JPH0954089A - 微量ヘモグロビン▲Ａ１ｃ▼測定用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】 以下のｉからｉｖの構成すなわち ｉ）溶血剤，変性剤，微粒子を塗布した溶血層 ｉｉ）抗ＨｂＡ_１ｃ抗体と抗ＩｇＧ抗体とを含む凝集層 ｉｉｉ）凝集した微粒子を捕捉する機能を有する測定層 ｉｖ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層と、以下のｉ
からｖｉｉの構成すなわち ｖ）溶血剤を塗布した溶血層 ｖｉ）ＨｂＡを捕捉する機能を有する測定層 ｖｉｉ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層とが、一個の
支持体上に並べて設置してあり、ｉからｉｖまでの間並
びにｖからｖｉｉまでの間を液体が移動しうることを特
徴とする、微量なヘモグロビンＡ_１ｃ測定用試験片 【効果】 大型の分析装置を用いず、しかも前処理を要
せずに患者自身が在宅でも簡単な操作でヘモグロビンＡ
_１ｃを測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、検体となる血中のヘモ
グロビンＡ（ＨｂＡと略する）と、そのグリコヘモグロ
ビンであるヘモグロビンＡ_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃと略する）
とを同時に簡易測定するための乾式の試験片に関する。
特に、検体中にＨｂＡ_１ｃが非常に少ない場合に有用な
試験片に関する。

【０００２】

【従来の技術】血中のヘモグロビンに糖が結合（グリコ
シル化）したグリコヘモグロビンは、その濃度が過去１
〜２ケ月間の平均的な血中糖濃度を反映するため、糖尿
病の診断あるいは糖尿病の経過観察に適した指標として
広く利用されている。

【０００３】グリコヘモグロビンを測定する場合には、
全体のヘモグロビン量を対照とした際のグリコヘモグロ
ビン量の比率で示される。ヘモグロビンの種類（ヘモグ
ロビンＡ，Ｓ，ＣおよびＥ）のうち、ヘモグロビンＡ
（ＨｂＡ）中の特定のグリコシル化ヘモグロビンであ
る、ヘモグロビンＡ_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃ）の割合を指標と
して用いることが臨床的に一般化されており、ＨｂＡ全
体に対するＨｂＡ_１ｃの比率で示すと、通常約４〜６％
がその目安とされている。

【０００４】このグリコヘモグロビンの測定法として
は、電気泳動法，イオン交換クロマトグラフィー法，ボ
ロン酸アフィニティクロマトグラフィー法，イムノアッ
セイ法などが知られているが、中でも所要時間や分離性
などの点からイオン交換クロマトグラフィー法が主流と
なっている。しかし、最近では特異性の高い『抗体』を
用いたイムノアッセイ法でも測定されるようになってき
た。

【０００５】従来のグリコヘモグロビンのイオン交換ク
ロマトグラフィー法およびイムノアッセイ法では、比較
的大型の分析装置を必要とし、大きな病院の検査室や検
査センターで測定が行なわれている。

【０００６】イムノアッセイ法は、使用する抗体の特異
性が高いため、イオン交換クロマトグラフィー法におい
て問題とされる不安定型グリコヘモグロビン，カルバミ
ル化ヘモグロビン，アセトアルデヒド化ヘモグロビン，
およびアセチル化ヘモグロビンなどの影響を受けず、迅
速かつ検体処理能力が高い長所がある。

【０００７】しかし、グリコヘモグロビンに対する特異
抗体は、ヘモグロビンとの化学構造の相違する部位（つ
まりヘモグロビンに糖の結合した部分）をエピトープと
している上に、ＨｂＡ_１ｃの場合は特にそのその部位が
十分に露出していないため、イムノアッセイ法を行う
際、多くの場合その部位を露出させるための溶血および
／又は変性操作が必要である。

【０００８】イムノアッセイ法を応用したもので、血中
ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ、Ｓ、ＣおよびＥ）を目
視により判定する使い捨てタイプの乾式検査具（Ｓｃｒ
ｅｅｎｉｎｇ３，６７〜７６，１９９４）も知られてい
る。この乾式検査具は患者自身でも測定することが可能
であるが、前処理として溶血操作を必要とし、ＨｂＡ
_１ｃ等のグリコヘモグロビンの測定用ではない。前処理
を患者自身が行う場合、操作の煩雑さの他に汚染も問題
である。

【０００９】ＨｂＡ_１ｃ等を測ることができ、かつ検体
を前処理せずに測定可能な乾式試験片が開発されればそ
のメリットは極めて大きいわけであるが、現在まだ知ら
れていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、溶血
および／又は変性の前処理操作を必要とせず、大型の分
析装置を使わずに小型機器を用いて、検体数の少ない中
小の病院や開業医、又は患者自身でも簡単な操作でＨｂ
ＡとＨｂＡ_１ｃとを同時に直接測定できる乾式試験片を
提供することを目的とする。また、検体中にＨｂＡ_１ｃ
が特に少ない場合でも良好に測定できる乾式試験片を提
供することも目的とする。

【００１１】上記目的は、以下の構成すなわち ｉ）溶血剤，変性剤，微粒子を塗布した溶血層 ｉｉ）抗ＨｂＡ_１ｃ抗体と抗ＩｇＧ抗体とを含む凝集層 ｉｉｉ）凝集した微粒子を捕捉する機能を有する測定層 ｉｖ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層と、以下のｉ
からｖｉｉの構成すなわち ｖ）溶血剤を塗布した溶血層 ｖｉ）ＨｂＡを捕捉する機能を有する測定層 ｖｉｉ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層とが、一個の
支持体上に並べて設置してあり、ｉからｉｖまでの間お
よびｖからｖｉｉまでの間を液体が移動しうる試験片で
解決できる。

【００１２】また、上記目的は、以下の構成すなわち ｉ）溶血剤，変性剤，微粒子を塗布した溶血層 ｉｉ）ＨｂＡ_１ｃ抗体と抗ＩｇＧ抗体とを含む凝集層 ｉｉｉ）凝集した微粒子を捕捉する機能を有する第一の
測定層 ｉｖ）凝集していない微粒子を捕捉する機能を有する第
二の測定層 ｖ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層からなり、ｉ
からｖまでの間を液体が移動しうる乾式試験片でもまた
解決できる。

【００１３】全血検体を溶血層へ点着し、展開液等で展
開させた後、測定層において光学的に測定してＨｂＡと
ＨｂＡ_１ｃの量を同時に求め、それぞれの値を用いてＨ
ｂＡに対するＨｂＡ_１ｃの比率を算出することができ
る。本発明の試験片で測定する際の血液検体としては、
全血は勿論のこと、分離された赤血球も使用できる。

【００１４】検体中にＨｂＡ_１ｃが微量しか含まれずと
も、凝集層に抗ＩｇＧ抗体をさらに含ませることにより
感度を上げることができる。詳細は後述する。

【００１５】免疫凝集反応は、市販の着色ビーズを使用
するので、色素等で抗体を標識する必要がない。目的物
質を標識しないので、標識化による抗体の変性の危険性
もない。このとき、溶血層における微粒子は、ヘモグロ
ビンと光学的に区別して検出しうる色に着色されている
と、検出時に都合がよい。

【００１６】測定層での凝集微粒子の捕捉の方法は、濾
過することで捕捉することが一般的であるが、抗体やイ
オン交換樹脂を使用する方法も使用できる。

【００１７】

【発明の実施の形態】図１は、本発明による試験片の一
つの態様の平面図と側面図である。これを試験具Ａとす
る。

【００１８】支持体１の上に、展開可能な材質からなる
２つの展開膜２および３が装着されている。本発明で
は、液を通すことの出来る材質を「展開膜」と呼び、そ
の展開膜へ溶血層や凝集層などの構成層を設けたものを
「展開層」と呼ぶことにする。一方の展開膜２には順
次、展開開始点Ｐと，溶血剤を塗布した溶血層４と，抗
ＨｂＡ抗体またはイオン交換物質を固定化した測定層５
と，展開残液を吸収させる吸収剤からなる吸収層６とが
設けられている。他方の展開膜３には順次，展開開始点
Ｐ’と，溶血剤と変性剤と微粒子を塗布した溶血層７
と，抗ＨｂＡ_１ｃ抗体と抗ＩｇＧ抗体を塗布した凝集層
８と，凝集微粒子のみを捕捉しうる測定層９と，展開残
液を吸収させる吸収剤からなる吸収層１０とが設けられ
ている。

【００１９】使用する際には、まず試験片Ａの溶血層４
と溶血層７へ血液検体を同量づつ点着することにより始
まる。溶血層４において血液が溶血され、次いで展開液
を展開開始点Ｐに加えてＨｂを展開させる。展開された
ＨｂＡ（ＨｂＡ_１ｃを含んでいる）は測定層５に固定化
されている抗ＨｂＡ抗体又はイオン交換物質に捕捉さ
れ、展開残液は吸収層６に吸収される。一方、溶血層７
において血液は溶血と同時に変性され、ＨｂＡ_１ｃを含
むＨｂＡは微粒子に吸着される。引き続き展開液を展開
開始点Ｐ’に加えると、その微粒子は展開され、微粒子
は凝集層８に塗布されている抗ＨｂＡ_１ｃ抗体と反応し
て凝集し、凝集した微粒子は測定層９に捕捉され、凝集
していない微粒子を含む展開残液は吸収層１０に吸収さ
れる。測定層５に捕捉されたＨｂＡの着色度と、測定層
９に捕捉された微粒子自身（ＨｂＡ_１ｃに相当）の着色
度とを光学的方法によって測定する。その結果からそれ
ぞれＨｂＡおよびＨｂＡ_１ｃ量を求めた後、ＨｂＡに対
するＨｂＡ_１ｃの比率を算出する。

【００２０】ここで、もしも検体中のＨｂＡ_１ｃが非常
に微量だと、その少なさのために１個の微粒子へ吸着す
るＨｂＡ_１ｃがたったの１個という可能性も生じる。１
個の微粒子へ多数のＨｂＡ_１ｃが吸着するからこそ、抗
ＨｂＡ_１ｃ抗体を介して凝集反応が起こるので、これで
は抗体を介してそれらの微粒子が凝集できない。そこ
で、その状態でも凝集を行うために、抗ＨｂＡ_１ｃ抗体
を作製した動物のＩｇＧに対する抗体を使用して、「抗
体どうし」を連結し、微粒子どうしを繋ぐ。

【００２１】ここで、各構成の材質としてはいずれも公
知の物質でよいが、具体的には次のようなものである。

【００２２】支持体は、光透過性でも光非透過性でも良
いが、展開終了後の測定を支持体下部から行うのである
ならば、透明なもの、たとえばポリエチレンテレフタレ
ートなどが望ましい。 その他の例；ポリスチレン、ポリエステル、酢酸セルロ
ースなど

【００２３】液をクロマトさせる、展開層全体を形成し
ている展開膜の材質は、液を通しやすいマトリックス状
物質が望ましい。例えば、濾紙といったセルロース、酢
酸セルロース、ニトロセルロース、ガラスファイバーな
どがある。

【００２４】吸収剤の条件としては、展開残液を吸収す
るのに十分な細孔容積を有するマトリクッス的な物質
か、乾燥ゲルといった吸水性に優れた物質が好ましい。 例：セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリル酸、ポ
リビニールアルコールなど

【００２５】凝集した微粒子を捕捉するための測定層
は、濾過剤を用いて濾過することで捕捉することが一般
的であるが、抗体やイオン交換樹脂を使用する方法もあ
る。濾過剤を用いる際の材質の例としては、ポリテトラ
フルオロエチレン、ポリスルオン、ポリプロピレン、ポ
リビニリデンジフロライド、セルロース混合エステルな
どがある。

【００２６】目的物質を吸着させるための微粒子は、免
疫凝集反応で使用される、市販の着色ラテックスや、着
色または無着色金属コロイド（金、銀、銅）など（着色
の場合は、へモグロビンの色と光学的に区別して測定で
きるものが好ましい）が使用できる。

【００２７】支持体上へ展開膜を配置する方法として
は、細長くテープ状に加工した展開膜を両面テープや接
着剤やホットメルトを用いて物理的に固定する。テープ
状に加工する際の幅・長さは、クロマトグラフィー技術
に準ずる。

【００２８】溶血剤としてはサポニンが有力であるが、
さらに界面活性剤も使用でき、その種類としては、ポリ
ソルベート、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチ
ルエーテルなどが挙げられる。その中でも溶血能の点か
ら、トリトンＸ−１００が市販品として特に望ましい。

【００２９】溶血層に塗布される変性剤は、ＨｂＡ_１ｃ
を変性させてＨｂＡとの化学構造の相違する部位（つま
り糖結合部分）を露出させ、抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が免疫的
に認識し易くする役割を有する。チオシアン酸塩のよう
な酸や、プロテアーゼのような加水分解酵素が好ましい
が、環境を単に酸性にするのみでも良い。

【００３０】展開に用いる展開液としては、通常のイム
ノアッセイ法に使用されるような、少量の蛋白質、塩、
界面活性剤などを含む緩衝液が望ましく、一例として
は、０．１％ウシ血清アルブミンと、０．０１％トリト
ンＸ−１００と、０．９％塩化ナトリウムとを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液が挙げられる。展開層に各層を設ける
ために、展開膜へ各種試薬を含浸・塗布または結合させ
る。手法としては当業者間で公知の方法で良く、施すべ
き物質を１種以上の溶液に溶かし込み、塗り付けること
で含浸したり、インクジェットプリンターで噴霧した
り、化学的に結合する（「酵素免疫測定法」医学書院、
１９８７）ことがされる。いずれにしても、最終的には
乾燥させる。

【００３１】凝集層に塗布された抗ＨｂＡ_１ｃ抗体と、
測定層に固定化された抗ＨｂＡ抗体は、ポリクローナル
抗体かモノクローナル抗体のいずれも使用できる。抗Ｉ
ｇＧ抗体は、抗ＨｂＡ_１ｃ抗体を作製した動物のＩｇＧ
に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体
が使用できる。

【００３２】ＨｂＡを測定する方の展開膜の測定層に固
定化されたイオン交換物質は、ジエチルアミノエチルセ
ルロースやカルボキシメチルセルロースなどが使用でき
る。

【００３３】図２は、本発明による試験片のもう一つの
態様の平面図である。これを試験具Ｂとする。

【００３４】支持体２１の上に、液を展開可能な材質で
できた展開膜２２を装着し、展開膜２２に順次、溶血剤
・微粒子および変性剤を塗布した溶血層２３と、抗Ｈｂ
Ａ_１ｃ抗体と抗ＩｇＧ抗体を塗布した凝集層２４と、凝
集微粒子を捕捉できる孔径を有する濾過剤でできた測定
層２５と、凝集しない微粒子を捕捉する濾過剤でできた
測定層２６と、展開残液を吸収する吸収剤からなる吸収
層２７とが設けてある。

【００３５】試験片Ｂの溶血層２３に血液検体を点着す
ると、検体は溶血および変性され、ＨｂＡ_１ｃを含むＨ
ｂＡは微粒子に吸着される。次いで展開液を展開開始点
Ｐに加えると、その微粒子は凝集層２４に塗布されてい
る抗ＨｂＡ_１ｃ抗体と免疫反応して凝集する。つまりそ
の凝集塊は、ＨｂＡのうち、ＨｂＡ_１ｃのみが原因で凝
集している。続いて凝集した微粒子（ＨｂＡ_１ｃ由来）
は孔径の大きい濾過膜である測定層２５に捕捉され、一
方凝集していない微粒子（ＨｂＡ由来）は孔径の小さい
濾過膜である測定層２６に捕捉され、その他の展開残液
は吸収層２７に吸収される。測定層２５および２６中の
ＨｂＡの着色度と、測定層２５に捕捉された微粒子自身
の着色度（ＨｂＡ_１ｃ量に相当）とを光学的に測定し、
その結果からそれぞれＨｂＡおよびＨｂＡ_１ｃを求めた
後、ＨｂＡに対するＨｂＡ_１ｃの比率を算出する。試験
片Ｂは試験片Ａと同様に、検体中にＨｂＡ_１ｃが非常に
少なくとも、抗ＩｇＧ抗体を使用して「抗体どうし」を
繋ぐことにより測定が可能である。また、各構成の材料
は、試験片Ａと同様である。

【００３６】図３は、本発明による試験片のもう一つの
態様の平面図である。これを試験片Ｃとする。

【００３７】支持体３１の上に液を展開可能な材質でで
きた展開層３２を装着し、展開層３２に順次、溶血剤・
微粒子および変性剤を塗布した溶血層３３と、抗ＨｂＡ
_１ｃ抗体と抗ＩｇＧ抗体を塗布した凝集層３４と、凝集
微粒子のみを捕捉しうる濾過膜でできた測定層３５と、
展開残液を吸収させる吸収剤からなる吸収層３６とを設
けてある。これは第２図の試験片Ｂのうち、凝集しない
微粒子を捕捉する濾過剤でできた測定層２６と、展開残
液を吸収する吸収剤からなる吸収層２７とを一つにまと
めた、試験片Ｂの別態様というべきものである。使用方
法は試験片Ｂと同じで、特定物質ＨｂＡ_１ｃが関与する
微粒子は凝集して測定層３５に捕捉され、凝集していな
い微粒子を含む展開残液は吸収層３６に吸収される。そ
の後、測定層３５と吸収層３６中のＨｂＡ_１ｃを含むＨ
ｂＡの着色度と、測定層３５に捕捉された微粒子の着色
度を光学的方法により分別測定し、その結果からＨｂＡ
およびＨｂＡ_１ｃを求めた後、ＨｂＡに対するＨｂＡ
_１ｃの比率を算出する。試験片Ａと同様に、検体中にＨ
ｂＡ_１ｃが非常に少なくとも、抗ＩｇＧ抗体を使用して
「抗体どうし」を繋ぐことにより測定が可能である。ま
た、各構成の材料は、試験片Ｂと同様である。

【００３８】

【発明の効果】本発明による乾式の試験片を用いると、
大型の分析装置を用いず、しかも前処理を要せずに患者
自身が在宅でも簡単な操作でＨｂＡとＨｂＡ_１ｃを同時
に測定できる。また、免疫凝集反応を利用し、市販の着
色ビーズを使用するので抗体を標識する必要もない。さ
らに、目的物質を標識しないので、標識化による抗体の
変性の危険性もない。また、検体中にＨｂＡ_１ｃが非常
に少なくとも凝集反応を起こすために、測定が可能であ
る。

【００３９】

【図面の簡単な説明】

【図１】は、本発明の試験片Ａの平面図と側面図であ
る。

【図２】は、本発明の試験片Ｂの平面図である。側面図
は図１と同じなので省略した。

【図３】は、図２の試験片の別態様（試験具Ｃ）の平面
図である。側面図は図１と同じなので省略した。

【符号の説明】

１，２１，３１ ： 支持体 ２，３，２２，３２ ： 展開層 ４，７，２３，３３ ： 溶血層 ８，２４，３４ ： 凝集層 ５，９，２５，２６，３５ ： 測定層 ６，１０，２７，３６ ： 吸収層 Ｐ，Ｐ’： 展開開始点

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】全血中のヘモグロビンＡ（ＨｂＡと略す
   る）量に対する微量なヘモグロビンＡ_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃ
   と略する）量を測定するための試験片であって、以下の
   ｉからｉｖの構成すなわち ｉ）溶血剤，変性剤，微粒子を塗布した溶血層 ｉｉ）抗ＨｂＡ_１ｃ抗体と抗ＩｇＧ抗体とを含む凝集層 ｉｉｉ）凝集した微粒子を捕捉する機能を有する測定層 ｉｖ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層と、以下のｉ
   からｖｉｉの構成すなわち ｖ）溶血剤を塗布した溶血層 ｖｉ）ＨｂＡを捕捉する機能を有する測定層 ｖｉｉ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層とが、一個の
   支持体上に並べて設置してあり、ｉからｉｖまでの間並
   びにｖからｖｉｉまでの間を液体が移動しうることを特
   徴とする、血液検体用試験片。
2. 【請求項２】溶血層における微粒子が、ヘモグロビンと
   光学的に区別して検出しうる色に着色されている、特許
   請求の範囲第１に記載の試験片。
3. 【請求項３】測定層での凝集微粒子の捕捉の方法が、濾
   過剤による濾過によるものである、特許請求の範囲第１
   又は２項に記載の試験片。
4. 【請求項４】血中のＨｂＡ_１ｃを測定するための試験片
   であって、以下のｉからｖの構成すなわち ｉ）溶血剤，変性剤，微粒子を塗布した溶血層 ｉｉ）ＨｂＡ_１ｃ抗体と抗ＩｇＧ抗体とを含む凝集層 ｉｉｉ）凝集した微粒子を捕捉する機能を有する第一の
   測定層 ｉｖ）凝集していない微粒子を捕捉する機能を有する第
   二の測定層 ｖ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層からなり、ｉ
   からｖまでの間を液体が移動しうることを特徴とする、
   血液検体用試験片。
5. 【請求項５】測定層での凝集微粒子の捕捉の方法は、孔
   径が異なる濾過剤による濾過によるものであり、第一の
   測定層の孔径が第二の測定層の孔径よりも大きい、特許
   請求の範囲第４項に記載の試験片。
6. 【請求項６】溶血層における微粒子が、ヘモグロビンと
   光学的に区別して検出しうる色に着色されている、特許
   請求の範囲第４又は５項に記載の試験片。
7. 【請求項７】ｉｖの第二の測定層がｖの吸収層を兼ねる
   ことにより、ｉｖの第二の測定層とｖの吸収層が一つに
   なっている、特許請求の範囲第４から６項のいずれかに
   記載の試験片。