに、前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＡを付加した各ＩＬ－６結合核酸分子を用い、アナライトであるＩＬ－６の濃度を６．２５、１２．５、２５、５０、もしくは１００ｎｍｏｌ／Ｌ、または１２．５、２５、５０、１００、もしくは２００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例５（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、各ＬＤＨ５結合核酸分子とＬＤＨ５との解離定数、各ＣｇＡ結合核酸分子とＣｇＡとの解離定数、および各ＩＬ－６結合核酸分子と前記ＩＬ－６との解離定数を算出した。これらの結果を下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　前記表２に示すように、いずれの結合核酸分子も極めて優れたターゲットとの結合能を有することがわかった。特に、ＬＤＨ５結合核酸分子５、ＬＤＨ５結合核酸分子６、ＣｇＡ結合核酸分子１、およびＣｇＡ結合核酸分子６は、ターゲットと極めて優れた結合能を示した。
（４）プルダウンによる結合の確認
　５’末端をビオチン修飾したＬＤＨ５結合核酸分子３およびＣｇＡ結合核酸分子１を、それぞれ、前記ストレプトアビジンで修飾されたビーズと接触させることにより、ＬＤＨ５結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＬ」ともいう）およびＣｇＡ結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＧ」ともいう）を調製した。つぎに、前記結合ビーズＬおよびＧを、それぞれ、９０（ｖ／ｖ）％の唾液を含むＳＢバッファー（唾液サンプル）またはＬＤＨ５もしくはＣｇＡを含むＳＢバッファー（ターゲットサンプル）と混合した以外は、前記実施例２（５）と同様にして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、ゲルを撮影した。また、コントロール１は、５’末端をビオチン修飾した下記のコントロールの核酸分子３または４を使用した以外は同様にして、コントロール２は、ＬＤＨ５またはＣｇＡのみを使用した以外は同様にして、撮影した。なお、前記コントロールの核酸分子３および４は、それぞれ、ＬＤＨ５結合核酸分子３およびＣｇＡ結合核酸分子１のコントロールとして用いた。
コントロールの核酸分子３（配列番号３６）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATG-3’
コントロールの核酸分子４（配列番号３７）
5’-GGTTTGTCCAGTCAGCCTCCTAAAG-3’
　前記結合ビーズＬを用いた結果を図２２に示す。図２２は、前記結合ビーズＬを用いたプルダウンの結果を示す写真である。図２２において、レーン１およびレーンＣ１は、前記ターゲットサンプルの結果を示し、レーン２およびレーンＣ２は、前記唾液サンプルの結果を示す。図２２において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、レーンＭ（マーカー）、レーン１（ターゲットサンプル）、レーンＣ１（コントロール１）、レーンＬＤＨ５（コントロール２）、レーン２（唾液サンプル）、およびレーンＣ２（コントロール１）を示す。図２２に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約３５ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記ターゲットサンプルおよび前記唾液サンプルでは、図中の矢印で示すように、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、前記ＬＤＨ５結合核酸分子３とＬＤＨ５との結合が確認された。これらの結果から、前記ＬＤＨ５結合核酸分子が、ＬＤＨ５と結合することが分かった。
　つぎに、前記結合ビーズＧを用いた結果を図２３に示す。図２３は、前記結合ビーズＧを用いたプルダウンの結果を示す写真である。図２３において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、レーンＭ（マーカー）、レーン１（ターゲットサンプル）、レーンＣ１（コントロール１）、レーンＣｇＡ（コントロール２）、レーン２（唾液サンプル）、レーンＣ２（コントロール１）、およびレーンＭ（マーカー）を示す。図２３に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約５０～６０ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記ターゲットサンプルおよび前記唾液サンプルでは、図中の矢印で示すように、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、前記ＣｇＡ結合核酸分子１とＣｇＡとの結合が確認された。これらの結果から、前記ＣｇＡ結合核酸分子が、ＣｇＡと結合することが分かった。
　以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
　この出願は、２０１６年９月１５日に出願された日本出願特願２０１６－１８０８９３および２０１７年５月３０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１７／０２００６４を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
＜付記＞
　上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない
（付記１）
下記化学式（１）で表されることを特徴とする、ヌクレオシド誘導体またはその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 前記化学式（１）中、
Ｓｕは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（－ＮＲ１－）、エーテル基（－Ｏ－）、またはチオエーテル基（－Ｓ－）であり、
Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基である。
（付記２）
Ｘ１が、イミノ基（－ＮＲ１－）である、付記１記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記３）
Ｘ２が、イミノ基（－ＮＲ１－）である、付記１または２記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記４）
Ｒ１が、水素原子である、付記２または３記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記５）
Ｌ１が、ビニレン基（－ＣＨ＝ＣＨ－）である、付記１から４のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記６）
Ｌ２が、エチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－）である、付記１から５のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記７）
前記ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団または前記ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団が、下記化学式（２）で表される、付記１から６のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 前記化学式（２）中、
Ｒ２は、水素原子、保護基、または下記化学式（３）で表される基であり、
Ｒ３は、水素原子、保護基、またはホスホロアミダイト基であり、
Ｒ４は、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 前記化学式（３）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｚは、ヒドロキシル基またはイミダゾール基であり、
ｍは、１～１０の整数である。
（付記８）
前記化学式（１）で表されるヌクレオシド誘導体が、下記化学式（４）で表されるヌクレオシド誘導体である、付記１から７のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 （付記９）
付記１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの合成試薬。
（付記１０）
付記１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの製造方法。
（付記１１）
付記１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
（付記１２）
前記ポリヌクレオチドが、ターゲットに結合する結合核酸分子である、付記１１記載のポリヌクレオチド。
（付記１３）
前記ターゲットが、分泌型免疫グロブリンＡ、アミラーゼ、Ｃ反応タンパク質（ＣＲＰ）、β－ディフェンシン４Ａ、リゾチーム、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）、およびインターロイキン（ＩＬ）－６からなる群から選択された少なくとも一つである、付記１２記載のポリヌクレオチド。
（付記１４）
候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および
前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、
前記候補ポリヌクレオチドが、付記１１から１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする、結合核酸分子の製造方法。
（付記１５）
前記ターゲットが、分泌型免疫グロブリンＡ、アミラーゼ、Ｃ反応タンパク質（ＣＲＰ）、β－ディフェンシン４Ａ、リゾチーム、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）、およびインターロイキン（ＩＬ）－６からなる群から選択された少なくとも一つである、付記１４記載の製造方法。
（付記１６）
下記（ａ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、α－アミラーゼ結合核酸分子。
（ａ）下記（ａ１）のポリヌクレオチド
（ａ１）配列番号２および１４～１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記１７）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記１６記載のα－アミラーゼ結合核酸分子。
（付記１８）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである、付記１７記載のα－アミラーゼ結合核酸分子。
（付記１９）
前記修飾基が、グアニン残基である、付記１８記載のα－アミラーゼ結合核酸分子。
（付記２０）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記１６から１９のいずれか一項に記載のα－アミラーゼ結合核酸分子。
（付記２１）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα－アミラーゼを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記１６から２０のいずれか一項に記載のα－アミラーゼ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のα－アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα－アミラーゼを検出することを特徴とする、α－アミラーゼの分析方法。
（付記２２）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記２１記載のα－アミラーゼの分析方法。
（付記２３）
下記（ｃ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、Ｃ反応タンパク質（ＣＲＰ）結合核酸分子。
（ｃ）下記（ｃ１）のポリヌクレオチド
（ｃ１）配列番号４～７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記２４）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記２３記載のＣＲＰ結合核酸分子。
（付記２５）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである、付記２４記載のＣＲＰ結合核酸分子。
（付記２６）
前記修飾基が、グアニン残基である、付記２５記載のＣＲＰ結合核酸分子。
（付記２７）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記２３から２６のいずれか一項に記載のＣＲＰ結合核酸分子。
（付記２８）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＣ反応タンパク質（ＣＲＰ）を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記２３から２７のいずれか一項に記載のＣＲＰ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＣＲＰと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＣＲＰを検出することを特徴とする、ＣＲＰの分析方法。
（付記２９）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記２８記載のＣＲＰの分析方法。
（付記３０）
下記（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、β－ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ結合核酸分子。
（ｂ）下記（ｂ１）のポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号８～１０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記３１）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記３０記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記３２）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである、付記３１記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記３３）
前記修飾基が、グアニン残基である、付記３２記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記３４）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記３０から３３のいずれか一項に記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記３５）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のβ－ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記３０から３４のいずれか一項に記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＢＤＮ４Ａと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＢＤＮ４Ａを検出することを特徴とする、ＢＤＮ４Ａの分析方法。
（付記３６）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記３５記載のＢＤＮ４Ａの分析方法。
（付記３７）
下記（ｌ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、リゾチーム結合核酸分子。
（ｌ）下記（ｌ１）のポリヌクレオチド
（ｌ１）配列番号１１および１２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記３８）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記３７記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記３９）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである、付記３８記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記４０）
前記修飾基が、グアニン残基である、付記３９記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記４１）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記３７から４０のいずれか一項に記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記４２）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のリゾチームを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記３７から４１のいずれか一項に記載のリゾチーム結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のリゾチームと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のリゾチームを検出することを特徴とする、リゾチームの分析方法。
（付記４３）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記４２記載のリゾチームの分析方法。
（付記４４）
下記（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５結合核酸分子。
（ｄ）下記（ｄ１）のポリヌクレオチド
（ｄ１）配列番号１７～２３のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記４５）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記４４記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記４６）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである、付記４５記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記４７）
前記修飾基が、グアニン残基である、付記４６記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記４８）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記４４から４７のいずれか一項に記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記４９）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記４４から４８のいずれか一項に記載のＬＤＨ５結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＬＤＨ５と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＬＤＨ５を検出することを特徴とする、ＬＤＨ５の分析方法。
（付記５０）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記４９記載のＬＤＨ５の分析方法。
（付記５１）
下記（ｇ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）結合核酸分子。
（ｇ）下記（ｇ１）のポリヌクレオチド
（ｇ１）配列番号２４～３３のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記５２）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記５１記載のＣｇＡ結合核酸分子。
（付記５３）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである、付記５２記載のＣｇＡ結合核酸分子。
（付記５４）
前記修飾基が、グアニン残基である、付記５３記載のＣｇＡ結合核酸分子。
（付記５５）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記５１から５４のいずれか一項に記載のＣｇＡ結合核酸分子。
（付記５６）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記５１から５５のいずれか一項に記載のＣｇＡ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＣｇＡと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＣｇＡを検出することを特徴とする、ＣｇＡの分析方法。
（付記５７）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記５６記載のＣｇＡの分析方法。
（付記５８）
下記（ｉ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、インターロイキン（ＩＬ）－６結合核酸分子。
（ｉ）下記（ｉ１）のポリヌクレオチド
（ｉ１）配列番号３４～３５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記５９）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記５８記載のＩＬ－６結合核酸分子。
（付記６０）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである、付記５９記載のＩＬ－６結合核酸分子。
（付記６１）
前記修飾基が、グアニン残基である、付記６０記載のＩＬ－６結合核酸分子。
（付記６２）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記５８から６１のいずれか一項に記載のＩＬ－６結合核酸分子。
（付記６３）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のインターロイキン（ＩＬ）－６を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記５８から６２のいずれか一項に記載のＩＬ－６結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＩＬ－６と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＩＬ－６を検出することを特徴とする、ＩＬ－６の分析方法。
（付記６４）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記６３記載のＩＬ－６の分析方法。
　本発明によれば、新たなヌクレオシド誘導体またはその塩を提供できる。また、本発明のヌクレオシド誘導体は、ピリミジン環に加え、プリン環様の構造を含む。このため、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、分子内または分子間で相互作用可能な原子の数が、ピリミジン環の構造を１つ含むヌクレオシド誘導体より相対的に多い。このため、本発明のヌクレオシド誘導体を含む結合核酸分子は、例えば、ピリミジン環の構造を１つ含むヌクレオシド誘導体と比較して、ターゲットに対する結合能が向上する。このため、本発明のヌクレオシド誘導体によれば、例えば、ターゲットに対し優れた結合能を示す結合核酸分子を製造できる。したがって、本発明は、例えば、分析分野、医療分野、ライフサイエンス分野等の分野において、極めて有用である。

Claims (15)

  1. 下記化学式（１）で表されることを特徴とする、ヌクレオシド誘導体またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     前記化学式（１）中、
    Ｓｕは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
    Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基であり、
    Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（－ＮＲ１－）、エーテル基（－Ｏ－）、またはチオエーテル基（－Ｓ－）であり、
    Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２～１０の炭化水素基である。
  2. Ｘ１が、イミノ基（－ＮＲ１－）である、請求項１記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
  3. Ｘ２が、イミノ基（－ＮＲ１－）である、請求項１または２記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
  4. Ｒ１が、水素原子である、請求項２または３記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
  5. Ｌ１が、ビニレン基（－ＣＨ＝ＣＨ－）である、請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
  6. Ｌ２が、エチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－）である、請求項１から５のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
  7. 前記ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団または前記ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団が、下記化学式（２）で表される、請求項１から６のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     前記化学式（２）中、
    Ｒ２は、水素原子、保護基、または下記化学式（３）で表される基であり、
    Ｒ３は、水素原子、保護基、またはホスホロアミダイト基であり、
    Ｒ４は、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     前記化学式（３）中、
    Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
    Ｚは、ヒドロキシル基またはイミダゾール基であり、
    ｍは、１～１０の整数である。
  8. 前記化学式（１）で表されるヌクレオシド誘導体が、下記化学式（４）で表されるヌクレオシド誘導体である、請求項１から７のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  9. 請求項１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの合成試薬。
  10. 請求項１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの製造方法。
  11. 請求項１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
  12. 前記ポリヌクレオチドが、ターゲットに結合する結合核酸分子である、請求項１１記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記ターゲットが、分泌型免疫グロブリンＡ、アミラーゼ、Ｃ反応タンパク質（ＣＲＰ）、β－ディフェンシン４Ａ、リゾチーム、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）、およびインターロイキン（ＩＬ）－６からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１２記載のポリヌクレオチド。
  14. 候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および
    前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、
    前記候補ポリヌクレオチドが、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする、結合核酸分子の製造方法。
  15. 前記ターゲットが、分泌型免疫グロブリンＡ、アミラーゼ、Ｃ反応タンパク質（ＣＲＰ）、β－ディフェンシン４Ａ、リゾチーム、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）、およびインターロイキン（ＩＬ）－６からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１４記載の製造方法。
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