JP5539314B2 - 薄厚チャンバに含まれる薄膜状体液試料中の極めて低レベルの分析物を検出する方法 - Google Patents

Description

本願は、２００８年４月９日に出願された米国仮特許出願第６１／０４３，５７１号明細書の利益を主張する。

本発明は、米国特許第６，９２９，９５３号明細書に開示されるような撮像システムを使用して、極めて低レベルの標的分析物を検出及び定量化するための方法及び装置に関する。特定のホルモン、例えばＴＳＨなどの一部の分析物の場合、そのレベルはマイクロリットル当たり数万個の分子ほどの低さであり得る。こうした極めて低いレベルは、本発明を使用することにより計測して、分析物の個々の分子を計数することができる。本発明はまた、一次的な定量方法であり、従って標準化する必要がないという利点も有する。

本方法は、例えば、典型的には厚さが約２ミクロン（２μ）〜１０ミクロン（１０μ）の薄厚の平面状チャンバに含まれる薄膜状の生体体液試料として配置された所定の標的分析物を検出及び定量化するためのものである。標的分析物は、少なくとも２個のエピトープを有する。この方法は、所定の標的分析物の単一の分子を固定された基板に結合させることにより機能し、但し、アッセイには、２つ以上のエピトープに対する結合剤が用いられてもよい。基板は、それに結合している捕捉抗体又はリガンドを有する。抗体又はリガンドは標的分析物の１つ又は複数の第１のエピトープに特異的であり、分析物を固定化してその拡散を妨げる；すなわち、標的分析物を基板に結合させるように機能する。次に、標識プローブを使用することにより、結合した標的分析物が検出される。プローブは、その表面に結合した１つ又は複数の抗体又はリガンドを含み、その抗体又はリガンドは、標的分析物の１つ又は複数の第２のエピトープに特異的である。

第１及び第２のタイプのエピトープは、空間的に、一方のエピトープの結合がもう一方のエピトープの結合を妨げることのないように標的分析物上に位置していなければならない。用語「抗体」及び「リガンド」は、標的エピトープに強力且つ特異的に結合することが可能な任意の物質を指すものとし、免疫グロブリン、アプタマー（ａｐｔｉｍｅｒ）、及び同様の高結合親和性をもつ任意の生物学的結合剤を含むものとする。

この方法は、少なくとも２つの到達可能なエピトープを有する任意の標的分析物の検出及び同定に好適である。かかる標的分析物の例は、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）である。以下に記述されるとおり、生体体液検体試料、好ましくは血漿又は血清がチャンバに導入され、このチャンバの表面積寸法は、試料の単位面積当たりの計数可能な標的分析物分子の数が最大となるように選択される。

チャンバの底面又は上面はプラスチックシートで形成され、そこに抗α−ＴＳＨ抗体が、計測が求められる標的分析物の最高量を捕捉するのに必要な量を超える量で結合している。捕捉抗体は、アッセイ中に抗体がその結合している表面から離れることのないよう、固定された基板に不可逆的に結合していなければならない。この範囲は、捕捉範囲と称される。

血漿又は血清試料がチャンバに添加され、試料中の全てのＴＳＨ分子が捕捉抗体を含む固定された基板に結合し、それにより試料中に存在する全ての分子が固定化される。薄い（典型的には１０ミクロン（１０μ）未満の）チャンバ厚さであれば垂直方向の分子拡散が可能となり、それにより薄いチャンバの２つの層間における拡散が急速に生じ、分析物の全ての分子が捕捉抗体表面に接触することが可能となる。理想的には、血漿、又は他の検査対象の生体体液は、透明で、且つアッセイにおける分析物の結合又は信号の検出を妨げ得る細胞などの粒子を含まないものでなければならない。

同時に、又は短時間の初期インキュベーション期間後、抗β−ＴＳＨ抗体などの、分析物の第２のエピトープに特異的な抗体と結合する蛍光ナノ粒子が、これもまた計数対象の分子の最大数を結合するのに必要な分量を超える分量で試料に添加される。ナノ粒子は、好ましくは直径が１０〜１００ナノメートル（１０〜１００ｎｍ）で、ユウロピウム蛍光材料、又は量子ドットと称されるもの、若しくは他の蛍光ナノ粒子（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯが供給業者である）などの、任意の検出可能なナノ粒子からなる。これらの蛍光ナノ粒子は、十分に小さく、且つその表面結合抗体が固定化された分析物に付着しない限りコロイド懸濁液の状態のままであるような密度でなければならない。

ＴＳＨ分析物の第２のエピトープに対する抗体／リガンドを含む単一の蛍光ナノ粒子が、基板に結合している各ＴＳＨ分子に付着する。固定化された分析物と付着することによる固定化がなされていない蛍光ナノ粒子は、常にコロイド懸濁液の状態のままであり、ブラウン運動に起因して動く。結合したナノ粒子を結合していないナノ粒子と識別するため、結合していない信号を発生するナノ粒子によるバックグラウンドの光を生じる固定されていない発光ナノ粒子の発光と比較して、固定された発光ナノ粒子による信号を計測可能な程度に上昇させるのに十分な長さのある期間にわたりインキュベートした後、検査チャンバを適切な蛍光照明下に結合した粒子の焦点面で撮像する。この露光時間は、計測機器により適応的に決定され得るが、その範囲に結合したナノ粒子がないこともあり得るため、その上限は制限される。基板に固定されているため一箇所に留まるナノ粒子は、その全ての光子がわずか数画素に収まり、一方、ブラウン運動に起因して「躍動」して動き回るナノ粒子は、その輝度がより広い範囲に分散し、従って固定された粒子の検出が可能となる。捕捉抗体のないチャンバの表面積は、対照範囲として機能し得る。

この手法を用いると、撮像範囲におけるナノ粒子の濃度は十分に低く、従って完全に重なり合うことがなく、固定された粒子を識別するセンサの能力を低下させないはずである。従って、個々の識別可能な固定された蛍光粒子の数は、捕捉範囲内の捕捉抗体の上側又は下側にあるチャンバの容積に含まれる標的分析物の分子の数に等しい。対照範囲の上側にある流体の容積は、固定化された捕捉抗体又はリガンドの上側にある容積と比較して比較的少量であるため、チャンバ又は狭小な通路の総容積を計算する目的上は無視することができる。狭小な通路は、対照範囲を捕捉範囲と分離する拡散隔壁として機能するもので、捕捉範囲に関する正確なチャンバ容積を求めるために用いられ得る。或いは、捕捉範囲を対照範囲と分離する実際の不透過性の隔壁を用いてもよい。含有試料において計測され得る分子の最大数は、チャンバの捕捉範囲と画素の拡大率とにより定義される。標的分析物の濃度は、検出された分子の数を、チャンバにおける捕捉範囲の上側の試料含有量で除算したものである。チャンバの容積は、チャンバの既知の高さと試料の面積とにより定義され、試料の面積は、試料面積内の画素数と、面積／画素拡大倍率とにより定義され得る。従って、チャンバ高さ及び拡大率が既知の場合、試料容積の大きさもまた、分析を実施する機器により決定され得る。結合した分子は、捕捉された標識ナノ粒子からの信号の同時発生が回避されるように、互いに十分な距離を置いて結合している必要がある。例えば、ナノ粒子に含まれる信号の蛍光を３〜１０画素の範囲にわたって検出することができ、且つナノ粒子の所望の画像間隔が、その距離の少なくとも２倍、すなわち約１５画素分離れていて、拡大率が０．５μｍ／画素の画像サイズをもたらす場合、１平方ｃｍの試料面積であれば、チャンバ当たり最大約１〜２００万個の分子の検出に十分な解像度を含み得る。チャンバで検出される分子の大きさの下限は、理論上、当然ながら計数統計により制限されるものである。当業者は、チャンバが薄いほど、標識された標的分析物リガンドの結合物と遊離物との区別がし易くなり、しかしチャンバに含まれる試料の容積は小さくなることを理解するであろう。チャンバの面積が大きくなるほど、ダイナミックレンジが高まり、しかし分析用のチャンバの画像を取得するのに、より長い時間が必要となる。

１０ミクロン（ｌ０μ）の高さで、２マイクロリットルを捕捉範囲に保持する２ｃｍ²のチャンバであれば、この容積中に数個の分子の存在を検出することができる。これは、試料の原液における約１０アトモル濃度の感度に相当する。必要であれば、１０マイクロリットル〜１，０００マイクロリットルの試料を薄いチャンバを通じてゆっくりと流し、それにより当該容積中のほとんど又は全ての分子を捕捉することによって試料の容積を増加させることで、装置及び方法の感度を線形的に上昇させることができる。流量は、約１〜７マイクロリットル毎秒の範囲であり得る。このアッセイは先述のとおり行われ得るが、分析チャンバは、試料保持リザーバと廃液リザーバとの間に置かれてもよく、流れが完了するまで検出ナノ粒子の追加は行われず、結果はチャンバを通じて流れた容積ごとに報告され得る。試料容積の増加は試料によって押し上げられ得るが、収集チャンバに吸収性材料を使用すると、流れを自動化することができる。試料は、捕捉範囲及び対照範囲の双方を流れ得る。

従って、本発明の目的は、分析チャンバに入れられた血漿又は血清中の単一分子標的分析物の量を定量するための方法を提供することである。

本発明の目的は、少なくとも１つの透明な表面を有する平面状の薄膜状試料チャンバの表面に標的分析物分子を捕捉し、捕捉された分子を、測光法で計測し得るように光学的に強調させることが関わる、記載される特徴の方法を提供することである。

本発明のこの、及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面に示されるとおりのその詳細な説明に照らし合わせることでさらに明らかとなるであろう。

標的分析物、この場合ＴＳＨについての血漿又は血清試料のアッセイに使用される薄膜状試料検査チャンバの一部分の概略的な平面図である。 図１と同様の図であり、但し、血漿又は血清試料と蛍光分析物が存在する複数のレポーターとを充填した後の検査チャンバを示す。 図２と同様の図であり、但し、検査チャンバが標的分析物の存在に関して撮像されたときの検査チャンバの電子画像を示す。 より大きい容積の試料供給源範囲と、複合的な薄膜状検査チャンバ範囲と、より大きい容積の試料受入れ範囲とを含む薄膜状試料検査チャンバアセンブリの代替的実施形態の概略的な平面図である。 図４と同様の概略的な平面図であり、但し、試料が薄膜状の検査チャンバ範囲を動いているところを示す。 図５と同様の概略的な平面図であり、但し、薄膜状の検査チャンバ範囲を、試料がそこを通った後に撮像したところを示す。

ここで図１を参照すると、概して符号２により標示される薄膜状の検査試料採集チャンバの一部分が示される。この場合にアッセイされる検査試料は血漿又は血清であり、ＴＳＨ（甲状腺特異的ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｏｒｍｏｎｅ））の存在についてアッセイされる。チャンバ２は表面又は壁４を有し、そこに複数のリガンド６が固着している。この場合、リガンド６は、アッセイ対象のＴＳＨ分子の第１の表面エピトープに特異的である。

図２は、アッセイ対象の血漿と蛍光レポーター粒子８との混合物を充填した後のチャンバ２を示す。粒子８は、標的分析物の第２のエピトープに特異的なリガンドを含み、そのため粒子の一部は、検査チャンバ２に入れられる前に標的分析物分子と結合する。標的分析物分子１２と結合した蛍光レポーター粒子は、符号１０により標示される。結合せず遊離している蛍光レポーター粒子は、図２では符号８により標示される。標的分析物、この場合ＴＳＨは、図２では符号１２により標示される。図２は、捕捉された分析物１２のいくつかと、数多くの結合せず遊離している蛍光レポーター粒子８とを示す。非結合粒子８は、試料４中において、矢印１４により概略的に示されるとおり動く傾向がある。これは、図３に概略的に示されるとおり試料採集チャンバ２が撮像されたときに、図３で符号１０’により示されるとおり、捕捉されたレポーター粒子（標的分析物上にある）からの蛍光信号が試料中で比較的明るく、且つ図３で符号８’により示されるとおり、遊離しているレポーター粒子からの蛍光信号が比較的暗く、又は不鮮明となる場合である。

このように、試料４中の捕捉された標的分析物の数は、試料４を撮像することにより容易に決定することができる。試料採集チャンバ２の容積は制御されるため、チャンバ２内の試料４の容積は既知であり、標的分析物のカウント数は標的分析物／試料容積単位で計測することができる。

ここで図４〜６を参照すると、より大きい容積のアッセイ対象試料を採集することのできる本発明の機器の実施形態が示される。この実施形態は、より多いアッセイ対象の血漿又は血清試料が入る試料リザーバ１６を含む。リザーバ１６は、例えば試料を１ｍｌまで保持することができる。リザーバ１６は可撓性の上表面を有し、これを押圧することにより試料を圧迫し、アセンブリの試料検査チャンバ構成要素２を通じて圧送することができる。検査チャンバ２は、捕捉リガンド６を含まない対照範囲２０と試料採集範囲２’とを含む。この対照範囲は一定の尺度では示されず、捕捉範囲よりはるかに小さいか、又は必要であれば、分析物捕捉リガンド６を含む捕捉範囲との拡散隔壁に接続されてもよい。リザーバ１６が圧迫されると、試料は矢印Ａの方向に、試料採集範囲２’と対照範囲２０とを同時に通って動く。範囲２’及び２０を通過した後、試料は、必要に応じて試料吸収剤を含み得る受入れリザーバ１８に溜まる。

図６は、試料チャンバ２’において、試料がそこを通った後に検出され得る画像を示す。この画像は、捕捉レポーター粒子の明るい像１０を示し、及び遊離している、すなわち捕捉されていないレポーター粒子からのより暗く不鮮明な蛍光信号８を示し得る。試料検査の妥当性が立証される場合には、対照範囲２０は不鮮明な蛍光信号８のみを含む。リザーバ１６及び１８を含めることで、より多量の試料をアッセイすることが可能となり、従ってより妥当な検査結果を提供することができる。図４〜６の破線１１は、試料採集範囲２’と対照範囲２０との間の不透過性の隔壁を示し、これは２つの範囲間で試料が交わることを防止するものである。

本発明は、その構造に関して本発明の記載の範囲内で多くの変更が可能である。そうした変更としては、高さが２μｍ〜１０μｍの、１ｍｍ²〜４００ｍｍ²の範囲のアッセイチャンバの面積が挙げられる。局部的に結合する抗体は、好ましくは均一なパターンに置かれ、隣接する対照範囲は、所望の分析物に対して親和性のない抗体を有するか、又は抗体を全く有しない。対照範囲は、標識された分析物に対応しないより高い強度の点がないことを確認したり、又はそうした点の非特異的な検出を制御したりするために望ましい。捕捉抗体に曝露した試料量のより正確な容積決定を達成するため、試料の対照範囲から捕捉範囲への拡散は制限することが好ましい。また、必要であれば、標準曲線用として実施することも可能であり、この場合、複数の濃度の既知の分析物が分析チャンバに入れられ、同様の条件下に分析される。捕捉範囲において撮像された面積当たりの検出可能な個別信号領域の数から、対照範囲において撮像された面積当たりの検出可能な個別信号を差し引いたものが、分析物の既知の濃度に対してプロットされ、それにより標準曲線が得られる。その結果を用いることで、標準曲線と同じ条件下で分析される未知の試料中の分析物の濃度が計算され得る。

局部的な蛍光粒子を生じる効果を有することから、ＲＣＡＴ（ローリングサークル増幅技術）などのプローブ信号増幅をナノ粒子の代わりに用いることもできる。

本発明の構想から逸脱することなく、本発明の開示される実施形態の多くの変更及び変形が行われ得るため、添付の特許請求の範囲により要求される場合を除き、本発明を制限することは意図されない。

Claims (14)

1. 試料内の標的分析物分子を定量化するための生体体液試料のイムノアッセイの実施方法であって、
   試料アッセイチャンバを提供するステップと、
   試料内の標的分析物分子の全てを結合するのに十分な、標的分析物分子に特異的な複数の捕捉抗体又はリガンドを提供するステップであって、前記捕捉抗体又はリガンドが、試料アッセイチャンバ又は試料アッセイチャンバ内の固定化された構造の表面に固定され、前記捕捉抗体又はリガンドが、標的分析物分子上の１つ又は複数の第１のエピトープに特異的である、ステップと、
   前記試料アッセイチャンバに、前記生体体液試料と、標的分析物分子上の１つ又は複数の第２のエピトープに選択的に結合する抗体とカップリングされた蛍光遊離ナノ粒子との混合物を充填するステップと、
   前記試料アッセイチャンバ内の前記静止状態の混合物を撮像し、前記試料中の捕捉された標的分析物分子と結合することにより固定化された蛍光遊離ナノ粒子が、前記試料中でブラウン運動現象に起因して蛍光遊離ナノ粒子が動く結果として、前記試料中の蛍光遊離ナノ粒子と測光法で識別することができ、前記固定された捕捉抗体又はリガンドにより捕捉された標的分析物分子であって、固定化された状態にある、固定化された標的分析物上の第２のエピトープに結合する抗体とカップリングされた蛍光遊離ナノ粒子を撮像することにより検出可能となる標的分析物分子を計数するステップと、を含む、方法。
2. 前記蛍光遊離ナノ粒子が量子ドットである、請求項１に記載の方法。
3. 前記蛍光遊離ナノ粒子が、前記試料中の捕捉された標的分析物分子と結合することにより固定化された量子ドットであって、前記試料中のブラウン運動現象の結果として生じる蛍光遊離ナノ粒子の動きにより、前記試料中の蛍光遊離ナノ粒子と測光法で識別することのできる量子ドットである、請求項１に記載の方法。
4. 標識された検出抗体の結合しているものと遊離しているものとの区別が、画像又は走査の分析を利用する電子的手段により実施される、請求項１に記載の方法。
5. アッセイ材料が無希釈である、請求項１に記載の方法。
6. 前記蛍光遊離ナノ粒子が、２００ナノメートル未満の直径である、請求項１に記載の方法。
7. 前記蛍光遊離ナノ粒子が、１０〜１００ナノメートルの範囲の直径である、請求項６に記載の方法。
8. 加えられる試料容積が、前記試料アッセイチャンバの容積より大きい、請求項１に記載の方法。
9. 試料アッセイチャンバ内の標的分析物分子を定量化するための生体体液試料のイムノアッセイの実施方法であって、
   前記生体体液試料と、前記生体体液試料中に存在する標的分析物分子上の１つ又は複数の第２のエピトープに選択的に結合する抗体とカップリングされた蛍光遊離ナノ粒子との混合液の供給源を提供するステップであって、前記供給源が、前記試料アッセイチャンバの試料容量より大きい試料容量を有する、ステップと、
   前記混合液の供給源中の標的分析物分子の全てと結合するのに十分な、標的分析物に特異的な複数の捕捉抗体又はリガンドを提供するステップであって、前記捕捉抗体又はリガンドが、試料アッセイチャンバ又は試料アッセイチャンバ内の固定化された構造の表面に固定され、前記捕捉抗体又はリガンドが、前記生体体液試料中に存在する標的分析物分子上の１つ又は複数の第１のエピトープに特異的である、ステップと、
   前記混合液を、その前記供給源から前記試料アッセイチャンバを通じて試料受入れリザーバに送るステップであって、前記標的分析物が前記試料中に存在する場合、それにより前記標的分析物が前記試料アッセイチャンバ内で前記捕捉抗体又はリガンドと結合する、ステップと、
   前記試料アッセイチャンバを撮像し、前記試料中の捕捉された標的分析物分子と結合することにより固定化された蛍光遊離ナノ粒子が、前記試料中でブラウン運動現象に起因して蛍光遊離ナノ粒子が動く結果として、前記試料中の蛍光遊離ナノ粒子と測光法で識別することができ、前記固定された捕捉抗体又はリガンドにより捕捉された標的分析物分子であって、固定化された状態にある、固定化された標的分析物上の前記第１のエピトープに結合する抗体とカップリングされた蛍光遊離ナノ粒子を撮像することにより検出可能となる標的分析物分子を計数するステップと、を含む、方法。
10. 前記蛍光遊離ナノ粒子が量子ドットである、請求項９に記載の方法。
11. 前記蛍光遊離ナノ粒子が、前記試料中の捕捉された標的分析物分子と結合することにより固定化された量子ドットであって、前記試料中のブラウン運動現象の結果として生じる蛍光遊離ナノ粒子の動きにより、前記試料中の蛍光遊離ナノ粒子と測光法で識別することのできる量子ドットである、請求項９に記載の方法。
12. 標識された検出抗体の結合しているものと遊離しているものとの区別が、画像又は走査の分析を利用する電子的手段により実施される、請求項９に記載の方法。
13. 前記蛍光遊離ナノ粒子が、２００ナノメートル未満の範囲の直径である、請求項９に記載の方法。
14. 前記蛍光遊離ナノ粒子が、１０〜１００ナノメートルの範囲の直径である、請求項１３に記載の方法。