WO2023191543A1 - 암의 진단용 조성물 - Google Patents

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WO2023191543A1
WO2023191543A1 PCT/KR2023/004274 KR2023004274W WO2023191543A1 WO 2023191543 A1 WO2023191543 A1 WO 2023191543A1 KR 2023004274 W KR2023004274 W KR 2023004274W WO 2023191543 A1 WO2023191543 A1 WO 2023191543A1
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polypeptide
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cancer
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PCT/KR2023/004274
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김성수
박영민
신현석
한승만
노동영
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㈜베르티스
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing breast cancer using mass spectrometry.
  • Breast cancer is the most common cancer among women in the world, and it is also a fatal cancer that is the number one cause of death among women.
  • Conventional methods for screening breast cancer are focused on imaging methods.
  • mammography an imaging diagnostic method for breast cancer, poses risks due to excessive radiation exposure, and dense breasts have limitations that reduce diagnostic accuracy, and cause discomfort and pain to patients due to body exposure and compression.
  • breast ultrasound is an expensive test method, so user accessibility is limited, and the results may vary depending on the tester's skill level or the age of the device. Due to the shortcomings of the prior art, there is a high demand for an easy, simple, and economical test method in the field of early diagnosis of breast cancer, and a blood test is considered one of the most suitable methods.
  • the existing blood test for breast cancer is the CA15-3 immunoassay, which was developed in the 1980s and approved by the U.S. FDA in 1997.
  • the diagnostic accuracy for early-stage breast cancer is as low as 10-20%, so it is used for monitoring treatment patients rather than for early diagnosis. It is currently in use.
  • mass spectrometry is a suitable method for using multiple markers in that it can measure a large number of markers simultaneously and does not use antibodies.
  • biomarkers Although research on discovering thousands of biomarkers through mass spectrometry has continued, cases of clinical application are still rare due to issues of high price, low reproducibility, and long analysis time.
  • the present inventors used blood (serum and plasma) from which high-concentration proteins such as albumin, immunoglobulin, and transferrin were not removed as the subject of analysis, while drastically reducing the analysis time to less than 10 minutes, ultimately sufficient for clinical use.
  • blood serum and plasma
  • high-concentration proteins such as albumin, immunoglobulin, and transferrin
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for diagnosing cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method of providing information for diagnosing cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a screening method for a composition for preventing or treating cancer.
  • the present invention provides APOC1 (Apolipoprotein C1), CHL1 (Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9 (Matrix metalloproteinase-9), PRDX6 (Peroxiredoxin-6), PRG4 (Proteoglycan 4), PPBP ( One or more polypeptides or partial fragments thereof selected from the group consisting of Platelet basic protein (FN1), Fibronectin (FN1), von Willebrand factor (VWF), and Clusterin (CLU);
  • APOC1 Apolipoprotein C1
  • CHL1 Neurodeficib
  • MMP9 Microx metalloproteinase-9
  • PRDX6 Peroxiredoxin-6
  • PRG4 Proteoglycan 4
  • PPBP One or more polypeptides or partial fragments thereof selected from the group consisting of Platelet basic protein (FN1), Fibronectin (FN1), von Willebrand factor (VWF), and Clusterin (CLU)
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide may be an agent for measuring the expression level of Apolipoprotein C1 (APOC1).
  • APOC1 is a member of Apolipoprotein C, and in humans, it can be encoded by the APOC1 gene. In addition, it is first expressed in the liver and can later be activated when monocytes differentiate into macrophages.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide may be an agent for measuring the expression level of CHL1.
  • the CHL1 refers to “Close Homolog of L1” and can also be called Neural Cell Adhesion Molecule L1 Like protein. In humans, it is produced by the CHL1 gene. Can be encrypted.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide may be an agent for measuring the expression level of Matrix Metalloproteinase-9 (MMP9).
  • MMP-9 is also known as 92kDa type IV Collagenase, 92kDa gelatinase, or Gelatinase B (GELB).
  • MMP-9 is a member of the Zinc-Metalloproteinases family and is known to be involved in decomposing the extracellular matrix. In humans, it may be encoded by the MMP9 gene.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide may be an agent for measuring the expression level of Peroxiredoxin-6 (PRDX6).
  • PRDX6 may be a member of the ferredoxin family, which is an antioxidant enzyme, and may be encoded by the PRDX6 gene in humans.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide may be an agent for measuring the expression level of Proteoglycan 4 (PRG4).
  • PRDG4 is also called Lubricin, and in humans, it can be encoded by the Prg4 gene.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide may be an agent for measuring the expression level of Pro-Platelet basic protein (PPBP).
  • PPBP Pro-Platelet basic protein
  • the PPBP is also called a chemokine (CXC motif) ligand (chemokine (CXC motif) ligand, CXCL7), and in humans, it can be encoded by the PPBP gene.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide may be an agent for measuring the expression level of Fibronectin 1 (FN1).
  • FN1 Fibronectin 1
  • the FN1 is a high molecular weight glycoprotein that can be attached to Integrin, a membrane receptor protein of the extracellular matrix, and can bind to other extracellular matrix proteins such as collagen, fibrin, and heparan sulfate proteoglycans. there is. Additionally, in humans, it can be encoded by the FN1 gene.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide may be an agent for measuring the expression level of von Willebrand Factor (VWF).
  • VWF von Willebrand Factor
  • the VWF is an adhesion factor produced by vascular endothelial cells or megakaryocytes of the bone marrow and acts as an adhesive when platelets combine with subendothelial tissue, or as an auxiliary agent for factor VIII among coagulation factors, it binds to the corresponding factor in the blood to stabilize it. It can perform an inducing action. Additionally, in humans, it can be encoded by the VWF gene.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide may be an agent for measuring the expression level of Clusterin (CLU).
  • Clusterin protein is a disulfide-linked heterodimeric protein with a molecular weight of 75-80 kDa and is known to be involved in cell debris removal and cell death. Additionally, in humans, it can be encoded by the CLU gene.
  • cancer refers to or refers to a physiological condition typically characterized by uncontrolled cell growth in mammals.
  • Cancers subject to diagnosis in the present invention specifically include breast cancer, ovarian cancer, colon cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, and non-small cell lung cancer.
  • Hodgkin's lymphoma Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma , esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord It may be a tumor, a brainstem glioma, or a pituitary adenoma, and more specifically, it may be breast cancer.
  • CNS central nervous system
  • the “diagnosis” refers to determining the susceptibility of a subject to a specific disease or condition, determining whether the subject currently has a specific disease or condition, and determining whether the subject currently has a specific disease or condition. Determining a subject's prognosis (e.g., identifying a pre-metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment), or therametrics (e.g., determining the efficacy of a treatment) includes monitoring the state of an object to provide information. For the purpose of the present invention, the diagnosis is to confirm whether or not the cancer has developed or the possibility (risk) of developing it.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptides is not particularly limited, but includes, for example, antibodies, oligopeptides, ligands, PNA (peptide nucleic acid) and aptamers that specifically bind to the polypeptides. ) may include one or more types selected from the group consisting of
  • the “antibody” refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction.
  • antibody refers to an antibody that specifically binds to the polypeptides mentioned in the present invention.
  • the antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.
  • the antibody can be easily produced using techniques well known in the art.
  • polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art, which include injecting the protein antigen into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody.
  • These polyclonal antibodies can be produced from any animal, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cows, dogs, etc.
  • monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519), which is well known in the art, or phage antibody library technology (Clackson et al, Nature, 352 :624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991).
  • Antibodies prepared by the above method can be separated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • antibodies of the invention include intact forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody molecule.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment that possesses at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2, and Fv.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • DNA has a phosphate-ribose sugar backbone
  • PNA has a repeated N-(2-aminoethyl)-glycine backbone linked by peptide bonds, which greatly increases its binding force and stability to DNA or RNA, making it useful in molecular biology. , is used in diagnostic analysis and antisense therapy.
  • PNA was described in Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). “Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide”. It is disclosed in detail in Science 254 (5037): 1497-1500.
  • the “aptamer” is an oligonucleic acid or peptide molecule, and general information on aptamers is described in Bock LC et al., Nature 355(6360):5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K “Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine”. J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. “An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727 (1998)] is disclosed in detail.
  • the agent for measuring the expression level of genes encoding the polypeptides may include one or more selected from the group consisting of primers, probes, and antisense nucleotides that specifically bind to the genes.
  • the “primer” is a fragment that recognizes the target gene sequence and includes forward and reverse primer pairs, but is preferably a primer pair that provides analysis results with specificity and sensitivity. High specificity can be granted when the nucleic acid sequence of the primer is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample, so that the primer amplifies only the target gene sequence containing the complementary primer binding site and does not cause non-specific amplification. .
  • the “probe” refers to a substance that can specifically bind to a target substance to be detected in a sample, and refers to a substance that can specifically confirm the presence of the target substance in the sample through the binding.
  • the type of probe is not limited as it is a material commonly used in the art, but is preferably PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA, and is most preferred. It is PNA.
  • the probe is a biomaterial that is derived from or similar to living organisms or includes those manufactured in vitro, such as enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, nerve cells, DNA, and It may be RNA, DNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides, RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides, and examples of proteins may include antibodies, antigens, enzymes, peptides, etc.
  • LNA Locked nucleic acids
  • LNA nucleosides contain the common nucleic acid bases of DNA and RNA and can form base pairs according to the Watson-Crick base pairing rules. However, due to the ‘locking’ of the molecule due to the methylene bridge, LNA does not form the ideal shape in Watson-Crick bonding.
  • LNA When LNA is included in a DNA or RNA oligonucleotide, the LNA can pair with the complementary nucleotide chain more quickly and increase the stability of the double helix.
  • the “antisense” refers to a sequence of nucleotide bases in which an antisense oligomer hybridizes with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, typically allowing the formation of an mRNA and RNA:oligomer heteroduplex within the target sequence. and oligomers having an intersubunit backbone. Oligomers may have exact or approximate sequence complementarity to the target sequence.
  • amino acid sequence information of the polypeptide according to the present invention and the nucleic acid sequence encoding the polypeptide are disclosed through various public data, those skilled in the art can use this as a primer, probe, or antisense nucleotide that specifically binds to the gene encoding the polypeptide. You will be able to design it easily.
  • APOC1 polypeptide Some fragments of the APOC1 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (TPDVSSALDK);
  • CHL1 polypeptide Some fragments of the CHL1 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (VIAVNEVGR);
  • MMP9 polypeptide Some fragments of the MMP9 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (AVIDDAFAR);
  • PRDX6 polypeptide Some fragments of the PRDX6 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (LSILYPATTGR);
  • PRG4 polypeptide Some fragments of the PRG4 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (AIGPSQTHTIR);
  • Some fragments of the PPBP polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (TTSGIHPK);
  • Some fragments of the FN1 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (STTPDITGYR);
  • VWF polypeptide Some fragments of the VWF polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (ILAGPAGDSNVVK);
  • Some fragments of the CLU polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (TLLSNLEEAK).
  • the cancer that can be diagnosed with the diagnostic composition of the present invention is breast cancer.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide includes antibodies, oligopeptides, ligands, PNA (peptide nucleic acid), and aptamers that specifically bind to the polypeptide or some fragments thereof. It includes one or more types selected from the group consisting of aptamer).
  • the agent for measuring the expression level of the gene encoding the polypeptide or partial fragment thereof is one or more selected from the group consisting of primers, probes, and antisense nucleotides that specifically bind to the gene. Includes.
  • the present invention provides a diagnostic kit containing the diagnostic composition of the present invention.
  • the diagnostic kit can be used to diagnose the occurrence, likelihood of onset, treatment responsiveness, prognosis, stage, possibility of recurrence, etc. of a cancer disease.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit, but is not limited thereto.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the kit for diagnosing cancer of the present invention may further include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for the analysis method.
  • the kit for diagnosing cancer may further include essential elements required to perform a reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit contains a pair of primers specific for the gene encoding the marker protein.
  • Primers are nucleotides having a sequence specific to the nucleic acid sequence of the gene, and may have a length of about 7bp to 50bp, more specifically, about 10bp to 30bp. It may also include primers specific to the nucleic acid sequence of the control gene.
  • reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffer (pH and magnesium concentration vary), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, and the RNase inhibitor DEPC.
  • -Can include DEPC-water, sterilized water, etc.
  • a DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, etc. for producing a fluorescently labeled probe.
  • the substrate may also include cDNA or oligonucleotides corresponding to control genes or fragments thereof.
  • the diagnostic kit of the present invention may include essential elements required to perform ELISA.
  • ELISA kits contain antibodies specific for these proteins.
  • Antibodies are antibodies that have high specificity and affinity for a marker protein and almost no cross-reactivity to other proteins, and may be monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • ELISA kits may include antibodies specific for control proteins.
  • Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g. conjugated with antibodies) and their substrates or those capable of binding to antibodies. It may contain other substances, etc.
  • the fixture for the antigen-antibody binding reaction includes a nitrocellulose membrane, a PVDF membrane, a well plate synthesized from polyvinyl resin or polystyrene resin, and a glass slide glass. etc. may be used, but are not limited thereto.
  • the label for the secondary antibody in the diagnostic kit of the present invention is preferably a conventional coloring agent that produces a color reaction, and includes HRP (horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, colloid gold, and FITC ( Labels such as fluorescein and dye such as poly L-lysine-fluorecein isothiocyanate) and RITC (rhodamine-B-isothiocyanate) may be used, but are not limited thereto. .
  • HRP horseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase alkaline phosphatase
  • colloid gold and FITC
  • Labels such as fluorescein and dye such as poly L-lysine-fluorecein isothiocyanate
  • RITC rhodamine-B-isothiocyanate
  • the chromogenic substrate for inducing color development in the diagnostic kit of the present invention is preferably used according to the label that produces a chromogenic reaction, such as TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[ 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine), etc. can be used.
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethyl bezidine
  • ABTS[ 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine), etc. can be used.
  • the coloring substrate is provided dissolved in a buffer solution (0.1 M NaAc, pH 5.5).
  • a chromogenic substrate such as TMB is decomposed by HRP used as a marker for the secondary antibody conjugate to produce a chromogenic deposit, and the presence or absence of the marker proteins is detected by visually checking the degree of deposition of the chromogenic deposit.
  • the washing solution preferably contains a phosphate buffer solution, NaCl, and Tween 20, and a buffer solution (PBST) consisting of 0.02M phosphate buffer solution, 0.13M NaCl, and 0.05% Tween 20. It is more desirable.
  • PBST buffer solution
  • the washing solution reacts with the secondary antibody to the antigen-antibody conjugate, then adds an appropriate amount to the fixative and washes 3 to 6 times.
  • Sulfuric acid solution H 2 SO 4
  • the diagnostic kit of the present invention is an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • APOC1 Polipoprotein C1
  • CHL1 Neuronal cell adhesion molecule L1 like
  • MMP9 Microx metalloproteinase-9
  • PRDX6 Peroxiredoxin- 6
  • PRG4 Proteoglycan 4
  • PPBP Platelet basic protein
  • FN1 Fibronectin
  • VWF von Willebrand factor
  • CLU Clusterin
  • the “object of interest” refers to an individual with a high probability of developing the cancer in which it is uncertain whether or not it will develop the cancer.
  • the “biological sample” refers to any material, biological fluid, tissue or cell obtained from or derived from an individual, for example, whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells.
  • Liquid biopsy e.g., the patient's tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, sputum, or ascites
  • Liquid biopsy collected for histopathological examination by inserting a hollow needle into an organ in the body without cutting the skin of the patient. ), etc.
  • the present invention may include measuring the expression level of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 to 9 or the gene encoding the same in the biological sample separated as described above.
  • the step of measuring the expression level is APOC1 (Apolipoprotein C1), CHL1 (Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9 (Matrix metalloproteinase-9), PRDX6 (Peroxiredoxin-6), PRG4 (Proteoglycan 4), PPBP ( This may be a step of measuring the expression level of one or more proteins (polypeptides) selected from the group consisting of Platelet basic protein (FN1), Fibronectin (FN1), von Willebrand factor (VWF), and Clusterin (CLU) or the gene encoding the same.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide is not particularly limited, but includes, for example, antibodies, oligopeptides, ligands, PNA (peptide nucleic acid), and aptamers that specifically bind to the polypeptide. It may include one or more types selected from the group consisting of.
  • Methods for measuring or comparative analysis of the expression level of the polypeptide in the present invention include protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF) analysis, and SELDI-TOF.
  • protein chip analysis immunoassay
  • ligand binding assay ligand binding assay
  • MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • SELDI-TOF SELDI-TOF
  • the expression level of the polypeptide can be measured or comparatively analyzed by a multiple reaction monitoring (MRM) method.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the multiple reaction monitoring method can be performed using mass-spectrometry, preferably triple quadrupole mass-spectrometry.
  • the multiple reaction monitoring (MRM) method using mass-spectrometry is an analysis technology that can selectively separate, detect, and quantify specific analytes and monitor changes in their concentration.
  • MRM is a method that can quantitatively and accurately measure substances such as trace amounts of biomarkers present in biological samples. It uses the first mass filter (Q1) to selectively collide with mother ions among the ion fragments generated from the ionization source. delivered to the tube. Then, the mother ion that reaches the collision tube collides with the internal collision gas, splits to generate daughter ions, and is sent to the second mass filter (Q2), where only characteristic ions are transmitted to the detection unit. In this way, it is an analysis method with high selectivity and sensitivity that can detect only information on the desired component.
  • MRM is used for quantitative analysis of small molecules and is used to diagnose specific genetic diseases.
  • the MRM method is easy to measure multiple peptides simultaneously and has the advantage of being able to confirm the relative concentration difference of protein diagnostic marker candidates between normal people and cancer patients without antibodies.
  • the MRM analysis method is being introduced to analyze complex proteins and peptides in blood, especially in proteome analysis using mass spectrometry (Anderson L. et al., Mol CellProteomics, 5: 375-88 , 2006; DeSouza, L. V. et al., Anal. Chem., 81: 3462-70, 2009).
  • the expression level of the polypeptide mentioned in the present invention can be measured by the multiple reaction monitoring method.
  • the mass/charge value (m/z value) of the target peptide can be used, and at this time, the m/z value of The information is as shown in Table 1 below, but is not limited thereto.
  • the polypeptides include APOC1 (Apolipoprotein C1), CHL1 (Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9 (Matrix metalloproteinase-9), PRDX6 (Peroxiredoxin-6), PRG4 (Proteoglycan 4), PPBP (Platelet basic protein), It may be Fibronectin (FN1), von Willebrand factor (VWF), or Clusterin (CLU).
  • APOC1 Apolipoprotein C1
  • CHL1 Neuronase-9
  • PRDX6 Peroxiredoxin-6
  • PRG4 Proteoglycan 4
  • PPBP Platinum basic protein
  • It may be Fibronectin (FN1), von Willebrand factor (VWF), or Clusterin (CLU).
  • any internal standard material commonly used in the multiple reaction monitoring analysis may be used as the internal standard, for example, E. coli beta galactosidase may be used.
  • the amino acid substituted with the isotope is lysine. It may be arginine, but is not limited thereto.
  • the peptide synthesized here can be an isolated peptide that is more than 95% pure.
  • the internal standard material may include one or more radioactive isotopes selected from the group consisting of 2 H, 3 H, 11 C, 13 C, 14 C, 13 N, 15 N, 15 O, 17 O and 18 O.
  • radioactive isotopes selected from the group consisting of 2 H, 3 H, 11 C, 13 C, 14 C, 13 N, 15 N, 15 O, 17 O and 18 O.
  • it is not limited to the radioactive isotopes described above, and may include all types of isotopes that can be used as a comparison group to measure the absolute amount of polypeptide.
  • the agent for measuring the expression level of the gene encoding the polypeptide may include one or more selected from the group consisting of primers, probes, and antisense nucleotides that specifically bind to the gene.
  • the analysis method for measuring the amount of mRNA as a process for confirming the presence and expression level of the gene encoding the polypeptide includes reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR) and competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT- PCR), real-time reverse transcription polymerase reaction (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA), Northern blotting, DNA chip, etc., but are not limited thereto.
  • the expression level of the polypeptide or the gene encoding the polypeptide measured in the biological sample of the subject of interest increases or decreases compared to the normal control, it can be predicted that the likelihood of developing cancer is high.
  • treatment responsiveness can be predicted by measuring the expression level of the polypeptide or the gene encoding the polypeptide measured in the biological sample of the subject of interest.
  • the prognosis of the subject preferably the prognosis after surgical operation, can be predicted by measuring the expression level of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 to 9 or the gene encoding the same measured on the biological sample of the subject of interest.
  • the object of interest may be an individual who developed cancer and underwent surgical resection.
  • the stage of cancer in an individual can be predicted by measuring the expression level of the polypeptide or the gene encoding the polypeptide measured in a biological sample of the object of interest.
  • the “stage” refers to the extent to which cancer cells have spread and the stage of cancer progression.
  • International classification according to the progress of cancer generally follows the TNM staging classification.
  • T Tumor Size
  • N Lymph Node
  • M Metalastasis
  • T, N, and M is a classification according to whether or not it has metastasized to other organs.
  • Table 2 The detailed classification for T, N, and M is as shown in Table 2 below, and the cancer stage classification according to this is shown in Table 3 below.
  • TNM staging Justice Size of primary tumor Size of the primary tumor (T stage) Size of the primary tumor (T stage) T0 A tumor that appears malignant in the form of tumor cells, but is limited to the mucosa or epithelium and has not yet invaded the basement membrane. T1 The lesion is limited to the primary organ, the tumor is mobile, and there is no invasion into adjacent or surrounding tissues. T2 The size of the tumor is about 2 to 5 cm. T3 The tumor size is larger than T2 but is confined within the organ.
  • lymph node metastasis N stage
  • Lymph node status N stage
  • N0 No evidence of lymph node lesions
  • N1 Involvement of one lymph node (larger than 1 to 2 cm, usually up to 3 cm) that is palpable, mobile, and confined to the primary site.
  • N2 Palpable, partially mobile, or firm or rigid lymph nodes, with microscopic evidence of invasion, clinically intertwined, and present on the contralateral or bilateral side (3 to 5 cm) N3 It is completely fixed, passes through the capsule, and is completely fixed to bones, large blood vessels, skin, nerves, etc., and is larger than 6cm.
  • Distant metastasis M stage
  • Distant metastasis M stage
  • M0 No distant metastases
  • M1 There are distant metastases
  • the possibility of cancer recurrence can be predicted by measuring the expression level of the polypeptide or the gene encoding the polypeptide measured in a biological sample of the subject of interest.
  • APOC1 polypeptide Some fragments of the APOC1 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (TPDVSSALDK);
  • CHL1 polypeptide Some fragments of the CHL1 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (VIAVNEVGR);
  • MMP9 polypeptide Some fragments of the MMP9 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (AVIDDAFAR);
  • PRDX6 polypeptide Some fragments of the PRDX6 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (LSILYPATTGR);
  • PRG4 polypeptide Some fragments of the PRG4 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (AIGPSQTHTIR);
  • Some fragments of the PPBP polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (TTSGIHPK);
  • Some fragments of the FN1 polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (STTPDITGYR);
  • VWF polypeptide Some fragments of the VWF polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (ILAGPAGDSNVVK);
  • Some fragments of the CLU polypeptide have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (TLLSNLEEAK).
  • the biological sample includes whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, plasma, and serum. ), sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva ), peritoneal washings, ascites, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid. ), pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells , cell extract, or cerebrospinal fluid.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide is composed of an antibody, an oligopeptide, a ligand, a peptide nucleic acid (PNA), and an aptamer that specifically binds to the polypeptide. It includes one or more species selected from the group.
  • the expression level of the polypeptide can be measured using protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF) analysis, SELDI- TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Ouchteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis analysis. , liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (LC-MS/MS), Western blotting, or ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
  • MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • SELDI- TOF Surface Enhanced Laser Desorption
  • the expression level of the polypeptide is measured by a multiple reaction monitoring (MRM) method.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the mass-to-charge ratio (m/z) of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 is 1032.5280 or a value within ⁇ 1 of this value when the z value is 1;
  • the mass-to-charge ratio (m/z) of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 is 966.5524 when the z value is 1 or a value within ⁇ 1 of this value;
  • the mass-to-charge ratio (m/z) of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 is 977.5051 when the z value is 1 or a value within ⁇ 1 of this value;
  • the mass-to-charge ratio (m/z) of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 4 is 1191.6732 when the z value is 1 or a value within ⁇ 1 of this value;
  • the mass-to-charge ratio (m/z) of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 5 is 1180.6433 when the z value is 1 or a value within ⁇ 1 of this value;
  • the mass-to-charge ratio (m/z) of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 6 is 840.4574 when the z value is 1 or a value within ⁇ 1 of this value;
  • the mass-to-charge ratio (m/z) of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 7 is 1110.5426 when the z value is 1 or a value within ⁇ 1 of this value;
  • the mass-to-charge ratio (m/z) of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 8 is 1240.6896 when the z value is 1 or a value within ⁇ 1 of this value;
  • the mass-to-charge ratio (m/z) of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 9 is 1117.6099 when the z value is 1 or a value within ⁇ 1 of this value.
  • a synthetic peptide isotopically substituted for a specific element of a specific amino acid constituting each polypeptide as an internal standard;
  • E. coli beta galactosidase when performing the multiple reaction monitoring, a synthetic peptide isotopically substituted for a specific element of a specific amino acid constituting each polypeptide as an internal standard;
  • E. coli beta galactosidase when performing the multiple reaction monitoring, a synthetic peptide isotopically substituted for a specific element of a specific amino acid constituting each polypeptide as an internal standard.
  • the synthetic peptide has the same sequence as the sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 and contains a stable isotope. Includes.
  • the stable isotope is a stable isotope of one or more elements selected from the group consisting of carbon and nitrogen.
  • the expression level of the gene encoding the polypeptide can be measured using reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase reaction ( Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA), Northern blotting or DNA chip.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcription polymerase reaction
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • Northern blotting or DNA chip.
  • the CHL1 Neurode adhesion molecule L1 like
  • MMP9 Microx metalloproteinase-9
  • PRG4 Proteoglycan 4
  • PPBP Platinum basic protein
  • FN1 Fibronectin
  • VWF The expression levels of von Willebrand factor and CLU (Clusterin) polypeptides or the genes encoding them are increased compared to the normal control group;
  • APOC1 Apolipoprotein C1
  • PRDX6 Peroxiredoxin-6
  • the information providing method predicts the responsiveness of a target individual to an anticancer agent.
  • the present invention provides a method for screening a composition for preventing or treating cancer, comprising the following steps:
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1 (TPDVSSALDK), SEQ ID NO: 2 (VIAVNEVGR), SEQ ID NO: 3 (AVIDDAFAR), SEQ ID NO: 4 (LSILYPATTGR), SEQ ID NO: 5 (AIGPSQTHTIR), SEQ ID NO: 6 (TTSGIHPK), SEQ ID NO: 7 (STTPDITGYR) ), contacting the candidate material with a biological sample containing one or more polypeptides selected from the group consisting of polypeptides represented by SEQ ID NO: 8 (ILAGPAGDSNVVK) and SEQ ID NO: 9 (TLLSNLEEAK), genes encoding them, or cells expressing them. ordering step; and
  • SEQ ID NO: 1 (TPDVSSALDK), SEQ ID NO: 2 (VIAVNEVGR), SEQ ID NO: 3 (AVIDDAFAR), SEQ ID NO: 4 (LSILYPATTGR), SEQ ID NO: 5 (AIGPSQTHTIR), SEQ ID NO: 6 (TTSGIHPK), sequence in the biological sample Measuring the expression level of one or more polypeptides selected from the group consisting of polypeptides represented by SEQ ID NO: 7 (STTPDITGYR), SEQ ID NO: 8 (ILAGPAGDSNVVK), and SEQ ID NO: 9 (TLLSNLEEAK) or genes encoding them;
  • SEQ ID NO: 2 The expression level of the SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 polypeptide, or the gene encoding the same, measured on a biological sample of the subject of interest This decreases compared to the normal control group;
  • the candidate substance is determined to be a composition for preventing or treating cancer.
  • these biological samples can be reacted with candidate drugs for preventing or treating cancer, with or without manipulation.
  • test substance in the present invention refers to an unknown substance used in screening to test whether it is added to a sample containing cells expressing the genes of the present invention and affects the activity or expression level of these genes. do.
  • the test substances include, but are not limited to, compounds, nucleotides, peptides, and natural extracts.
  • the step of measuring the expression level or activity of the gene in a biological sample treated with a test substance can be performed by various expression level and activity measurement methods known in the art.
  • An input unit that receives an input value
  • a reading unit including a pre-trained machine learning model to determine whether breast cancer has occurred
  • the input value is 1 (TPDVSSALDK), SEQ ID NO: 2 (VIAVNEVGR), SEQ ID NO: 3 (AVIDDAFAR), SEQ ID NO: 4 (LSILYPATTGR), SEQ ID NO: 5 (AIGPSQTHTIR), SEQ ID NO: 6 (TTSGIHPK), and SEQ ID NO: 7 in the biological sample.
  • STTPDITGYR SEQ ID NO: 8 (ILAGPAGDSNVVK), and SEQ ID NO: 9 (TLLSNLEEAK).
  • machine learning in the present invention refers to algorithms and statistical models used by computer systems to perform tasks without explicit instructions from the outside, relying on patterns and inferences.
  • the machine learning model is specifically deep learning, logistic regression, support vector machine (SVM), random forest, and gradient boosting algorithm (GBM). ) can be used, and more specifically, deep learning can be used, but is not limited to this and all types of machine learning that can diagnose breast cancer using data measuring the expression level of the biomarker of the present invention. You can use the model.
  • the machine learning model is a deep learning model.
  • the biological sample is blood.
  • the input value of the machine learning model may be a measurement value of the expression level of a polypeptide measured in “blood,” a biological sample, but is not limited to this, and may be any substance obtained or derived from an individual, biological It refers to body fluid, tissue, or cells, for example, whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, plasma, serum ( serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva saliva, peritoneal washings, ascites, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid ( lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cell ), cell extract, or cerebrospinal fluid, but preferably for histopathological examination by inserting a hollow needle into an organ in the body without incising the skin of
  • the measurement value of the expression level of the polypeptide is a quantitative value based on mass spectrometry.
  • the mass spectrometry is Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS).
  • APOC1 Polipoprotein C1
  • CHL1 Neuronal cell adhesion molecule L1 like
  • MMP9 Microx metalloproteinase-9
  • PRDX6 Peroxiredoxin-6
  • PRG4 Proteoglycan 4
  • PPBP Polypeptides or partial fragments thereof selected from the group consisting of (Platelet basic protein), FN1 (Fibronectin), VWF (von Willebrand factor), and CLU (Clusterin);
  • a method for diagnosing cancer comprising administering to a subject a composition containing an agent for measuring the expression level of a gene encoding the same.
  • the present invention provides a method of discovering an agent for measuring the expression level of proteins (or fragments thereof) specifically expressed in cancer or genes encoding them, and diagnosing cancer using the same.
  • the present invention discovers specific proteins and fragments thereof from the blood proteome that can be useful in diagnosing cancer and uses them as biomarkers for diagnosis, thereby enabling easy and accurate diagnosis of breast cancer at an early stage. This can be useful in significantly lowering the mortality rate of patients with related diseases.
  • Figure 1 is a diagram of a library constructed by analyzing peptides in a blood sample.
  • Figure 1a is a diagram showing the process of building a library (PepQuant Library) consisting of mass spectrometry data for peptides present in a blood sample, and shows a description of the sample, protein pretreatment, and mass spectrometry process.
  • Figure 1b is a diagram showing the process of searching for a quantifiable target peptide by comparing a chromatogram produced by a triple quadrupole (MS/MS) device with a chromatogram from a standard product.
  • MS/MS triple quadrupole
  • Figure 1c is a diagram showing the distribution of quantifiable peptides, and is a diagram showing the log-scale transformation distribution for 124 blood proteins whose concentrations are known in the blood atlas among proteins that can be quantified in the PepQuant library.
  • FIG. 1D is a diagram showing the histogram distribution for the blood proteins in FIG. 1C.
  • Figure 1e is a diagram showing the number of markers that can be quantified for each serum/plasma in the PepQuant library.
  • Figure 2 is a diagram showing the structure of a deep learning model for developing a breast cancer diagnosis model.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of an experiment confirming the diagnostic accuracy by the biomarker combination and deep learning algorithm selected in the present invention.
  • Figure 3a is a diagram showing the ROC curve analyzing the diagnostic accuracy by the biomarker combination and deep learning algorithm selected in the present invention.
  • Figure 3b is a box plot showing the results of analyzing the diagnostic accuracy by the biomarker combination and deep learning algorithm selected in the present invention by stage of breast cancer and the results of other cancers.
  • An MRM library (PepQuant Library) was constructed to secure the maximum number of reproducible and quantifiable peptides within a very fast analysis time of 10 minutes by using whole serum and plasma without removing high-concentration proteins.
  • the MRM library (PepQuant library) corresponds to a comprehensive LC-MSMS chromatogram database of 4,683 surrogate peptides generated from 3,338 proteins and determined to be the most stable forms. This library contains both 4,683 standard and endogenous peptide chromatograms.
  • Serum/plasma samples from which high-concentration proteins (albumin, transferrin, immunoglobulin, etc.) were not removed were used. 5 ⁇ l of serum was loaded into a buffer containing urea and dithiothreitol (DTT) reagents. Through this, the disulfide bond of cysteine was broken and the protein structure was unraveled. It was incubated at 35°C for 1 hour and 30 minutes. After incubation, it was cooled to room temperature, iodoacetamide (IAA) was added, and cultured for 30 minutes in the dark at room temperature. The broken portion of the disulfide bond was alkylated by IAA to prevent recombination.
  • IAA iodoacetamide
  • trypsin digestion it was diluted with ammonium bicarbonate buffer, 5ug (about 1:50 (w/w)) of trypsin was loaded, and cultured at 37°C for 16 hours. Afterwards, the trypsin reaction was terminated using 10% TFA, and desalting was performed. Completely dried samples were stored at -80°C until mass analysis. For mass spectrometry, dried samples were resuspended in 0.1% formic acid (FA).
  • FA formic acid
  • Heavy peptide standards for each biomarker used in this development were synthesized and used at the GMP (Good Manufacturing Practice) facility of Vertis (Republic of Korea). The stock solution of each heavy peptide standard was stored in a deep freezer at -80°C and diluted and used whenever necessary.
  • An MRM library called 'pepQuant-library' was constructed to select peptides that can be detected under rapid concentration gradient conditions of 10 minutes without removing high-concentration proteins.
  • This library contains a database of 4,683 standard and endogenous peptide chromatograms.
  • This clinical trial used serum samples collected in a prospective multicenter clinical trial of breast cancer markers (KCT 0004847).
  • the clinical trial collected a total of 649 plasma and serum samples from 13 hospitals from 2019 to 2020.
  • the available serum samples in sufficient quantity were limited to 402 serum samples from 12 hospitals.
  • all samples are adult female specimens.
  • the serum samples used in this clinical trial are normal samples and belong to the BI-RADS 1 or 2 category, in which cancer is not detected in breast imaging. Additionally, the condition must be met that there has been no other cancer or recurrence within 5 years. Cancer samples belong to samples taken from breast cancer patients before biopsy. The number of samples at each hospital is as follows.
  • the age group of the collected samples is women over 20 years old, with people in their 40s and 50s accounting for 63% of all women.
  • the normal group corresponds to those who have not developed any cancer, including other cancers, for 5 years and do not need a breast biopsy for imaging purposes.
  • the cancer patient group refers to cases that have been pathologically confirmed through breast biopsy.
  • the distribution by stage was as follows: TNM stage 0 was 9.5%, stage 1 was 38.1%, stage 2 was 35.7%, and stage 3-4 was 16.7% for samples with known stage.
  • Samples from five major cancers other than breast cancer (20 thyroid cancers, 20 ovarian cancers, 20 pancreatic cancers, 18 lung cancers, and 20 colon cancers) were used in a retrospective clinical trial (Seoul National University) to discover and verify breast cancer markers. Serum samples from 98 cases were collected under IRB approval (H-1911-085-1079).
  • the deep learning model was found to have the highest AUC value. Therefore, the deep learning model that showed the highest AUC value was selected as the final algorithm model.
  • the structure of the model consists of 100 estimators.
  • the 100 estimators have the same structure based on a fully-connected layer.
  • Each estimator consists of a total of four layers, and each layer includes a fully-connected layer (linear layer), batch normalization, Relu function, and drop-out. out).
  • the last layer of each estimator outputs a value between 0 and 1, that is, a value representing the probability of cancer, through the sigmoid function.
  • the outputs of 100 estimators were combined into one matrix through a concatenation layer, and this matrix was used as the input to the masking layer.
  • the output of the masking layer is a mask matrix that determines important estimators among 100 estimators.
  • the mask has a weight for each estimator through the Softmax function, and the final output value was calculated by multiplying the output of the estimator concatenated with the mask ( Figure 2).
  • non-cancer samples were radiologically unlikely to be breast cancer (BI-RADS C1, C2), 187 samples with no experience of developing cancer within 5 years and 98 samples from patients with cancer other than breast cancer were used, and surgery for patients with confirmed breast cancer was used.
  • a total of 215 samples were used (Table 7). 70% of normal samples and 70% of cancer samples were randomly classified and used to develop an algorithm model, and the remaining 30% were used to verify the model.
  • the primary candidate marker selection criterion was to select markers with an average ratio of breast cancer samples to normal samples of 1.2 times or more or 0.8 times or less, and 30 candidate markers were derived (Table 8).
  • the p-value was derived using a two-sided t-test to select less than 5%, and the P-value was calculated using the Wilcoxon rank sum test.
  • the early diagnosis system for breast cancer was a system that relied on images, and there was a problem that diagnosis accuracy could be reduced due to breast density, technician skill, and old equipment.
  • factors that reduce accessibility such as radiation risk, discomfort, and pain, are also considered problems with the conventional early diagnosis method of breast cancer.
  • the present inventors demonstrated that 452 blood proteins can be quantified in LC-MS/MS without removing high-concentration proteins within a quick analysis time of 10 minutes.
  • the final 9 markers that passed the analytical performance evaluation were selected as breast cancer screening markers.
  • the algorithm formula was developed and verified to show a high accuracy of over 0.9 based on AUC, confirming that it is accurate enough to be directly applied to clinical practice.
  • the PepQuant library can be applied to select not only breast cancer markers but also other types of cancer and other disease markers.

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Abstract

본 발명은 암에서 특이적으로 발현되는 단백질(또는 이의 절편) 또는 이들을 인코딩하는 유전자를 이용하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 혈액 단백체 중 암의 진단에 유용하게 사용할 수 있는 특정 단백질 및 이의 절편을 발굴하여 이를 진단을 위한 바이오마커로 사용함으로써, 특히 유방암을 조기에 간편하고 정확하게 진단할 수 있으며, 이를 통해 관련 질환자의 사망률을 현저히 낮추는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

암의 진단용 조성물
본 발명은 질량 분석을 이용한 유방암 진단 방법에 관한 것이다.
유방암은 전 세계 여성 암 발병률 1위인 암이자, 여성 암 1위의 사망요인을 기록하는 치명적인 암이기도 하다. 종래 유방암을 선별하는 방법은 영상적 방법에 치중되어 있다. 특히 유방암의 영상 진단 방법인 맘모그래피(mammography)는 과량의 방사선 노출에 의한 위해 우려가 존재하고, 치밀형 유방에는 진단 정확도가 낮아지는 한계점이 존재하며, 신체 노출 및 압착에 따른 불편과 고통을 환자에게 주게 되는 단점이 있다. 또한 유방초음파 검사는 고가의 검사법으로 이용자의 접근성이 제한적이며, 검사자의 숙련도 또는 기기 노후 정도에 따라 결과의 판정이 달라질 수 있다. 이처럼 종래 기술의 단점 때문에 유방암 조기 진단 분야에서 쉽고 간편하면서 경제적인 검사법에 대한 높은 요구가 존재하며, 이에 가장 적합한 방법 중 하나로 혈액 검사기 꼽힌다.
현존하는 유방암 혈액검사는 1980년대 개발되어 1997년 미국 FDA 승인을 받은 CA15-3 면역검사법이 존재하나, 초기 단계의 유방암에 대해서는 진단 정확도가 10~20% 대로 낮아 조기 진단용보다는 치료환자의 모니터링 용도로 사용하고 있는 실정이다.
한편, 최근 임상 현장에서 단일마커에 의한 검사로는 정확한 진단을 내리기 어렵다는 인식이 있으며, 이를 해결하기 위한 다(多) 지표 마커가 대안으로 부상하고 있다. 이러한 인식 속에서, 질량 분석법은 동시에 많은 수의 마커를 측정할 수 있을 뿐 아니라 항체를 이용하지 않는다는 점에서 다 지표 마커를 이용하기에 적합한 방법에 해당한다. 다만, 지금까지 질량분석기를 통한 수천 개의 바이오마커 발굴 연구가 지속되어 왔으나 높은 가격과 낮은 재현성 및 긴 분석 시간의 이슈 등에 의해 여전히 임상에 적용되는 사례는 드문 상황이다.
질량 분석법이 임상 현장에 잘 적용되기 위해서는 무엇보다 가격 경쟁력 및 재현성을 확보해야 하며, 분석 시간 또한 대폭 줄여야 한다. 특히 혈액 단백질 전처리 과정에서 재현성과 경제성을 동시에 확보하기 위해 고농도 단백질을 제거(abundant proteins depletion)를 하지 않은 상태의 혈액을 그대로 전처리하는 것이 필요하며, 분석 시간 역시 기존 1-2시간에서 10-20분대로 대폭적인 축소가 필수적이다. 분석에 불필요한 고농도 단백질들(high abundant proteins)의 제거는 단백질 동정(profiling)의 수를 증가시켜 줄 수 있지만, 고농도 단백질들이 제거되는 과정에서 이들과 함께 일부의 피분석 물질들 또한 제거되며 샘플 간 또는 컬럼 간 단백질 제거 정도가 상이하기 때문에 재현성을 장담하기 어렵고, 여러 스텝을 거쳐야 하는 속성상 핸들링 에러율이 증가하며, 분석 시간이 길어지게 되어 상당한 비용 증가의 요인이 된다.
이에, 본 발명자들은 알부민, 면역글로불린, 트랜스페린 등의 고농도 단백질들을 제거하지 않은 상태의 혈액(혈청 및 혈장)을 분석의 대상으로 하면서도 10분 이내로 분석 시간을 대폭 축소하여 궁극적으로 임상에서 사용하기에 충분한 경제성과, 재현성을 확보한 유방암 선별 바이오마커를 발굴하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 기존 유방암에 대한 진단방법인 유방X선 촬영술이 가지는 과량의 방사선 노출 및 치밀형 유방에 대한 낮은 진단 정확도를 해결하기 위하여, 고농도의 단백질들을 제거하지 않은 상태의 혈액을 분석의 대상으로 하여 간편하면서, 신속한 분석을 가능하게 하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 임상 체계에서 사용 가능한 수준의 정량성과 재현성이 확보된 바이오마커를 발굴하였고, 이를 통하여 신속하면서도 높은 신뢰도로 유방암을 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 암의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암의 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 APOC1(Apolipoprotein C1), CHL1(Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9(Matrix metalloproteinase-9), PRDX6(Peroxiredoxin-6), PRG4(Proteoglycan 4), PPBP(Platelet basic protein), FN1(Fibronectin), VWF(von Willebrand factor) 및 CLU(Clusterin)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이들의 일부 절편; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 기존 유방암에 대한 진단방법인 유방X선 촬영술이 가지는 과량의 방사선 노출 및 치밀형 유방에 대한 낮은 진단 정확도를 해결하기 위하여, 고농도의 단백질들을 제거하지 않은 상태의 혈액을 분석의 대상으로 하여 간편하면서, 신속한 분석을 가능하게 하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 임상 체계에서 사용 가능한 수준의 정량성과 재현성이 확보된 바이오마커를 발굴하였고, 이를 통하여 신속하면서도 높은 신뢰도로 유방암을 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C1, APOC1)의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 상기 APOC1은, 아포리포단백질 C(Apolipoprotein C)의 구성원이며, 인간에서는 APOC1 유전자에 의하여 암호화될 수 있다. 또한, 가장 처음에는 간에서 발현되고, 이후 단핵구가 대식세포로 분화할 때 활성화될 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 CHL1의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 상기 CHL1은,“L1의 근접 상동(Close Homolog of L1)”을 뜻하며, 또한 신경세포부착분자-L1-유사-단백질(Neural Cell Adhesion Molecule L1 Like protein)이라고도 불릴 수 있으며, 인간에서는 CHL1 유전자에 의하여 암호화될 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 기질금속단백분해효소 9(Matrix Metalloproteinase-9, MMP9)의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 상기 MMP-9은 92kDa 형 IV 콜로게나제(92kDa type IV Collagenase), 92kDa 젤라티나제(92kDa gelatinase) 또는 젤라티나제 B(Gelatinase B, GELB)로도 알려져 있다. MMP-9은 아연-금속단백분해효소 계열(Zinc-Metalloproteinases family) 계열의 구성원이며, 세포외기질(Extracellular matrix)을 분해하는 것에 관여한다고 알려져 있다. 인간에서는 MMP9 유전자에 의하여 암호화될 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 페로시레독신-6(Peroxiredoxin-6, PRDX6)의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 상기 PRDX6는 항산화효소인 페레독신 패밀리(Peredoxin Family)의 구성원일 수 있으며, 인간에서는 PRDX6 유전자에 의하여 암호화될 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 프로테오글리칸 4(Proteoglycan 4, PRG4)의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 상기 PRDG4는 루브리신(Lubricin)이라고도 불리며, 인간에서는 Prg4 유전자에 의하여 암호화될 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 전혈소판 기본 단백질(Pro-Platelet basic protein, PPBP)의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 상기 PPBP는 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드(케모카인 (C-X-C motif) ligand, CXCL7)이라고도 불리며, 인간에서는 PPBP 유전자에 의하여 암호화될 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 파이브로넥틴 1(Fibronectin 1, FN1)의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 상기 FN1은 고분자량 당단백질로써 세포외기질의 막수용체 단백질인 인테그린(Integrin)에 부착될 수 있으며, 다른 세포외기질 단백질인 콜라겐, 파이브린, 황산헤파란 당단백질(Heparan Sulfate Proteoglycans)과 결합할 수 있다. 또한, 인간에서는 FN1 유전자에 의하여 암호화될 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 폰빌레브란드인자(von Willebrand Factor, VWF)의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 상기 VWF는 혈관내피세포 또는 골수의 거대핵세포에서 생산되는 접착인자로써 혈소판이 내피하조직과 결합 시 접착제 역할을 하거나, 응고인자 중 제 Ⅷ인자의 보조체로써 혈액중에서 해당 인자와 결합하여 안정화를 유도하는 작용을 수행할 수 있다. 또한, 인간에서는 VWF 유전자에 의하여 암호화될 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 클러스터린(Clusterin, CLU)의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 클러스터린 단백질은 75-80 kDa의 분자량을 가지는 디설파이드-연결 헤테로다이머 단백질로서, 세포 잔해 제거 및 세포 사멸과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 인간에서는 CLU 유전자에 의하여 암호화될 수 있다.
본 발명에서 진단의 대상이 되는 질환으로 상기 “암”은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 진단의 대상이 되는 암은 구체적으로 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비 호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장 암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연 조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS, central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으며, 보다 구체적으로는 유방암일 수 있다.
본 발명에서 상기 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 상기한 암의 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드들의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 폴리펩타이드들에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 “항체”는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명에서 언급하는 폴리펩타이드들에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
본 발명의 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술 (Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 상기 “PNA(Peptide Nucleic Acid)”는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). “Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide”. Science 254(5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 상기 “앱타머”는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K “Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine”. J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. “An artificial cell- cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)] 에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드들을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 “프라이머”는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 “프로브”란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고 뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 “LNA(Locked nucleic acids)”란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 ‘locking’으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다. 본 발명에서 상기 “안티센스”는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로 이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛 간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드의 아미노산 서열 정보 및 이를 코딩하는 핵산 서열은 다양한 public data를 통해 개시되어 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면,
상기 APOC1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 1(TPDVSSALDK)의 아미노산 서열을 가지며;
상기 CHL1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 2(VIAVNEVGR)의 아미노산 서열을 가지고;
상기 MMP9 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 3(AVIDDAFAR)의 아미노산 서열을 가지며;
상기 PRDX6 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 4(LSILYPATTGR)의 아미노산 서열을 가지고;
상기 PRG4 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 5(AIGPSQTHTIR)의 아미노산 서열을 가지며;
상기 PPBP 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 6(TTSGIHPK)의 아미노산 서열을 가지고;
상기 FN1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 7(STTPDITGYR)의 아미노산 서열을 가지며;
상기 VWF 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 8(ILAGPAGDSNVVK)의 아미노산 서열을 가지고;
상기 CLU 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 9(TLLSNLEEAK)의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 진단용 조성물로 진단할 수 있는 암은 유방암이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩타이드 또는 이의 일부 절편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리펩타이드 또는 이의 일부 절편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 진단용 조성물을 포함하는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에서는 상기 진단용 키트를 이용하여 암 질환의 발병 여부, 발병 가능성, 치료 반응성, 예후, 병기, 재발 가능성 등을 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 진단의 대상이 되는 상기 암에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 암의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명에서 상기 암의 진단용 키트는 역전사 중합효소 반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소 반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 구체적으로는 약 10bp 내지 30bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합 효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광 표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합 할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 진단용 키트에서 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐 (polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 진단용 키트에서 2차 항체의 표지체는 발색 반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질 (fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 진단용 키트에서 발색을 유도하기 위한 발색 기질은 발색 반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 마커 단백질들의 존재 유무를 검출한다.
본 발명의 진단용 키트에서 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02M 인산염 완충용액, 0.13M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 진단용 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, APOC1(Apolipoprotein C1), CHL1(Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9 (Matrix metalloproteinase-9), PRDX6(Peroxiredoxin-6), PRG4(Proteoglycan 4), PPBP(Platelet basic protein), FN1(Fibronectin), VWF(von Willebrand factor) 및 CLU(Clusterin)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이들의 일부 절편; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 측정의 대상이 되는 폴리펩타이드들에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기 “목적하는 개체”란, 상기 암의 발병 여부가 불확실한 개체로, 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
본 발명에서 상기 “생물학적 시료”는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수 막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액 (lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물 (cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 발병 가능성이 높은 환자의 피부를 절개하지 않고 중공침 등을 생체 내 기관에 자입하여 병리조직학적 검사용으로 채취한 액체 생검(예를 들면, 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 복수(ascites) 등)일 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 1 내지 9로 표시되는 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 APOC1(Apolipoprotein C1), CHL1(Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9(Matrix metalloproteinase-9), PRDX6(Peroxiredoxin-6), PRG4(Proteoglycan 4), PPBP(Platelet basic protein), FN1(Fibronectin), VWF(von Willebrand factor) 및 CLU(Clusterin)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질(폴리펩타이드) 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계일 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography- Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스 턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의할 수 있다.
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법은 질량분석기 (mass-spectrometry), 바람직하게는 삼중 사극자 질량 분석기 (triple quadrupole mass-spectrometry)를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 질량분석기 (mass-spectrometry)를 이용한 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법은 특정 분석물질을 선택적으로 분리하여 검출하고 정량하여 그 농도변화를 모니터링할 수 있는 분석 기술이다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제 1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 어미이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 어미이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. MRM은 작은 분자의 정량분석에 활용되어 특정 유전병을 진단하는데 쓰이고 있다. MRM 방법은 다수의 펩타이드를 동시에 측정하기에 용이하며, 항체가 없이 정상 인과 암환자 사이에서 단백질 진단 마커 후보들의 상대적 농도차를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한 민감도와 선택성이 탁월하여 특히, 질량분석기를 이용한 프로테옴 분석에서 혈액 내에 있는 복잡한 단백질과 펩타이드의 분석을 위해 MRM 분석방법이 도입되고 있다(Anderson L. et al., Mol CellProteomics, 5: 375-88, 2006; DeSouza, L. V. et al., Anal. Chem., 81: 3462-70, 2009).
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법에 의해 본 발명에서 언급하는 폴리펩타이드의 발현 수준의 측정을 할 수 있다.
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법에 의해 본 발명에서 언급하는 폴리펩타이드의 발현 수준을 분석하기 위하여, 타겟 펩타이드의 질량/전하 값(m/z 값)을 사용할 수 있고, 이 때 m/z 값의 정보는 하기 표 1에 나타낸 바와 같으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
No Gene Protein Accession No. Sequence M+H
1 APOC1 Apolipoprotein C1 P02654 TPDVSSALDK 1032.5280
2 CHL1 Neural cell adhesion molecule L1 like O00533 VIAVNEVGR 966.5524
3 MMP9 Matrix metalloproteinase-9 P14780 AVIDDAFAR 977.5051
4 PRDX6 Peroxiredoxin-6 P30041 LSILYPATTGR 1191.6732
5 PRG4 Proteoglycan 4 Q92954 AIGPSQTHTIR 1180.6433
6 PPBP Platelet basic protein P02775 TTSGIHPK 840.4574
7 FN1 Fibronectin P02751 STTPDITGYR 1110.5426
8 VWF von Willebrand factor P04275 ILAGPAGDSNVVK 1240.6896
9 CLU Clusterin P10909 TLLSNLEEAK 1117.6099
본 발명에서 폴리펩타이드는 APOC1(Apolipoprotein C1), CHL1(Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9(Matrix metalloproteinase-9), PRDX6(Peroxiredoxin-6), PRG4(Proteoglycan 4), PPBP(Platelet basic protein), FN1(Fibronectin), VWF(von Willebrand factor) 또는 CLU(Clusterin)일 수 있다. 상기 폴리펩타이드들의 타겟 펩타이드를 이용하여 목적하는 개체의 생물학적 시료 속에 존재하는 각각의 폴리펩타이드들의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서 내부 표준 물질은 상기 다중 반응 모니터링 분석 시 일반적으로 사용되는 임의의 내부 표준 물질이 사용될 수 있으나, 예를 들어, 대장균 베타 갈락토시다아제가 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 폴리펩타이드의 혈액 내 절대량을 측정하기 위하여 타겟 펩타이드의 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩타이드를 내부 표준 물질로서 합성하는 경우, 동위 원소로 치환된 아미노산은 리신(Lysine)이나 아르기닌(Arginine)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 합성된 펩타이드는 95% 이상 순수 분리된 펩타이드를 사용할 수 있다.
본 발명에서 내부 표준 물질은 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O 및 18O로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방사성 동위원소를 포함할 수 있으나, 전술한 방사성 동위원소에 국한되지 않고, 폴리펩타이드의 절대량을 측정하는데 비교군으로 사용할 수 있는 모든 종류의 동위원소를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가하거나 감소한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 치료 반응성을 예측할 수 있다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 서열번호 1 내지 9로 표시되는 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 개체의 예후, 바람직하게는 외과적 수술 후 예후를 예측할 수 있다. 여기서 상기 목적하는 개체는 암이 발병하여 외과적 절제 수술을 받은 개체일 수 있다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 개체에서 암의 병기를 예측할 수 있다.
본 발명에서 상기 “병기(stage)”란 암세포가 퍼진 정도, 암의 진행 단계를 의미하는 것으로, 암의 진행상황에 따른 국제적 분류는 일반적으로 TNM 병기 분류에 따른다. 여기서 ‘T(Tumor Size)’는 원발 종양의 크기에 따른 분류이고, ‘N(Lymph Node)’은 림프절 전이 정도에 따른 분류이며, ‘M(Metastasis)’은 다른 장기로의 전이 여부에 따른 분류에 해당한다. T, N, M에 있어서 상세 분류는 하기 표 2와 같으며 이에 따른 암의 병기 분류는 하기 표 3과 같다.
TNM 병기 정의
원발 종양의 크기
(T 병기)
Size of the primary tumor
(T stage)		 T0 종양세포의 형태가 악성종양의 모습을 보이나 발생한 점막 또는 상피에 국한돼 있고 아직 기저막을 침윤하지 않은 종양
T1 원발된 장기에 제한된 병변, 종양이 가동성이 있으며 인접 및 주위조직에 침범이 없음
T2 종양의 크기가 2~5cm 정도
T3 종양의 크기가 T2 보다 크나 장기 내에 국한됨
T4 주변 조직과 유착 및 침윤한 상태
림프절 전이 여부
(N 병기)
Lymph node status
(N stage)		 N0 림프절 병변의 증거가 없음
N1 촉지되고 가동성이 있으며 첫 번째 위치에 제한되어 있는 림프절(1~2cm 이상, 보통 3cm까지의 크기) 하나에 침범
N2 촉지되고 부분적으로 가동성이 있는 또는 단단하거나 딱딱한 림프절, 현미경적으로 침범의 증거가 있고 임상적으로 서로 엉켜있으며 반대측 또는 양측에서 나타남(3~5cm)
N3 완전히 고정되어 있고 피막을 통과해 뼈나 큰 혈관, 피부, 신경 등에 완전히 고정되어 있으며 6cm 이상의 크기
원격전이 여부(M 병기)
Distant metastasis
(M stage)		 M0 원격전이가 없음
M1 원격전이가 있음
병기분류 T1 T2 T3 T4
N0 1기 2기
N1 3기
N2
N3
M1 4기
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 암의 재발 가능성을 예측할 수 있다.
본 발명에서 암의 종류에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면,
상기 APOC1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 1(TPDVSSALDK)의 아미노산 서열을 가지며;
상기 CHL1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 2(VIAVNEVGR)의 아미노산 서열을 가지고;
상기 MMP9 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 3(AVIDDAFAR)의 아미노산 서열을 가지며;
상기 PRDX6 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 4(LSILYPATTGR)의 아미노산 서열을 가지고;
상기 PRG4 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 5(AIGPSQTHTIR)의 아미노산 서열을 가지며;
상기 PPBP 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 6(TTSGIHPK)의 아미노산 서열을 가지고;
상기 FN1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 7(STTPDITGYR)의 아미노산 서열을 가지며;
상기 VWF 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 8(ILAGPAGDSNVVK)의 아미노산 서열을 가지고;
상기 CLU 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 9(TLLSNLEEAK)의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액 (mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침 (saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉 수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리펩타이드의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석 법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리펩타이드의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면,
상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1032.5280 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이고;
서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 966.5524 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이며;
서열번호 3로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 977.5051 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이고;
서열번호 4로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1191.6732 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이며;
서열번호 5로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1180.6433 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이고;
서열번호 6로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 840.4574 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이며;
서열번호 7로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1110.5426 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이고;
서열번호 8로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1240.6896 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이며;
서열번호 9로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1117.6099 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 다중 반응 모니터링 수행 시 내부 표준 물질로써 상기 각각의 폴리펩타이드를 구성하는 특정 아미노산의 특정 원소를 동위원소로 치환한 합성 펩타이드; 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 합성 펩타이드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9로 표시되는 서열과 동일 서열을 가지며 안정 동위원소(stable isotope)를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 안정 동위원소는 탄소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 원소의 안정 동위원소이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면,
상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 CHL1(Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9(Matrix metalloproteinase-9), PRG4(Proteoglycan 4), PPBP(Platelet basic protein), FN1(Fibronectin), VWF(von Willebrand factor) 및 CLU(Clusterin) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가하고;
APOC1(Apolipoprotein C1) 및 PRDX6(Peroxiredoxin-6) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 감소한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체의 항암제에 대한 반응성을 예측한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 서열번호 1(TPDVSSALDK), 서열번호 2(VIAVNEVGR), 서열번호 3(AVIDDAFAR), 서열번호 4(LSILYPATTGR), 서열번호 5(AIGPSQTHTIR), 서열번호 6(TTSGIHPK), 서열번호 7(STTPDITGYR), 서열번호 8(ILAGPAGDSNVVK) 및 서열번호 9(TLLSNLEEAK)로 표시되는 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드, 이들을 인코딩하는 유전자 또는 이들을 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 생물학적 시료 내 서열번호 1(TPDVSSALDK), 서열번호 2(VIAVNEVGR), 서열번호 3(AVIDDAFAR), 서열번호 4(LSILYPATTGR), 서열번호 5(AIGPSQTHTIR), 서열번호 6(TTSGIHPK), 서열번호 7(STTPDITGYR), 서열번호 8(ILAGPAGDSNVVK) 및 서열번호 9(TLLSNLEEAK)로 표시되는 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계;
상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9 폴리펩타이드, 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 감소하고;
서열번호 1 또는 서열번호 4 폴리펩타이드, 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 후보물질은 암의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.
본 발명에서 상기 시료 및 상기 암에 관해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 암의 예방 또는 치료용 후보 약제와 반응시킬 수 있다.
본 발명에서의 용어 “후보 물질”은 본 발명의 유전자를 발현하는 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 이들 유전자의 활성 또는 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 상기 유전자의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 발현량 및 활성 측정방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은
입력값을 입력받는 입력부;
유방암의 발병 여부를 판독하도록 사전 학습된 기계학습 모델을 포함하는 판독부; 및
유방암의 발병 여부를 출력하는 출력부를 포함하고;
상기 입력값은 생물학적 시료 내의 1(TPDVSSALDK), 서열번호 2(VIAVNEVGR), 서열번호 3(AVIDDAFAR), 서열번호 4(LSILYPATTGR), 서열번호 5(AIGPSQTHTIR), 서열번호 6(TTSGIHPK), 서열번호 7(STTPDITGYR), 서열번호 8(ILAGPAGDSNVVK) 및 서열번호 9(TLLSNLEEAK)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현 수준의 측정값인 것을 특징으로 하는 시스템을 제공한다.
본 발명에서의 용어 “기계학습”은 컴퓨터 시스템이 패턴과 추론에 의존하여, 외부에서의 명시적 지시 없이 업무를 수행하는데 사용하는 알고리즘 및 통계 모델을 의미한다. 본 발명에서 기계학습 모델은 구체적으로 딥러닝(Deep learning), 로지스틱 회귀(Logistic regression), 서포트 벡터 머신(Support vector machine, SVM), 랜덤 포레스트(Random forest), 경사 부스팅 알고리즘(Gradient boosting algorithm, GBM)를 사용할 수 있고, 보다 구체적으로 딥러닝(Deep learning)을 사용할 수 있으나, 이에 국한되지 않고 본 발명의 바이오마커의 발현량을 측정한 데이터를 이용하여 유방암을 진단할 수 있는 모든 종류의 기계학습 모델을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 기계학습 모델은 딥러닝(Deep Learning) 모델이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액이다.
본 발명에서 기계학습 모델의 입력값은 생물학적 시료인 “혈액”에서 측정된 폴리펩타이드의 발현 수준의 측정값의 측정값일 수 있으나, 이에 국한되지 않고 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수 막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액 (lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물 (cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 발병 가능성이 높은 환자의 피부를 절개하지 않고 중공침 등을 생체 내 기관에 자입하여 병리조직학적 검사용으로 채취한 액체 생검(예를 들면, 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 복수(ascites) 등)일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리펩타이드의 발현 수준의 측정값은 질량분석(Mass Spectrometry)에 따른 정량값이다.
본 발명에서 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하기 위한 질량분석(Mass Spectrometry)에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 질량분석은 액체 크로마토그래피-다중 질량 분석(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS)이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 APOC1(Apolipoprotein C1), CHL1(Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9(Matrix metalloproteinase-9), PRDX6(Peroxiredoxin-6), PRG4(Proteoglycan 4), PPBP(Platelet basic protein), FN1(Fibronectin), VWF(von Willebrand factor) 및 CLU(Clusterin)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이들의 일부 절편; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 암에서 특이적으로 발현되는 단백질(또는 이의 절편) 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 발굴하고, 이를 이용하여 암을 진단하는 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 혈액 단백체 중 암의 진단에 유용하게 사용할 수 있는 특정 단백질 및 이의 절편을 발굴하여 이를 진단을 위한 바이오마커로 사용함으로써, 특히 유방암을 조기에 간편하고 정확하게 진단할 수 있으며, 이를 통해 관련 질환자의 사망률을 현저히 낮추는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 혈액 샘플 내의 펩타이드를 분석하여 구성한 라이브러리에 관한 그림이다. 도 1a는 혈액 샘플에 존재하는 펩타이드에 대한 질량분석 데이터로 구성된 라이브러리(PepQuant Library)를 구축 프로세스를 도시한 그림으로서, 샘플에 대한 설명 및 단백질 전처리와 질량분석 과정을 나타내고 있다. 도 1b는 삼중 사중극자(Triple quadrupole(MS/MS)) 장비에서 산출되는 크로마토그램과 표준품에 의한 크로마토그램을 비교하여 정량 가능한 타겟 펩타이드를 탐색하는 과정을 도시한 그림이다. 도 1c는 정량 가능한 펩타이드의 분포를 도시한 그림으로, PepQuant 라이브러리에서 정량 가능한 단백질 중 blood atlas에서 농도가 알려진 124개 혈액 단백질에 대한 로그-스케일 변환 분포를 도시한 그림이다. 도 1d는 도 1c의 혈액 단백질에 대한 히스토그램 분포를 도시한 그림이다. 도 1e는 PepQuant 라이브러리에서 혈청/혈장(serum/plasma)별로 정량 가능한 마커 수를 도시한 그림이다.
도 2는 유방암 진단 모델을 개발하기 위한 딥러닝(Deep learning) 모델의 구조를 도시한 그림이다.
도 3은 본 발명에서 선정된 바이오마커 조합 및 딥러닝 알고리즘에 의한 진단 정확도를 확인한 실험의 결과를 도시한 그림이다. 도 3a는 본 발명에서 선정된 바이오마커 조합 및 딥러닝 알고리즘에 의한 진단 정확도를 분석한 ROC 곡선을 도시(ROC Curve)한 그림이다. 도 3b는 본 발명에서 선정된 바이오마커 조합 및 딥러닝 알고리즘에 의한 진단 정확도를 유방암의 기수 별로 분석한 결과 및 타암 결과를 표시한 박스 플롯(Box plot)이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
PepQuant library 구축
고농도 단백질 제거 없이 전체 혈청 및 혈장을 활용하여 10분이라는 매우 빠른 분석 시간 내에서 재현 가능하고 정량 가능한 펩타이드의 수를 최대한 확보하기 위해 MRM 라이브러리(PepQuant Library)를 구축하였다.
이를 위해 Secretome Database(Science, 2019), Blood atlas DB 및 문헌 연구에서 혈액에 존재하는 것으로 알려진 3,338개의 서로 다른 단백질 목록을 수집했으며, 이 중 4,683개의 대표 펩타이드(surrogate peptide: 특정 단백질에만 존재하는 시퀀스를 갖고 있어, 특정 단백질을 대표할 수 있는 펩타이드를 의미함)를 자체 알고리즘 및 선정의 로직을 구축하여 인 실리코(in silico)로 선정하였다.
선정된 4,683개 펩타이드를 모두 합성하였으며, 합성된 개별 펩타이드들은 실제 혈청 샘플에 존재하는 동일한 펩타이드들이 검출되는지 여부를 알기 위한 용도로 사용되었다. 즉, 합성 표준 펩타이드의 머무름 시간 및 단편화 패턴을 먼저 파악하고, 혈액 시료 내에서도 동일한 머무름 시간과 동일한 단편화 패턴이 관찰되면, 이 펩타이드는 혈액 내에서 검출이 된 것으로 판단하였다. MRM 라이브러리(PepQuant 라이브러리)는 3,338개의 단백질에서 생성되어 가장 안정적인 형태라고 판단되는 4,683개의 대리 펩타이드에 대한 포괄적인 LC-MSMS 크로마토그램 데이터베이스에 해당한다. 이 라이브러리에는 4,683개의 표준 펩타이드 크로마토그램과 내인성 펩타이드 크로마토그램이 모두 포함되어 있다. 총 148개의 혈액 샘플을 사용하여 'PepQuant Library'라는 MRM 라이브러리를 구축하였다. 이 샘플에는 6가지 다른 암 유형(유방암 40개, 췌장암 20개, 갑상선암 20개, 난소암 20개, 결장직장암 18개, 질병이 없는 정상 혈액 샘플 30개)이 포함되었다.
시료 수집 및 전처리법
- 시료수집
2019년부터 2020년까지 총 13개 기관에서 혈액 시료를 유방암 및 암 진단 마커 발굴을 위한 IRB를 통해 시료 수집이 진행되었다. 이중, 서울대 병원에서 수집한 암 샘플 40례 및 정상 샘플 30례를 이용하였다. 그 외, 유방암 외 타 암 마커 및 상관성 연구를 위해 2020년 수집한 혈청 시료 췌장암 20례, 갑상선암 20례, 난소암 20례, 폐암 20례, 대장암 18례를 이용하였다.
- MRM 분석 전 시료 전처리
고농도 단백질(알부민, 트랜스페린, 면역글로불린 등)을 제거하지 않은 혈청/혈장 시료를 사용하였다. 혈청 5㎕를 요소(urea)와 디티오트레이톨(DTT) 시약이 첨가된 버퍼에 로딩하였다. 이를 통해 시스테인의 이황화 결합을 끊어지면서 단백질 구조가 풀어지게 하였다. 이를 35℃에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 배양 후, 실온으로 냉각하고, 요오도아세트아미드(IAA)를 넣고 실온 암실에서 30분 동안 배양하였다. IAA에 의해 이황화 결합의 끊어진 부분이 알킬화시켜 재결합이 없게 하였다. 이후 트립신 소화를 위해 중탄산암모늄(ammonium bicarbonate)버퍼로 희석시키고 트립신은 5ug (약 1:50 (w/w)) 로딩하고 37℃에서 16시간 배양하였다. 이후, 10% TFA를 이용하여 트립신 반응을 종결하고, 탈염을 수행하였다. 완전히 말려진 시료는 질량 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다. 질량 분석 시 건조된 샘플을 0.1% 포름산(FA)으로 재현탁하였다.
- 질량분석
질량분석기는 Qtrap 5500 및 Qtrap 5500 plus를 이용했으며(Sciex, USA), 분석 소프트웨어는 Analyst 1.7.2를 이용했고, 정량 프로그램은 Multiquant(3.0.2)를 사용하였다. LC 분리는 C18 역상 컬럼을 사용하였으며, MRM 모드에서 분석하였다.
시약
본 개발에 사용된 각 바이오마커별 헤비 펩타이드 스탠다드(heavy peptide standard)는 ㈜베르티스(Republic of Korea)의 GMP(Good Manufacturing Practice) 시설에서 합성하여 사용하였다. 각 헤비 펩타이드 스탠다드의 저장용 용액(stock solution)은 -80℃의 디프 프리저(deep freezer)에 보관하고, 필요할 때마다 희석하여 사용하였다.
- PepQuant library 구축 및 마커 발굴 결과
고농도 단백질들을 제거하지 않은 상태에서 10분의 빠른 농도구배 조건에서 검출 가능한 펩타이드를 선택하기 위해 'pepQuant-library'라는 MRM 라이브러리를 구축하였다. 이 라이브러리에는 4,683개의 표준 펩타이드 크로마토그램과 내인성 펩타이드 크로마토그램이 모두 데이터베이스화 되어 있다.
합성 표준품의 머무름 시간과 제2 생성물 패턴과 혈액 내의 펩타이드의 것과 일치하는 것 중 S/N 비율(S/N ratio)이 3 이상이면 이들 펩타이드를 검출 가능한 펩타이드로 정의하였다. 반대로 단편화된 패턴이나 머무름 시간이 일치하지 않으면 대상 펩타이드는 검출되지 않은 것으로 간주하였다. 4,683개의 합성 표준 펩타이드의 크로마토그램 정보를 기반으로 실제 혈액 샘플에 존재하는 452개의 단백질, 852개의 펩타이드를 검출하였다. 검출 가능한 펩타이드 중 농도를 알고 있는 124개 단백질의 분포를 파악한 결과, 40mg/ml 이상에서 1ng/ml 수준까지 광범위한 농도를 함유하고 있는 것을 확인하였다(도 1). 이러한 결과는 유사한 조건의 다른 연구와 비교하였을 때 훨씬 많은 단백질이 검출되었다는 것을 보여준다(표 4).
고농도 단백체 비제거 상태에서 측정 가능한 단백질 수 비교
검출
(Detection)		 단백질 분포
(Protein range)		 질량분석 종류
(Mass type)		 구배시간
(Gradient time)		 년도
(Year)
AJ Percy et al. 142 31mg~44ng/ml LC-MSMS 45 min 2013
PE Geyer et al. 313 NA Orbitrap 20 min 2016
A Kraut et al. 280 NA Orbitrap 60 min 2019
PepQuant-library 452 40mg~1ng /ml LC-MSMS 10 min 2022
알고리즘 개발 방법
- 검체 이용
본 임상은 유방암 마커의 전향적 다기관 임상시험(KCT 0004847)에서 수집된 혈청 검체를 이용했다. 해당 임상은 13개 병원에서 2019년부터 2020년까지 총 649례의 혈장 및 혈청 검체를 수집하였다. 그러나 해당 임상시험의 목표 중 하나인 혈청 검체에서 추가적인 유방암 마커의 발굴과 개발을 위해 이용할 수 있는 충분한 양이 있는 혈청 검체는 12개 병원 402개의 혈청 검체에 한정되었다. 더불어 모두 성인 여성 검체이다. 해당 임상에서 이용한 혈청 검체는 정상 검체는 유방 영상에서 암이 발견되지 않는 BI-RADS 1 또는 2 범주에 속한다. 또한 5년 이내에 다른 암이나 재발이 없었다는 조건을 만족해야 한다. 암 샘플은 생검 전에 채취한 유방암 환자의 샘플에 속한다. 각 병원의 검체수는 다음과 같다. 서울대병원(정상 187명), 분당서울대병원(암 14명), 단국대병원(암 27명), 중앙대병원(암 26명), 한림대학교 강남성심병원(암 13명), 국립암센터(암 22명), 명지병원(암 25명), 한양대학교병원(암 9명), 가톨릭대학교, 서울 ST. 성모병원(암 11명), 고려대 안암병원(암 14명), 고려대 구로병원(암 29명), 경상대학교 병원(암 25명), (표 5).
수집 검체의 연령대는 20세 이상 여성이며, 40~50대가 전체 여성의 63%를 차지하고 있다. 정상군은 5년간 타 암을 포함하여 어떤 암도 발병하지 않았고, 영상학적으로 유방의 조직검사가 필요하지 않은 경우에 해당한다. 암 환자군은 유방 조직 검사를 통해 병리학적으로 확진된 케이스를 의미한다. 기수별 분포는 기수가 밝혀진 샘플에 대해 TNM병기 0기 9.5%, 1기 38.1%, 2기 35.7%, 3-4기 16.7%로 분포되었다.
유방암이 아닌 5대 암 시료(갑상선암 20례, 난소암 20례, 췌장암 20례, 폐암 18례, 대장암 20례)는 유방암 마커 발굴 및 검증을 위한 타 암 검증에 대한 후향적 임상 시험(서울대학교 IRB 승인 H-1911-085-1079)에서 98례의 혈청샘플을 수집하였다.
알고리즘 개발세트 : 총 샘플 정보
그룹 나이 수 BMI
(AVG.)		 농도 수준(Density_grade) (1~4) TNM 병기 분류
1 2 3 4 NA 0 1 2 3-4 NA
정상 20 ~ 39 30 20.8 0 0 4 6 20 - - - - -
40 ~ 49 68 23.1 1 0 26 28 13 - - - - -
50 ~ 59 62 23.6 0 5 33 17 6 - - - - -
60 ~ 69 26 24.3 1 5 17 2 1 - - - - -
70 + 5 22.1 0 2 3 0 0 - - - - -
합계 187 2 12 81 52 40
암환자 20 ~ 39 9 21.5 0 2 5 1 0 0 2 5 1 1
40 ~ 49 66 23.6 8 16 19 4 1 8 16 19 5 18
50 ~ 59 85 24.0 3 29 18 11 2 3 29 18 14 21
60 ~ 69 73 24.9 7 22 21 5 0 7 22 21 6 17
70 + 28 25.1 2 10 10 2 0 2 10 10 2 4
합계 215 3 14 24 7 213 20 80 75 35 61
총계 402 22 91 155 75 43 20 80 75 35 61
- 혈액분리, MRM 분석 전 시료 전처리, 질량분석
본 발명의 PepQuant library 구축에서 사용한 혈액분리, MRM 분석 전 시료 전처리 및 질량분석 방법과 동일한 방법을 사용하였다.
- 분석 마커
PepQuant-library에 의해 발굴된 최종 마커를 이용하였다.
- 알고리즘 모델 개발
정상 샘플 70%와 암 샘플 70%는 랜덤하게 분류하여 알고리즘 모델 개발에 사용하였다. 무작위 샘플링은 총 5회 진행되고, 개발에 사용한 세트에서 사용하지 않은 30%로 검증(test)을 수행한다(표 6). 유방암 진단 모델을 개발하기 위해, 여러 알고리즘을 테스트하였다. 딥러닝(Deep learning), 로지스틱 회귀공식(Logistic regression), 랜덤 포레스트(Random forest), 경사 부스팅 알고리즘(Gradient boosting algorithm)을 사용하였고, 모든 알고리즘은 파이썬(Python)을 이용하였다. 로지스틱 회귀공식, 랜덤 포레스트는 사이킷-런(scikit-learn) 프레임워크에서 기본 파라미터(parameter)를 사용하여 개발하였고, 경사 부스팅 알고리즘은 XGboost 프레임워크의 기본 파라미터를 사용하였다. 딥러닝 모델은 토치(torch) 프레임워크를 사용해 개발하였다.
최적 알고리즘 모델 선정을 위한 입력 데이터(input data) 정보
Algorithm
development
(70%)		 Test (30%)
external validation		 Total
(100%)
Normal 131 56 187
Age 20-39 20 8
Age 40-59 92 36
Age 60-79 19 11
Age 80+ 0 0
Unknown 0 1
Breast cancer 150 65 215
Age 20-39 3 3
Age 40-59 82 35
Age 60-79 51 19
Age 80+ 4 1
Unknown 10 7
Stage 0 14 2
Stage 1 33 22
Stage 2 41 16
Stage 3+ 10 3
unknown 52 22
Total 281 121 402
4가지 딥러닝/기계학습(deep learning/machine learning) 모델 중 딥러닝 모델이 가장 높은 AUC 값을 가진 것으로 조사되었다. 이에, 결론적으로 가장 높은 AUC 값을 보인 딥러닝 모델을 최종 알고리즘 모델로 선택하였다.
- 딥러닝 모델 구조
모델(Model)의 구조는 100개의 에스티메이터(estimator)로 구성하였다. 100개의 에스티메이터는 완전 연결 계층(fully-connected layer)를 기반으로 하는 동일한 구조를 가진다. 각 에스티메이터는 총 4개의 계층으로 구성되어 있으며, 각 계층은 완전 연결 계층(fully-connected layer(linear layer)), 배치 정규화(batch normalization), Relu 함수(Relu function), 드롭-아웃(Drop-out)의 순서로 구성하였다. 각 에스티메이터의 마지막 층은 시그모이드 함수(Sigmoid function)을 통해 0과 1 사이의 값, 즉 암(cancer)일 확률을 나타내는 값을 출력한다. 100개 에스티메이터의 출력은 연접 계층(concatenation layer)을 통해 하나의 행렬로 합쳐졌으며, 해당 행렬은 마스킹 계층(masking layer)의 입력으로 사용되었다. 마스킹 계층(Masking layer)의 출력은 100개 에스티메이터 중, 중요 에스티메이터를 결정하는 마스크(mask) 행렬을 출력한다. 해당 마스크는 소프트맥스 함수(Softmax function)를 통해 각 에스티메이터에 대한 가중치를 가지며, 해당 마스크와 연접(concatenated)된 에스티메이터의 출력을 곱하여 최종 출력 값을 산출하였다(도 2).
- 모델 검증
모델 훈련과 검증을 위해 사용된 검체는 타 암 샘플까지 포함하여 총 500샘플을 이용하였다. 이 중 암이 아닌 검체는 영상학적으로 유방암 가능성이 없고(BI-RADS C1,C2), 5년 내 암 발병 경험이 없는 샘플 187개와 유방암이 아닌 타 암 질환자 샘플 98개가 이용되었으며, 유방암 확진자의 수술 전 샘플 215개가 사용되었다(표 7). 정상 샘플 70%와 암 샘플 70%는 랜덤하게 분류하여 알고리즘 모델 개발에 사용되고, 나머지 30%는 모델 검증에 사용하였다.
딥러닝 알고리즘 개발에 이용된 입력 데이터(input data) 정보
Sample category Training set (70%) Test set (30%) Total
(100%)
Healthy controls Age Total 131 56 187
Age 20-39 20 8
Age 40-59 92 36
Age 60-79 19 11
Age 80+ 0 0
Unknown 0 1
Breast cancer Age Total 150 65 215
Age 20-39 3 3
Age 40-59 82 35
Age 60-79 51 19
Age 80+ 4 1
Unknown 10 7
Stage Total 150 65 215
Stage 0 14 2
Stage 1 33 22
Stage 2 41 16
Stage 3+ 10 3
unknown 52 22
Other cancers Other cancers total 69 29 98
Ovarian 14 6
Pancreas 14 6
Thyroid 14 6
Colon 14 6
lung 13 5
Total 350 150 500
- 유방암 마커 선별
Library에 사용된 시료 중 유방암 시료 50개와 정상 시료 50개를 이용하여 PepQuant library에 올라온 타겟 펩타이드 목록(target peptide list) 내에서 혈청(Serum)에서 발견 가능한 418개에 대해 LC-MS/MS를 이용하여 MRM 분석(MRM analysis)을 수행했고 여기에서 유방암과 정상 간 농도 수치의 차이가 유의하게 발생하는 단백질을 마커로 선정했다. 정량을 위해 마커별로 합성 동위원소 표준품을 내부표준품(IS, internal standard)으로 이용했다. 분석물(A, analyte)의 농도는 (A/IS ratio X IS quantity = quantification value)으로 나타냈다. 내부표준품은 총 418개를 합성하였으며(Bertis, Korea) 전체 샘플 전처리법은 PepQuant library 구축 시 이용했던 방법과 동일하다.
일차 후보 마커 선별 기준은 유방암 시료 대 정상 시료의 평균 비율이 1.2배 이상 혹은 0.8배 이하인 마커를 선정했고, 30개의 후보 마커를 도출하였다(표 8). p-value의 도출은 t-test의 양측검정을 이용해 5% 미만으로 선정했으며, P-value 산정은 윌콕슨 순위합 검정(Wilcoxon rank sum test)을 이용하였다.
30개 후보 마커
번호 유전자 식별번호(Accession) 단백질 명칭
(Protein name)		 sequence
1 FN1 P02751 Fibronectin STTPDITGYR
2 FN1 P02751 Fibronectin VDVIPVNLPGEHGQR
3 VWF P04275 von Willebrand factor ILAGPAGDSNVVK
4 VWF P04275 von Willebrand factor VTVFPIGIGDR
5 MMP9 P14780 Matrix metalloproteinase 9 AVIDDAFAR
6 PRG4 Q92954 Proteoglycan 4 AIGPSQTHTIR
7 PRG4 Q92954 Proteoglycan 4 DQYYNIDVPSR
8 THBS1 P07996 Thrombospondin 1 LVPNPDQK
9 APOC1 P02654 Apolipoprotein C1 TPDVSSALDK
10 CHL1 O00533 Neural cell adhesion molecule L1 like VIAVNEVGR
11 B2M P61769 Beta-2-microglobulin IQVYSR
12 LYZ P61626 Lysozyme C STDYGIFQINSR
13 CTSD P07339 Cathepsin D VSTLPAITLK
14 PPBP P02775 Platelet basic protein TTSGIHPK
15 C4BPA P04003 C4b-binding protein alpha chain LSLEIEQLELQR
16 HBD P02042 Hemoglobin subunit delta TAVNALWGK
17 lgals3bp Q08380 Galectin-3-binding protein YSSDYFQAPSDYR
18 MASP1 P48740 Mannan-binding lectin serine protease 1 SDFSNEER
19 APOF Q13790 Apolipoprotein F SGVQQLIQYYQDQK
20 CPB2 Q96IY4 Carboxypeptidase B2 YSFTIELR
21 VCAM1 P19320 Vascular cell adhesion protein 1 SIDGAYTIR
22 GPLD1 P80108 Phosphatidylinositol-glycan-specific phospholipase D GAVYVYFGSK
23 FCGBP Q9Y6R7 IgGFc-binding protein GNPAVSYVR
24 LTF P02788 lactotransferrin YYGYTGAFR
25 FCN2 Q15485 Ficolin-2 VDGSVDFYR
26 PRDX6 P30041 Peroxiredoxin-6 LSILYPATTGR
27 IGF1 P05019 Insulin-like growth factor1 GFYFNKPTGYGSSSR
28 CLU P10909 Clusterin TLLSNLEEAK
29 CHGA P10645 Chromogranin-A ILSILR
30 PIGR P01833 Polymeric immunoglobulin receptor VYTVDLGR
이후 30개 후보 마커를 암 시료 96개, 정상 시료 95개에서 비교 검증하였고, 유방암 시료 대 정상 시료의 평균 비율이 1.2배 이상 또는 0.8배 이하인 마커를 이용하였다(p-value <0.05). 이 과정에서 총 16개 마커가 추려졌으며, 질량분석기에서의 마커별 분석적 성능 테스트를 실시하여 최종 9개 마커를 선정하였다(표 9). 참고로 분석적 성능 시험은 유방암 후보 마커를 대상으로 질량분석기에서의 정량 결과의 신뢰성을 증명하기 위한 검증 시험으로 해당 펩타이드의 정량값을 LC-MS/MS로 측정하였고, 특이성 (선택성), 직선성, 일내 정밀성 / 일간 정밀성 (precision), 안정성 (stability), 매질효과의 항목을 중심으로 마커를 평가하였다.
최종 9종 마커 리스트
번호 유전자 단백질 서열 등록번호
(Accession No.)
1 APOC1 Apolipoprotein C1 TPDVSSALDK P02654
2 CHL1 Neural cell adhesion molecule L1 like VIAVNEVGR O00533
3 MMP9 Matrix metalloproteinase-9 AVIDDAFAR P14780
4 PRDX6 Peroxiredoxin-6 LSILYPATTGR P30041
5 PRG4 Proteoglycan 4 AIGPSQTHTIR Q92954
6 PPBP Platelet basic protein TTSGIHPK P02775
7 FN1 Fibronectin STTPDITGYR P02751
8 VWF von Willebrand factor ILAGPAGDSNVVK P04275
9 CLU Clusterin TLLSNLEEAK P10909
알고리즘 개발 결과
500개의 샘플 중 350개의 샘플(70%)로 개발된 deep learning 알고리즘에 나머지 150개의 샘플에서 검증할 때 최대 0.9207의 AUC 값이 산출되었으며, 5회 무작위 배정으로 학습 및 검증한 결과의 평균값 또한 0.9105임을 보여주었다(도 3a). 또한 유방암 0~1기에 대한 알고리즘 값이 2기~3기에 대한 값 대비 낮지 않음을 보여주고 있어, 0-1기의 유방암도 높은 정확도로 진단할 수 있음을 확인하였다(도 3b). 더불어 타 암 샘플에 대해서는 유방암이 아닌 상태인 정상으로 판정되어, 알고리즘이 유방암에 보다 특이적일 수 있음을 보여준다.
결론
지금까지 유방암의 조기 진단 시스템은 영상에 의존하는 시스템이어서, 유방 밀도, 기술자의 숙련도, 노후된 기기로 인해 진단 정확도가 떨어질 수 있다는 문제점이 존재하였다. 아울러, 방사선 위험, 불편함, 고통 등이 접근성을 낮추는 요인들도 종래 유방암 조기 진단 방법의 문제점으로 꼽힌다.
따라서 고정밀 혈액 검사는 영상 진단의 근본적인 문제를 해결하는 대안이 될 수 있다. 유방암 혈액 검사인 기존 CA15-3 면역분석법은 발병 초기의 정확도가 낮은 단점이 존재한다. 따라서 정확도를 높이기 위해서는 멀티마커 조합으로 구성할 필요가 있었다.
본 발명자들은 LC-MS/MS에서 고농도 단백질들을 제거하지 않은 상태에서 452개의 혈액단백질을 10분의 빠른 분석 시간 내 정량할 수 있음을 증명하였다. 이 정량 가능한 마커 중 분석적 성능 평가까지 통과한 최종 9개 마커를 유방암 선별 마커로 선정하였다. 또한, 알고리즘 공식을 개발 및 검증하여 AUC 기준으로 0.9 이상의 높은 정확도를 보여 임상에 직접 적용할 수 있을 정도의 정확도를 가짐을 확인하였다. 나아가, PepQuant 라이브러리는 유방암 마커뿐만 아니라 다른 유형의 암 및 기타 질병 마커 선택에도 적용할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (26)

  1. APOC1(Apolipoprotein C1), CHL1(Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9(Matrix metalloproteinase-9), PRDX6(Peroxiredoxin-6), PRG4(Proteoglycan 4), PPBP(Platelet basic protein), FN1(Fibronectin), VWF(von Willebrand factor) 및 CLU(Clusterin)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이들의 일부 절편; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 진단용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 APOC1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 1(TPDVSSALDK)의 아미노산 서열을 가지며;
    상기 CHL1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 2(VIAVNEVGR)의 아미노산 서열을 가지고;
    상기 MMP9 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 3(AVIDDAFAR)의 아미노산 서열을 가지며;
    상기 PRDX6 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 4(LSILYPATTGR)의 아미노산 서열을 가지고;
    상기 PRG4 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 5(AIGPSQTHTIR)의 아미노산 서열을 가지며;
    상기 PPBP 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 6(TTSGIHPK)의 아미노산 서열을 가지고;
    상기 FN1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 7(STTPDITGYR)의 아미노산 서열을 가지며;
    상기 VWF 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 8(ILAGPAGDSNVVK)의 아미노산 서열을 가지고;
    상기 CLU 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 9(TLLSNLEEAK)의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩타이드 또는 이의 일부 절편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 또는 이의 일부 절편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 포함하는 진단용 키트.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
  8. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, APOC1(Apolipoprotein C1), CHL1(Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9(Matrix metalloproteinase-9), PRDX6(Peroxiredoxin-6), PRG4(Proteoglycan 4), PPBP(Platelet basic protein), FN1(Fibronectin), VWF(von Willebrand factor) 및 CLU(Clusterin)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이들의 일부 절편; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 APOC1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 1(TPDVSSALDK)의 아미노산 서열을 가지며;
    상기 CHL1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 2(VIAVNEVGR)의 아미노산 서열을 가지고;
    상기 MMP9 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 3(AVIDDAFAR)의 아미노산 서열을 가지며;
    상기 PRDX6 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 4(LSILYPATTGR)의 아미노산 서열을 가지고;
    상기 PRG4 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 5(AIGPSQTHTIR)의 아미노산 서열을 가지며;
    상기 PPBP 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 6(TTSGIHPK)의 아미노산 서열을 가지고;
    상기 FN1 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 7(STTPDITGYR)의 아미노산 서열을 가지며;
    상기 VWF 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 8(ILAGPAGDSNVVK)의 아미노산 서열을 가지고;
    상기 CLU 폴리펩타이드의 일부 절편은 서열번호 9(TLLSNLEEAK)의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액 (mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침 (saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제 8 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 9 항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1032.5280 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이고;
    서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 966.5524 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이며;
    서열번호 3로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 977.5051 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이고;
    서열번호 4로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1191.6732 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이며;
    서열번호 5로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1180.6433 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이고;
    서열번호 6로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 840.4574 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이며;
    서열번호 7로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1110.5426 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이고;
    서열번호 8로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1240.6896 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값이며;
    서열번호 9로 표시되는 폴리펩타이드의 질량 대 전하비(m/z)는, z값이 1일 때 1117.6099 또는 이 값의 ±1 범위 내의 값인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 다중 반응 모니터링 수행 시 내부 표준 물질로써 상기 각각의 폴리펩타이드를 구성하는 특정 아미노산의 특정 원소를 동위원소로 치환한 합성 펩타이드; 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 합성 펩타이드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9로 표시되는 서열과 동일 서열을 가지며 안정 동위원소(stable isotope)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 안정 동위원소는 탄소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 원소의 안정 동위원소인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 8 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 8 항에 있어서,
    상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 CHL1(Neural cell adhesion molecule L1 like), MMP9(Matrix metalloproteinase-9), PRG4(Proteoglycan 4), PPBP(Platelet basic protein), FN1(Fibronectin), VWF(von Willebrand factor) 또는 CLU(Clusterin) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가하고;
    APOC1(Apolipoprotein C1) 또는 PRDX6(Peroxiredoxin-6) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 감소한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 8 항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체의 항암제에 대한 반응성을 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 다음의 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법:
    (a) 서열번호 1(TPDVSSALDK), 서열번호 2(VIAVNEVGR), 서열번호 3(AVIDDAFAR), 서열번호 4(LSILYPATTGR), 서열번호 5(AIGPSQTHTIR), 서열번호 6(TTSGIHPK), 서열번호 7(STTPDITGYR), 서열번호 8(ILAGPAGDSNVVK) 및 서열번호 9(TLLSNLEEAK)로 표시되는 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드, 이들을 인코딩하는 유전자 또는 이들을 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 생물학적 시료 내 서열번호 1(TPDVSSALDK), 서열번호 2(VIAVNEVGR), 서열번호 3(AVIDDAFAR), 서열번호 4(LSILYPATTGR), 서열번호 5(AIGPSQTHTIR), 서열번호 6(TTSGIHPK), 서열번호 7(STTPDITGYR), 서열번호 8(ILAGPAGDSNVVK) 및 서열번호 9(TLLSNLEEAK)로 표시되는 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계;
    상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9 폴리펩타이드, 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 감소하고;
    서열번호 1 또는 서열번호 4 폴리펩타이드, 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 후보물질은 암의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.
  22. 유방암의 진단 시스템으로서,
    입력값을 입력받는 입력부;
    유방암의 발병 여부를 판독하도록 사전 학습된 기계학습 모델을 포함하는 판독부; 및
    유방암의 발병 여부를 출력하는 출력부를 포함하고;
    상기 입력값은 생물학적 시료 내의 서열번호 1(TPDVSSALDK), 서열번호 2(VIAVNEVGR), 서열번호 3(AVIDDAFAR), 서열번호 4(LSILYPATTGR), 서열번호 5(AIGPSQTHTIR), 서열번호 6(TTSGIHPK), 서열번호 7(STTPDITGYR), 서열번호 8(ILAGPAGDSNVVK) 및 서열번호 9(TLLSNLEEAK)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현 수준의 측정값인 것을 특징으로 하는 시스템.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 기계학습 모델은 딥러닝(Deep Learning) 모델인 것을 특징으로 하는 시스템.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 시스템.
  25. 제 22항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 발현 수준의 측정값은 질량분석(Mass Spectrometry)에 따른 정량값인 것을 특징으로 하는 시스템.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 질량분석은 액체 크로마토그래피-다중 질량 분석(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS)인 것을 특징으로 하는 시스템.
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