WO2022113496A1 - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質結合核酸分子、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用センサ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出試薬、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの不活性化剤 - Google Patents

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質結合核酸分子、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用センサ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出試薬、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの不活性化剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2022113496A1
WO2022113496A1 PCT/JP2021/034667 JP2021034667W WO2022113496A1 WO 2022113496 A1 WO2022113496 A1 WO 2022113496A1 JP 2021034667 W JP2021034667 W JP 2021034667W WO 2022113496 A1 WO2022113496 A1 WO 2022113496A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cov
sars
seq
nucleic acid
acid molecule
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/034667
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
宏貴 皆川
智子 藤田
信太郎 加藤
あすみ 稲熊
克紀 堀井
Original Assignee
Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 filed Critical Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社
Priority to JP2022565082A priority Critical patent/JPWO2022113496A1/ja
Priority to US18/038,955 priority patent/US20240002860A1/en
Priority to CN202180077368.6A priority patent/CN116710553A/zh
Priority to EP21897474.9A priority patent/EP4253545A1/en
Publication of WO2022113496A1 publication Critical patent/WO2022113496A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule, a sensor for detecting SARS-CoV-2, a reagent for detecting SARS-CoV-2, a method for detecting SARS-CoV-2, and a SARS-CoV-2 virus. Regarding inactivating agents.
  • SARS-CoV-2 also called “2019-nCoV”
  • 2019-nCoV SARS-CoV-2
  • Non-Patent Document 1 In order to detect SARS-CoV-2, an attempt is being made to obtain an aptamer targeting the proteins constituting SARS-CoV-2 (Non-Patent Document 1).
  • the present invention can specifically bind to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein involved in the binding to the angiotensin converting enzyme 2 (ACE2), which is the target of SARS-CoV-2, and has a binding force. It is an object of the present invention to provide a bound nucleic acid molecule having a high protein content and a slow dissociation rate.
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule (hereinafter, also referred to as “nucleic acid molecule”) of the present invention contains any of the following polynucleotides (a), (b), (c) and (d).
  • B A polynucleotide consisting of a base sequence having 80% or more identity with respect to the base sequence of (a) above and binding to a SARS-CoV-2 spike glycoprotein;
  • C A poly having a base sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide having the base sequence of (a) above, and binding to a SARS-CoV-2 spike glycoprotein.
  • nucleotide (D) A polynucleotide consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in the base sequence of (a) above and binds to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.
  • SEQ ID NO: 1 GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCG T GCC T AA T C T CACCCCACGGAA TT CA T GGCAAAGCCGAGG T G T C TT G T A TT C
  • SEQ ID NO: 2 GGTATGTCTCCGCCACTGAAATC T AA T C T CACA TT G T AAGCAAAGGAGAA T AAGCAAAGCCGAGG T G T C TT G T A TT C
  • SEQ ID NO: 3 GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCC T GACCGC T GACCAAA T C T CAG T GCAGA T GCAAAGCCGAGG T G T C TT G T A TT C
  • SEQ ID NO: 4 GGTATGTCTCCGCCACTGAAATC TT G T CCCC T AA T AGG TT CCGAC T GACAAG T GCAAAGCCGAGG T G T C TT G T A TT C
  • SEQ ID NO: 5 GGTTTAGCCCT
  • the SARS-CoV-2 detection sensor of the present invention is characterized by containing the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the SARS-CoV-2 detection reagent of the present invention is characterized by containing the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the method for detecting SARS-CoV-2 of the present invention comprises a step of contacting a sample with a nucleic acid molecule to detect SARS-CoV-2 spiked glycoprotein in the sample.
  • the nucleic acid molecule is the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection step is characterized in that the SARS-CoV-2 spike glycoprotein in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and the SARS-CoV-2 in the sample is detected by the binding.
  • the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention can specifically bind to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein, has a high binding force, and has a slow dissociation. Therefore, according to the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention, for example, depending on the presence or absence of binding to the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein in the sample, SARS-CoV- 2 can be detected.
  • FIG. 1 is a graph showing the binding ability of aptamers to SARS-CoV-2 spike glycoprotein in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding ability of the aptamer to the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein in Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding ability of the aptamer to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein in Example 2.
  • FIG. 4 is a graph showing the binding ability of the aptamer to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein in Example 2.
  • FIG. 5 is a graph showing the binding ability of the aptamer to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein in Example 2.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding ability of the aptamer to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein in Example 2.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing the sequence of SARS-CoV-2 spike glycoprotein.
  • FIG. 8 is a graph showing the binding ability of the aptamer to the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein in Example 3.
  • SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule is any one of the following (a), (b), (c) and (d). Characterized by containing a polynucleotide: (A) A polynucleotide consisting of a base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7 or a partial sequence of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7; (B) A polynucleotide consisting of a base sequence having 80% or more identity with respect to the base sequence of (a) above and binding to a SARS-CoV-2 spike glycoprotein; (C) A poly having a base sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide having the base sequence of (a) above, and binding to a SARS-CoV-2 spike glycoprotein.
  • nucleotide (D) A polynucleotide consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in the base sequence of (a) above and binds to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. ;
  • SARS-CoV-2 means severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Infections caused by SARS-CoV-2 are also called COVID-19.
  • SARS-Cov-2 is a virus classified in the genus Betacoronavirus.
  • the coronavirus containing SARS-CoV-2 contains an envelope composed of an envelope protein, a membrane protein, a spike sugar protein and the like, and a single-stranded RNA which is a genomic RNA is covered with the envelope.
  • the surface amino acid of the spiked glycoprotein may or may not be sugar-chain-modified.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can bind to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein, which is a protein constituting SARS-CoV-2.
  • the SARS-CoV-2 spike glycoprotein is involved in binding to the target of SARS-CoV-2, angiotensin converting enzyme 2 (ACE2).
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • a schematic diagram of the sequence of the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein is shown in FIG.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is, for example, a trimer of the RBD domain, the S1 + S2 domain, the S1 domain, and the S1 + S2 domain (also referred to as S-trimer) constituting the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. It may be combined with at least one of.
  • the binding properties of the nucleic acid molecule of the present invention to the RBD domain, S1 + S2 domain, S1 domain, and trimer are, for example, four types of commercially available reagents shown in Table 1 described in Example 1 described later, respectively. Can be confirmed by using as a target.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is also referred to as, for example, an aptamer below.
  • amino acid sequence of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein for example, the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 15) registered in accession number P0DTC2 of UniProt (http://www.uniprot.org/) can be used. can give.
  • each of the domains of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein has RBD domain: 319-541 (SEQ ID NO: 16) and S1 + S2 domain: 13-1273 (SEQ ID NO:) in the amino acid sequence number of accession number P0DTC2. 17), S1 domain: 13-685 (SEQ ID NO: 18).
  • One or more mutations eg, deletion, substitution, insertion and /
  • each amino acid sequence eg, deletion, substitution, insertion and /
  • SARS-CoV-2 spike glycoprotein and each domain thereof for example, to the extent to which the nucleic acid molecule of the present invention binds. Or addition
  • SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein SEQ ID NO: 15
  • RBD domain of SARS-CoV-2 spike glycoprotein (SEQ ID NO: 16) RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAG
  • S1 + S2 domain of SARS-CoV-2 spike glycoprotein SEQ ID NO: 17
  • S1 domain of SARS-CoV-2 spike glycoprotein SEQ ID NO: 18
  • binding to SARS-CoV-2 spike glycoprotein means, for example, “having a binding ability to SARS-CoV-2 spike glycoprotein” or "SARS-CoV-2 spike”. It also has a binding activity to glycoproteins.
  • the binding between the nucleic acid molecule of the present invention and the SARS-CoV-2 spike glycoprotein can be determined, for example, by surface plasmon resonance molecule interaction (SPR: Surface Plasma resonance) analysis or the like. For the analysis, for example, ProteON (trade name, BioRad) can be used. Since the nucleic acid molecule of the present invention binds to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein, it can be used, for example, for the detection of SARS-CoV-2.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide of (a) or (b) above, or a molecule containing the polynucleotide. Further, the nucleic acid molecule of the present invention may be composed of, for example, DNA, RNA or DNA and RNA. When the nucleic acid molecule of the present invention is composed of DNA, the nucleic acid molecule of the present invention can be referred to as, for example, a DNA molecule or a DNA aptamer.
  • the polynucleotide (a) may be, for example, a polynucleotide containing the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7, or a polynucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7. Further, the polynucleotide (a) may be a nucleotide containing a partial sequence of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7, or may be a polynucleotide composed of the partial sequences.
  • the partial sequence is not particularly limited, and may be, for example, a sequence in which at least one of the 5'end and 3'end sequences is deleted from the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7, or a sequence in the intermediate region is missing. It may be a lost sequence.
  • the polynucleotides of SEQ ID NOs: 1 to 7 are shown below. In the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7 and SEQ ID NOs: 8 to 13, which will be described later, the modified bases are underlined. The modified base will be described later.
  • SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein-Binding Nucleic Acid Molecular 1 (SEQ ID NO: 1) GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCG T GCC T AA T C T CACCCCACGGAA TT CA T GGCAAAGCCGAGG T G T C TT G T A TT C SARS-CoV-2 spike glycoprotein binding nucleic acid molecule 2 (SEQ ID NO: 2) GGTATGTCTCCGCCACTGAAATC T AA T C T CACA TT G T AAGCAAAGGAGAA T AAGCAAAGCCGAGG T G T C TT G T A TT C SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein-Binding Nucleic Acid Molecular 3 (SEQ ID NO: 3) GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCC T GACCGC T GACCAAA T C T CAG T GCAGA T GCAAAGCCGAGG T G T C TT G T A TT C SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein-
  • the partial sequence is not particularly limited, and for example, the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is the base sequence of SEQ ID NO: 8, and the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 2 is the base of SEQ ID NO: 9.
  • the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 3, which is a sequence, is the base sequence of SEQ ID NO: 10, and the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 5 is the base sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 12 is the base sequence of SEQ ID NO: 12, or the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 7 is the base sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the "identity” is not particularly limited, and may be, for example, as long as the polynucleotide of the above (b) binds to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.
  • the identity is, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, particularly preferably 98% or more, most preferably 99. % Or more.
  • the identity can be calculated from the default parameters using, for example, analysis software such as BLAST or FASTA (hereinafter, the same applies).
  • the polynucleotide (b) may be, for example, the polynucleotide (b1) below.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide of (b1) above or a molecule containing the polynucleotide.
  • "including the base sequence of any of SEQ ID NOs: 8 to 13” can also be said to be, for example, "the base sequence of any of SEQ ID NOs: 8 to 13 is conserved".
  • the SARS-CoV-2 spike sugar protein comprises a base sequence having 80% or more identity with respect to the base sequence of (a) above, and contains any of the base sequences of SEQ ID NOs: 8 to 13. Polynucleotide to bind
  • the polynucleotide in the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the polynucleotide of (b2) below.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide of (b2) above, or a molecule containing the polynucleotide.
  • B2 It consists of a base sequence having 80% or more identity with respect to the base sequence of the above (a), and can form a secondary structure represented by the following formulas (2) to (14), and SARS. -CoV-2 Spike Polynucleotide that binds to glycoprotein
  • the polynucleotide of (b2) is composed of, for example, a base sequence having 80% or more identity with respect to the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 13, and the above-mentioned formulas (2) to (14), respectively.
  • the identity can be referred to, for example, the description of the identity in the polynucleotide of (b).
  • the correspondence between the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 13 and the secondary structures represented by the formulas (2) to (14) is shown below.
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (2).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (3).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (4).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (5).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (6).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (7).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (8).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (9).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (10).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (11).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 11 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (12).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 12 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (13).
  • the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 13 can form, for example, a secondary structure represented by the above formula (14).
  • the polynucleotide of (b2) is specifically composed of, for example, a base sequence having 80% or more identity with respect to the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 and 5 to 7, respectively. It is possible to form a secondary structure represented by the above formulas (9) to (14) corresponding to SEQ ID NOs: 8 to 13, which is a partial sequence of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 and 5 to 7, and SARS.
  • -CoV-2 Spike A polynucleotide that binds to a glycoprotein.
  • the secondary structure can be formed means that, for example, the polynucleotide of the above (b2) can form the stem structure and the loop structure in the above formula.
  • the stem structure and loop structure will be described later.
  • the base pairs facing each other may be a combination of bases capable of forming a hydrogen bond. Examples of the combination of bases capable of forming a hydrogen bond include AT, TA, AU, UA, GC, and CG.
  • the "secondary structure" may be, for example, a secondary structure actually formed or a secondary structure when a simulation is performed by a known means.
  • the polynucleotide in the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the polynucleotide of (c) below.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide of the following (c) or a molecule containing the polynucleotide of the following (c).
  • C A poly having a base sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide having the base sequence of (a) above, and binding to a SARS-CoV-2 spike glycoprotein. nucleotide
  • the "hybridizable polynucleotide” is, for example, a polynucleotide completely or partially complementary to the polynucleotide of the above (a), and the SARS-CoV-2 spike sugar. Any range may be used as long as it binds to the protein.
  • the hybridization can be detected, for example, by various hybridization assays.
  • the hybridization assay is not particularly limited, and is, for example, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed .” Edited by Sambrook et al. [Cold Spring Harbor Laboratory Press]. (1989)] etc. can also be adopted.
  • the "stringent condition” may be, for example, any of a low stringent condition, a medium stringent condition, and a high stringent condition.
  • Low stringent conditions are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C. conditions.
  • the "medium stringent condition” is, for example, a condition of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. conditions.
  • the degree of stringency can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, probe concentration and length, ionic strength, and time.
  • the "stringent conditions” are, for example, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed .” Edited by Sambrook et al. [Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor Laboratory Press). 1989)] etc. can also be adopted.
  • the polynucleotide in the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the polynucleotide of (d) below.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide of the following (d) or a molecule containing the polynucleotide of the following (d).
  • D A polynucleotide consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in the base sequence of (a) above and binds to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.
  • “1 or several” may be, for example, a range in which the polynucleotide of the above (d) binds to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.
  • the “1 or several” is, for example, 1 to 16 pieces, 1 to 12 pieces, 1 to 10 pieces, 1 to 8 pieces, 1 to 7 pieces, 1 to 5 pieces, in the base sequence of the above (a). 1 to 3 pieces, 1 to 2 pieces, 1 piece.
  • the numerical range of the number of bases, the number of sequences, etc. discloses, for example, all positive integers belonging to the range. That is, for example, the description of "1 to 5 bases” means all disclosures of "1, 2, 3, 4, 5 bases” (hereinafter, the same applies).
  • the polynucleotide (d) may be, for example, the polynucleotide (d1) below.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide of (d1) or a molecule containing the polynucleotide.
  • (d1) "including the base sequence of any of SEQ ID NOs: 8 to 13” can also be said to be “conserving the base sequence of any of SEQ ID NOs: 8 to 13.”
  • D1 In the base sequence of (a) above, one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added, and include any of the base sequences of SEQ ID NOs: 8 to 13.
  • SARS-CoV-2 Spike A polynucleotide that binds to a glycoprotein
  • the polynucleotide (d) may be, for example, the polynucleotide (d2) below.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide of (d2) or a molecule containing the polynucleotide.
  • D2 In the base sequence of the above (a), one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added, and are represented by the above formulas (2) to (14).
  • the constituent unit of the polynucleotide is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the polynucleotide is, for example, a DNA consisting of a deoxyribonucleotide residue, a DNA containing a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue, and may further contain a non-nucleotide residue.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of any of the polynucleotides (a) to (d), or a molecule containing any of the polynucleotides (a) to (d).
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, two or more polynucleotides of any one of (a) to (d) above, as will be described later.
  • the two or more polynucleotides (a) to (d) may have the same sequence or different sequences.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have, for example, a linker and / or an additional sequence.
  • the linker is, for example, a sequence between polynucleotides
  • the additional sequence is, for example, a sequence added to the terminal.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides are linked to form a single-stranded polynucleotide.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides may be directly linked to each other, for example, or may be indirectly linked to each other via a linker.
  • the sequences of the polynucleotides are preferably directly or indirectly linked at their respective ends.
  • the number of the sequences is not particularly limited, and is, for example, 2 or more, 2 to 20, 2 to 10, 2 or 3.
  • the length of the linker is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 base length, 1 to 24 base length, 1 to 20 base length, 3 to 12 base length, and 5 to 9 base length.
  • the constituent unit of the linker is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the linker is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues.
  • linker examples include polydeoxythymine (poly dT), polydeoxyadenine (poly dA), poly dAdT which is a repeating sequence of A and T, and the like, and poly dT and poly dAdT are preferable.
  • the polynucleotide is preferably a single-stranded polynucleotide. It is preferred that the single-stranded polynucleotide be capable of forming a stem structure and a loop structure, for example, by self-annealing. It is preferable that the polynucleotide can form, for example, a stem loop structure, an internal loop structure and / or a bulge structure.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, double-stranded.
  • one single-stranded polynucleotide comprises any of the polynucleotides (a)-(d) above, and the other single-stranded polynucleotide is not limited.
  • the other single-stranded polynucleotide include a polynucleotide containing a base sequence complementary to any of the polynucleotides (a) to (d).
  • the nucleic acid molecule of the present invention is double-stranded, for example, it is preferable to dissociate it into a single-stranded polynucleotide by denaturation or the like prior to use. Further, it is preferable that the dissociated single-stranded polynucleotide according to any one of (a) to (d) forms, for example, a stem structure and a loop structure as described above.
  • the stem structure and the loop structure can be formed means, for example, that the stem structure and the loop structure are actually formed, and even if the stem structure and the loop structure are not formed, the stem structure is conditionally formed. And the ability to form loop structures.
  • stem structure and loop structure can be formed includes, for example, both the case of experimental confirmation and the case of prediction by simulation of a computer or the like.
  • the constituent unit of the nucleic acid molecule of the present invention is, for example, a nucleotide residue.
  • the length of the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the lower limit of the length of the nucleic acid molecule is, for example, 15 base length, 35 base length, 55 base length, and 75 base length.
  • the upper limit of the length of the nucleic acid molecule is, for example, 1000 base length, 200 base length, 100 base length, 90 base length, and 80 base length.
  • the range of lengths of the nucleic acid molecules is, for example, 15 to 1000 bases, 35 to 200 bases, 55 to 90 bases, and 75 to 80 bases.
  • nucleotide residue examples include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • nucleic acid molecule of the present invention examples include DNA composed only of deoxyribonucleotide residues, and DNA containing one or several ribonucleotide residues. In the latter case, "1 or several" is not particularly limited, and for example, in the polynucleotide, for example, 1 to 91, 1 to 30, 1 to 15, 1 to 7, 1 to 3 in the polynucleotide. One or two.
  • the polynucleotide may contain a natural base or a modified base as a base in a nucleotide residue.
  • the natural base non-artificial base
  • examples thereof include a purine base having a purine skeleton, a pyrimidine base having a pyrimidine skeleton, and the like.
  • the purine base is not particularly limited, and examples thereof include adenine (a) and guanine (g).
  • the pyrimidine base is not particularly limited, and examples thereof include cytosine (c), thymine (t), and uracil (u).
  • the site and number thereof are not particularly limited.
  • the nucleic acid molecule of the present invention has the modified base, in the polynucleotides of SEQ ID NOs: 1 to 13, for example, a part or all of the underlined thymine is the modified base.
  • the underlined thymine is a modified base
  • the modified base is preferably a modified thymine modified with a thymine base.
  • the modified base is, for example, a base modified with a modifying group.
  • the base modified by the modifying group is, for example, the natural base.
  • Examples of the natural base include purine bases and pyrimidine bases.
  • the modified base is not particularly limited, and examples thereof include modified adenine, modified guanine, modified cytosine, modified thymine, and modified uracil.
  • the modified base may be directly modified with the modifying group, or the modified base may be indirectly modified with the modifying group. In the latter case, for example, the modified base may be modified with the modifying group via a linker.
  • the linker is not particularly limited.
  • the modification site of the modified base with the modifying group is not particularly limited.
  • the modification site of the pyrimidine base includes, for example, the 5-position and the 6-position of the pyrimidine skeleton, and the 5-position is preferable.
  • timine has a methyl group on the carbon at the 5-position, so that the modifying group may be directly or indirectly bonded to the carbon at the 5-position, for example.
  • the modifying group may be directly or indirectly bonded to the carbon of the methyl group bonded to the carbon at the 5-position.
  • modified thymine base examples include nucleotide residues represented by the following formula (1) (hereinafter, also referred to as “NG7”).
  • the nucleotide triphosphate represented by the above formula (1) can be used as a monomer molecule.
  • the monomer molecule binds to another nucleotide triphosphate by a phosphodiester bond.
  • the method for producing the monomer can be produced by a known method, and for example, International Publication No. 2018/052063 can be referred to.
  • the nucleotide residue containing the modified thymine base in the polynucleotide is represented by, for example, the following formula (1A).
  • the underlined thymine base in the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 13 is preferably a modified thymine base represented by the above formula (1).
  • the underlined nucleotide residue in the polynucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 13 is the nucleotide residue represented by the above formula (1A).
  • the polynucleotide may contain, for example, only one type of modified base, or may contain two or more types of modified bases.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, a modified nucleotide.
  • the modified nucleotide may be a nucleotide having the above-mentioned modified base, a nucleotide having a modified sugar modified with a sugar residue, or a nucleotide having the modified base and the modified sugar.
  • the sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include a deoxyribose residue and a ribose residue.
  • the modification site in the sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include the 2'-position and the 4'-position of the sugar residue, and both of them may be modified.
  • Examples of the modifying group of the modified sugar include a methyl group, a fluoro group, an amino group, a thio group and the like.
  • the base is a pyrimidine base in the modified nucleotide residue
  • the 2'position and / or the 4'position of the sugar residue is modified.
  • the modified nucleotide residue include, for example, a deoxyribose residue or a 2'-methylated-urasyl nucleotide residue modified at the 2'position of the ribose residue, and a 2'-methylated-cytosine nucleotide residue.
  • the number of the modified bases is not particularly limited. In the polynucleotide, the number of the modified bases is, for example, one or more.
  • the modified base is, for example, 1 to 80, 1 to 70, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10 in the polynucleotide, and also.
  • All bases may be the modified bases.
  • the number of the modified bases may be, for example, the number of any one type of the modified bases, or the total number of the two or more types of the modified bases.
  • the modified base in the total length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is also not particularly limited, and is, for example, 1 to 80, 1 to 50, and 1 to 20, preferably the same as the above range. Is.
  • the ratio of the modified base is not particularly limited.
  • the ratio of the modified base is, for example, 1/100 or more, 1/40 or more, 1/20 or more, 1/10 or more, 1/4 or more, and 1/3 or more of the total number of bases of the polynucleotide. ..
  • the ratio of the modified base to the total length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is not particularly limited and is the same as the above range.
  • the total number of bases is, for example, the total number of natural bases and the number of modified bases in the polynucleotide.
  • the ratio of the modified base is shown as a fraction, and the total number of bases and the number of modified bases satisfying this are positive integers, respectively.
  • the number of the modified thymine is not particularly limited.
  • natural thymine can be replaced with the modified thymine.
  • the number of the modified thymines is, for example, one or more.
  • the modified thymine is, for example, 1 to 80, 1 to 70, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10 in the polynucleotide, and also. , All thymines may be the modified thymines.
  • the proportion of the modified thymine in the polynucleotide is not particularly limited.
  • the ratio of the modified thymine is, for example, 1/100 or more, 1/40 or more, 1/20 or more, 1/10 or more, 1/4 or more in the total of the number of the natural thymine and the number of the modified thymine. , 1/3 or more.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, one or several artificial nucleic acid monomer residues.
  • the "1 or several" is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 30, 1 to 10 in the polynucleotide.
  • Examples of the artificial nucleic acid monomer residue include PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), ENA (2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids) and the like.
  • the nucleic acid at the monomer residue is, for example, the same as described above.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is preferably nuclease resistant, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention preferably has, for example, the modified nucleotide residue and / or the artificial nucleic acid monomer residue because of nuclease resistance. Since the nucleic acid molecule of the present invention is nuclease resistant, for example, PEG (polyethylene glycol) of several tens of kDa, deoxythymidine, or the like may be bound to the 5'end or 3'end.
  • PEG polyethylene glycol
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have, for example, an additional sequence.
  • the additional sequence is preferably attached to at least one of the 5'end and the 3'end of the nucleic acid molecule, more preferably the 3'end.
  • the additional sequence is not particularly limited.
  • the length of the additional sequence is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 base lengths, 1 to 50 base base lengths, 1 to 25 base base lengths, and 18 to 24 base base lengths.
  • the constituent unit of the additional sequence is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the additional sequence is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues. Specific examples of the additional sequence include poly dT, poly dA and the like.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used, for example, by immobilizing it on a carrier.
  • the nucleic acid molecule of the present invention preferably has, for example, either the 5'end or the 3'end immobilized, more preferably the 3'end.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be immobilized directly on the carrier or indirectly. In the latter case, for example, it is preferable to immobilize via the additional sequence.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have, for example, a labeling substance, and specifically, the labeling substance may be bound to the nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule to which the labeling substance is bound can also be referred to as, for example, the nucleic acid sensor of the present invention.
  • the labeling substance may be attached to at least one of the 5'end and the 3'end of the nucleic acid molecule, for example. Labeling with the labeling substance may be, for example, binding or chemical modification.
  • the labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include enzymes, fluorescent substances, dyes, isotopes, drugs, toxins, and antibiotics. Examples of the enzyme include luciferase and NanoLuc luciferase.
  • fluorescent substance examples include fluorescent groups such as pyrene, TAMRA, fluorescein, Cy3 dye, Cy5 dye, FAM dye, rhodamine dye, Texas red dye, JOE, MAX, HEX, and TYE.
  • fluorescent groups such as pyrene, TAMRA, fluorescein, Cy3 dye, Cy5 dye, FAM dye, rhodamine dye, Texas red dye, JOE, MAX, HEX, and TYE.
  • Alexa dyes such as Alexa488 and Alexa647.
  • the labeling substance may be directly linked to the nucleic acid molecule, for example, or may be indirectly linked via a linker.
  • the linker is not particularly limited, and is, for example, a polynucleotide linker and the like.
  • the method for producing a nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited, and can be synthesized by a genetic engineering method or a known method, for example, a nucleic acid synthesis method using chemical synthesis.
  • the nucleic acid molecule of the present invention exhibits binding properties to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Therefore, the use of the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited as long as it is used for utilizing the binding property to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used in various methods, for example, in place of the antibody against the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.
  • SARS-CoV-2 spike glycoprotein can be detected. This makes it possible to detect SARS-CoV-2.
  • the method for detecting SARS-CoV-2 spiked glycoprotein and SARS-CoV-2 is not particularly limited, and for example, referring to the detection method described later, binding of SARS-CoV-2 spiked glycoprotein to the nucleic acid molecule. Can be done by detecting.
  • the detection sensor of the present invention is a SARS-CoV-2 detection sensor and is characterized by containing the nucleic acid molecule of the present invention. ..
  • the detection sensor of the present invention may contain the nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations are not particularly limited.
  • the detection sensor of the present invention for example, by binding the nucleic acid molecule and the SARS-CoV-2 spike glycoprotein, the SARS-CoV-2 can be detected as described above.
  • the detection sensor of the present invention has, for example, a carrier, and the nucleic acid molecule is arranged on the carrier.
  • the nucleic acid molecule is preferably immobilized on the carrier. Immobilization of the nucleic acid molecule on the carrier is, for example, as described above.
  • the method of using the detection sensor of the present invention is not particularly limited, and the nucleic acid molecule of the present invention and the detection method of the present invention can be incorporated.
  • the detection reagent of the present invention is characterized by containing the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection reagent of the present invention may contain the nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations are not limited.
  • the SARS-CoV-2 can be detected as described above.
  • the detection reagent of the present invention may include, for example, the sensor of the present invention as the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection reagent of the present invention may further have, for example, a labeling substance, and the labeling substance may be bound to the nucleic acid molecule.
  • the labeling substance for example, the description in the nucleic acid molecule of the present invention can be incorporated.
  • the detection reagent of the present invention may have, for example, a carrier, and the nucleic acid molecule may be immobilized on the carrier.
  • the carrier for example, the description in the nucleic acid molecule of the present invention can be incorporated.
  • the detection reagent of the present invention may contain other components in addition to the nucleic acid molecule of the present invention, for example.
  • the component include a non-specific adsorbent, the carrier, a buffer solution, an instruction manual, and the like.
  • the non-specific adsorbent include dextran, tRNA (transfer RNA), salmon sperm DNA and the like.
  • tRNA for example, tRNA from E. coli MRE 600 (Merck Life Science Co., Ltd., Cat No.: 10109541001) or the like can be used.
  • As the salmon sperm DNA for example, deoxyribonucleic acid, low molecular weight from salmon sperm (manufactured by Sigma-Aldrich, Cat No .: 31149-10G-F) and the like can be used.
  • the nucleic acid molecule and other components such as the buffer solution may be contained in separate containers, or may be mixed or unconfused in the same container.
  • the detection reagent of the present invention can also be referred to as a detection kit.
  • the detection method of the present invention comprises contacting a sample with a nucleic acid molecule to detect the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein in the sample, and the nucleic acid molecule comprises a step of detecting the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein.
  • the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention In the detection step, the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein in the sample and the nucleic acid molecule are bound to each other, and the binding results in the binding. It is characterized by detecting SARS-CoV-2 in a sample.
  • the detection method of the present invention is characterized by using the nucleic acid molecule of the present invention, and other steps, conditions and the like are not particularly limited. Further, in the detection method of the present invention, the SARS-CoV-2 detection sensor of the present invention or the detection reagent or detection kit of the present invention may be used as the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein, for example, the binding between the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein and the nucleic acid molecule is detected.
  • the detection method of the present invention can detect the presence or absence of SARS-CoV-2 spiked glycoprotein or the amount of SARS-CoV-2 spiked glycoprotein in a sample, and thus can be qualitative or quantitative. It can be said that it is possible.
  • the detection method of the present invention can be referred to as an analysis method because it can be used for qualitative analysis or quantitative analysis, for example.
  • the sample is not particularly limited.
  • the sample include aerosols, saliva, urine, plasma and serum.
  • the aerosol refers to, for example, a mixture of fine liquid or solid particles suspended in a gas and surrounding gas.
  • a gas that may contain the minute liquid, solid particles, or the like can be used as the sample.
  • the sample may be, for example, a gas sample (including the aerosol), a liquid sample, or a solid sample.
  • the sample is preferably a liquid sample, for example, because it is easy to come into contact with the nucleic acid molecule and is easy to handle.
  • a mixture, an extract, a solution, or the like may be prepared using a solvent and used.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and a buffer solution.
  • the detection step includes, for example, a contact step of bringing the sample into contact with the nucleic acid molecule to bind the SARS-CoV-2 spike glycoprotein in the sample to the nucleic acid molecule, and the SARS-CoV-2 spike. It includes a binding detection step of detecting a binding between a glycoprotein and the nucleic acid molecule. Further, the detection step further includes, for example, a step of detecting the presence or absence or amount of SARS-CoV-2 spike glycoprotein in the sample based on the result of the binding detection step.
  • the contact method between the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the contact between the sample and the nucleic acid molecule is preferably carried out, for example, in a liquid.
  • the liquid is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and a buffer solution.
  • the contact conditions between the sample and the nucleic acid molecule are not particularly limited.
  • the contact temperature is, for example, 4 to 37 ° C. and 18 to 25 ° C.
  • the contact time is, for example, 10 to 120 minutes and 30 to 60 minutes.
  • the nucleic acid molecule may be, for example, an immobilized nucleic acid molecule immobilized on a carrier or an unfixed free nucleic acid molecule.
  • a carrier for example, the sample is brought into contact with the sample.
  • the immobilized nucleic acid molecule is preferable because it is excellent in handleability.
  • the carrier is not particularly limited, and examples thereof include a substrate, beads, a container, and the like, and examples of the container include a microplate, a tube, and the like.
  • the immobilization of the nucleic acid molecule is, for example, as described above.
  • the binding detection step is a step of detecting the binding between the SARS-CoV-2 spike glycoprotein and the nucleic acid molecule in the sample.
  • the binding detection step is a step of detecting the binding between the SARS-CoV-2 spike glycoprotein and the nucleic acid molecule in the sample.
  • the binding between the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein and the nucleic acid molecule cannot be detected, it can be determined that the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein and SARS-CoV-2 are not present in the sample. When the binding is detected, it can be determined that SARS-CoV-2 spike glycoprotein and SARS-CoV-2 are present in the sample.
  • the method for detecting the binding between the SARS-CoV-2 spike glycoprotein and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • a conventionally known method for detecting a bond between substances can be adopted, and specific examples thereof include the above-mentioned SPR and the like.
  • the binding may be, for example, detection of a complex of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein and the nucleic acid molecule.
  • SARS-CoV-2 virus inactivating agent of the present invention is, as described above, the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention. It is characterized by including.
  • the inactivating agent of the present invention is characterized by using the nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations are not particularly limited.
  • Activity is, for example, the function of SARS-CoV-2 spike glycoprotein and SARS-CoV-2, specifically, for example, the function of binding to a target (eg, angiotensin converting enzyme 2 (ACE2)). Can be given. It may also be, for example, infectious and virulent of SARS-CoV-2.
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • Inactivation refers to, for example, inhibiting the functions of SARS-CoV-2 spike glycoprotein and SARS-CoV-2. The “inactivation” may completely suppress or partially suppress the activity.
  • the nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein. Therefore, for example, by binding the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein to the nucleic acid molecule. It is possible to inactivate SARS-CoV-2 spiked glycoproteins and SARS-CoV-2.
  • the inactivation or inactivation can also be referred to as, for example, "neutralization”. Therefore, the inactivating agent of the present invention can also be called a neutralizing agent.
  • Example 1 The binding ability of the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention to the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein was confirmed by SPR.
  • SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecules 1 to 7 (hereinafter, also referred to as "binding nucleic acid molecules 1 to 7, respectively))). It was synthesized and used as the DNA aptamer of the example.
  • SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecules 1 to 7 the underlined thymine nucleotide residue in the base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7 was designated as NG7 represented by the above formula (1).
  • the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecules 1 to 7 were added with 20-base-long polydeoxyadenine (poly dA) at the 3'end and used as a poly dA-added aptamer in SPR described later. ..
  • the "RBD domain” is the RBD domain (hereinafter, also referred to as RBD) that constitutes the SARS-CoV-2 spike glycoprotein
  • the "S1 + S2 domain” is the SARS-CoV-, respectively.
  • S1 domain is the S1 domain (hereinafter also referred to as S1) constituting the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein
  • “3 "Protein” indicates the trimer of the S1 + S2 domain (hereinafter, also referred to as a trimer).
  • the amino acid sequence of each target is prepared based on the amino acid sequence registered in the following NCBI accession numbers, and has the amino acid sequences of the above-mentioned SEQ ID NOs: 15 to 18.
  • RBD domain YP_009724390.1 S1 + S2 domain: YP_009724390.1 S1 domain: QHD43416.1 Trimer: QHD43416.1
  • each of the reagents was dissolved in sterilized distilled water to a concentration of 1 mg / mL, and the solution was used as a sample.
  • SB1T buffer was used for diluting each of the samples.
  • the composition of the SB1T buffer was 40 mmol / L HEPES (pH is 7.4), 125 mmol / L NaCl, 1 mmol / L MgCl 2, 5 mmol / L KCl and 0.01% Tween® 20.
  • a chip with streptavidin immobilized (trade name: ProteOnNLC SensorChip, BioRad) was set in ProteON XPR36.
  • DW ultrapure water
  • 2.5 ⁇ mol / L biotinylated poly dT was injected into the flow cell of the sensor chip and bound until the signal intensity (RU: Resonance Unit) was saturated.
  • the biotinylated poly dT was prepared by biotinylated the 5'end of 20 base length deoxythymidine.
  • the bound nucleic acid molecules 1 to 7 to which the poly dA of 200 nmol / L is added are injected into the flow cell of the chip at a flow rate of 25 ⁇ L / min for 80 seconds to saturate the signal intensity. Combined up to.
  • each of the 400 nmol / L samples was injected with SB1T buffer at a flow rate of 50 ⁇ L / min for 120 seconds, and subsequently, under the same conditions, the SB1T buffer was flowed and washing was performed for 300 seconds.
  • the signal intensity after the injection of the sample was measured with the injection start of the sample as 0 second.
  • the SPR was performed under the condition of 25 ° C.
  • the signal intensity was measured in the same manner except that a sample containing BSA (manufactured by Sigma, catalog number: # A7906) was used instead of each sample shown in Table 1 above.
  • FIGS. 1 (A) to 1 (G) are graphs showing the binding properties of the binding nucleic acid molecules 1 to 7 to each of the 400 nmol / L samples.
  • the horizontal axis shows the elapsed time (seconds) after the start of injection of the sample, and the vertical axis shows the signal intensity (RU).
  • the bound nucleic acid molecules 1, 2, 5 to 7 are particularly RBD, S1S2, S1 and among the above samples. And to the trimer, it showed binding. Further, as shown in FIGS.
  • the bound nucleic acid molecules 3 and 4 show binding property to each of the above samples, particularly S1S2, S1 and trimer. rice field.
  • the control BSA
  • all of the binding nucleic acid molecules 1 to 7 had a signal intensity of almost 0 and did not show binding property. From this result, it was found that the bound nucleic acid molecules 1 to 7 bind to each of the samples with excellent specificity, and the binding can be detected by measuring the signal intensity.
  • the binding ability of the bound nucleic acid molecule of the present invention to SARS-CoV-2 spike glycoprotein was confirmed by SPR.
  • SARS-CoV-2 spiked glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention can be subjected to the binding ability to the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein by SPR under the solution condition to which dextran having an effect of preventing non-specific binding of nucleic acid is added. confirmed. In addition, dynamic parameters were obtained.
  • control nucleic acid molecule the control nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 14) consisting of the base sequence of the following SEQ ID NO: 14 was used instead of the binding nucleic acid molecules 1 to 13, and the experiment was conducted in the same manner.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 14 below is the base sequence described in Non-Patent Document 1 (Song Y et al, Anal. Chem. (2020), 92, 9895-9900.).
  • Control nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 14) CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA
  • SB1T buffer containing dextran a buffer to which dextran was added
  • the composition of the SB1T buffer containing dextran is 40 mmol / L HEPES (pH is 7.4), 125 mmol / L NaCl, 1 mmol / L MgCl 2, 5 mmol / L KCl, 0.01% Tween® 20, and It was set to 0.1 mmol / L dextran.
  • FIGS. 2 to 6 are graphs showing the binding properties of the binding nucleic acid molecules 1, 2, 5 to 9, 11 to 13 to the RBD, and FIGS. 2 to 5K are the results without dextran, (L).
  • ⁇ (V) shows the result with dextran.
  • the horizontal axis represents the elapsed time (seconds) after the start of injection of the sample
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU).
  • the black dotted line indicates the actually measured value
  • the gray solid line indicates the fitting curve calculated based on the actually measured value.
  • the bound nucleic acid molecules 1, 2, 5 to 9, 11 to 13 are in the condition without dextran and with dextran. It showed high binding to the RBD.
  • the control nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 14) showed binding to the RBD in the buffer without dextran, but in the buffer containing dextran. Lost its binding to the RBD. From this result, the binding nucleic acid molecules 1, 2, 5 to 9, 11 to 13 can bind to the RBD with better specificity as compared with the control nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 14). all right.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding properties of the binding nucleic acid molecules 3, 4, and 10 to the trimer, (A) to (D) are the results without dextran, and (E) and (F) are. The result with dextran is shown.
  • the horizontal axis shows the elapsed time (seconds) after the start of injection of the sample, and the vertical axis shows the signal intensity (RU).
  • the bound nucleic acid molecules 3, 4, and 10 have signal intensities after the start of injection under the conditions of no dextran and with dextran. RU) was constant.
  • FIG. 6 was constant.
  • the signal intensity (RU) of the control nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 14) decreased with the lapse of time after the start of injection. From this result, the bound nucleic acid molecules 3, 4, and 10 are slower (slow off rate) and higher than the control nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 14) with respect to the trimer. It was found to have a binding force.
  • Tables 2 and 3 show the dissociation constants (KD) of the bound nucleic acid molecules 1 to 13 for the RBD and the trimer, respectively.
  • KD dissociation constant
  • Table 2 "*" indicates that the dissociation constant (KD) was below the detection limit that can be measured by SPR. It is considered that this is because the divergence of the bound nucleic acid molecule was slow and the off rate was a very small value.
  • the bound nucleic acid molecules 1 to 13 have very low dissociation constants (KD) for the RBD and the trimer as compared to the control nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 14). It was a value and was found to have excellent binding properties.
  • the binding ability of the bound nucleic acid molecule of the present invention to SARS-CoV-2 spike glycoprotein could be confirmed by SPR under the solution condition to which dextran having an effect of preventing non-specific binding of nucleic acid was added. ..
  • the dynamic parameters could be obtained.
  • Example 3 The ability of the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention to bind to the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein was evaluated by ELAA (Enzyme Linked Aptamer Assay).
  • the wells are washed once with 200 ⁇ l SB1T buffer (40 mmol / l HEPES (pH 7.4), 125 mmol / l NaCl, 1 mmol / l MgCl 2 , 5 mmol / l KCl, 0.01% Tween 20).
  • SB1T buffer 40 mmol / l HEPES (pH 7.4), 125 mmol / l NaCl, 1 mmol / l MgCl 2 , 5 mmol / l KCl, 0.01% Tween 20.
  • TBS blocking buffer Cat No .: 37570, manufactured by Pierce Biotechnology
  • the aptamer was adjusted to 1 ⁇ mol / l with SB1T buffer and heat-denatured under the conditions of 95 ° C. for 5 minutes. After the denaturation, the mixture was rapidly cooled to 4 ° C. and folded. The aptamer was added to the well on which RBD was immobilized at 50 ⁇ l / well and incubated at 25 ° C. for 1 hour. After the incubation, the wells were washed 3 times with 200 ⁇ l SB1T buffer.
  • SA-HRP streptavidin-horseradish peroxidase
  • FIG. 8 is a graph showing the binding ability of bound nucleic acid molecules 1 and 8 to the RBD.
  • the vertical axis shows the average of the difference in absorbance for the same 3 wells of the sample
  • the error bar shows the standard deviation
  • the horizontal axis shows the type of bound nucleic acid molecule and the presence or absence of addition of RBD.
  • the difference in absorbance did not change with or without the addition of RBD.
  • the bound nucleic acid molecules 1 and 8 the difference in absorbance increased in the presence of RBD.
  • SARS-CoV-2 spike glycoprotein binding nucleic acid molecule comprising any of the following polynucleotides (a), (b), (c) and (d):
  • A A polynucleotide consisting of a base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7 or a partial sequence of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7;
  • B A polynucleotide consisting of a base sequence having 80% or more identity with respect to the base sequence of (a) above and binding to a SARS-CoV-2 spike glycoprotein;
  • C A poly having a base sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide having the base sequence of (a) above, and binding to a SARS-CoV-2 spike glycoprotein.
  • nucleotide (D) A polynucleotide consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in the base sequence of (a) above and binds to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.
  • SEQ ID NO: 1 GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCG T GCC T AA T C T CACCCCACGGAA TT CA T GGCAAAGCCGAGG T G T C TT G T A TT C
  • SEQ ID NO: 2 GGTATGTCTCCGCCACTGAAATC T AA T C T CACA TT G T AAGCAAAGGAGAA T AAGCAAAGCCGAGG T G T C TT G T A TT C
  • SEQ ID NO: 3 GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCC T GACCGC T GACCAAA T C T CAG T GCAGA T GCAAAGCCGAGG T G T C TT G T A TT C
  • SEQ ID NO: 4 GGTATGTCTCCGCCACTGAAATC TT G T CCCC T AA T AGG TT CCGAC T GACAAG T GCAAAGCCGAGG T G T C TT G T A TT C
  • SEQ ID NO: 5 GGTTTAGCCCT
  • the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is the base sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 2 is the base sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 3 is the base sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 5 is the base sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 6 is the base sequence of SEQ ID NO: 12, or
  • the nucleic acid molecule according to Appendix 1, wherein the partial sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 7 is the base sequence of SEQ ID NO: 13.
  • SEQ ID NO: 8 CCACTGAAATCCG T GCC T AA T C T CACCCCACGGAA TT CA T GG;
  • SEQ ID NO: 9 TCCGCCACTGAAATC T AA T C T CACA TT G T AAGCAAAGGAGAA T AA;
  • SEQ ID NO: 10 CCACTGAAATCCC T GACCGC T GACCAAA T C T CAG T GCAGA T;
  • SEQ ID NO: 11 TGTGCACTCTCCCGG T A T CCC T AA T C T CACCCGA T ACC;
  • SEQ ID NO: 12 TGACATGAGCCAGG T GCA T C TT GAACG T CA T AGA T ACCG TT GA T G T GC T G;
  • SEQ ID NO: 13 GCTGATACTCGG T A T CCC T AA T C T CACCCGA T ACCG.
  • B1 The SARS-CoV-2 spike sugar protein comprises a base sequence having 80% or more identity with respect to the base sequence of (a) above, and contains any of the base sequences of SEQ ID NOs: 8 to 13. The polynucleotide to which it binds.
  • (D1) In the base sequence of (a) above, one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added, and include any of the base sequences of SEQ ID NOs: 8 to 13.
  • SARS-CoV-2 Spike A polynucleotide that binds to a glycoprotein.
  • (Appendix 5) The SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule according to any one of Supplementary note 1 to 4, wherein the binding nucleic acid molecule contains a modified base in which the base is modified with a modifying group.
  • a SARS-CoV-2 detection reagent comprising the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule according to any one of Supplementary Notes 1 to 9.
  • (Appendix 12) It comprises a step of contacting a sample with a nucleic acid molecule to detect the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein in the sample.
  • the nucleic acid molecule is the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule according to any one of Supplementary note 1 to 9.
  • the SARS-CoV-2 spike glycoprotein in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and the SARS-CoV-2 spike glycoprotein in the sample is detected by the binding. How to detect SARS-CoV-2.
  • Appendix 13 The method for detecting SARS-CoV-2 according to Appendix 12, wherein the sample is at least one selected from the group consisting of aerosol, saliva, urine, plasma, and serum.
  • Appendix 14 A SARS-CoV-2 virus inactivating agent or neutralizing agent comprising the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule according to any one of Supplementary Notes 1 to 9.
  • the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention can specifically bind to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein, has a high binding force, and has a slow dissociation. Therefore, according to the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention, for example, depending on the presence or absence of binding to the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein in the sample, SARS-CoV- 2 Spike glycoproteins can be detected.
  • the SARS-CoV-2 spiked glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention is an extremely useful tool for detecting SARS-CoV-2 in the fields of preventive medicine, health care, diagnosis of infectious diseases, etc., for example. I can say.
  • the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule of the present invention can be used, for example, for virus detection in biological samples and aerosols, virus inactivation, and the like.

Abstract

SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対し特異的に結合可能であり、結合力が高く、且つ乖離が遅い結合核酸分子を提供する。　本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子は、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。 （ａ）配列番号１～７の塩基配列または配列番号１～７の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド （ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド

Description

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質結合核酸分子、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用センサ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出試薬、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの不活性化剤
　本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質結合核酸分子、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用センサ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出試薬、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの不活性化剤に関する。
　昨今、新型コロナウイルスであるSARS-CoV-2（「2019-nCoV」ともいう。）の世界的なパンデミックが問題になっており、SARS-CoV-2による感染のメカニズムの解明、および治療法やワクチンの開発が進められている。
　そこで、SARS-CoV-2の検出を行うため、SARS-CoV-2を構成するタンパク質を標的としたアプタマーの取得が試みられている（非特許文献１）。
Song Y et al, Anal. Chem. (2020), 92, 9895-9900.
　しかしながら、SARS-CoV-2に対し特異的に結合可能であり、結合力が高く、且つ乖離が遅いアプタマーが求められている。
　そこで、本発明は、SARS-CoV-2のターゲットであるアンジオテンシン変換酵素２（ACE2）との結合に関与する、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対し、特異的に結合可能であり、結合力が高く、且つ乖離が遅い結合核酸分子の提供を目的とする。
　本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子（以下、「核酸分子」ともいう）は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする：
（ａ）配列番号１～７の塩基配列または配列番号１～７の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド；
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド；
配列番号１：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCGTGCCTAATCTCACCCCACGGAATTCATGGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
配列番号２：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCTAATCTCACATTGTAAGCAAAGGAGAATAAGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
配列番号３：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCCTGACCGCTGACCAAATCTCAGTGCAGATGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
配列番号４：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCTTGTCCCCTAATAGGTTCCGACTGACAAGTGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
配列番号５：GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGTGCACTCTCCCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC；
配列番号６：GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGACATGAGCCAGGTGCATCTTGAACGTCATAGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC；
配列番号７：GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGTGCTGATACTCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC。
　本発明のSARS-CoV-2検出用センサは、前記本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子を含むことを特徴とする。
　本発明のSARS-CoV-2検出試薬は、前記本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子を含むことを特徴とする。
　本発明のSARS-CoV-2の検出方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、前記本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のSARS-CoV-2を検出することを特徴とする。
　本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子は、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対し特異的に結合可能であり、結合力が高く、且つ乖離が遅い。このため、本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子によれば、例えば、試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質との結合の有無によって、優れた精度で、SARS-CoV-2を検出できる。
図１は、実施例１におけるアプタマーのSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を示すグラフである。 図２は、実施例２におけるアプタマーのSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を示すグラフである。 図３は、実施例２におけるアプタマーのSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を示すグラフである。 図４は、実施例２におけるアプタマーのSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を示すグラフである。 図５は、実施例２におけるアプタマーのSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を示すグラフである。 図６は、実施例２におけるアプタマーのSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を示すグラフである。 図７は、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の配列を示す模式図である。 図８は、実施例３におけるアプタマーのSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を示すグラフである。
（１）SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子
　本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする：
（ａ）配列番号１～７の塩基配列または配列番号１～７の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド；
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド；
　本発明において、「SARS-CoV-2」は、severe acute respiratory syndrome coronavirus 2を意味する。SARS-CoV-2による感染症は、COVID-19とも呼ばれる。SARS-Cov-2は、ベータコロナウイルス属に分類されるウイルスである。SARS-CoV-2を含むコロナウイルスは、エンベロープタンパク質、メンブランタンパク質、およびスパイク糖タンパク質等から構成されるエンベロープを含み、ゲノムRNAである一本鎖RNAが前記エンベロープに覆われている。前記スパイク糖タンパク質は、表面のアミノ酸が糖鎖修飾されていてもよいし、糖鎖修飾されていなくてもよい。
　本発明の核酸分子は、前述のように、SARS-CoV-2を構成するタンパク質であるSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合可能である。SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質は、SARS-CoV-2のターゲットである、アンジオテンシン変換酵素２（ACE2）との結合に関与する。SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の配列の模式図を図７に示す。本発明の核酸分子は、例えば、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を構成するRBDドメイン、S1+S2ドメイン、S1ドメイン、および、前記S1+S2ドメインの三量体（S-trimerともいう。）の少なくともいずれかに結合してもよい。また、これらの全てに結合してもよいし、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質のその他の領域に結合してもよい。本発明の核酸分子と前記RBDドメイン、S1+S2ドメイン、S1ドメイン、および三量体との結合性は、それぞれ、例えば、後述する実施例１に記載の表１に示す４種類の市販の試薬をターゲットとして用いることにより、確認することができる。本発明の核酸分子は、例えば、以下、アプタマーともいう。
　SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質のアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）のアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ２に登録されている下記のアミノ酸配列（配列番号１５）があげられる。なお、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の前記各ドメインは、前記アクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ２のアミノ酸配列番号において、RBDドメイン：319-541（配列番号１６）、S1+S2ドメイン：13-1273（配列番号１７）、S1ドメイン：13-685（配列番号１８）で示される。前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質およびその各ドメインには、例えば、本発明の核酸分子が結合する範囲で、各アミノ酸配列に対して1以上の変異（例えば、欠失、置換、挿入および／または付加）が導入されていてもよい。
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質（配列番号１５）
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質のRBDドメイン（配列番号１６）
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質のS1+S2ドメイン（配列番号１７）
SQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質のS1ドメイン（配列番号１８）
SQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR
　本発明において、「SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合する」とは、例えば、「SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を有している」、または、「SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合活性を有している」ともいう。本発明の核酸分子とSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ：Surface　Plasmon　resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明の核酸分子は、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合することから、例えば、SARS-CoV-2の検出に使用できる。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。また、本発明の核酸分子は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡから構成されてもよい。本発明の核酸分子がＤＮＡから構成される場合、本発明の核酸分子は、例えば、ＤＮＡ分子、ＤＮＡアプタマーということができる。
　前記（ａ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記配列番号１～７の塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記配列番号１～７の塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。また、前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前記配列番号１～７の塩基配列の部分配列を含むヌクレオチドでもよいし、前記部分配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記部分配列は、特に制限されず、例えば、前記配列番号１～７の塩基配列において、５’末端および３’末端の少なくとも一方の配列を欠失した配列でもよいし、中間領域の配列を欠失した配列でもよい。前記配列番号１～７のポリヌクレオチドを以下に示す。なお、配列番号１～７、および後述する配列番号８～１３の塩基配列において、修飾塩基に下線を付している。修飾塩基については、後述する。
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子１（配列番号１）
GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCGTGCCTAATCTCACCCCACGGAATTCATGGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子２（配列番号２）
GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCTAATCTCACATTGTAAGCAAAGGAGAATAAGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子３（配列番号３）
GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCCTGACCGCTGACCAAATCTCAGTGCAGATGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子４（配列番号４）
GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCTTGTCCCCTAATAGGTTCCGACTGACAAGTGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子５（配列番号５）
GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGTGCACTCTCCCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子６（配列番号６）
GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGACATGAGCCAGGTGCATCTTGAACGTCATAGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子７（配列番号７）
GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGTGCTGATACTCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC
　前記部分配列は、特に制限されず、例えば、前記配列番号１の塩基配列の部分配列が、配列番号８の塩基配列である、前記配列番号２の塩基配列の部分配列が、配列番号９の塩基配列である、前記配列番号３の塩基配列の部分配列が、配列番号１０の塩基配列である、前記配列番号５の塩基配列の部分配列が、配列番号１１の塩基配列である、前記配列番号６の塩基配列の部分配列が、配列番号１２の塩基配列である、または、前記配列番号７の塩基配列の部分配列が、配列番号１３の塩基配列である。
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子８（配列番号８）
CCACTGAAATCCGTGCCTAATCTCACCCCACGGAATTCATGG
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子９（配列番号９）
TCCGCCACTGAAATCTAATCTCACATTGTAAGCAAAGGAGAATAA
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子１０（配列番号１０）
CCACTGAAATCCCTGACCGCTGACCAAATCTCAGTGCAGAT
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子１１（配列番号１１）
TGTGCACTCTCCCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACC
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子１２（配列番号１２）
TGACATGAGCCAGGTGCATCTTGAACGTCATAGATACCGTTGATGTGCTG
SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子１３（配列番号１３）
GCTGATACTCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACCG
　前記（ｂ）において、「同一性」は、特に制限されず、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
　前記（ｂ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｂ１）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｂ１）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。下記（ｂ１）において、「配列番号８～１３のいずれかの塩基配列を含み」は、例えば、「配列番号８～１３のいずれかの塩基配列が保存されている」ということもできる。
（ｂ１）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、配列番号８～１３のいずれかの塩基配列を含み、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド
　本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｂ２）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｂ２）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｂ２）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、下記式（２）～（１４）で表される二次構造を形成可能であり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　前記（ｂ２）のポリヌクレオチドは、具体的には、例えば、配列番号１～１３の塩基配列に対して８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ、前記式（２）～（１４）で表される二次構造を形成可能であり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチドである。
　前記（ｂ１）および（ｂ２）のポリヌクレオチドにおいて、同一性は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドにおける同一性の説明を援用できる。
　前記配列番号１～１３の塩基配列と、前記式（２）～（１４）で表される二次構造の対応関係を、以下に示す。
配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（２）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（３）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（４）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（５）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（６）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（７）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（８）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（９）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（１０）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（１１）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（１２）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号１２の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（１３）で表される二次構造を形成可能である。
配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記式（１４）で表される二次構造を形成可能である。
　また、前記（ｂ２）のポリヌクレオチドは、具体的には、例えば、配列番号１～３、および５～７の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ、配列番号１～３、および５～７の塩基配列の部分配列である、配列番号８～１３に対応する前記式（９）～（１４）で表される二次構造を形成可能であり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチドである。
　前記（ｂ２）において、「二次構造を形成可能」とは、例えば、前記（ｂ２）のポリヌクレオチドが、前記式におけるステム構造およびループ構造を形成可能であることをいう。ステム構造およびループ構造については、後述する。前記ステム構造において、向かい合う塩基対は、水素結合を形成可能な塩基の組合せであればよい。前記水素結合を形成可能な塩基の組合せは、例えば、Ａ－Ｔ、Ｔ－Ａ、Ａ－Ｕ、Ｕ－Ａ、Ｇ－Ｃ、またはＣ－Ｇがあげられる。前記「二次構造」は、例えば、実際に形成される二次構造でもよいし、既知の手段によりシミュレーションを行った場合の二次構造でもよい。
　本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｃ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、下記（ｃ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、下記（ｃ）のポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド
　前記（ｃ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドであり、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合する範囲であればよい。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載されている方法を採用することもできる。
　前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載の条件を採用することもできる。
　本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｄ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、下記（ｄ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、下記（ｄ）のポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド
　前記（ｄ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドが、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）の塩基配列において、例えば、１～１６個、１～１２個、１～１０個、１～８個、１～７個、１～５個、１～３個、１～２個、１個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１～５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
　前記（ｄ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｄ１）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｄ１）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。下記（ｄ１）において、「配列番号８～１３のいずれかの塩基配列を含み」は、「配列番号８～１３のいずれかの塩基配列が保存されている」ということもできる。
（ｄ１）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、配列番号８～１３のいずれかの塩基配列を含み、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド
　前記（ｄ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｄ２）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｄ２）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｄ２）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記式（２）～（１４）で表される二次構造を形成可能であり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド
　前記（ｄ１）および（ｄ２）のポリヌクレオチドにおける「１もしくは数個」は、前記（ｄ）のポリヌクレオチドにおける「１もしくは数個」の説明を援用できる。
　本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）から（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記（ａ）から（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ）から（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記（ａ）から（ｄ）の２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。ここで、前記リンカーとは、例えば、ポリヌクレオチド間の配列であり、前記付加配列とは、例えば、末端に付加された配列である。
　本発明の核酸分子が、例えば、複数のポリヌクレオチドを含む場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上、２～２０、２～１０、２または３である。
　前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長、１～２４塩基長、１～２０塩基長、３～１２塩基長、５～９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
　本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
　本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
　本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
　本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記核酸分子の長さは、特に制限されない。前記核酸分子の長さの下限は、例えば、１５塩基長、３５塩基長、５５塩基長、７５塩基長である。前記核酸分子の長さの上限は、例えば、１０００塩基長であり、２００塩基長、１００塩基長、９０塩基長、８０塩基長である。前記核酸分子の長さの範囲は、例えば、１５～１０００塩基長、３５～２００塩基長、５５～９０塩基長、７５～８０塩基長である。
　前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～９１個、１～３０個、１～１５個、１～７個、１～３個、１または２個である。
　前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド残基における塩基として、天然塩基を含んでもよいし、修飾塩基を含んでもよい。前記天然塩基（非人工塩基）は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。
　前記ポリヌクレオチドが前記修飾塩基を有する場合、その部位および個数は、特に制限されない。本発明の核酸分子が前記修飾塩基を有する場合、前記配列番号１～１３のポリヌクレオチドにおいては、例えば、下線部のチミンの一部または全部が、修飾塩基である。前記下線部のチミンが修飾塩基の場合、前記修飾塩基は、チミン塩基が修飾された修飾チミンであることが好ましい。
　前記修飾塩基は、例えば、塩基が修飾基で修飾されたものである。前記修飾基により修飾される塩基（被修飾塩基）は、例えば、前記天然塩基である。前記天然塩基は、例えば、プリン塩基、ピリミジン塩基等があげられる。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、修飾ウラシルがあげられる。
　前記修飾塩基は、例えば、前記被修飾塩基が、直接、前記修飾基で修飾されてもよいし、前記被修飾塩基が、間接的に、前記修飾基で修飾されてもよい。後者の場合、例えば、前記被修飾塩基が、リンカーを介して、前記修飾基で修飾される形態があげられる。前記リンカーは、特に制限されない。
　前記被修飾塩基の前記修飾基による修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられ、５位が好ましい。前記ピリミジン塩基の５位が修飾される場合、チミンは、５位の炭素にメチル基を有することから、例えば、５位の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよいし、５位の炭素に結合したメチル基の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよい。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「－ＣＨ３」または「－Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾チミンまたは修飾ウラシルということができる。
　前記修飾チミン塩基は、下記式（１）で表されるヌクレオチド残基（以下、「ＮＧ７」ともいう）があげられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　この場合、前記ポリヌクレオチドの合成には、例えば、前記式（１）で表されるヌクレオチド三リン酸を、モノマー分子として使用することができる。前記ポリヌクレオチドの合成において、例えば、前記モノマー分子は、ホスホジエステル結合により、他のヌクレオチド三リン酸と結合する。前記モノマーの製造方法は、公知の方法で製造でき、例えば、国際公開第２０１８／０５２０６３号公報を参照できる。
　前記修飾チミン塩基として式（１）で表されるヌクレオチド残基を含む場合、前記ポリヌクレオチドにおいて前記修飾チミン塩基を含むヌクレオチド残基は、例えば、下記式（１Ａ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　前記ポリヌクレオチドにおいて、前記配列番号１～１３の塩基配列における下線部のチミン塩基が、前記式（１）で表される修飾チミン塩基であることが好ましい。この場合、前記配列番号１～１３の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、下線部のヌクレオチド残基が、前記式（１Ａ）で表されるヌクレオチド残基であるということもできる。
　前記ポリヌクレオチドは、例えば、いずれか１種類の修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の修飾塩基を含んでもよい。
　本発明の核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
　前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
　前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’－メチル化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－メチル化－シトシンヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－アミノ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－アミノ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－チオ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－チオ化－シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
　前記修飾塩基の個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の個数は、例えば、１個以上である。前記修飾塩基は、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、１～７０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個であり、また、全ての塩基が、前記修飾塩基でもよい。前記修飾塩基の個数は、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基の個数であってもよいし、２種類以上の前記修飾塩基の個数の合計であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基も、特に制限されず、例えば、１～８０個、１～５０個、１～２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
　前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の割合は、特に制限されない。前記修飾塩基の割合は、前記ポリヌクレオチドの全塩基数のうち、例えば、１／１００以上、１／４０以上、１／２０以上、１／１０以上、１／４以上、１／３以上である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基の割合も、特に制限されず、前述の範囲と同様である。ここで、前記全塩基数は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおける天然塩基の個数と前記修飾塩基の個数の合計である。前記修飾塩基の割合を分数で示すが、これを満たす全塩基数と修飾塩基数とは、それぞれ正の整数である。
　前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾チミンの場合、前記修飾チミンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾チミンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの個数は、例えば、１個以上である。前記修飾チミンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、１～７０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個であり、また、全てのチミンが、前記修飾チミンでもよい。
　前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの割合は、特に制限されない。前記修飾チミンの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾チミンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、１／４０以上、１／２０以上、１／１０以上、１／４以上、１／３以上である。
　本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～１００個、１～５０個、１～３０個、１～１０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）、ＥＮＡ（2’-O, 4’-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
　本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
　本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長、１～５０塩基長、１～２５塩基長、１８～２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
　本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
　本発明の核酸分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよく、具体的には、前記核酸分子に前記標識物質が結合してもよい。前記標識物質が結合した前記核酸分子は、例えば、本発明の核酸センサということもできる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合させてもよい。前記標識物質による標識化は、例えば、結合でもよいし、化学修飾でもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、酵素、蛍光物質、色素、同位体、薬物、毒素および抗生物質等があげられる。前記酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、ポリヌクレオチドのリンカー等である。
　本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。
　本発明の核酸分子は、前述のように、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質への結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
　本発明の核酸分子によれば、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を検出できる。これにより、SARS-CoV-2を検出できる。SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質、およびSARS-CoV-2の検出方法は、特に制限されず、例えば、後述の検出方法を参照し、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子との結合を検出することによって行える。
（２）SARS-CoV-2検出用センサ
　本発明の検出用センサは、前述のように、SARS-CoV-2の検出用センサであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出用センサは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、特に制限されない。本発明の検出用センサを使用すれば、例えば、前記核酸分子と前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質とを結合させることで、前述のように、前記SARS-CoV-2を検出できる。
　本発明の検出用センサは、例えば、さらに担体を有し、前記担体に前記核酸分子が配置されている。前記核酸分子は、前記担体に固定化されていることが好ましい。前記担体への前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。本発明の検出用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明の核酸分子および前記本発明の検出方法を援用できる。
（３）検出試薬およびキット
　本発明の検出試薬は、前記本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出試薬を使用すれば、前述のように、例えば、前記SARS-CoV-2の検出等を行うことができる。
　本発明の検出試薬は、例えば、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のセンサを含んでもよい。本発明の検出試薬は、例えば、さらに、標識物質を有し、前記標識物質が、前記核酸分子に結合されてもよい。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。また、本発明の検出試薬は、例えば、担体を有し、前記担体に前記核酸分子が固定化されてもよい。前記担体は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。
　本発明の検出試薬は、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、非特異的吸着剤、前記担体、緩衝液、使用説明書等があげられる。前記非特異的吸着剤としては、例えば、デキストラン、tRNA（トランスファーRNA）、サケ精子DNA等があげられる。前記tRNAとしては、例えば、tRNA　from E. coli MRE 600（メルク　ライフサイエンス社製、Cat No.:10109541001）等が使用できる。前記サケ精子DNAは、例えば、デオキシリボ核酸, 低分子量 from salmon sperm（Sigma-Aldrich社製、Cat No.:31149-10G-F）等が使用できる。
　本発明の検出試薬において例えば、前記核酸分子および前記緩衝液等のその他の構成要素は、それぞれ別個の容器に収容されてもよいし、同一の容器に混合または未混同で収容されてもよい。前記核酸分子と前記その他の構成要素とが別々の容器に収容されている場合、本発明の検出試薬は、検出キットということもできる。
（４）検出方法
　本発明の検出方法は、前述のように、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のSARS-CoV-2を検出することを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のSARS-CoV-2検出用センサまたは本発明の検出試薬もしくは検出キットを使用してもよい。
　本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に特異的に結合することから、例えば、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質およびSARS-CoV-2を特異的に検出可能である。具体的には、本発明の検出方法は、例えば、試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の有無またはSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の量を検出可能であることから、定性または定量も可能といえる。また、本発明の検出方法は、例えば、定性分析または定量分析が可能なことから、分析方法ということもできる。
　本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、エアロゾル、唾液、尿、血漿および血清等があげられる。前記エアロゾルは、例えば、気体中に浮遊する微小な液体や固体の粒子と周囲の気体との混合物のことをいう。前記試料がエアロゾルである場合、例えば、前記微小な液体や固体の粒子等が含まれる可能性のある気体を、試料とすることができる。
　前記試料は、例えば、気体試料（前記エアロゾルを含む。）でもよいし、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記気体試料および固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
　前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の有無または量を検出する工程を含む。
　前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
　前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４～３７℃、１８～２５℃であり、接触時間は、例えば、１０～１２０分、３０～６０分である。
　前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
　前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の有無を検出（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の量を検出（定量）できる。
　そして、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質およびSARS-CoV-2は存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質およびSARS-CoV-2が存在すると判断できる。
　前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。また、前記結合は、例えば、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子との複合体の検出でもよい。
（５）SARS-CoV-2ウイルスの不活性化剤
　本発明のSARS-CoV-2ウイルスの不活性化剤は、前述のように、前記本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の不活性化剤は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の構成は、特に制限されない。
　「活性」とは、例えば、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質およびSARS-CoV-2の機能であり、具体的には、例えば、ターゲット（例えば、アンジオテンシン変換酵素２（ACE2））に結合する機能があげられる。また、例えば、SARS-CoV-2の感染性および毒性でもよい。「不活性化（不活化ともいう。）」は、例えば、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質およびSARS-CoV-2の前記機能を阻害することをいう。「不活性化」は、前記活性を完全に抑制してもよいし、部分的に抑制してもよい。
　本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に特異的に結合することから、例えば、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子との結合により、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質およびSARS-CoV-2を不活性化することが可能である。前記不活性化または不活化は、例えば、「中和」ということもできる。このため、本発明の不活性化剤は、中和剤ということもできる。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
［実施例１］
　本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子について、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を、ＳＰＲにより確認した。
（１）アプタマー
　前記配列番号１～７の塩基配列からなるポリヌクレオチド（SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子１～７（以下、それぞれ、「結合核酸分子１～７」ともいう））を合成し、実施例のＤＮＡアプタマーとした。SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子１～７は、前記配列番号１～７の塩基配列における下線部のチミンヌクレオチド残基を、前記式（１）で表されるＮＧ７とした。
　前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子１～７は、その３’末端に、２０塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。
（２）試料
　下記表１に示す４種類の市販の試薬を用い、以下の試験に使用した。なお、表中、ターゲットは、それぞれ、「RBDドメイン」が、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を構成するRBDドメイン（以下、RBDともいう。）、「S1+S2ドメイン」が、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を構成するS1+S2ドメイン（以下、S1S2ともいう。）、「S1ドメイン」が、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を構成するS1ドメイン（以下、S1ともいう。）、「三量体」が、前記S1+S2ドメインの三量体（以下、三量体ともいう。）を示す。なお、各ターゲットのアミノ酸配列は、以下のＮＣＢＩアクセッション番号に登録されたアミノ酸配列に基づき調製されており、前述の配列番号１５～１８のアミノ酸配列を有する。
RBDドメイン: YP_009724390.1
S1+S2ドメイン: YP_009724390.1
S1ドメイン: QHD43416.1
三量体: QHD43416.1
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　前記各試薬を、１ｍｇ／ｍＬとなるように滅菌済み蒸留水で溶解し、前記溶液を試料として用いた。なお、下記結合性の解析等において、前記各試料の希釈には、ＳＢ１Ｔバッファーを使用した。前記ＳＢ１Ｔバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨは、７．４）、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌおよび０．０１％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とした。
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
　結合能の解析には、ProteOn XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。
　まず、ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名：ProteOn NLC Sensor Chip、BioRad社）を、ProteON XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、２．５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Resonance Unit）が飽和するまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２０塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＢ１Ｔバッファーを用いて、２００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡを付加した結合核酸分子１～７を、それぞれ、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が飽和するまで結合させた。続いて、４００ｎｍｏｌ／Ｌの前記各試料を、それぞれ、ＳＢ１Ｔバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＢ１Ｔバッファーを流して洗浄を３００秒間行った。前記試料のインジェクション開始を０秒として、前記試料のインジェクション後のシグナル強度を測定した。前記ＳＰＲは、２５℃の条件下で行った。
　さらに、コントロールとして、前記表１に示す各試料に代えて、ＢＳＡ（Sigma社製、カタログ番号：#A7906）を含む試料を用いた以外は同様にして、シグナル強度を測定した。
　この結果を図１に示す。図１（Ａ）～（Ｇ）は、４００ｎｍｏｌ／Ｌの前記各試料に対する結合核酸分子１～７の結合性を示すグラフである。図１の各グラフにおいて、横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図１（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｅ）～（Ｇ）に示すように、前記結合核酸分子１、２、５～７は、前記各試料のうち、特に、RBD、S1S2、S1、および三量体に対して、結合性を示した。また、図１（Ｃ）、および（Ｄ）に示すように、前記結合核酸分子３、４は、前記各試料のうち、特に、S1S2、S1、および三量体に対して、結合性を示した。一方、コントロール（ＢＳＡ）に対しては、前記結合核酸分子１～７は、いずれも、シグナル強度がほぼ０であり、結合性を示さなかった。この結果から、前記結合核酸分子１～７は、前記各試料に対して優れた特異性で結合すること、および、シグナル強度を測定することにより、前記結合を検出できることがわかった。
　以上のように、本発明の結合核酸分子について、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を、ＳＰＲにより確認できた。
［実施例２］
　本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子について、核酸の非特異的結合を防ぐ効果のあるデキストランを加えた溶液条件で、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を、ＳＰＲにより確認した。また、動態パラメータを求めた。
（１）アプタマー
　前記配列番号１～７の塩基配列からなるポリヌクレオチドに加え、前記配列番号８～１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド（SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子８～１３（以下、それぞれ、結合核酸分子８～１３ともいう））を、前記実施例１と同様にして合成した。
　また、コントロールの核酸分子として、結合核酸分子１～１３に代えて、下記配列番号１４の塩基配列からなるコントロールの核酸分子（配列番号１４）を用いて、同様にして実験を行った。下記配列番号１４の塩基配列は、非特許文献１（Song Y et al, Anal. Chem. (2020), 92, 9895-9900.）に記載の塩基配列である。
コントロールの核酸分子（配列番号１４）
CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA
（２）試料
　試料として、前記実施例１の表１に示す前記RBD、および前記三量体を用いた。
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
　ＳＰＲによる結合能の解析は、前記実施例１と同様にして行った。前記各試料の濃度は、それぞれ、前記RBDの場合、400、200、100、50、25ｎｍｏｌ／Ｌとし、前記三量体の場合、200、100、50、25、12.5ｎｍｏｌ／Ｌとした。
　さらに、前記ＳＢ１Ｔバッファーに代えて、デキストランを加えたバッファー（デキストラン入りＳＢ１Ｔバッファー）を用いた以外は前記実施例１と同様にして、実験を行った。前記デキストラン入りＳＢ１Ｔバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨは、７．４）、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、０．０１％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、および０．１ｍｍｏｌ／Ｌデキストランとした。
　この結果を図２～図６に示す。図２～図５は、前記RBDに対する結合核酸分子１、２、５～９、１１～１３の結合性を示すグラフであり、（Ａ）～（Ｋ）は、デキストランなしの結果、（Ｌ）～（Ｖ）は、デキストランありの結果を示す。図２～図５の各グラフにおいて、横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。なお、図２～図６の各グラフにおいて、黒の点線は、実測値を示し、灰色の実線は、前記実測値に基づき算出したフィッティングカーブを示す。図２～５の（Ａ）～（Ｊ）および（Ｌ）～（Ｕ）に示すように、結合核酸分子１、２、５～９、１１～１３は、デキストランなしおよびデキストランありの条件において、前記RBDに対して、高い結合性を示した。また、図３（Ｋ）および図５（Ｖ）に示すように、コントロールの核酸分子（配列番号１４）は、デキストランなしのバッファーにおいては、前記RBDに対する結合性を示したが、デキストラン入りバッファーにおいては、前記RBDに対する結合性を失った。この結果から、結合核酸分子１、２、５～９、１１～１３は、前記RBDに対して、コントロールの核酸分子（配列番号１４）と比較して、より優れた特異性で結合することがわかった。
　図６は、前記三量体に対する結合核酸分子３、４、および１０の結合性を示すグラフであり、（Ａ）～（Ｄ）は、デキストランなしの結果、（Ｅ）および（Ｆ）は、デキストランありの結果を示す。図６の各グラフにおいて、横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図６（Ａ）～（Ｃ）、（Ｅ）、および（Ｆ）に示すように、結合核酸分子３、４、および１０は、デキストランなしおよびデキストランありの条件において、インジェクション開始後のシグナル強度（ＲＵ）が一定であった。これに対し、図６（Ｄ）に示すように、コントロールの核酸分子（配列番号１４）は、インジェクション開始後の時間経過にともない、シグナル強度（ＲＵ）が減少した。この結果から、結合核酸分子３、４、および１０は、前記三量体に対して、コントロールの核酸分子（配列番号１４）と比較して、より乖離が遅く（slow off rateである）、高い結合力を有することがわかった。
　さらに、前記図２～図６のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。この結果を表２および３に示す。表２および３は、それぞれ、前記RBD、および前記三量体に対する結合核酸分子１～１３の解離定数（ＫＤ）を示す。なお、表２において、「＊」は、解離定数（ＫＤ）が、ＳＰＲで測定できる検出限界以下であったことを示す。これは、結合核酸分子の乖離が遅く、off rateが非常に小さい値であったためであると考えられる。表２および３に示すように、結合核酸分子１～１３は、前記RBD、および前記三量体に対する解離定数（ＫＤ）が、コントロールの核酸分子（配列番号１４）と比較して、非常に低い値であり、優れた結合性であることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　以上のように、本発明の結合核酸分子について、核酸の非特異的結合を防ぐ効果のあるデキストランを加えた溶液条件で、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を、ＳＰＲにより確認できた。また、動態パラメータを求めることができた。
［実施例３］
　本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子について、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を、ＥＬＡＡ（Enzyme Linked Aptamer Assay）によって評価した。
（１）アプタマー
　前記配列番号１および８の塩基配列からなるポリヌクレオチド（結合核酸分子１および結合核酸分子８）を、前記実施例１と同様にして合成した。
（２）試料
　試料として、前記実施例１の表１に示す前記RBDを用いた。
（３）ＥＬＡＡによる結合能の解析
　ＥＬＡＡによる結合能の解析は、非特許文献２（I. Shiratori et al, Biochem Biophys Res Commun 443 (2014) 37-41.）に記載の方法と同様に行った。具体的には、前記RBDを５０ｍｍｏｌ／ｌ　炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で１μｇ／１００μｌになるように希釈した。前記希釈後、前記RBDは、 Maxisorpプレート（Thermo Scientific/Nunc, Waltham, MA）のウェルに１μｇ／ウェルになるように加え、４℃、一晩の条件下で、固相化した。前記固相化後、ウェルを２００μｌのＳＢ１Ｔバッファー（４０ｍｍｏｌ／ｌ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１２５ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ　ＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＣｌ、０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０）で１回洗浄し、前記洗浄後、２００μｌのTBS blocking buffer（Cat No.: 37570、Pierce Biotechnology社製）で、室温（約２５℃、以下、同様）、１時間の条件下で、ブロッキングを行った。つぎに、実施例１（３）と同様にして、アプタマーの５’末端を、ビオチン化した。前記ビオチン化後、前記アプタマーは、ＳＢ１Ｔバッファーで１μｍｏｌ／ｌに調整し、９５℃、５分の条件下で熱変性を行った。前記変性後、４℃に急冷してフォールディングを行った。前記アプタマーは、RBDを固相化した前記ウェルに５０μｌ／ウェルになるように加え、２５℃、１時間の条件下で、インキュベートした。前記インキュベート後、前記ウェルを２００μｌのＳＢ１Ｔバッファーで３回洗浄した。前記洗浄後、ＳＢ１Ｔバッファーで１０００倍に希釈したstreptavidin-horseradish peroxidase（SA-HRP）（Citiva社製）を１００μｌ加え、２５℃、３０分の条件下で、インキュベートした。前記インキュベート後、前記ウェルをＳＢ１Ｔバッファーで３回洗浄した。前記洗浄後、TMB solution （MOSS社製）を１００μｌ加え、室温、１０分の条件下で、インキュベートした。前記インキュベート後、０．５Ｎの硫酸を加え、反応を停止させた。その後、infinite M1000Pro（Tecan社製）を用いて、前記ウェルについて、４９０ｎｍと６２０ｎｍ（バックグラウンド）との吸光度を測定した。そして、各結合核酸分子について、４９０ｎｍと６２０ｎｍとの吸光度の差分（ＡＢＳ（４９０ｎｍ－６２０ｎｍ））を算出した。コントロールは、前記結合核酸分子１および８を未添加とした以外は同様にして、吸光度の差分を算出した。
　この結果を図８に示す。図８は、結合核酸分子１および８における、前記RBDに対する結合能を示すグラフである。図８において、縦軸は、同じサンプル３ウェル分の吸光度の差分の平均を示し、エラーバーは、標準偏差を示し、横軸は、結合核酸分子の種類およびRBDの添加の有無を示す。アプタマーなしの場合、RBDの添加の有無に関わらず、吸光度の差分は、変わらなかった。他方、前記結合核酸分子１および８において、吸光度の差分は、RBDの存在下で増加した。
　以上のことから、本発明の結合核酸分子について、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する結合能を、ELAAにより確認できた。
　以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０２０年１１月３０日に出願された日本出願特願２０２０－１９８５５６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
＜付記＞
　上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子：
（ａ）配列番号１～７の塩基配列または配列番号１～７の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド；
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド；
配列番号１：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCGTGCCTAATCTCACCCCACGGAATTCATGGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
配列番号２：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCTAATCTCACATTGTAAGCAAAGGAGAATAAGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
配列番号３：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCCTGACCGCTGACCAAATCTCAGTGCAGATGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
配列番号４：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCTTGTCCCCTAATAGGTTCCGACTGACAAGTGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
配列番号５：GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGTGCACTCTCCCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC；
配列番号６：GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGACATGAGCCAGGTGCATCTTGAACGTCATAGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC；
配列番号７：GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGTGCTGATACTCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC。
（付記２）
前記配列番号１の塩基配列の部分配列が、配列番号８の塩基配列である、
前記配列番号２の塩基配列の部分配列が、配列番号９の塩基配列である、
前記配列番号３の塩基配列の部分配列が、配列番号１０の塩基配列である、
前記配列番号５の塩基配列の部分配列が、配列番号１１の塩基配列である、
前記配列番号６の塩基配列の部分配列が、配列番号１２の塩基配列である、または、
前記配列番号７の塩基配列の部分配列が、配列番号１３の塩基配列である、付記１記載の核酸分子：
配列番号８：CCACTGAAATCCGTGCCTAATCTCACCCCACGGAATTCATGG；
配列番号９：TCCGCCACTGAAATCTAATCTCACATTGTAAGCAAAGGAGAATAA；
配列番号１０：CCACTGAAATCCCTGACCGCTGACCAAATCTCAGTGCAGAT；
配列番号１１：TGTGCACTCTCCCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACC；
配列番号１２：TGACATGAGCCAGGTGCATCTTGAACGTCATAGATACCGTTGATGTGCTG；
配列番号１３：GCTGATACTCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACCG。
（付記３）
前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）のポリヌクレオチドである、付記１または２記載の核酸分子：
（ｂ１）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、配列番号８～１３のいずれかの塩基配列を含み、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド。
（付記４）
前記（ｄ）のポリヌクレオチドが、下記（ｄ１）のポリヌクレオチドである、付記１または２記載の核酸分子：
（ｄ１）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、配列番号８～１３のいずれかの塩基配列を含み、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド。
（付記５）
前記結合核酸分子が、塩基が修飾基で修飾された修飾塩基を含む、付記１から４のいずれかに記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子。
（付記６）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミン塩基である、付記５記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子。
（付記７）
前記修飾チミン塩基が、下記式（１）で表される修飾チミン塩基である、付記６記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （付記８）
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記配列番号１～１３の塩基配列における下線部のチミン塩基が、修飾塩基である、付記５から７のいずれかに記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子。
（付記９）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記１から８のいずれかに記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子。
（付記１０）
付記１から９のいずれかに記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子を含むことを特徴とする、SARS-CoV-2検出用センサ。
（付記１１）
付記１から９のいずれかに記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子を含むことを特徴とする、SARS-CoV-2検出試薬。
（付記１２）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記１から９のいずれかに記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を検出することを特徴とする、SARS-CoV-2の検出方法。
（付記１３）
前記試料が、エアロゾル、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも１つである、付記１２記載のSARS-CoV-2の検出方法。
（付記１４）
付記１から９のいずれかに記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子を含むことを特徴とする、SARS-CoV-2ウイルスの不活性化剤または中和剤。
　以上のように、本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子は、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対し特異的に結合可能であり、結合力が高く、且つ乖離が遅い。このため、本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子によれば、例えば、試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質との結合の有無によって、優れた精度で、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を検出できる。したがって、本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子は、例えば、予防医学、健康管理、および感染症等の診断等の分野におけるSARS-CoV-2の検出に、極めて有用なツールといえる。本発明のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子は、例えば、生体試料やエアロゾル中のウイルス検出、およびウイルスの不活性化等に用いることができる。

 

Claims (14)

  1. 下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子：
    （ａ）配列番号１～７の塩基配列または配列番号１～７の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド；
    （ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド
    （ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド；
    配列番号１：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCGTGCCTAATCTCACCCCACGGAATTCATGGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
    配列番号２：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCTAATCTCACATTGTAAGCAAAGGAGAATAAGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
    配列番号３：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCCCTGACCGCTGACCAAATCTCAGTGCAGATGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
    配列番号４：GGTATGTCTCCGCCACTGAAATCTTGTCCCCTAATAGGTTCCGACTGACAAGTGCAAAGCCGAGGTGTCTTGTATTC；
    配列番号５：GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGTGCACTCTCCCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC；
    配列番号６：GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGACATGAGCCAGGTGCATCTTGAACGTCATAGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC；
    配列番号７：GGTTTAGCCCTCGACTCCAAATGTGCTGATACTCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACCGTTGATGTGCTGCCAATAC。
  2. 前記配列番号１の塩基配列の部分配列が、配列番号８の塩基配列である、
    前記配列番号２の塩基配列の部分配列が、配列番号９の塩基配列である、
    前記配列番号３の塩基配列の部分配列が、配列番号１０の塩基配列である、
    前記配列番号５の塩基配列の部分配列が、配列番号１１の塩基配列である、
    前記配列番号６の塩基配列の部分配列が、配列番号１２の塩基配列である、または、
    前記配列番号７の塩基配列の部分配列が、配列番号１３の塩基配列である、請求項１記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子：
    配列番号８：CCACTGAAATCCGTGCCTAATCTCACCCCACGGAATTCATGG；
    配列番号９：TCCGCCACTGAAATCTAATCTCACATTGTAAGCAAAGGAGAATAA；
    配列番号１０：CCACTGAAATCCCTGACCGCTGACCAAATCTCAGTGCAGAT；
    配列番号１１：TGTGCACTCTCCCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACC；
    配列番号１２：TGACATGAGCCAGGTGCATCTTGAACGTCATAGATACCGTTGATGTGCTG；
    配列番号１３：GCTGATACTCGGTATCCCTAATCTCACCCGATACCG。
  3. 前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）のポリヌクレオチドである、請求項１または２記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子：
    （ｂ１）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、配列番号８～１３のいずれかの塩基配列を含み、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド。
  4. 前記（ｄ）のポリヌクレオチドが、下記（ｄ１）のポリヌクレオチドである、請求項１または２記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子：
    （ｄ１）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、配列番号８～１３のいずれかの塩基配列を含み、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合するポリヌクレオチド。
  5. 前記結合核酸分子が、塩基が修飾基で修飾された修飾塩基を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子。
  6. 前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミン塩基である、請求項５記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子。
  7. 前記修飾チミン塩基が、下記式（１）で表される修飾チミン塩基である、請求項６記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  8. 前記ポリヌクレオチドにおいて、前記配列番号１～１３の塩基配列における下線部のチミン塩基が、修飾塩基である、請求項５から７のいずれか一項に記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子。
  9. 前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１から８のいずれか一項に記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子。
  10. 請求項１から９のいずれか一項に記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子を含むことを特徴とする、SARS-CoV-2検出用センサ。
  11. 請求項１から９のいずれか一項に記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子を含むことを特徴とする、SARS-CoV-2検出試薬。
  12. 試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を検出する工程を含み、
    前記核酸分子が、請求項１から９のいずれか一項に記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子であり、
    前記検出工程において、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を検出することを特徴とする、SARS-CoV-2の検出方法。
  13. 前記試料が、エアロゾル、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１２記載のSARS-CoV-2の検出方法。
  14. 請求項１から９のいずれか一項に記載のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合核酸分子を含むことを特徴とする、SARS-CoV-2ウイルスの不活性化剤。

     
PCT/JP2021/034667 2020-11-30 2021-09-22 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質結合核酸分子、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用センサ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出試薬、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの不活性化剤 WO2022113496A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022565082A JPWO2022113496A1 (ja) 2020-11-30 2021-09-22
US18/038,955 US20240002860A1 (en) 2020-11-30 2021-09-22 SARS-CoV-2 SPIKE GLYCOPROTEIN-BINDING NUCLEIC ACID MOLECULE, SARS-CoV-2 DETECTION SENSOR, SARS-CoV-2 DETECTION REAGENT, SARS-CoV-2 DETECTION METHOD, AND SARS-CoV-2 VIRUS DEACTIVATOR
CN202180077368.6A CN116710553A (zh) 2020-11-30 2021-09-22 SARS-CoV-2刺突糖蛋白结合核酸分子、SARS-CoV-2检测用传感器、SARS-CoV-2检测试剂、SARS-CoV-2的检测方法和SARS-CoV-2病毒的灭活剂
EP21897474.9A EP4253545A1 (en) 2020-11-30 2021-09-22 Sars-cov-2 spike glycoprotein-binding nucleic acid molecule, sars-cov-2 detection sensor, sars-cov-2 detection reagent, sars-cov-2 detection method, and sars-cov-2 virus deactivator

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-198556 2020-11-30
JP2020198556 2020-11-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022113496A1 true WO2022113496A1 (ja) 2022-06-02

Family

ID=81755498

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/034667 WO2022113496A1 (ja) 2020-11-30 2021-09-22 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質結合核酸分子、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用センサ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出試薬、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの不活性化剤

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240002860A1 (ja)
EP (1) EP4253545A1 (ja)
JP (1) JPWO2022113496A1 (ja)
CN (1) CN116710553A (ja)
WO (1) WO2022113496A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018052063A1 (ja) 2016-09-15 2018-03-22 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法
CN111849994A (zh) * 2020-03-31 2020-10-30 厦门大学 SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体及其应用
JP2020198556A (ja) 2019-06-03 2020-12-10 キヤノン株式会社 画像処理装置及びその制御方法、プログラム、記憶媒体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018052063A1 (ja) 2016-09-15 2018-03-22 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法
JP2020198556A (ja) 2019-06-03 2020-12-10 キヤノン株式会社 画像処理装置及びその制御方法、プログラム、記憶媒体
CN111849994A (zh) * 2020-03-31 2020-10-30 厦门大学 SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARDY WEISSHOFF, OXANA KRYLOVA, HEIKE NIKOLENKO, HANS-DIRK DüNGEN, ANDRE DALLMANN, SUSANNE BECKER, PETER GöTTEL, JOHANNE: "Aptamer BC 007 - Efficient binder of spreading-crucial SARS-CoV-2 proteins", HELIYON, vol. 6, no. 11, 1 November 2020 (2020-11-01), GB , pages e05421, XP055761899, ISSN: 2405-8440, DOI: 10.1016/j.heliyon.2020.e05421 *
I. SHIRATORI ET AL., BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 443, 2014, pages 37 - 41
LIU RAN, HE LEI, HU YUANSHENG, LUO ZHAOFENG, ZHANG JINGJING: "A serological aptamer-assisted proximity ligation assay for COVID-19 diagnosis and seeking neutralizing aptamers", CHEMICAL SCIENCE, vol. 11, no. 44, 18 November 2020 (2020-11-18), United Kingdom , pages 12157 - 12164, XP055935172, ISSN: 2041-6520, DOI: 10.1039/D0SC03920A *
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
SONG Y ET AL., ANAL. CHEM., vol. 92, 2020, pages 9895 - 9900
YANLING SONG, JIA SONG, XINYU WEI, MENGJIAO HUANG, MIAO SUN, LIN ZHU, BINGQIAN LIN, HAICONG SHEN, ZHI ZHU, CHAOYONG YANG: "Discovery of Aptamers Targeting the Receptor-Binding Domain of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 92, no. 14, 21 July 2020 (2020-07-21), US , pages 9895 - 9900, XP055759814, ISSN: 0003-2700, DOI: 10.1021/acs.analchem.0c01394 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116710553A (zh) 2023-09-05
JPWO2022113496A1 (ja) 2022-06-02
EP4253545A1 (en) 2023-10-04
US20240002860A1 (en) 2024-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6491610B2 (ja) 試験試料の多重化分析
Thiviyanathan et al. Aptamers and the next generation of diagnostic reagents
Kawakami et al. In vitro selection of aptamers that act with Zn2+
US9404919B2 (en) Multiplexed analyses of test samples
US7855054B2 (en) Multiplexed analyses of test samples
JP2007195560A (ja) 核酸リガンド
EP3108045B1 (en) Compositions and methods for detecting microorganisms
Jia et al. Oligoarginine peptides slow strand annealing and assist non-enzymatic RNA replication
US20200340042A1 (en) In vitro selection for nucleic acid aptamers
EP3995575A1 (en) Aptamer selection method and immunity analysis method using aptamer
US10760084B2 (en) α-amylase-binding nucleic acid molecule and use thereof
WO2022113496A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質結合核酸分子、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用センサ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出試薬、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの不活性化剤
JP6347498B2 (ja) 卵アレルゲンに結合する核酸分子およびその用途
AU2017202493B2 (en) Multiplexed analyses of test samples
US10934548B2 (en) Wheat allergen-binding nucleic acid molecule and use thereof
JP6399611B2 (ja) エビアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途
JP7405400B2 (ja) 核酸分子およびその用途
JP2022106581A (ja) Ｃｒｐ結合核酸分子、ｃｒｐ検出用センサ、ｃｒｐ検出試薬、ｃｒｐの検出方法、およびｃｒｐ結合領域
Tran Computational Techniques Applied to RNA Structures and Bacterial Genomes
JP2019149979A (ja) 分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）結合核酸分子、ｓＩｇＡ検出用センサ、ｓＩｇＡ検出試薬、およびｓＩｇＡの分析方法
JP2019041672A (ja) 核酸分子およびその用途
Graham Isolating HIV NCp7 Peptide Mimics that Target the Anticodon Stem Loop Region of Human Transfer RNA Lysine3 in a Modification Dependent Manner
AU2013203360A1 (en) Multiplexed analyses of test samples

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21897474

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022565082

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202180077368.6

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18038955

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021897474

Country of ref document: EP

Effective date: 20230630