CN116529604A - 心血管事件风险预测 - Google Patents

Abstract

提供了用于评定患有射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)或患有射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)的个体以预测在90天、180天或1年时间段内发生心血管(CV)事件的风险的生物标志物、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。

Description

心血管事件风险预测

发明领域

本申请总体涉及生物标志物的检测以及一种评估患有慢性心力衰竭的个体体内未来心血管事件的风险的方法，并且更具体地涉及用于评定个体以预测发生心血管(CV)事件的风险的一种或多种生物标志物、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。此类事件包括但不限于住院治疗和死亡。

背景技术

心血管疾病是美国的死亡主因。存在原发性事件(D’Agostino,R等人，―GeneralCardiovascular Risk Profile for Use in Primary Care:The Framingham HeartStudy”Circulation 117:743-53(2008)；以及Ridker,P.等人，―Development andValidation of Improved Algorithms for the Assessment of Global CardiovascularRisk in Women”JAMA 297(6):611-619(2007))以及继发性事件(Shlipak,M.等人，―Biomarkers to Predict Recurrent Cardiovascular Disease:The Heart&Soul Study”Am.J.Med.121:50-57(2008))风险的许多现有和重要的预测物，所述预测物广泛用于临床实践和治疗试验中。不幸的是，接受者操作特征曲线、危险比和一致性显示出现有风险因素和生物标志物的表现是适度的(约0.75的AUC表示这些因素的表现仅介于抛硬币与无比精确中间)。除了提高诊断性能的需求之外，还需要在个体内对有益(和破坏性)干预和生活方式改变作出近期和个人反应的风险产品。常用的Framingham方程具有三个主要问题。首先，它的期限太长：它给出了10年风险计算，但人类并不重视未来风险，并且不愿意基于这些未来风险而作出行为和生活方式改变。其次，它对干预反应不大：它最主要取决于实足年龄(其无法降低)；以及性别(其无法改变)。第三，在此处设想的高风险群体内，Framingham因素无法很好地区分高风险和低风险：高四分位数与低四分位数之间的危险比仅为2，并且当人们试图使用Framingham评分来通过将受试者分层为更细化的层(例如，十分位数)而使风险个性化时，观察到的事件率对于许多十分位数而言是类似的。

心血管疾病的风险因素广泛用于推进医学治疗的强度和性质，并且它们的使用无疑已经促成了在过去二十年内已经观察到的心血管发病率和死亡率的降低。这些因素常规上已经被组合到算法中，但不幸的是，它们并未捕捉到所有风险(心脏病的最常见的首发症状仍是死亡)。事实上，它们可能仅捕捉到一半风险。在一级预防中，约0.76的ROC曲线下面积对于此类风险因素是典型的，而在二级预防中表现更为糟糕(典型为0.62)，数值仅为抛硬币的0.5与无比精确的1.0之间的约四分之一到一半的表现。

此外，在有3209个人的Framingham研究(Wang等人，―Multiple Biomarkers forthe Prediction of First Major Cardiovascular Events and Death”N.Eng.J.Med.355:2631-2637(2006))中，添加10种生物标志物(CRP、BNP、NT-BNP前体、醛固酮、肾素、纤维蛋白原、D-二聚体、1型纤溶酶原激活剂抑制物、高半胱氨酸和尿白蛋白与肌酐比)在加上现有风险因素时并未显著地改进AUC：在年龄、性别和常规风险因素下，0至5年事件的AUC为0.76，并且将生物标志物的最佳组合添加到混合物的情况下为0.77，并且在二级预防中，情况更为糟糕。

对在1年窗口内具有心血管事件的较高风险的患者的早期鉴别是重要的，因为对具有升高风险的个体的更积极的治疗可改进结果。因此，最佳管理需要积极干预以降低被视为具有较高风险的那些患者体内发生心血管事件的风险，而具有心血管事件的较低风险的患者可接受备用的昂贵的且潜在具有侵害性的治疗，所述治疗对患者而言可能不具有有益效果。

用于预测在限定的时间段内具有特定疾病状态或疾患的风险的生物标志物选择涉及首先鉴别用于特定医学应用的标志物，所述标志物与事件的概率和/或时机具有可测量且统计上显著的关系。生物标志物可包括分泌或脱落的分子，所述分子处于所关注的疾患的因果关系中，或者处于疾病或疾患发展或进展的下游阶段或与疾病或疾患发展或进展并行，或者两者兼有。所述分子响应于容易发生心血管事件的生物过程而释放到来自心血管组织或来自其他器官以及周围组织和循环细胞的血流中，或者它们可反映病理生理学的下游效应，诸如肾功能的下降。生物标志物可包括小分子、肽、蛋白质和核酸。影响生物标志物的鉴别的一些关键问题包括可用数据的过拟合和数据的偏差。

各种方法已经被用于鉴别生物标志物和诊断或预测具有疾病或疾患的风险的尝试中。对于基于蛋白质的标志物，这些方法包括双向电泳、质谱法和免疫测定方法。对于核酸标志物，这些方法包括mRNA表达谱、微小RNA谱、FISH、基因表达系列分析(SAGE)、大规模基因表达阵列、基因测序和基因分型(SNP或小变体分析)。

双向电泳的效用受限于低检测灵敏度；关于蛋白质溶解度、电荷和疏水性的问题；凝胶再现性；以及单个斑点代表多种蛋白质的可能性。对于质谱法，取决于所使用的形式，局限性围绕样品处理和分离、对低丰度蛋白质的灵敏度、信噪比考虑因素和立即鉴别检测到的蛋白质的无能性展开。关于生物标志物发现的免疫测定方法的局限性集中于基于抗体的多重测定法测量大量分析物的无能性。人们可能简单地印刷高质量抗体的阵列，并且在没有夹心的情况下测量结合到这些抗体的分析物。(这将是使用核酸序列的全基因组来通过杂交测量生物体或细胞中的所有DNA或RNA序列的等效形式。由于杂交可为针对同一性的严格测试，因此杂交实验发挥了作用。)然而，即使非常良好的抗体在选择其结合配偶体时通常也不够严格以在血液或甚至细胞提取物的背景下发挥作用，因为在这些基质中的蛋白质集合具有非常不同的丰度，这可能会导致较差的信噪比。因此，人们必须使用与关于生物标志物发现的基于免疫测定的方法不同的方法-人们将需要使用多重ELISA测定(即，夹心)以获得足够的严格性来同时测量许多分析物，以决定哪些分析物确实是生物标志物。夹心免疫测定法无法按比例扩展到高含量，并且因此使用严格的夹心免疫测定法的生物标志物发现使用标准阵列形式是不可行的。最后，抗体试剂具有大量批次可变性和试剂不稳定性的缺点。用于蛋白质生物标志物发现的即时平台克服了这个问题。

这些方法中的许多方法依赖或要求在分析之前进行一些类型的样品分级。因此，进行足够有力的研究所需的样品制备是非常困难、昂贵和耗时的，所述研究被设计成鉴别和发现在一系列明确定义的样品群体中的统计上相关的生物标志物。在分级期间，各种各样的可变性可被引入各种样品中。例如，潜在标志物对于过程可能是不稳定的，标志物的浓度可能会变化，可能会发生不当的聚集或崩解，并且可能会发生非故意的样品污染，并且因此使得在早期疾病中预料的微妙变化变得模糊。

广泛认可的是，使用这些技术的生物标志物发现和检测方法具有关于鉴别诊断性或预测性生物标志物的严重局限性。这些局限性包括检测低丰度生物标志物的无能性、一致地覆盖蛋白质组的整个动态范围的无能性、样品处理和分级的不可再现性，以及方法的总体不可再现性和稳健性的缺乏。另外，这些研究已经将偏差引入数据中，并且无法充分解决样品群体的在鉴别和校验目标疾病群体内的生物标志物所需的分布和随机化方面的复杂性，包括适当控制。

尽管旨在于发现新型有效生物标志物的努力已经持续了数十年，但努力在很大程度上是不成功的。针对各种疾病的生物标志物通常已经在科研实验室中加以鉴别，通常通过在对一些疾病过程进行基础研究时的意外发现来鉴别。基于发现并利用少量临床数据，公布了提出新的生物标志物鉴别的论文。然而，这些提议的生物标志物中的大多数仍未被证实为真正或有用的生物标志物，主要是因为所测试的少量临床样品仅提供事实上已经发现有效生物标志物的薄弱统计证据。也就是说，初始鉴别相对于统计学的基本要素是不严谨的。

基于失败的生物标志物发现努力的历史，已经提出进一步促进一般理解的理论：用于诊断、预后或预测发生疾病和疾患的风险的生物标志物是罕见和难以发现的。基于2D凝胶或质谱法的生物标志物研究支持这些概念。极少有用的生物标志物已经通过这些方法加以鉴别。然而，通常被忽略的是，2D凝胶和质谱法测量以约1nM及更高的浓度存在于血液中的蛋白质，并且这个蛋白质集合很可能是最不可能随着疾病或特定疾患的发展而改变的集合。除即时生物标志物发现平台之外，不存在蛋白质组学生物标志物发现平台，所述生物标志物发现平台能够在低得多的浓度下精确地测量蛋白质表达水平。

关于复杂的人类生物学的生物化学途径了解到很多知识。许多生物化学途径结束或开始于分泌的蛋白质，所述分泌的蛋白质在病变内局部发挥作用；例如，分泌生长因子以刺激病变中的其他细胞的复制，并且分泌其他因子以避开免疫系统等等。虽然这些分泌的蛋白质中的许多分泌的蛋白质以旁分泌形式发挥作用，但一些分泌的蛋白质在身体内远距离地起作用。对生物化学途径具有基本理解的本领域技术人员将理解，许多病变特定蛋白质必然会以低于(甚至远低于)2D凝胶和质谱法的检测极限的浓度存在于血液中。必定会领先于这种相对大量的疾病生物标志物鉴别的是蛋白质组学平台，所述蛋白质组学平台可分析浓度低于可通过2D凝胶或质谱法检测的那些浓度的蛋白质。

慢性心力衰竭(也称为充血性心力衰竭(CHF))在心脏无法泵送足够的血液和氧气来支持其他器官的正常功能时发生，并且是65岁以上个体住院治疗的最常见的病因。通过超声心动图测量的左心室射血分数(LVEF)显示了每次心脏收缩时左心室泵出的血液量。基于射血分数(EF)水平，HF可分类为射血分数降低的HF，HFrEF(LVEF<40％)；射血分数保留的HF，HFpEF(LVEF≥50％)；以及射血分数中间范围的HF，HFmrEF(LVEF为40％至49％)。

如上文所讨论，如果可准确地确定此类事件的倾向性，则可通过积极治疗来预防心血管事件，并且通过将此类干预的目标群体锁定在最需要此类干预的人身上和/或对最不需要此类干预的人解除锁定，可提高医疗资源分配效率并且同时可降低成本。另外地，当患者了解到与其心血管事件的个人可能性有关的准确的近期信息时，这比基于群体的长期信息更不容易否认，并且会带来改善的生活方式选择和提高的用药依从性，这会增加益处。现有的多标志物测试需要从个体收集多个样品或需要在多个测定之间分割样品。最优地，改进的测试将仅需要单一的血液、尿液或其他样品类型和单一的测定。因此，需要能够预测1年时间段内的心血管事件的生物标志物、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。

发明内容

本申请包括用于预测患有慢性心力衰竭(诸如稳定型慢性心力衰竭)的个体在90天时间段、180天时间段或1年时间段内具有心血管(CV)事件的风险的生物标志物、方法、试剂、装置、系统和试剂盒。本申请的生物标志物是使用本文详细描述的基于慢解离率适体的多重测定法来鉴别。通过使用本文所述的基于慢解离率适体的多重生物标志物鉴别方法，本申请描述了一组生物标志物，所述一组生物标志物可用于预测患有慢性心力衰竭(诸如稳定型慢性心力衰竭)的患者在90天、180天或1年内发生CV事件的可能性。

在一些实施方案中，所述个体患有射血分数保留的稳定型慢性心力衰竭(HFpEF)。在一些实施方案中，所述个体具有降低的射血分数(HFrEF)。在一些实施方案中，预测所述个体的1年死亡率预后。

心血管疾病涉及多个生物过程和组织。与心血管疾病相关联的生物系统和过程的实例是炎症、血栓形成、与疾病相关联的血管生成、血小板活化、巨噬细胞活化、肝脏急性反应、细胞外基质重塑和肾功能。这些过程可依据性别、绝经后状态和年龄，并根据凝血状态和血管功能来观察。由于这些系统部分地通过基于蛋白质的信号传递系统进行通信，并且可在单一血液样品中测量多种蛋白质，因此本发明提供了聚焦于来自慢性心力衰竭中所涉及的特定生物系统和过程的蛋白质的基于单一样品、单一测定、多种蛋白质的测试。

在一些实施方案中，提供了用于为受试者筛选心血管事件(CV)事件的风险的方法，所述方法包括：形成具有N种生物标志物蛋白质的生物标志物组；以及检测来自所述受试者的样品中所述N种生物标志物蛋白质中的每一者的水平，其中N至少为2，并且其中a)所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者选自HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1和ATL2；或b)所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1和ATL2，并且所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自N端BNP前体、RSPO4、BNP、MIC-1、FABPA、ILRL1、ANGP2、HE4、TAGL、RNAS1和TSP2。

在一些实施方案中，提供了预测受试者将具有CV事件的可能性的方法，所述方法包括：形成具有N种生物标志物蛋白质的生物标志物组；以及检测来自所述受试者的样品中所述N种生物标志物蛋白质中的每一者的水平，其中N至少为2，并且其中a)所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者选自HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1和ATL2；或b)所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1和ATL2，并且所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自N端BNP前体、RSPO4、BNP、MIC-1、FABPA、ILRL1、ANGP2、HE4、TAGL、RNAS1和TSP2。

在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是RNAS6和PAP1。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是RNAS6和ATL2。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是HCC-1和PAP1。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是HCC-1和ATL2。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是HCC-1和RNAS6。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是PAP1和SVEP1。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是HCC-1和SVEP1。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是RNAS6和SVEP1。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是PAP1和ATL2。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质全部选自HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1、ATL2、N端BNP前体、RSPO4、BNP、MIC-1、FABPA、ILRL1、ANGP2、HE4、TAGL、RNAS1和TSP2。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是MIC-1。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是RNAS1。在任何前述实施方案中，N为2，N为3，N为4，N为5，N为6，N为7，N为8，N为9，N为10，N为11，N为12，N为13，N为14，N为15，或N为16。在一些实施方案中，所述受试者患有射血分数降低的心力衰竭。在一些实施方案中，提供了为受试者预测/筛选心血管事件(CV)事件的风险的方法，所述方法包括：形成具有N种生物标志物蛋白质的生物标志物组；以及检测来自所述受试者的样品中所述N种生物标志物蛋白质中的每一者的水平，其中N至少为2，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自RET和CRDL1，并且所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自四连接素、N端BNP前体、TNNT2、CA125、MIC-1、SLPI、HE4、MMP-12、HSPB6、WISP-2、GHR和IGFBP-2。

在一些实施方案中，提供了预测受试者将具有CV事件的可能性的方法，所述方法包括：形成具有N种生物标志物蛋白质的生物标志物组；以及检测来自所述受试者的样品中所述N种生物标志物蛋白质中的每一者的水平，其中N至少为2，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自RET和CRDL1，并且所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自四连接素、N端BNP前体、TNNT2、CA125、MIC-1、SLPI、HE4、MMP-12、HSPB6、WISP-2、GHR和IGFBP-2。

在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是RET和CRDL1。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是MIC-1。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是HE4。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是四连接素。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是GHR。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是CA125。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是N端BNP前体。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是IGFBP-2。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是WISP-2。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是TNNT2。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是HSPB6。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是SLPI。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质中的一者是MMP-12。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质全部选自RET、CRDL1、四连接素、N端BNP前体、TNNT2、CA125、MIC-1、SLPI、HE4、MMP-12、HSPB6、WISP-2、GHR和IGFBP-2。在任何前述修改中，N为2，N为3，N为4，N为5，N为6，N为7，N为8，N为9，N为10，N为11，N为12，N为13，或N为14。在一些实施方案中，所述受试者患有射血分数保留的心力衰竭。

在各种实施方案中，所述CV事件是死亡。

在一些实施方案中，筛选或预测所述受试者在从所述受试者取得所述样品的日子算起的1年内具有CV事件的风险或可能性。在一些实施方案中，筛选或预测所述受试者在从所述受试者取得所述样品的所述日子算起的180天内具有CV事件的所述风险或可能性。在一些实施方案中，筛选或预测所述受试者在从所述受试者取得所述样品的所述日子算起的90天内具有CV事件的所述风险或可能性。在一些实施方案中，如果所述N种生物标志物蛋白质中至少2种的每一者的水平相对于相应生物标志物蛋白质的对照水平是异常的，则所述受试者在从所述受试者取得所述样品的所述日子算起的1年、180天或90天内具有CV的所述风险或可能性是高的。在一些实施方案中，如果所述N种生物标志物蛋白质中的每一者的所述水平相对于相应生物标志物蛋白质的对照水平是异常的，则所述受试者在从所述受试者取得所述样品的所述日子算起的1年、180天或90天内具有CV的所述风险或可能性是高的。在一些实施方案中，所述受试者在从所述受试者取得所述样品的所述日子算起的1年、180天或90天内具有CV事件的所述风险或可能性被计算为从所述受试者取得所述样品的所述日子算起存活1年、180天或90天的概率。

在一些实施方案中，所述样品选自血液样品、血清样品、血浆样品和尿液样品。在一些实施方案中，所述样品是血液样品。在一些实施方案中，所述方法是在体外执行。

在一些实施方案中，所述方法包括使来自所述受试者的所述样品的生物标志物蛋白质与一组捕获试剂接触，其中所述一组捕获试剂中的每种捕获试剂特异性结合到正被检测的一种生物标志物蛋白质。在一些实施方案中，所述捕获试剂中的两者结合到正被检测的相同的生物标志物蛋白质。在一些实施方案中，两种捕获试剂特异性结合到SVEP1，并且其中所述两种捕获试剂是包含不同序列的适体。在一些实施方案中，所述方法包括使来自所述受试者的所述样品的生物标志物蛋白质与一组捕获试剂接触，其中所述一组捕获试剂中的每种捕获试剂特异性结合到正被检测的不同的生物标志物蛋白质。在一些实施方案中，每种捕获试剂是抗体或适体。在一些实施方案中，每种生物标志物捕获试剂是适体。在一些实施方案中，至少一种适体是慢解离率适体。在一些实施方案中，至少一种慢解离率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、或至少10个具有修饰的核苷酸。在一些实施方案中，每种慢解离率适体以≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的解离率(t1/2)结合到其靶蛋白。

在一些实施方案中，CV事件的所述风险或可能性是基于检测到的生物标志物水平和选自以下项的至少一项额外生物医学信息：a)对应于所述受试者的身体描述词的信息，b)对应于所述受试者的体重变化的信息，c)对应于所述受试者的种族的信息，d)对应于所述受试者的性别的信息，e)对应于所述受试者的吸烟史的信息，f)对应于所述受试者的饮酒史的信息，g)对应于所述受试者的职业史的信息，h)对应于所述受试者的心血管疾病或其他循环系统疾患的家族史的信息，i)对应于所述受试者体内至少一种遗传标志物的存在或不存在的信息，所述至少一种遗传标志物与所述受试者或所述受试者的家族成员体内的心血管疾病的较高风险相关联，j)对应于所述受试者的临床症状的信息，k)对应于其他实验室测试的信息，l)对应于所述受试者的基因表达值的信息，以及m)对应于所述受试者对已知心血管风险因素，诸如高饱和脂肪、高盐、高胆固醇的饮食的占有性的信息，n)对应于所述受试者的通过选自由以下项组成的组的技术获得的成像结果的信息：心电图、超声心动图、针对内膜中层厚度的颈动脉超声、血流介导的扩张、脉搏波速度、踝臂指数、负荷超声心动图、心肌灌注成像、CT冠状动脉钙化、高分辨率CT血管造影术、MRI成像和其他成像模态，o)关于所述受试者的用药的信息，p)对应于所述受试者的年龄的信息，以及q)关于所述受试者的肾功能的信息。

在一些实施方案中，所述至少一项额外生物医学信息是对应于所述受试者的所述年龄的信息。在一些实施方案中，所述方法包括出于确定医疗保险费或人寿保险费的目的而确定CV事件的所述风险或可能性。在一些实施方案中，所述方法还包括确定医疗保险或人寿保险的承保范围或保费。在一些实施方案中，所述方法还包括使用来源于所述方法的信息来预测和/或管理医疗资源的利用。在一些实施方案中，所述方法还包括使用来源于所述方法的信息来作出获取或购买医疗实践、医院或公司的决策。

在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括N种生物标志物蛋白质捕获试剂，其中N至少为2，并且其中所述捕获试剂中的至少一者结合到HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1或ATL2，并且所述捕获试剂中的至少一者结合到N端BNP前体、RSPO4、BNP、MIC-1、FABPA、ILRL1、ANGP2、HE4、TAGL、RNAS1或TSP2。在一些实施方案中，所述捕获试剂中的两者结合到SVEP1，并且其余捕获试剂中的每一者结合到选自HCC-1、RNAS6、PAP1、ATL2、N端BNP前体、RSPO4、BNP、MIC-1、FABPA、ILRL1、ANGP2、HE4、TAGL、RNAS1和TSP2的不同蛋白质。在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括N种生物标志物蛋白质捕获试剂，其中N至少为2，并且其中所述捕获试剂中的至少一者结合到RET或CRDL1，并且所述捕获试剂中的至少一者结合到四连接素、N端BNP前体、TNNT2、CA125、MIC-1、SLPI、HE4、MMP-12、HSPB6、WISP-2、GHR或IGFBP-2。在一些实施方案中，每种捕获试剂结合到不同的生物标志物蛋白质。在一些实施方案中，N为2，N为3，N为4，N为5，N为6，N为7，N为8，N为9，N为10，N为11，N为12，N为13，N为14，N为15，N为16，或N为17。在一些实施方案中，N为2，N为3，或N为4，或N为5，或N为6，或N为7，或N为8，或N为9，或N为10，或N为11，或N为12，或N为13，或N为14。

在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质捕获试剂中的每一者特异性结合到选自表1的生物标志物蛋白质。在一些实施方案中，所述N种生物标志物蛋白质捕获试剂中的每一者特异性结合到选自表2的生物标志物蛋白质。在一些实施方案中，所述N种生物标志物捕获试剂中的每一者是抗体或适体。在一些实施方案中，每种生物标志物捕获试剂是适体。在一些实施方案中，至少一种适体是慢解离率适体。在一些实施方案中，至少一种慢解离率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、或至少10个具有修饰的核苷酸。在一些实施方案中，其中每种慢解离率适体以≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的解离率(t1/2)结合到其靶蛋白。在一些实施方案中，所述试剂盒用于检测来自受试者的样品中的所述N种生物标志物蛋白质。在一些实施方案中，所述试剂盒用于确定所述受试者在从所述受试者取得所述样品的日子算起的1年内经历CV事件的风险或可能性，其中所述受试者患有心力衰竭。在一些实施方案中，所述CV事件是死亡。在一些实施方案中，所述受试者患有射血分数降低的心力衰竭。在一些实施方案中，所述受试者患有射血分数保留的心力衰竭。

附图说明

图1示出了HFrEF模型的训练数据集的观察到的Kaplan-Meier存活概率，其中个体按365天内的预测事件概率分为多个四分位数。第1至第4四分位数用最上面的线(四分位数1)、下面的第二条线(四分位数2)、下面的第三条线(四分位数3)和最下面的线(四分位数4)进行描述。

图2A至图2B示出了HFrEF模型的校验数据集的每个四分位数的Kaplan-Meier存活曲线。图2B中的阴影区域表示Kaplan-Meier估计的95％置信区间。

图3示出了HFpEF模型的训练数据集的观察到的Kaplan-Meier存活概率，其中个体按365天内的预测事件概率分为多个四分位数。第1至第4四分位数用最上面的线(四分位数1)、下面的第二条线(四分位数2)、下面的第三条线(四分位数3)和最下面的线(四分位数4)进行描述。阴影区域表示Kaplan-Meier估计的95％置信区间。

图4示出了HFpEF模型的校验数据集的每个四分位数的Kaplan-Meier存活曲线。阴影区域表示Kaplan-Meier估计的95％置信区间。

图5示出了用于与本文描述的各种计算机实现的方法一起使用的非限制性示例性计算机系统。

图6示出了可用于检测生物样品中的一种或多种生物标志物的非限制性示例性适体测定法。

图7至图9示出了可并入适体(诸如慢解离率适体)中的某些示例性经修饰的嘧啶。

具体实施方式

虽然将结合某些代表性实施方案来描述本发明，但将理解，本发明由权利要求限定，并且不限于这些实施方案。

本领域技术人员将认识到，在本发明的实践中可使用与本文描述的那些类似或等同的许多方法和材料。本发明决不限于所描述的方法和材料。

除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。尽管在本发明的实践中可使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法、装置和材料，但本文描述了某些方法、装置和材料。

本文中引用的所有出版物、公开专利文件和专利申请特此以引用的方式并入，其程度如同每个单独出版物、公开专利文件或专利申请被具体地和单独地指出是以引用的方式并入那样。

如本文所使用，术语―包含(comprises、comprising)”、―包括(includes、including)”、―含有(contains、containing)”及其任何变型意图覆盖非排他性的包含，使得包含、包括或含有元素或元素列表的过程、方法、过程限定产品或物质组合可包括未明确列出的其他元素。

本申请包括用于预测在限定的时间段内(诸如在90天、180天或1年内)发生近期CV事件的风险的生物标志物、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。

如本文所使用，―心血管事件”或―CV事件”广泛地涵盖患有慢性心力衰竭的受试者的中风、短暂性脑缺血发作(TIA)、心肌梗塞(MI)、死亡和/或因心力衰竭而住院治疗。在一些实施方案中，―心血管事件”是因心力衰竭而住院治疗、或死亡。在一些实施方案中，―心血管事件”是因心力衰竭而住院治疗。在一些实施方案中，―心血管事件”是死亡。

如本文所使用，术语―心力衰竭”或―HF”是指由心室血液充盈或射血的任何结构或功能损伤引起的复杂的临床综合征。HF的典型表现是呼吸困难和疲劳，这可能会限制运动耐力和体液潴留，并且可能会导致肺充血和/或内脏充血和/或外周性水肿。HF的临床综合征可能由心包、心肌、心内膜、心脏瓣膜或大血管的疾病或者某些代谢异常引起。许多患有HF的患者因左心室(LV)心肌功能受损而出现症状。(Yancy等人，2013ACCF/AHAguideline for the management of heart failure:A report of the Americancollege of cardiology foundation/American heart association task force onpractice guidelines.J Amer College Cardiol,62(16),e147-e239.(2013).)如本文所使用，除非另外指示，否则术语―慢性心力衰竭”或―CHF”是指稳定型慢性心力衰竭。

如本文所使用，术语―射血分数”或―EF”是指每次收缩时从心脏泵送的流出血液的分数(百分比)。它通常通过超声心动图来测量，并且用作受试者心脏功能的一般量度。它可被测量为每次收缩时从心脏左心室泵出的血液量。它也可被测量为从心脏右心室泵出到肺部的血液量。如本文所使用，除非另外指示，否则术语―射血分数”或―EF”是指左心室射血分数。射血分数为50％或更高的患者被分类为患有―射血分数保留的心力衰竭”(HFpEF)，并且射血分数为40％的患者和射血分数低于40％的患者被分类为患有―射血分数降低的心力衰竭”(HFrEF)。(Ponikowski P、Voors A、Anker S等人，2016ESC Guidelinesfor the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure.Eur JHeart Fail.2016；37:2129-200.)

在一些实施方案中，提供了用于单独地或以各种组合使用来评估在1年时间段内发生未来CV事件的风险或可能性的生物标志物，其中CV事件被定义为因心力衰竭而住院治疗、或死亡。如下文详细描述的，示例性实施方案包括表1或表2中提供的生物标志物。

虽然某些描述的CV事件生物标志物可能能够单独地用于评估CV事件的风险或可能性，但本文还描述了用于对CV事件生物标志物的多个子集进行分组的方法，其中每个分组或子集选择可用作两种或更多种生物标志物的组，在本文中可互换地称为―生物标志物组”和组。在一些实施方案中，CV事件是死亡。因此，各种实施方案提供了包括表1中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种或所有十六种生物标志物的组合。其他不同的实施方案提供了包括表2中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或所有十四种生物标志物的组合。

―生物样品”、―样品”和―测试样品”在本文中可互换地使用来指从个体获得或以其他方式得到的任何物质、生物流体、组织或细胞。这包括血液(包括全血、白血球、外周血单核细胞、血沉棕黄层、血浆和血清)、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、尿液、唾液、腹膜洗涤物、腹水、囊液、腺液、淋巴液、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊液。这还包括所有前述物质的经实验分离的部分。例如，可将血液样品分级为血清、血浆或含有特定类型的血液细胞(诸如红细胞或白细胞(白血球))的部分。在一些实施方案中，血液样品是干血点。在一些实施方案中，血浆样品是干血浆点。在一些实施方案中，样品可为来自个体的样品的组合，诸如组织和流体样品的组合。术语―生物样品”还包括例如含有均质化固体物质(诸如来自于粪便样品、组织样品或组织活检)的物质。术语―生物样品”还包括来源于组织培养物或细胞培养物的物质。可采用用于获得生物样品的任何合适的方法；示例性方法包括例如静脉切开术、拭子(例如，口腔拭子)和细针抽吸活检程序。易于进行细针抽吸的示例性组织包括淋巴结、肺、甲状腺、乳房、胰腺和肝脏。还可例如通过显微解剖(例如，激光捕获显微解剖(LCM)或激光显微解剖(LMD))、膀胱洗涤、涂片(例如，PAP涂片)或导管灌洗来收集样品。从个体获得或得到的―生物样品”包括在从个体获得之后已经以任何合适的方式进行加工的任何这种样品。在一些实施方案中，生物样品是血浆样品。

另外，在一些实施方案中，可通过从多个个体取得生物样品并将它们合并，或者将每个个体的生物样品的等分试样合并来得到生物样品。对于来自单个个体的样品，可如本文所描述处理合并的样品，并且例如，如果在合并的样品中确定了不良预后，则可重新测试每个个体生物样品以确定哪个或哪些个体具有增加或降低的CV事件(诸如死亡)风险。

出于本说明书的目的，短语―归属于来自个体的生物样品的数据”意图表示处于某种形式的数据来源于个体的生物样品，或者使用所述生物样品生成。数据在生成之后可能会被重新格式化、修正或在一定程度上数学地改变，诸如通过将一个测量系统中的单位转换为另一个测量系统中的单位来进行；但是，数据应被理解为原先来源于生物样品或者使用所述生物样品生成。

―靶标”、―靶分子”和―分析物”在本文中可互换地使用来指可存在于生物样品中的任何所关注的分子。―所关注的分子”包括特定分子的任何细微变化，诸如在蛋白质的情况下，例如为氨基酸序列的细微变化、二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化，或任何其他操作或修饰(诸如与基本上不改变分子身份的标记组分缀合)。―靶分子”、―靶标”或―分析物”是指一种类型或种类的分子或多分子结构的一组拷贝。示例性靶分子包括蛋白质、多肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、亲和体、抗体模拟物、病毒、病原体、毒性物质、底物、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞、组织和前述物质中任一种的任何片段或部分。在一些实施方案中，靶分子是蛋白质，在这种情况下，靶分子可被称为―靶蛋白”。

如本文所使用，―捕获剂”或―捕获试剂”是指能够特异性结合到生物标志物的分子。―靶蛋白捕获试剂”是指能够特异性结合到靶蛋白的分子。非限制性的示例性捕获试剂包括适体、抗体、阿德耐汀(adnectin)、锚蛋白、其他抗体模拟物和其他蛋白质支架、自身抗体、嵌合体、小分子、核酸、凝集素、配体结合受体、印迹聚合物、高亲和性多聚体(avimer)、肽模拟物、激素受体、细胞因子受体、合成受体、以及任何上述捕获试剂的修饰物和片段。在一些实施方案中，捕获试剂选自适体和抗体。

术语―抗体”是指任何物种的全长抗体以及此类抗体的片段和衍生物，包括Fab片段、F(ab')₂片段、单链抗体、Fv片段和单链Fv片段。术语―抗体”还指合成来源的抗体，诸如噬菌体展示技术来源的抗体和片段、亲和体、纳米体等。

如本文所使用，―标志物”和―生物标志物”可互换地使用来指某种靶分子，所述靶分子指示或暗示个体体内的正常或异常过程或个体体内的疾病或其他疾患。更具体地，―标志物”或―生物标志物”是与特定生理状态或过程(无论是正常的还是异常的，并且如果是异常的，则无论是慢性的还是急性的)的存在相关联的解剖学、生理学、生物化学或分子参数。生物标志物可通过各种方法来检测和测量，这些方法包括实验室测定和医学成像。在一些实施方案中，生物标志物是靶蛋白。

如本文所使用，―生物标志物水平”和―水平”是指使用用于检测生物样品中的生物标志物的任何分析方法实现的测量结果并且指示生物样品中的生物标志物、用于生物样品中的生物标志物或对应于生物样品中的生物标志物的存在、不存在、绝对量或浓度、相对量或浓度、滴度、水平、表达水平、测量水平的比率等。―水平”的确切性质取决于用于检测生物标志物的特定分析方法的具体设计和组成。

当生物标志物指示或暗示个体体内的异常过程或者疾病或其他状况时，该生物标志物通常被描述为与指示或暗示个体体内的正常过程或者不存在疾病或其他状况的生物标志物的表达水平或值相比较是过表达或低表达的。―上调”、―经上调”、―过表达”、―过表达的”及其任何变型可互换地使用来指生物样品中的生物标志物的值或水平大于通常在来自健康或正常个体的类似生物样品中检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。这些术语还可指生物样品中的生物标志物的值或水平大于可能在特定疾病的不同阶段检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。

―下调”、―经下调”、―低表达”、―低表达的”及其任何变型可互换地使用来指生物样品中的生物标志物的值或水平小于通常在来自健康或正常个体的类似生物样品中检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。这些术语还可指生物样品中的生物标志物的值或水平小于可能在特定疾病的不同阶段检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。

另外，过表达或低表达的生物标志物还可被称为―差异表达”或者与指示或暗示个体体内的正常过程或者不存在疾病或其他状况的生物标志物的―正常”表达水平或值相比较具有―差异水平”或―差异值”。因此，生物标志物的―差异表达”也可被称为偏离生物标志物的―正常”表达水平。

靶分子的―对照水平”是指来自未患有疾病或疾患的个体、或来自未被怀疑患有疾病或疾患或未处于患有疾病或疾患的风险中的个体、或来自有过原发性或首次心血管事件但没有继发性心血管事件的个体，或来自患有稳定的心血管疾病的个体的处于相同样品类型的靶分子的水平。对照水平可指来自未患有疾病或疾患、或未被怀疑患有疾病或疾患或未处于患有疾病或疾患的风险中、或有过原发性或首次心血管事件但没有继发性心血管事件，或患有稳定的心血管疾病或其组合的个体群体的样品中的靶分子的平均水平。

如本文所使用，―个体”、―受试者”和―患者”可互换地使用来指哺乳动物。哺乳动物个体可为人或非人个体。在各种实施方案中，个体是人。健康或正常个体是通过常规诊断方法无法检测到所关注的疾病或疾患(包括例如慢性心力衰竭和心血管事件，诸如心肌梗塞、中风和因心力衰竭而住院治疗)的个体。

―诊断(Diagnose、diagnosing、diagnosis)”及其变型是指基于一种或多种体征、症状、数据或与个体有关的其他信息而检测、确定或辨别该个体的健康状态或状况。个体的健康状态可被诊断为健康/正常(即，诊断出不存在疾病或疾患)或诊断为生病/异常(即，诊断出存在疾病或疾患或者评定疾病或疾患的特征)。术语―诊断(diagnose、diagnosing、diagnosis)”等相对于特定疾病或疾患涵盖疾病的初始检测；对疾病的表征或分类；对疾病进展、缓解或复发的检测；以及在对个体施用治疗或疗法之后对疾病反应的检测。CV事件的风险预测包括将具有增加的CV事件风险的个体与不具有增加的CV事件风险的个体区分开来。

―预后(Prognose、prognosing、prognosis)”及其变型是指对患有疾病或疾患的个体体内该疾病或疾患的未来病程的预测(例如，预测患者存活率)，并且此类术语涵盖在对个体施用治疗或疗法之后对疾病或疾患反应的评估。

―评估(Evaluate、evaluating、evaluation)”及其变型涵盖―诊断”和―预后”两者，并且还涵盖与未患有疾病或疾患的个体体内该疾病的未来病程有关的确定或预测，以及关于疾病或疾患将在明显已经被治愈该疾病或该疾患已经有所缓解的个体体内复发的风险的确定或预测。术语―评估”还涵盖评定个体对疗法的反应，例如像预测个体是可能对治疗剂有良好反应还是不太可能对治疗剂有反应(或例如将经历毒性或其他不期望的副作用)，选择用于向个体施用的治疗剂，或者监测或确定个体对已向个体施用的疗法的反应。因此，―评估”CV事件的风险可包括例如以下项中的任一者：预测个体体内发生CV事件的未来风险；预测明显没有CV问题的个体体内发生CV事件的风险；预测特定类型的CV事件；预测发生CV事件的时间；或者确定或预测个体对CV治疗的反应，或基于对来源于个体的生物样品的生物标志物值的确定而选择向个体施用的CV治疗。CV事件的风险评估可包括诸如连续地评定CV事件的风险，或者以升级的分类对CV事件的风险进行分类的实施方案。风险分类包括例如分为两个或更多个分类的分类，诸如―CV事件的风险没有升高”；―CV事件的风险升高”；和/或―CV事件的风险低于平均风险”。在一些实施方案中，CV事件的风险评估是针对限定的时间段。非限制性的示例性限定的时间段包括90天、180天和1年。在各种实施方案中，CV事件是死亡。

如本文所使用，―额外生物医学信息”是指除了使用本文描述的任何生物标志物进行的评估之外的对个体的一项或多项评估，所述评估与CV风险或更具体地CV事件风险相关联。―额外生物医学信息”包括以下项中的任一者：个体的身体描述词，包括个体的身高和/或体重；个体的年龄；个体的性别；体重变化；个体的种族；职业史；心血管疾病(或其他循环系统病症)家族史；个体体内存在与心血管疾病(或其他循环系统病症)的较高风险相关的一种或多种遗传标志物或者家庭成员存在颈动脉内膜厚度的变化；临床症状，诸如胸痛、体重增加或减少基因表达值；个体的身体描述词，包括通过放射成像观察到的身体描述词；吸烟状况；饮酒史；职业史；饮食习惯——盐、饱和脂肪和胆固醇摄入；咖啡因摄取；以及成像信息，诸如心电图、超声心动图、针对内膜中层厚度的颈动脉超声、血流介导的扩张、脉搏波速度、踝臂指数、负荷超声心动图、心肌灌注成像、CT冠状动脉钙化、高分辨率CT血管造影、MRI成像和其他成像模态；以及个体的用药。结合任何额外生物医学信息的评估对生物标志物水平进行测试，包括其他实验室测试(例如，HDL、LDL测试、CRP水平、Nt-BNP前体测试、BNP测试、高灵敏度肌钙蛋白测试、半乳糖凝集素3测试、血清白蛋白测试、肌酸测试)与单独的生物标志物测试或单独评估任何特定项的额外生物医学信息(例如，单独的颈动脉内膜厚度成像)相比较可例如提高CV事件预测的灵敏度、特异性和/或AUC。可使用本领域已知的常规技术从个体获得额外生物医学信息，诸如通过使用常规患者问卷或健康史问卷等从个体本身获得，或从执业医师处获得等。结合任何额外生物医学信息的评估对生物标志物水平进行测试与单独的生物标志物测试或单独评估任何特定项的额外生物医学信息(例如，单独的CT成像)相比较可例如提高CV事件预测(或其他心血管相关用途)的灵敏度、特异性和/或阈值。

如本文所使用，相对于生物标志物值的―检测”或―确定”包括使用用于观察和记录对应于生物标志物水平的信号的仪器和生成该信号所需的一种或多种材料两者。在各种实施方案中，该生物标志物水平使用任何合适的方法来检测，这些方法包括荧光、化学发光、表面等离子体共振、表面声波、质谱、红外光谱、拉曼光谱、原子力显微镜、扫描隧道显微镜、电化学检测方法、核磁共振、量子点等。

―固体载体”在本文中是指具有分子可通过共价键或非共价键直接或间接地附着的表面的任何基底。―固体载体”可具有各种物理形式，其可包括例如膜；芯片(例如，蛋白质芯片)；载玻片(例如，载玻片或盖玻片)；柱；中空、实心、半实心、含有孔或腔的颗粒，例如像珠粒；凝胶；纤维，包括光纤材料；基质；以及样品容器。示例性样品容器包括样品孔、管、毛细管、小瓶以及能够保持样品的任何其他器皿、凹槽或凹口。样品容器可被容纳在多样品平台上，诸如微量滴定板、载玻片、微流体装置等。载体可由天然或合成材料、有机或无机材料构成。附着有捕获试剂的固体载体的组成通常取决于附着方法(例如，共价附着)。其他示例性容器包括微滴和微流体控制或散装的油性/水性乳液，在所述乳液内可进行测定和相关操作。合适的固体载体包括例如塑料、树脂、多糖、二氧化硅或二氧化硅基材料、功能化玻璃、改性硅、碳、金属、无机玻璃、膜、尼龙、天然纤维(例如像，丝、羊毛和棉花)、聚合物等。构成固体载体的材料可包括反应性基团，例如像羧基、氨基或羟基，所述反应性基团用于附着捕获试剂。聚合物固体载体可包括例如聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethyleneglycol tetraphthalate)、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、丁基橡胶、丁苯橡胶、天然橡胶、聚乙烯、聚丙烯、(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚碳酸酯和聚甲基戊烯。可使用的合适的固体载体颗粒包括例如编码颗粒(诸如类型编码颗粒)、磁性颗粒和玻璃颗粒。

生物标志物的示例性用途

在各种示例性实施方案中，通过经由任何数量的分析方法(包括本文描述的任何分析方法)检测对应于存在于个体的循环中(诸如血液、血清或血浆中)的一种或多种生物标志物的一个或多个生物标志物值，提供了用于评估个体体内发生CV事件的风险的方法。与不具有增加的CV事件风险的个体相比较，这些生物标志物例如在具有增加的CV事件风险的个体体内是差异表达的。例如，可使用对个体体内生物标志物的差异表达的检测来准许预测在90天、180天或1年时间范围内的CV事件风险。在各种实施方案中，CV事件是因心力衰竭而住院治疗、或死亡。在各种实施方案中，CV事件是死亡。

除了将生物标志物水平作为独立的诊断测试进行测试之外，生物标志物水平还可结合单核苷酸多态性(SNP)或其他遗传病变或变异性的确定来完成，这些遗传病变或变异性指示疾病或疾患易感性的风险增加。(参见例如Amos等人，Nature Genetics 40,616-622(2009))。

生物标志物水平也可结合放射学筛查来使用。生物标志物水平还可结合相关症状或基因测试来使用。在评估了CV事件的风险之后，检测本文描述的任何生物标志物可能是有用的，以指导个体的适当临床护理，包括在已经确定CV事件风险之后对高风险个体提高到更积极水平的护理。除了结合相关症状或风险因素测试生物标志物水平之外，还可结合其他类型的数据，特别是指示个体的心血管事件风险的数据(例如，患者临床病史、症状、心血管疾病家族史、吸烟史或饮酒史、风险因素(诸如一种或多种遗传标志物的存在和/或其他生物标志物的状态等))来评估关于生物标志物的信息。这些不同数据可通过可体现在计算机或其他设备/装置中的自动化方法(诸如计算机程序/软件)来评定。

生物标志物的测试还可与临床实践中目前使用的指南和心血管风险算法相关联。例如，Framingham风险评分使用风险因素来提供风险评分，此类风险因素包括LDL-胆固醇和HDL-胆固醇水平、减退的葡萄糖水平、吸烟、收缩压和糖尿病。高风险患者的出现率随着年龄增加，并且男性构成了比女性更大比例的高风险患者。

任何描述的生物标志物也可用于成像测试。例如，显像剂可偶联到任何描述的生物标志物，这可用于协助预测心血管事件的风险，监测对治疗干预的反应，在临床试验中选择目标群体以及其他用途。

对生物标志物和生物标志物水平的检测和确定

可使用各种已知分析方法中的任一种来检测本文描述的生物标志物的生物标志物水平。在一个实施方案中，使用捕获试剂检测生物标志物值。在各种实施方案中，捕获试剂可暴露于溶液中的生物标志物或可在捕获试剂被固定在固体载体上的情况下暴露于生物标志物。在其他实施方案中，捕获试剂含有与固体载体上的次级特征发生反应的特征。在这些实施方案中，捕获试剂可暴露于溶液中的生物标志物，然后捕获试剂上的特征可结合固体载体上的次级特征来使用，以将生物标志物固定在固体载体上。基于将进行的分析的类型而选择捕获试剂。捕获试剂包括但不限于：适体、抗体、阿德耐汀(adnectin)、锚蛋白、其他抗体模拟物和其他蛋白质支架、自身抗体、嵌合体、小分子、F(ab’)₂片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体结合受体、亲和体、纳米体、印迹聚合物、高亲和性多聚体(avimer)、肽模拟物、激素受体、细胞因子受体和合成受体、以及这些捕获试剂的修饰物和片段。

在一些实施方案中，使用生物标志物/捕获试剂复合物检测生物标志物水平。

在一些实施方案中，生物标志物水平来源于生物标志物/捕获试剂复合物并且被间接检测，例如像作为生物标志物/捕获试剂相互作用之后的反应的结果进行检测，但取决于生物标志物/捕获试剂复合物的形成。

在一些实施方案中，生物标志物水平直接从生物样品中的生物标志物进行检测。

在一些实施方案中，使用允许同时检测生物样品中的两种或更多种生物标志物的多重形式来检测生物标志物。在多重形式的一些实施方案中，捕获试剂直接或间接、共价或非共价地固定在固体载体上的离散位置。在一些实施方案中，多重形式使用离散的固体载体，其中每个固体载体具有与该固体载体相关联的唯一的捕获试剂，例如像量子点。在一些实施方案中，单独的装置用于检测生物样品中待检测的多种生物标志物中的每种生物标志物。单独的装置可被配置为准许生物样品中的每种生物标志物被同时处理。例如，可使用微量滴定板，使得板中的每个孔用于独特地分析生物样品中待检测的一种或多种生物标志物。

在一个或多个前述实施方案中，可使用荧光标签来标记生物标志物/捕获试剂复合物的组分以实现对生物标志物水平的检测。在各种实施方案中，可使用已知技术将荧光标记缀合到对本文描述的任何生物标志物具有特异性的捕获试剂，然后可使用荧光标记来检测对应的生物标志物水平。合适的荧光标记包括稀土螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、别藻蓝蛋白、PBXL-3、Qdot 605、丽丝胺、藻红蛋白、德克萨斯红和其他此类化合物。

在一些实施方案中，荧光标记是荧光染料分子。在一些实施方案中，荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚环体系，其中吲哚环的3-碳上的取代基含有化学反应性基团或共轭物质。在一些实施方案中，染料分子包括AlexFluor分子，例如像AlexaFluor 488、AlexaFluor532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 680或AlexaFluor 700。在其他实施方案中，染料分子包括第一类型和第二类型的染料分子，例如像两种不同的AlexaFluor分子。在一些实施方案中，染料分子包括第一类型和第二类型的染料分子，并且这两种染料分子具有不同的发射光谱。

荧光可利用与各种各样的测定形式兼容的各种仪器来测量。例如，分光荧光计已经被设计成分析微量滴定板、显微镜载玻片、印刷阵列、比色皿等。参见J.R.Lakowicz的Principles of Fluorescence Spectroscopy，Springer Science+Business Media公司，2004。参见Bioluminescence&Chemiluminescence:Progress&Current Applications；Philip E.Stanley和Larry J.Kricka编辑，World Scientific Publishing Company，2002年1月。

在一个或多个实施方案中，化学发光标签可任选地用于标记生物标志物/捕获复合物的组分以实现对生物标志物水平的检测。合适的化学发光材料包括以下项中的任一者：草酰氯、罗丹明6G、Ru(bipy)₃ ²⁺、TMAE(四(二甲氨基)乙烯)、邻苯三酚(1,2,3-三羟基苯)、光泽精、过氧草酸盐、芳基草酸盐、吖啶酯、二氧杂环丁烷等。

在一些实施方案中，检测方法包括生成对应于生物标志物水平的可检测信号的酶/底物组合。通常，酶催化生色底物的化学变化，这可使用各种技术来测量，这些技术包括分光光度法、荧光法和化学发光法。合适的酶包括例如荧光素酶、荧光素、苹果酸脱氢酶、脲酶、辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、尿酸酶、黄嘌呤氧化酶、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。

在一些实施方案中，检测方法可为生成可测量信号的荧光、化学发光、放射性核素或酶/底物组合的组合。在一些实施方案中，多模态信号传递在生物标志物测定形式中可具有独特且有利的特征。

在一些实施方案中，如下文所讨论，本文描述的生物标志物的生物标志物水平可使用任何分析方法来检测，这些方法包括单重适体测定法、多重适体测定法、单重或多重免疫测定法、mRNA表达谱分析、miRNA表达谱分析、质谱分析、组织学/细胞学方法等。

使用基于适体的测定法确定生物标志物水平

针对生物样品和其他样品中的生理学上重要的分子的检测和定量的诸多测定在科学研究和卫生保健领域是重要的工具。一类所述测定涉及使用包括被固定在固体载体上的一种或多种适体的微阵列。所述适体各自能够以高特异性方式且以极高亲和力结合到靶分子。参见例如名为―Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,475,096；另外参见例如美国专利号6,242,246、美国专利号6,458,543和美国专利号6,503,715，所述专利中的每一者的名称均为―Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”。一旦微阵列与样品接触，适体就结合到样品中存在的它们各自的靶分子，并且因而能够确定对应于生物标志物的生物标志物水平。

如本文所使用，―适体”是指对靶分子具有特异性结合亲和力的核酸。应认识到，亲和力相互作用是一个程度的问题；然而，在此上下文中，适体对其靶标的―特异性结合亲和力”表示适体通常以比其结合到测试样品中的其他组分高得多的亲和力程度结合到其靶标。―适体”是包含特定核苷酸序列的一种类型或种类的核酸分子的一组拷贝。适体可包括任何合适数量的核苷酸，包括任何数量的经化学修饰的核苷酸。―多种适体”是指多于一组这样的分子。不同的适体可具有相同或不同数量的核苷酸。适体可为DNA或RNA或经化学修饰的核酸，并且可为单链、双链或含有双链区域，并且可包括更高级的结构。适体还可为光适体，其中光反应性或化学反应性官能团被包括在适体中以允许其共价地连接到其对应的靶标。本文公开的任何适体方法可包括使用特异性结合相同靶分子的两种或更多种适体。如下文进一步描述的，适体可包括标签。如果适体包括标签，则并非适体的所有拷贝都需要具有相同的标签。此外，如果不同的适体各自都包括标签，则这些不同的适体可具有相同的标签或不同的标签。

可使用任何已知的方法，包括SELEX过程来鉴别适体。一旦被鉴别，就可根据任何已知的方法(包括化学合成方法和酶促合成方法)来制备或合成适体。

术语―SELEX”和―SELEX过程”在本文中可互换地使用，一般是指(1)选择以期望的方式与靶分子相互作用的适体，例如以高亲和力结合到蛋白质，与(2)这些选择的核酸的扩增的组合。SELEX过程可用于鉴别对特定靶标或生物标志物具有高亲和力的适体。

SELEX通常包括：制备核酸的候选混合物；将候选混合物结合到期望的靶分子以形成亲和复合物；将亲和复合物与未结合的候选核酸分离；将核酸从亲和复合物中分开并分离；纯化核酸；以及鉴别特定的适体序列。该过程可包括多次循环以进一步提升所选择的适体的亲和力。该过程可包括在该过程中的一个或多个点处的扩增步骤。参见例如名为―Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,475,096。SELEX过程可用于生成共价地结合其靶标的适体以及非共价地结合其靶标的适体。参见例如名为―Systematic Evolution ofNucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Chemi-SELEX”的美国专利号5,705,337。

SELEX过程可用于鉴别含有经修饰的核苷酸的高亲和力适体，所述经修饰的核苷酸对适体赋予改进的特征，例如像改进的体内稳定性或改进的递送特征。此类修饰的实例包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置处的化学取代。SELEX过程鉴别的含有经修饰的核苷酸的适体在名为―High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing ModifiedNucleotides”的美国专利号5,660,985中进行了描述，所述专利描述了含有在嘧啶的5’-和2’-位置处经过化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。参见上文，美国专利号5,580,737描述了高特异性适体，所述高特异性适体含有由2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)和/或2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的一种或多个核苷酸。还参见名为―SELEX and PHOTOSELEX”的美国专利申请公布20090098549，所述专利申请描述了具有扩展的物理和化学性质的核酸文库以及其在SELEX和photoSELEX中的用途。

SELEX还可用于鉴别具有期望的解离率特征的适体。参见名为―Method forGenerating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国公布号20090004667，所述公布描述了用于生成可结合到靶分子的适体的改进的SELEX方法。描述了用于产生适体和光适体的方法，所述适体和光适体从其相应的靶分子中解离的速率较慢。所述方法涉及使候选混合物与靶分子接触，允许形成核酸-靶标复合物，并且执行慢解离率富集过程，其中具有快速解离率的核酸-靶标复合物将解离并且不会再次形成，而具有缓慢解离率的复合物将保持完整。另外地，所述方法包括在产生候选核酸混合物时使用经修饰的核苷酸，以生成具有改进的解离率性能的适体。非限制性的示例性经修饰的核苷酸包括例如图7至图9中所示的经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，适体包含具有修饰(诸如碱基修饰)的至少一个核苷酸。在一些实施方案中，适体包含具有疏水修饰(诸如疏水碱基修饰)的至少一个核苷酸，从而允许与靶蛋白进行疏水接触。在一些实施方案中，此类疏水接触有助于适体的更大亲和力和/或更慢的解离率结合。在图7中示出了具有疏水修饰的非限制性示例性核苷酸。在一些实施方案中，适体包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有疏水修饰的核苷酸，其中每个疏水修饰可与其他疏水修饰相同或不同。在一些实施方案中，适体中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个疏水修饰可独立地选自图7所示的疏水修饰。

在一些实施方案中，适体是慢解离率适体。在一些实施方案中，慢解离率适体(包括包含具有疏水修饰的至少一个核苷酸的适体)具有≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的解离率(t1/2)。

在一些实施方案中，测定采用包括光反应性官能团的适体，所述光反应性官能团使得适体能够共价地结合或―光交联”其靶分子。参见例如名为―Nucleic Acid LigandDiagnostic Biochip”的美国专利号6,544,776。这些光反应性适体也被称为光适体。参见例如美国专利号5,763,177、美国专利号6,001,577和美国专利号6,291,184，所述专利中的每一者的名称均为―Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by ExponentialEnrichment:Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX”；另外参见例如名为―Photoselection of Nucleic Acid Ligands”的美国专利号6,458,539。在使微阵列与样品接触并且光适体有了结合到其靶分子的机会之后，光适体被光活化并且洗涤固体载体以去除任何非特异性结合的分子。可使用严苛的洗涤条件，因为由于光适体上一个或多个光活化的官能团产生的共价键，大体上并不会去除结合到光适体的靶分子。以此方式，该测定实现了对应于测试样品中的生物标志物的生物标志物水平的检测。

在一些测定形式中，适体在与样品接触之前被固定在固体载体上。然而，在某些情况下，在与样品接触之前固定适体可能无法提供最佳测定。例如，适体的预固定可能会导致适体与靶分子在固体载体的表面上的低效混合，这可能会导致过长的反应时间，并且因此延长孵育期以准许适体与其靶分子有效结合。另外，当在测定中采用光适体时并且根据用作固体载体的材料，固体载体可能倾向于散射或吸收用于影响光适体与其靶分子之间共价键形成的光。此外，根据所采用的方法，检测靶分子与其适体的结合可能不精确，因为固体载体的表面也可能会暴露于所使用的任何标记剂并受其影响。最后，适体在固体载体上的固定通常涉及在将适体暴露于样品之前的适体制备步骤(即，固定)，并且该制备步骤可能会影响适体的活性或功能。

另外已经描述了适体测定，所述适体测定准许适体在溶液中捕获其靶标，然后采用分离步骤，所述分离步骤被设计成在检测之前去除适体-靶标混合物的特定组分(参见名为―Multiplexed Analyses of Test Samples”的美国公布号20090042206)。所描述的适体测定方法使得能够通过检测和定量核酸(即，适体)来检测和定量测试样品中的非核酸靶标(例如，蛋白质靶标)。所描述的方法产生用于检测和定量非核酸靶标的核酸替代物(即，适体)，从而允许将包括扩增的各种各样的核酸技术应用于更广泛范围的期望靶标，包括蛋白质靶标。

适体可被构建成有助于从适体生物标志物复合物(或光适体生物标志物共价复合物)中分离测定组分，并且准许分离适体以用于检测和/或定量。在一个实施方案中，这些构建体可包括适体序列内的可裂解或可释放元件。在其他实施方案中，可将额外功能引入适体中，例如标记的或可检测的组分、间隔物组分或特异性结合标签或固定元件。例如，适体可包括经由可裂解部分连接到适体的标签、标记、分隔标记的间隔物组分和可裂解部分。在一个实施方案中，可裂解元件是光可裂解接头。光可裂解接头可附着到生物素部分和间隔物区段，可包括用于胺衍生化的NHS基团，并且可用于将生物素基团引入适体，从而允许稍后在测定方法中释放适体。

利用所有测定组分在溶液中进行的均质测定在检测信号之前不需要分离样品与试剂。这些方法是快速且易于使用的。这些方法基于与其特定靶标发生反应的分子捕获或结合试剂而生成信号。在本文描述的方法的一些实施方案中，分子捕获试剂包含一种或多种适体和/或抗体等，并且一种或多种适体和/或抗体等中的每一者的特定靶标可为表1或表2所示的生物标志物。

在一些实施方案中，用于信号生成的方法利用由于荧光团标记的捕获试剂与其特定生物标志物靶标的相互作用而引起的各向异性信号变化。当标记的捕获物与其靶标发生反应时，增加的分子量导致附着到复合物的荧光团的旋转运动变得慢得多，从而改变各向异性值。通过监测各向异性变化，结合事件可用于定量地测量溶液中的生物标志物。其他方法包括荧光偏振测定法、分子信标方法、时间分辨荧光淬灭、化学发光、荧光共振能量转移等。

可用于检测生物样品中的生物标志物水平的示例性基于溶液的适体测定法包括以下项：(a)通过使生物样品与包括第一标签并对生物标志物具有特定亲和力的适体接触来制备混合物，其中当样品中存在生物标志物时形成适体亲和复合物；(b)将该混合物暴露于包括第一捕获元件的第一固体载体，并且允许第一标签与第一捕获元件缔合；(c)去除混合物中未与第一固体载体缔合的任何组分；(d)将第二标签附着到适体亲和复合物的生物标志物组分；(e)从第一固体载体释放适体亲和复合物；(f)将所释放的适体亲和复合物暴露于包括第二捕获元件的第二固体载体并且允许第二标签与第二捕获元件缔合；(g)通过将未复合的适体从适体亲和复合物中分割出来，将任何未复合的适体从混合物中去除；(h)从固体载体中洗脱适体；以及(i)通过检测适体亲和复合物的适体组分来检测生物标志物。

本领域已知的任何手段都可用于通过检测适体亲和复合物的适体组分来检测生物标志物值。许多不同的检测方法可用于检测亲和复合物的适体组分，例如像杂交测定法、质谱法或QPCR。在一些实施方案中，核酸测序方法可用于检测适体亲和复合物的适体组分，并且由此检测生物标志物值。简而言之，可对测试样品进行任何种类的核酸测序方法以鉴别和定量测试样品中存在的一种或多种适体的一个或多个序列。在一些实施方案中，序列包括整个适体分子或可用于独特地鉴别分子的分子的任何部分。在其他实施方案中，鉴别测序是将特定序列添加到适体；此类序列通常被称为―标签”、―条形码”或―邮政编码”。在一些实施方案中，测序方法包括酶促步骤以扩增适体序列或者将任何种类的核酸(包括含有对任何位置的化学修饰的RNA和DNA)转换为适合于测序的任何其他种类的核酸。

在一些实施方案中，测序方法包括一个或多个克隆步骤。在其他实施方案中，测序方法包括不进行克隆的直接测序方法。

在一些实施方案中，测序方法包括利用特异性引物的定向方法，所述特异性引物靶向测试样品中的一种或多种适体。在其他实施方案中，测序方法包括靶向测试样品中的所有适体的鸟枪法。

在一些实施方案中，测序方法包括酶促步骤以扩增目标被设定为测序的分子。在其他实施方案中，测序方法直接对单个分子进行测序。可用于检测对应于生物样品中的生物标志物的生物标志物值的示例性基于核酸测序的方法包括以下项：(a)利用酶促步骤将含有经化学修饰的核苷酸的适体的混合物转换为未经修饰的核酸；(b)利用大量并行测序平台(例如像454测序系统(454Life Sciences/Roche)、Illumina测序系统(Illumina)、ABISOLiD测序系统(Applied Biosystems)、HeliScope单分子测序仪(Helicos Biosciences)或Pacific Biosciences实时单分子测序系统(Pacific BioSciences)或Polonator G测序系统(Dover Systems))对所得的未经修饰的核酸进行鸟枪法测序；以及(c)通过特异性序列和序列计数来鉴别和定量混合物中存在的适体。

在实施例1中描述了使用适体检测生物样品中的生物标志物的非限制性示例性方法。另外参见Kraemer等人，2011,PLoS One 6(10):e26332。

使用免疫测定法确定生物标志物水平

免疫测定方法是基于抗体与其对应的靶标或分析物的反应，并且可根据特定的测定形式检测样品中的分析物。为了提高基于免疫反应性的测定方法的特异性和灵敏度，通常使用单克隆抗体及其片段，这归因于其特异性表位识别。多克隆抗体也已经成功地用于各种免疫测定法中，因为与单克隆抗体相比较，它们对靶标的亲和力增加。免疫测定法已经被设计用于各种各样的生物样品基质。免疫测定形式已经被设计为提供定性、半定量和定量结果。

定量结果通过使用在待检测的已知浓度的特定分析物下产生的标准曲线来生成。将来自未知样品的响应或信号绘制到标准曲线上，并且确立对应于未知样品中的靶标的量或水平。

已经设计了多种免疫测定形式。ELISA或EIA可定量检测分析物。该方法依赖于将标记附着到分析物或抗体，并且标记组分直接或间接地包括酶。ELISA测试的形式可被设计成用于分析物的直接、间接、竞争或夹心检测。其他方法依赖于标记，例如像放射性同位素(I¹²⁵)或荧光。额外技术包括例如凝集反应、浊度测定法、比浊法、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、免疫细胞化学法、免疫组织化学法、流式细胞术、Luminex测定法等(参见ImmunoAssay：APractical Guide，Brian Law编辑，由Taylor&Francis,Ltd.出版，2005版)。

示例性测定形式包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法、荧光、化学发光和荧光共振能量转移(FRET)或时间分辨FRET(TR-FRET)免疫测定法。用于检测生物标志物的程序的实例包括生物标志物免疫沉淀，随后是允许大小和肽水平区分的定量方法，诸如凝胶电泳、毛细管电泳、平面电色谱等。

检测和/或定量可检测标记或信号生成材料的方法取决于标记的性质。由适当的酶催化的反应(其中可检测的标记是酶；见上文)的产物可以是但不限于荧光的、发光的或放射性的，或者它们可吸收可见光或紫外光。适于检测此类可检测标记的检测器的实例包括但不限于：x射线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、光度计和密度计。

任何检测方法均可以按允许任何合适的反应准备、处理和分析的任何形式进行。这可以是例如在多孔测定板(例如，96孔或386孔)中或使用任何合适的阵列或微阵列。各种剂的储备溶液可手动或自动地制取，并且所有随后的移液、稀释、混合、分配、洗涤、孵育、样品读出、数据收集和分析都可使用可商购获得的分析软件、机器人和能够检测可检测标记的检测仪器来自动地完成。

使用基因表达谱分析确定生物标志物水平

在一些实施方案中，测量生物样品中的mRNA可用作检测生物样品中对应的蛋白质的水平的替代形式。因此，在一些实施方案中，可通过检测适当的RNA来检测本文描述的生物标志物或生物标志物组。

在一些实施方案中，通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-PCR，然后是qPCR)来测量mRNA表达水平。RT-PCR用于由mRNA产生cDNA。cDNA可用于qPCR测定中以随着DNA扩增过程的进行而产生荧光。通过与标准曲线进行比较，qPCR可产生绝对测量结果，诸如每个细胞的mRNA拷贝数。RNA印迹、微阵列、Invader测定法和RT-PCR结合毛细管电泳都已用于测量样品中mRNA的表达水平。参见Gene Expression Profiling:Methods and Protocols，RichardA.Shimkets编辑，Humana Press,2004。

使用体内分子成像技术检测生物标志物

在一些实施方案中，本文描述的生物标志物可用于分子成像测试中。例如，显像剂可偶联到捕获试剂，这可用于体内检测生物标志物。

体内成像技术提供了用于确定个体体内特定疾病状态的非侵入性方法。例如，身体的所有部分，或甚至整个身体都可被视作三维图像，从而提供有关身体内形态和结构的有价值的信息。此类技术可与本文描述的生物标志物的检测相结合，以提供有关体内生物标志物的信息。

由于技术的各种进展，体内分子成像技术的使用正在扩大。这些进展包括新的造影剂或标记的开发，诸如放射性标记和/或荧光标记，其可在体内提供强信号；以及强大的新的成像技术的开发，其可从身体外部检测和分析这些信号，所述新的成像技术具有足够的灵敏度和精确度以提供有用的信息。造影剂可在适当的成像系统中显现，从而提供有造影剂位于其中的身体的一个或多个部分的图像。造影剂可与以下项结合或缔合：捕获试剂，例如像适体或抗体，和/或肽或蛋白质、或寡核苷酸(例如，用于基因表达的检测)或复合物，所述复合物含有这些项中的任一者与一种或多种大分子和/或其他微粒形式。

造影剂还可具有可用于成像中的放射性原子的特征。合适的放射性原子包括用于闪烁摄影研究的锝-99m或碘-123。其他可容易检测的部分包括例如用于磁共振成像(MRI)的自旋标记，例如像再次有碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。此类标记在本领域中是众所周知的并且可由本领域的普通技术人员容易地选择。

标准成像技术包括但不限于：磁共振成像、计算机断层扫描、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)等。对于诊断性体内成像，在选择给定的造影剂，诸如给定的放射性核素和使用来靶向的特定生物标志物(蛋白质、mRNA等)时，可用的检测仪器类型是主要因素。所选择的放射性核素通常具有可由给定类型的仪器检测的衰变类型。另外，在选择用于体内诊断的放射性核素时，其半衰期应足够长，以使得能够在靶组织的最大摄取时进行检测，但也应足够短，以使得对宿主的有害辐射被最小化。

示例性成像技术包括但不限于：PET和SPECT，它们是将放射性核素全身(synthetically)或局部地施用于个体的成像技术。随着时间的推移而测量放射性示踪剂的后续摄取，并且使用来获得与靶向组织和生物标志物有关的信息。由于所采用的特定同位素的高能(γ-射线)发射以及用于检测所述发射的仪器的灵敏度和精密性，可从身体外部推断二维放射性分布。

PET中常用的正电子发射核素包括例如碳-11、氮-13、氧-15和氟-18。因电子捕获和/或γ-发射衰变的同位素用于SPECT中，并且包括例如碘-123和锝-99m。利用锝-99m标记氨基酸的示例性方法是在存在螯合前体的情况下对高锝酸盐离子进行还原，以形成不稳定的锝-99m-前体络合物，其进而又与经双官能修饰的趋化肽的金属结合基团发生反应以形成锝-99m-趋化肽缀合物。

抗体经常用于此类体内成像诊断方法。用于体内诊断的抗体的制备和使用在本领域中是众所周知的。类似地，适体可用于此类体内成像诊断方法。例如，用于鉴别本文描述的特定生物标志物的适体可被适当地标记并且注射到个体体内以体内检测生物标志物。如前所述，根据将使用的成像模态来选择所使用的标记。与其他显像剂相比较，适体定向的显像剂可具有与组织穿透、组织分布、动力学、消除、效力和选择性相关的独特且有利的特征。

此类技术也可任选地利用标记的寡核苷酸执行，例如用于通过利用反义寡核苷酸成像来检测基因表达。这些方法用于原位杂交，例如，利用荧光分子或放射性核素作为标记。用于检测基因表达的其他方法包括例如检测报告基因的活性。

另一种一般类型的成像技术是光学成像，其中通过在受试者外部的光学装置来检测受试者体内的荧光信号。这些信号可能归因于实际的荧光和/或生物发光。光学检测装置灵敏度的提高增加了光学成像在体内诊断测定中的有用性。

有关其他技术的综述，请参见N.Blow,Nature Methods,6,465-469,2009。

使用质谱方法确定生物标志物水平

各种配置的质谱仪可用于检测生物标志物水平。有若干类型的质谱仪可供使用，或者可按不同的配置进行生产。通常，质谱仪具有以下主要部件：样品入口、离子源、质量分析器、检测器、真空系统和仪器控制系统以及数据系统。样品入口、离子源和质量分析器的差异通常定义了仪器类型及其能力。例如，入口可为毛细管柱液相色谱源，或者可为诸如用于基质辅助激光解吸中的直接探针或载物台。常见的离子源是例如电喷雾，包括纳米喷雾和微喷雾或基质辅助激光解吸。常见的质量分析器包括四极滤质器、离子阱质量分析器和飞行时间质量分析器。另外的质谱方法在本领域中是众所周知的(参见Burlingame等人，Anal.Chem.70:647R-716R(1998)；Kinter和Sherman,New York(2000))。

蛋白质生物标志物和生物标志物水平可通过以下项中的任一项来检测和测量：电喷雾电离质谱(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(M S)n、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、硅上解吸/电离(D IOS)、二次离子质谱(SIMS)、四极飞行时间(Q-TOF)、串联飞行时间(T OF/TOF)技术(称为ultraflex III TOF/TOF)、大气压化学电离质谱(AP CI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)N、大气压光化电离质谱(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS)N、四极质谱、傅里叶变换质谱(FTMS)、定量质谱以及离子阱质谱。

样品制备策略用于在蛋白质生物标志物的质谱表征和生物标志物水平的测定之前标记和富集样品。标记方法包括但不限于：用于相对和绝对定量的同量异序标签(iTRAQ)和细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)。用于在质谱分析之前选择性富集样品中的候选生物标志物蛋白质的捕获试剂包括但不限于：适体、抗体、核酸探针、嵌合体、小分子、F(ab’)₂片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体结合受体、亲和体、纳米体、锚蛋白、结构域抗体、另选的抗体支架(例如，双抗体等)、印迹聚合物、高亲和性多聚体、肽模拟物、拟肽、肽核酸、苏糖核酸、激素受体、细胞因子受体和合成受体，以及这些的修饰物和片段。

使用邻位连接测定法确定生物标志物水平

邻位连接测定法可用于确定生物标志物值。简而言之，使测试样品与可为一对抗体或一对适体的一对亲和探针接触，其中该对的每个成员都用寡核苷酸延伸。该对亲和探针的靶标可为一种蛋白质上的两个不同决定簇(determinates)或两种不同蛋白质中的每一者上的一个决定簇，它们可作为同源或异源多聚体复合物存在。当探针结合到靶决定簇时，寡核苷酸延伸的游离端变得足够接近以一起杂交。寡核苷酸延伸的杂交通过共同的连接寡核苷酸来促成，当寡核苷酸延伸定位在足够接近之处时，所述连接寡核苷酸用于将所述寡核苷酸延伸桥接在一起。一旦探针的寡核苷酸延伸被杂交，延伸的末端通过酶促DNA连接而连结在一起。

每个寡核苷酸延伸包含用于PCR扩增的引物位点。一旦寡核苷酸延伸连接在一起，寡核苷酸就会形成连续的DNA序列，所述序列通过PCR扩增揭示关于靶蛋白的身份和量的信息，以及关于蛋白质-蛋白质相互作用的信息，其中靶决定簇是在两种不同的蛋白质上。邻位连接可通过使用实时PCR而提供针对实时蛋白质浓度和相互作用信息的高灵敏度和特异性的测定。未结合所关注的决定簇的探针不具有达到接近度的对应的寡核苷酸延伸，并且不会进行连接或PCR扩增，从而导致不产生信号。

前述测定法使得能够检测可用于预测CV事件风险或可能性的方法中的生物标志物值，其中所述方法包括在来自个体的生物样品中检测至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种或所有十六种选自表1中的生物标志物的生物标志物；或者至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或所有十四种选自表2中的生物标志物的生物标志物，其中如下文所描述，使用生物标志物值的分类指示个体是否具有在90天、180天、或1年时间段内发生CV事件的高风险。根据本文描述的任何方法，可单独地检测和分类生物标志物值，或者可共同地检测和分类所述生物标志物值，例如以多重测定形式来检测和分类。

生物标志物的分类和疾病评分的计算

在一些实施方案中，给定的诊断测试的生物标志物―签名”含有一组生物标志物，每种生物标志物在所关注的群体中具有特征水平。在一些实施方案中，特征水平可指特定组中的个体的生物标志物水平的均值或平均值。在一些实施方案中，本文描述的诊断方法可用于将来自个体的未知样品指派到两个组中的一个组中(无论是否具有增加的CV事件风险)。

将样品指派到两个或更多个组中的一个组中被称为分类，并且用于完成这种指派的程序被称为分类器或分类方法。分类方法也可被称为评分方法。存在可用于从一组生物标志物水平构建诊断分类器的许多分类方法。在一些情况下，分类方法使用监督学习技术来执行，其中使用从人们希望区分的两个(或更多个，用于多重分类状态)不同组内的个体获得的样品来收集数据集。由于每个样品所属类别(组或群体)对于每个样品而言事先是已知的，因此可训练分类方法以给出期望的分类响应。也可能使用无监督学习技术来产生诊断分类器。

用于开发诊断分类器的常用方法包括：决策树；装袋+提升+森林；基于规则推理的学习；Parzen窗；线性模型；逻辑；神经网络方法；无监督聚类；K-均值；分层递升/递减；半监督学习；原型方法；最近邻；核密度估计；支持向量机；隐马尔可夫模型；玻尔兹曼学习；并且分类器可简单地或以使特定目标函数最小化的方式组合。有关综述，请参见例如PatternClassification,R.O.Duda等人编辑，John Wiley&Sons，第2版，2001；另外参见TheElements of Statistical Learning-Data Mining,Inference,and Prediction,T.Hastie等人编辑，Springer Science+Business Media,LLC，第2版，2009。

为了使用监督学习技术产生分类器，获得被称为训练数据的一组样品。在诊断测试的背景下，训练数据包括来自稍后将对其指派未知样品的不同组(类别)的样品。例如，从对照群体中的个体和特定疾病群体中的个体收集的样品可构成训练数据，以开发可将未知样品(或更特别地，由其获得样品的个体)分类为具有该疾病或者不具有该疾病的分类器。从训练数据开发分类器被称为训练分类器。关于分类器训练的具体细节取决于监督学习技术的性质。训练朴素贝叶斯分类器是这种监督学习技术的实例(参见例如PatternClassification,R.O.Duda等人编辑，John Wiley&Sons，第2版，2001；另外参见TheElements of Statistical Learning-Data Mining,Inference,and Prediction,T.Hastie等人编辑，Springer Science+Business Media,LLC，第2版，2009)。例如，在美国公布号：2012/0101002和2012/0077695中描述了朴素贝叶斯分类器的训练。

由于通常存在比训练集中的样品多许多的潜在生物标志物水平，因此必须小心避免过拟合。当统计模型描述随机误差或噪声而不是潜在关系时，发生过拟合。过拟合可以多种方式避免，所述方式包括例如限制开发分类器时使用的生物标志物的数量，假设生物标志物反应互相独立，限制所采用的潜在统计模型的复杂性以及确保潜在统计模型符合数据。

使用一组生物标志物开发诊断测试的说明性实例包括应用朴素贝叶斯分类器，这是一种基于贝叶斯定理的对生物标志物进行严格的独立处理的简单概率分类器。每种生物标志物通过每个类别中的所测量的RFU值或对数RFU(相对荧光单位)值的类别相关概率密度函数(pdf)来描述。一个类别中的生物标志物的集合的联合pdf被假设为每种生物标志物的各个类别相关pdf的乘积。在此背景下训练朴素贝叶斯分类器相当于指派参数(―参数化”)以表征类别相关pdf。可使用类别相关pdf的任何潜在模型，但模型通常应符合在训练集中观察到的数据。

朴素贝叶斯分类器的性能取决于用于构建和训练分类器的生物标志物的数量和质量。单一生物标志物将根据其KS距离(Kolmogorov-Smirnov)来表现。如果后续添加的生物标志物独立于第一生物标志物，则添加具有良好KS距离(例如，>0.3)的后续生物标志物通常会提高分类性能。使用灵敏度加特异性作为分类器评分，可利用贪心算法的变型来生成许多高评分分类器。(贪心算法是遵循带着找到全局最优值的希望在每个阶段作出局部最佳选择的问题解决元启发式方法(metaheuristic)的任何算法。)

描述分类器性能的另一种方式是利用接受者操作特征(ROC)，或者简称为ROC曲线或ROC曲线图。ROC是二元分类器系统的灵敏度、或真阳性率与假阳性率(1-特异性或1-真阴性率)的曲线图，因为它的鉴别阈值是变化的。ROC也可通过绘制阳性中真阳性的分数(TPR＝真阳性率)与阴性中的假阳性的分数(FPR＝假阳性率)来等效地表示。这也被称为相对操作特征曲线，因为它是两个操作特征(TPR和FPR)随着标准变化的比较。ROC曲线下面积(AUC)通常用作诊断准确性的综合度量。它可采用0.0至1.0的值。AUC具有一个重要的统计性质：分类器的AUC等同于分类器将随机选择的正实例排在随机选择的负实例前面的概率(Fawcett T,2006.An introduction to ROC analysis.Pattern RecognitionLetters.27:861–874)。这等同于威尔科克森秩检验(Wilcoxon test of ranks)(Hanley,J.A.,McNeil,B.J.,1982The meaning and use of the area under a receiveroperating characteristic(ROC)curve.Radiology 143,29-36.)。相对于已知参考标准描述诊断测试的性能的另一种方式是净重新分类指数：与参考标准测试比较时，新的测试正确地使风险升级或降级的能力。参见例如Pencina等人，2011,Stat.Med.30:11-21。虽然ROC曲线下的AUC对于评定2类分类器的性能而言是最优的，但分层和个性化用药依赖于群体含有多于2个类的推断。对于此类比较，上四分位数与下四分位数(或其他分层，诸如十分位数)的危险比可能更为适用。

本文实现的风险和可能性预测可应用于处于初级护理或专业心血管中心内的个体，或甚至直接应用于消费者。在一些实施方案中，用于预测事件的分类器可能涉及针对它们所应用的群体的一些校准——例如，由于种族或地理环境，可能存在变化。在一些实施方案中，此类校准可从大量群体研究中事先建立，因此当应用于单个患者时，在进行风险预测之前并入这些校准。如本文所描述，取得、适当处理并分析静脉血液样品。一旦分析完成，就可在并入或不并入来自本文描述的医疗记录的其他元数据，诸如遗传或人口统计元数据的情况下在数学上进行风险预测。取决于消费者的专业知识水平，各种形式的信息输出都是可能的。对于寻求最简单类型输出的消费者而言，在一些实施方案中，信息可能是―此人在未来x天(其中x为90-365)内是否可能具有事件，是/否”或可选地类似于―红绿灯”的红灯/黄灯/绿灯或其口头或书面等效形式，诸如高/中等/低风险。对于寻求更多细节的消费者，在一些实施方案中，风险可被输出为数字或图形输出，从而将每单位时间的事件概率示出为连续评分、或更多的层数(诸如十分位数)，和/或发生事件的平均时间和/或最可能的事件类型。在一些实施方案中，输出可包括治疗建议。随着时间的推移对同一患者的纵向监测将实现显示出对干预或生活方式改变的反应的图形。在一些实施方案中，可同时提供多于一种类型的输出以满足具有不同专业知识水平的患者和护理团队的各个成员的需求。

在一些实施方案中，例如使用适体(诸如慢解离率适体)在来自受试者的血液样品(诸如血浆样品或血清样品)中检测表1或表2所示的生物标志物。对数RFU值用于计算个体具有CV事件的风险或可能性，或预后指数(PI)。

考虑到PI，受试者在未来―t”天内遭受心血管事件(CV事件)的概率由以下公式给出：

/>

其中PI是预后指数(或线性预测值)，并且s是极值分布的相关联的尺度参数。在各种实施方案中，―t”是90至365天。

试剂盒

本文描述的生物标志物的任何组合可使用合适的试剂盒(诸如用于执行本文公开的方法的试剂盒)来检测。此外，任何试剂盒可含有如本文所描述的一种或多种可检测标记，诸如荧光部分等。

在一些实施方案中，试剂盒包括(a)用于检测生物样品中的一种或多种生物标志物的一种或多种捕获试剂(例如像，至少一种适体或抗体)，其中生物标志物包括至少两种、至少三种、至少四种、至少五种，至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种或所有十六种选自表1中的生物标志物的生物标志物；或者至少两种、至少三种、至少四种、至少五种，至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或所有十四种选自表2中的生物标志物的生物标志物；以及任选地(b)一种或多种软件或计算机程序产品，如本文进一步所描述，所述软件或计算机程序产品用于将从中获得生物样品的个体分类为具有或不具有增加的CV事件风险，或者用于确定个体具有增加的CV事件风险的可能性。可选地，可提供关于由人手动地执行以上步骤的一个或多个说明书，而不是一个或多个计算机程序产品。

在一些实施方案中，试剂盒包括固体载体、至少一种捕获试剂和信号生成材料。试剂盒还可包括关于使用装置和试剂、处理样品和分析数据的说明书。另外，试剂盒可与计算机系统或软件一起使用，以分析和报告生物样品的分析结果。

试剂盒还可含有用于处理生物样品的一种或多种试剂(例如，增溶缓冲液、清洁剂、洗涤液或缓冲液)。本文描述的任何试剂盒还可包括例如缓冲液、封闭剂、质谱基质材料、抗体捕获剂、阳性对照样品、阴性对照样品、软件和信息(诸如方案、指导和参考数据)。

在一些实施方案中，提供了用于分析CV事件风险状态的试剂盒，其中试剂盒包括对本文描述的生物标志物具有特异性的一种或多种适体的PCR引物。在一些实施方案中，试剂盒还可包括关于生物标志物的使用以及所述生物标志物与CV事件的风险预测的相关性的说明书。在一些实施方案中，试剂盒另外可包括DNA阵列，所述DNA阵列含有以下项中的一者或多者的补体：对本文描述的生物标志物具有特异性的适体、用于扩增或分离样品DNA的试剂和/或酶。在一些实施方案中，试剂盒可包括用于实时PCR的试剂，例如TaqMan探针和/或引物，以及酶。

例如，试剂盒可包括(a)试剂，所述试剂包括用于确定测试样品中的一种或多种生物标志物的水平的至少一种捕获试剂，以及任选地(b)一种或多种算法或计算机程序，所述算法或计算机程序用于执行将在测试样品中定量的每种生物标志物的量与一个或多个预定截止值进行比较的步骤。在一些实施方案中，算法或计算机程序基于所述比较而为定量的每种生物标志物指派评分，并且在一些实施方案中，将定量的每种生物标志物的所指派的评分进行组合以获得总评分。另外，在一些实施方案中，算法或计算机程序将总评分与预定评分进行比较，并且使用该比较来确定个体是否具有增加的CV事件风险。可选地，可提供关于由人手动地执行以上步骤的一个或多个说明书，而不是一个或多个算法或计算机程序。

生物标志物组

在一些实施方案中，检测了表1中列出的生物标志物中的一者或多者。在一些实施方案中，在来自患有HFrEF的个体的样品中检测了表1中列出的一种或多种生物标志物。在一些实施方案中，检测了表1中列出的所有生物标志物。在一些实施方案中，检测了表1中列出的每种蛋白质的水平。在一些实施方案中，执行对一种或多种生物标志物或所有生物标志物的检测，以便确定受试者在限定的时间段内将具有CV事件的风险或可能性。在一些此类实施方案中，限定的时间段是90天、180天或一年。在一些实施方案中，限定的时间段是一年。在一些实施方案中，CV事件是死亡。

表1

在一些实施方案中，检测了表2中列出的生物标志物中的一者或多者。在一些实施方案中，在来自患有HFpEF的个体的样品中检测了表2中列出的一种或多种生物标志物。在一些实施方案中，检测了下表中列出的所有生物标志物。在一些实施方案中，检测了表2中列出的每种蛋白质的水平。在一些实施方案中，执行对一种或多种生物标志物或所有生物标志物的检测，以便确定受试者在限定的时间段内将具有CV事件的风险或可能性。在一些此类实施方案中，限定的时间段是90天、180天或一年。在一些实施方案中，限定的时间段是一年。在一些实施方案中，CV事件是死亡。

表2

计算机方法和软件

一种用于评定个体体内发生CV事件的风险或可能性的方法可包括以下项：1)获得生物样品；2)执行分析方法以检测和测量生物样品中的生物标志物或某一组中的生物标志物集合；3)任选地执行任何数据归一化或标准化；4)确定每种生物标志物水平；以及5)报告结果。在一些实施方案中，根据受试者的群体/种族校准结果。在一些实施方案中，以某种方式将生物标志物水平进行组合并且报告组合的生物标志物水平的单一值。在这种方法中，在一些实施方案中，评分可为从所有生物标志物的积分确定的单一数值，将所述单一数值与指示疾病存在或不存在的预设阈值进行比较。或者，诊断或预测评分可为各自表示生物标志物值的一系列条，并且可将反应模式与预设模式进行比较，以确定疾病、疾患或增加的事件风险(或无增加的事件风险)的存在或不存在。

本文描述的方法的至少一些实施方案可通过使用计算机来实现。在图5中示出了计算机系统100的实例。参考图5，系统100被示出为包括经由总线108电耦合的硬件元件，包括处理器101、输入装置102、输出装置103、存储装置104、计算机可读存储介质读取器105a、通信系统106、处理加速装置(例如，DSP或专用处理器)107和存储器109。计算机可读存储介质读取器105a进一步耦合到计算机可读存储介质105b，该组合全面地代表了远程、本地、固定和/或可移动存储装置加上用于暂时和/或更永久地含有计算机可读信息的存储介质、存储器等，这可包括存储装置104、存储器109和/或任何其他这样的可存取系统100资源。系统100还包括软件元件(被示出为当前位于工作存储器191内)，包括操作系统192和其他代码193，诸如程序、数据等。

相对于图5，系统100具有广泛的灵活性和可配置性。因此，例如，可能利用单个架构来实现可根据当前期望的方案、方案变型、扩展等进一步配置的一个或多个服务器。然而，对于本领域技术人员而言将显而易见的是，可根据更具体的应用要求更好地利用实施方案。例如，一个或多个系统元件可能被实现为系统100部件内(例如，通信系统106内)的子元件。例如，也可能利用定制的硬件和/或特定元件可能在硬件、软件或两者中实现。另外，虽然可采用与其他计算装置(诸如网络输入/输出装置(未示出))的连接，但将理解，也可能利用与其他计算装置的有线、无线、调制解调器和/或其他一种或多种连接。

在一方面，所述系统可包括数据库，所述数据库含有表示CV事件的风险预测特性的生物标志物特征。生物标志物数据(或生物标志物信息)可被用作计算机的输入，以用作计算机实现的方法的一部分。生物标志物数据可包括如本文所描述的数据。

在一方面，所述系统还包括用于向一个或多个处理器提供输入数据的一个或多个装置。

所述系统还包括用于存储分级数据元素的数据集的存储器。

在另一方面，用于提供输入数据的装置包括用于检测数据元素的特征的检测器，例如像质谱仪或基因芯片读取器。

所述系统另外可包括数据库管理系统。用户请求或查询可以由数据库管理系统理解的适当语言进行格式化，所述数据库管理系统处理查询以从训练集的数据库中提取相关信息。

所述系统可能能够连接到网络服务器和一个或多个客户端所连接的网络。如本领域所已知，网络可为局域网(LAN)或广域网(WAN)。优选地，服务器包括运行计算机程序产品(例如，软件)来访问数据库数据以处理用户请求所需的硬件。

所述系统可包括用于执行来自数据库管理系统的指令的操作系统(例如，UNIX或Linux)。在一方面，操作系统可在诸如互联网的全球通信网络上操作，并且利用全球通信网络服务器来连接到这种网络。

所述系统可包括包含图形显示界面的一个或多个装置，所述图形显示界面包括界面元件，诸如按钮、下拉菜单、滚动条、用于输入文本的字段等，如本领域已知的图形用户界面中常规存在的。用户界面上输入的请求可被传输给所述系统中的应用程序以用于格式化，以在系统数据库中的一者或多者中搜索相关信息。由用户输入的请求或查询可以任何合适的数据库语言构建。

图形用户界面可由作为操作系统的一部分的图形用户界面代码生成并且可用于输入数据和/或显示输入的数据。处理后的数据的结果可显示在界面中，在与所述系统通信的打印机上打印，保存在存储器装置中，和/或通过网络传输，或者可以计算机可读介质的形式提供。

所述系统可与输入装置通信以向所述系统提供关于数据元素的数据(例如，表达值)。在一方面，输入装置可包括基因表达谱分析系统，包括例如质谱仪、基因芯片或阵列读取器等。

根据各种实施方案的用于分析CV事件风险预测生物标志物信息的方法和设备可以任何合适的方式，例如使用在计算机系统上操作的计算机程序来实现。可使用包括处理器和随机存取存储器的常规的计算机系统，诸如可远程访问的应用服务器、网络服务器、个人计算机或工作站。额外的计算机系统部件可包括存储器装置或信息存储系统(诸如大容量存储系统)和用户界面，例如常规的监视器、键盘和跟踪装置。计算机系统可为独立系统或者包括服务器和一个或多个数据库的计算机网络的一部分。

CV事件风险预测生物标志物分析系统可提供完成数据分析的功能和操作，诸如数据收集、处理、分析、报告和/或诊断。例如，在一个实施方案中，计算机系统可执行可接收、存储、搜索、分析和报告与CV事件风险预测生物标志物相关的信息的计算机程序。计算机程序可包括执行各种功能或操作的多个模块，诸如用于处理原始数据和生成补充数据的处理模块，以及用于分析原始数据和补充数据以生成CV事件风险预测状态和/或诊断或风险计算的分析模块。计算CV事件的风险状态可任选地包括生成或收集关于个体相对于疾病、疾患或事件的状况的任何其他信息(包括额外生物医学信息)，鉴别是否可能需要进一步测试，或者以其他方式评估个体的健康状态。

本文描述的一些实施方案可被实现为包括计算机程序产品。计算机程序产品可包括计算机可读介质，所述计算机可读介质具有体现在介质中的计算机可读程序代码以使得应用程序在具有数据库的计算机上执行。

如本文所使用，―计算机程序产品”是指处于自然或编程语言语句形式的有组织的指令集，所述指令集包含在任何性质(例如，书面、电子、磁性、光学或其他形式)的物理介质上并且可与计算机或其他自动化数据处理系统一起使用。此类编程语言语句在由计算机或数据处理系统执行时致使计算机或数据处理系统根据语句的特定内容起作用。计算机程序产品包括但不限于：嵌入计算机可读介质中的源代码和目标代码和/或测试或数据文库中的程序。另外，可以多种形式提供使得计算机系统或数据处理设备装置能够以预选方式起作用的计算机程序产品，包括但不限于：原始源代码、汇编代码、目标代码、机器语言、前述各项的加密或压缩版本以及任何和所有等效形式。

在一方面，提供了一种用于评估CV事件的风险或可能性的计算机程序产品。计算机程序产品包括体现程序代码的计算机可读介质，所述程序代码可由计算装置或系统的处理器执行，所述程序代码包括：检索归属于来自个体的生物样品的数据的代码，其中所述数据包括各自对应于表1或表2中的生物标志物之一的生物标志物水平；以及执行分类方法的代码，所述分类方法根据生物标志物值指示个体的CV事件风险状态。

在又一方面，提供了一种用于指示CV事件的可能性或风险的计算机程序产品。计算机程序产品包括体现程序代码的计算机可读介质，所述程序代码可由计算装置或系统的处理器执行，所述程序代码包括：检索归属于来自个体的生物样品的数据的代码，其中所述数据包括生物标志物值，所述生物标志物值对应于生物样品中选自表1或表2中提供的生物标志物的至少一种生物标志物；以及执行分类方法的代码，所述分类方法根据生物标志物值指示个体的CV事件风险状态。

尽管已经将各种实施方案描述为方法或设备，但应理解，可通过与计算机耦合的代码，例如驻留在计算机上或可由计算机访问的代码来实现实施方案。例如，可利用软件和数据库来实现上文讨论的许多方法。因此，除了通过硬件实现的实施方案之外，还应注意，这些实施方案可通过使用包括计算机可用介质的制品来实现，所述计算机可用介质具有嵌入其中的计算机可读程序代码，所述计算机可读程序代码带来本说明书中公开的功能的实现。因此，期望呈其程序代码手段的实施方案也被视为同样受到本专利的保护。另外，实施方案可被体现为存储在几乎任何种类的计算机可读存储器中的代码，所述计算机可读存储器包括但不限于：RAM、ROM、磁性介质、光学介质或磁光介质。甚至更一般地，实施方案可以软件或硬件或其任何组合实现，包括但不限于：在通用处理器上运行的软件、微代码、可编程逻辑阵列(PLA)或专用集成电路(ASIC)。

还设想了，实施方案可作为体现在载波中的计算机信号、以及通过传输介质传播的信号(例如，电信号和光信号)来实现。因此，上文讨论的各种类型的信息可以诸如数据结构的结构进行格式化，并且作为电信号通过传输介质进行传输或存储在计算机可读介质上。

还应注意，本文叙述的许多结构、材料和动作可被叙述为用于执行功能的手段或用于执行功能的步骤。因此，应理解，这种语言有权覆盖在本说明书内公开的所有此类结构、材料或动作以及其等效形式，包括以引用的方式并入的事物。

本文公开的生物标志物的利用以及用于确定生物标志物值的各种方法在上文相对于CV事件的风险评估进行了详细描述。然而，该过程的应用、所鉴别的生物标志物的使用以及用于确定生物标志物值的方法完全适用于其他特定类型的心血管疾患、任何其他疾病或医学疾患，或者可能获益于或不获益于辅助医学治疗的个体的鉴别。

其他方法

在一些实施方案中，本文描述的生物标志物和方法用于确定医疗保险费或承保范围判定和/或人寿保险费或承保范围判定。在一些实施方案中，本文描述的方法的结果用于确定医疗保险费和/或人寿保险费。在一些此类情况下，提供医疗保险或人寿保险的组织请求或以其他方式获得有关受试者的CV事件的风险或可能性的信息，并且使用该信息来确定受试者的适当的医疗保险费或人寿保险费。在一些实施方案中，由提供医疗保险或人寿保险的组织请求测试并为所述测试付费。在一些实施方案中，由实践或卫生系统或公司的潜在收购者使用测试来预测收购继续进行情况下的未来负债或成本。

在一些实施方案中，本文描述的生物标志物和方法用于预测和/或管理医疗资源的利用。在一些此类实施方案中，这些方法不是出于这种预测的目的而实施，而是将从该方法获得的信息用于医疗资源的利用的这种预测和/或管理中。例如，测试机构或医院可针对许多受试者汇总来自本方法的信息，以便预测和/或管理特定机构处或特定地理区域中的医疗资源的利用。

实施例

提供以下实施例只是为了说明的目的而不是意图限制如所附权利要求中所限定的本申请的范围。以下实施方案中描述的常规分子生物学技术可如标准实验室手册中所描述来实施，诸如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(2001)。

实施例1：使用适体的示例性生物标志物检测

检测样品中的一种或多种生物标志物蛋白质的示例性方法例如在Kraemer等人，PLoS One 6(10):e26332中进行描述，并且在下文进行描述。三种不同的定量方法：描述了基于微阵列的杂交、基于Luminex珠粒的方法和qPCR。

试剂

HEPES、NaCl、KCl、EDTA、EGTA、MgCl₂和Tween-20可例如从Fisher Biosciences购买。标称8000分子量的葡聚糖硫酸钠盐(DxSO4)可例如从AIC购买，并且用去离子水透析，至少20小时更换一次。KOD EX DNA聚合酶可例如从VWR购买。四甲基氯化铵和CAPSO可例如从Sigma-Aldrich购买，并且链霉亲和素-藻红蛋白(SAPE)可例如从Moss公司购买。4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)可例如从Gold Biotechnology购买。链霉亲和素包被的96孔板可例如从Thermo Scientific购买(Pierce链霉亲和素包被板HBC，透明，96孔，产品编号15500或15501)。NHS-PEO4-生物素可例如从Thermo Scientific购买(EZ-Link NHS-PEO4-生物素，产品编号21329)，溶解于无水DMSO中，并且可以一次性使用的等分试样冷冻保存。IL-8、MIP-4、脂质运载蛋白-2、RANTES、MMP-7和MMP-9可例如从R&D Systems购买。抵抗素和MCP-1可例如从PeproTech购买，并且tPA可例如从VWR购买。

核酸

常规的(包括胺和生物素取代的)寡脱氧核苷酸可例如从Integrate d DNATechnologies(IDT)购买。Z-嵌段是序列5'-(AC-BnBn)7-AC-3'的单链寡脱氧核苷酸，其中Bn指示苄基取代的脱氧尿苷残基。Z-嵌段可使用常规的亚磷酰胺化学法来合成。适体捕获试剂也可通过常规的亚磷酰胺化学法来合成，并且可使用例如timberline TL-600或T L-150加热器和用于洗脱产物的一定梯度的三乙基碳酸氢铵(TEAB)/ACN，例如在21.5×75mm的PRP-3柱上纯化，所述柱在80℃下在Waters Autopurification 2767系统(或Waters 600系列半自动化系统)上操作。在260nm处执行检测，并且在汇集最佳级分之前跨主峰收集级分。

缓冲液

缓冲液SB18由40mM HEPES、101mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2和0.05％(v/v)Tween20构成，所述缓冲液用NaOH调整为pH7.5。缓冲液SB17是补充有1mM EDTA三钠的SB18。缓冲液PB1由10mM HEPES、101mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2、1mM EDTA三钠和0.05％(v/v)Tween-20构成，所述缓冲液用NaOH调整为pH 7.5。CAPSO洗脱缓冲液由100mM CAPSO pH10.0和1M NaCl组成。中和缓冲液含有500mM HEPES、500mM HCl和0.05％(v/v)Tween-20。Agilent杂交缓冲液是专有制剂，其作为试剂盒(Oligo aCGH/ChIP芯片上杂交试剂盒)的一部分进行供应。Agilent洗涤缓冲液1是专有制剂(Oligo aCGH/ChIP芯片上洗涤缓冲液1，Agilent)。Agilent洗涤缓冲液2是专有制剂(Oligo aCGH/ChIP芯片上洗涤缓冲液2，Agilent)。TMAC杂交溶液由4.5M四甲基氯化铵、6mM EDTA三钠、75mM Tris-HCl(pH 8.0)和0.15％(v/v)Sarkosyl组成。KOD缓冲液(10倍浓缩)由1200mM Tris-HCl、15mM MgSO4、100mMKCl、60mM(NH4)2SO4、1％v/v Triton-X 100和1mg/mL BSA组成。

样品制备

将血清(在-80℃下以100μL等分试样保存)在25℃水浴中解冻10分钟，然后在样品稀释之前保存于冰上。通过轻轻涡旋8秒来混合样品。通过稀释到补充有0.6mM MgCl2、1mMEGTA三钠、0.8mM AEBSF和2μM Z-嵌段的0.94×SB17中来制备6％血清样品溶液。将6％血清储备溶液的一部分在SB17中进行10倍稀释以产生0.6％血清储备液。在一些实施方案中，使用6％和0.6％储备液以分别检测高丰度和低丰度分析物。

捕获试剂(适体)和链霉亲和素板制备

根据其同源分析物(或生物标志物)的相对丰度将适体分成2种混合物。对于每种适体，储备浓度为4nM，并且每种适体的最终浓度为0.5nM。将适体储备混合物在SB17缓冲液中进行4倍稀释，经5分钟加热到95℃并且经15分钟时间段冷却到37℃，之后进行使用。这种变性-复性循环意图将适体构象异构体分布归一化并且因此确保可再现的适体活性，尽管存在可变的历程。在使用之前，将链霉亲和素板用150μL缓冲液PB1洗涤两次。

孵育和板捕获

将热冷却的2×适体混合物(55μL)与等体积的6％或0.6％血清稀释液进行组合，从而产生含有3％和0.3％血清的混合物。将板用硅胶密封垫(Axymat硅胶密封垫，VWR)密封并且在37℃下孵育1.5小时。然后将混合物转移到洗涤过的96孔链霉亲和素板的孔中并且在设定为37℃的Eppendorf Thermomixer上在以800rpm振荡下进一步孵育两小时。

手动测定

除非另外指明，否则通过倾卸来去除液体，之后在分层的纸巾上轻叩2次。洗涤体积是150μL，并且所有振荡孵育都是在设定为25℃、800rpm的Eppendorf Thermomixer上进行。通过吸移来去除混合物，并且利用补充有1mM硫酸葡聚糖和500μM生物素的缓冲液PB1经1分钟将板洗涤两次，之后利用缓冲液PB1经15秒将所述板洗涤4次。添加含1mM NHS-PEO4-生物素的缓冲液PB1的新鲜制取的溶液(150μL/孔)，并且在振荡下将板孵育5分钟。去除NHS-生物素溶液，并且利用补充有20mM甘氨酸的缓冲液PB1将板洗涤3次，并且利用缓冲液PB1将所述板洗涤3次。然后将补充有1mM DxSO4的85μL缓冲液PB1添加到每个孔，并且在BlackRay紫外灯(标称波长365nm)下在5cm的距离处在振荡下对板辐照20分钟。将样品转移到新的洗涤过的链霉亲和素包被板、或现有的洗涤过的链霉亲和素板的未使用的孔中，从而将高样品稀释度和低样品稀释度混合物组合到单一孔中。在室温下在振荡下将样品孵育10分钟。去除未被吸附的物质，并且利用补充有30％甘油的缓冲液PB1将板洗涤8次，每次持续15秒。然后利用缓冲液PB1将板洗涤1次。在室温下利用100μL CAPSO洗脱缓冲液将适体洗脱5分钟。将90μL洗脱物转移到96孔HybAid板中，并且添加10μL中和缓冲液。

半自动化测定

将携带被吸附的平衡混合物的链霉亲和素板放置在BioTek EL406板洗涤器的平台上，所述板洗涤器被编程为执行以下步骤：通过抽吸来去除未被吸附的物质，并且利用补充有1mM硫酸葡聚糖和500μM生物素的300μL缓冲液PB1将孔洗涤4次。然后利用300μL缓冲液PB1将孔洗涤3次。添加含1mM NHS-PEO4-生物素的缓冲液PB1的150μL新鲜制备(从100mM的DMSO储备液制备)的溶液。在振荡下将板孵育5分钟。抽吸出液体，并且利用补充有10mM甘氨酸的300μL缓冲液PB1将孔洗涤8次。添加补充有1mM硫酸葡聚糖的100μL缓冲液PB1。在这些自动化步骤之后，将板从板洗涤器中移除，并且在安装在紫外光源(BlackRay，标称波长365nm)下方的热振荡器上在5cm的距离处放置20分钟。热振荡器被设定为800rpm和25℃。在20分钟辐照之后，将样品手动地转移到新的洗涤过的链霉亲和素板(或现有的洗涤过的板的未使用的孔)中。此时将高丰度(3％血清+3％适体混合物)和低丰度反应混合物(0.3％血清+0.3％适体混合物)组合到单一孔中。将这个―两者捕集(Catch-2)”板放置在BioTekEL406板洗涤器的平台上，所述板洗涤器被编程为执行以下步骤：在振荡下将板孵育10分钟。抽吸出液体，并且利用补充有30％甘油的300μL缓冲液PB1将孔洗涤21次。利用300μL缓冲液PB1将孔洗涤5次，并且抽吸出最终洗涤液。添加100μL CAPSO洗脱缓冲液，并且在振荡下将适体洗脱5分钟。在这些自动化步骤之后，接着将板从板洗涤器的平台中移除，并且将样品的90μL等分试样手动地转移到含有10μL中和缓冲液的HybAid 96孔板的孔中。

与定制的Agilent 8×15k微阵列杂交

将24μL中和的洗脱物转移到新的96孔板中，并且将含有由10种Cy3适体构成的一组杂交对照的6μL的10×Agilent嵌段(Oligo aCGH/ChIP芯片上杂交试剂盒，大体积，Agilent 5188–5380)添加到每个孔。将30μL的2×Agilent杂交缓冲液添加到每个样品并且进行混合。将40μL所得杂交溶液手动地吸移到杂交衬垫载玻片(杂交衬垫载玻片，每个载玻片8个微阵列形式，Agilent)的每个―孔”中。根据制造商方案，将每个阵列携带与具有20×dT接头的每种适体的40个核苷酸随机区域互补的10种探针的定制的Agilent微阵列载玻片放置到衬垫载玻片上。夹紧装配体(杂交室试剂盒-由SureHyb实现，Agilent)，并且在以20rpm旋转时在60℃下将所述装配体孵育19小时。

杂交后洗涤

将约400mL Agilent洗涤缓冲液1放置到两个单独的玻璃染色皿中的每一者中。当浸没在洗涤缓冲液1中时，拆卸并分开载玻片(一次不超过两个)，之后将所述载玻片转移到也含有洗涤缓冲液1的第二染色皿中的载玻片架中。在搅拌下将载玻片在洗涤缓冲液1中另外孵育5分钟。将载玻片转移到预平衡至37℃的洗涤缓冲液2中，并且在搅拌下孵育5分钟。将载玻片转移到含有乙腈的第四染色皿中，并且在搅拌下孵育5分钟。

微阵列成像

在100％ PMT设定以及在0.05处实现的XRD选项下，在5μm分辨率下，使用Cy3通道经由Agilent G2565CA微阵列扫描仪系统对微阵列载玻片进行成像。使用10.5.1.1版Agilent特征提取软件在GE1_105_Dec08方案下处理所得的TIFF图像。

Luminex探针设计

固定于珠粒的探针具有与靶适体的40个核苷酸随机区域的3’端互补的40个脱氧核苷酸。通过携带5’氨基端的六乙二醇(HEG)接头使适体互补区域偶联到Luminex微球体。生物素化的检测脱氧寡核苷酸包含与靶适体的5’引物区域互补的17至21个脱氧核苷酸。生物素部分附接于检测寡聚物的3’端。

使探针偶联到Luminex微球体

基本上根据制造商说明书，但在以下修改下使探针偶联到Luminex Microplex微球体：氨基端寡核苷酸量是每2.5×10⁶个微球体0.08nMol，并且第二次EDC添加量在10mg/mL下是5μL。在设定为25℃和600rpm的Eppendorf ThermoShaker中进行偶联反应。

微球体杂交

涡旋微球体储备溶液(约40000个微球体/μL)，并且在Health Sonics超声清洗器(型号：T1.9C)中将所述微球体储备溶液超声处理60秒以使微球体悬浮。在1.5×TMAC杂交溶液中将悬浮的微球体稀释成每个反应有2000个微球体，并且通过涡旋和超声处理来混合。将每个反应33μL的珠粒混合物转移到96孔HybAid板中。将含15nM生物素化的检测寡核苷酸储备液的7μL的1×TE缓冲液添加到每个反应并且进行混合。添加10μL中和的测定样品，并且利用硅盖垫密封件将板密封。首先在96℃下将板孵育5分钟，并且在常规的杂交烘箱中在50℃下在不搅拌的情况下孵育过夜。利用补充有0.5％(w/v)BSA的75μL的1×TMAC杂交溶液将过滤板(Dura pore，Millipore部件编号MSBVN1250，1.2μm孔隙大小)预先润湿。将来自杂交反应的整个样品体积转移到过滤板中。利用含有0.5％ BSA的75μL的1×TMAC杂交溶液冲洗杂交板，并且将任何剩余物质都转移到过滤板中。在缓慢真空下过滤样品，其中历经约8秒抽空150μL缓冲液。利用含有0.5％ BSA的75μL的1×TMAC杂交溶液将过滤板洗涤1次，并且将过滤板中的微球体再悬浮于含有0.5％ BSA的75μL的1×TMAC杂交溶液中。对过滤板进行保护而使其免于光照，并且在Eppendorf Thermalmixer R上在1000rpm下孵育5分钟。然后利用含有0.5％ BSA的75μL的1×TMAC杂交溶液将过滤板洗涤1次。将75μL含10μg/mL链霉亲和素藻红蛋白(SAPE-100,MOSS公司)的1×TMAC杂交溶液添加到每个反应，并且在Eppendorf Thermalmixer R上在25℃下以1000rpm孵育60分钟。利用含有0.5％ BSA的75μL的1×TMAC杂交溶液将过滤板洗涤2次，并且将过滤板中的微球体再悬浮于含有0.5％ BSA的75μL的1×TMAC杂交溶液中。然后在受到免于光照的保护下在Eppendorf ThermalmixerR上在1000rpm下将过滤板孵育5分钟。然后利用含有0.5％ BSA的75μL的1×TMAC杂交溶液将过滤板洗涤1次。将微球体再悬浮于补充有0.5％ BSA的75μL的1×TMAC杂交溶液中，并且在运行XPonent 3.0软件的Luminex 100仪器上进行分析。在高PMT校准和7500至18000的双重鉴别器设定下，对每种珠粒类型计数至少100个微球体。

QPCR读出

在水中，在108至102个拷贝的范围内，在10倍稀释以及无模板对照下制取qPCR的标准曲线。将中和的测定样品40倍稀释到diH2O中。在2×最终浓度(2×KOD缓冲液、400μMdNTP混合物、400nM正向引物和反向引物混合物、2×SYBR Green I和0.5U KOD EX)下制备qPCR主混合物。将10μL的2×qPCR主混合物添加到10μL稀释的测定样品。在BioRad MyIQiCycler上运行qPCR，先是在96℃下运行2分钟，接着是在96℃下持续5秒并在72℃下持续30秒的40次循环。

实施例2.HFrEF模型和心血管事件的预测

为了预测患有HFrEF的个体在一年内将具有CV事件的风险或可能性，开发了含有一组16种生物标志物蛋白质的模型。CV事件被定义为死亡。训练分析是使用Bristol MyersSquibb(BMS)Penn心力衰竭研究(PHFS)数据集开发。PHFS包括1,345名患者和360个事件。亨利福特心力衰竭(HFHF)研究包括620名患者和222个事件。社区动脉粥样硬化危险(ARIC)研究包括44名患者和25个事件。ARIC visit5数据和亨利福特数据集用于在精化时进行验证。

表3A示出了用于HFrEF模型开发(训练和验证)和校验的数据集的分层。

表3A

HFrEF模型是具有威布尔(Weibull)分布的加速失败时间(AFT)存活模型。作为其特征，这个模型具有17种适体。总之，17种适体结合16种不同的生物标志物蛋白质，在表1中列出了所述生物标志物蛋白质。这个模型的输出是在指定时间点的存活概率，即为(1-p(该时间点的全因死亡))。因此，输出是0与1之间的数字，其中0是最低存活概率(最高风险)，而1是最高存活概率(最低风险)。使用重复Lasso AFT存活模型的多次迭代对特征列表进行精化，并且使用非惩罚型AFT回归方法训练最终模型。

总体结果

每个模型拟合是具有威布尔分布的使用相应试剂值的线性组合的拟合的加速失败时间回归模型。一致性指数(C-指数)是通过比较由每个相应模型预测的1年风险概率与训练数据中的死亡或删失时间的一致性来计算。

在下表3B中给出了使用模型预测指定时间范围内死亡的C-指数和ROC曲线下面积(AUC)值。

表3B

*C-指数不是时间特定的，因此对于6个月和1年时间点两者，C-指数校验结果将是相同的。

模型开发

表4A示出了按训练/验证/校验和数据集细分，在6个月、1年之前，在研究中的任何时间点处以及不在研究中的时间点处经历死亡的个体的数量。

表4A

在下表4B至表4D中示出了用于验证中使用的训练数据集、ARIC visit 5数据集和亨利福特数据集，以及校验中使用的PHFS和亨利福特(HFHF)数据集的PHFS开发队列的部分的人口统计数据。

表4B：用于训练、验证和校验数据集的PHFS开发队列

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为了确保数据质量，在分析数据之前执行预处理步骤。预处理步骤包括数据质量控制(QC)和预分析。

关于PHFS数据的数据QC显示，29个样品未通过行核查(row-check)，这意味着杂交或三个中值比例因子中的至少一个超出了0.4至2.5的范围，从而表明该特定样品存在通过再次运行所述样品都将无法解决的技术问题(例如，堵塞(clog))。另外，存在12个异常值样品，其中至少5％的测量结果超过了来自中值信号的6个MAD。从进一步分析中去除这总共41个样品(1.1％)。最后，从数据集中去除所有未通过靶标确认特异性测试的分析物。

有关亨利福特数据的数据QC显示，24个样品未通过行核查并且被去除。这是该组中644名HFrEF患者的3.7％。这个数据集中不存在异常值样品。

关于ARIC Visit 5数据的数据QC未显示行核查失败或异常值，并且因此不去除样品。

预分析并没有显示探索的任何临床变量(年龄、性别、种族、糖尿病状态、BMI、HFpEF/HFrEF状态、事件状态和eGFR)与任何数据集中的归一化比例因子之间存在密切关系的证据。

在数据质量控制和预分析之后，分两个步骤完成模型开发：1)概念证明(POC)，以及2)精化。

在POC步骤中仅使用了训练数据。探索的初步模型是具有弹性网正则化的Cox，以及使用威布尔和对数逻辑分布的具有弹性网正则化的AFT，全部都使用10次重复的5折交叉校验。对于POC分析，性别和年龄被包括在针对复合终点的初始仅HFrEF模型的开发中。

在精化时开发的模型使用了PFHS、ARIC visit 5和亨利福特数据集。就像在POC中一样，PHFS数据以80/20划入训练/校验。所有ARIC数据(44个样品)都仅用于验证。亨利福特数据以20/80划入验证/校验。

最终模型是具有威布尔分布的AFT模型，并且具有17个特征，即为17种适体。选择这种模型类型的原因在于其在POC中的表现。

特征列表是使用具有3次重复的五折交叉校验的AFT弹性网模型，使用多轮重复Lasso(其中λ＝100且α＝0.125)来开发。用POC分析中排名前100名的单变量特征启动所述模型。在每一轮模型拟合之后，人为确定系数大小的阈值，并且从特征列表中去除具有最小系数(以绝对值计)的特征。重复这项操作，直到所得的模型指标(一年(365天)处的C-指数和AUC)开始落入验证集中。然后使用17种适体的最终列表来拟合不具有惩罚参数的标准AFT存活模型。

POC结果

对于以全因死亡为终点的HFrEF模型，满足了初始模型性能标准，从而提供了足够的证据来将这项测试移入模型精化中。针对复合终点的全患者模型和HFrEF模型都未通过初始性能标准，并且不建议移入精化中。

POC结果显示，在不同的错误发现率(FDR)下显著的许多分析物调整了Cox模型的p值水平。

可在表5中观察到关于全因死亡-射血分数降低测试的心力衰竭预后的那些数字和百分比。

表5

FDR	#分析物(％)≤FDR水平
		0.10	1853(35.1％)
0.05	1584(30.0％)
		0.01	1228(23.2％)

表现最好的模型是具有弹性网回归惩罚参数的Cox模型，其C-指数达到0.751。最好的AFT对数逻辑模型的C-指数达到0.71。这两者都超过了C-指数>0.67的可行性阈值。由于AFT模型的更好的可解释性，因此这是用于精化的优选方法。这个模型在一年处的AUC为0.782。

在POC中向所述模型添加年龄和性别并没有提高模型性能，并且在精化时没有包括在任何模型中。

精化结果

在针对HFrEF群体精化时开发的最终模型是使用威布尔分布的17-适体AFT存活模型。最终模型不包括正则化参数(α和λ)。

具有31个特征的模型在训练和验证数据方面取得了略好的指标，但远不如模型强化期间稳定，并且因此被拒绝了。

所述模型在用于POC的PHFS数据中的80％上进行了训练。验证指标是针对所有患有HFrEF的ARIC visit 5患者和20％的患有HFrEF的亨利福特患者进行计算。其余数据(20％的PHFS和80％的亨利福特数据)被留出来进行校验。在上表3B中示出了使用所述模型预测一年内死亡或预测一年内复合终点的C-指数和AUC结果。

图1示出了训练数据集的观察到的Kaplan-Meier概率，其中个体按365天内的预测事件概率分为多个四分位数。正如对表现良好的模型预期的那样，这些线在180天和365天处很好地分开。

校验

在模型开发中未使用的20％的PHFS和80％的亨利福特数据上评定了模型的校验。预测的是一年内的存活概率。为了通过校验，需要C-指数和AUC的最小值为0.7。

在表6中针对训练集、验证集和校验集示出了在1年(365天)和6个月(180天)处的AUC、以及C-指数。所有校验指标都高于通过校验所需的指标。(在一年和六个月处C-指数>0.7且AUC>0.7)。就像预期的那样，从训练数据到校验数据在所有三个指标上都略有下降。

表6

图2A示出了校验数据集的观察到的Kaplan-Meier概率，其中个体按365天内的预测事件概率分为多个四分位数。正如我们对表现良好的模型期待看到的那样，这些线在180天和365天处很好地分开。另外，这些线在约45天之后没有交叉，这是模型表现符合预期的另一个指标。图2B示出了在按预测风险四分位数分层时在校验数据中观察到的存活概率，对于不同的Kaplan-Meier曲线都具有95％的置信区间。每个四分位数的存活概率截止值为Q4：p<0.813，Q3：p<0.9；Q2<0.942，且Q1>0.942。

使用最终模型评估干扰测试数据的推定干扰性。1000和2000mg/dL处的白蛋白、500和1000mg/dL处的血红蛋白、胆固醇和缬沙坦都未通过365天和180天处的干扰测试的第一步骤，但没有一个会对模型的C-指数产生明显的影响。超出范围的RFU值是在模型开发期间经由缩尾处理来估算。总而言之，在校验数据上的模型强化工具结果(包括干扰测试和测定噪声模拟)是令人满意的，满足了365天和180天两者处的C-指数和AUC指标目标两者。

实施例3：HFrEF生物标志物组模型的分析

对包括表1中列出的生物标志物的各种组合的模型生物标志物组进行分析，以确定每个组的一年内全因死亡的C-指数。下表7和表8示出了在测量包括1至8种生物标志物蛋白质的各种组合时的模型结果。

表7中的结果显示，包括CCL14、RNASE6、REG3A和SVEP1中的至少两者，或CCL14、RNASE6、REG3A和ADAMTSL2中的至少两者的组表现出色，C-指数高于0.700。

表8中的结果还显示，包括ADAMTSL2、CCL14、REG3A、RNASE6或SVEP1并包括GDF15、THBS2、SVEP1、RNASE1、TAGLN、RSPO4和WFDC2中的至少一者的许多组表现出色，C-指数高于0.700。在有两次包括SVEP1的组中，使用结合SVEP1的两种不同的适体测量SVEP1。

表7：包括由所指示的基因表达的蛋白质的组的性能

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表8：包括由所指示的基因表达的蛋白质的组的性能

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实施例4.HFpEF模型和心血管事件的预测

为了预测患有HFpEF的个体在一年内将具有CV事件的风险或可能性，开发了含有一组14种生物标志物蛋白质的模型。CV事件被定义为死亡。训练分析是使用BMS Penn心力衰竭研究(PHFS)数据集开发。PHFS包括1,345名患者和360个事件。亚利桑那大学亨利福特数据集(AZHF)和ARIC visit 5数据集的一部分用于验证。校验数据集是来自PHFS、AZHF和ARIC数据集的留出部分。

表9A示出了用于HFpEF模型训练、验证和校验的数据集的分层。

表9A

HFpEF模型是具有威布尔分布的加速失败时间(AFT)存活模型。作为其特征，这个模型具有14种适体。14种适体结合14种不同的生物标志物蛋白质，在表2中列出了所述生物标志物蛋白质。这个模型的输出是一年内的存活概率，而传统指标在传统上被评定为逆概率(即，发生事件的概率)。使用训练和验证数据集中的单变量关联、用于特征选择模型的交叉校验弹性网以及具有高CV的分析物的去除来精化特征列表。使用非惩罚型AFT回归方法训练最终模型。在下表9B中示出了模型指标。表9B中的结果显示，在对训练、验证和校验数据集的1年风险预测中，所述模型超过了性能标准。

表9B

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模型开发

在下表10中示出了训练数据集中使用的PHFS开发队列的部分的人口统计数据。在表11A和表11B中分别示出了验证数据集中使用的AZHF队列和ARIC visit 5队列的部分的人口统计数据。在表12中相应地示出了校验数据集中使用的PHFS、AZHF、ARIC visit 5队列的部分的人口统计数据。

表10：PHFS开发队列

表11A：AZHF验证队列

表11B：ARIC visit 5验证队列

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表12：组合校验队列

为了确保数据质量，在分析数据之前执行预处理步骤。预处理步骤包括数据质量控制(QC)和预分析。

数据QC显示，原始组合数据集中的29个样品未通过行核查，这意味着杂交或三个中值比例因子中的至少一个超出了0.4至2.5的范围，从而表明该特定样品存在通过再次运行所述样品都将无法解决的技术问题(例如，堵塞)。另外，存在12个异常值样品，其中至少5％的测量结果超过了来自中值信号的6个MAD。从进一步分析中去除这总共41个样品(1.1％)。最后，从数据集中去除所有未通过靶标确认特异性测试的分析物。

预分析并没有显示探索的任何临床变量(年龄、性别、种族、糖尿病状态、BMI、HFpEF/HFrEF状态、事件状态和eGFR)与归一化比例因子之间存在密切关系的证据。

在数据质量控制和预分析之后，分两个步骤完成模型开发：1)概念证明(POC)，以及2)精化。

在POC步骤中仅使用了训练数据。探索的初步模型是具有弹性网正则化的Cox，以及使用威布尔和对数逻辑分布的具有弹性网正则化的AFT，全部都使用10次重复的5折交叉校验。

对于复合终点和全因死亡终点两者，都满足初始模型性能标准。另外，针对全因死亡训练的HFpEF模型表现得几乎与在预测复合终点时针对复合终点训练的模型一样好。针对全因死亡训练了在精化中寻求的HFpEF，使得它与HFrEF模型精化一致(参见实施例2)。

在精化时开发的模型使用了PFHS、AZHF和ARIC visit 5数据集。就像在POC中一样，PHFS数据以80/20划入训练/校验。AZHF以20/80划入验证/校验，以保留相当大的候选校验数据集。ARIC数据以50/50划分。

最终模型是威布尔AFT模型，并且具有14个特征。选择这种模型类型的原因在于其在POC中的表现、与HFrEF模型的一致性、以及提供估计风险概率的能力。

POC结果

POC结果显示，对于单变量Cox与终点的关联，许多分析物在不同的FDR水平下是显著的。在下表13中示出了关于全因死亡POC的HFpEF预后的那些数字和百分比。

表13

FDR	#分析物(％)≤FDR水平
		0.10	780(14.7％)
0.05	593(11.2％)
		0.01	323(6.1％)

表现最好的模型是AFT威布尔模型，其C-指数达到0.698，并且90天处的AUC为0.81，而365天处的AUC为0.685。这两个模型都移入精化中。

尽管它不是预先定义的模型之一，但也完成了针对全因死亡训练以及针对全因死亡终点评估的HFpEF患者的评定。最佳模型是AFT威布尔分布，其C-指数达到0.718。由于这个模型通过了C-指数大于0.67的POC标准，因此它也被移入精化。

精化结果

在针对HFpEF群体精化时开发的最终模型是使用威布尔分布的14-适体AFT存活模型。最终模型不包括正则化参数(α和λ)。所述模型在用于POC的PHFS数据中的80％上进行了训练。验证指标是针对20％的患有HFpEF的AZHF患者和50％的患有HFpEF的ARIC visit5患者进行计算。其余数据被留出来进行校验。

所述模型是使用来自推导和AZHF验证数据集的重叠的单变量特征的简化特征列表来构建，并且通过LASSO特征选择进一步精化。最佳模型的α为0.2，最小λ为(0.1)，并且观察到具有15个特征的所得最佳模型在训练与验证之间的C-指数差异仅为1％，两组都高于0.80。进一步评定了精化后的模型，并且为所得的14-特征模型去除了具有高CV的特征。使用1年处的C-指数和AUC评定最终模型以预测全因死亡的终点。在预测住院治疗或死亡的复合终点时，还评定了预测的一致性和AUC。在下表14中示出了训练和验证数据集的结果。95％置信区间(CI)在括号中示出。

表14

校验

在模型开发中未使用的20％的PHFS和80％的AZHF数据上评定了模型的校验。辅助校验数据集是50％的ARIV visit 5。预测的是一年内的存活概率。为了通过校验，需要C-指数和AUC的最小值为0.7。

在下表15中示出了校验结果，以及用于比较的训练和验证结果。在表15中针对训练集、验证集和校验集示出了在1年(365天)和6个月(180天)处的AUC、以及C-指数。所有校验指标都高于通过校验所需的指标(在一年和六个月处C-指数>0.7且AUC>0.7)。

表15

除了区分指标(C-指数和AUC)之外，在训练和校验数据集中还观察到了预测模型在观察到的事件率上的拟合。使用拟合的AFT模型，预测了每个相应的样品在0至365天的每个离散的时间点处的存活概率。

图3和图4分别示出了在按365天内的预测风险四分位数分层时对校验和训练数据集观察到的Kaplan-Meier概率。正如对表现良好的模型预期的那样，这些线在180天和365天处分开。另外，这些线在约45天之后没有交叉，这是模型表现符合预期的另一个指标。

使用最终模型评估干扰测试数据的推定干扰性。只有白蛋白、血红蛋白和缬沙坦未通过365天和180天处的干扰测试的第一步骤，但它们中没有一个会显著地影响180天或365天的模型输出性能指标。最终模型具有14个特征，并且在HFpEF患者中预测到了365天或180天死亡风险。模型输出是0至1的风险概率。在校验数据集中，所述模型输出都达到或超过了相应时间点处C-指数和AUC的校验标准。

实施例5：HFpEF生物标志物组模型的分析

对包括表2中列出的生物标志物的各种组合的模型生物标志物组进行分析，以确定每个组的一年内全因死亡的C-指数。下表16A和表16B示出了在测量包括1至8种生物标志物蛋白质的各种组合时的模型结果。表16A中的结果显示，至少包括GDF15和RET或CHRDL1的组表现出色，C-指数高于0.700。另外，包括GDF15、WFDC2、CLEC3B、GHR、MUC16、NPPB、IGFBP2、CCN5、TNNT2、HSPB6、SLPI、MMP12、RET和CHRDL1中的至少两到十三种的组表现出色。表16A和表16B中的结果显示，包括GDF15、WFDC2、CLEC3B、GHR、MUC16、NPPB、IGFBP2、CCN5、TNNT2、HSPB6、SLPI、MMP12、RET和CHRDL1中的至少三者的组表现出色，C-指数高于0.700。

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Claims (77)

1.一种用于为受试者筛选心血管事件(CV)事件的风险的方法，所述方法包括：形成具有N种生物标志物蛋白质的生物标志物组；以及检测来自所述受试者的样品中所述N种生物标志物蛋白质中的每一者的水平，其中N至少为2，并且其中a)所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者选自HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1和ATL2；或b)所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1和ATL2，并且所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自N端BNP前体、RSPO4、BNP、MIC-1、FABPA、ILRL1、ANGP2、HE4、TAGL、RNAS1和TSP2。

2.一种预测受试者将具有CV事件的可能性的方法，所述方法包括：形成具有N种生物标志物蛋白质的生物标志物组；以及检测来自所述受试者的样品中所述N种生物标志物蛋白质中的每一者的水平，其中N至少为2，并且其中a)所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者选自HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1和ATL2；或b)所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1和ATL2，并且所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自N端BNP前体、RSPO4、BNP、MIC-1、FABPA、ILRL1、ANGP2、HE4、TAGL、RNAS1和TSP2。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是RNAS6和PAP1。

4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是RNAS6和ATL2。

5.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是HCC-1和PAP1。

6.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是HCC-1和ATL2。

7.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是HCC-1和RNAS6。

8.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是PAP1和SVEP1。

9.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是HCC-1和SVEP1。

10.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是RNAS6和SVEP1。

11.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是PAP1和ATL2。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质全部选自HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1、ATL2、N端BNP前体、RSPO4、BNP、MIC-1、FABPA、ILRL1、ANGP2、HE4、TAGL、RNAS1和TSP2。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是MIC-1。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是RNAS1。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中N为2，N为3，N为4，N为5，N为6，N为7，N为8，N为9，N为10，N为11，N为12，N为13，N为14，N为15，或N为16。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述受试者患有射血分数降低的心力衰竭。

17.一种用于为受试者筛选心血管事件(CV)事件的风险的方法，所述方法包括：形成具有N种生物标志物蛋白质的生物标志物组；以及检测来自所述受试者的样品中所述N种生物标志物蛋白质中的每一者的水平，其中N至少为2，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自RET和CRDL1，并且所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自四连接素、N端BNP前体、TNNT2、CA125、MIC-1、SLPI、HE4、MMP-12、HSPB6、WISP-2、GHR和IGFBP-2。

18.一种预测受试者将具有CV事件的可能性的方法，所述方法包括：形成具有N种生物标志物蛋白质的生物标志物组；以及检测来自所述受试者的样品中所述N种生物标志物蛋白质中的每一者的水平，其中N至少为2，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自RET和CRDL1，并且所述N种生物标志物蛋白质中的至少一者选自四连接素、N端BNP前体、TNNT2、CA125、MIC-1、SLPI、HE4、MMP-12、HSPB6、WISP-2、GHR和IGFBP-2。

19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的至少两者是RET和CRDL1。

20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是MIC-1。

21.如权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是HE4。

22.如权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是四连接素。

23.如权利要求17至22中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是GHR。

24.如权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是CA125。

25.如权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是N端BNP前体。

26.如权利要求17至25中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是IGFBP-2。

27.如权利要求17至26中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是WISP-2。

28.如权利要求17至27中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是TNNT2。

29.如权利要求17至28中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是HSPB6。

30.如权利要求17至29中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是SLPI。

31.如权利要求17至30中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质中的一者是MMP-12。

32.如权利要求17至31中任一项所述的方法，其中所述N种生物标志物蛋白质全部选自RET、CRDL1、四连接素、N端BNP前体、TNNT2、CA125、MIC-1、SLPI、HE4、MMP-12、HSPB6、WISP-2、GHR和IGFBP-2。

33.如权利要求17至32中任一项所述的方法，其中N为2，N为3，N为4，N为5，N为6，N为7，N为8，N为9，N为10，N为11，N为12，N为13，或N为14。

34.如权利要求17至33中任一项所述的方法，其中所述受试者患有射血分数保留的心力衰竭。

35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述CV事件是死亡。

36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中筛选或预测所述受试者在从所述受试者取得所述样品的日子算起的1年内具有CV事件的风险或可能性。

37.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中筛选或预测所述受试者在从所述受试者取得所述样品的所述日子算起的180天内具有CV事件的所述风险或可能性。

38.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中筛选或预测所述受试者在从所述受试者取得所述样品的所述日子算起的90天内具有CV事件的所述风险或可能性。

39.如权利要求36至38中任一项所述的方法，其中如果所述N种生物标志物蛋白质中至少2种的每一者的水平相对于相应生物标志物蛋白质的对照水平是异常的，则所述受试者在从所述受试者取得所述样品的所述日子算起的1年、180天或90天内具有CV的所述风险或可能性是高的。

40.如权利要求36至38中任一项所述的方法，其中如果所述N种生物标志物蛋白质中的每一者的所述水平相对于相应生物标志物蛋白质的对照水平是异常的，则所述受试者在从所述受试者取得所述样品的所述日子算起的1年、180天或90天内具有CV的所述风险或可能性是高的。

41.如权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述受试者在从所述受试者取得所述样品的所述日子算起的1年、180天或90天内具有CV事件的所述风险或可能性被计算为从所述受试者取得所述样品的所述日子算起存活1年、180天或90天的概率。

42.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述样品选自血液样品、血清样品、血浆样品和尿液样品。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述样品是血液样品。

44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述方法是在体外执行。

45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述方法包括使来自所述受试者的所述样品的生物标志物蛋白质与一组捕获试剂接触，其中所述一组捕获试剂中的每种捕获试剂特异性结合到正被检测的一种生物标志物蛋白质。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述捕获试剂中的两者结合到正被检测的相同的生物标志物蛋白质。

47.如权利要求46所述的方法，其中两种捕获试剂特异性结合到SVEP1，并且其中所述两种捕获试剂是包含不同序列的适体。

48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述方法包括使来自所述受试者的所述样品的生物标志物蛋白质与一组捕获试剂接触，其中所述一组捕获试剂中的每种捕获试剂特异性结合到正被检测的不同的生物标志物蛋白质。

49.如权利要求45至48中任一项所述的方法，其中每种捕获试剂是抗体或适体。

50.如权利要求49所述的方法，其中每种生物标志物捕获试剂是适体。

51.如权利要求50所述的方法，其中至少一种适体是慢解离率适体。

52.如权利要求51所述的方法，其中至少一种慢解离率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、或至少10个具有修饰的核苷酸。

53.如权利要求51或权利要求52所述的方法，其中每种慢解离率适体以≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的解离率(t_1/2)结合到其靶蛋白。

54.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中CV事件的所述风险或可能性是基于所述检测到的生物标志物水平和选自以下项的至少一项额外生物医学信息

a)对应于所述受试者的身体描述词的信息，

b)对应于所述受试者的体重变化的信息，

c)对应于所述受试者的种族的信息，

d)对应于所述受试者的性别的信息，

e)对应于所述受试者的吸烟史的信息，

f)对应于所述受试者的饮酒史的信息，

g)对应于所述受试者的职业史的信息，

h)对应于所述受试者的心血管疾病或其他循环系统疾患的家族史的信息，

i)对应于所述受试者体内至少一种遗传标志物的存在或不存在的信息，所述至少一种遗传标志物与所述受试者或所述受试者的家族成员体内的心血管疾病的较高风险相关联，

j)对应于所述受试者的临床症状的信息，

k)对应于其他实验室测试的信息，

l)对应于所述受试者的基因表达值的信息，以及

m)对应于所述受试者对已知心血管风险因素，诸如高饱和脂肪、高盐、高胆固醇的饮食的占有性的信息，

n)对应于所述受试者的通过选自由以下项组成的组的技术获得的成像结果的信息：心电图、超声心动图、针对内膜中层厚度的颈动脉超声、血流介导的扩张、脉搏波速度、踝臂指数、负荷超声心动图、心肌灌注成像、CT冠状动脉钙化、高分辨率CT血管造影术、MRI成像和其他成像模态，

o)关于所述受试者的用药的信息，

p)对应于所述受试者的年龄的信息，以及

q)关于所述受试者的肾功能的信息。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述至少一项额外生物医学信息是对应于所述受试者的所述年龄的信息。

56.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括出于确定医疗保险费或人寿保险费的目的而确定CV事件的所述风险或可能性。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述方法还包括确定医疗保险或人寿保险的承保范围或保费。

58.如权利要求1至57中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使用来源于所述方法的信息来预测和/或管理医疗资源的利用。

59.如权利要求1至58中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使用来源于所述方法的信息来作出获取或购买医疗实践、医院或公司的决策。

60.一种试剂盒，所述试剂盒包括N种生物标志物蛋白质捕获试剂，其中N至少为2，并且其中所述捕获试剂中的至少一者结合到HCC-1、RNAS6、PAP1、SVEP1或ATL2，并且所述捕获试剂中的至少一者结合到N端BNP前体、RSPO4、BNP、MIC-1、FABPA、ILRL1、ANGP2、HE4、TAGL、RNAS1或TSP2。

61.如权利要求60所述的试剂盒，其中所述捕获试剂中的两者结合到SVEP1，并且其余捕获试剂中的每一者结合到选自HCC-1、RNAS6、PAP1、ATL2、N端BNP前体、RSPO4、BNP、MIC-1、FABPA、ILRL1、ANGP2、HE4、TAGL、RNAS1和TSP2的不同蛋白质。

62.一种试剂盒，所述试剂盒包括N种生物标志物蛋白质捕获试剂，其中N至少为2，并且其中所述捕获试剂中的至少一者结合到RET或CRDL1，并且所述捕获试剂中的至少一者结合到四连接素、N端BNP前体、TNNT2、CA125、MIC-1、SLPI、HE4、MMP-12、HSPB6、WISP-2、GHR或IGFBP-2。

63.如权利要求62所述的试剂盒，其中每种捕获试剂结合到不同的生物标志物蛋白质。

64.如权利要求60或权利要求61所述的试剂盒，其中N为2，N为3，N为4，N为5，N为6，N为7，N为8，N为9，N为10，N为11，N为12，N为13，N为14，N为15，N为16，或N为17。

65.如权利要求62或权利要求63所述的试剂盒，其中N为2，N为3，或N为4，或N为5，或N为6，或N为7，或N为8，或N为9，或N为10，或N为11，或N为12，或N为13，或N为14。

66.如权利要求60、61和64中任一项所述的试剂盒，其中所述N种生物标志物蛋白质捕获试剂中的每一者特异性结合到选自表1的生物标志物蛋白质。

67.如权利要求62、63或65中任一项所述的试剂盒，其中所述N种生物标志物蛋白质捕获试剂中的每一者特异性结合到选自表2的生物标志物蛋白质。

68.如权利要求60至67中任一项所述的试剂盒，其中所述N种生物标志物捕获试剂中的每一者是抗体或适体。

69.如权利要求68所述的试剂盒，其中每种生物标志物捕获试剂是适体。

70.如权利要求69所述的试剂盒，其中至少一种适体是慢解离率适体。

71.如权利要求70所述的试剂盒，其中至少一种慢解离率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、或至少10个具有修饰的核苷酸。

72.如权利要求70或权利要求71所述的试剂盒，其中每种慢解离率适体以≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的解离率(t_1/2)结合到其靶蛋白。

73.如权利要求60至72中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒用于检测来自受试者的样品中的所述N种生物标志物蛋白质。

74.如权利要求73所述的试剂盒，所述试剂盒用于确定所述受试者在从所述受试者取得所述样品的日子算起的1年内经历CV事件的风险或可能性，其中所述受试者患有心力衰竭。

75.如权利要求74所述的试剂盒，其中所述CV事件是死亡。

76.如权利要求74或75所述的试剂盒，其中所述受试者患有射血分数降低的心力衰竭。

77.如权利要求74或75所述的试剂盒，其中所述受试者患有射血分数保留的心力衰竭。