JP3300612B2 - ヘモグロビンの影響回避方法 - Google Patents
ヘモグロビンの影響回避方法Info
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- JP3300612B2 JP3300612B2 JP23966696A JP23966696A JP3300612B2 JP 3300612 B2 JP3300612 B2 JP 3300612B2 JP 23966696 A JP23966696 A JP 23966696A JP 23966696 A JP23966696 A JP 23966696A JP 3300612 B2 JP3300612 B2 JP 3300612B2
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、呈色反応をレート
アッセイで光吸収測定を行う際の、ヘモグロビンの影響
を回避する方法に関する。
アッセイで光吸収測定を行う際の、ヘモグロビンの影響
を回避する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床試験などで行われる生化学的分析・
生化学的測定において、液系試薬を用いる方法と、乾式
試薬（乾式分析要素と呼称される）を用いる方法があ
る。これら両者とも、検出や定量には光の反射率などを
用いて、反応系の呈色を観察する。特に、乾式分析要素
を用いた光吸収測定における一般的な分析方法の一つと
して、レートアッセイ（二点以上の変化量を測定し、反
応速度から濃度等を求める方法）がある。
生化学的測定において、液系試薬を用いる方法と、乾式
試薬（乾式分析要素と呼称される）を用いる方法があ
る。これら両者とも、検出や定量には光の反射率などを
用いて、反応系の呈色を観察する。特に、乾式分析要素
を用いた光吸収測定における一般的な分析方法の一つと
して、レートアッセイ（二点以上の変化量を測定し、反
応速度から濃度等を求める方法）がある。
【０００３】そこでは全血から血球を分離除去して血漿
・血清を検体として用いるが、分離前から溶血している
検体や、分離時に赤血球が溶血を起こした検体を使用す
る場合、血液中のヘモグロビンが血漿・血清中へ混入す
ることがある。すると、目的成分のデータにヘモグロビ
ンのデータが重なってしまう（所謂『かぶり』）。しか
もヘモグロビンの吸収波長は経時的に変化するためにヘ
モグロビンのデータを単純に差し引くことも出来ず、得
られるデータは実際のものとは大きく異なってしまう。
・血清を検体として用いるが、分離前から溶血している
検体や、分離時に赤血球が溶血を起こした検体を使用す
る場合、血液中のヘモグロビンが血漿・血清中へ混入す
ることがある。すると、目的成分のデータにヘモグロビ
ンのデータが重なってしまう（所謂『かぶり』）。しか
もヘモグロビンの吸収波長は経時的に変化するためにヘ
モグロビンのデータを単純に差し引くことも出来ず、得
られるデータは実際のものとは大きく異なってしまう。
【０００４】そのため、ヘモグロビンの吸収の経時変化
を回避することが必要である。影響回避の方法として、
検体盲検（ブランク）を測定する方法や、ヘモグロビン
を物理的・化学的に変性させて経時変化を止める方法
（特公平３−５８４６７号）や、測光時にヘモグロビン
の吸収波長の変化が少ない６５０ｎｍ以上の波長で測定
する方法（特開昭６２−２０９３６０号）等が考案され
ている。
を回避することが必要である。影響回避の方法として、
検体盲検（ブランク）を測定する方法や、ヘモグロビン
を物理的・化学的に変性させて経時変化を止める方法
（特公平３−５８４６７号）や、測光時にヘモグロビン
の吸収波長の変化が少ない６５０ｎｍ以上の波長で測定
する方法（特開昭６２−２０９３６０号）等が考案され
ている。
【０００５】これらの方法のうち、盲検を測定する方法
は二度手間で面倒であり、特に乾式分析要素においては
使用する全ての試薬類が一体型になっているために盲検
測定は困難である。また、ヘモグロビンを変性させる方
法は操作が煩雑の上、分析の目的成分（例えば酵素な
ど）をも変性させる危険性があり、手軽さ・簡便さが売
り物の乾式分析要素には向かない。
は二度手間で面倒であり、特に乾式分析要素においては
使用する全ての試薬類が一体型になっているために盲検
測定は困難である。また、ヘモグロビンを変性させる方
法は操作が煩雑の上、分析の目的成分（例えば酵素な
ど）をも変性させる危険性があり、手軽さ・簡便さが売
り物の乾式分析要素には向かない。
【０００６】測光時に、ヘモグロビンの吸収が少ない６
５０ｎｍ以上の波長で測定する方法は、液系試薬を用い
た場合では有効である。というのは、６５０ｎｍ以上に
も僅かにヘモグロビンの吸収が存在するものの、液系の
様に検体が大幅に希釈されていると、ヘモグロビンの吸
収の少ない波長（例えば６８０ｎｍ）で測定すればヘモ
グロビンの被りは問題にならないからである。しかし一
方、乾式分析要素の様に検体が希釈されずに分析に用い
られると、ヘモグロビンの６００ｎｍ以上の小さな吸収
波長でもその吸収波長は測定値に重大な影響を与え、大
きな問題となる。
５０ｎｍ以上の波長で測定する方法は、液系試薬を用い
た場合では有効である。というのは、６５０ｎｍ以上に
も僅かにヘモグロビンの吸収が存在するものの、液系の
様に検体が大幅に希釈されていると、ヘモグロビンの吸
収の少ない波長（例えば６８０ｎｍ）で測定すればヘモ
グロビンの被りは問題にならないからである。しかし一
方、乾式分析要素の様に検体が希釈されずに分析に用い
られると、ヘモグロビンの６００ｎｍ以上の小さな吸収
波長でもその吸収波長は測定値に重大な影響を与え、大
きな問題となる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
の様な問題点を有さない、ヘモグロビンの吸収波長の経
時変化に左右されない、新規な影響回避方法を得ること
にある。
の様な問題点を有さない、ヘモグロビンの吸収波長の経
時変化に左右されない、新規な影響回避方法を得ること
にある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記課題を解決すべく鋭
意研究に取り組んだ結果、光吸収測定を行う際にヘモグ
ロビンの吸収波長の経時変化を回避するためには、測定
波長を５１７ｎｍ〜５２９ｎｍか、又は、５８０ｎｍ〜
５９２ｎｍに設定すればよいことを発見した。さらに好
ましくは、測定波長を５２０ｎｍ〜５２６ｎｍか、又
は、５８３ｎｍ〜５８９ｎｍに設定する。
意研究に取り組んだ結果、光吸収測定を行う際にヘモグ
ロビンの吸収波長の経時変化を回避するためには、測定
波長を５１７ｎｍ〜５２９ｎｍか、又は、５８０ｎｍ〜
５９２ｎｍに設定すればよいことを発見した。さらに好
ましくは、測定波長を５２０ｎｍ〜５２６ｎｍか、又
は、５８３ｎｍ〜５８９ｎｍに設定する。
【０００９】本発明は、乾式分析要素において特に有用
であることは勿論のこと、液系でも十分に威力を発揮す
ることは明らかである。また、混入したヘモグロビンの
吸収波長の「経時変化」を回避することができるので、
乾式分析要素で多用されている、『二点以上の変化量
（反応速度）を測定する方法』すなわちレートアッセイ
を使用する系で特に有効である。測定系としては、可視
系発色剤であれば酸化系発色剤でも還元系発色剤のいず
れでも使用できる。
であることは勿論のこと、液系でも十分に威力を発揮す
ることは明らかである。また、混入したヘモグロビンの
吸収波長の「経時変化」を回避することができるので、
乾式分析要素で多用されている、『二点以上の変化量
（反応速度）を測定する方法』すなわちレートアッセイ
を使用する系で特に有効である。測定系としては、可視
系発色剤であれば酸化系発色剤でも還元系発色剤のいず
れでも使用できる。
【００１０】図１はヘモグロビンの吸収波長を示してい
る（縦軸；吸光度（ＯＤ）、横軸；波長（ｎｍ））。図
の様に、６００ｎｍ以上の波長では吸収が少なく、ここ
で測定を行えば測定値に影響はないとされている。しか
し先述の様に、この吸収は経時変化を起こすので、乾式
では無視できない程の誤差になる。
る（縦軸；吸光度（ＯＤ）、横軸；波長（ｎｍ））。図
の様に、６００ｎｍ以上の波長では吸収が少なく、ここ
で測定を行えば測定値に影響はないとされている。しか
し先述の様に、この吸収は経時変化を起こすので、乾式
では無視できない程の誤差になる。
【００１１】その経時変化の様子を図２に示す。図２
は、ｐＨ１１の環境下でのヘモグロビンの吸収の変化を
示したものである（縦軸；吸光度（ＯＤ）、横軸；波長
（ｎｍ））。一本の線と隣の線との間は、１分間の間隔
を示す。図から判断できる様に、時間が経過するにつれ
て曲線はなだらかに（水平に近く）なる。従って、時間
経過に伴って着色度が増加してゆく反応試薬ならば、５
２０ｎｍ〜５９０ｎｍの波長域では測定値へ負の誤差を
与え、それ以外の可視部の波長では測定値へ正の誤差を
与える。また逆に、時間経過に伴って着色が減退してゆ
く反応試薬ならば、５２０ｎｍ〜５９０ｎｍの波長域で
は測定値へ正の誤差を与え、それ以外の可視部の波長で
は測定値へ負の誤差を与える。より温和な条件下であっ
ても、多かれ少なかれこの様な変化が生じ、測定値へ正
負の誤差を与えてしまい、特に乾式分析要素上ではその
影響が顕著である。本発明の原理は、その経時変化の起
こらない部分の波長で測定しようとするものである。
は、ｐＨ１１の環境下でのヘモグロビンの吸収の変化を
示したものである（縦軸；吸光度（ＯＤ）、横軸；波長
（ｎｍ））。一本の線と隣の線との間は、１分間の間隔
を示す。図から判断できる様に、時間が経過するにつれ
て曲線はなだらかに（水平に近く）なる。従って、時間
経過に伴って着色度が増加してゆく反応試薬ならば、５
２０ｎｍ〜５９０ｎｍの波長域では測定値へ負の誤差を
与え、それ以外の可視部の波長では測定値へ正の誤差を
与える。また逆に、時間経過に伴って着色が減退してゆ
く反応試薬ならば、５２０ｎｍ〜５９０ｎｍの波長域で
は測定値へ正の誤差を与え、それ以外の可視部の波長で
は測定値へ負の誤差を与える。より温和な条件下であっ
ても、多かれ少なかれこの様な変化が生じ、測定値へ正
負の誤差を与えてしまい、特に乾式分析要素上ではその
影響が顕著である。本発明の原理は、その経時変化の起
こらない部分の波長で測定しようとするものである。
【００１２】ヘモグロビンの吸収の経時変化が起こらな
い部分の波長は、５２０ｎｍ〜５２６ｎｍと５８３ｎｍ
〜５８９ｎｍの範囲内にある。測定時の温度などの条件
によってこの範囲は多少変動するが、臨床検査装置で一
般的とされる調節温度である２０度から４５度までで
は、上記変動は問題にならないほど小さい。
い部分の波長は、５２０ｎｍ〜５２６ｎｍと５８３ｎｍ
〜５８９ｎｍの範囲内にある。測定時の温度などの条件
によってこの範囲は多少変動するが、臨床検査装置で一
般的とされる調節温度である２０度から４５度までで
は、上記変動は問題にならないほど小さい。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下に本発明の方法による例を示
すが、本発明はこれらによって制限されるものではな
い。 ＧＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）
測定用乾式分析要素の例 〇試薬塗工液の調製 （処方） Ｌ−アラニン ０．９ｇ α−ケトグルタル酸 ０．１ｇ ピルビン酸オキシダーゼ ２０Ｋユニット リン酸 ０．０５ｇ ペルオキシダーゼ １０Ｋユニット ４−アミノ−アンチピリン ０．０５ｇ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキ シアニリン ０．０５ｇ アルギン酸ナトリウム ２．０ｇ 蒸留水 ８．０ｇ リン酸１カリウム ０．０４ｇ リン酸２ナトリウム ０．２４ｇ 上記成分を混合して試薬塗工液を調製し、この塗工液を
不透明ポリエチレンテレフタレートフィルム上へ濡れ厚
さ２００μｍでコーティングし、４０℃で３０分間乾燥
することにより、試薬層を得た。
すが、本発明はこれらによって制限されるものではな
い。 ＧＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）
測定用乾式分析要素の例 〇試薬塗工液の調製 （処方） Ｌ−アラニン ０．９ｇ α−ケトグルタル酸 ０．１ｇ ピルビン酸オキシダーゼ ２０Ｋユニット リン酸 ０．０５ｇ ペルオキシダーゼ １０Ｋユニット ４−アミノ−アンチピリン ０．０５ｇ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキ シアニリン ０．０５ｇ アルギン酸ナトリウム ２．０ｇ 蒸留水 ８．０ｇ リン酸１カリウム ０．０４ｇ リン酸２ナトリウム ０．２４ｇ 上記成分を混合して試薬塗工液を調製し、この塗工液を
不透明ポリエチレンテレフタレートフィルム上へ濡れ厚
さ２００μｍでコーティングし、４０℃で３０分間乾燥
することにより、試薬層を得た。
【００１４】○展開層の調製 （処方） トリトンＸ−１００ ０．１０ｇ 蒸留水 ９．９０ｇ 上記成分を混合したものを、厚さ０．２５ｍｍのポリエ
ステル製の布（ザヴィーナミニマックス；（株）鐘紡の
商標）に含浸して展開層を得た。
ステル製の布（ザヴィーナミニマックス；（株）鐘紡の
商標）に含浸して展開層を得た。
【００１５】○分析要素への加工 先の試薬層の上に展開層を濡れた状態でラミネートし、
４０℃で３０分間乾燥させた。得られた積層物を５ｍｍ
×７ｍｍにカットし、５ｍｍ×８０ｍｍの白色ポリエチ
レンテレフタレート片の先端に両面テープで固定し、分
析要素とした。
４０℃で３０分間乾燥させた。得られた積層物を５ｍｍ
×７ｍｍにカットし、５ｍｍ×８０ｍｍの白色ポリエチ
レンテレフタレート片の先端に両面テープで固定し、分
析要素とした。
【００１６】○測定 健常人から採取した全血を、故意に溶血させたものとさ
せないものに分け、それぞれ血清分離した。各々の血清
へＧＰＴを最終濃度３０ユニット／ｌになるように添加
し、そこから６μｌを分析要素へ適用し、３７℃でイン
キュベーションし、インキュベート開始後３分から４分
までの５７５，５８５，６１０ｎｍの各反射率をモニタ
ーすることにより、ヘモグロビンの測定値への影響を調
べた。ヘモグロビン濃度は、反射吸光度計（スポットケ
ム；（株）京都第一科学の商標）で測定・確認し、溶血
させたものは３００ｍｇ／ｄｌであった。反射率はクベ
ルカ−ムンク（Ｋｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ）の式に従っ
てＫ／Ｓ値に換算し、その差（ΔＫ／Ｓ値）を求めた。
結果を表１に示す。
せないものに分け、それぞれ血清分離した。各々の血清
へＧＰＴを最終濃度３０ユニット／ｌになるように添加
し、そこから６μｌを分析要素へ適用し、３７℃でイン
キュベーションし、インキュベート開始後３分から４分
までの５７５，５８５，６１０ｎｍの各反射率をモニタ
ーすることにより、ヘモグロビンの測定値への影響を調
べた。ヘモグロビン濃度は、反射吸光度計（スポットケ
ム；（株）京都第一科学の商標）で測定・確認し、溶血
させたものは３００ｍｇ／ｄｌであった。反射率はクベ
ルカ−ムンク（Ｋｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ）の式に従っ
てＫ／Ｓ値に換算し、その差（ΔＫ／Ｓ値）を求めた。
結果を表１に示す。
【００１７】 別の発色剤を使用したＧＰＴ測定用乾式分析要素 ○試薬塗工液の調製 （処方） Ｌ−アラニン ０．９ｇ α−ケトグルタル酸 ０．１ｇ ピルビン酸オキシダーゼ ２０Ｋユニット リン酸 ０．０５ｇ ペルオキシダーゼ １０Ｋユニット ４−アミノ−アンチピリン ０．０５ｇ Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン ０．０５ｇ アルギン酸ナトリウム ２．０ｇ 蒸留水 ８．０ｇ リン酸１カリウム ０．０４ｇ リン酸２ナトリウム ０．２４ｇ 上記成分を混合して試薬塗工液を調製し、この塗工液を
不透明ポリエチレンテレフタレートフィルム上へ濡れ厚
さ２００μｍでコーティングし、４０℃で３０分間乾燥
することにより、試薬層を得た。展開層の調製と、分析
要素への加工及び測定方法は、先の実施例と同じに行っ
た。結果を表２に示す。
不透明ポリエチレンテレフタレートフィルム上へ濡れ厚
さ２００μｍでコーティングし、４０℃で３０分間乾燥
することにより、試薬層を得た。展開層の調製と、分析
要素への加工及び測定方法は、先の実施例と同じに行っ
た。結果を表２に示す。
【００１８】○結果 表１と表２から判るように、測定波長を５２５ｎｍか５
８５ｎｍに設定することで誤差を０％にすることができ
た。
８５ｎｍに設定することで誤差を０％にすることができ
た。
【００１９】
【発明の効果】以上の様に、本発明による手法を用いれ
ば、盲検を行わないので二度手間はなく、ヘモグロビン
を変性させないので煩雑ではなく目的成分を変性させる
危険性もない。そして、６５０ｎｍ以上で測定する方法
よりも確実で、乾式分析要素の手軽さ・簡便性も損なわ
ない。
ば、盲検を行わないので二度手間はなく、ヘモグロビン
を変性させないので煩雑ではなく目的成分を変性させる
危険性もない。そして、６５０ｎｍ以上で測定する方法
よりも確実で、乾式分析要素の手軽さ・簡便性も損なわ
ない。
【００２０】
【図１】図１は、ヘモグロビンの吸収波長を示したもの
である。
である。
【図２】図２は、ヘモグロビンの吸収波長の経時変化を
示したものである。
示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−38947（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−503777（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−501797（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｌｙｔ ｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，８, 273−276 Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，26／２，227 −231 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/72 C12Q 1/00 G01N 21/78 G01N 33/52
Claims (4)
- 【請求項１】可視系発色剤を用いる反応系で、呈色反応
を光吸収を用いてレートアッセイで測定する際に、ヘモ
グロビンの吸収波長の経時変化を回避する方法であっ
て、測定波長を５１７ｎｍ〜５２９ｎｍか、又は、５８
０ｎｍ〜５９２ｎｍに設定することを特徴とする、ヘモ
グロビンの影響回避方法。 - 【請求項２】さらに好ましくは、測定波長を５２０ｎｍ
〜５２６ｎｍか、又は、５８３ｎｍ〜５８９ｎｍに設定
する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】乾式の分析要素で使用する、特許請求の範
囲第１または２項に記載の方法。 - 【請求項４】酵素活性を測定する際に用いられる、特許
請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23966696A JP3300612B2 (ja) | 1995-08-07 | 1996-08-07 | ヘモグロビンの影響回避方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-231909 | 1995-08-07 | ||
| JP23190995 | 1995-08-07 | ||
| JP23966696A JP3300612B2 (ja) | 1995-08-07 | 1996-08-07 | ヘモグロビンの影響回避方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09119932A JPH09119932A (ja) | 1997-05-06 |
| JP3300612B2 true JP3300612B2 (ja) | 2002-07-08 |
Family
ID=26530175
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23966696A Expired - Fee Related JP3300612B2 (ja) | 1995-08-07 | 1996-08-07 | ヘモグロビンの影響回避方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3300612B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4223163B2 (ja) * | 1999-10-25 | 2009-02-12 | パナソニック株式会社 | 免疫クロマトグラフィー試験片、及びクロマトグラフ分析方法 |
| JP5017612B2 (ja) * | 2006-09-15 | 2012-09-05 | 株式会社シノテスト | 生体試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬、ヘモグロビンの影響回避方法、並びにヘモグロビンの影響回避剤 |
| JP4889670B2 (ja) | 2008-03-26 | 2012-03-07 | 富士フイルム株式会社 | 溶血の影響を低減した体液成分測定用乾式分析素子 |
| KR101177353B1 (ko) * | 2010-10-08 | 2012-11-15 | 주식회사 메디센서 | 진단 장치 및 이를 이용한 진단 방법 |
-
1996
- 1996-08-07 JP JP23966696A patent/JP3300612B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２６／２，２２７−２３１ |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，８，２７３−２７６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09119932A (ja) | 1997-05-06 |
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