JP6763552B2 - ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法 - Google Patents
ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法に関する。
試料中のターゲットを分析するために、ターゲットと結合する結合分子が用いられている。また、前記ターゲットに結合する結合分子としては、抗体に加え、アプタマー等のターゲットに結合する結合核酸分子も用いられている（特許文献１）。
前記結合核酸分子の取得方法としては、多数の候補ポリヌクレオチドと、ターゲットを接触させ、前記候補ポリヌクレオチドにおいて前記ターゲットと結合するポリヌクレオチドを前記結合核酸分子として選抜するＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法等が知られている。また、前記ＳＥＬＥＸ法により、結合核酸分子を取得する場合、前記結合核酸分子を構成する天然のヌクレオシド分子に加え、前記天然のヌクレオシド分子を修飾した、修飾ヌクレオシド分子も使用されている。
しかしながら、公知の天然ヌクレオシドおよびその誘導体では、十分な結合能を有する結合核酸分子が得られないターゲットが存在する。このため、例えば、アプタマーの作製に使用可能な修飾ヌクレオシド誘導体が求められている。
そこで、本発明は、新たなヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法の提供を目的とする。
本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩は、下記化学式（１）で表されることを特徴とする。
前記化学式（１）中、
Ｓｕは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和または不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（−ＮＲ１−）、エーテル基（−Ｏ−）、またはチオエーテル基（−Ｓ−）であり、
Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基である。
Ｓｕは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和または不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（−ＮＲ１−）、エーテル基（−Ｏ−）、またはチオエーテル基（−Ｓ−）であり、
Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基である。
本発明のポリヌクレオチドの合成試薬は、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする。
本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする。
本発明の結合核酸分子の製造方法は、候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および
前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、
前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることを特徴とする。
前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、
前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることを特徴とする。
本発明によれば、新たなヌクレオシド誘導体またはその塩を提供できる。
＜ヌクレオシド誘導体またはその塩＞
本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩は、前述のように、下記化学式（１）で表されることを特徴とする。
前記化学式（１）中、
Ｓｕは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和または不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（−ＮＲ１−）、エーテル基（−Ｏ−）、またはチオエーテル基（−Ｓ−）であり、
Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基である。
本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩は、前述のように、下記化学式（１）で表されることを特徴とする。
Ｓｕは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和または不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（−ＮＲ１−）、エーテル基（−Ｏ−）、またはチオエーテル基（−Ｓ−）であり、
Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基である。
本発明のヌクレオシド誘導体は、プリン環様の構造を２つ含む。このため、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、分子内または分子間で相互作用可能な原子の数が、プリン環様の構造を１つ含むヌクレオシド誘導体より相対的に多い。このため、本発明のヌクレオシド誘導体を含む結合核酸分子は、例えば、プリン環様の構造を１つ含むヌクレオシド誘導体と比較して、ターゲットに対する結合能が向上する。このため、本発明のヌクレオシド誘導体によれば、例えば、ターゲットに対し優れた結合能を示す結合核酸分子を製造できる。
前記化学式（１）において、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和または不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基である。Ｌ１の炭素数は、その下限が、２であり、その上限が、１０であり、好ましくは、８、６であり、その範囲が、例えば、２〜８、２〜６である。Ｌ１の炭素数は、２が好ましい。Ｌ２の炭素数は、その下限が、２であり、その上限が、１０であり、好ましくは、８、６であり、その範囲が、例えば、２〜８、２〜６である。Ｌ２の炭素数は、２が好ましい。Ｌ１およびＬ２の具体例としては、例えば、エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ビニレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）、プロピレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、イソプロピレン基（−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−）、ブチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、メチルブチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ジメチルブチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）、エチルブチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ（Ｃ２Ｈ5）−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ペンチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、へキシレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ヘプチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、オクチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）等があげられる。Ｌ１は、ビニレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）が好ましい。また、Ｌ２は、エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）が好ましい。Ｌ１およびＬ２は、同じ炭化水素基でもよいし、異なる炭化水素基でもよく、後者の具体例として、Ｌ１は、ビニレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）であり、Ｌ２は、エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）であることが好ましい。
前記化学式（１）において、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（−ＮＲ１−）、エーテル基（−Ｏ−）、またはチオエーテル基（−Ｓ−）である。前記イミノ基において、Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基であり、水素原子が好ましい。前記直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基は、Ｌ１およびＬ２における説明を援用できる。Ｘ１は、イミノ基（−ＮＲ１−）が好ましい。また、Ｘ２は、イミノ基（−ＮＲ１−）が好ましい。Ｘ１およびＸ２は、同じ置換基でもよいし、異なる置換基でもよく、前者の具体例として、Ｘ１およびＸ２は、イミノ基（−ＮＲ１−）が好ましく、ＮＨ基がより好ましい。
前記化学式（１）において、前記ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団は、特に制限されず、公知の天然または人工ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団があげられる。前記天然ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団は、例えば、リボヌクレオシド残基におけるリボース骨格を有する原子団、デオキシリボヌクレオシドにおけるデオキシリボース骨格を有する原子団等があげられる。前記人工ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団は、例えば、人工ヌクレオシド残基における二環式の糖骨格を有する原子団があげられ、具体例として、ＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）等における２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とが、架橋されたリボース骨格を有する原子団等があげられる。前記ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団は、特に制限されず、公知の天然または人工ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団があげられる。前記天然ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団は、例えば、リボヌクレオチド残基におけるリボース−リン酸骨格を有する原子団、デオキシリボヌクレオチドにおけるデオキシリボース−リン酸骨格を有する原子団等があげられる。前記人工ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団は、例えば、人工ヌクレオチド残基における二環式の糖リン酸骨格を有する原子団があげられ、具体例として、ＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）等における２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とが、架橋されたリボース−リン酸骨格を有する原子団等があげられる。
前記化学式（１）において、前記ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団は、下記化学式（２）で表されることが好ましい。
前記化学式（２）中、
Ｒ２は、水素原子、保護基、または下記化学式（３）で表される基であり、
Ｒ３は、水素原子、保護基、またはホスホロアミダイト基であり、
Ｒ４は、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり、
前記化学式（３）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｚは、ヒドロキシル基またはイミダゾール基であり、
ｍは、１〜１０の整数である。
Ｒ２は、水素原子、保護基、または下記化学式（３）で表される基であり、
Ｒ３は、水素原子、保護基、またはホスホロアミダイト基であり、
Ｒ４は、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｚは、ヒドロキシル基またはイミダゾール基であり、
ｍは、１〜１０の整数である。
前記化学式（２）において、Ｒ２は、水素原子、保護基、または前記化学式（３）で表される基である。前記保護基は、特に制限されず、例えば、核酸の合成方法において使用されている公知のヒドロキシル基の保護基があげられ、具体例として、ＤＭＴｒ基（４，４’−ジメトキシ（トリフェニルメチル）基）等があげられる。Ｒ２が前記化学式（３）で表される基である場合、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、ヌクレオチド誘導体ということもできる。
前記化学式（２）において、Ｒ３は、水素原子、保護基、またはホスホロアミダイト基である。前記保護基は、特に制限されず、例えば、Ｒ２における説明を援用できる。前記ホスホロアミダイト基は、下記化学式（５）で表される。Ｒ３がホスホロアミダイト基である場合、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、ヌクレオシド誘導体のホスホロアミダイト化物ということもできる。また、Ｒ２が前記化学式（３）で表される基であり、Ｒ３がホスホロアミダイト基である場合、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、ヌクレオチド誘導体のホスホロアミダイト化物ということもできる。
前記化学式（２）において、Ｒ４は、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり、水素原子またはヒドロキシル基が好ましい。Ｒ４が水素原子の場合、本発明のヌクレオシド誘導体は、糖骨格として、デオキシリボース骨格を有し、例えば、ＤＮＡの合成に使用できる。また、Ｒ４がヒドロキシル基の場合、本発明のヌクレオシド誘導体は、糖骨格として、リボース骨格を有し、例えば、ＲＮＡの合成に使用できる。
前記化学式（３）において、Ｙは、酸素原子または硫黄原子である。Ｙが酸素原子の場合、本発明のヌクレオシド誘導体を構成単位として含むポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を有するポリヌクレオチドということもできる。また、Ｙが硫黄原子の場合、本発明のヌクレオシド誘導体を構成単位として含むポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を有するポリヌクレオチドということもできる。
前記化学式（３）において、Ｚは、ヒドロキシル基またはイミダゾール基である。前記イミダゾール基において、イミダゾールは、例えば、１位の窒素原子を介して、リン酸原子に結合している。
前記化学式（３）において、ｍは、１〜１０の整数であり、好ましくは、１〜３、１〜２、１である。
本発明のヌクレオシド誘導体は、下記化学式（４）、（６）、（７）または（８）で表されることが好ましい。以下、下記化学式（４）、（６）、（７）および（８）で表されるヌクレオシド誘導体を、それぞれ、ＭＫ４、ＭＫ１、ＭＫ２、およびＭＫ３ともいう。
本発明のヌクレオシド誘導体およびその塩は、その鏡像異性体、互変異性体、または幾何異性体、配座異性体および光学異性体等の立体異性体ならびにそれらの塩であってもよい。具体的に、前記化学式（２）等および後述する化学式において、糖骨格は、Ｄ体としているが、本発明のヌクレオシド誘導体は、これに限定されず、糖骨格をＬ体としてもよい。
前記本発明のヌクレオシド誘導体の塩は、酸付加塩でもよいが、塩基付加塩でもよい。さらに、前記酸付加塩を形成する酸は無機酸でも有機酸でもよく、前記塩基付加塩を形成する塩基は無機塩基でも有機塩基でもよい。前記無機酸としては、特に制限されず、例えば、硫酸、リン酸、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、次亜フッ素酸、次亜塩素酸、次亜臭素酸、次亜ヨウ素酸、亜フッ素酸、亜塩素酸、亜臭素酸、亜ヨウ素酸、フッ素酸、塩素酸、臭素酸、ヨウ素酸、過フッ素酸、過塩素酸、過臭素酸、および過ヨウ素酸等があげられる。前記有機酸は、特に制限されず、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモベンゼンスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸等があげられる。前記無機塩基は、特に制限されず、例えば、水酸化アンモニウム、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩および炭酸水素塩等があげられ、より具体的には、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウム等があげられる。前記有機塩基は、特に制限されず、例えば、エタノールアミン、トリエチルアミンおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等があげられる。
本発明のヌクレオシド誘導体の製造方法は、特に制限されず、公知の合成方法を組合せて製造することができる。具体例として、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、後述する実施例の合成方法のように、アクリル酸構造が導入されたヌクレオシド誘導体と、末端にアミノ基を有する置換基を、アミノ基の水素原子と置換したアデニンとのアミド化反応により合成することができる。
＜ポリヌクレオチドの合成試薬＞
本発明のポリヌクレオチドの合成試薬（以下、「合成試薬」ともいう）は、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする。本発明の合成試薬は、前記本発明のヌクレオシド誘導体を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の合成試薬は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩の説明を援用できる。本発明の合成試薬によれば、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを合成できる。
本発明のポリヌクレオチドの合成試薬（以下、「合成試薬」ともいう）は、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする。本発明の合成試薬は、前記本発明のヌクレオシド誘導体を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の合成試薬は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩の説明を援用できる。本発明の合成試薬によれば、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを合成できる。
本発明の合成試薬において、前記ヌクレオシド誘導体は、例えば、前記ホスホロアミダイト化物および前記ヌクレオチド誘導体の少なくとも一方を含むことが好ましい。
本発明の合成試薬は、例えば、さらに、ポリヌクレオチドの合成に使用する他の試薬を含んでもよい。
＜ポリヌクレオチドの製造方法＞
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、前記合成工程において、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用いることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩および合成試薬の説明を援用できる。本発明のポリヌクレオチドの製造方法によれば、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを製造できる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、前記合成工程において、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用いることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩および合成試薬の説明を援用できる。本発明のポリヌクレオチドの製造方法によれば、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを製造できる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法において、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩として、前記本発明の合成試薬を用いてもよい。
前記合成工程において、前記ポリヌクレオチドの合成方法は、特に制限されず、公知のポリヌクレオチドの合成方法により実施できる。前記ヌクレオチド誘導体またはその塩として、前記ホスホロアミダイト化物を用いる場合、前記合成工程は、ホスホロアミダイト法によりポリヌクレオチドを合成できる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、例えば、前記合成工程で得られたポリヌクレオチドを精製する精製工程を含んでもよい。前記精製工程における精製方法は、特に制限されず、カラムクロマトグラフ等の公知の精製方法により実施できる。
＜ポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドは、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、およびポリヌクレオチドの製造方法の説明を援用できる。本発明のポリヌクレオチドによれば、例えば、後述するように、ターゲットに結合する結合核酸分子を製造できる。本発明のポリヌクレオチドにおいて、前記構成単位は、例えば、ポリヌクレオチドの一部であることを意味する。
本発明のポリヌクレオチドは、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、およびポリヌクレオチドの製造方法の説明を援用できる。本発明のポリヌクレオチドによれば、例えば、後述するように、ターゲットに結合する結合核酸分子を製造できる。本発明のポリヌクレオチドにおいて、前記構成単位は、例えば、ポリヌクレオチドの一部であることを意味する。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、下記化学式（９）で表される構造を含む。下記化学式（９）における各置換基の説明は、例えば、前述の各置換基の説明を援用できる。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ターゲットに結合する結合核酸分子であってもよい。前記ターゲットは、特に制限されず、任意のターゲットとでき、具体例として、生体分子があげられる。前記生体分子は、例えば、分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）、アミラーゼ（例えば、α−アミラーゼ）、クロモグラニンＡ、β−ディフェンシン（Defensin）２、β−ディフェンシン４Ａ、カリクレイン、Ｃ反応タンパク質（C-Reactive Protein、CRP）、カルプロテクチン、Statherins、コルチゾル、メラトニン、リゾチーム、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、インターロイキン（ＩＬ）−６等があげられる。前記結合核酸分子は、例えば、後述する本発明の結合核酸分子の製造方法により製造できる。
本発明のポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチド誘導体に加え、例えば、他のヌクレオチドを含んでもよい。前記ヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドがあげられる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチドのみから構成されるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含むＤＮＡ／ＲＮＡ、リボヌクレオチドのみから構成されるＲＮＡ等があげられる。前記他のヌクレオチドは、例えば、修飾ヌクレオチドでもよい。
前記修飾ヌクレオチドは、例えば、修飾デオキシリボヌクレオチドおよび修飾リボヌクレオチドがあげられる。前記修飾ヌクレオチドは、例えば、前記ヌクレオチドにおける糖が修飾されたものがあげられる。前記糖は、例えば、デオキシリボースまたはリボースがあげられる。前記ヌクレオチドにおける修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖の２’位および／または４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾ヌクレオチドは、例えば、塩基としてピリミジン塩基（ピリミジン核）を有するヌクレオチドが修飾されたもの、または、塩基としてプリン塩基（プリン核）を有するヌクレオチドが修飾されたものがあげられ、好ましくは前者である。以下、ピリミジン塩基を有するヌクレオチドをピリミジンヌクレオチドといい、修飾されたピリミジンヌクレオチドを修飾ピリミジンヌクレオチドといい、プリン塩基を有するヌクレオチドをプリンヌクレオチドといい、修飾されたプリンヌクレオチドを修飾プリンヌクレオチドという。前記ピリミジンヌクレオチドは、例えば、ウラシルを有するウラシルヌクレオチド、シトシンを有するシトシンヌクレオチド、チミンを有するチミンヌクレオチド等があげられる。前記修飾ヌクレオチドにおいて、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチドの具体例は、例えば、リボースの２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド等があげられる。
前記他のヌクレオチドにおける塩基は、例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）の天然塩基（非人工塩基）でもよいし、非天然塩基（人工塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基および改変塩基等があげられ、前記天然塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（Ｇ）に代えて、シトシン（Ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（Ｃ）に代えて、グアニン（Ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（Ａ）に代えて、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（Ｔ）に代えて、アデニン（Ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（Ｕ）に代えて、アデニン（Ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’−メチルウラシル、２’−メチルシトシン、２’−フルオロウラシル、２’−フルオロシトシン、２’−アミノウラシル、２’−アミノシトシン、２’−チオウラシル、２’−チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
本発明のポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチド誘導体に加え、例えば、人工核酸モノマーを含んでもよい。前記人工核酸モノマーは、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ、ＥＮＡ等があげられる。前記モノマー残基における塩基は、例えば、前述と同様である。
本発明のポリヌクレオチドの長さは、特に制限されず、例えば、その下限は、１０塩基、２０塩基、２５塩基であり、その上限は、例えば、１５０塩基、１００塩基、７０塩基であり、その範囲は、例えば、１０〜１５０塩基、２０〜１００塩基、２５〜７０塩基である。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されず、また、その長さも特に制限されない。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、例えば、前記ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは５’末端である。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ（登録商標）３色素、Ｃｙ（登録商標）５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ（登録商標）６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。
前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、前記付加配列を介して、間接的に連結してもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明のポリヌクレオチドは、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明のポリヌクレオチドを固定化する場合、例えば、前記ポリヌクレオチドは、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
＜結合核酸分子の製造方法＞
本発明の結合核酸分子の製造方法は、前述のように、候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることを特徴とする。本発明の結合核酸分子の製造方法は、例えば、前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の結合核酸の製造方法は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩、合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、およびポリヌクレオチドの説明を援用できる。本発明の結合核酸分子の製造方法において、前記候補ポリヌクレオチドは、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含む。このため、本発明の結合核酸分子の製造方法によれば、例えば、ターゲットに対し優れた結合能を示す結合核酸分子を製造できる。
本発明の結合核酸分子の製造方法は、前述のように、候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることを特徴とする。本発明の結合核酸分子の製造方法は、例えば、前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の結合核酸の製造方法は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩、合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、およびポリヌクレオチドの説明を援用できる。本発明の結合核酸分子の製造方法において、前記候補ポリヌクレオチドは、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含む。このため、本発明の結合核酸分子の製造方法によれば、例えば、ターゲットに対し優れた結合能を示す結合核酸分子を製造できる。
本発明の結合核酸分子において、前記接触工程および前記選抜工程は、例えば、ＳＥＬＥＸ法に基づき実施できる。
前記接触工程における候補ポリヌクレオチドの数は、特に制限されず、例えば、４２０〜４１２０種類（約１０１２〜１０７２）種類、４３０〜４６０（約１０１８〜１０３６）種類である。
前記接触工程では、候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる。そして、この接触により、前記候補ポリヌクレオチドと前記ターゲットとを反応させ、前記候補ポリヌクレオチドと前記ターゲットとの複合体を形成する。前記接触工程において使用する前記ターゲットは、例えば、前記ターゲットそのものであってもよいし、前記ターゲットの分解物であってもよい。前記候補ポリヌクレオチドと前記ターゲットとの結合条件は、特に制限されず、例えば、前記両者を溶媒中で一定時間インキュベートすることで実施できる。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、前記両者の結合等が保持されるものが好ましく、具体例として、各種緩衝液があげられる。
つぎに、前記選抜工程では、前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する。具体的には、前記ターゲットと複合体を形成した候補ポリヌクレオチドを、前記結合核酸分子として回収する。なお、前記接触工程後の前記候補ポリヌクレオチドと前記ターゲットとの混合物には、前記複合体の他に、例えば、前記複合体形成に関与しない候補ポリヌクレオチドが含まれる。このため、例えば、前記混合物から、前記複合体と、前記未反応の候補ポリヌクレオチドとを、分離することが好ましい。前記分離方法は、特に制限されず、例えば、前記ターゲットと前記候補ポリヌクレオチドとの吸着性の違いや、前記複合体と前記候補ポリヌクレオチドとの分子量の違いを利用する方法等があげられる。
この他にも、例えば、前記複合体の形成時において、担体に固定化したターゲットを使用する方法もあげられる。すなわち、前記ターゲットを予め担体に固定化し、前記担体と前記候補ポリヌクレオチドとを接触させ、前記固定化ターゲットと候補ポリヌクレオチドとの複合体を形成させる。そして、前記固定化ターゲットに結合していない未反応の候補ポリヌクレオチドを除去した後、前記担体から、前記ターゲットと前記候補ポリヌクレオチドとの複合体を解離させればよい。前記ターゲットの担体への固定化方法は、特に制限されず、公知の方法により実施できる。前記担体は、特に制限されず、公知の担体が使用できる。
このようにして、前記ターゲットに結合する結合核酸分子を製造できる。
本発明の製造方法は、例えば、前記選抜された結合核酸分子の塩基配列を決定する塩基配列決定工程を含んでもよい。前記塩基配列の決定方法は、特に制限されず、公知の塩基配列の決定方法により実施できる。
本発明の結合核酸分子の製造方法は、例えば、前記接触工程および前記選抜工程の１セットを１サイクルとして、合計２サイクル以上実施してもよく、具体例として、３〜１５サイクルがあげられる。
＜α−アミラーゼ結合核酸分子＞
本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子（以下、「α−アミラーゼ核酸分子」ともいう）は、下記（ａ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａ）下記（ａ１）のポリヌクレオチド
（ａ１）配列番号１および１１〜１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子（以下、「α−アミラーゼ核酸分子」ともいう）は、下記（ａ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａ）下記（ａ１）のポリヌクレオチド
（ａ１）配列番号１および１１〜１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、前述のようにα−アミラーゼに結合可能である。前記α−アミラーゼは、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトα−アミラーゼのアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ０４７４５に登録されている。
本発明において、「α−アミラーゼに結合する」とは、例えば、α−アミラーゼに対する結合能を有している、または、α−アミラーゼに対する結合活性を有しているともいう。本発明のα−アミラーゼ核酸分子と前記α−アミラーゼとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、α−アミラーゼに結合することから、例えば、α−アミラーゼの検出に使用できる。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、前述のように、下記（ａ）のポリヌクレオチドを含む。
（ａ）下記（ａ１）のポリヌクレオチド
（ａ１）配列番号１および１１〜１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ）下記（ａ１）のポリヌクレオチド
（ａ１）配列番号１および１１〜１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
α−アミラーゼ結合核酸分子１（配列番号１）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子２（配列番号１１）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTA-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子３（配列番号１２）
5’-GCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTA-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子４（配列番号１３）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCAGACTATTATTTCAAGTACGTGGGGGTCTTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子５（配列番号１４）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子６（配列番号１５）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACT-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子７（配列番号１６）
5’-GCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACT-3’
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子２（配列番号１１）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTA-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子３（配列番号１２）
5’-GCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTA-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子４（配列番号１３）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCAGACTATTATTTCAAGTACGTGGGGGTCTTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子５（配列番号１４）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子６（配列番号１５）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACT-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子７（配列番号１６）
5’-GCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACT-3’
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ａ２）、（ａ３）、または（ａ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
（ａ４）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
（ａ４）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
前記（ａ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ａ２）のポリヌクレオチドが、α−アミラーゼに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、例えば、１〜１５個、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個、１個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
前記（ａ３）において、「同一性」は、例えば、前記（ａ３）のポリヌクレオチドが、α−アミラーゼに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
前記（ａ４）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ１）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドであり、α−アミラーゼに結合する範囲であればよい。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Sambrook）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載されている方法を採用することもできる。
前記（ａ４）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Sambrook）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載の条件を採用することもできる。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子において、前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、例えば、以下、α−アミラーゼアプタマーともいう。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、前記いずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、後述するように、前記いずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または後述する付加配列等を有してもよい。ここで、前記リンカーとは、例えば、ポリヌクレオチド間の配列であり、前記付加配列とは、例えば、末端に付加された配列である。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子が、例えば、複数の前記ポリヌクレオチドを含む場合、前記複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上、２〜２０、２〜１０、２または３である。
前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜２０塩基長、３〜１２塩基長、５〜９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）のポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明のα−アミラーゼ核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、１〜３０個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１または２個である。
前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド残基における塩基として、天然塩基を含んでもよいし、修飾塩基を含んでもよい。前記天然塩基（非人工塩基）は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）等があげられ、好ましくは、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）である。
前記ポリヌクレオチドが前記修飾塩基を有する場合、その部位および個数は、特に制限されない。前記（ａ）のポリヌクレオチドが前記修飾塩基を有する場合、前記配列番号１および１１〜１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいては、例えば、下線部のアデニンの一部または全部が、修飾塩基である。前記下線部のアデニンが修飾塩基の場合、前記修飾塩基は、プリン塩基が修飾基で修飾された修飾プリン塩基であることが好ましい
前記修飾塩基は、例えば、塩基が修飾基で修飾されたものである。前記修飾基により修飾される塩基（被修飾塩基）は、例えば、前記天然塩基である。前記天然塩基は、例えば、プリン塩基、ピリミジン塩基等があげられる。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、修飾ウラシルがあげられる。
前記修飾塩基は、例えば、前記被修飾塩基が、直接、前記修飾基で修飾されてもよいし、前記被修飾塩基が、間接的に、前記修飾基で修飾されてもよい。後者の場合、例えば、前記被修飾塩基が、リンカーを介して、前記修飾基で修飾される形態があげられる。前記リンカーは、特に制限されない。
前記被修飾塩基の前記修飾基による修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられ、７位が好ましい。前記プリン塩基の修飾部位が７位の場合、７位の窒素原子は、炭素原子に置換されていることが好ましい。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられ、５位が好ましい。前記ピリミジン塩基の５位が修飾される場合、チミンは、５位の炭素にメチル基を有することから、例えば、５位の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよいし、５位の炭素に結合したメチル基の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよい。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「−ＣＨ３」または「−Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
前記修飾塩基が修飾プリン塩基である場合、前記修飾基は、アデニン残基が好ましい。すなわち、前記修飾プリン塩基は、例えば、塩基が前記アデニン残基で修飾されている。前記アデニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位（前記アデニン残基における被修飾塩基との結合部位）は、特に制限されず、前記アデニン残基における６位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記アデニン残基で修飾される前記被修飾塩基は、特に制限されないが、例えば、プリン塩基が好ましく、プリン塩基の７位の原子が、前記アデニン残基で修飾されていることが好ましい。前記修飾塩基が修飾チミンである場合、前記修飾基は、アデニン残基またはグアニン残基が好ましい。すなわち、前記修飾塩基は、例えば、塩基が前記アデニン残基またはグアニン残基で修飾されている。前記アデニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位は、特に制限されず、例えば、前記アデニン残基における６位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記グアニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位は、特に制限されず、例えば、前記グアニン残基における２位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記アデニン残基または前記グアニン残基で修飾される前記被修飾塩基は、特に制限されないが、例えば、チミンが好ましく、チミンの５位の炭素に結合したメチル基の炭素が、前記アデニン残基または前記グアニン残基で修飾されていることが好ましい。
前記修飾基が前記アデニン残基または前記グアニン残基の場合、例えば、以下に示すように、前記リンカーを介して、前記修飾基により前記被修飾塩基が修飾されていることが好ましい。
［ヌクレオチド残基］−［リンカー］−［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］−［リンカー］−［グアニン残基］
［ヌクレオチド残基］−［リンカー］−［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］−［リンカー］−［グアニン残基］
前記リンカーは、特に制限されず、例えば、以下のように、前記ヌクレオチド残基と前記アデニン残基または前記グアニン残基との間の式で表されるが、これには限定されない。下記式において、(CH2)nにおけるｎの数値は、例えば、１〜１０、２〜１０、２である。
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-(CH2)n- ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-(CH2)n- ［グアニン残基］
［ヌクレオチド残基］ -C=C-C(=O)-NH-(CH2)n- ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-CH2-CH2- ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-CH2-CH2- ［グアニン残基］
［ヌクレオチド残基］ -C=C-C(=O)-NH-CH2-CH2- ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-(CH2)n- ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-(CH2)n- ［グアニン残基］
［ヌクレオチド残基］ -C=C-C(=O)-NH-(CH2)n- ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-CH2-CH2- ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-CH2-CH2- ［グアニン残基］
［ヌクレオチド残基］ -C=C-C(=O)-NH-CH2-CH2- ［アデニン残基］
前記式において、前記リンカーの一端［＝Ｃ］および［−Ｃ］は、例えば、ヌクレオチド残基における被修飾塩基の炭素と、それぞれ、二重結合または単結合を形成し、前記リンカーの他端［ＣＨ２−］は、例えば、グアニン残基またはアデニン残基のアミン（−ＮＨ）と結合している。
前記ポリヌクレオチドにおける前記アデニン残基で修飾されたアデノシンヌクレオチド残基の具体例として、例えば、下記化学式（１０）に示す残基（以下、「ＭＫ４のヌクレオチド残基」ともいう）があげられる。なお、本発明は、これには限定されない。
前記配列番号１および１１〜１６の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、下線部のアデニンが、前記ＭＫ４のヌクレオチド残基であることがより好ましい。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子が、例えば、前記ＭＫ４のヌクレオチド残基を有する場合、前記ポリヌクレオチドの合成には、例えば、前記化学式（４）に示すヌクレオチド三リン酸（以下、「ＭＫ４モノマー」ともいう）を、モノマー分子として使用することができる。前記ポリヌクレオチドの合成において、例えば、前記モノマー分子は、ホスホジエステル結合により、他のヌクレオチド三リン酸と結合する。前記ＭＫ４モノマーの製造方法については、後述する。
前記修飾基としては、この他に、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、ベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、トリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’−デアザアデニン等があげられ、前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’−デアザグアニン等があげられ、前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’−メチルシトシン（５−Ｍｅ−ｄＣ）等があげられ、前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルチミン、５’−トリプタミノカルボニルチミン、５’−イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられ、前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’−イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。例示した前記修飾ウラシルは、チミンの修飾塩基ということもできる。
前記ポリヌクレオチドは、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１〜９１個または１〜７８個、前述の範囲と同様である。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜５０個、１〜３０個、１〜１０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜５０塩基長、１〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明のα−アミラーゼ核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。
本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、前述のように、前記α−アミラーゼに結合性を示す。このため、本発明のα−アミラーゼ核酸分子の用途は、前記α−アミラーゼへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明のα−アミラーゼ核酸分子は、例えば、前記α−アミラーゼに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
＜α−アミラーゼ分析用センサ＞
本発明のα−アミラーゼ分析用センサは、α−アミラーゼの分析用センサであって、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のα−アミラーゼ分析用センサは、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のα−アミラーゼ分析用センサを使用すれば、例えば、前記α−アミラーゼ核酸分子と前記α−アミラーゼとを結合させることで、前記α−アミラーゼを検出できる。本発明のα−アミラーゼ分析用センサは、例えば、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子の説明を援用できる。
本発明のα−アミラーゼ分析用センサは、α−アミラーゼの分析用センサであって、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のα−アミラーゼ分析用センサは、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のα−アミラーゼ分析用センサを使用すれば、例えば、前記α−アミラーゼ核酸分子と前記α−アミラーゼとを結合させることで、前記α−アミラーゼを検出できる。本発明のα−アミラーゼ分析用センサは、例えば、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子の説明を援用できる。
本発明のα−アミラーゼ分析用センサは、例えば、さらに担体を有し、前記担体に前記核酸分子が配置されている。前記核酸分子は、前記担体に固定化されていることが好ましい。前記担体への前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。本発明のα−アミラーゼ分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のα−アミラーゼ核酸分子および後述の本発明のα−アミラーゼの分析方法の説明を援用できる。
＜α−アミラーゼの分析方法＞
本発明のα−アミラーゼの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα−アミラーゼを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα−アミラーゼを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のα−アミラーゼ核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のα−アミラーゼの分析方法は、前記本発明のα−アミラーゼ核酸分子として、前記本発明のα−アミラーゼ分析用センサを使用してもよい。本発明のα−アミラーゼの分析方法の説明は、例えば、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子、α−アミラーゼの分析用センサの説明を援用できる。
本発明のα−アミラーゼの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα−アミラーゼを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα−アミラーゼを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のα−アミラーゼ核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のα−アミラーゼの分析方法は、前記本発明のα−アミラーゼ核酸分子として、前記本発明のα−アミラーゼ分析用センサを使用してもよい。本発明のα−アミラーゼの分析方法の説明は、例えば、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子、α−アミラーゼの分析用センサの説明を援用できる。
本発明によれば、前記本発明のα−アミラーゼ核酸分子が、α−アミラーゼに特異的に結合することから、例えば、α−アミラーゼと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のα−アミラーゼを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のα−アミラーゼの有無またはα−アミラーゼの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、唾液、尿、血漿および血清等があげられる。
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記α−アミラーゼと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のα−アミラーゼの有無または量を分析する工程を含む。
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃、１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分、３０〜６０分である。
前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のα−アミラーゼの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のα−アミラーゼの量を分析（定量）できる。
そして、前記α−アミラーゼと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にα−アミラーゼは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にα−アミラーゼが存在すると判断できる。
前記α−アミラーゼと前記核酸分子との結合の分析方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。また、前記結合の検出は、例えば、前記α−アミラーゼと前記核酸分子との複合体の検出でもよい。
＜α−アミラーゼ検出キット＞
本発明のα−アミラーゼ検出キットは、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記α−アミラーゼの検出等を行うことができる。本発明のα−アミラーゼ検出キットは、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子、α−アミラーゼ分析用センサ、α−アミラーゼの分析方法の説明を援用できる。
本発明のα−アミラーゼ検出キットは、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記α−アミラーゼの検出等を行うことができる。本発明のα−アミラーゼ検出キットは、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子、α−アミラーゼ分析用センサ、α−アミラーゼの分析方法の説明を援用できる。
本発明のα−アミラーゼ検出キットは、例えば、前記本発明のα−アミラーゼ核酸分子として、前記本発明のα−アミラーゼ分析用センサを含んでもよい。また、前記本発明のα−アミラーゼ検出キットは、例えば、前記本発明のα−アミラーゼ核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、緩衝液、使用説明書等があげられる。
＜ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子＞
本発明のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ結合核酸分子（以下、「ＢＤＮ４Ａ核酸分子」ともいう）は、下記（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｂ）下記（ｂ１）のポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号４〜６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ結合核酸分子（以下、「ＢＤＮ４Ａ核酸分子」ともいう）は、下記（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｂ）下記（ｂ１）のポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号４〜６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子は、例えば、特に言及しない限り、「α−アミラーゼ」を「ＢＤＮ４Ａ」に、「（ａ）」を「（ｂ）」に、「（ａ１）」を「（ｂ１）」に、「（ａ２）」を「（ｂ２）」に、「（ａ３）」を「（ｂ３）」に、「（ａ４）」を「（ｂ４）」に、「配列番号１および１１〜１６」を「配列番号４〜６」に読み替えて、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子、α−アミラーゼ分析用センサ、α−アミラーゼの分析方法およびα−アミラーゼ検出キットの説明を援用できる。また、この点は、後述するＢＤＮ４Ａ分析用センサ、ＢＤＮ４Ａの分析方法およびＢＤＮ４Ａ検出キットの説明においても同様である。
本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子は、前述のようにＢＤＮ４Ａに結合可能である。前記ＢＤＮ４Ａは、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトＢＤＮ４Ａのアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｏ１５２６３に登録されている。
本発明において、「ＢＤＮ４Ａに結合する」とは、例えば、ＢＤＮ４Ａに対する結合能を有している、または、ＢＤＮ４Ａに対する結合活性を有しているともいう。本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子と前記ＢＤＮ４Ａとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子は、ＢＤＮ４Ａに結合することから、例えば、ＢＤＮ４Ａの検出に使用できる。
本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子は、前述のように、下記（ｂ）のポリヌクレオチドを含む。
（ｂ）下記（ｂ１）のポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号４〜６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）下記（ｂ１）のポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号４〜６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１（配列番号４）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTATTTTTACGGGGTATAGTTCTCTGAGGAGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子２（配列番号５）
5’-CGAGCCGCACATTTCTATTTTTACGGGGTATAGTTCTCTGAGGAGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子３（配列番号６）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCACCGTGATAGTTCTCTGAGGAGGACTTCTAGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTATTTTTACGGGGTATAGTTCTCTGAGGAGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子２（配列番号５）
5’-CGAGCCGCACATTTCTATTTTTACGGGGTATAGTTCTCTGAGGAGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子３（配列番号６）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCACCGTGATAGTTCTCTGAGGAGGACTTCTAGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
前記（ｂ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｂ２）、（ｂ３）、または（ｂ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ｂ２）前記（ｂ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＢＤＮ４Ａに結合するポリヌクレオチド
（ｂ３）前記（ｂ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＢＤＮ４Ａに結合するポリヌクレオチド
（ｂ４）前記（ｂ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＢＤＮ４Ａに結合するポリヌクレオチド
（ｂ２）前記（ｂ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＢＤＮ４Ａに結合するポリヌクレオチド
（ｂ３）前記（ｂ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＢＤＮ４Ａに結合するポリヌクレオチド
（ｂ４）前記（ｂ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＢＤＮ４Ａに結合するポリヌクレオチド
＜ＢＤＮ４Ａ分析用センサ＞
本発明のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ分析用センサは、β−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａの分析用センサであって、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、制限されない。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサを使用すれば、例えば、前記ＢＤＮ４Ａ核酸分子と前記ＢＤＮ４Ａとを結合させることで、前記ＢＤＮ４Ａを検出できる。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサは、例えば、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子および後述の本発明のＢＤＮ４Ａの分析方法の説明を援用できる。
本発明のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ分析用センサは、β−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａの分析用センサであって、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、制限されない。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサを使用すれば、例えば、前記ＢＤＮ４Ａ核酸分子と前記ＢＤＮ４Ａとを結合させることで、前記ＢＤＮ４Ａを検出できる。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサは、例えば、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子および後述の本発明のＢＤＮ４Ａの分析方法の説明を援用できる。
＜ＢＤＮ４Ａの分析方法＞
本発明のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＢＤＮ４Ａと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＢＤＮ４Ａを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のＢＤＮ４Ａの分析方法は、前記本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子として、前記本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサを使用してもよい。本発明のＢＤＮ４Ａの分析方法の説明は、例えば、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子、ＢＤＮ４Ａの分析用センサの説明を援用できる。
本発明のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＢＤＮ４Ａと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＢＤＮ４Ａを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のＢＤＮ４Ａの分析方法は、前記本発明のＢＤＮ４Ａ核酸分子として、前記本発明のＢＤＮ４Ａ分析用センサを使用してもよい。本発明のＢＤＮ４Ａの分析方法の説明は、例えば、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子、ＢＤＮ４Ａの分析用センサの説明を援用できる。
＜ＢＤＮ４Ａ検出キット＞
本発明のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ検出キットは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ＢＤＮ４Ａの検出等を行うことができる。本発明のＢＤＮ４Ａ検出キットは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子、ＢＤＮ４Ａ分析用センサ、ＢＤＮ４Ａの分析方法の説明を援用できる。
本発明のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ検出キットは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ＢＤＮ４Ａの検出等を行うことができる。本発明のＢＤＮ４Ａ検出キットは、前記本発明のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子、ＢＤＮ４Ａ分析用センサ、ＢＤＮ４Ａの分析方法の説明を援用できる。
＜リゾチーム結合核酸分子＞
本発明のリゾチーム結合核酸分子（以下、「リゾチーム核酸分子」ともいう）は、下記（ｌ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｌ）下記（ｌ１）のポリヌクレオチド
（ｌ１）配列番号７〜９のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明のリゾチーム結合核酸分子（以下、「リゾチーム核酸分子」ともいう）は、下記（ｌ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｌ）下記（ｌ１）のポリヌクレオチド
（ｌ１）配列番号７〜９のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明のリゾチーム核酸分子は、例えば、特に言及しない限り、「α−アミラーゼ」を「リゾチーム」に、「（ａ）」を「（ｌ）」に、「（ａ１）」を「（ｌ１）」に、「（ａ２）」を「（ｌ２）」に、「（ａ３）」を「（ｌ３）」に、「（ａ４）」を「（ｌ４）」に、「配列番号１および１１〜１６」を「配列番号７〜９」に読み替えて、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子、α−アミラーゼ分析用センサ、α−アミラーゼの分析方法およびα−アミラーゼ検出キットの説明を援用できる。また、この点は、後述するリゾチーム分析用センサ、リゾチームの分析方法およびリゾチーム検出キットの説明においても同様である。
本発明のリゾチーム核酸分子は、前述のようにリゾチームに結合可能である。前記リゾチームは、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトリゾチームのアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ６１６２６に登録されている。
本発明において、「リゾチームに結合する」とは、例えば、リゾチームに対する結合能を有している、または、リゾチームに対する結合活性を有しているともいう。本発明のリゾチーム核酸分子と前記リゾチームとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のリゾチーム核酸分子は、リゾチームに結合することから、例えば、リゾチームの検出に使用できる。
本発明のリゾチーム核酸分子は、前述のように、下記（ｌ）のポリヌクレオチドを含む。
（ｌ）下記（ｌ１）のポリヌクレオチド
（ｌ１）配列番号７〜９のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｌ）下記（ｌ１）のポリヌクレオチド
（ｌ１）配列番号７〜９のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
リゾチーム結合核酸分子１（配列番号７）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTAACGGGAACTTCAACCCATACAGTCTTTTGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
リゾチーム結合核酸分子２（配列番号８）
5’-CGAGCCGCACATTTCTAACGGGAACTTCAACCCATACAGTCTTTTGAGTTCCC-3’
リゾチーム結合核酸分子３（配列番号９）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTTTACTCCGGAACCCATACAGTCTTTTCCGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTAACGGGAACTTCAACCCATACAGTCTTTTGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
リゾチーム結合核酸分子２（配列番号８）
5’-CGAGCCGCACATTTCTAACGGGAACTTCAACCCATACAGTCTTTTGAGTTCCC-3’
リゾチーム結合核酸分子３（配列番号９）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTTTACTCCGGAACCCATACAGTCTTTTCCGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
前記（ｌ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｌ２）、（ｌ３）、または（ｌ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ｌ２）前記（ｌ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、リゾチームに結合するポリヌクレオチド
（ｌ３）前記（ｌ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リゾチームに結合するポリヌクレオチド
（ｌ４）前記（ｌ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、リゾチームに結合するポリヌクレオチド
（ｌ２）前記（ｌ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、リゾチームに結合するポリヌクレオチド
（ｌ３）前記（ｌ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リゾチームに結合するポリヌクレオチド
（ｌ４）前記（ｌ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、リゾチームに結合するポリヌクレオチド
＜リゾチーム分析用センサ＞
本発明のリゾチーム分析用センサは、リゾチームの分析用センサであって、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のリゾチーム分析用センサは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のリゾチーム分析用センサを使用すれば、例えば、前記リゾチーム核酸分子と前記リゾチームとを結合させることで、前記リゾチームを検出できる。本発明のリゾチーム分析用センサは、例えば、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のリゾチーム分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のリゾチーム核酸分子および後述の本発明のリゾチームの分析方法の説明を援用できる。
本発明のリゾチーム分析用センサは、リゾチームの分析用センサであって、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のリゾチーム分析用センサは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のリゾチーム分析用センサを使用すれば、例えば、前記リゾチーム核酸分子と前記リゾチームとを結合させることで、前記リゾチームを検出できる。本発明のリゾチーム分析用センサは、例えば、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のリゾチーム分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のリゾチーム核酸分子および後述の本発明のリゾチームの分析方法の説明を援用できる。
＜リゾチームの分析方法＞
本発明のリゾチームの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のリゾチームを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のリゾチームと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のリゾチームを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のリゾチーム核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のリゾチームの分析方法は、前記本発明のリゾチーム核酸分子として、前記本発明のリゾチーム分析用センサを使用してもよい。本発明のリゾチームの分析方法の説明は、例えば、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子、リゾチームの分析用センサの説明を援用できる。
本発明のリゾチームの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のリゾチームを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のリゾチームと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のリゾチームを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のリゾチーム核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のリゾチームの分析方法は、前記本発明のリゾチーム核酸分子として、前記本発明のリゾチーム分析用センサを使用してもよい。本発明のリゾチームの分析方法の説明は、例えば、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子、リゾチームの分析用センサの説明を援用できる。
＜リゾチーム検出キット＞
本発明のリゾチーム検出キットは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記リゾチームの検出等を行うことができる。本発明のリゾチーム検出キットは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子、リゾチーム分析用センサ、リゾチームの分析方法の説明を援用できる。
本発明のリゾチーム検出キットは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記リゾチームの検出等を行うことができる。本発明のリゾチーム検出キットは、前記本発明のリゾチーム結合核酸分子、リゾチーム分析用センサ、リゾチームの分析方法の説明を援用できる。
＜ＬＤＨ５結合核酸分子＞
本発明の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５結合核酸分子（以下、「ＬＤＨ５核酸分子」ともいう）は、下記（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｄ）下記（ｄ１）のポリヌクレオチド
（ｄ１）配列番号１７〜２０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５結合核酸分子（以下、「ＬＤＨ５核酸分子」ともいう）は、下記（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｄ）下記（ｄ１）のポリヌクレオチド
（ｄ１）配列番号１７〜２０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明のＬＤＨ５核酸分子は、例えば、特に言及しない限り、「α−アミラーゼ」を「ＬＤＨ５」に、「（ａ）」を「（ｄ）」に、「（ａ１）」を「（ｄ１）」に、「（ａ２）」を「（ｄ２）」に、「（ａ３）」を「（ｄ３）」に、「（ａ４）」を「（ｄ４）」に、「配列番号１および１１〜１６」を「配列番号１７〜２０」に読み替えて、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子、α−アミラーゼ分析用センサ、α−アミラーゼの分析方法およびα−アミラーゼ検出キットの説明を援用できる。また、この点は、後述するＬＤＨ５分析用センサ、ＬＤＨ５の分析方法およびＬＤＨ５検出キットの説明においても同様である。
本発明のＬＤＨ５核酸分子は、前述のようにＬＤＨ５に結合可能である。前記ＬＤＨ５は、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトＬＤＨ５のアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ００３３８に登録されている。
本発明において、「ＬＤＨ５に結合する」とは、例えば、ＬＤＨ５に対する結合能を有している、または、ＬＤＨ５に対する結合活性を有しているともいう。本発明のＬＤＨ５核酸分子と前記ＬＤＨ５との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のＬＤＨ５核酸分子は、ＬＤＨ５に結合することから、例えば、ＬＤＨ５の検出に使用できる。
本発明のＬＤＨ５核酸分子は、前述のように、下記（ｄ）のポリヌクレオチドを含む。
（ｄ）下記（ｄ１）のポリヌクレオチド
（ｄ１）配列番号１７〜２０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ）下記（ｄ１）のポリヌクレオチド
（ｄ１）配列番号１７〜２０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
ＬＤＨ５結合核酸分子１（配列番号１７）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子２（配列番号１８）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAGAGGGAGATCATCTCTCTGGCGGACACAACCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子３（配列番号１９）
5’-ACCTCGCCGTTTATGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子４（配列番号２０）
5’-TGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGC-3’
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子２（配列番号１８）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAGAGGGAGATCATCTCTCTGGCGGACACAACCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子３（配列番号１９）
5’-ACCTCGCCGTTTATGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子４（配列番号２０）
5’-TGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGC-3’
前記（ｄ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｄ２）、（ｄ３）、または（ｄ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ｄ２）前記（ｄ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＬＤＨ５に結合するポリヌクレオチド
（ｄ３）前記（ｄ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＬＤＨ５に結合するポリヌクレオチド
（ｄ４）前記（ｄ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＬＤＨ５に結合するポリヌクレオチド
（ｄ２）前記（ｄ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＬＤＨ５に結合するポリヌクレオチド
（ｄ３）前記（ｄ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＬＤＨ５に結合するポリヌクレオチド
（ｄ４）前記（ｄ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＬＤＨ５に結合するポリヌクレオチド
＜ＬＤＨ５分析用センサ＞
本発明のＬＤＨ５分析用センサは、ＬＤＨ５の分析用センサであって、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のＬＤＨ５分析用センサは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のＬＤＨ５分析用センサを使用すれば、例えば、前記ＬＤＨ５核酸分子と前記ＬＤＨ５とを結合させることで、前記ＬＤＨ５を検出できる。本発明のＬＤＨ５分析用センサは、例えば、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のＬＤＨ５分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のＬＤＨ５核酸分子および後述の本発明のＬＤＨ５の分析方法の説明を援用できる。
本発明のＬＤＨ５分析用センサは、ＬＤＨ５の分析用センサであって、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のＬＤＨ５分析用センサは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のＬＤＨ５分析用センサを使用すれば、例えば、前記ＬＤＨ５核酸分子と前記ＬＤＨ５とを結合させることで、前記ＬＤＨ５を検出できる。本発明のＬＤＨ５分析用センサは、例えば、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のＬＤＨ５分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のＬＤＨ５核酸分子および後述の本発明のＬＤＨ５の分析方法の説明を援用できる。
＜ＬＤＨ５の分析方法＞
本発明のＬＤＨ５の分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＬＤＨ５を検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＬＤＨ５と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＬＤＨ５を検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のＬＤＨ５核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のＬＤＨ５の分析方法は、前記本発明のＬＤＨ５核酸分子として、前記本発明のＬＤＨ５分析用センサを使用してもよい。本発明のＬＤＨ５の分析方法の説明は、例えば、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子、ＬＤＨ５の分析用センサの説明を援用できる。
本発明のＬＤＨ５の分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＬＤＨ５を検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＬＤＨ５と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＬＤＨ５を検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のＬＤＨ５核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のＬＤＨ５の分析方法は、前記本発明のＬＤＨ５核酸分子として、前記本発明のＬＤＨ５分析用センサを使用してもよい。本発明のＬＤＨ５の分析方法の説明は、例えば、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子、ＬＤＨ５の分析用センサの説明を援用できる。
＜ＬＤＨ５検出キット＞
本発明のＬＤＨ５検出キットは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ＬＤＨ５の検出等を行うことができる。本発明のＬＤＨ５検出キットは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子、ＬＤＨ５分析用センサ、ＬＤＨ５の分析方法の説明を援用できる。
本発明のＬＤＨ５検出キットは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ＬＤＨ５の検出等を行うことができる。本発明のＬＤＨ５検出キットは、前記本発明のＬＤＨ５結合核酸分子、ＬＤＨ５分析用センサ、ＬＤＨ５の分析方法の説明を援用できる。
＜ＩＬ−６結合核酸分子＞
本発明のインターロイキン（ＩＬ）−６結合核酸分子（以下、「ＩＬ−６核酸分子」ともいう）は、下記（ｉ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｉ）下記（ｉ１）のポリヌクレオチド
（ｉ１）配列番号２１〜２２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明のインターロイキン（ＩＬ）−６結合核酸分子（以下、「ＩＬ−６核酸分子」ともいう）は、下記（ｉ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｉ）下記（ｉ１）のポリヌクレオチド
（ｉ１）配列番号２１〜２２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明のＩＬ−６核酸分子は、例えば、特に言及しない限り、「α−アミラーゼ」を「ＩＬ−６」に、「（ａ）」を「（ｉ）」に、「（ａ１）」を「（ｉ１）」に、「（ａ２）」を「（ｉ２）」に、「（ａ３）」を「（ｉ３）」に、「（ａ４）」を「（ｉ４）」に、「配列番号１および１１〜１６」を「配列番号２１〜２２」に読み替えて、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子、α−アミラーゼ分析用センサ、α−アミラーゼの分析方法およびα−アミラーゼ検出キットの説明を援用できる。また、この点は、後述するＩＬ−６分析用センサ、ＩＬ−６の分析方法およびＩＬ−６検出キットの説明においても同様である。
本発明のＩＬ−６核酸分子は、前述のようにＩＬ−６に結合可能である。前記ＩＬ−６は、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトＩＬ−６のアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ０５２３１に登録されている。
本発明において、「ＩＬ−６に結合する」とは、例えば、ＩＬ−６に対する結合能を有している、または、ＩＬ−６に対する結合活性を有しているともいう。本発明のＩＬ−６核酸分子と前記ＩＬ−６との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名、BioRad社）が使用できる。本発明のＩＬ−６核酸分子は、ＩＬ−６に結合することから、例えば、ＩＬ−６の検出に使用できる。
本発明のＩＬ−６核酸分子は、前述のように、下記（ｉ）のポリヌクレオチドを含む。
（ｉ）下記（ｉ１）のポリヌクレオチド
（ｉ１）配列番号２１〜２２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｉ）下記（ｉ１）のポリヌクレオチド
（ｉ１）配列番号２１〜２２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
ＩＬ−６結合核酸分子１（配列番号２１）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAGTTCAATGGTATTGTATCGACTCTTCTCGCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＩＬ−６結合核酸分子２（配列番号２２）
5’-ACCTCGCCGTTTATGAGTTCAATGGTATTGTATCGACTCTTCTC-3’
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAGTTCAATGGTATTGTATCGACTCTTCTCGCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＩＬ−６結合核酸分子２（配列番号２２）
5’-ACCTCGCCGTTTATGAGTTCAATGGTATTGTATCGACTCTTCTC-3’
前記（ｉ）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｉ２）、（ｉ３）、または（ｉ４）のポリヌクレオチドの意味も含む。
（ｉ２）前記（ｉ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＩＬ−６に結合するポリヌクレオチド
（ｉ３）前記（ｉ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＩＬ−６に結合するポリヌクレオチド
（ｉ４）前記（ｉ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＩＬ−６に結合するポリヌクレオチド
（ｉ２）前記（ｉ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＩＬ−６に結合するポリヌクレオチド
（ｉ３）前記（ｉ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＩＬ−６に結合するポリヌクレオチド
（ｉ４）前記（ｉ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＩＬ−６に結合するポリヌクレオチド
＜ＩＬ−６分析用センサ＞
本発明のＩＬ−６分析用センサは、ＩＬ−６の分析用センサであって、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のＩＬ−６分析用センサは、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のＩＬ−６分析用センサを使用すれば、例えば、前記ＩＬ−６核酸分子と前記ＩＬ−６とを結合させることで、前記ＩＬ−６を検出できる。本発明のＩＬ−６分析用センサは、例えば、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のＩＬ−６分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のＩＬ−６核酸分子および後述の本発明のＩＬ−６の分析方法の説明を援用できる。
本発明のＩＬ−６分析用センサは、ＩＬ−６の分析用センサであって、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のＩＬ−６分析用センサは、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明のＩＬ−６分析用センサを使用すれば、例えば、前記ＩＬ−６核酸分子と前記ＩＬ−６とを結合させることで、前記ＩＬ−６を検出できる。本発明のＩＬ−６分析用センサは、例えば、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子の説明を援用できる。本発明のＩＬ−６分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明のＩＬ−６核酸分子および後述の本発明のＩＬ−６の分析方法の説明を援用できる。
＜ＩＬ−６の分析方法＞
本発明のＩＬ−６の分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＩＬ−６を検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＩＬ−６と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＩＬ−６を検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のＩＬ−６核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のＩＬ−６の分析方法は、前記本発明のＩＬ−６核酸分子として、前記本発明のＩＬ−６分析用センサを使用してもよい。本発明のＩＬ−６の分析方法の説明は、例えば、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子、ＩＬ−６の分析用センサの説明を援用できる。
本発明のＩＬ−６の分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＩＬ−６を検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＩＬ−６と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＩＬ−６を検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のＩＬ−６核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明のＩＬ−６の分析方法は、前記本発明のＩＬ−６核酸分子として、前記本発明のＩＬ−６分析用センサを使用してもよい。本発明のＩＬ−６の分析方法の説明は、例えば、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子、ＩＬ−６の分析用センサの説明を援用できる。
＜ＩＬ−６検出キット＞
本発明のＩＬ−６検出キットは、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ＩＬ−６の検出等を行うことができる。本発明のＩＬ−６検出キットは、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子、ＩＬ−６分析用センサ、ＩＬ−６の分析方法の説明を援用できる。
本発明のＩＬ−６検出キットは、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成および条件等は、特に制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ＩＬ−６の検出等を行うことができる。本発明のＩＬ−６検出キットは、前記本発明のＩＬ−６結合核酸分子、ＩＬ−６分析用センサ、ＩＬ−６の分析方法の説明を援用できる。
以下に実施例を示して、本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
［実施例１］
以下に示す合成例により、ＭＫ１〜４を調製した。
以下に示す合成例により、ＭＫ１〜４を調製した。
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は、質量分析装置（API2000、販売元：Applied Biosystems社製）を用い、ポジティブイオンモードまたはネガティイオンモードで実施した。1H NMRスペクトルは、核磁気共鳴装置（JNM-ECS400、JEOL社製）を用い、取得した。化学シフトは、内部標準であるテトラメチルシラン（Ｍｅ４Ｓｉ）に対する相対値δ（ｐｐｍ）として表される。イオン交換クロマトグラフは、クロマトグラフシステム（ECONO system、Bio-Rad社製）を用いて実施した。前記イオン交換クロマトグラフでは、diethylaminoethyl（ＤＥＡＥ）A-25-Sephadex（Amershambiosciences社製）を充填したガラスカラム（φ２５×５００ｍｍ）を使用した。
（合成例１）ＭＫ１の合成
ＡＺ６（２９０ｍｇ、９．０６×１０−４ｍｏｌ）を真空乾燥させ、ｄｒｙ−ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、３ｍＬ）に溶かした。これにＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール・一水和物、１７６ｍｇ、１．１５×１０−５ｍｏｌ、１．２ｅｑ．）、ＰｙＢＯＰ（登録商標）（ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム、５７９ｍｇ、１．１５×１０−５ｍｏｌ、１．２ｅｑ．）、およびＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、４．６ｍＬ、２．７２×１０−２ｍｏｌ、３０ｅｑ．）を加え、さらにｄｒｙ−ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かしたＮＫ１（４９３ｍｇ、９．４８×１０−４ｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を加え、撹拌した。前記攪拌開始４０分後において、減圧留去し、残渣を水に溶かし、吸引ろ過で沈殿物を回収した。ろ液を逆相カラムクロマトグラフで粗精製した後、ろ物と共にカラムクロマトグラフで精製し、ＭＫ１を得た。ＭＫ１の物性値を以下に示す。
収量：２６１ｍｇ 収率：６０％
ESI-MS （positive ion mode） m/z, found = 481.2, calculated for [（M+H）+] = 481.2
found = 503.1, calculated for [（M+Na）+] = 503.2
1HNMR （400 MHz, DMSO-d6） δ8.22 （1H, m）, 8.11 （1H, s）, 8.10 （1H, s）, 7.87 （1H, s）, 7.63 （1H, d）, 6.52 （1H, q）, 6.35 （1H, d）, 5.27 （1H, s）, 3.82 （1H, m）, 2.18 （1H, m）
収量：２６１ｍｇ 収率：６０％
ESI-MS （positive ion mode） m/z, found = 481.2, calculated for [（M+H）+] = 481.2
found = 503.1, calculated for [（M+Na）+] = 503.2
1HNMR （400 MHz, DMSO-d6） δ8.22 （1H, m）, 8.11 （1H, s）, 8.10 （1H, s）, 7.87 （1H, s）, 7.63 （1H, d）, 6.52 （1H, q）, 6.35 （1H, d）, 5.27 （1H, s）, 3.82 （1H, m）, 2.18 （1H, m）
（合成例２）ＭＫ２の合成
ＭＫ１（１０８ｍｇ、２．２５×１０−４ｍｏｌ）を真空乾燥させ、Ａｒ（アルゴン）で置換した。つぎに、ｄｒｙ−ＤＭＦで２回（１回目：４０ｍＬ、２回目：４ｍＬ）、およびｄｒｙ−ＭｅＣＮ（アセトニトリル）で３回（１回目：９ｍＬ、２回目：５ｍＬ、３回目：５ｍＬ）共沸した。ｄｒｙ−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（６ｍＬ）で懸濁させた後、ｄｒｙ−Ｔｒｉｂｕｔｈｙｌ ａｍｉｎｅ（１３０μＬ、５．４４×１０−４ｍｏｌ、２．５ｅｑ．）を加えた。そして、氷冷下でＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（４２μＬ、４．５０×１０−４ｍｏｌ、２ｅｑ．）を加え、撹拌した。前記攪拌開始４０分後において、再びｄｒｙ−Ｔｒｉｂｕｔｈｙｌ ａｍｉｎｅ（２５０μＬ、１．０５×１０−３ｍｏｌ、５ｅｑ．）およびＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（８４μＬ、４．５０×１０−４ｍｏｌ、４ｅｑ．）を加え、氷冷下で１時間撹拌した。前記撹拌後、冷１ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＢ（Triethylammonium bicarbonate） ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＬ）を加え、５分間撹拌し、クエンチした。そして、減圧留去し、Ｅｔｈｅｒで結晶化させ、吸引ろ過し、黄色固体を得た。前記固体を水に溶かし、陰イオン交換カラムクロマトグラフで精製し、凍結乾燥させ、ＭＫ２を得た。ＭＫ２の物性値を以下に示す。
収量：３０．０μｍｏｌ 収率：１３．４％
ESI-MS （negative ion mode） m/z, found = 559.1, calculated for [（M-H）-] = 559.2
収量：３０．０μｍｏｌ 収率：１３．４％
ESI-MS （negative ion mode） m/z, found = 559.1, calculated for [（M-H）-] = 559.2
（合成例３）ＭＫ３の合成
ＭＫ２（３０．０３μｍｏｌ）を真空乾燥させ、ｄｒｙ−Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（１０ｍＬ）で３回共沸し、一晩真空乾燥させた。前記乾燥後、Ａｒで置換し、ｄｒｙ−ＤＭＦ（２ｍＬ）およびｄｒｙ−ＴＥＡ（トリエチルアミン、２８μＬ、１．９８×１０−４ｍｏｌ、６．６ｅｑ．）で溶かした。さらに、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（１６ｍｇ、１４．０２×１０−４ｍｏｌ、４ｅｑ．）、２，２’−Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｙｒｉｄｉｎｅ（１７ｍｇ、７．７２×１０−４ｍｏｌ、１．６ｅｑ．）、およびＴｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（２０ｍｇ、７．６３×１０−４ｍｏｌ、１．６ｅｑ．）を加え、室温で撹拌した。前記攪拌開始６．５時間後、得られた反応液を、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（３９ｍｇ、３．１９×１０−４ｍｏｌ、１０ｅｑ．）をｄｒｙ−Ａｃｅｔｏｎｅ（１８mL）、ｄｒｙ−Ｅｔｈｅｒ（２７ｍＬ）、およびｄｒｙ−ＴＥＡ（２ｍＬ）で溶かした溶液に加え、前記添加後４℃で３０分静置した。そして、沈殿物をｄｒｙ−Ｅｔｈｅｒ（１２ｍＬ）で５回デカンテーションした。これを真空乾燥させ、ＭＫ３をクルードとして得た。
理論収量：３０．０３μｍｏｌ
理論収量：３０．０３μｍｏｌ
（合成例４）ＭＫ４の合成
ＭＫ３（３０．０３μｍｏｌ）を真空乾燥させ、Ａｒで置換し、ｄｒｙ−Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）で２回共沸した後、ｄｒｙ−ＤＭＦ（１ｍＬ）で懸濁させた。これにｄｒｙ−ｎ−Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ（３０μＬ、１．２５×１０−４ｍｏｌ、４ｅｑ．）および０．５ｍｏｌ／L ｎ−Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ＤＭＦ（３１０μＬ、１．５３×１０−４ｍｏｌ、５ｅｑ．）を加え、室温で撹拌した。前記攪拌開始６．５時間後、１ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＢ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＬ）を加え、３０分間撹拌し、減圧留去した。これに水を加え、Ｅｔｈｅｒで２回分液し、水層を陰イオン交換カラムクロマトグラフで精製し、凍結乾燥することでＭＫ４を得た。ＭＫ４の物性値を以下に示す。
収量：３．３３μｍｏｌ 収率：１１．１%
ESI-MS （negative ion mode） m/z, found = 719.0, calculated for [（M-H）-] = 719.1
収量：３．３３μｍｏｌ 収率：１１．１%
ESI-MS （negative ion mode） m/z, found = 719.0, calculated for [（M-H）-] = 719.1
［実施例２］
ＭＫ４を用いて、ｓＩｇＡに結合する結合核酸分子およびα−アミラーゼに結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
ＭＫ４を用いて、ｓＩｇＡに結合する結合核酸分子およびα−アミラーゼに結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
（１）結合核酸分子
チミン、グアニンまたはシトシンを含むデオキシリボヌクレオチド（それぞれ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ）に加え、デオキシリボヌクレオチドとしてＭＫ４を用いて作製した候補ポリヌクレオチドを用いた以外は、ＳＥＬＥＸ法によりターゲットに対する結合核酸分子を取得した。具体的には、ビーズ（Dynabeads MyOne Carboxylic Acid、Invitrogen社）にターゲットであるｓＩｇＡ（MP Biomedicals,LLC-Cappel Products社製）またはヒト唾液アミラーゼ（Lee BioSolutions, Inc社製）を、添付のプロトコルに基づいて結合させた。前記結合後、セレクションバッファー（ＳＢバッファー：４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．５）で洗浄し、ターゲットビーズを調製した。５’末端をビオチン修飾した相補鎖（フォワード（Ｆｗ）プライマー領域−Ｎ３０（３０塩基）−リバース（Ｒｖ）プライマー領域）と、フォワードプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（KOD Dash、東洋紡社製）と、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＭＫ４とを用いて、ＭＫ４が挿入されたｄｓＤＮＡを調製した。つぎに、前記ビーズ（Dynabeads MyOne Carboxylic Acid）に前記ｄｓＤＮＡを結合させた後、０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液によりｓｓ（single strand）ＤＮＡを溶出した。さらに、０．０８ｍｏｌ／Ｌ 塩酸水溶液で中和することで、ｓｓＤＮＡのライブラリを調製した。２０ｐｍｏｌのライブラリを２５０μｇの前記ターゲットビーズと２５℃、１５分の条件で混合後、前記ＳＢバッファーでビーズを洗浄した。そして、７ｍｏｌ／Ｌの尿素水溶液によりビーズ結合ｓｓＤＮＡを溶出した。溶出したｓｓＤＮＡを前記フォワードプライマーとビオチン修飾したリバースプライマーとを用いてＰＣＲにより増幅した。なお、前記ＰＣＲでは、デオキシリボヌクレオチドとして、ｄＴＴＰ、アデニンを含むデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ）、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰを用いた。得られたｄｓＤＮＡを磁気ビーズ（Dynabeads MyOne SA C1 magnetic beads、Invitrogen社製）に結合させた後、０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液によりフォワード鎖を溶出し、除去した。前記除去後、前記磁気ビーズを前記ＳＢバッファーで洗浄した。前記相補鎖が固相化された磁気ビーズと、フォワードプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（KOD Dash、東洋紡社製）と、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびＭＫ４とを用いて、前述の方法でＭＫ４が挿入されたｄｓＤＮＡを調製した。つぎに、０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液によりフォワード鎖を溶出することによりｓｓＤＮＡのライブラリを調製し、このライブラリを次のラウンドに使用した。同様の工程を８ラウンド実施することで、ｓＩｇＡまたはα−アミラーゼに結合する核酸分子をセレクション後、フォワードプライマーと、ビオチン修飾していないリバースプライマーを用いてＰＣＲを行なった。そして、シーケンサー（GS junior sequencer、Roche社製）により、得られた核酸分子のシーケンスを行った。
チミン、グアニンまたはシトシンを含むデオキシリボヌクレオチド（それぞれ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ）に加え、デオキシリボヌクレオチドとしてＭＫ４を用いて作製した候補ポリヌクレオチドを用いた以外は、ＳＥＬＥＸ法によりターゲットに対する結合核酸分子を取得した。具体的には、ビーズ（Dynabeads MyOne Carboxylic Acid、Invitrogen社）にターゲットであるｓＩｇＡ（MP Biomedicals,LLC-Cappel Products社製）またはヒト唾液アミラーゼ（Lee BioSolutions, Inc社製）を、添付のプロトコルに基づいて結合させた。前記結合後、セレクションバッファー（ＳＢバッファー：４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．５）で洗浄し、ターゲットビーズを調製した。５’末端をビオチン修飾した相補鎖（フォワード（Ｆｗ）プライマー領域−Ｎ３０（３０塩基）−リバース（Ｒｖ）プライマー領域）と、フォワードプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（KOD Dash、東洋紡社製）と、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＭＫ４とを用いて、ＭＫ４が挿入されたｄｓＤＮＡを調製した。つぎに、前記ビーズ（Dynabeads MyOne Carboxylic Acid）に前記ｄｓＤＮＡを結合させた後、０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液によりｓｓ（single strand）ＤＮＡを溶出した。さらに、０．０８ｍｏｌ／Ｌ 塩酸水溶液で中和することで、ｓｓＤＮＡのライブラリを調製した。２０ｐｍｏｌのライブラリを２５０μｇの前記ターゲットビーズと２５℃、１５分の条件で混合後、前記ＳＢバッファーでビーズを洗浄した。そして、７ｍｏｌ／Ｌの尿素水溶液によりビーズ結合ｓｓＤＮＡを溶出した。溶出したｓｓＤＮＡを前記フォワードプライマーとビオチン修飾したリバースプライマーとを用いてＰＣＲにより増幅した。なお、前記ＰＣＲでは、デオキシリボヌクレオチドとして、ｄＴＴＰ、アデニンを含むデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ）、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰを用いた。得られたｄｓＤＮＡを磁気ビーズ（Dynabeads MyOne SA C1 magnetic beads、Invitrogen社製）に結合させた後、０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液によりフォワード鎖を溶出し、除去した。前記除去後、前記磁気ビーズを前記ＳＢバッファーで洗浄した。前記相補鎖が固相化された磁気ビーズと、フォワードプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（KOD Dash、東洋紡社製）と、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびＭＫ４とを用いて、前述の方法でＭＫ４が挿入されたｄｓＤＮＡを調製した。つぎに、０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液によりフォワード鎖を溶出することによりｓｓＤＮＡのライブラリを調製し、このライブラリを次のラウンドに使用した。同様の工程を８ラウンド実施することで、ｓＩｇＡまたはα−アミラーゼに結合する核酸分子をセレクション後、フォワードプライマーと、ビオチン修飾していないリバースプライマーを用いてＰＣＲを行なった。そして、シーケンサー（GS junior sequencer、Roche社製）により、得られた核酸分子のシーケンスを行った。
この結果、α−アミラーゼに対する結合核酸分子として、下記配列番号１の塩基配列からなる結合核酸分子が、ｓＩｇＡに対する結合核酸分子として、下記配列番号２の塩基配列からなる結合核酸分子が得られた。下記配列番号１および２の塩基配列において、下線で示すＡが、ＭＫ４である。
α−アミラーゼ結合核酸分子１（配列番号１）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
ｓＩｇＡ結合核酸分子（配列番号２）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCAAGCCACGGAGAGTCCGAGGTGACCATTAAGCAGGAAACTACAATGGGCGGGCTTA-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子１（配列番号１）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
ｓＩｇＡ結合核酸分子（配列番号２）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCAAGCCACGGAGAGTCCGAGGTGACCATTAAGCAGGAAACTACAATGGGCGGGCTTA-3’
（２）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合の確認
前記α−アミラーゼ結合核酸分子１とα−アミラーゼとの結合および前記ｓＩｇＡ結合核酸分子とｓＩｇＡとの結合を下記ＳＰＲ条件により測定した。なお、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１および前記ｓＩｇＡ結合核酸分子は、下記リガンド２として、その３’末端に２０塩基長のポリｄＴを付加したものを使用した。さらに、コントロール１は、下記アナライトとして、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた以外は同様にして、コントロール２は、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１の結合を確認する系では、下記アナライトとして、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ、Creative BioMart社製）を用い、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子の結合を確認する系では、下記アナライトとして、前記α−アミラーゼを用いた以外は、同様にして結合を確認した。
前記α−アミラーゼ結合核酸分子１とα−アミラーゼとの結合および前記ｓＩｇＡ結合核酸分子とｓＩｇＡとの結合を下記ＳＰＲ条件により測定した。なお、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１および前記ｓＩｇＡ結合核酸分子は、下記リガンド２として、その３’末端に２０塩基長のポリｄＴを付加したものを使用した。さらに、コントロール１は、下記アナライトとして、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた以外は同様にして、コントロール２は、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１の結合を確認する系では、下記アナライトとして、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ、Creative BioMart社製）を用い、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子の結合を確認する系では、下記アナライトとして、前記α−アミラーゼを用いた以外は、同様にして結合を確認した。
（ＳＰＲ測定条件）
測定装置：ProteOn（商標）XPR36（BioRad社製）
測定チップ：ProteOn（商標）NLC Sensor Chip（BioRad社製）
リガンド１：５’末端をビオチン修飾したｐｏｌｙｄＡ（２０塩基長)：５μｍｏｌ／Ｌ
バッファー：４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４
リガンド２：２００ｎｍｏｌ／Ｌの３’末端にｐｏｌｙＴ（２０塩基長）を付加した結合核酸分子を含むバッファー
Ligand Flow Rate：２５μＬ／ｍｉｎ、８０ｓｅｃ
アナライト（Analyte）：４００ｎｍｏｌ／Ｌのターゲットを含むバッファー
Analyte Flow Rate：５０μＬ／ｍｉｎ
Contact Time：１２０ｓｅｃ
Dissociation：３００ｓｅｃ
・sIgA： IgA (Secretory) ,Human（MP Biomedicals, LLC-Cappel Products社製、カタログ番号： #55905）
・アミラーゼ：α−アミラーゼ（Lee Biosolutions社製、カタログ番号：#120-10)
・ＣｇＡ：Recombinant full length Human Chromogranin A（Creative BioMart社製、カタログ番号： #CHGA-26904TH）
・BSA：Bovine Serum Albumin（SIGMA社製、カタログ番号：#A7906）
測定装置：ProteOn（商標）XPR36（BioRad社製）
測定チップ：ProteOn（商標）NLC Sensor Chip（BioRad社製）
リガンド１：５’末端をビオチン修飾したｐｏｌｙｄＡ（２０塩基長)：５μｍｏｌ／Ｌ
バッファー：４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４
リガンド２：２００ｎｍｏｌ／Ｌの３’末端にｐｏｌｙＴ（２０塩基長）を付加した結合核酸分子を含むバッファー
Ligand Flow Rate：２５μＬ／ｍｉｎ、８０ｓｅｃ
アナライト（Analyte）：４００ｎｍｏｌ／Ｌのターゲットを含むバッファー
Analyte Flow Rate：５０μＬ／ｍｉｎ
Contact Time：１２０ｓｅｃ
Dissociation：３００ｓｅｃ
・sIgA： IgA (Secretory) ,Human（MP Biomedicals, LLC-Cappel Products社製、カタログ番号： #55905）
・アミラーゼ：α−アミラーゼ（Lee Biosolutions社製、カタログ番号：#120-10)
・ＣｇＡ：Recombinant full length Human Chromogranin A（Creative BioMart社製、カタログ番号： #CHGA-26904TH）
・BSA：Bovine Serum Albumin（SIGMA社製、カタログ番号：#A7906）
前記α−アミラーゼ結合核酸分子１とα−アミラーゼとの結合の結果を図１に、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子とｓＩｇＡとの結合の結果を図２に示す。図１は、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１のα−アミラーゼに対する結合能を示すグラフである。図１において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図１に示すように、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１は、ＣｇＡおよびＢＳＡに結合しないのに対し、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１は、α−アミラーゼに結合した。
つぎに、図２は、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子のｓＩｇＡに対する結合能を示すグラフである。図２において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図２に示すように、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子は、α−アミラーゼおよびＢＳＡに結合しないのに対し、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子は、ｓＩｇＡに結合した。
これらのことから、本発明のヌクレオシド誘導体であるＭＫ４を用いて、α−アミラーゼに結合する結合核酸分子およびｓＩｇＡに結合する結合核酸分子を取得できることがわかった。
（３）結合力の確認
前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した前記α−アミラーゼ結合核酸分子１を用い、アナライトであるα−アミラーゼの濃度を、５、１０、２０、４０、または８０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。また、前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した前記ｓＩｇＡ結合核酸分子を用い、アナライトであるｓＩｇＡの濃度を、１２．５、２５、５０、１００、または２００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１と前記α−アミラーゼとの解離定数、および前記ｓＩｇＡ結合核酸分子と前記ｓＩｇＡとの解離定数を算出した。この結果、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１と前記α−アミラーゼとの解離定数は、８．１４ｎＭであり、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子と前記ｓＩｇＡとの解離定数は、７．６３ｎＭであった。これらの結果から、いずれの結合核酸分子も極めて優れたターゲットとの結合能を有することがわかった。
前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した前記α−アミラーゼ結合核酸分子１を用い、アナライトであるα−アミラーゼの濃度を、５、１０、２０、４０、または８０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。また、前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した前記ｓＩｇＡ結合核酸分子を用い、アナライトであるｓＩｇＡの濃度を、１２．５、２５、５０、１００、または２００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１と前記α−アミラーゼとの解離定数、および前記ｓＩｇＡ結合核酸分子と前記ｓＩｇＡとの解離定数を算出した。この結果、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１と前記α−アミラーゼとの解離定数は、８．１４ｎＭであり、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子と前記ｓＩｇＡとの解離定数は、７．６３ｎＭであった。これらの結果から、いずれの結合核酸分子も極めて優れたターゲットとの結合能を有することがわかった。
（４）キャピラリー電気泳動による結合の確認
前記α−アミラーゼ結合核酸分子１とα−アミラーゼとの結合を下記キャピラリー電気泳動条件により測定した。なお、前記α−アミラーゼ結合核酸分子は、下記クローンとして、その５’末端を２０塩基長のＴＹＥ（商標）６６５で標識化したものを使用した。コントロールは、前記ターゲットにおいて、α−アミラーゼを添加しなかった以外は同様にして、測定した。
前記α−アミラーゼ結合核酸分子１とα−アミラーゼとの結合を下記キャピラリー電気泳動条件により測定した。なお、前記α−アミラーゼ結合核酸分子は、下記クローンとして、その５’末端を２０塩基長のＴＹＥ（商標）６６５で標識化したものを使用した。コントロールは、前記ターゲットにおいて、α−アミラーゼを添加しなかった以外は同様にして、測定した。
（キャピラリー電気泳動条件）
測定装置：SV1210形コスモアイ（日立ハイテクノロジー社）
測定チップ：i-チップ12（HitachiChemical社）
泳動ゲル：０．６％（Hydroxypropyl）methyl cellulose, viscosity 2.600-5,600（SIGMA社製、カタログ番号： #H7509）
ゲル溶解バッファー：４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２
クローン：２００ｎｍｏｌ／Ｌの５’末端をＴＹＥ（商標）６６５で標識化したアミラーゼ結合核酸分子、４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２を含む溶液
ターゲット：４μｍｏｌ／Ｌのアミラーゼ（α-Amylase - High Purity ,Human 、Lee BioSolutions, Inc.社製、カタログ番号：#120-10）、４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２を含む溶液
Folding：９５℃、５ｍｉｎ後、Ｏｎ ｉｃｅ ５ｍｉｎ
Mixing：ターゲットを添加後、室温（２５℃前後）、３０分間、１０００ｒｐｍ
Injection Voltage：６００V
Injection Time：１２０ｓｅｃ
Separation Voltage：３５０Ｖ
Separation Time：２６０ｓｅｃ
測定装置：SV1210形コスモアイ（日立ハイテクノロジー社）
測定チップ：i-チップ12（HitachiChemical社）
泳動ゲル：０．６％（Hydroxypropyl）methyl cellulose, viscosity 2.600-5,600（SIGMA社製、カタログ番号： #H7509）
ゲル溶解バッファー：４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２
クローン：２００ｎｍｏｌ／Ｌの５’末端をＴＹＥ（商標）６６５で標識化したアミラーゼ結合核酸分子、４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２を含む溶液
ターゲット：４μｍｏｌ／Ｌのアミラーゼ（α-Amylase - High Purity ,Human 、Lee BioSolutions, Inc.社製、カタログ番号：#120-10）、４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２を含む溶液
Folding：９５℃、５ｍｉｎ後、Ｏｎ ｉｃｅ ５ｍｉｎ
Mixing：ターゲットを添加後、室温（２５℃前後）、３０分間、１０００ｒｐｍ
Injection Voltage：６００V
Injection Time：１２０ｓｅｃ
Separation Voltage：３５０Ｖ
Separation Time：２６０ｓｅｃ
この結果を図３に示す。図３は、キャピラリー電気泳動の結果を示す写真である。図３において、写真の左側は、泳動時間を示し、各レーンは、左から、コントロール（α−アミラーゼ無し）およびα−アミラーゼありの結果を示す。図３に示すように、α−アミラーゼ無しのコントロールと比較して、α−アミラーゼありの場合、泳動時間が長くなった。これらの結果から、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１が、α−アミラーゼと結合することが分かった。
（５）プルダウンによる結合の確認
５’末端をビオチン修飾したα−アミラーゼ結合核酸分子１と、ストレプトアビジンで修飾されたビーズ（Dynabeads MyOne SA C1 magnetic beads、Invitrogen社製）とを接触させることにより、α−アミラーゼ結合核酸分子結合ビーズ１（以下、「結合ビーズＡ１」ともいう）を調製した。つぎに、前記結合ビーズＡ１を、唾液を含むＳＢバッファー（唾液サンプル）と混合し、室温（２５℃前後）で６０分間、１０００ｒｐｍで振盪した。
５’末端をビオチン修飾したα−アミラーゼ結合核酸分子１と、ストレプトアビジンで修飾されたビーズ（Dynabeads MyOne SA C1 magnetic beads、Invitrogen社製）とを接触させることにより、α−アミラーゼ結合核酸分子結合ビーズ１（以下、「結合ビーズＡ１」ともいう）を調製した。つぎに、前記結合ビーズＡ１を、唾液を含むＳＢバッファー（唾液サンプル）と混合し、室温（２５℃前後）で６０分間、１０００ｒｐｍで振盪した。
つぎに、振盪後の結合ビーズＡ１を、前記ＳＢバッファーで３回洗浄処理した。そして、ＳＤＳバッファーの存在下、９５℃で１０分間処理することで、前記結合ビーズＡ１に結合したα−アミラーゼを溶出した。前記ＳＤＳバッファーの組成は、６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、２％ＳＤＳ、５％スクロース、０．００２％ブロモフェノールブルー、１％２−メルカプトエタノールとした。
得られた溶出液をゲル（ＰＡＧＥＬ Ｃ５０Ｌ、ＡＴＴＯ社製）にロードし、泳動バッファーの存在下、電気泳動を行なった。前記泳動バッファーの組成は、２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１９２ｍｍｏｌ／Ｌ グリシン、０．１％ＳＤＳとした。つぎに、泳動後のゲルを染色剤（Ｇｅｌ Ｃｏｄｅ、Thermo SCIENTIFIC社製、カタログ番号：#24594）で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（BioRad社製）で撮影した。また、コントロール１は、５’末端をビオチン修飾したα−アミラーゼに結合しない核酸分子（コントロールの核酸分子１）を使用した以外は同様にして、コントロール２は、α−アミラーゼのみを使用した以外は同様にして、撮影した。
コントロールの核酸分子１（配列番号３）
5’-GGATACCTTAACGCCGCCTATTG-3’
コントロールの核酸分子１（配列番号３）
5’-GGATACCTTAACGCCGCCTATTG-3’
この結果を図４に示す。図４は、プルダウンの結果を示す写真である。図４において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍ）、前記唾液サンプル（１）、コントロール１（Ｃ１）、およびコントロール２（ＡＭＹ）を示す。図４に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約５０ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記唾液サンプルでは、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１とα−アミラーゼとの結合が確認された。これらの結果から、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１が、α−アミラーゼと結合することが分かった。
［実施例３］
ＭＫ４を用いて、ヒトβ−ディフェンシン４Ａおよびヒトリゾチームに結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
ＭＫ４を用いて、ヒトβ−ディフェンシン４Ａおよびヒトリゾチームに結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
（１）結合核酸分子
ヒトβ−ディフェンシン４Ａおよびヒトリゾチームに結合する結合核酸分子は、ターゲットであるｓＩｇＡに代えて、ヒトβ−ディフェンシン４Ａ（Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#C127）またはヒトリゾチーム（Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#P61626）を用いた以外は、前記実施例２（１）と同様にして、取得した。
ヒトβ−ディフェンシン４Ａおよびヒトリゾチームに結合する結合核酸分子は、ターゲットであるｓＩｇＡに代えて、ヒトβ−ディフェンシン４Ａ（Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#C127）またはヒトリゾチーム（Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#P61626）を用いた以外は、前記実施例２（１）と同様にして、取得した。
この結果、β−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａに結合する結合核酸分子として、下記配列番号４〜６の塩基配列からなる結合核酸分子が、リゾチームに対する結合核酸分子として、下記配列番号７〜９の塩基配列からなる結合核酸分子が得られた。下記配列番号４〜９の塩基配列において、下線で示すＡが、ＭＫ４である。
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１（配列番号４）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTATTTTTACGGGGTATAGTTCTCTGAGGAGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子２（配列番号５）
5’-CGAGCCGCACATTTCTATTTTTACGGGGTATAGTTCTCTGAGGAGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子３（配列番号６）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCACCGTGATAGTTCTCTGAGGAGGACTTCTAGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
リゾチーム結合核酸分子１（配列番号７）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTAACGGGAACTTCAACCCATACAGTCTTTTGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
リゾチーム結合核酸分子２（配列番号８）
5’-CGAGCCGCACATTTCTAACGGGAACTTCAACCCATACAGTCTTTTGAGTTCCC-3’
リゾチーム結合核酸分子３（配列番号９）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTTTACTCCGGAACCCATACAGTCTTTTCCGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１（配列番号４）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTATTTTTACGGGGTATAGTTCTCTGAGGAGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子２（配列番号５）
5’-CGAGCCGCACATTTCTATTTTTACGGGGTATAGTTCTCTGAGGAGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子３（配列番号６）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCACCGTGATAGTTCTCTGAGGAGGACTTCTAGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
リゾチーム結合核酸分子１（配列番号７）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTAACGGGAACTTCAACCCATACAGTCTTTTGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
リゾチーム結合核酸分子２（配列番号８）
5’-CGAGCCGCACATTTCTAACGGGAACTTCAACCCATACAGTCTTTTGAGTTCCC-3’
リゾチーム結合核酸分子３（配列番号９）
5’-GGTTACACGAGCCGCACATTTCTTTACTCCGGAACCCATACAGTCTTTTCCGGAGTTCCCAGGCGAAGTTGTTATC-3’
（２）ＳＰＲによる結合の確認
各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子とＢＤＮ４Ａとの結合、および各リゾチーム結合核酸分子とリゾチームとの結合は、前記リガンド２として、その３’末端に２０塩基長のポリｄＴを付加したＢＤＮ４Ａ結合核酸分子またはリゾチーム結合核酸分子を用い、アナライトとして、下記のタンパク質を用いた以外は、前記実施例２（２）と同様にして実施した。また、コントロールは、前記アナライトとして、α−アミラーゼおよびｓＩｇＡを用いた以外は同様にして結合を確認した。
・β-Defensin 4A：β-Defensin 4A ,Human (Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#C127)
・human Lysozyme：Recombinant Human Lysozyme C (Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#P61626)
各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子とＢＤＮ４Ａとの結合、および各リゾチーム結合核酸分子とリゾチームとの結合は、前記リガンド２として、その３’末端に２０塩基長のポリｄＴを付加したＢＤＮ４Ａ結合核酸分子またはリゾチーム結合核酸分子を用い、アナライトとして、下記のタンパク質を用いた以外は、前記実施例２（２）と同様にして実施した。また、コントロールは、前記アナライトとして、α−アミラーゼおよびｓＩｇＡを用いた以外は同様にして結合を確認した。
・β-Defensin 4A：β-Defensin 4A ,Human (Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#C127)
・human Lysozyme：Recombinant Human Lysozyme C (Novoprotein Scientific Inc. 社製、カタログ番号：#P61626)
各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子とＢＤＮ４Ａとの結合の結果を図５に、各リゾチーム結合核酸分子とリゾチームとの結合の結果を図６に示す。
図５は、各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子のＢＤＮ４Ａに対する結合能を示すグラフである。図５において、（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ、前記ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１〜３の結果を示す。図５において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図５に示すように、前記ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子は、アミラーゼおよびｓＩｇＡには結合せず、ＢＤＮ４Ａに結合した。
つぎに、図６は、各リゾチーム結合核酸分子のリゾチームに対する結合能を示すグラフである。図６において、（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ、前記リゾチーム結合核酸分子１〜３の結果を示す。図６において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図６に示すように、前記リゾチーム結合核酸分子は、アミラーゼおよびｓＩｇＡには結合せず、リゾチームに結合した。
これらのことから、本発明のヌクレオシド誘導体であるＭＫ４を用いて、ＢＤＮ４Ａに結合する結合核酸分子およびリゾチームに結合する結合核酸分子を取得できることがわかった。
（３）結合力の確認
前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を用い、アナライトであるＢＤＮ４Ａの濃度を、２５、５０、１００、２００、または４００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例３（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。さらに、前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した各リゾチーム結合核酸分子を用い、アナライトであるリゾチームの濃度を、１２．５、２５、５０、１００、または２００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例３（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子とＢＤＮ４Ａとの解離定数および各リゾチーム結合核酸分子と前記リゾチームとの解離定数を算出した。これらの結果を下記表１に示す。
前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子を用い、アナライトであるＢＤＮ４Ａの濃度を、２５、５０、１００、２００、または４００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例３（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。さらに、前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した各リゾチーム結合核酸分子を用い、アナライトであるリゾチームの濃度を、１２．５、２５、５０、１００、または２００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例３（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、各ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子とＢＤＮ４Ａとの解離定数および各リゾチーム結合核酸分子と前記リゾチームとの解離定数を算出した。これらの結果を下記表１に示す。
前記表１に示すように、いずれの結合核酸分子も極めて優れたターゲットとの結合能を有することがわかった。
（４）プルダウンによる結合の確認
５’末端をビオチン修飾したＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１およびリゾチーム結合核酸分子１を、それぞれ、前記ストレプトアビジンで修飾されたビーズと接触させることにより、ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＣ」ともいう）およびリゾチーム結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＤ」ともいう）を調製した。つぎに、前記結合ビーズＣおよびＤを、それぞれ、９０（ｖ／ｖ）％の唾液を含むＳＢバッファー（唾液サンプル）またはＢＤＮ４Ａもしくはリゾチームを含むＳＢバッファー（ターゲットサンプル）と混合した以外は、前記実施例２（５）と同様にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲルを撮影した。また、コントロール１は、５’末端をビオチン修飾した下記のコントロールの核酸分子２を使用した以外は同様にして、コントロール２は、ＢＤＮ４Ａ、またはリゾチームのみを使用した以外は同様にして、撮影した。
コントロールの核酸分子２（配列番号１０）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAAC-3’
５’末端をビオチン修飾したＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１およびリゾチーム結合核酸分子１を、それぞれ、前記ストレプトアビジンで修飾されたビーズと接触させることにより、ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＣ」ともいう）およびリゾチーム結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＤ」ともいう）を調製した。つぎに、前記結合ビーズＣおよびＤを、それぞれ、９０（ｖ／ｖ）％の唾液を含むＳＢバッファー（唾液サンプル）またはＢＤＮ４Ａもしくはリゾチームを含むＳＢバッファー（ターゲットサンプル）と混合した以外は、前記実施例２（５）と同様にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲルを撮影した。また、コントロール１は、５’末端をビオチン修飾した下記のコントロールの核酸分子２を使用した以外は同様にして、コントロール２は、ＢＤＮ４Ａ、またはリゾチームのみを使用した以外は同様にして、撮影した。
コントロールの核酸分子２（配列番号１０）
5’-GGTAACCGCCCTGTCTTGATAAC-3’
つぎに、前記結合ビーズＣを用いた結果を図７に示す。図７は、前記結合ビーズＣを用いたプルダウンの結果を示す写真である。図７において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、レーンＭ（マーカー）、レーン４（ターゲットサンプル）、レーンＣ１（コントロール１）、レーンｈＢＤＮ（コントロール２）、レーンＭ（マーカー）、レーン８（唾液サンプル）、レーンＣ２（コントロール１）、およびレーンｈＢＤＮ（コントロール２）を示す。図７に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約１０ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記ターゲットサンプルおよび前記唾液サンプルでは、図中の矢印で示すように、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、前記ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子１とＢＤＮ４Ａとの結合が確認された。これらの結果から、前記ＢＤＮ４Ａ結合核酸分子が、ＢＤＮ４Ａと結合することが分かった。
つぎに、前記結合ビーズＤを用いた結果を図８に示す。図８は、前記結合ビーズＤを用いたプルダウンの結果を示す写真であり、（Ａ）は、前記ターゲットサンプルの結果を示し、（Ｂ）は、前記唾液サンプルの結果を示す。図８（Ａ）において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、レーンＭ（マーカー）、レーン２（ターゲットサンプル）、レーンＣ１（コントロール１）、レーンｈＬｙｓ（コントロール２）、およびレーンＭ（マーカー）を示し、（Ｂ）において、各レーンは、左から、レーンＭ（マーカー）、レーン６（唾液サンプル）、レーンＣ１（コントロール１）、レーンｈＬｙｓ（コントロール２）、およびレーンＭ（マーカー）を示す。図８に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約１５ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記ターゲットサンプルおよび前記唾液サンプルでは、図中の矢印で示すように、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、前記リゾチーム結合核酸分子１とリゾチームとの結合が確認された。これらの結果から、前記リゾチーム結合核酸分子が、リゾチームと結合することが分かった。
［実施例４］
ＭＫ４を用いて、ヒトα−アミラーゼに結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
ＭＫ４を用いて、ヒトα−アミラーゼに結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
（１）結合核酸分子
ヒトα−アミラーゼに結合する結合核酸分子は、ターゲットであるｓＩｇＡに代えて、前述のヒトα−アミラーゼを用いた以外は、前記実施例２（１）と同様にして、取得した。
ヒトα−アミラーゼに結合する結合核酸分子は、ターゲットであるｓＩｇＡに代えて、前述のヒトα−アミラーゼを用いた以外は、前記実施例２（１）と同様にして、取得した。
この結果、α−アミラーゼに結合する結合核酸分子として、下記配列番号１１〜１６の塩基配列からなる結合核酸分子が得られた。下記配列番号１１〜１６の塩基配列において、下線で示すＡが、ＭＫ４である。
α−アミラーゼ結合核酸分子２（配列番号１１）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTA-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子３（配列番号１２）
5’-GCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTA-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子４（配列番号１３）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCAGACTATTATTTCAAGTACGTGGGGGTCTTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子５（配列番号１４）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子６（配列番号１５）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACT-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子７（配列番号１６）
5’-GCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACT-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子２（配列番号１１）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTA-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子３（配列番号１２）
5’-GCAATCTCCCTAATCTAGTGACGAAAATGTACGAGGGGGTCATTTGAAACTA-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子４（配列番号１３）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCAGACTATTATTTCAAGTACGTGGGGGTCTTGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子５（配列番号１４）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACTACAATGGGCGGGCTTATC-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子６（配列番号１５）
5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACT-3’
α−アミラーゼ結合核酸分子７（配列番号１６）
5’-GCAATCTCCCTAATCTAAAGTTTCTAAACGATGTGGCGGCATTCAGAAACT-3’
（２）ＳＰＲによる結合の確認
各α−アミラーゼ結合核酸分子とα−アミラーゼとの結合は、前記実施例２（２）における前記α−アミラーゼ結合核酸分子１と同様にして、実施した。また、コントロールは、前記アナライトとして、ＣｇＡおよびＢＳＡを用いた以外は同様にして結合を確認した。これらの結果を図９に示す。
各α−アミラーゼ結合核酸分子とα−アミラーゼとの結合は、前記実施例２（２）における前記α−アミラーゼ結合核酸分子１と同様にして、実施した。また、コントロールは、前記アナライトとして、ＣｇＡおよびＢＳＡを用いた以外は同様にして結合を確認した。これらの結果を図９に示す。
図９は、各α−アミラーゼ結合核酸分子のα−アミラーゼに対する結合能を示すグラフである。図９において、（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ、前記α−アミラーゼ結合核酸分子２〜７の結果を示す。図９において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図９に示すように、各α−アミラーゼ結合核酸分子は、ＣｇＡおよびＢＳＡには結合せず、α−アミラーゼに結合した。
（３）結合力の確認
前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した各α−アミラーゼ結合核酸分子を用い、アナライトであるα−アミラーゼの濃度を、５、１０、２０、４０、または８０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例４（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、前記各α−アミラーゼ結合核酸分子と前記α−アミラーゼとの解離定数を算出した。この結果、前記α−アミラーゼ結合核酸分子２〜７と前記α−アミラーゼとの解離定数は、それぞれ、６．９１、７．７５、５．１８、１３．２、１１．５、および１１．１ｎＭであった。これらの結果から、いずれの結合核酸分子も極めて優れたターゲットとの結合能を有することがわかった。
前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した各α−アミラーゼ結合核酸分子を用い、アナライトであるα−アミラーゼの濃度を、５、１０、２０、４０、または８０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例４（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、前記各α−アミラーゼ結合核酸分子と前記α−アミラーゼとの解離定数を算出した。この結果、前記α−アミラーゼ結合核酸分子２〜７と前記α−アミラーゼとの解離定数は、それぞれ、６．９１、７．７５、５．１８、１３．２、１１．５、および１１．１ｎＭであった。これらの結果から、いずれの結合核酸分子も極めて優れたターゲットとの結合能を有することがわかった。
（４）キャピラリー電気泳動による結合の確認
前記α−アミラーゼ結合核酸分子１に加え、前記α−アミラーゼ結合核酸分子５を用いた以外は、前記実施例２（４）と同様にして、測定した。また、コントロールは、前記ターゲットにおいて、α−アミラーゼを添加しなかった以外は同様にして、測定した。
前記α−アミラーゼ結合核酸分子１に加え、前記α−アミラーゼ結合核酸分子５を用いた以外は、前記実施例２（４）と同様にして、測定した。また、コントロールは、前記ターゲットにおいて、α−アミラーゼを添加しなかった以外は同様にして、測定した。
この結果を図１０に示す。図１０は、キャピラリー電気泳動の結果を示す写真である。図１０において、写真の左側は、泳動時間を示し、各レーンは、左から、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１のコントロール（α−アミラーゼ無し）およびα−アミラーゼあり、ならびに前記α−アミラーゼ結合核酸分子５のコントロール（アミラーゼ無し）およびα−アミラーゼありの結果を示す。図１０に示すように、各α−アミラーゼ結合核酸分子において、α−アミラーゼ無しのコントロールと比較して、α−アミラーゼありの場合、泳動時間が長くなった。これらの結果から、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１および５が、α−アミラーゼと結合することが分かった。
（５）プルダウンによる結合の確認
５’末端をビオチン修飾したα−アミラーゼ結合核酸分子５を、前記ストレプトアビジンで修飾されたビーズと接触させることにより、α−アミラーゼ結合核酸分子結合ビーズ５（以下、「結合ビーズＡ５」ともいう）を調製した。そして、前記結合ビーズＡ１に加え、前記結合ビーズＡ５を用い、前記サンプルとして、α−アミラーゼを含むターゲットサンプルを用いた以外は、前記実施例２（５）と同様にして、撮影した。また、コントロール１は、５’末端をビオチン修飾したα−アミラーゼに結合しない核酸分子（前記コントロールの核酸分子１）を使用した以外は同様にして、コントロール２は、α−アミラーゼのみを使用した以外は同様にして、撮影した。
５’末端をビオチン修飾したα−アミラーゼ結合核酸分子５を、前記ストレプトアビジンで修飾されたビーズと接触させることにより、α−アミラーゼ結合核酸分子結合ビーズ５（以下、「結合ビーズＡ５」ともいう）を調製した。そして、前記結合ビーズＡ１に加え、前記結合ビーズＡ５を用い、前記サンプルとして、α−アミラーゼを含むターゲットサンプルを用いた以外は、前記実施例２（５）と同様にして、撮影した。また、コントロール１は、５’末端をビオチン修飾したα−アミラーゼに結合しない核酸分子（前記コントロールの核酸分子１）を使用した以外は同様にして、コントロール２は、α−アミラーゼのみを使用した以外は同様にして、撮影した。
これらの結果を図１１に示す。図１１は、前記結合ビーズＡ１およびＡ５を用いたプルダウンの結果を示す写真である。図１１において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍ）、前記結合ビーズＡ１（１）、前記結合ビーズＡ５（２）、コントロール１（Ｃ１）、およびコントロール２（ＡＭＹ）を示す。図１１に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約５０ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記結合ビーズＡ１およびＡ５では、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、α−アミラーゼ結合核酸分子１および５とα−アミラーゼとの結合が確認された。これらの結果から、前記α−アミラーゼ結合核酸分子１および５が、α−アミラーゼと結合することが分かった。
［実施例５］
ＭＫ４を用いて、ヒトＬＤＨ５およびヒトＩＬ−６に結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
ＭＫ４を用いて、ヒトＬＤＨ５およびヒトＩＬ−６に結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
（１）結合核酸分子
ヒトＬＤＨ５およびヒトＩＬ−６に結合する結合核酸分子は、ターゲットであるｓＩｇＡに代えて、ヒトＬＤＨ５（Meridian Life Science, Inc.社製、カタログ番号：#A38558H-100)またはヒトＩＬ−６（MP Biomedicals,LLC-Cappel Products社製、カタログ番号：#55905）を用いた以外は、前記実施例２（１）と同様にして、取得した。
ヒトＬＤＨ５およびヒトＩＬ−６に結合する結合核酸分子は、ターゲットであるｓＩｇＡに代えて、ヒトＬＤＨ５（Meridian Life Science, Inc.社製、カタログ番号：#A38558H-100)またはヒトＩＬ−６（MP Biomedicals,LLC-Cappel Products社製、カタログ番号：#55905）を用いた以外は、前記実施例２（１）と同様にして、取得した。
この結果、ＬＤＨ５に結合する結合核酸分子として、下記配列番号１７〜２０の塩基配列からなる結合核酸分子が、ＩＬ−６に対する結合核酸分子として、下記配列番号２１〜２２の塩基配列からなる結合核酸分子が得られた。下記配列番号１７〜２２の塩基配列において、下線で示すＡが、ＭＫ４である。
ＬＤＨ５結合核酸分子１（配列番号１７）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子２（配列番号１８）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAGAGGGAGATCATCTCTCTGGCGGACACAACCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子３（配列番号１９）
5’-ACCTCGCCGTTTATGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子４（配列番号２０）
5’-TGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGC-3’
ＩＬ−６結合核酸分子１（配列番号２１）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAGTTCAATGGTATTGTATCGACTCTTCTCGCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＩＬ−６結合核酸分子２（配列番号２２）
5’-ACCTCGCCGTTTATGAGTTCAATGGTATTGTATCGACTCTTCTC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子１（配列番号１７）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子２（配列番号１８）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAGAGGGAGATCATCTCTCTGGCGGACACAACCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子３（配列番号１９）
5’-ACCTCGCCGTTTATGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGC-3’
ＬＤＨ５結合核酸分子４（配列番号２０）
5’-TGCTGCTGGCTCGTGAGACGGATATCAGGTCTCCTAAGGCTGGC-3’
ＩＬ−６結合核酸分子１（配列番号２１）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATGAGTTCAATGGTATTGTATCGACTCTTCTCGCCTAAGGCTGGCTGGCTACTATAC-3’
ＩＬ−６結合核酸分子２（配列番号２２）
5’-ACCTCGCCGTTTATGAGTTCAATGGTATTGTATCGACTCTTCTC-3’
（２）ＳＰＲによる結合の確認
各ＬＤＨ５結合核酸分子とＬＤＨ５との結合、および各ＩＬ−６結合核酸分子とＩＬ−６との結合は、前記リガンド２として、その３’末端に２０塩基長のポリｄＴを付加したＬＤＨ５結合核酸分子またはＩＬ−６結合核酸分子を用い、アナライトとして、下記のタンパク質を用いた以外は、前記実施例２（２）と同様にして実施した。また、コントロールは、前記アナライトとして、α−アミラーゼおよびｓＩｇＡを用いた以外は同様にして結合を確認した。
・LDH5：Lactate Dehydrogenase 5 ,Human (Meridian Life Science, Inc.社製、カタログ番号：#A38558H-100)
・CgA： Recombinant full length Human Chromogranin A (Creative BioMart社製、カタログ番号：#CHGA-26904TH)
・IL-6： IL-6, Human, Recombinant (PeproTech社製、カタログ番号：#200-06)
・アミラーゼ：α−アミラーゼ(Lee Biosolutions社製、カタログ番号：#120-10)
・sIgA: IgA (Secretory) ,Human (MP Biomedicals,LLC-Cappel Products社製、カタログ番号：#55905)
各ＬＤＨ５結合核酸分子とＬＤＨ５との結合、および各ＩＬ−６結合核酸分子とＩＬ−６との結合は、前記リガンド２として、その３’末端に２０塩基長のポリｄＴを付加したＬＤＨ５結合核酸分子またはＩＬ−６結合核酸分子を用い、アナライトとして、下記のタンパク質を用いた以外は、前記実施例２（２）と同様にして実施した。また、コントロールは、前記アナライトとして、α−アミラーゼおよびｓＩｇＡを用いた以外は同様にして結合を確認した。
・LDH5：Lactate Dehydrogenase 5 ,Human (Meridian Life Science, Inc.社製、カタログ番号：#A38558H-100)
・CgA： Recombinant full length Human Chromogranin A (Creative BioMart社製、カタログ番号：#CHGA-26904TH)
・IL-6： IL-6, Human, Recombinant (PeproTech社製、カタログ番号：#200-06)
・アミラーゼ：α−アミラーゼ(Lee Biosolutions社製、カタログ番号：#120-10)
・sIgA: IgA (Secretory) ,Human (MP Biomedicals,LLC-Cappel Products社製、カタログ番号：#55905)
各ＬＤＨ５結合核酸分子とＬＤＨ５との結合の結果を図１２に、各ＩＬ−６結合核酸分子とＩＬ−６との結合の結果を図１３に示す。
図１２は、各ＬＤＨ５結合核酸分子のＬＤＨ５に対する結合能を示すグラフである。図１２において、（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ、前記ＬＤＨ５結合核酸分子１〜４の結果を示す。図１２において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図１２に示すように、各ＬＤＨ５結合核酸分子は、アミラーゼおよびｓＩｇＡには結合せず、ＬＤＨ５に結合した。
つぎに、図１３は、各ＩＬ−６結合核酸分子のＩＬ−６に対する結合能を示すグラフである。図１３において、（Ａ）〜（Ｂ）は、それぞれ、前記ＩＬ−６結合核酸分子１〜２の結果を示す。図１３において、横軸は、リガンドをインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図１３に示すように、各ＩＬ−６結合核酸分子は、アミラーゼおよびｓＩｇＡには結合せず、ＩＬ−６に結合した。
つぎに、各結合核酸分子の測定チップへの固定化量と、各核酸分子とターゲットとの結合量に基づき、各結合核酸分子の結合能を検討した。具体的には、リガンド２のインジェクション後のシグナル強度（ＲＵ）を測定し、これを各核酸分子の測定チップへの固層化量を示すシグナルとして、核酸分子固層化測定値（Ａ）とした。また、アナライトのインジェクションおよびバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。そして、インジェクション開始を０秒として、１１５〜１２５秒の間におけるシグナル強度の平均値を求め、これを、各結合核酸分子とターゲットとの結合量を示すシグナルとして、ターゲット結合測定値（Ｂ）とした。そして、ターゲット結合測定値（Ｂ）を核酸分子固層化測定値（Ａ）で割った値（Ｂ／Ａ）を、相対値（Relative Unit）として求め、これを結合能とした。また、コントロールは、前記アナライトとして、α−アミラーゼおよびｓＩｇＡを用いた以外は同様にして結合能を確認した。
各ＬＤＨ５結合核酸分子の結果を図１４に、各ＩＬ−６結合核酸分子の結果を図１５に示す。
図１４は、各ＬＤＨ５結合核酸分子のＬＤＨ５への結合量の相対値（Relative Unit）を示すグラフである。図１４において、横軸は、ＬＤＨ５結合核酸分子の種類を示し、縦軸は、相対値を示す。図１４に示すように、α−アミラーゼまたはｓＩｇＡを用いたコントロールでは結合が確認できなかった。これに対し、いずれのＬＤＨ５結合核酸分子も、ＬＤＨ５に結合した。
図１５は、各ＩＬ−６結合核酸分子のＩＬ−６への結合量の相対値を示すグラフである。図１５において、横軸は、ＩＬ−６結合核酸分子の種類を示し、縦軸は、相対値を示す。図１５に示すように、α−アミラーゼまたはｓＩｇＡを用いたコントロールでは結合が確認できなかった。これに対し、いずれのＩＬ−６結合核酸分子も、ＩＬ−６に結合した。
これらのことから、本発明のヌクレオシド誘導体であるＭＫ４を用いて、ＬＤＨ５に結合する結合核酸分子およびＩＬ−６に結合する結合核酸分子を取得できることがわかった。
（３）結合力の確認
前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した各ＬＤＨ５結合核酸分子を用い、アナライトであるＬＤＨ５の濃度を、１．２５、２．５、５、１０、もしくは２０ｎｍｏｌ／Ｌ、または６．２５、１２．５、２５、５０、もしくは１００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例５（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。さらに、前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した各ＩＬ−６結合核酸分子を用い、アナライトであるＩＬ−６の濃度を、６．２５、１２．５、２５、５０、もしくは１００ｎｍｏｌ／Ｌ、または１２．５、２５、５０、１００、もしくは２００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例５（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、各ＬＤＨ５結合核酸分子とＬＤＨ５との解離定数および各ＩＬ−６結合核酸分子と前記ＩＬ−６との解離定数を算出した。これらの結果を下記表２に示す。
前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した各ＬＤＨ５結合核酸分子を用い、アナライトであるＬＤＨ５の濃度を、１．２５、２．５、５、１０、もしくは２０ｎｍｏｌ／Ｌ、または６．２５、１２．５、２５、５０、もしくは１００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例５（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。さらに、前記リガンド２として、３’末端に２０塩基長ｐｏｌｙＴを付加した各ＩＬ−６結合核酸分子を用い、アナライトであるＩＬ−６の濃度を、６．２５、１２．５、２５、５０、もしくは１００ｎｍｏｌ／Ｌ、または１２．５、２５、５０、１００、もしくは２００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例５（２）と同様にして、結合力の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合力の相対値（ＲＵ）に基づき、各ＬＤＨ５結合核酸分子とＬＤＨ５との解離定数および各ＩＬ−６結合核酸分子と前記ＩＬ−６との解離定数を算出した。これらの結果を下記表２に示す。
前記表２に示すように、いずれの結合核酸分子も極めて優れたターゲットとの結合能を有することがわかった。特に、ＬＤＨ５結合核酸分子２〜４は、ターゲットと極めて優れた結合能を示した。
（４）プルダウンによる結合の確認
５’末端をビオチン修飾したＬＤＨ５結合核酸分子１を、前記ストレプトアビジンで修飾されたビーズと接触させることにより、ＬＤＨ５結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＬ」ともいう）を調製した。つぎに、前記結合ビーズＬを、それぞれ、９０（ｖ／ｖ）％の唾液を含むＳＢバッファー（唾液サンプル）またはＬＤＨ５を含むＳＢバッファー（ターゲットサンプル）と混合した以外は、前記実施例２（５）と同様にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲルを撮影した。また、コントロール１は、５’末端をビオチン修飾した下記のコントロールの核酸分子３を使用した以外は同様にして、コントロール２は、ＬＤＨ５のみを使用した以外は同様にして、撮影した。
コントロールの核酸分子３（配列番号２３）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATG-3’
５’末端をビオチン修飾したＬＤＨ５結合核酸分子１を、前記ストレプトアビジンで修飾されたビーズと接触させることにより、ＬＤＨ５結合核酸分子結合ビーズ（以下、「結合ビーズＬ」ともいう）を調製した。つぎに、前記結合ビーズＬを、それぞれ、９０（ｖ／ｖ）％の唾液を含むＳＢバッファー（唾液サンプル）またはＬＤＨ５を含むＳＢバッファー（ターゲットサンプル）と混合した以外は、前記実施例２（５）と同様にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲルを撮影した。また、コントロール１は、５’末端をビオチン修飾した下記のコントロールの核酸分子３を使用した以外は同様にして、コントロール２は、ＬＤＨ５のみを使用した以外は同様にして、撮影した。
コントロールの核酸分子３（配列番号２３）
5’-GGAATTGACACCTCGCCGTTTATG-3’
つぎに、前記結合ビーズＬを用いた結果を図１６に示す。図１６は、前記結合ビーズＬを用いたプルダウンの結果を示す写真である。図１６において、写真の左側の数字が、分子量を示し、各レーンは、左から、レーンＭ（マーカー）、レーン１（ターゲットサンプル）、レーンＣ１（コントロール１）、レーンＬＤＨ５（コントロール２）、レーンＭ（マーカー）、レーン２（唾液サンプル）、およびレーンＣ２（コントロール１）を示す。図１６に示すように、コントロール１では、コントロール２と同様の位置（約３５ｋＤａ）にバンドが観察されなかったのに対し、前記ターゲットサンプルおよび前記唾液サンプルでは、図中の矢印で示すように、コントロール２と同様の泳動度の位置にバンドが観察された。すなわち、前記ＬＤＨ５結合核酸分子１とＬＤＨ５との結合が確認された。これらの結果から、前記ＬＤＨ５結合核酸分子が、ＬＤＨ５と結合することが分かった。
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
この出願は、２０１６年９月１５日に出願された日本出願特願２０１６−１８０８９４および２０１７年５月３０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１７／０２００６５を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない
（付記１）
下記化学式（１）で表されることを特徴とする、ヌクレオシド誘導体またはその塩。
前記化学式（１）中、
Ｓｕは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和または不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（−ＮＲ１−）、エーテル基（−Ｏ−）、またはチオエーテル基（−Ｓ−）であり、
Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基である。
（付記２）
Ｘ１が、イミノ基（−ＮＲ１−）である、付記１記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記３）
Ｘ２が、イミノ基（−ＮＲ１−）である、付記１または２記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記４）
Ｒ１が、水素原子である、付記２または３記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記５）
Ｌ１が、ビニレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）である、付記１から４のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記６）
Ｌ２が、エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）である、付記１から５のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記７）
前記ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団または前記ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団が、下記化学式（２）で表される、付記１から６のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
前記化学式（２）中、
Ｒ２は、水素原子、保護基、または下記化学式（３）で表される基であり、
Ｒ３は、水素原子、保護基、またはホスホロアミダイト基であり、
Ｒ４は、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり、
前記化学式（３）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｚは、ヒドロキシル基またはイミダゾール基であり、
ｍは、１〜１０の整数である。
（付記８）
前記化学式（１）で表されるヌクレオシド誘導体が、下記化学式（４）で表されるヌクレオシド誘導体である、付記１から７のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記９）
付記１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの合成試薬。
（付記１０）
付記１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの製造方法。
（付記１１）
付記１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
（付記１２）
前記ポリヌクレオチドが、ターゲットに結合する結合核酸分子である、付記１１記載のポリヌクレオチド。
（付記１３）
前記ターゲットが、分泌型免疫グロブリンＡ、アミラーゼ、β−ディフェンシン４Ａ、リゾチーム、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、およびインターロイキン（ＩＬ）−６からなる群から選択された少なくとも一つである、付記１２記載のポリヌクレオチド。
（付記１４）
候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および
前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、
前記候補ポリヌクレオチドが、付記１１から１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする、結合核酸分子の製造方法。
（付記１５）
前記ターゲットが、分泌型免疫グロブリンＡ、アミラーゼ、β−ディフェンシン４Ａ、リゾチーム、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、およびインターロイキン（ＩＬ）−６からなる群から選択された少なくとも一つである、付記１４記載の製造方法。
（付記１６）
下記（ａ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、α−アミラーゼ結合核酸分子。
（ａ）下記（ａ１）のポリヌクレオチド
（ａ１）配列番号１および１１〜１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記１７）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記１６記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
（付記１８）
前記修飾塩基が、プリン塩基が修飾基で修飾された修飾プリン塩基である、付記１７記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
（付記１９）
前記修飾基が、アデニン残基である、付記１８記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
（付記２０）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記１６から１９のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
（付記２１）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα−アミラーゼを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記１６から２０のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα−アミラーゼを検出することを特徴とする、α−アミラーゼの分析方法。
（付記２２）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記２１記載のα−アミラーゼの分析方法。
（付記２３）
下記（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、β−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ結合核酸分子。
（ｂ）下記（ｂ１）のポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号４〜６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記２４）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記２３記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記２５）
前記修飾塩基が、プリン塩基が修飾基で修飾された修飾プリン塩基である、付記２４記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記２６）
前記修飾基が、アデニン残基である、付記２５記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記２７）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記２３から２６のいずれか一項に記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記２８）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記２３から２７のいずれか一項に記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＢＤＮ４Ａと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＢＤＮ４Ａを検出することを特徴とする、ＢＤＮ４Ａの分析方法。
（付記２９）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記２８記載のＢＤＮ４Ａの分析方法。
（付記３０）
下記（ｌ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、リゾチーム結合核酸分子。
（ｌ）下記（ｌ１）のポリヌクレオチド
（ｌ１）配列番号７〜９のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記３１）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記３０記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記３２）
前記修飾塩基が、プリン塩基が修飾基で修飾された修飾プリン塩基である、付記３１記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記３３）
前記修飾基が、アデニン残基である、付記３２記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記３４）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記３０から３３のいずれか一項に記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記３５）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のリゾチームを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記３０から３４のいずれか一項に記載のリゾチーム結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のリゾチームと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のリゾチームを検出することを特徴とする、リゾチームの分析方法。
（付記３６）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記３５記載のリゾチームの分析方法。
（付記３７）
下記（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５結合核酸分子。
（ｄ）下記（ｄ１）のポリヌクレオチド
（ｄ１）配列番号１７〜２０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記３８）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記３７記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記３９）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである、付記３８記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記４０）
前記修飾基が、アデニン残基である、付記３９記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記４１）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記３７から４０のいずれか一項に記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記４２）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記３７から４１のいずれか一項に記載のＬＤＨ５結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＬＤＨ５と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＬＤＨ５を検出することを特徴とする、ＬＤＨ５の分析方法。
（付記４３）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記４２記載のＬＤＨ５の分析方法。
（付記４４）
下記（ｉ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、インターロイキン（ＩＬ）−６結合核酸分子。
（ｉ）下記（ｉ１）のポリヌクレオチド
（ｉ１）配列番号２１〜２２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記４５）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記４４記載のＩＬ−６結合核酸分子。
（付記４６）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである、付記４５記載のＩＬ−６結合核酸分子。
（付記４７）
前記修飾基が、アデニン残基である、付記４６記載のＩＬ−６結合核酸分子。
（付記４８）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記４４から４７のいずれか一項に記載のＩＬ−６結合核酸分子。
（付記４９）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のインターロイキン（ＩＬ）−６を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記４４から４８のいずれか一項に記載のＩＬ−６結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＩＬ−６と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＩＬ−６を検出することを特徴とする、ＩＬ−６の分析方法。
（付記５０）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記４９記載のＩＬ−６の分析方法。
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない
（付記１）
下記化学式（１）で表されることを特徴とする、ヌクレオシド誘導体またはその塩。
Ｓｕは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和または不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、イミノ基（−ＮＲ１−）、エーテル基（−Ｏ−）、またはチオエーテル基（−Ｓ−）であり、
Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数２〜１０の炭化水素基である。
（付記２）
Ｘ１が、イミノ基（−ＮＲ１−）である、付記１記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記３）
Ｘ２が、イミノ基（−ＮＲ１−）である、付記１または２記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記４）
Ｒ１が、水素原子である、付記２または３記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記５）
Ｌ１が、ビニレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）である、付記１から４のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記６）
Ｌ２が、エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）である、付記１から５のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
（付記７）
前記ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団または前記ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団が、下記化学式（２）で表される、付記１から６のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
Ｒ２は、水素原子、保護基、または下記化学式（３）で表される基であり、
Ｒ３は、水素原子、保護基、またはホスホロアミダイト基であり、
Ｒ４は、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｚは、ヒドロキシル基またはイミダゾール基であり、
ｍは、１〜１０の整数である。
（付記８）
前記化学式（１）で表されるヌクレオシド誘導体が、下記化学式（４）で表されるヌクレオシド誘導体である、付記１から７のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
付記１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの合成試薬。
（付記１０）
付記１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの製造方法。
（付記１１）
付記１から８のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
（付記１２）
前記ポリヌクレオチドが、ターゲットに結合する結合核酸分子である、付記１１記載のポリヌクレオチド。
（付記１３）
前記ターゲットが、分泌型免疫グロブリンＡ、アミラーゼ、β−ディフェンシン４Ａ、リゾチーム、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、およびインターロイキン（ＩＬ）−６からなる群から選択された少なくとも一つである、付記１２記載のポリヌクレオチド。
（付記１４）
候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および
前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、
前記候補ポリヌクレオチドが、付記１１から１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする、結合核酸分子の製造方法。
（付記１５）
前記ターゲットが、分泌型免疫グロブリンＡ、アミラーゼ、β−ディフェンシン４Ａ、リゾチーム、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、およびインターロイキン（ＩＬ）−６からなる群から選択された少なくとも一つである、付記１４記載の製造方法。
（付記１６）
下記（ａ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、α−アミラーゼ結合核酸分子。
（ａ）下記（ａ１）のポリヌクレオチド
（ａ１）配列番号１および１１〜１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記１７）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記１６記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
（付記１８）
前記修飾塩基が、プリン塩基が修飾基で修飾された修飾プリン塩基である、付記１７記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
（付記１９）
前記修飾基が、アデニン残基である、付記１８記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
（付記２０）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記１６から１９のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
（付記２１）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα−アミラーゼを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記１６から２０のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα−アミラーゼを検出することを特徴とする、α−アミラーゼの分析方法。
（付記２２）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記２１記載のα−アミラーゼの分析方法。
（付記２３）
下記（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、β−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａ結合核酸分子。
（ｂ）下記（ｂ１）のポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号４〜６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記２４）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記２３記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記２５）
前記修飾塩基が、プリン塩基が修飾基で修飾された修飾プリン塩基である、付記２４記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記２６）
前記修飾基が、アデニン残基である、付記２５記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記２７）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記２３から２６のいずれか一項に記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子。
（付記２８）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のβ−ディフェンシン（ＢＤＮ）４Ａを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記２３から２７のいずれか一項に記載のＢＤＮ４Ａ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＢＤＮ４Ａと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＢＤＮ４Ａを検出することを特徴とする、ＢＤＮ４Ａの分析方法。
（付記２９）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記２８記載のＢＤＮ４Ａの分析方法。
（付記３０）
下記（ｌ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、リゾチーム結合核酸分子。
（ｌ）下記（ｌ１）のポリヌクレオチド
（ｌ１）配列番号７〜９のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記３１）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記３０記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記３２）
前記修飾塩基が、プリン塩基が修飾基で修飾された修飾プリン塩基である、付記３１記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記３３）
前記修飾基が、アデニン残基である、付記３２記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記３４）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記３０から３３のいずれか一項に記載のリゾチーム結合核酸分子。
（付記３５）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のリゾチームを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記３０から３４のいずれか一項に記載のリゾチーム結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のリゾチームと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のリゾチームを検出することを特徴とする、リゾチームの分析方法。
（付記３６）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記３５記載のリゾチームの分析方法。
（付記３７）
下記（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５結合核酸分子。
（ｄ）下記（ｄ１）のポリヌクレオチド
（ｄ１）配列番号１７〜２０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記３８）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記３７記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記３９）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである、付記３８記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記４０）
前記修飾基が、アデニン残基である、付記３９記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記４１）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記３７から４０のいずれか一項に記載のＬＤＨ５結合核酸分子。
（付記４２）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記３７から４１のいずれか一項に記載のＬＤＨ５結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＬＤＨ５と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＬＤＨ５を検出することを特徴とする、ＬＤＨ５の分析方法。
（付記４３）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記４２記載のＬＤＨ５の分析方法。
（付記４４）
下記（ｉ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、インターロイキン（ＩＬ）−６結合核酸分子。
（ｉ）下記（ｉ１）のポリヌクレオチド
（ｉ１）配列番号２１〜２２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（付記４５）
前記核酸分子は、塩基が修飾された修飾塩基を含む、付記４４記載のＩＬ−６結合核酸分子。
（付記４６）
前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである、付記４５記載のＩＬ−６結合核酸分子。
（付記４７）
前記修飾基が、アデニン残基である、付記４６記載のＩＬ−６結合核酸分子。
（付記４８）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記４４から４７のいずれか一項に記載のＩＬ−６結合核酸分子。
（付記４９）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のインターロイキン（ＩＬ）−６を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記４４から４８のいずれか一項に記載のＩＬ−６結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＩＬ−６と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＩＬ−６を検出することを特徴とする、ＩＬ−６の分析方法。
（付記５０）
前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、付記４９記載のＩＬ−６の分析方法。
本発明によれば、新たなヌクレオシド誘導体またはその塩を提供できる。また、本発明のヌクレオシド誘導体は、プリン環様の構造を２つ含む。このため、本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、分子内または分子間で相互作用可能な原子の数が、プリン環様の構造を１つ含むヌクレオシド誘導体より相対的に多い。このため、本発明のヌクレオシド誘導体を含む結合核酸分子は、例えば、プリン環様の構造を１つ含むヌクレオシド誘導体と比較して、ターゲットに対する結合能が向上する。このため、本発明のヌクレオシド誘導体によれば、例えば、ターゲットに対し優れた結合能を示す結合核酸分子を製造できる。したがって、本発明は、例えば、分析分野、医療分野、ライフサイエンス分野等の分野において、極めて有用である。
Claims (6)
- 下記化学式（４）で表されることを特徴とする、ヌクレオシド誘導体またはその塩。
- 請求項１記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの合成試薬。
- 請求項１記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの製造方法。
- 請求項１記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
- 候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および
前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、
前記候補ポリヌクレオチドが、請求項４記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする、結合核酸分子の製造方法。 - 前記ターゲットが、β−ディフェンシン４Ａを含む、請求項５記載の製造方法。
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