JPS58158199A - 血清アルカリ性ホスフアタ−ゼ活性測定方法 - Google Patents
血清アルカリ性ホスフアタ−ゼ活性測定方法Info
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- JPS58158199A JPS58158199A JP4239482A JP4239482A JPS58158199A JP S58158199 A JPS58158199 A JP S58158199A JP 4239482 A JP4239482 A JP 4239482A JP 4239482 A JP4239482 A JP 4239482A JP S58158199 A JPS58158199 A JP S58158199A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、血清アルカリ性ホスファターゼ活性の測定方
法に関し、特にチモールフタレインモノ燐酸を基質とし
て活性を測定する方法において、ジェタノーＭアミン・
塩酸緩衝液を使用することによシ測定の正確さと信頼性
を高めたものである。
法に関し、特にチモールフタレインモノ燐酸を基質とし
て活性を測定する方法において、ジェタノーＭアミン・
塩酸緩衝液を使用することによシ測定の正確さと信頼性
を高めたものである。
ア７レカリ性ホスファターゼは燐酸ニス’７−ルを加水
分解する酵素で、生体中では腎の近位尿細管、肝の毛細
胆管、乳腺、小腸繊毛、骨芽細胞、胎盤などに存在し、
その局在が細胞膜であることから、膜を通しての能動輸
送に関与しているとされる。
分解する酵素で、生体中では腎の近位尿細管、肝の毛細
胆管、乳腺、小腸繊毛、骨芽細胞、胎盤などに存在し、
その局在が細胞膜であることから、膜を通しての能動輸
送に関与しているとされる。
従って、血清アルカリ性ホスファターゼを測定すること
は、肝、胆道疾患、骨疾患、あるいは妊娠の経過観察な
どの鑑別診断に有用であり、今日では日常スクリーニン
グ検査として広く行なわれている。その測定方法は、ジ
ノワラ（Ｓｈ ｉ ｎｏｗａｒａ ）等の方法、ペツシ
イーロウリイ（Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ）法、および
カインドーキング（Ｋｉｎｄ−Ｋｉｎｇ）法などの報告
によシ基礎が確立し、更に基質として各種のモノ燐酸エ
ステルを用いた測定法が試みられ、例えばバブソン（Ｂ
ａｂｓｏｎ）等により提案されたフェノールフタレイン
モノ燐酸を基質として用する方法（Ａ、 Ｌ、 Ｂａｂ
ｓｏｎ、 Ｃ１１ｎ＊ Ｃｈｅｍ＊＊ １２ ｅ （８
）４８２（１９６６））等がある。しかし、これらの測
定法は、血清中の共存物質でおるヘモグロビン、ビリル
ビン、および混濁などの影響をうけ、正確な測定値が得
られない場合も少くない。
は、肝、胆道疾患、骨疾患、あるいは妊娠の経過観察な
どの鑑別診断に有用であり、今日では日常スクリーニン
グ検査として広く行なわれている。その測定方法は、ジ
ノワラ（Ｓｈ ｉ ｎｏｗａｒａ ）等の方法、ペツシ
イーロウリイ（Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ）法、および
カインドーキング（Ｋｉｎｄ−Ｋｉｎｇ）法などの報告
によシ基礎が確立し、更に基質として各種のモノ燐酸エ
ステルを用いた測定法が試みられ、例えばバブソン（Ｂ
ａｂｓｏｎ）等により提案されたフェノールフタレイン
モノ燐酸を基質として用する方法（Ａ、 Ｌ、 Ｂａｂ
ｓｏｎ、 Ｃ１１ｎ＊ Ｃｈｅｍ＊＊ １２ ｅ （８
）４８２（１９６６））等がある。しかし、これらの測
定法は、血清中の共存物質でおるヘモグロビン、ビリル
ビン、および混濁などの影響をうけ、正確な測定値が得
られない場合も少くない。
その後、これらの方法を改良した全く新しい測定法が提
案された（Ａ、 Ｖ、 Ｒｏｙ、 Ｃ１ｉｎｅ Ｃｈｅ
ｍ、 ＊１６、（５）４８１（１９７０））。その方法
（以下ロイの方法とｂう）は、基質としてチモールフタ
レインモノ燐酸を使用し、２−アミノ−２−メチル−１
−フ゛ロバノールを緩衝成分としだ、８７’Ｃ・１０分
間測定によるもので、従来法に比し座変が良く、前記の
ような血清中の共存物質の影響を殆んど受けずに測定す
ることが可能となった。しかしながら、その基質緩衝液
は、冷蔵・密栓保存すると、わずか１ｊ月でｐＨが０．
０５以上変化し、かつ測定における盲検値の上昇が著し
いなど、日常検査に適用するには安定性に乏しく、測定
の信頼性に欠けるという問題がある。
案された（Ａ、 Ｖ、 Ｒｏｙ、 Ｃ１ｉｎｅ Ｃｈｅ
ｍ、 ＊１６、（５）４８１（１９７０））。その方法
（以下ロイの方法とｂう）は、基質としてチモールフタ
レインモノ燐酸を使用し、２−アミノ−２−メチル−１
−フ゛ロバノールを緩衝成分としだ、８７’Ｃ・１０分
間測定によるもので、従来法に比し座変が良く、前記の
ような血清中の共存物質の影響を殆んど受けずに測定す
ることが可能となった。しかしながら、その基質緩衝液
は、冷蔵・密栓保存すると、わずか１ｊ月でｐＨが０．
０５以上変化し、かつ測定における盲検値の上昇が著し
いなど、日常検査に適用するには安定性に乏しく、測定
の信頼性に欠けるという問題がある。
本発明は、上記ロイの方法の欠点を解消したもノテ、緩
衝液として、２−了ミノー２−メチｚｕ−１−プロッタ
ノールに代え、ジェタノールアミンを使用することによ
シ、基質およびｐＨの安定性を高め、少くとも６ｊ月間
はアルヵり性ホスファターゼを正確に測定すること全可
能にしたものである。
衝液として、２−了ミノー２−メチｚｕ−１−プロッタ
ノールに代え、ジェタノールアミンを使用することによ
シ、基質およびｐＨの安定性を高め、少くとも６ｊ月間
はアルヵり性ホスファターゼを正確に測定すること全可
能にしたものである。
以下、本発明について詳しく説明する。
本発明によれば、基質としてチモールフタレインモノ燐
酸を含むジェタノールアミン・塩酸緩衝液を検体に加え
、遊離するチモールフタレインをアルカリ性で発色させ
、その吸光度を測定することにより、アルカリ性ホスフ
ァターゼ活性の正確な値が求められる。
酸を含むジェタノールアミン・塩酸緩衝液を検体に加え
、遊離するチモールフタレインをアルカリ性で発色させ
、その吸光度を測定することにより、アルカリ性ホスフ
ァターゼ活性の正確な値が求められる。
本発明測定法に使用される試薬は、チモールフタレイン
モノ燐酸を含む基質緩衝液と、反応を停止させ、かつ遊
離したチモールフタレインを発色させるためのアルカリ
性反応停止液、およびチモールフタレインを一定濃Ｉｆ
含有する標準液−とから成る。基質緩衝液は、ジェタノ
ールアミン・塩酸緩衝液に、チモールフタレインモノ燐
酸（溶解性の点より、ナトリウム塩、マグネシウム塩、
アンモニウム塩などが用いられる）、アルカリ性ホスフ
ァターゼの賦活剤（好ましくは、塩化マグネシウム□な
ど）、およびチモールフタレインの析出沈殿を防止する
ための界面活性剤（好ましくは、Ｂｒ１ｊ−３５など）
、更に必要なら防腐剤（例えば、アジ化ナトリウムなど
）を配合してなるもので、基質であるチモールフタレイ
ンモノｍａｏ濃度は０．１５〜０．２壬、液ｐＨは９７
５〜９．８５（８７’Ｃ）に調製されたものが好ましい
。反応停止液は、水酸化ナトリウムと炭酸ナトリウムを
含む水溶液であシ、その濃度はそれぞれ０．１ Ｍ程変
でもよいが、約０．５ Ｍ前後の高濃変に調節すること
によυ、反応停止後、未遊離のチモールフタレインモノ
燐酸に起因する黄色を退色させ、吸光度測定におりで遊
離したチモールフタレインの青色を正確に反映させるこ
とができる。標準液は、アルコール水溶液にチモールフ
タレインヲ界面活性剤（好ましくは、Ｂｒ１ｊ −３５
など）にて溶解したもので、チモールフタレイン濃度ハ
０．１〜０．２係が適当である。上記各試薬の好ましめ
組成例を示せば下記のくとくである。
モノ燐酸を含む基質緩衝液と、反応を停止させ、かつ遊
離したチモールフタレインを発色させるためのアルカリ
性反応停止液、およびチモールフタレインを一定濃Ｉｆ
含有する標準液−とから成る。基質緩衝液は、ジェタノ
ールアミン・塩酸緩衝液に、チモールフタレインモノ燐
酸（溶解性の点より、ナトリウム塩、マグネシウム塩、
アンモニウム塩などが用いられる）、アルカリ性ホスフ
ァターゼの賦活剤（好ましくは、塩化マグネシウム□な
ど）、およびチモールフタレインの析出沈殿を防止する
ための界面活性剤（好ましくは、Ｂｒ１ｊ−３５など）
、更に必要なら防腐剤（例えば、アジ化ナトリウムなど
）を配合してなるもので、基質であるチモールフタレイ
ンモノｍａｏ濃度は０．１５〜０．２壬、液ｐＨは９７
５〜９．８５（８７’Ｃ）に調製されたものが好ましい
。反応停止液は、水酸化ナトリウムと炭酸ナトリウムを
含む水溶液であシ、その濃度はそれぞれ０．１ Ｍ程変
でもよいが、約０．５ Ｍ前後の高濃変に調節すること
によυ、反応停止後、未遊離のチモールフタレインモノ
燐酸に起因する黄色を退色させ、吸光度測定におりで遊
離したチモールフタレインの青色を正確に反映させるこ
とができる。標準液は、アルコール水溶液にチモールフ
タレインヲ界面活性剤（好ましくは、Ｂｒ１ｊ −３５
など）にて溶解したもので、チモールフタレイン濃度ハ
０．１〜０．２係が適当である。上記各試薬の好ましめ
組成例を示せば下記のくとくである。
基質緩衝液：
チモールフタレインモノ燐酸ナトリウム・・・３ｍＭ
Ｂｒ ｉ ｊ −３５・−０，５（Ｗ／Ｖ ）％壇ｆヒ
マグネグウム ・・・１ｍＭアジ
ｆヒナトリウムー： ０． ｌ （Ｗ／Ｖ ） ４上記
を含む０．６ Ｍジェタノールアミン・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，８０±０．０５．液温８７’Ｃ。
マグネグウム ・・・１ｍＭアジ
ｆヒナトリウムー： ０． ｌ （Ｗ／Ｖ ） ４上記
を含む０．６ Ｍジェタノールアミン・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，８０±０．０５．液温８７’Ｃ。
反応停止液：
水酸化ナトリウム ・・・０．５Ｍ炭酸ナトリ
ウム ・・・０．５Ｍ標準液： チモールフタレイン ・・・３ｍＭＢｒ ｉ ｊ
−８５・・・１．５ （Ｗ／Ｖ ）４上記を含む６０
壬エタノール水溶液。
ウム ・・・０．５Ｍ標準液： チモールフタレイン ・・・３ｍＭＢｒ ｉ ｊ
−８５・・・１．５ （Ｗ／Ｖ ）４上記を含む６０
壬エタノール水溶液。
本発明に使用される各試薬の調製後の安定性を、ロイの
方法におけるそれと比較すれば、下記のように、両者の
反応停止液、標準液の室温での安定性はかわらないが、
基質緩衝液のｐＨおよび基質の安定性の点で本発明の方
がすぐれておシ、日常検査の観点から、本発明測定法の
信頼性が高いことがわかる。
方法におけるそれと比較すれば、下記のように、両者の
反応停止液、標準液の室温での安定性はかわらないが、
基質緩衝液のｐＨおよび基質の安定性の点で本発明の方
がすぐれておシ、日常検査の観点から、本発明測定法の
信頼性が高いことがわかる。
基質緩衝液（＠度２・〜−８°Ｃ保存）本発明：１２週
間ｐＨの変化なし、 ロイ ：８週間でｐＨ０，０５低下っ 反応停止液（密栓保存） 本発明：変質なし ロイ ：変質なし 標準液（密栓保存） 本発明：変質なし ロイ ：原液のみ不変（但し、２−アミノ−２−メチル
−１−プロパノ−ルー塩酸緩衝液で１００倍希釈した使
用液は長期保存でチモールフタレインが析出する）。
間ｐＨの変化なし、 ロイ ：８週間でｐＨ０，０５低下っ 反応停止液（密栓保存） 本発明：変質なし ロイ ：変質なし 標準液（密栓保存） 本発明：変質なし ロイ ：原液のみ不変（但し、２−アミノ−２−メチル
−１−プロパノ−ルー塩酸緩衝液で１００倍希釈した使
用液は長期保存でチモールフタレインが析出する）。
盲検のブランク値
本発明：６ケ月で１０幅上昇
ロイ 、：１ケ月で８０係１昇。
本発明測定法の実施例について説明すれば、まず小試験
管３本を用意し、それぞれ検体、標準、盲検とし、それ
ぞれに基質緩衝液０．５ ｍｌを加え、３７°Ｃで５分
間加温する。ついで各試験管に血清、標準液、精製水を
０．０５ ｍｌずつ加え混和して正確に１０分間反応さ
せる。その後、反応停止液をそれぞれ’５ｔｓｌずつ加
えよく混和し、３７’Ｃで１５分間加温すると、アルカ
′り性ホスファターゼによって遊離シたチモールフタレ
インが発色する。その発色はアルカリ性ホスファターゼ
活性と比例するから、盲検を対照として標準と検体の５
９０ ｎｍにおける吸光度を測定すれば１．下式によシ
検体の活性が求められる。
管３本を用意し、それぞれ検体、標準、盲検とし、それ
ぞれに基質緩衝液０．５ ｍｌを加え、３７°Ｃで５分
間加温する。ついで各試験管に血清、標準液、精製水を
０．０５ ｍｌずつ加え混和して正確に１０分間反応さ
せる。その後、反応停止液をそれぞれ’５ｔｓｌずつ加
えよく混和し、３７’Ｃで１５分間加温すると、アルカ
′り性ホスファターゼによって遊離シたチモールフタレ
インが発色する。その発色はアルカリ性ホスファターゼ
活性と比例するから、盲検を対照として標準と検体の５
９０ ｎｍにおける吸光度を測定すれば１．下式によシ
検体の活性が求められる。
北記測定により８０検体について得られた測定結果を第
１図に示す。図は、７７レカリ性ホヌフアターゼの標準
的な測定法とされているカイノド−キング法による同一
検体について得られた測定値と対比したものである。図
から明らかなように、カインドーギング法による測定値
が正常値（２，７〜１０Ｋｉｎｇ−Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ
単位）であった１９検体は本発明法による測定値もすべ
て正常値を示し、カイノド−キング法で異常値を示した
１１検体は、多少値のことなるものもあるが本発明法に
よる測定値も同様の異常値を示しておシ、画法の測定値
の間には高じ相関関係が認められ（相関係数γ＝０．９
６７８）、その回帰式として、Ｙ＝１．００６Ｘ＋ １
．２３７ （Ｙ ：カイノド−キング法の測定値、Ｘ二
本発明法の測定値）が得られた。
１図に示す。図は、７７レカリ性ホヌフアターゼの標準
的な測定法とされているカイノド−キング法による同一
検体について得られた測定値と対比したものである。図
から明らかなように、カインドーギング法による測定値
が正常値（２，７〜１０Ｋｉｎｇ−Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ
単位）であった１９検体は本発明法による測定値もすべ
て正常値を示し、カイノド−キング法で異常値を示した
１１検体は、多少値のことなるものもあるが本発明法に
よる測定値も同様の異常値を示しておシ、画法の測定値
の間には高じ相関関係が認められ（相関係数γ＝０．９
６７８）、その回帰式として、Ｙ＝１．００６Ｘ＋ １
．２３７ （Ｙ ：カイノド−キング法の測定値、Ｘ二
本発明法の測定値）が得られた。
また、異常値を示した検体のうち、本発明性測定値とカ
イノド−キング法測定値とが著しく異なる２検体ａとｂ
についてみると、本発明性測定値（ａ ： ｌ １．４
に−Ａ単位、ｂ：１２．０Ｋ−Ａ単位）は正常値に近い
のに対し、カインドーキング法測定饋（ａ ： ２１．
８に−Ａ単位、ｂ：２１．７に−Ａ単位）は著しく高い
。そこで、この２検体について１イソザイムを検索した
結果、２検体とも、肝、骨に由来するアルカリ性ホスフ
ァターゼの値には異常はなく、小腸由来のそれが高いこ
とがわかった。すなわち、上記２検体について本発明測
定法が正常値に近い低い値を示したのは、本発明測定法
の基質であるチモールフタレインモノ燐酸が、カイノド
−キング法の基質であるフェニル燐酸よりも、小腸由来
のアルカリ性ホスファターゼに対する基質特異性が低め
ことに起因する。通常、疾患の体外鑑別診断のためのア
ルカリ性ホスファターゼの測定においては、肝、骨由来
のそ−４が測定対象となることからすれば、小腸由来の
それに対する基質特異性の低い本発明法により得られる
測定値は、カイノド−キング法のそれに比し、よシ正確
にアルカリ性ホスファターゼの異常の有無を反映してｂ
ると言うことができる。まだ、このことを利用し、カイ
ノド−キング法と併用すれば、小腸由来のアイソザイム
を検出することも可能である。
イノド−キング法測定値とが著しく異なる２検体ａとｂ
についてみると、本発明性測定値（ａ ： ｌ １．４
に−Ａ単位、ｂ：１２．０Ｋ−Ａ単位）は正常値に近い
のに対し、カインドーキング法測定饋（ａ ： ２１．
８に−Ａ単位、ｂ：２１．７に−Ａ単位）は著しく高い
。そこで、この２検体について１イソザイムを検索した
結果、２検体とも、肝、骨に由来するアルカリ性ホスフ
ァターゼの値には異常はなく、小腸由来のそれが高いこ
とがわかった。すなわち、上記２検体について本発明測
定法が正常値に近い低い値を示したのは、本発明測定法
の基質であるチモールフタレインモノ燐酸が、カイノド
−キング法の基質であるフェニル燐酸よりも、小腸由来
のアルカリ性ホスファターゼに対する基質特異性が低め
ことに起因する。通常、疾患の体外鑑別診断のためのア
ルカリ性ホスファターゼの測定においては、肝、骨由来
のそ−４が測定対象となることからすれば、小腸由来の
それに対する基質特異性の低い本発明法により得られる
測定値は、カイノド−キング法のそれに比し、よシ正確
にアルカリ性ホスファターゼの異常の有無を反映してｂ
ると言うことができる。まだ、このことを利用し、カイ
ノド−キング法と併用すれば、小腸由来のアイソザイム
を検出することも可能である。
本発明測定法は、従来のロイの方法に比し、日常検査に
適しており、正確な測定値を得ることができる。また、
現在標準的な方法とされているカイノド−キング法とく
らべても、鑑別診断用としてすぐれている。
適しており、正確な測定値を得ることができる。また、
現在標準的な方法とされているカイノド−キング法とく
らべても、鑑別診断用としてすぐれている。
第１図は本発明方法とカイノド−キング法による血清ア
ルカリ性ホスファターゼ測定値を示すグラフである。 代理人 弁理士 宮 崎 新八部
ルカリ性ホスファターゼ測定値を示すグラフである。 代理人 弁理士 宮 崎 新八部
Claims (1)
- （１）基・質としてチモールフタレインモノ燐酸を含む
ジェタノールアミン・塩酸緩衝液を検体に加工、遊離す
るチモールフタレインをアルカリ性にて発色させ、その
吸光変を測定してア７レカリ性ホスファターゼ活性を求
めることを特徴とする血清アルカリ性ホスファターゼ活
性測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4239482A JPS58158199A (ja) | 1982-03-17 | 1982-03-17 | 血清アルカリ性ホスフアタ−ゼ活性測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4239482A JPS58158199A (ja) | 1982-03-17 | 1982-03-17 | 血清アルカリ性ホスフアタ−ゼ活性測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58158199A true JPS58158199A (ja) | 1983-09-20 |
| JPH024279B2 JPH024279B2 (ja) | 1990-01-26 |
Family
ID=12634843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4239482A Granted JPS58158199A (ja) | 1982-03-17 | 1982-03-17 | 血清アルカリ性ホスフアタ−ゼ活性測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58158199A (ja) |
-
1982
- 1982-03-17 JP JP4239482A patent/JPS58158199A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH024279B2 (ja) | 1990-01-26 |
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