KR102535909B1 - 디지털 분자 분석 - Google Patents

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Abstract

개별적으로 분해된 분석물/리포터 결합 이벤트들의 직접적인 디지털 측정에 의해 결합 이벤트들의 평가에 의해 분석물의 빠르고 정확한 측정을 위한 시스템, 디바이스 및 방법이 여기에 제공된다. 여기에 개시된 디지털 분자 분석 시스템, 디바이스 및 방법은 단일의 분석물 분자의 결합을 검출 및 리포트하고, 이진 포맷으로 각각의 그러한 결합을 리포트하는 광학 리포터 분자들을 사용하여 입자별 판독이 가능하다. 그러한 디지털 분자 분석 시스템, 디바이스 및 방법은 필드에서의 사용을 위한 모바일 전자 디바이스상에서와 같은 다양한 응용들에서 유용하다.

Description

디지털 분자 분석
본 출원은 2017년 3월 12일자로 출원된 미국 가출원 제 62/470,303 호 우선권의 이익을 주장하며; 이의 개시가 여기에 그 전체가 기록된 것처럼 참조에 의해 포함된다.
필드에서 수행가능한 포인트-오브-케어 진단 및 다른 분석이 절실하게 필요하다. 분석을 위한 전용 연구실로 진단 테스트, 특히 혈액 테스트와 같은 분석들을 전송하는 것과 연관된 지연 및 비용이 제거될 수 있다면, 응답이 더 효율적이고 효과적으로 행해질 수 있을 것이다. 클리닉 연구실들은 정밀, 작업대 기구들 상에서 생화학적 분석을 수행함으로써 진단 테스트를 행한다. 모바일 전자 디바이스상에서의 이들 기구들을 소형화하고 그들의 기능을 복제하려는 노력은 어려움 투성이이다. 다수의 경우들에서, 그 결과들은 사용불가하다.
필요한 것은 저렴하지만, 정확한 포인트-오브-케어, 말하자면 예를 들어 빠르고 정확한 결과를 예를 들어 의사들 및 그들의 환자들에게 제공하는 진단 테스트이다.
개개의 분석된 분석물/리포터 결합 이벤트의 직접적인, 디지털 측정에 의한, 결합 이벤트의 분석에 의한 분석물의 빠르고 정확한 측정을 위한 시스템, 디바이스 및 방법이 여기에 제공된다. 여기에 개시된 디지털 분자 분석 시스템, 디바이스 및 방법은 단일의 분석물 분자의 결합을 검출 및 리포트하고, 이진 포맷으로 각각의 그러한 결합을 리포트하는 광학적 리포터 분자들을 사용하여 입자별 판독이 가능하다. 그러한 디지털 분자 분석 시스템, 디바이스 및 방법은 필드에서의 사용을 위한 모바일 전자 디바이스상에서와 같은 다양한 응용들에서 유용하다.
도 1 은 아날로그 분석의 개념도이다.
도 2 는 아날로그 분석 절차의 개념도이다.
도 3 은 아날로그 분석 결과의 시뮬레이션이다.
도 4 는 디지털 분자 분석 시스템의 부분의 개념도이다.
도 5 는 대안적인 디지털 분자 분석 시스템의 부분의 개념도이다.
도 6 은 디지털 분자 분석 이미지 데이터의 개념도이다.
도 7 은 디지털 분자 분석 데이터의 이미지이다.
도 8 은 디지털 분자 분석 결과의 시뮬레이션이다.
도 9 는 클립-온 분석 칩 판독기를 갖는 모바일 전자 디바이스를 도시한다.
도 10 은 디지털 분자 분석에 임베딩될 수도 있는 코드들을 도시한다.
도 11 은 리포터 분자상의 리포터 볼륨 두께에서의 변동의 효과를 도시한다. 이 도면에서 1 은 리포터 볼륨을 나타내고; 2 는 리코더 디바이스의 표면을 나타내며; 3 은 리포터 분자를 나타내고; 4 는 리포터 분자로부터 리코더 디바이스까지의 광학 경로를 나타낸다.
도 12 는 얇은 리포터 볼륨 및 그것의 특성을 도시한다. 이 도면에서 1 은 리포터 볼륨을 나타내고; 2 는 리코더 디바이스의 표면을 나타내며; 3 은 리포터 분자를 나타내고; 4 는 리포터 분자로부터 리코더 디바이스까지의 광학 경로를 나타내며; 5 는 리포터 분자 (4) 에 부착되거나 그것을 포함하는 더 큰 입자를 나타낸다.
도 13 은 광학적 스펙트럼에 대한 곡선-피팅 방법의 적용을 도시한다. 수평 축은 nm 단위의 파장을 나타내고, 수직 축은 광학 신호의 강도를 나타낸다.
도 14 는 강하게 결합하는 리포터 분자 (상측 곡선) 및 약하게 결합하는 리포터 분자 (하측 곡선) 에 대한 결합 등온선 플롯을 도시한다
도 15 는 낮은 리포터 분자 포화도에서 분석물 농도의 결정에 관한 오차의 효과를 나타낸다. 수평 축은 분석물 농도이고, 수직 축은 결합된/총 리포터 분자 농도의 비율이다. 1 로 표시된 어두운 수평 및 수직 화살표는 리포터 분자 농도 및 분석물 농도의 “정확한” 결정을 나타낸다. 2 로 표시된 밝은 수평 및 수직 화살표는 리포터 분자 농도 및 분석물 농도의 “부정확한” 결정을 나타낸다.
도 16 은 높은 리포터 분자 포화도에서 분석물 농도의 결정에 관한 오차의 효과를 나타낸다. 수평 축은 분석물 농도이고, 수직 축은 결합된/총 리포터 분자 농도의 비율이다. 1 로 표시된 어두운 수평 및 수직 화살표는 리포터 분자 농도 및 분석물 농도의 “정확한” 결정을 나타낸다. 2 로 표시된 밝은 수평 및 수직 화살표는 리포터 분자 농도 및 분석물 농도의 “부정확한” 결정을 나타낸다.
모바일 전자 디바이스에서 생화학적 분석을 수행해야 할 필요성이 크지만, 종래의 분석들을 간단히 소형화하여 전문의, 클리닉 연구실의 통제된 환경 밖에서 그들을 수행하려는 시도는 과거에는 성공하지 못했다. 종래의 생화학분석은 본질적으로 아날로그 측정이기 때문에 신뢰성있게 소형화될 수 없다.
디지털 분석은 최소한 세 가지 방법으로 아날로그 분석의 고유한 불확실성을 제거한다. (1) 디지털 분석은 아날로그 노이즈에 매우 강한 이진 이벤트에 기초한다. (2) 디지털 분석은 아날로그 분석에서 비활성 분석 분자의 알려지지 않은 조각에서 발생하는 오류를 제거한다. (3) 디지털 분석은 불균일 조명과 같은 공간적 불균일성과 관련된 문제를 제거한다.
예를 들어, 알려진 농도의 항체와 혼합되는 샘플 내의 항원의 농도를 측정하도록 설계된 항원-항체 분석을 고려하라. 그 분석은 항원에 결합하는 항체가 그렇지 않은 것과 상이한 광학 신호를 방출하는 광학적 판독을 갖는다. (예를 들어, 결합되지 않은 항체는 신호를 방출하지 않을 수도 있다.) 항원-항체 결합의 친화도를 고려할 때, 벌크 광학 판독 신호가 항원 농도를 추정하는데 사용될 수도 있다.
이 절차는 엄격한 품질 관리를 갖춘 전문 실험실 환경에서 합리적으로 잘 작동하도록 행해질 수 있다. 그러나 필드 설정에서 모바일 장치로 수행하면 비참하게 실패한다. 기존의 아날로그 생화학 분석은 정교하며 휴대폰, 태블릿 및 유사한 장치에서 수행될 때 매우 부정확한 결과를 제공한다.
한 가지 문제는 엄격한 실험실 프로토콜이 없으면 아마도 알려져 있는 항체 농도의 상당 부분이 비활성일 수 있다는 것이다. 필드 설정에서, 부적절한 취급, 오염, 변성 및 기타 문제로 인해 항체의 10 %에서 100 % 사이가 비활성 상태가 될 수 있다. 더욱 나쁜 것은, 비활성 항체의 부분은 알려져 있지 않다. 그것은 관찰불가하며 관측된 데이터를 평균화하여 제거될 수 없는 시스템 오류를 나타낸다. 결합되지 않은 항체의 부분 및 비활성 항체의 부분은 혼동된다; 그들의 신호는 구별할 수 없다.
디지털 분석은 수백만의 결과를 평균화하기보다는 분석물과 리포터 분자, 예를 들어 항원과 항체 또는 상보적 뉴클레오티드 서열 사이의 개별 결합 이벤트를 계수함으로써 이 문제를 감소시키거나 제거한다. 모바일 디바이스는 수백만 개의 생화학적 이벤트들 - 픽셀 당 1 개 또는 노출 당 수천만 개 - 을 샘플링할 수 있는 고품질 카메라를 포함하기 때문에 디지털 분석에 적합하다. 또한 모바일 디바이스는 이미지 분석을 위한 상당한 처리 능력과 결과를 보고하고 필요한 경우 오프로드 처리를 위한 통신 능력을 포함한다.
디지털 분석은 이미지에서 특징들을 선택하고 그들을 유효 또는 널 (null) 로 분류한다. 널 특징은 예를 들어 위치, 밝기, 파장 또는 모양에 대한 특정 기준을 충족하지 않는 이미지에서의 모든 것을 포함한다. 비활성 항체는 널 특징의 일반적인 원인이지만 불규칙한 샘플 조명, 부정확한 광학 정렬, 샘플 불규칙성 - 모바일 설정에서 및 부적절한 제어를 갖는 다른 시나리오에서의 모든 일반적인 문제 - 도 기여한다. 디지털 분석에서, 데이터 분석을 위해 널 특징은 폐기된다; 유효한 특징만 분석 결과에 기여한다. 유효한 특징은 결합된 또는 결합되지 않은 것으로서 카운트되며, 이들이 유일한 가능성이다. 예 혹은 아니오; 1 또는 0. 디지털 분석에서 463 개의 유효한 특징들이 결합된 것으로 카운트되고 886 개의 특징들이 결합되지 않은 것으로 카운트되면, 결합된 부분은 463/(463 + 886) = 463/1349 = 0.343 이다. 이러한 종류의 결과는 디지털 프로세스에서 비롯된다. 그것이 알려진 분석물 결합 친화도와 결합될 때, 그것은 원하는 분석물 농도를 제공한다. 널로서 분류된 이벤트의 부분은 결과에 차이가 없다.
그것이 디지털인 분석 자체라는 것을 명심하는 것이 도움이된다. 이 개념은 아날로그 결과의 유비쿼터스 디지털화와 관련이 없다. 아날로그 분석에 의해 생성된 신호는 분석 또는 저장을 위해 디지털화 될 수도 있지만 아날로그 신호를 디지털화하는 것은 그것에 "베이킹 인 되는 (baked in)" 시스템 오류를 제거할 수 없다. 유사하게, 아날로그 장비로 만든 음악 녹음은 녹음이 디지털로 저장되어 있어도 아날로그 녹음 프로세스에서 음악과 분리할 수 없는 정적 팝 (pop) 과 히스 (hiss) 를 보유한다.
이제 도면을 참조하면, 도 1 은 아날로그 분석의 개념 설명이다. 큐벳에는 샘플이 들어 있다. 샘플은 예를 들어 항원 및 항체를 함유하는 용액일 수도 있다. 항체는 항원 분자에 결합할 때, 새로 형성된 항체-항원 복합체가 광학적 여기에 의해 조사될 때 광학 신호를 방출하도록 표지될 수도 있다. 광학 신호는 스펙트럼 측정일 수 있으며; 즉, 광 강도 대 파장. 큐벳은, 비록 적은 양의 시료를 담을 수 있지만, 수 밀리리터가 일반적인 크기이며, 수십억 개의 항체와 항원 분자를 포함한다. 관찰된 스펙트럼은 수십억 개의 결합된, 표지된 항체-항원 복합체가 방출하는 스펙트럼의 복합체이다. 그러나 알려지지 않은 부분의 항체는 작동하지 않는다; 그들은 응집체에 걸리거나 변성되거나 다른 문제가 있기 때문에 항원에 결합할 수 없다.
도 2 는 아날로그 분석 절차의 개념도이다. 분석은 항체 농도와 혼합된 미지의 항원 농도로 시작한다. (준비되고 항원에 결합할 수 있는) 활성 항체 대 (항원에 결합할 수 없거나 항원과 결합하는데 사용할 수 없는) 비활성 항체의 비는 알려져 있지 않다. 전문 실험실 설정에서, 통제된 환경에서 엄격한 절차를 따르는 숙련된 기술자는 활성-대-비활성 비율을 높거나 최소한 일관되게 유지할 수 있다. 그러나 필드 또는 포인트-오브-케어 설정에서, 활성 대 비활성 항체의 비율은 훨씬 낮고, 더 나쁘고, 완전히 일관성이 없다.
활성 항체는 항원-항체 친화도, 항원 농도 및 미지의 활성 항체 농도에 의해 결정된 레이트로 항원에 결합한다.
도 3 은 아날로그 분석 결과의 시뮬레이션다. 벌크 스펙트럼 (두꺼운 실선 곡선) 은 아날로그 분석에서 관찰된 것 ("SPECTRUM OUT") 을 나타낸다. 다수의 밝은 파선 곡선은 단일 항원-항체 결합 이벤트로부터의 스펙트럼을 나타낸다. 그러나 이러한 스펙트럼은 아날로그 분석에서는 관찰할 수 없다. 도 3 의 시뮬레이션에서, 결합되지 않은 활성 항체는 약 495 nm 파장의 빛을 방출하는 반면, 결합된 활성 항체는 약 505 nm 파장의 빛을 방출한다. 알려지지 않은 수의 비활성 항체는 빛을 방출하지 않는다. 이는 벌크 스펙트럼이 모든 활성 항체의 부분으로서 결합 된 항체의 수를 측정하기에 충분한 정보를 제공하지 않음을 의미한다.
비활성 항체가 여전히 빛을 방출할 수 있기 때문에 실제 실험에서는 상황이 더 나빠지지만 그 빛은 항원 결합에 대한 정보를 제공하지 않는다. 그것은 단지 시스템 오류에 기여한다.
도 4 는 디지털 분자 분석 시스템의 일부의 개념도이다. 도 4 에 예시된 디지털 분자 분석은 예를 들어, 스마트 폰 카메라로 수행된 모바일 암시야 현미경이 플라즈몬 나노입자 샌드위치형 면역 분석의 이미지를 캡처하는 예를 도시한다. 이 분석에서, 내부 전반사 (TIR) 기질은 관심 항원에 결합하도록 설계된 포획 항체로 기능화된 플라즈몬 나노입자로 코팅된다. 동일하거나 상이한 항체로 기능화된 (즉, 항원의 등가 부분 또는 상이한 부분에 결합하도록 설계된) 추가 플라즈몬 나노입자가 샘플에서의 관심 항원과 함께 도입된다. 여기 광은 에지로부터 기판으로 도입된다. 결합된 항체는 결합되지 않은 항체 및 비활성 항체와는 상이한 광학 신호를 방출한다. 열화 또는 보다 일반적으로 응집과 같은 많은 요인으로 인해 항체가 비활성이 될 수 있다. 상이한 신호들은 이미지에서 상이한 크기, 밝기, 스펙트럼, 형상 등으로 나타날 수 있고, 이들 팩터들 중 하나 이상을 고려하여 활성 또는 널로 분류될 수 있다.
도 5 는 또한 디지털 분자 분석 시스템의 부분의 개념도이다; 그것은 TIR 기질이 관심의 분석물 DNA/RNA 의 일부에 상보적인 DNA 또는 RNA 의 포획 뉴클레오티드 서열로 기능화된 플라즈몬 나노입자로 코팅되는 상기 예의 대안이다. 상이한 cDNA/cRNA 로 기능화된 (즉, 분석물 DNA/RNA 의 다른 섹션에 결합하도록 설계된) 추가 플라즈몬 나노입자가 샘플에서의 분석물 DNA/RNA 와 함께 도입된다. 결합된 DNA/RNA 서열은 결합되지 않은 항체 및 비활성 항체와는 상이한 광학 신호를 방출한다.
도 6 은 디지털 분자 분석 이미지 데이터; 즉, 암시야 현미경으로서 동작하는 모바일 디바이스 카메라에 의해 캡처된 이미지의 일부의 개념도이다. 이미지는 결합된 항원-항체 복합체에 의해 생성된 스폿 (spot), 결합되지 않은 항체로부터의 스폿, 비활성 또는 널 항체로부터의 스폿 및 여러 가지 이유로 결함이 있는 이미지의 영역이 될 수도 있는 결함 구역을 포함한다. 이미지의 조명이 불균일하지 않고, 심지어 균일과는 거리가 멀 수도 있다. 공간 조명 패턴이 알려져 있는 한, 조명 파장에서 이미지를 기록함으로써, 예를 들어, 이미지의 임의의 지점에서의 결과가 알려진 조명으로 정규화 될 수도 있다.
도 7 은 현미경으로서 작동하는 모바일 디바이스 카메라에 의해 얻어진 디지털 분자 분석 데이터의 묘사이다. 본 개시에서와 같이 그레이 스케일로 도시될 때 이러한 도면은 원래의 컬러 이미지와 비교하여 덜 인상적이므로, 그것은 흑백 제출을 위해 수동으로 향상되었다. 이미지에서 활성 항체에 해당하는 스폿 주위에 흰색 원이 그려져 있다. 이미지의 다른 모든 스폿은 널 또는 비활성 항체이다. 활성 항체 중, 11 개 중 4 개가 결합되어 있다; 이들은 예를 들어 백색 원 주위에 회색 원으로 도시되어 있다. 활성 대 널, 및 결합된 대 결합되지 않은의 식별은 이미지 분석 소프트웨어에 의해 수행된다. 이미지 분석은 모바일 디바이스상에서 수행될 수도 있다. 대안적으로, 모바일 디바이스는 이미지를 다른 프로세서로 전송할 수 있다. 그것은 예를 들어 이미지를 컴퓨터 클라우드의 가상 서버로 보낼 수도 있다.
디지털 부자 분석에서 결합되지 않은 항체로부터 결합된 항체를 구별하는 이미지 처리의 예로서 도 8 은 디지털 분석 결과의 시뮬레이션다. 도 8 은 디지털 분석으로부터의 이미지에서 6 개의 스폿으로부터의 스펙트럼을 나타낸다. 결합된 대 결합되지 않은에 대한 기준은 스폿으로부터의 스펙트럼이 파장이 500 nm 보다 높거나 낮은 지 여부이다. 도면에 도시된 범위에 속하지 않는 스펙트럼을 가진 스팟은 널이다. 위에서 아래로, 스펙트럼은 결합되지 않은, 결합되지 않은, 결합된, 비활성 (널), 결합되지 않은 및 결합된 항체 부위로부터의 스팟에 해당한다. 두 개의 긍정적 결과, 세 개의 부정 및 하나의 널이 존재한다. 따라서 결합된 항체의 비율은 2/5 이다. 전술 한 바와 같이, 실제 실험은 비활성 항체로부터의 광학 신호에 의해 복잡해진다. 따라서, 선택 기준은 특정 파장 위 또는 아래의 스펙트럼 중심보다 더 복잡 할 수도 있다. 기준은 예로서 좁은 스펙트럼 대역, 강도 기준, 스펙트럼 형상 및 공간 형상을 포함할 수도 있다.
선택 기준은 또한 공간 조명 패턴에 대한 지식을 고려한다. 방출 파장에서 측정된 강도는 이미지의 동일한 위치에서 여기 파장에서의 조명 강도에 의해 정규화된다. 이것은 아날로그 측정을 괴롭히는 공간적 불균일성의 문제를 제거합니다. 분석은 각 입자에 대해 "여기 인 (EXCITATION IN)" "스펙트럼 아웃 (SPECTRUM OUT)" 을 고려하여 입자별로 디지털 방식으로 진행된다. 주어진 입자에 대한 결과는 단지 0 또는 1 일 수 있다.
디지털 분자 분석은 클립-온 분석 칩 판독기를 갖춘 모바일 전자 디바이스를 도시하는 도 9 에 도시된 바와 같은 모바일 디바이스로 수행될 수도 있다. 분석 칩 리더는 예를 들어 암시야 이미징을 위해 모바일 디바이스 카메라를 적응시키는 광학 컴포넌트를 포함할 수도 있다. 분석 칩은 분석물 용액을 수용하도록 설계되었으며 항체로 미리 코팅될 수도 있다.
디지털 분석은 이미징 및 이미지 분석에 기초하기 때문에, 코드는 분석 칩에 배치되고 결합 이벤트를 측정하는데 사용 된 동일한 이미지로부터 판독될 수도 있다. 도 10 은 디지털 분석에 임베딩될 수도 있는 코드를 도시한다. 예로는 바코드, 빠른 응답 (QR) 코드, 조작된 파장에서 광을 방출하는 퀀텀 도트, 온도, 습도, 광 노출, 가스 노출 및 기타 환경 데이터의 나노 입자 리포터가 있다. 특정 분석 유형을 나타내는 식별 마크 또는 샘플 식별도 포함될 수 있다.
상기 논의된 예는 항원-항체 결합을 사용하여 제시된다. 항원 및 항체는 분석 판독을 위해 광학 리포터 분자에 연결될 수도 있다. 다른 가교 메커니즘을 포함하는 분석도 디지털 방식으로 수행 될 수 있다. 예를 들어, 광학 리포터 분자에 결합된 DNA 또는 RNA 단편의 혼성에 기초한 분석은 디지털 분자 분석으로서 수행될 수도 있으며, 여기서 상보적 DNA 또는 RNA 단편은 항원 및 항체 분자를 대신한다. 예로서, 짧은 DNA 서열의 제 1 부분은 광학 리포터에 결합 될 수 있고, 짧은 DNA 서열의 제 2 부분은 다른 광학 리포터에 결합될 수도 있다. 제 1 및 제 2 부분이 더 길고 상보적인 DNA 서열에 결합하는 경우, 2 개의 광학 리포터는 서로 가깝게 모이며, 따라서 더 멀리 있을 때와 비교하여 상이한 광학 신호를 방출한다. 이러한 종류의 분석은 상보적 DNA 서열을 검출하는데 사용될 수 있다.
결론적으로, 아날로그 분석으로 전문적인 실험실 계측을 위한 대리자로 모바일 디바이스를 사용하는 것은 어리석은 일이다. 디지털 분자 분석은 단일 분석물 분자와 리포터 분자 사이의 개별 상호 작용의 입자별 판독을 허용하여, 전통적인 분석에 수반되는 실제적인 문제를 무의미하게 만든다. 아날로그 분석에서 발견되는 시스템 오류의 일반적인 원인을 줄이거나 제거하는 진단 결과를 제공하기 위해 모바일 디바이스의 이미징 및 이미지 처리 능력을 레버링하는 경우, 디지털 분자 분석은 의사와 환자가 중요한 건강 정보를 빠르고 저렴하게 얻을 수 있도록 도와주는 포인트-오브-케어 진단 테스트와 같은 인-필드 (in-field) 평가, 및 광범위한 애플리케이션들에 걸쳐 데이터의 수집 및 분석을 가능하게 한다.
용어 및 정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본원에서 사용되는 바와 같은 하기 용어는 나타낸 의미를 갖는다.
값 범위가 개시되고 표기 "n1 내지 ... n2" 또는 "n1 과 ... n2 사이" 가 사용되는 경우 (n1 및 n2 는 수임), 달리 명시되지 않는 한, 이러한 표기는 수 그 자체 및 그들 사이의 범위를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 범위는 말단 값 사이에서 및 말단 값을 포함하여 적분 또는 연속적일 수 있다. 예를 들어, 범위 "2 내지 6 개 탄소" 는, 탄소가 정수 단위로 존재하므로, 2, 3, 4, 5 및 6 개 탄소 원자를 포함하는 것으로 의도된다. 비교하여, 예를 들어 범위 "1 내지 3 μM (마이크로몰)" 은 1 μM, 3 μM, 및 유효 숫자의 임의의 수 사이의 모든 것 (예를 들어, 1.255 μM, 2.1 μM, 2.9999 μM 등) 을 포함하는 것을 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "약" 은 오차 범위 내에서 변수와 같은 값을 나타내도록 수식하는 수치를 한정하는 것으로 의도된다. 데이터의 표 또는 차트에서 주어진 평균 값에 대한 표준 편차와 같은 특정한 오차 범위가 인용되지 않는 경우, 용어 "약" 은 유효 숫자를 고려하여, 인용된 값을 포함하는 범위 및 숫자를 반올림하거나 내림하여 포함될 수 있는 범위도 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "정확도"는 실제 값으로부터 보고되거나 추정된 값의 근접성을 지칭하기 위해 사용된다. 부정확한 측정, 관찰 또는 추정은 실제 값으로부터 벗어난다. 정확한 측정, 관찰 또는 추정은 실제 값으로부터 벗어나지 않는다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "분석물" 또는 "분석물 분자" 는 샘플 내의 존재 또는 부재, 또는 양이 원래 알려지지 않은, 그리고 샘플 내의 존재 또는 부재, 또는 포함된 양에 대한 지식이 유용할 분자 또는 입자를 기술하기 위해 사용된다. 분석물의 예는 생체 분자, 예컨대 펩티드, 단백질, 사이토 카인 및 프리온; 항체 및 이의 단편; 핵산 (DNA/RNA) 및 이를 함유하는 입자, 예컨대 히스톤; 탄수화물, 지질, 호르몬 및 중간체 및 대사 산물과 같은 작은 유기 및 생물 무기 분자; 매크로사이클, 바이오폴리머 (예를 들어, 올리고당, 폴리 페놀 및 플라스틱) 와 같은 매크로분자; 및 바이러스, 바이러스 입자, 바이러스 생성물 (예 : 비로카인) 을 포함한다. 분석물은 또한 바이오마커, 즉, 유기체의 생물학적 상태 (예를 들어, 질병 또는 비 질병 상태와 같은 조건) 와 연관되고, 질병, 부상, 또는 세포 또는 유기체 손상의 존재를 보고할 수 있는 조성물 및/또는 분자 또는 조성물 및/또는 분자의 복합체로서 카테고리화될 수도 있다. 이러한 마커가 항체 또는 이의 단편에 결합할 때, 이들은 항원으로 지칭될 수도 있다. 본원에 개시된 디지털 분자 분석에 의해 검출된 의미있는 (예를 들어, 정상 및 비정상) 수준의 분석물에 대한 값은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있을 것이다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "영역 검출기"는 소스로부터 이미지를 기록할 수 있는, 즉 들어오는 광학 신호의 강도뿐만 아니라 광학 신호의 원점을 기록할 수 있는 기록 장치를 지칭한다. 영역 감지기의 일반적인 예로는 텔레비전 카메라, 디지털 SLR 카메라 및 휴대폰 카메라가 있다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "분석 칩" 은 광학 리포터 분자의 포획 엘리먼트와 분석물 사이의 상호작용이 관찰될 수 있도록 분석물을 함유하는 샘플에 노출될 수 있는, 슬라이드와 같은 비교적 얇은 평평한 큐벳 내에 선택적으로 인클로징된, 리포터 표면상에 스폿팅 (spotting) 되거나 다르게는 증착된 리포터 분자 (예를 들어, 광학 리포터 분자) 의 마이크로어레이를 지칭한다. 분석 칩의 제조를 위한 기술은 당업계에 공지되어있다. 분석 칩은 광학 리포터 분자로서 항체, 단백질, DNA, RNA 등으로 기능화된 플라즈몬 나노 입자를 포함할 수도 있다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "분석 칩 판독기"는 분석 칩으로부터의 신호를 관찰 및 기록하기 위한 시스템 또는 디바이스를 지칭한다. 분석 칩 판독기는 본원에 개시된 바와 같은 디지털 분자 분석 시스템의 일부일 수도 있고, 전형적으로 분석 칩을 수용하기 위한 챔버, 이미지 센서 (예를 들어, 카메라) 와 같은 기록 디바이스, 분석으로부터 수집된 데이터를 메모리로 전송하기 위한 수단, 및 선택적으로, 발광 다이오드 (LED) 와 같은 광원을 포함한다. 또한, 분석 칩 판독기는 펌프, 채널, 용액을 위한 챔버, 밸브, 믹서 등과 같은 미세 유체 하드웨어; 및 데이터의 적어도 일부 분석을 수행하기 위한 하드웨어 및/또는 소프트웨어를 포함할 수도 있다. 특정 실시형태들에서, 분석 칩 판독기는 스마트 폰 또는 다른 모바일 장치와 결합되고 휴대용 분석 시스템의 일부로서 사용될 수 있으며; 소형화된 마이크로플레이트 및 칩 판독기는 당업계에 알려져있다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "결합 등온선"은 분석물의 상이한 농도들에서 분석물 분자에 대한 결합된 리포터 분자의 결합의 정도를 지칭한다. 일반적으로, 결합된 리포터 분자/총 리포터 분자의 비로 정의될 수 있는 결합의 정도는 증가된 분석물 농도에 따라 증가하고, 거의 모든 리포터 분자가 분석물 분자에 결합됨에 따라 결국 1 에 접근한다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "비닝 (binning)"은 둘 이상의 픽셀로부터의 신호들의 하나의 신호로의 조합을 지칭한다. 신호 대 잡음을 개선하기 위해 공간 해상도가 희생될 수 있는 경우 비닝이 사용될 수 있다. 예를 들어, "2x2 비닝"은 픽셀들의 2x2 정사각형들로의 그룹화, 및 각 정사각형에 포함된 픽셀의 신호를 합산하는 것을 지칭한다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "생체 분자" 는 펩티드, 단백질, 핵산, 당, 단당류 및 다당류, 지질, 리포프로테인, 전 세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 검출 (정성적 또는 정량적) 이 요구될 수도 있는 임의의 유형의 유기 또는 생물 무기 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "카메라"는 예를 들어 디지털 이미지로서 시각적 이미지를 기록하기 위한 이미지 센서의 유형을 지칭한다. "메가픽셀 카메라" 는 이미지 당 백만 또는 백만의 배수 픽셀들을 기록할 수 있는 카메라이다. 많은 스마트 폰 카메라는 10 메가 픽셀 이상의 카메라를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "통신 인터페이스" 는 본원에 사용된 디바이스 또는 시스템으로부터 다른 디바이스 또는 시스템으로 데이터를 전송하기 위한 수단을 지칭한다. 무선 통신 인터페이스의 예는 이동 전화, 예를 들어 셀룰러, Wi-Fi 및 블루투스 기술과 같은 무선 디바이스에서 사용되는 인터페이스를 포함한다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "농도"는 단위 부피의 용액 당 용액 중 용질의 양을 지칭한다. 농도는 몰 농도, 즉 용액 1 리터당 용질의 몰수, 또는 수 농도, 즉 용액 1 리터당 용질 분자의 수의 단위로 특정될 수 있다. 몰 농도와 수 농도는 쉽게 상호 변환될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "농도" 는 "용액" 의 전통적인 정의 외부의 시스템, 예를 들어 고체 지지체에 테 더링된 분자를 포함하는 시스템을 포함하도록 확장된다.
본 명세서에서 단독으로 또는 조합으로 사용되는 용어 "디컨볼루션 (deconvolution)" 은 복수의 광학 리포터 분자로부터의 개별 광학 신호로 구성된 집합적 광학 신호로부터, 개별 광학 리포터 분자로부터의 개별 광학 신호를 결정하기 위한 방법을 설명하기 위해 사용된다. 디컨볼루션은 곡선-피팅 기술을 사용하여 스펙트럼 영역에 걸쳐 부분적으로 중첩하고 단일 집합 스펙트럼을 형성하기 위해 결합된 개별 광학 리포터 분자로부터 개별 스펙트럼 특징을 결정할 수 있다. 디컨볼루션은 곡선-피팅 기술을 사용하여 검출기의 공간 영역에서 부분적으로 중첩하고 단일 집합 이미지를 형성하기 위해 결합된 개별 광학 리포터 분자로부터 개별 이미지를 결정할 수 있다. 디컨볼루션 기술은 소그룹의 광학 리포터 분자에 특히 유용하다는 것이 이해될 것이다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "검출하다" 또는 "검출" 은 샘플에서의 분석물의 현존, 존재 또는 사실의 결정의 방법을 기술하기 위해 사용된다.
용어 "발산 (divergence)" 은 기록 디바이스에 의해 수용되는 수직으로부터의 편차를 나타낸다. 이상적인 영역 검출기 유형의 기록 디바이스는 검출기 평면에 수직인 광선만을 수용할 것이다. 실제 영역 검출기는 수직로부터 일정 각도로 도달하는 광선을 허용할 것이다. 이러한 특징은 (검출기에 의해 더 많은 광선이 수용되므로) 신호 대 잡음비를 증가시킬 수 있지만, 그것은 또한 허용되는 발산 각도의 크기, 및 영역 검출기 픽셀의 크기 및 영역 검출기와 샘플 평면 사이의 거리에 따라 공간 해상도를 감소시킨다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "배양하다" 는 잠재적으로 분석물 분자를 함유할 수 있는 샘플에 리포터 분자를 노출시키는 과정을 기술하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "길쭉한" 은 상이한 차원들을 갖는 볼륨을 기술하는데 사용된다. 길쭉한 볼륨의 예는 단부 면들 사이의 거리가 단부 면들에 평행한 차원들보다 상당히 크거나 상당히 작은 프리즘 또는 실린더를 포함한다. 길쭉한 볼륨의 다른 예는 하나의 축이 다른 축보다 상당히 크거나 상당히 작은 타원체이다.
본 명세서에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "광학 경로" 는 리포터 분자로부터 검출기까지의 경로를 기술하는데 사용된다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "광학 리포터 분자" 또는 동등하게 "광학 리포터" 는 분석물 분자의 존재 또는 부재, 또는 양 또는 농도를 광학 신호로 리포트할 수 있는 리포터 분자를 기술하는데 사용된다. 광학 리포터 분자와 접촉하는 (선택적으로, 특정 분석 형식에서, 다른 광학 리포터 분자를 갖는) 분석물 분자의 존재 또는 부재는 광학 신호의 변화를 유도한다. 분석물에 결합된 광학 리포터 분자 ("결합된 광학 리포터 분자") 는 분석물에 결합되지 않은 광학 리포터 분자 ("결합되지 않은 광학 리포터 분자") 와 상이한 신호를 방출할 것이다.
본 명세서에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "광학 신호" 는 광학 리포터 분자로부터 발생하는 신호를 기술하는데 사용된다. 광학 신호는 스펙트럼의 가시 범위 내에 있거나 스펙트럼의 가시 범위 밖에 있을 수도 있다. 그 신호는 예를 들어:
* 광의 파장;
* 신호의 강도;
* 밝기;
* 신호 또는 스펙트럼의 형상;
* 스펙트럼 대역의 존재 또는 부재;
* 흡수 대역의 흡광 계수;
* 흡수 대역의 λmax;
* 방출 대역의 퀀텀 수율; 또는
* 방출 대역의 형광 비등방성이다.
광학 리포터 분자로부터의 광학 신호는 분석물 분자의 결합 시에 변할 수도 있다. 결합 시의 광학 신호의 변화는 다음 중 하나일 수도 있다:
* 특정된 파장 위 또는 아래의 스펙트럼 중심에서의 시프트;
* 최대 강도의 파장 (λmax) 에서의 시프트;
* 신호의 크기 또는 강도의 변화;
* 밝기의 증가 또는 감소;
* 신호의 형상의 변화;
* 스펙트럼 대역의 존재 또는 부재;
* 스펙트럼의 형상의 변화;
* 흡수 대역의 흡광 계수의 변화;
* 흡수 대역의 λmax 의 변화;
* 방출 대역의 퀀텀 수율의 변화; 및
* 방출 대역의 형광 비등방성의 변화.
본 명세서에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "픽셀" 은 그의 신호가 다른 픽셀과 독립적으로 측정될 수 있는 영역 검출기, 예를 들어 이미지 센서상의 영역을 지칭한다. 영역 검출기는 일반적으로 영역 검출기 제조자에 의해 결정된 각 픽셀의 크기 및 두 방향에서의 픽셀의 카운트를 갖는 픽셀들의 2 차원 그리드로 분할된다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "정밀도"는 보고되거나 추정된 값과 연관되는 오차의 추정을 지칭하기 위해 사용된다. 낮은 정밀도 측정, 관찰 또는 추정은 이러한 수치의 실제 값에 대한 근접성에 대한 높은 정도의 불확실성과 연관된다. 높은 정밀도 측정, 관찰 또는 추정은 이러한 수치의 실제 값에 대한 근접성에 대한 낮은 정도의 불확실성과 연관된다. 정밀도는 종종 그래프 또는 수치 값들에 대한 범위상의 오차 막대를 사용하여 정량화될 수 있다. 예를 들어, 10.5 ± 0.1 로 보고되는 추정값은 실제 값이 10.4 와 10.6 사이일 가능성이 매우 높다는 것을 나타낸다; 실제 값이 이 범위를 벗어날 가능성은 작지만 0 은 아니다.
용어 "단백질", "폴리펩티드", "펩티드" 및 "올리고 펩티드" 는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 조성물을 포함한다. 폴리펩티드는 일반적으로 20 개의 자연 발생 아미노산으로 지칭되는 20 개의 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 폴리펩티드는 (자연 발생적이든 자연 발생적이지 않든) 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 변형되는, 말단 아미노산을 포함하는, 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 변형의 예는 예를 들어 글리코실화 또는 다른 번역 후 변형을 포함한다. 본 개시의 폴리펩티드에 존재할 수 있는 변형은 다음을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다: 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 접합, 헤미 모이어티의 공유 접합, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 공유 접합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 접합, 포스파티딜이노시톨의 공유 접합, 가교 결합, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 디메틸화, 공유 가교의 형성, 시스틴의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 당화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아미노산의 단백질에의 전달-RNA 매개된 부가 예컨대 아르기닐화, 및 유비퀴틴화.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "정성적 분석" 은 샘플 내의 분석물 분자의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 방법을 기술하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 정성적 분석 방법은 샘플 내의 분석물의 단일의 분자의 존재 또는 부재를 리포트한다. 일부 실시형태에서, 정성적 분석 방법은 특정 임계값 미만의 수준에서 분석물을 함유하는 샘플 내의 분석물의 부재를 부정확하게 보고 한다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "정량적 분석" 은 샘플 내의 분석물 분자의 양을 결정하기 위한 방법을 기술하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 "기록 디바이스" 라는 용어는 광학 신호를 기록하기 위한 디바이스를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 광학 신호는 전기 신호로 변환된다. 특정 실시형태에서, 기록 디바이스는 전하 결합 ("CCD") 디바이스이다. 특정 실시형태에서, 기록 디바이스는 상보적 금속산화물 반도체 ("CMOS") 디바이스이다.
본원에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 용어 "리포터 분자" 는 분석물 분자의 존재 또는 부재, 또는 양 또는 농도를 리포트하고, 단독으로 또는 다른 리포터 분자와의 조합으로 디지털 분자 분석에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 분자를 기술하는 데 사용된다. 전형적으로, 리포터 분자는 분석물 분자에 결합할 것이고, 리포터 분자/분석물 분자 복합체는 하나 이상의 스펙트럼 특성에서 상당히 다를 것이다. 리포터 분자는 항체 또는 이의 단편, 핵산, 단백질 및 펩티드일 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수도 있다. 리포터 분자는 또한 생화학적 기원의 모이어티 및 합성 모이어티를 포함하는 키메라 분자일 수 있고; 예들은 항체-기능화된 플라즈몬 나노 입자 및 뉴클레오티드-기능화된 플라즈몬 나노 입자를 포함한다. 리포터 분자는 핵산 또는 펩티드에 기초한 압타머일 수 있다.
여기에서 단독으로 또는 조합으로 사용되는 용어 “리포터 볼륨” 은 리포터 분자가 위치되는 측정 디바이스의 볼륨을 기술하는데 사용된다. 리포터 볼륨은 샘플 컴파트먼트와 실질적으로 동일할 수도 있거나, 리포터 볼륨은 더 작을 수도 있다. 특정의 실시형태들에서, 리포터 분자에 대한 광학 경로에 평행한 리포터 볼륨의 치수는 작을 것이다. 특정의 실시형태들에서, 리포터 볼륨은 단일층을 구성할 것이다.
여기에서 단독으로 또는 조합으로 사용되는 용어 “샘플” 은 관심의 분석물을 함유하는 조성물을 기술하는데 사용된다. 샘플은 종종 유체, 예를 들어 수용액 내에 있을 것이다. 샘플은 화학적 또는 생물학적일 수도 있다. 혈액, 혈장, 테스트될 소스로부터의 물, 식물, 동물, 또는 인간 조직 샘플로부터의 추출물은 생물학적 샘플의 예이다. 화학적 샘플은 석유화학 또는 산업 폐기물을 포함하는 물 샘플과 같은, 생물학적 기원의 물질을 포함하지 않는 것일 것이다. 유기체로부터 추출된 생물학적 샘플들은 다음을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다: 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 점액, 타액, 가래, 대변, 및 다른 생리학적 분비물들 뿐아니라 조직의 추출물, 및 또는 관심의 타겟 입자를 포함할 수 있는 신체의 임의의 다른 구성성분. 세포 또는 조직 배양 또는 배양 브로스 (culture broth) 와 같은 다른 유사한 시료도 관심이 있다.
생물학적 샘플은 신선하거나 저장될 수도 있다 (예를 들어, 혈액 은행에 저장된 혈액 또는 혈액 프랙션). 생물학적 샘플은 본 발명의 분석을 위해 명백하게 획득되는 신체 유체 또는 본 발명의 분석을 위해 서브-샘플링될 수 있는 다른 목적을 위해 획득된 신체 유체일 수도 있다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 전체 혈액이다. 전혈은 표준 클리닉 절차를 사용하여 대상으로부터 획득될 수도 있다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈장이다. 혈장은 항응고제 처리된 혈액의 원심분리에 의해 전혈 샘플로부터 획득될 수 있다. 그러한 처리는 백혈구 성분의 버피 코트 및 혈장의 상청액을 제공한다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈청이다. 혈청은 항응고제가 없는 튜브에서 수집된 전혈 샘플의 원심분리에 의해 획득될 수 있다. 혈액은 원심분리 전에 응고되도록 허용된다. 원심분리에 의해 획득되는 노르스름하고 불그스름한 유체가 혈청이다. 다른 실시형태에서, 샘플은 소변이다. 그 샘플은 적절한 완충 용액에서의 희석에 의해 필요에 따라 사전처리되거나, 헤파린화되거나, 원한다면 농축되거나, 초원심분리, 고속 성능 액체 크로마토그래피 (FPLC) 에 의한 분별, 또는 덱스트란 설페이트를 갖는 단백질을 포함하는 아폴리포 단백질 B 의 석출 또는 다른 방법을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 수의 방법에 의해 분별될 수도 있다. 포스페이트, 트리스 등과 같은, 생리학적 pH 에서의 임의의 수의 표준 완충 수용액이 사용될 수 있다.
결합 현상과 관련하여 여기에 사용된 용어 “포화” 는 거의 모든 리포터 분자가 분석물 분자에 결합되는 상태를 지칭한다. 포화의 조건의 특징은 분석물의 농도에서의 증가가 리포터 분자의 결합의 정도에서의 작은 증가를 야기한다는 것이다.
여기에 사용된 용어 “스마트폰” 은 모바일 운영 시스템 및 음성, SMS, 및 인터넷 데이터 통신, 및 통상적으로 wi-fi 를 위한 통합된 모바일 광대역 셀룰러 네트워크 연결을 갖는 소형 개인용 컴퓨터를 지칭한다.
여기에 사용된 용어 “태블릿 컴퓨터” 또는 “태블릿” 은 통상적으로 모바일 운영 시스템, LCD 터치스크린 디스플레이, 재충전가능한 배터리, 및 무선 (선택적으로, 셀룰러) 통신 인터페이스를 갖는 얇은, 평평한, 휴대용 개인용 컴퓨터를 지칭한다.
실시형태들
본 발명은 다음의 실시형태들에 의해 더 설명된다.
실시형태 1. 본 개시는 샘플에서의 적어도 하나의 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법을 제공하며, 그 방법은:
적어도 하나의 유형의 분석물 분자들로 배양된 적어도 하나의 유형의 광학 리포터 분자들에 의해 방출된 복수의 신호들의 이미지에서,
각 유형의 광학 리포터 분자들에 대해, 결합된 및 결합되지 않은 광학 리포터 분자들을 개별적으로 분해함으로써 이미지에서 분석물 분자들에 결합된 이산 광학 리포터 분자들 (“결합된 광학 리포터 분자들”) 의 수 및 분석물에 결합되지 않은 이산 광학 리포터 분자들 (“결합되지 않은 광학 리포터 분자들”) 의 수를 결정하는 단계; 및
광학 리포터 분자들의 총수에 대한 분율, 또는 분율에 대한 비례로서 결합된 광학 리포터 분자들의 수로부터 분석물의 존재 또는 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
실시형태 2. 특정의 실시형태들에서, 본 개시는 샘플에서의 적어도 하나의 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법을 제공하며, 그 방법은:
적어도 하나의 유형의 분석물 분자들로 배양된 적어도 하나의 유형의 광학 리포터 분자들에 의해 방출된 복수의 신호들의 이미지에서,
각 유형의 광학 리포터 분자들에 대해,
이미지의 특정의 영역들에서, 결합된 및 결합되지 않은 광학 리포터 분자들을 개별적으로 분해하는 것, 및
일 그룹의 2 개 이상의 광학 리포터 분자들이 분해되지 않는, 이미지의 특정의 다른 영역들에서, 그룹에서 결합된 광학 리포터 분자들 및 결합되지 않은 광학 리포터 분자들의 수를 제공하는 계산적 또는 수학적 디컨볼루션을 수행하는 것에 의해 이미지에서 분석물 분자들에 결합된 이산 광학 리포터 분자들 (“결합된 광학 리포터 분자들”) 의 수 및 분석물에 결합되지 않은 이산 광학 리포터 분자들 (“결합되지 않은 광학 리포터 분자들”) 의 수를 결정하는 단계; 및
광학 리포터 분자들의 총수에 대한 분율, 또는 분율에 대한 비례로서 결합된 광학 리포터 분자들의 수로부터 분석물의 존재 또는 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
실시형태 3. 실시형태들 1 또는 2 에 있어서, 광학 리포터 분자들은 리포터 표면상에 배열되는, 방법.
실시형태 4. 실시형태 3 에 있어서, 광학 리포터 분자들은 랜덤으로 배열되는, 방법.
실시형태 5. 실시형태 3 에 있어서, 광학 리포터 분자들은 패턴으로 배열되는, 방법.
실시형태 6. 실시형태들 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 결합된 광학 리포터 분자들의 분율은 샘플의 도입 전에 기록된 결합되지 않은 광학 리포터 분자들의 수로부터 결정되는, 방법.
실시형태 7. 실시형태들 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 분석물의 농도가 결정되는, 방법.
실시형태 8. 실시형태들 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 샘플은 생물학적 또는 화학적 샘플인, 방법.
실시형태 9. 실시형태들 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 분석물은:
* 뉴클레오티드 서열; 및
* 항원
으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 10. 실시형태들 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 광학 리포터 분자는:
* 분석물과 결합하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들; 및
* 분석물과 결합하는 항체 또는 그의 단편
으로부터 선택되는 포획 엘리먼트를 포함하는, 방법.
실시형태 11. 실시형태들 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 각각의 광학 리포터 분자는 플라즈몬 나노입자를 포함하는, 방법.
실시형태 12. 실시형태들 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 광학 리포터 분자는 하나 이상의 플라즈몬 나노입자들로 기능화된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들을 포함하는, 방법.
실시형태 13. 실시형태들 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 광학 리포터 분자는 하나 이상의 플라즈몬 나노입자들로 기능화된 하나 이상의 항체들을 포함하는, 방법.
실시형태 14. 실시형태들 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 광학 리포터 분자로부터의 신호는:
* 광의 파장;
* 신호의 강도;
* 밝기;
* 신호 또는 스펙트럼의 형상; 및
* 스펙트럼 대역들의 존재 또는 부재
로부터 선택되는, 방법.
실시형태 15. 실시형태들 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 하나의 신호가 광학 리포터 분자에 대한 분석물의 결합 시에 생성되는, 방법.
실시형태 16. 실시형태들 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 다른 신호가 광학 리포터 분자에 대한 분석물의 결합 및 분석물에 대한 제 2 리포터 분자의 결합 시에 생성되는, 방법.
실시형태 17. 실시형태들 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 결합된 광학 리포터 분자 및 결합되지 않은 광학 리포터 분자에 의해 생성된 신호들은 상이한, 방법.
실시형태 18. 실시형태들 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 결합된 및 결합되지 않은 광학 리포터 분자들은:
* 특정된 파장 위 또는 아래로의 스펙트럼의 중심의 시프트;
* 신호의 크기 또는 강도의 변화;
* 밝기의 증가 또는 감소;
* 신호의 형상의 변화;
* 스펙트럼 대역들의 존재 또는 부재; 및
* 스펙트럼의 형상의 변화
에 의해 개별적으로 분해되는, 방법.
실시형태 19. 실시형태들 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 광학 리포터 분자에 의해 방출된 신호는 광의 파장인, 방법.
실시형태 20. 실시형태들 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 결합된 및 결합되지 않은 광학 리포터 분자들은 특정된 파장 위 또는 아래로의 스펙트럼의 중심의 시프트에 의해 개별적으로 분해되는, 방법.
실시형태 21. 실시형태들 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 광학 리포터 분자들 중 적어도 일부는 각각의 부착된 광학 리포터 분자가 공간적으로 분해가능하도록 표면 (리포터 표면) 에 부착되는, 방법.
실시형태 22. 실시형태 21 에 있어서, 부착된 광학 리포터 분자들은 그리드 또는 그의 근사화로 배열되는, 방법.
실시형태 23. 실시형태 21 에 있어서, 각각의 부착된 광학 리포터 분자들은 기록 디바이스의 하나의 픽셀로서 분해가능한, 방법.
실시형태 24. 실시형태들 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 활성 광학 리포터 분자들 및 비활성 광학 리포터 분자들은 상이한 광학 신호들을 방출하는, 방법.
실시형태 25. 실시형태들 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 방법은 이미지에서 분석물 분자들에 결합된 이산 활성 광학 리포터 분자들 (“결합된 활성 광학 리포터 분자들”) 의 수 및 분석물에 결합되지 않은 이산 광학 리포터 분자들 (“결합되지 않은 활성 광학 리포터 분자들”) 의 수를 결정하는, 방법.
실시형태 26. 실시형태들 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 샘플의 불균일 조명은 분석물의 존재 또는 농도의 결정에 영향을 주지 않는, 방법.
실시형태 27. 실시형태들 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 이미지는 알려진 조명 파장에서 기록되는, 방법.
실시형태 28. 실시형태들 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 이미지의 임의의 지점에서의 결과들은 알려진 조명으로 정규화되는, 방법.
실시형태 29. 실시형태들 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 방출 파장에서 측정된 강도는 이미지 내의 동일한 위치에서 여기 파장에서의 조명 강도에 의해 정규화되는, 방법.
실시형태 30. 실시형태들 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 이미지를 기록한 센서의 하나 이상의 섹션들에서의 결함들은 분석물의 존재 또는 농도의 결정에 영향을 주지 않는, 방법.
실시형태 31. 실시형태들 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 일 유형의 광학 리포터 분자가 사용되는, 방법.
실시형태 32. 실시형태들 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 2 이상의 유형의 광학 리포터 분자가 사용되는, 방법.
실시형태 33. 실시형태들 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 방법은 샌드위치형 분석을 채용하는, 방법.
실시형태 34. 실시형태들 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 제 1 유형의 광학 리포터 분자들은 각각의 부착된 광학 리포터 분자가 공간적으로 분해가능하도록 표면 (리포터 표면) 에 부착되는, 방법.
실시형태 35. 실시형태들 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 제 1 유형의 광학 리포터 분자들은 플라즈몬 나노입자로 기능화된 분석물에 대한 포획 엘리먼트를 포함하는, 방법.
실시형태 36. 실시형태들 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 제 2 유형의 광학 리포터 분자들은 샘플과 함께 또는 샘플 뒤에 첨가되는, 방법.
실시형태 37. 실시형태들 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 제 2 유형의 광학 리포터 분자들은 플라즈몬 나노입자로 기능화된 분석물에 대한 포획 엘리먼트를 포함하는, 방법.
실시형태 38. 실시형태들 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 분석물은 항원인, 방법.
실시형태 39. 실시형태 38 에 있어서, 각각의 광학 리포터 분자는 항체 또는 그의 단편을 포획 엘리먼트로서 포함하는, 방법.
실시형태 40. 실시형태들 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 분석물은 뉴클레오티드 서열인, 방법.
실시형태 41. 실시형태 40 에 있어서, 각각의 광학 리포터 분자는 분석물 뉴클레오티드 서열에 상보적인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들을 포획 엘리먼트로서 포함하는, 방법.
실시형태 42. 실시형태들 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 방법은 모바일 디바이스를 포함하는 디지털 분자 분석 시스템상에서 수행되는, 방법.
실시형태 43. 실시형태들 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 실시형태들 50 내지 70 중 어느 하나의 디지털 분자 분석 시스템 상에서 수행되는, 방법.
실시형태 44. 샘플에서의 항원의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법으로서, 그 방법은,
항원으로 배양된 항체들을 포함하는 적어도 하나의 유형의 광학 리포터 분자들에 의해 방출된 복수의 신호들의 이미지에서, 결합된 및 결합되지 않은 광학 리포터 분자들을 개별적으로 분해함으로써 이미지에서 항원에 결합된 이산 활성 항체들 (“결합된 활성 항체들”) 의 수 및 항원에 결합되지 않은 이산 활성 항체들 (“결합되지 않은 활성 항체들”) 의 수를 결정하는 단계; 및
활성 항체들의 총수에 대한 분율, 또는 분율에 대한 비례로서 결합된 활성항체들의 수로부터 항원의 존재 또는 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
실시형태 45. 실시형태 44 에 있어서, 실시형태들 3 내지 11 및 13 내지 39 중 어느 하나의 한정들을 포함하는, 방법.
실시형태 46. 실시형태 45 에 있어서, 실시형태들 50 내지 70 중 어느 하나의 디지털 분자 분석 시스템상에서 수행되는, 방법.
실시형태 47. 샘플에서의 타겟 뉴클레오티드 서열의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법으로서, 그 방법은,
a) 타겟 뉴클레오티드 서열의 제 1 부분에 상보적인 제 1 포획 뉴클레오티드 서열을 포함하는 광학 리포터 분자 및
b) 타겟 뉴클레오티드 서열의 부분에 상보적인 제 1 포획 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 광학 리포터 분자 및 타겟 뉴클레오티드 서열에 결합된 타겟 뉴클레오티드 서열 (“결합된 복합체들”) 의 제 2 부분에 상보적인 제 2 포획 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 광학 리포터 분자
에 의해 방출된 복수의 신호들의 이미지에서,
상보적인 뉴클레오티드 서열의 제 1 및 제 2 부분들을 포함하는 광학 리포터 분자들에 결합된 이산 타겟 뉴클레오티드 서열들 (“결합된 복합체들”) 의 수를 결정하는 단계;
검출가능한 신호들을 방출하는 광학적 리포터 분자들의 총 수의 분율로서 결합된 복합체들에 대한 분율, 또는 결합된 복합체들의 수에 대한 비례로서 타겟 뉴클레오티드 서열의 존재 또는 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
실시형태 48. 실시형태 47 에 있어서, 실시형태들 3 내지 12 및 13 내지 37 중 어느 하나의 한정들을 포함하는, 방법
실시형태 49. 실시형태 48 에 있어서, 시스템은 실시형태들 50 내지 70 중 어느 하나인, 방법
실시형태 50. 샘플에서의 분석물의 농도를 결정하기 위한 디지털 분석 시스템으로서, 그 시스템은,
* 이미지 센서;
* 이미지를 디스플레이할 수 있는 스크린;
* 마이크로프로세서;
* 메모리;
* 메모리에 저장되고 이미지 센서에 의해 캡쳐된 데이터를 분석하고 데이터를 디지털적으로 분류할 수 있는 프로세서에 의해 실행가능한 이미지 분석 소프트웨어; 및
* 선택적으로, 통신 인터페이스
를 포함한다.
실시형태 51. 실시형태 50 에 있어서, 이미지 센서는 암시야 현미경의 부분으로서 동작할 수 있는, 디지털 분석 시스템.
실시형태 52. 실시형태 51 에 있어서, 이미지 센서는 메가픽셀 카메라인, 디지털 분석 시스템.
실시형태 53. 실시형태들 49 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 이미지 센서는 상보적 금속산화물 반도체 (CMOS) 카메라인, 디지털 분석 시스템.
실시형태 54. 실시형태들 49 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 광 또는 다른 전자기 방사선의 소스를 추가로 포함하는, 디지털 분석 시스템.
실시형태 55. 실시형태들 49 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 광원은 발광 다이오드 (LED) 를 포함하는, 디지털 분석 시스템.
실시형태 56. 실시형태들 49 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 선택적으로 제거가능한 샘플 챔버를 추가로 포함하는, 디지털 분석 시스템.
실시형태 57. 실시형태들 49 내지 56 중 어느 하나에 있어서,
* 한쪽 측면에 포획 엘리먼트들로 기능화된 플라즈몬 나노입자들을 포함하는 광학 리포터 분자들이 부착된, 유리 또는 폴리머로 제조된 리포터 표면; 및
* 리포터 표면의 반대 측면과 접촉하는 암시야 현미경에 적합한 도파관
을 추가로 포함하는, 디지털 분석 시스템.
실시형태 58. 실시형태들 49 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 각각의 부착된 광학 리포터 분자는 공간적으로 분해가능한, 디지털 분석 시스템.
실시형태 59. 실시형태 58 에 있어서, 부착된 광학 리포터 분자들은 그리드 또는 그것의 근사화로 배열되는, 디지털 분석 시스템.
실시형태 60. 실시형태 58 또는 59 에 있어서, 각각의 부착된 광학 리포터 분자는 기록 디바이스의 하나의 픽셀로서 분해가능한, 디지털 분석 시스템.
실시형태 61. 실시형태들 49 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 포획 엘리먼트는:
* 분석물과 결합하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들; 및
* 분석물과 결합하는 항체 또는 그의 단편
으로부터 선택되는, 디지털 분석 시스템.
실시형태 62. 실시형태들 49 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 분석물은 항원인, 디지털 분석 시스템.
실시형태 63. 실시형태들 49 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 각각의 광학 리포터 분자는 항체 또는 그의 단편을 포획 엘리먼트로서 포함하는, 디지털 분석 시스템.
실시형태 64. 실시형태들 49 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 분석물은 뉴클레오티드 서열인, 디지털 분석 시스템.
실시형태 65. 실시형태들 49 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 각각의 광학 리포터 분자는 분석물 뉴클레오티드 서열에 상보적인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들을 포획 엘리먼트로서 포함하는, 디지털 분석 시스템.
실시형태 66. 실시형태들 49 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 마이크로 프로세서, 메모리, 이미지 센서, 소프트웨어, 이미지를 디스플레이할 수 있는 스크린, 및 통신 인터페이스는 단일의, 휴대가능한 디바이스 내에 모두 포함되는, 디지털 분석 시스템.
실시형태 67. 실시형태들 49 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 통신 능력은 무선인, 디지털 분석 시스템.
실시형태 68. 실시형태들 49 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 단일의, 휴대가능한 디바이스는 스마트폰 및 태블릿 컴퓨터로부터 선택되는, 디지털 분석 시스템.
실시형태 69. 실시형태들 49 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 단일의, 휴대가능한 디바이스는 스마트폰인, 디지털 분석 시스템.
실시형태 70. 실시형태들 49 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 가깝고 안정한 근접도로 스마트폰, 샘플 챔버, 및 광원을 위치시키기 위한 케이스를 추가로 포함하는, 디지털 분석 시스템.
위의 엘리먼트들을 포함하는 디바이스들이 또한 제공된다.
실시형태 71. 실시형태들 1 내지 41, 44, 45, 47, 및 48 중 어느 하나의 방법을 수행할 수 있는, 실시형태들 #-# 중 어느 하나의 디지털 분석 시스템이 또한 제공된다.
실시형태 72. 생화학 분석을 수행하기 위한 방법으로서, 그 방법은:
항원으로 항체들을 배양하는 단계;
복수의 항체들의 이미지를 획득하는 단계;
활성 또는 널로서 이미지에서 보이는 항체들을 분류하는 단계;
이미지에서의 결합된 및 결합되지 않은 항체들의 수를 결정하는 단계; 및
활성 항체들의 수의 분율로서 결합된 항체들의 수로부터 항원의 농도를 측정하는 단계를 포함한다.
실시형태 73. 실시형태 72 에 있어서, 항체들은 표면에 부착되는, 방법.
실시형태 74. 실시형태 72 에 있어서, 항체들 및 항원은 광학 리포터 분자들로 표지되는, 방법.
실시형태 75. 실시형태 72 에 있어서, 이미지는 모바일 디바이스 카메라로 획득되는, 방법.
실시형태 76. 생화학 분석을 수행하기 위한 방법으로서, 그 방법은:
짧은 DNA 서열의 제 2 부분에 결합된 광학 리포터 분자들로 짧은 DNA 서열의 제 1 부분에 결합된 광학 리포터 분자들을 배양하는 단계;
복수의 광학 리포터 분자들의 이미지를 획득하는 단계;
활성 또는 널로서 이미지에서 보이는 분자 복합체들을 분류하는 단계;
활성 분자 복합체들을 결합된 또는 결합되지 않은으로서 분류하는 단계;
이미지에서의 결합된 및 결합되지 않은 복합체들의 수를 결정하는 단계; 및
활성 복합체들의 수의 분율로서 결합된 복합체들의 수로부터 짧은 DNA 서열의 제 1 및 제 2 부분들 양자 모두에 상보적인 DNA 서열의 농도를 측정하는 단계를 포함한다.
실시형태 77. 실시형태 76 에서, 짧은 DNA 서열들은 표면에 결합되는, 방법.
상기의 추가적인 실시형태들은 이하에 상세히 기술된다.
응용들
여기에 개시된 디지털 분자 분석 방법, 시스템, 및 디바이스들은 다양한 필드들 및 응용들에서 유용하다. 특히, 디지털 분자 분석들은 “필드” 에서, 즉 휴대가능한 설정에서 유용할 것이다. 예를 들어, 디지털 분자 분석들은 특히 원격 영역들, (예를 들어, 폭력적 충돌에 기인하여) 서비스가 충분하지 못하거나 접근하기가 어려운 영역들, 유행병에 의해 영향을 받는 영역들에서, 및 전통적인 분석 장비 및/또는 전문가들에 대한 접근이 제한되는 다른 경우들에서, 의학적 평가 및 진단 및 병원체들의 검출에서 유용할 것이다. 그것들은 또한 병원 또는 클리닉 내에서, 또는 그것들이 포인트 오브 케어 또는 침대 곁에서 수행 또는 사용될 수 있는 가정 방문 설정에서 유용할 것이다.
디지털 분자 분석들은 수의 센터에서, 목장 또는 농장에서, 또는 테스팅이 필요한 동물들이 위치되는 임의의 장소에서에 관계없이, 내과에서와 같이 수의과 설정에서 동일하게 유용할 것이다. 그것들은 또한 병원체 또는 공생 미생물에 대한 식물 또는 토양을 테스트하거나, 관심의 다른 유전자형 및 표현형을 검출하기 위해 원예 또는 농업 응용들에서 사용될 수 있을 것이다.
디지털 분자 분석은 또한 예를 들어 박테리아, 조류, 또는 균류, 또는 이들의 독성 산물들에 의한; 석유 또는 그것의 산물 및 부산물, 및 산업 폐기물에 의한 오염에 대해 물을 테스트하는데 사용될 수 있을 것이다. 그러한 분석은 병원체, 독소, 불순물, 오염, 및 해충에 대해 테스트하는 분야 또는 처리 시설과 같은 식품 안전 테스트 및 농업적 사용을 위해 유용할 것이다.
분석
다수의 유형의 생화학적 분석이 여기에 개시된 디지털 분자 분석 형식에 적응가능하다. 예들은 항체 또는 그의 단편에 의한 항원의 포획 및 결합의 면역분석; 관심의 분석물 DNA/RNA 에 상보적인 DNA 또는 RNA 의 하나 이상의 절편이 분석물을 포획하는데 사용되는 혼성화 분석; 및 수용체, 효소, 또는 다른 단백질에 대한 결합 파트너, 또는 그 역이 파트너 분석물 (예를 들어, 단백질 또는 그의 단편) 에 대한 포획 에이전트로서 사용되는리간드 결합 분석을 포함한다.
면역분석 및 혼성화 분석이 동일한 분석물 분자, 예를 들어 항원 또는 타겟 DNA/RNA 에 대한 결합 파트너 쌍들, 예를 들어 항체들 또는 cDNA/RNA 가 사용되는 샌드위치 형식을 채용할 수 있다는 것이 인정될 것이다. 본 개시는 따라서 결합 파트너 쌍들, 예를 들어 항체들을 포함하며, 여기서 양 항체들은 동일한 분자, 예를 들어 동일한 항원에 특정적이고, 그 쌍의 하나 또는 양 멤버들은 여기에 기술된 광학 리포터 분자를 포함한다. 다수의 포획 및 리포터 엘리먼트들의 조합은 여전히 다수의 광학 리포터 분자들을 포함하면서 여전히 그 자신이 광학 리포터 분자로 지칭될 수도 있는 신호 생성 배열을 포함한다.
포획 결합 파트너들 및 검출 결합 파트너 쌍들, 예를 들어 포획 및 검출 항체 또는 뉴크레오티드 쌍들은 리포터 분자에서 사용될 수 있다. 따라서, 여기에 개시된 디지털 분자 분석이 분석물의 무표지 (label-free) 검출을 허용하지만, 일부 실시형태들에서, 통상적으로 2 개의 결합 파트너들, 예를 들어 2 개의 항체들 또는 DNA 또는 RAN 의 2 개의 서열들이 사용되는 이질성 분석 프로토콜이 사용된다. 하나의 결합 파트너는 보통 플라즈몬 나노입자와 같은 솔리드 서포트에 고정화되는 포획 파트너이고, 다른 결합 파트너는 통상적으로 다른 플라즈몬 나노입자와 같은, 부착된 검출가능한 표지를 갖는 검출 결합 파트너이다. 항체들 및 항체 쌍들은 상업적으로 이용가능하고, 또한 본 기술에서 잘 알려진 방법들에 의해 설계 및 준비될 수 있다.
리포터 분자들은 비특정적 흡착에 의해, 또는 특정적 공유 결합에 의해 리포터 표면에 부착될 수 있다. 리포터 분자들의 로딩은 준비 용액에서의 리포터 분자들의 농도에 의해 대부분 결정될 것이다. 더욱 농축된 용액들은 더 높은 밀도의 리포터 분자들을 제공하면서 동시에 2 이상의 입자들을 포함하는 리포터 분자들의 클러스터들의 카운트를 증가시킬 것이다. 이러한 후자의 효과는 결코 성공적인 동작에 치명적이지 않다: 리포터 분자들의 더 작은 클러스터들은 이하에 논의되는 곡선-피팅 기법들로 분석될 수 있는 반면, 이들 기법들에 적합하지 않는 더 큰 클러스터들은 비활성으로서 플래깅될 수 있다. 리포터 분자 카운트를 증가시키고 관리가능하게 작은 수의 리포터 분자 클러스터들을 유지하는 충돌하는 목표들을 고려할 때, 평방 미크론 당 최대 약 1 개의 리포터 분자의 로딩이 특정의 실시형태들에서 최적인 것으로 증명될 것이다. 단일-분자 검출의 경우, 픽셀 당 (광학 리포터 분자에 결합된) 하나 이하의 분석물 분자와 같은 밀도가 유용할 것이다.
샌드위치 분석을 사용하는 분석은 다단계 절차로 수행될 수 있다: 포획 분자들로 기능화된 리포터 표면이 분석물에 노출된다. 포획 분자들의 특정의 분율이 분석물 농도에 따라 분석물에 결합할 것이다. 제 2 단계에서, 리포터 표면은 검출 분자들을 갖는 용액에 노출된다. 제 1 단계에서 분석물에 결합된 그러한 포획 분자들만이 제 2 단계에서 검출 분자들에 결합할 것이다. 이러한 방법의 명확한 이점은 포획 및 검출 분자들이 결합되지 않은 포획 분자에 비교하여, 포획 분자/분석물/검출 분자 조립체로부터 산출되는 광학 신호를 최적화하도록 선택될 수 있다는 점이다.
여기에 개시된 방법들은 클리닉적으로 진단된 질병 상태와 연관된 관심의 표현형 또는 유전자형 상태를 식별하는데 사용될 수 있다. 그러한 질병 상태들은 예를 들어 암, 심혈관계 질병, 염증성 질환, 자가면역 질환, 신경 질환, 전염병 및 임신 관련 질환을 포함한다. 대안적으로, 건강의 상태들은 마커들을 사용하여 검출될 수 있다.
여기에 개시된 방법들은 유전변이를 검출하는데 사용될 수 있다. 유전 변이는 여기서 하나 이상의 치환, 역위, 삽입, 결실, 또는 뉴클레오티드 서열들 (예를 들어, DNA 및 RNA) 및 단백질 (예를 들어, 펩티드 및 단백질) 에서의 돌연변이, 하나 이상의 미세결실, 하나 이상의 희귀 대립유전자, 다형성, 단일 염기 다형성 (SNP), 역위 및 전좌와 같은 대규모 유전적 다형성, 하나 이상의 뉴클레오티드 분자 (예를들어, DNA) 의 풍부 (abundance) 및/또는 복제수에서의 차이들 (예를 들어, 유전자 복제수 변이, CNV), 삼염색체, 단염색체, 및 게놈 재배열을 포함할 수도 있지만 이들에 제한되지 않는다. 일부 실시형태들에서, 유전 변이는 암과 같은 질병의 전이, 존재, 부재, 및/또는 위험, 약동학 변동성, 약물 독성, 부작용, 재발, 및/또는 대상에서의 장기 이식 거부 반응의 존재, 부재, 또는 위험과 관련될 수도 있다. 예를 들어, HER2 유전자에서의 복제수 변화는 유방암 환자가 허셉틴 처리에 반응할지 여부에 영향을 준다. 유사하게, 임산부로부터의 혈액 내의 염색체 21 (또는 18, 또는 13, 또는 성 염색체) 의 복제수의 증가를 검출하는 것은 태어나진 않은 아이에서의 다운 증후군 (또는 파타우 증후군 또는 에드워드 증후군) 에 대한 비침습적 진단으로서 사용될 수도 있다. 추가적인 예는 수용자 게놈에 존재하지 않는 이식된 장기로부터의 대립유전자의 검출이다 - 이들 대립유전자의 빈도, 또는 복제수를 모니터링하는 것은 잠재적 장기 거부 반응의 표시를 식별할 수도 있다.
측정 디바이스 및 시스템
여기에 기술된 디지털 분자 분석 방법은 측정 디바이스 또는 시스템을 채용하며, 이들 중 어느 하나는 샘플의 분석을 위해 요구된 부분들을 포함한다. 측정 디바이스는 샘플들이 관심의 샘플의 직접적인 추가에 의해 또는 그 자신이 관심의 샘플을 포함하는 큐벳 또는 슬라이드의 삽입에 의해 도입되는 샘플 컴파트먼트를 포함한다. 샘플 컴파트먼트는 또한 그의 기능이 관심의 분석물과 결합하고 광학 신호를 생성하는 것인 리포터 분자들을 포함하는 컴포넌트를 제공한다. 방출 방법들에 의존하는 설계들의 경우, 측정 디바이스는 리포터 분자 내에 포함된 발색단의 여기를 위한 조명 디바이스를 제공한다. 측정 디바이스는 리포터 분자로부터의 광학 신호를 검출 및 기록하는 기록 디바이스 (예를 들어, 이미지 센서, 예를 들어, 디지털 카메라) 를 포함한다. 마지막으로, 측정 디바이스는 동작에 대한 제어, 분석 결과를 디스플레이하거나 리포트하기 위한 디바이스, 및 외부 컴퓨터와의 인터페이스와 같은 추가적인 컴포넌트들을 포함할 수 있다. 여러 선택적 컴포넌트들의 존재, 및 그들의 상세는 측정 디바이스의 여러 설계 간에 상이할 수도 있다.
전체로서의 시스템 또는 디바이스는 편리한 샘플 추가 또는 제거를 위해 디바이스를 배향시키기 위한 마운트를 포함할 수 있다. 시스템은 모바일 컴퓨팅 디바이스에 커플링될 수 있다. 모바일 컴퓨팅 디바이스는 스마트폰, 소형 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터, 또는 유사한 휴대용 컴퓨팅 디바이스일 수 있다. 일부 예들에서, 모바일 컴퓨팅 디바이스는 디스플레이, 프로세서, 메모리, 및 메모리에 저장되고 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 명령들과 같은 모든 필요한 컴포넌트들을 포함하여, (i) 샘플의 도입, (ii) 광학적 여기, (iii) 샘플 품질 및 최적의 노출 시간을 평가하기 위한 샘플의 광학적 사전 스크리닝, (iv) 기록 디바이스에 의한 이미지의 기록, (v) 필요한 경우, 검출기 바이어스의 감산, (vi) 검출기 신호의 디지털화, (vii) 비휘발성 메모리에의 디지털 신호의 기록, (viii) 필요한 경우, 검출기의 리사이클링, 및 (ix) 디지털 신호의 처리와 같은 단계들의 고도로 자동화된 수행을 가능하게 한다. 그 기능들은 디지털 분석의 결과를 결정하는 것, 및 엔드 유저에게 시각적 형태로 결과를 전달하는 것을 더 포함한다.
디지털 분자 분석을 위한 검출 기구로서의 스마트폰 또는 다른 모바일 컴퓨팅 디바이스의 사용은 저렴하고 휴대가능하며 다기능의 시스템이 필드에서, 즉 연구실 밖에서 분석을 수행하는 것을 허용한다. 응용들은 중앙 연구실로 샘플을 전송할 필요가 없이 바이러스 수치, 영양 상태, 질병 바이오마커, 또는 환경 오염을 측정하기 위한 포인트-오브-케어 진단 시스템을 포함할 수 있다. 그러한 테스트는 사적 거주지, 글로벌-헬스 시설, 법 집행 시설, 및 의료 클리닉에서 수행될 수 있을 것이다. 모바일 컴퓨팅 디바이스는 인터넷에 연결될 수 있으며, 이는 환자 정보 및 지리적 위치를 갖는 센서 데이터의 조합을 가능하게 할 것이다. 외부 계산 시설에 대한 연결성은 데이터 해석, 지리적 및 인구통계적 맵핑, 데이터베이스 구축 및 유지, 및 원격 의료 전문가 및 당국으로의 통지의 전달을 위해 제공될 수 있다. 소형, 필드-동작가능 디지털 측정 디바이스는 연구실 내의 훈련된 기술자들에 대한 필요로로부터 분석을 자유롭게 할 것이다. 대신에, 이들 분석은 검출 시스템의 사이즈 및 감당할 수 있는 비용으로 인해 누구나에 의해 수행될 수 있을 것이다.
바이오센서
여기에 개시된 디지털 분자 분석 시스템 또는 디바이스는 “바이오센서” 로 칭해질 수도 있는 엘리먼트들을 포함한다. 바이오센서는 케미컬의 존재를 검출하기 위해 생물학적 분자 (예를 들어, 하나 이상의 효소, 항체, 또는 뉴클레오티드 서열) 를 사용하는 디바이스이다. 많은 종류의 바이오센서가 디지털 분자 분석에서 사용될 수도 있다. 바이오센서는 통상 함께 여기에 개시된 리포터 분자를 포함하는 (종종 “바이오수용기” 로 칭해지는) 포획 컴포넌트 및 리포터 컴포넌트 (“바이오트랜스듀서”), 뿐아니라 검출기, 프로세서, 및 디스플레이를 포함하는 시스템, 및 선택적으로 신호 증폭기, 확대 레즈, 및 광원과 같은 다른 엘리먼트들로 이루어진다. 분석물과 포획 엘리먼트 사이의 상호작용 (통상적으로 결합) 은 측정가능한 물리화학적 신호를 출력하는 리포터 엘리먼트에서의 변경을 생성한다. 이러한 상호작용은 샘플 내의 타겟 분석물의 존재 또는 농도를 나타내는 신호를 생성한다.
여기에 개시된 리포터 컴포넌트는 플라즈몬 나노입자들을 포함하는 광학 트랜스듀서, 다른 국소 표면 플라즈몬 공명 (LSPR) 시스템, 플라즈몬 스캐터링 시스템, 광결정, 및 단일의 분자를 검출하고 광학 신호를 생성할 수 있는 임의의 다른 기술을 포함한다.
포획 엘리먼트는 항체 또는 그것의 단편 (Fab, Fv 또는 scFr) 또는 도메인 (VH, VHH), 또는 핵산 (관심의 분석물에 대한 상보적인 DNA 또는 RNA 의 하나 이상의 절편) 과 같은 천연의 또는 가공된 바이오분자일 수도 있다.
포획 엘리먼트는 예를 들어 기능화 및 적층 증착, 또는 매트릭스, 예를 들어 졸-겔과 같은 크세로겔 또는 하이드로겔에의 포착에 의해 리포터 엘리먼트에 부착된다. (포획 및 리포터 엘리먼트들을 포함하는) 리포터 분자가 부착되며, “리포터 표면” 으로 칭해지는 센서의 표면은 예를 들어 폴리머 또는 유리; 또는 금속으로 코팅된 또는 리포터 엘리먼트를 포함하는 금속 나노입자들 (예를 들어 금 또는 은; 티탄, 크롬, 및 구리와 같은 다른 금속이 또한 사용되었다) 을 지니는 유리일 수도 있다. 이러한 표면은 분석물이 들어가거나 통과되는 챔버 또는 흐름 셀의 적어도 하나의 벽을 따라 형성 또는 정렬된다.
플라즈몬 나노입자 바이오센서의 예에서, 챔보 또는 흐름 셀은 유리 또는 폴리머로 제조될 수도 있으며; 유리 또는 폴리머 리포터 표면은 본 기술에서 알려진 방법들을 통해 도포되는, 포획 엘리먼트로 기능화된 금 나노입자들을 지닐 수도 있다. 암 시야 현미경을 사용한 분석의 경우, 광은 리포터 표면의 평면에 직교하는, 유리 또는 폴리머 리포터 표면의 에지를 통해 전달된다.
샘플 컴파트먼트
측정 디바이스는 관심의 샘플의 도입에 적합한 샘플 컴파트먼트를 제공한다. 광학적 측정 기법들을 채용하는 측정 디바이스는 하나의 짧은 차원을 갖는 길쭉한 샘플 컴파트먼트로부터 이익을 얻을 것이다. 리포터 분자로부터 기록 디바이스로의 광학 신호를 위한 광 경로는 그 짧은 차원과 평행하게 정렬될 것이다. 이러한 배향은 더 긴 광학 경로들에 대해 문제를 발생시킬 광학 신호의 흡수 및 분산을 최소화할 것이다. 이러한 기준은 프리즘형 또는 실린더형 샘플 컴파트먼트의 사용을 허용한다.
리포터 볼륨
샘플 컴파트먼트는 리포터 분자를 포함하는, 리포터 볼륨으로 칭해지는 컴파트먼트를 포함한다. 이러한 컴파트먼트는 관심의 샘플에 리포터 분자를 부가할 필요를 제거하고, 대신 리포터 분자의 리사이클링을 가능하게 할 것이다. 더 중요하게는, 리포터 분자는 실질적으로 고정적 배열로 유지되어, 비활성 리포터 분자가 측정 디바이스의 사용 이전에 식별 및 기록될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 리포터 볼륨은 그 자신 안에 리포터 분자를 보유하는 물리적 인클로져에 의해 정의된다. 그 물리적 인클로져는 리포터 분자와의 접촉을 위해 리포터 볼륨 내로의 분석물의 통과를 허용하도록 다공성일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 볼륨은 물리적 인클로져에 의해 정의되지 않고; 대신에 다른 수단이 리포터 볼륨 내에 리포터 분자를 보유하고 리포터 분자를 고정적으로 유지하기 위해 제공될 수 있다.
특정의 실시형태들에서, 리포터 분자는 3차원 서포트와 연관된다. 하나의 설계에서, 리포터 분자는 3차원 서포트에 공유 결합된다. 대안적으로, 리포터 분자는 3차원 서포트에 공유 결합되지 않고 3차원 서포트로부터의 확산을 방해하는 방식으로 3차원 서포트에 함침된다. 그러한 설계에서, 리포터 분자는 3차원 서포트에 실질적으로 트래핑되고, 고정적이다.
리포터 볼륨은 바람직하게는 리포터 분자에 대한 광학 통로에 수직인 차원에서 좁을 것이다. 이러한 지오메트리는 중요한 이점을 제공한다: 제 1 리포터 분자로부터의 광학 통로는 기록 디바이스에 도달하기 전에 제 2 리포터 분자와 만나기 쉽지 않다. 이것은 도 11 에 도시되어 있다. 좁은 리포터 볼륨은 오른쪽에 기록 디바이스, 및 리포터 볼륨 내의 리포터 분자의 불균일한 배열을 갖는 도 11(a) 에 도시되어 있다. 이러한 지오메트리에서, 리포터 분자들로부터 기록 디바이스로의 광학 경로들은 잘 분리되어 있다. 대조적으로, 넓은 리포터 볼륨이 도 11(b) 에 도시되어 있다. 이러한 지오메트리에서, 적어도 하나의 리포터 분자는 제 2 리포터 분자와 중첩한다. 이러한 중첩은 2 가지 이유로 바람직하지 않다: (a) 제 2 리포터 분자는 제 1 리포터 분자로부터의 신호를 부분적으로 재흡수할 수 있어서, 에러를 발생시킬 수 있고, (b) 리포터 분자로부터의 자유롭고 결합된 신호의 정확한 측정을 요구하는, 비활성 리포트 분자의 식별은 더 복잡하게 만들 것이다.
광학 경로들이 중첩하는 정도는 리포터 분자의 특정의 분포 (램덤, 반랜덤, 집성됨, 질서를 가짐), 리포터 분자의 농도 및 유효 크기, 및 리포터 볼륨의 두께를 포함하여, 리포터 볼륨을 정의하는 적은 수의 파라미터들로부터 추정될 수 있다. 본 개시의 특정의 실시형태들에서, 리포터 분자와 기록 디바이스 사이의 실질적으로 모든 광학 경로들은 다른 리포터 분자와 만나지 않는다. 특정의 실시형태들에서, 리포터 분자와 기록 디바이스 사이의 실질적으로 모든 광학 경로들은 많아야 하나의 다른 리포터 분자와 만난다.
일부 실시형태들에서, 리포터 볼륨은 충분히 얇아서 리포터 분자에 대한 단일의 층을 허용한다. 이러한 설계에서, 도 12(a) 에 도시된 바와 같이 모든 리포터 분자들은 실질적으로 광학 경로에 대해 수직이고 기록 디바이스에 평행한 평면에 있기 때문에, 광학 경로들의 중첩은 가능하지 않다. 표면 활성 분자의 사용과 같은 여러 단일층 기법들이 그러한 시스템을 획득하기 위해 사용될 수 있다. 표면 활성 분자들의 가교는 리포터 분자를 고정적으로 만들 수 있다. 리포터 표면의 논의는 이하에 상세히 제시된다.
상이한 리포터 분자들의 광학 경로들에 대한 가장 가까운 접근의 바람직한 거리는 (하나의 분자의 광학 경로가 제 2 분자를 관통하는지 여부를 결정할 수 있는) 리포터 분자들의 크기 뿐아니라 검출기의 공간 분해능, 및 특히 픽셀 크기에 의해 결정된다. 이상적으로, 각 리포터 분자는 가장 쉽게 비활성 리포터 분자들을 식별하고 활성 리포터 분자들로부터의 광학 신호를 관찰하기 위해 적어도 임의의 이웃 리포터 분자로부터의 픽셀에 의해 분리될 것이다. 더욱이, 기록 디바이스로 진입하는 광학 경로들의 발산에 따라, 훨씬 더 큰 분리가 바람직할 수도 있다. 도 12(b) 에 이것이 도시되며, 그에 대해 리포터 볼륨과 기록 디바이스 사이의 거리는 명확성을 위해 증가되었고, 그것에 대해 기록 디바이스로 진입하는 광학 신호의 작지만 비제로의 발산. 리포터 분자가 물리적으로 서로 중첩하지 않을지라도, 가깝게 이격된 리포터 분자들로부터의 광학 신호는 잠재적으로 중첩할 수 있다.
상이한 리포터 분자들의 광학 경로들 사이의 중첩을 최소화하기 위해, 리포터 분자의 응집을 최소화하거나, 역으로 리포터 분자 사이의 분리를 증가시키는 특징 및 기법이 이로울 것이라는 것이 분명할 것이다. 일 실시형태에서, 개별 리포터 분자는 마이크로구 또는 마이크로입자, 또는 나노입자와 같은 더 큰 입자에 커플링될 것이다. 더 큰 입자에의 리포터 분자의 커플링은 더 큰 입자의 크기에 기인하여 리포터 분자 사이의 평균 거리를 증가시키는 경향이 있다. 이것은 도 12(c) 에 도시되며, 여기서 리포터 분자 (3) 는 더 큰 입자 (5) 에 또는 그것 안에 부착된다.
리포터 표면
특정 실시형태들에서, 샘플 컴파트먼트는 리포터 분자의 부착을 위한 리포터 표면을 포함한다. 리포터 표면은 리포터 분자에서 기록 디바이스로의 광학 경로를 최소화하기 위해 길쭉한 샘플 컴파트먼트의 가장 짧은 치수에 직각으로 배향된다. 리포터 분자의 이러한 배열은 솔리드 서포트에 대한 리포터 분자의 용이한 부착을 허용하고, 또한 좁은 리포터 볼륨을 제공하며, 이는 상기 논의된 이유로 유리하다.
리포터 표면은 리포터 분자에 의해 생성된 신호에 실질적으로 투명한 윈도우 반대쪽으로 배향된다. 투명한 리포터 표면은 암 시야 현미경에 적합한 도파관과 접촉할 수 있다. 특정 실시형태들에서, 리포터 표면은 금속층을 포함한다. 추가의 특정 실시형태들에서, 금속 층은 표면 플라즈몬 공명에 적합하다. 리포터 표면 및 투명 윈도우는 프리즘형 샘플 컴파트먼트의 2 개의 단부면에, 또는 대안적으로 원통형 샘플 컴파트먼트의 2 개의 단부면에 위치 될 수있다. 특정 실시형태들에서, 단부면들은 평행하고 근위이며, 분석 슬라이드 또는 분석 칩을 근사화하거나 형성한다.
리포터 분자
측정 디바이스 및 시스템은 다양한 리포터 분자를 포함하고, 본원에 개시된 방법은 다양한 리포터 분자를 사용한다. 일 실시형태에서, 단일 유형의 리포터 분자가 사용되며, 이는 다양한 농도의 분석물에 대해 잘 작용하는 결합 반응을 제공할 것이다. 대안적으로, 동일한 분석물에 대해 상이한 친화도를 갖는 둘 이상의 상이한 리포터 분자가 사용될 수 있으며, 이는 하기에 보다 상세히 기술되는 바와 같이 단일 유형의 리포터 분자를 갖는 측정 디바이스보다 더 넓은 범위의 분석물 농도를 수용 할 수있다. 특정 실시양태에서, 상이한 분석물에 대한 친화도를 갖는 둘 이상의 상이한 리포터 분자가 제공된다.
리포터 분자는 발색단을 포함 할 수있다. 특정 실시형태에서, 발색단은 리포터 분자에 공유적으로 부착되고; 대안적으로, 이는 기능화를 통해 리포터 분자, 예를 들어 퀀텀 도트 또는 플라즈몬 나노 입자의 표면에 부착 될 수 있다. 특정 실시형태에서, 발색단은 전자기 방사선을 흡수한다. 특정 실시형태에서, 발색단은 가시 및 자외선으로부터 선택된 스펙트럼 영역에서 전자기 방사선을 흡수한다. 대안적으로, 발색단은 전자기 방사선을 산란시킬 수도 있다. 특정 실시형태에서, 발색단은 발광성이다. 특정 실시형태에서, 발색단은 형광성이다. 특정 실시형태에서, 발색단은 인광성이다.
본 개시의 특정 실시형태에서, 리포터 분자는 각각 분석 물의 결합시 광학 신호를 제공하는 발색단을 포함 할 수도 있다. 광학 신호는 흡수 대역의 흡광 계수의 변화, 흡수 대역의 λmax 의 변화, 방출 대역의 퀀텀 수율의 변화, 방출 대역의 형광 이방성 변화, 특정 파장 위 또는 아래의 스펙트럼 중심에서의 시프트, 최대 강도의 파장 (λmax), 신호의 크기 또는 강도의 변화, 밝기의 증가 또는 감소, 신호의 형상의 변화, 스펙트럼 대역의 존재 또는 부재; 및 스펙트럼의 형상의 변화일 수도 있다.
본 개시의 특정 실시형태에서, 광학 신호는 분석물과 발색단 사이의 상호 작용에 의해 야기된다. 특정 실시형태에서, 광학 신호는 분석 물질과 리포터 분자의 결합에 의해 간접적으로 야기된다. 특정 실시형태에서, 리포터 분자에 의한 분석물의 결합은 발색단의 흡수 또는 방출 특성에 영향을 미치는 입체 형태 변화를 유도한다. 특정 실시형태에서, 리포터 분자에 의한 분석물의 결합은 분석물상의 발색단과 리포터 분자상의 발색단 사이의 상호 작용을 유도한다.
본 개시의 특정 실시형태에서, 리포터 분자는 2 개의 발색단을 포함한다. 특정 실시형태에서, 리포터 분자에 의한 분석물의 결합은 2 개의 발색단 사이의 비 방사성 상호 작용을 증가시키는 리포터 분자의 기하학적 변화를 유도한다. 특정 실시형태에서, 리포터 분자에 의한 분석물의 결합은 2 개의 발색단 사이의 비 방사성 상호 작용을 감소시키는 리포터 분자의 기하학적 변화를 유도한다. 특정 실시형태에서, 비 방사성 상호 작용은 형광 켄칭이다. 특정 실시형태에서, 비 방사성 상호 작용은 형광 에너지 전달이다. 특정 실시형태에서, 비 방사성 상호 작용은 인광 에너지 전달이다. 특정 실시형태에서, 비 방사성 상호 작용은 플라즈몬 커플링된 공명 에너지 전달이다.
특정 실시형태에서, 발색단은 플라즈몬 나노 입자 및/또는 퀀텀 도트이다. 플라즈몬 나노 입자 및/또는 퀀텀 도트는 포획 엘리먼트를 지니도록 기능화 될 수도 있다. 포획 엘리먼트가 항체, 뉴클레오티드, 펩티드 또는 이의 단편과 같은 생물학적 분자인 경우, 발색단-포획 엘리먼트는 광학 리포터 분자 및 바이오 센서가 된다. 항원 또는 상보적 뉴클레오티드와 같은 분석물과의 접촉 (예를 들어, 결합) 은 전자 이동, 에너지 전달, 플라스몬 공명, 및 입자의 질량 및 이동도의 변화와 같은 영향으로 인해 나노 입자의 스펙트럼 특성의 변화를 유도하는 질량을 변화시킨다.
비활성 리포터 분자
본원에 기술된 방법은 비활성인 리포터 분자의 특정 분율을 수용하며, 즉, 이들 비활성 리포터 분자로부터의 광학 신호는 존재하지 않거나 대부분의 리포터 분자들과 실질적으로 상이하다. 이 행동은 리포터 분자가 분석물에 결합하지 못했기 때문 일 수 있다. 대안적으로, 리포터 분자는 분석물에 결합할 수 있지만 광학 신호를 생성하지 않거나, 나머지 광학 분자와 실질적으로 상이한 광학 신호를 생성한다.
특정 실시형태에서, 시스템은 리포터 분자로서 나노 입자를 사용한다. 나노 입자는 다른 나노 입자와의 응집 시 비활성화될 수 있다.
본 개시의 특정 실시형태에서, 비활성 리포터 분자는 응집 된 개별 단백질 (항체 포함), 올바르게 접히지 않은 펩티드 또는 단백질, 잘못된 잔기를 포함하는 펩티드 또는 단백질, 결함 발색단을 포함한다.
비활성 리포터 분자의 수는 측정 디바이스의 동작 수명 동안, 특히 비활성 리포터 분자에 결함성 조성물을 갖는 경우 실질적으로 일정하게 유지 될 수 있다. 또한, 리포터 분자의 화학적 열화, 특히 광원에의 반복된 고강도 노출에 의해 야기되는 광 화학적 열화, 또는 리포터 분자의 일부를 형성하는 단백질의 응집으로 인해, 측정 디바이스의 작동 수명 동안 비활성 분자의 수가 증가할 것이다.
비활성 리포터 분자는 광학 거동의 변화에 의해 식별 될 수 있다: 분석물 분자에의 노출 시 광학 신호를 생성하지 못하는 것, 또는 대부분의 리포터 분자와 상당히 다른 분석물 분자에의 노출시의 광학 신호의 생성.
특정 실시형태에서, 복수의 리포터 분자는 랜덤으로 분포된다. 특정 실시형태에서, 복수의 리포터 분자는 리포터 분자의 집합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 복수의 리포터 분자는 하나 이상의 차원에서 규칙적인 기하학적 순서를 포함한다. 특정 실시형태에서, 각각의 리포터 분자는 다른 리포터 분자가 위치하지 않는 배제 구역과 관련된다.
기록 디바이스 및 현미경
리포터 분자로부터의 광학 신호를 기록하기 위해 기록 디바이스가 제공된다. 특정 실시형태에서, 리포터 분자로부터의 광학 신호는 샘플 컴파트먼트의 투명한 창을 통과한다. 특정 실시형태에서, 기록 디바이스는 카메라와 같은 이미지 센서일 것이다. 예를 들어, CMOS (complementary metal-oxide semiconductor) 카메라는 각 픽셀을 개별적으로 읽을 수 있기 때문에 유용하다; 또한 CMOS 카메라는 전력을 거의 소비하지 않으므로 필드에서 디바이스의 일부로 사용될 때 더 오래 지속될 수 있다. 거의 모든 스마트 폰 카메라는 10 메가 픽셀 이상의 해상도를 가진 CMOS 카메라가 있어 여기에 개시된 방법, 시스템 및 디바이스에 유용하다.
본 개시의 특정 실시형태에서, 기록 디바이스는 샘플 컴파트먼트로부터의 하나 이상의 신호의 관찰을 허용한다. 특정 실시형태에서, 복수의 신호 각각은 샘플 컴파트먼트의 상이한 영역으로부터 기원한다. 특정 실시형태에서, 복수의 신호의 각각의 신호는 샘플 컴파트먼트에 걸쳐있는 규칙적인 기하학적 그리드의 픽셀로부터 기원된다.
특정 실시형태에서, 기록 디바이스의 픽셀은 직사각형 또는 정사각형 배열로 배열된다. 특정 실시형태에서, 기록 디바이스의 픽셀은 512 x 512 정사각형 배열, 1024 x 1024 정사각형 배열, 2048 x 2048 정사각형 배열 또는 4096 x 4096 정사각형 배열로 배열된다. 특정 실시형태에서, 각 픽셀로부터의 신호는 다른 모든 픽셀과 별도로 기록된다. 특정 실시형태에서, 2 x 2 세트의 픽셀로부터의 신호는 함께 비닝된다.
측정 디바이스는 복수의 리포터 분자의 상이한 영역으로부터의 복수의 신호의 관찰을 허용할 수 있다. 추가의 특정 실시형태에서, 복수의 리포터 분자의 상이한 영역은 규칙적인 그리드에 배치된다. 대안적으로, 실질적으로 모든 리포터 분자로부터의 개별 광학 신호는 임의의 다른 리포터 분자로부터의 간섭없이 관찰될 수 있다.
특정 실시형태에서, 기록 디바이스는 개별 픽셀 및/또는 개별 리포터 분자를 포획할 수 있다. 포획 엘리먼트가 기능화되는 기판으로서 플라즈몬 나노 입자/퀀텀 도트의 사용은 이러한 검출을 용이하게 한다. 기록 디바이스는 확대 렌즈와 함께 사용하여 훨씬 더 작은 신호를 검출할 수 있다. 이러한 렌즈는 당분야에 잘 공지되어 있다.
기록 디바이스는 리포터 분자/분석물 복합체의 검출 및 정량화를 위해 당 업계에 공지된 임의의 기술을 사용할 수 있다. 기록 디바이스는 리포터 분자 설계와 쌍을 이루는 광 흡수 및 방출 방법을 사용할 수 있다.
기록 디바이스는 광 흡수 측정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 리포터 분자와 결합하는 것은 분석물의 존재하에 착색된 생성물을 생성하는 효소-결합 면역 흡착 분석 (ELISA) 과 결합 될 수 있다. ELISA 가 플라즈몬 나노 입자 또는 양자점 상에 기능화될 때, 분석물의 존재 및 양은 예를 들어 흡수 특징의 파장, 강도 등에 의해 리포트될 것이고; 벌크 신호와 반대로 각각의 나노 입자로부터 신호를 생성할 것이다.
대안적으로, 광학적 출력은 리포터 분자상의 또는 광원에 의해 여기되는 리포터 분자와 결합된 형광단으로부터의 형광 방출을 포함할 수 있다. 분석물의 존재 및 양은 그 후 형광 방출의 강도에 의해 보고될 것이다. 형광단은 형광 방출이 향상되도록 광결정과 같은 표면에 근접할 수 있다. 형광 신호를 바람직한 결과로 조정하기 위해 다수의 형광 단이 사용될 수 있다. 따라서, 광학 신호는 둘 이상의 형광단들 사이의 여기 전달에 의해 변조될 수 있다.
형광 및 인광 퀀텀 수율, λmax 시프트, 이방성이 본 개시에서 예상된다. 이방성 측정을 위해, 편광기는 여기 또는 방출 광학 경로 또는 둘 다에 도입 될 수 있다. 광원은 방출 방법과 결합 될 수있다. 광원은 종래의 광대역 소스, 발광 다이오드, 또는 레이저일 수 있으며, 여기를 최적화하기 위해 직접 또는 격자와 같은 파장 선택 디바이스를 통해 샘플로 전달될 수 있다. 광은 도파관을 통합하고 리포터 표면의 베이스를 형성하는 내부 전반사 컴포넌트를 통해 지향되어, 암시야 여기를 제공할 수 있다.
[024] 일부 실시형태에서, 광학 분석 매체는 표면 강화 라만 산란 (SERS)을 위해 구성된 표면을 포함할 수 있다. 따라서, 광학 출력은 SERS 표면상의 리포터 분자에 의한 광원의 라만 산란을 포함할 수 있다. 분석물의 존재 및 양은 그 후 라만 산란의 강도에 의해 보고될 것이다.
비활성 리포터 분자의 식별
본원에서 "식별 방법"으로 불리는 비활성 리포터 분자를 식별하는 방법이 제공된다. 특정 시스템의 경우, 첫 번째, 분석물이 없는 용액과 두 번째, 고농도의 분석물을 갖는 용액의 2 개의 용액이 리포터 표면과 순차적으로 접촉될 것이다. 이들 두 용액은 각각 리포터 분자에 의한 분석물 결합의 부재 및 리포터 분자에 의한 분석물 결합의 거의 포화를 야기할 것임을 이해할 것이다. 이미지는 기록 디바이스를 사용하여 기록되고, 무 분석물 및 분석물-포화 조건들에 대한 이미지들 사이에 비교가 행해진다. 선택성 기준을 충족하지 않는 리포터 분자는 비활성으로 표시된다.
나노 입자 응집으로 인한 비활성화의 경우, 비활성 리포터 분자의 식별은 간단할 것이다. 응집체의 형성은 기록 장치로부터의 이미지의 육안 검사에서 명백할 것이며, 위에서 설명된 "무 분석물" 및 "분석물-포화" 절차를 요구하지 않을 것이다.
식별 방법은 측정 장치에서 리포터 분자의 위치에 대한 기록을 유지한다. 리포터 분자의 위치는 예를 들어 측정 장치의 적절한 기하학적 그리드 또는 기록 장치의 픽셀 좌표에 대한 x/y 좌표로 참조될 수 있다. 비활성 리포터 분자의 기록은 비 휘발성 컴퓨터 메모리에서 유지될 수 있다.
식별 방법은 리포터 분자를 비활성으로 태깅하는 기준을 제공할 것이다. 기준은 측정 장치에 대한 특정의 정확도 및 감도 요건들에 대해 충분히 높은 카운트의 리포터 분자를 유지하면서 열악하게 거동하는 리포터 분자를 사용하지 않는 것 사이의 균형을 유지하도록 설정된다. 바이어스를 제거하고 자동 태깅을 가능하게 하기 위해, 관찰되는 광학 신호의 유형에 기초하여, 수치 임계값을 선택할 수 있다. 단지 예로서, 특정 리포터 분자는 분석물 분자와 결합 시 방출 λmax 의 시프트, 및 이러한 예에서 대부분의 화합물에 대해 20 나노미터 (nm) 만큼 λmax 시프트들을 겪을 수도 있다. 이 특정 예에 대해 5 nm 시프트의 임계값이 선택될 수 있다.
정확성 및 감도에 대한 요건을 만족시키기 위해, 특정 분율의 리포터 분자를 배제하기 위해 수치 임계값을 선택할 수 있다. 앞의 예를 참조하면, 12 nm 의 λmax 시프트가 리포터 분자의 95 %에 대해 관찰될 수도 있다. 12 nm 의 임계값 λmax 가 그 후 리포터 분자의 95 %를 활성으로 유지하고, 리포터 분자의 5 % 를 비활성으로서 폐기하기 위해 선택될 수도 있다.
비활성 상태를 할당하기 위해 다양한 기준이 적용될 수 있다. 중요하게는, 리포터 분자를 비활성으로 할당하기 위해 임의의 기준이 선택될 수 있다. 임의의 하나의 리포터 분자의 결합은 다른 모든 리포터 분자와 무관하기 때문에, 활성 리포터 분자들의 풀에서의 리포터 분자의 제거는 나머지 분자의 거동에 영향을 미치지 않는다.
지시된 경우, 전술한 식별 방법은 측정 장치의 작동 수명 동안 주기적으로 반복될 수 있다. 이러한 프랙티스는 시간이 지남에 따라 성능이 저하될 수 있는 리포터 디바이스에 특히 유용할 것이다. 이상적으로, 식별 방법은 측정 장치가 모든 필요한 단계를 자동으로 수행하므로 최소량의 조작자 개입을 요구할 것이다. 나노 입자 기반 리포터 분자의 경우, 이미지를 주기적으로 기록할 수 있으며, 시간이 지남에 따라 발생할 수 있는 임의의 응집을 패턴 매칭 소프트웨어로 식별 할 수 있다.
식별 방법은 또한 측정 장치에 중간 농도의 분석물을 함유하는 하나 이상의 용액을 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 다양한 리포터 분자 포화가 예상되는 분석물의 정량적 측정에 특히 중요할 것이다. 다양한 분석물 농도에 걸친 여러 솔루션을 사용하여, 광학 리포팅 데이터와 분석물의 농도를 더 잘 일치시키기 위해 교정 곡선을 구성할 수 있다.
리포터 분자의 필드로부터의 공간적으로 분해된 신호의 사용으로부터의 주요 이점은 특히 문제가 되는 기록 장치의 영역이 그와 같이 플래깅될 수 있고 후속 분석에서 폐기될 수 있다는 것이다. 이것은 비활성 리포터 분자, 즉 부적절하게 접힌 항체의 경우뿐만 아니라 어려움을 제시하는 임의의 지역의 경우도 포함한다. 이것은 두 개 이상의 밀접하게 이격된 리포터 분자, 또는 무슨 이유든간에 자유 및 결합 상태가 잘 구분되지 않는 리포터 분자로부터의 중첩 스폿들을 포함할 수도 있다. 각각의 개별 리포터 분자의 결합은 다른 모든 리포터 분자와 독립적이며, 작은 세트의 광학 신호를 폐기하는 것은 감도에만 약간 영향을 미치면서 정확도 또는 정밀도를 향상시킬 수 있다.
정확도 / 정밀도 / 감도
개시된 디지털 측정 방법에 대한 정확도는 적어도 종래의 아날로그 방법에 대한 것 만큼 양호할 것으로 예상된다. 디지털 측정 방법은 정의상 낮은 정확도의 소스인 오류의 수개의 소스들을 최소화하거나 제거할 것이다. 예를 들어, 하나의 에러 소스는 비활성인 리포터 분자로부터 발생한다: 이들은 분석물 분자에 결합하지 않거나 분석물 분자에 결합하고 예상되는 광학 신호를 제공하지 않는다. 어느 상황이나, 고려되지 않으면, 관찰된 신호가 예상보다 낮기 때문에 분석물 농도의 추정에 오류를 도입한다.
개시된 디지털 측정 방법에 대한 정밀도는 적어도 종래의 아날로그 측정에 대한 것 만큼 양호할 것으로 예상된다. 전체 리포터 분자로부터의 벌크 신호를 관찰하는 종래의 방법은 모든 경우가 아니라 대부분의 경우에 다양한 통계적 및 수치적 방법을 사용하여 정밀한 추정들을 제공할 수 있다.
발색단을 포함하는 리포터 분자의 집합을 포함하는, 도 3 에 도시된 것과 같은 시스템을 고려하자. 벌크 신호의 관찰된 스펙트럼 시프트는 모든 시프트 (존재하는 경우) 의 평균일 것이며, 작은 분석물 농도에 대해서는 상당히 작을 수도 있다. 이러한 시프트는 특히 각 발색단을 둘러싼 상이한 미세 환경으로 인해 곡선이 넓어지는 것을 고려하여, 식별하기가 어려울 수도 있다.
대조적으로, 디지털 분자 분석을 사용하고, 각각의 리포터 분자에 대한 스펙트럼 시프트들을 관찰하면, 자유 리포터 분자는 제로 시프트를 디스플레이하는 반면, 결합된 리포터 분자는 풀 (full) 시프트를 디스플레이할 것이다. 여기에는 중간 상태는 없다. 당연히, 모든 발색단이 동일한 값만큼 시프트하지는 않을 것이지만, 예상 값과 범위는 필드에서 사용하기 전에 결정될 수 있다. 이상치를 갖는 리포터 분자는 비활성으로 폐기될 수 있다.
개시된 디지털 방법에 대한 신호대 잡음은 적어도 종래의 방법 만큼 양호할 것이다. 벌크 검출의 경우, 더 작은 농도의 분석물은 더 약한 벌크 신호를 야기할 것이다. 디지털 검출의 경우, 더 작은 농도의 분석물은 각각 동일한 강도 또는 값을 갖는 더 적은 수의 이산 신호를 야기할 것이다.
곡선 피팅
도 8 에 시뮬레이션으로서 도시되어 있는, 이산 리포터 분자에 대한 개별 신호는 신호대 잡음비를 향상시킬 수 있는 곡선 피팅 기법들에 적합하다. 각각의 활성 리포터 분자로부터의 신호는 (도 8 의 곡선에 대응하는) 이상화된 무잡음 곡선이 리포터 분자의 사전 지식에 기초하여 구축될 수 있는, 스펙트럼의 두 영역 중 어느 하나에 속할 것이다. 각각의 리포터는 오로지 자유롭거나 결합될 수 있기 때문에, 리포터 분자로부터의 관찰된 신호는 자유 또는 결합으로 할당될 수 있다. 이는 관찰된 신호를 모델링하기 위해 다양한 비율로 두 개 이상의 상태들로부터의 신호의 중첩이 수용되어야 하는 많은 곡선 피팅 애플리케이션들과 대조적이다.
곡선-피팅의 일 예가 도 13 에 도시된다. 회색으로 표시된 두 신호로부터의 방출이 합산되고, 순 관찰 신호를 형성하기 위한 "잡음" 의 시뮬레이션션 추가가 흑색으로 표시된다. 신호들은 도 7 에 제시된 것들과 유사하고, 도 12 의 수직 점선은 도 8 에 대해 논의된 500 nm 에서의 무 분석물 및 분석물-결합 리포터 분자의 동일한 묘사에 대응한다. 곡선 피팅 기법은, 관찰된 신호가 주어지면, 전체 신호를 제공하기 위해 결합한 개별 신호들을 추정할 수 있다. 적은 수의 잘 분리된 개별 신호를 포함하는 관찰된 신호는 곡선-피팅의 높은 정확도와 정밀도를 갖는 곡선-피팅을 사용하여 평가될 수 있다. 또한, 결합의 디지털 특성, 즉 리포터 분자가 분석물에 결합되거나 분석물이 없는 것 때문에, 단일 리포터 분자는, 가능한 중간 상태 없이, 분석물-결합 및 무 분석물 상태들에 대응하는 두 가지 가능한 신호들 중 하나만을 제공할 수 있다. 도 12 에 도시된 예에서, 관찰된 신호는 분석물-결합 및 무 분석물 리포터 분자에 상응하는 두 개의 리포터 분자, 500 nm 아래의 방출을 갖는 하나, 및 500 nm 위의 방출을 갖는 다른 하나에 명백하게 기인할 수 있다. 이 실험의 디지털 특성은 곡선 피팅 프로세스를 실질적으로 단순화할 것이다.
또한, 곡선-피팅 기법의 사용은 그의 광학 신호들이 공간적으로 분해될 수 없는 둘 이상의 리포터 분자를 취급하는데 유리한 것으로 입증될 수 있다. 그의 신호들이 서로로부터 분해될 수 없는 두 개의 리포터 분자의 경우, 네 가지 상태가 가능하다: (a) 결합된 양 수용체들; (b) 자유로운 양 수용체들; 및 (c) & (d) : 자유로운 하나의 리포터 (마지막 두 상태는 유사하지만 반드시 동일하지는 않은 광학 신호를 가질 것으로 예상될 수 있음). 이 상황은 반드시 단일 리포터 분자보다 더 복잡하다; 그러나, 그것은 벌크 샘플로부터의 광학 신호와 비교할 때 여전히 매우 관리가능하다.
곡선-피팅 방법은 그의 광학 신호가 공간적으로 부분적으로 분해되는 2 개 이상의 리포터 분자를 취급하는데 사용될 수 있으며, 즉 2 개 이상의 리포터 분자로부터의 광학 신호가 다수의 픽셀에 걸쳐 불균등하게 확산된다. 이 시나리오는 특히 미세하게 이격된 픽셀들을 갖는 기록 디바이스의 경우, 두 개 이상의 리포터 분자로부터의 정확한 공간적 중첩보다 더 일반적일 것으로 예상될 수 있다. 이 시나리오는 단일 픽셀로부터의 단일 스펙트럼 (또는 밀접하게 이격된 픽셀들의 집합으로부터의 합산 스펙트럼) 이 아니라, 대신 (부분적으로 중첩하는) 스폿들에 대한 프로파일들과 결합된, 밀접하게 이격된 픽셀들의 집합으로부터의 개별 스펙트럼을 집합의 곡선 피팅으로부터 이익을 얻을 수 있다.
결합 등온선
결합된 리포터 분자의 카운트와 "결합 등온선"으로 알려진, 분석물의 농도 사이의 관계는 복잡하고 간접적이다. 간단히 말해서, 결합된 리포터 분자/총 리포터 분자의 비율은 유리 분석물의 농도가 증가함에 따라 점근적으로 1 로 증가한다. (일반적으로, 분석물은 훨씬 더 작은 농도의 리포터 분자와 비교하여 과잉으로 존재하며, 따라서 유리 분석물 농도와 총 분석물 농도는 대략 동일하다. 이 근사화가 본 논의 전체에 걸쳐 사용될 것이다.) 더 높은 친화도 리포터 분자가 임의의 주어진 분석물 농도에서 더 높은 비율의 분석물 분자에 결합할 것이다. 중요하게는, 총 리포터 분자 농도는 활성 리포터 분자만을 지칭한다.
도 14 에는 2 개의 결합 등온선 곡선이 도시되어 있다. 가로 축은 분석물 농도에 해당하고 세로 축은 결합/총 리포터 분자의 비율에 해당한다. 곡선은 임의의 주어진 분석물 농도에서 결합/총 리포터 분자 비율을 결정하는 2 개의 결합 등온선을 나타낸다. 각각의 곡선에 대해, 분석물 농도가 증가함에 따라 그리고 리포터 분자가 포화에 가까워 짐에 따라, 즉 대부분의 모든 리포터 분자가 분석물 분자에 결합함에 따라 결합/총 수용체 비가 점근적으로 1 에 접근한다. 상부의 짙은 곡선은 더 높은 친화도 리포터 분자에 상응하고, 하부의 곡선은 더 낮은 친화도 리포터 분자에 상응한다. 분석물에 대한 리포터 분자의 친화도는 상이한 범위의 분석물 농도에서 분석물을 정량화하는 것의 편리함에 있어서 큰 역할을 할 것임이 명백할 것이다.
도 14 에서, 세로축 (리포터 분자의 결합/총 비율) 은 종속 변수이고, 결합/총 비율은 분석물 농도에 의존하기 때문에 분석물 농도는 독립 변수이다. 분석 목적으로, 그래프는 반대로 사용된다; 즉, 결합/총 비율은 실험에서 얻어지고 세로 축에 위치된다. 그래프 및 결합 등온선 곡선으로부터, 상응하는 유리 분석물 농도는 수평 축에서 발견된다. 시각적으로, 이 과정은 y 축상의 관찰된 결합/총 비율로부터 등온선 곡선으로 수평선을 그리고, x 축으로 수직선을 떨어뜨려, 분석물 농도를 찾음으로써 이해될 수 있다. (실제로, 이 프로세스는 수학적으로 또는 수치적으로 수행된다; 그러나 오류 분석은 여전히 유효하다.)
도 15 는 약 0.10 의 유리 분석물 농도를 갖는 샘플에 해당하며, 이는 약 0.72 의 결합/총 비율에 해당한다. 이 조건은 결합 등온선에 솔리드 원으로 표시된다. 수직 축에서의 결합/총 비율에 대한 0.72 의 "올바른" 결정은 결합 등온선으로 수평으로, 수평 축으로 아래로 트레이싱된다. 이 과정은 두 개의 검은 색 화살표로 표시된다. 결합/총 비율을 약 5 % 만큼 하향 추정한 결과는 두 개의 회색 화살표로 표시되며, 대응하는 회색 원이 결합 등온선상에 있다.
도 16 은 약 0.92 의 결합/총 비율에 대응하고, 다시 결합 등온선에 솔리드 원으로 표시되는, 약 0.40 의 더 높은 유리 분석물 농도를 갖는 샘플에 해당한다. 앞의 예와 같이 올바른 결정은 두 개의 검은 색 화살표로 표시된다. 결합/총 비율을 5 % 만큼 하향 추정하면 다시 회색 화살표와 회색 원으로 표시된다. 이 예에서, 결합/총 비율의 5 % 하향 추정은 분석물 농도에서의 약 40 % 의 실질적인 오차를 초래한다. 도 15 및 도 16 사이의 거동에서의 차이는　 이들 2 개의 그래프에 도시된 2 개의 스폭들에서의 결합 등온선 그래프의 상이한 기울기에 기인하고, 이러한 오차 전파는 결합 등온선 곡선이 더 평평한 더 높은 농도의 분석물에서 더 심각할 것이다.
분석물의 정량화를 위해 분자 결합을 이용하는 분석 디바이스는 또 다른 오류의 원인에 영항받기 쉽다: 많은 경우에, 모든 리포터 분자가 분석물의 결합에 대해 활성인 것은 아니다. 이는 상기 약술된 바와 같이, 추정된 분석물 농도에서 실질적인 오차로 전파될 수 있는 결합/총 비율의 추정에서 오차를 유발한다.
예를 들어, 리포터 분자의 10 % 가 비활성인 측정 디바이스를 고려하라. 리포터 분자의 포화는 예상된 최대 신호의 90 % 만 생성할 것이며, 이는 리포터 분자의 10 % 가 (분석물과의 결합 실패 또는 수용체/분석물 복합체의 광학 신호 생성 실패에 기인하여) 광학 신호를 제공하지 못하기 때문이다. 도 15 및 도 16 의 검사는 특히 더 높은 분석물 농도에서 측정에 도입될 실질적인 오차를 나타낼 것이다. 어느 정도까지, 이러한 오차는 포화 상태에서 측정 디바이스를 사전 스크리닝하여 최대 신호를 추정하여 향후 측정을 위한 벤치 마크로 사용되도록 다루어질 수 있다. 그러나, 완전 포화가 결코 달성될 수 없으므로 이러한 절차는 이상적이지 않다.
도 14 에는 2 개의 결합 등온선 곡선이 도시되어 있다. 상단의 짙은 곡선은 더 높은 친화도 리포터 분자에 해당한다. 이 리포터 분자를 사용하는 것의 이점은 비교적 낮은 농도에서 거의 완전한 포화가 달성될 수 있다는 점이다: 0.40 nM 에서, 리포터 분자는 90% 포화된다. 단점은 이러한 리포터 분자가 약 0.10 nM 의 더 작은 농도를 정량화하는데 유용하다는 것인데, 이는 결합 등온선 곡선의 얕은 영역이 위에서 논의 된 바와 같이 상당한 오차를 겪기 때문이다.
대조적으로, 낮은 친화도 리포터 분자에 해당하는 하단의 밝은 곡선은 전체 범위에 대해 곡선이 상대적으로 가파르 기 때문에 더 넓은 범위의 샘플 농도를 정량화하는 데 유용하다. 그러나, 리포터 분자는 이 범위에서 최대 70 %의 포화를 달성하고, 100 % 포화에 상응하는 신호의 결정은 달성하기가 어려울 것이다.
본원에 개시된 디지털 분자 분석 방법은 샘플 희석의 단계를 포함할 수 있으며, 이는 결합/총 리포터 분자 농도의 오차에 대한 측정의 민감성을 감소시킴으로써 추정된 분석물 농도의 정밀도를 향상시킬 것이다. 예로서, 결합 거동이 도 15 에 도시되는 상기 논의된 샘플을 고려한다. 높은 정도의 리포터 분자 포화로 인해, 결합 등온선 곡선은 0.40 의 분석물 농도 부근의 영역에서 매우 얕고, 분석물 농도의 결정은 따라서 결합된/총 리포터 분자 농도에서의 작은 오차에도 매우 민감하다. 이러한 비율은 위에서 논의한 바와 같이 디지털 측정에 의해 더 정밀해 진다; 그러나, 처음부터 분석물 농도의 결정이 결합된/총 리포터 분자 농도의 오차에 민감하지 않은 것이 바람직할 것이다.
이 샘플의 4 배 희석 효과, 즉 분석물의 농도가 0.40 에서 0.10 으로 떨어지기 위한 충분한 양의 용질의 첨가의 효과를 고려하라. 이 희석의 결과로서, 결합 거동은 이제 도 14 로 표시될 것이다. 0.10 의 새로운 분석물 농도 부근의 영역에서의 더 가파른 결합 등온선 곡선으로 인해, 분석물 농도의 결정은 결합된/총 리포터 농도에서의 오차에 훨씬 덜 민감하다.
디지털 측정의 감도 특성은 샘플 희석의 단계를 정밀도를 향상시키는 매력적인 절차로 만든다. 결합된 리포터 분자 농도의 벌크 "아날로그" 측정의 정밀도는 샘플 희석시 어려움을 겪을 것임이 명백할 것이다. 도 14 로부터 도 13 으로 가서, 결합된 리포터 분자 농도는 0.92 에서 0.72 로 감소하여, 결합된 농도의 22 % 감소를 나타낸다. 결합된 리포터 분자 농도에 비례하는 벌크 아날로그 신호는 크기가 22 % 감소한다. 잡음의 크기가 일정하게 유지되기 때문에, 이러한 크기의 감소는 신호 대 잡음의 증가를 동반할 것이다. 따라서, 전술한 결합 등온선 효과로 인한 정밀도의 증가는 결합된 리포터 농도의 결정에서 악화된 신호 대 잡음으로 인한 정밀도의 감소에 의해 대응될 것이다.
반대로, 디지털 측정은 희석에 따른 신호 대 잡음의 이러한 저하에 훨씬 덜 민감하다. 위에서 논의한 바와 같이, 결합된 리포터 분자의 감소된 카운트는 아날로그 측정과 다르게 디지털 측정에 영향을 미친다. 아날로그 측정의 벌크 신호를 약화시켜 신호 대 잡음을 악화시키기 보다는, 결합된 리포터 분자의 감소된 카운트는 리포터 디바이스에 의해 수신되는 이산 광학 신호의 카운트를 간단히 감소시킬 것이다. 중요하게, 이들 이산 광학 신호 각각의 강도는 변하지 않은 채로 남아있을 것이다.
이러한 이유로, 상술한 바와 같이 정밀도를 향상시키기 위한 희석 방법은 아날로그 신호 대 잡음 효과로 인한 정밀도의 감소를 수반하지 않고, 따라서 디지털 측정에 유리한 것으로 입증될 것이다. 측정 방법은 측정 장치로 도입하기 전에 샘플을 사전 희석하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 측정 방법은 분석물 농도를 보고한 후, 샘플의 반복 측정이 정밀도를 향상시킬 것임을 사용자에게 표시할 수 있고, 사용자에게 권장 희석 수준에 대해 추가로 조언할 수 있다.
측정 방법은 최적 희석을 제안하기 위해 분석물 농도의 낮은 정밀도 추정을 신속하게 제공하도록 최적화되는 샘플의 빠른 사전 스크린을 포함할 수 있다.
개시된 방법에 대해 예상되는 많은 용도에서, 임계치에 대응하는 임계값 또는 컷오프가 확립되었다. 이러한 임계값 또는 컷오프는 환경법에 의해 설정된 규제 수준 또는 특정 건강 상태에 해당하는 중요한 바이오마커 수준에 대응할 수 있다. 측정 방법은 의도된 사용에 적합한 측정 조건을 제공하기 위해 권장된 스캔 파라미터 및 희석 수준을 조정할 수 있다.
특정 실시형태에서, 측정 장치는 샘플의 자동 희석을 위한 메커니즘을 제공할 수 있다. 이는 기존 샘플의 일부를 분출한 다음 희석을 위한 용질의 도입하여 달성될 수 있다. 이것은 또한 용질로 사전 희석된 새로운 샘플을 도입함으로써 달성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 권장 희석 수준은 측정 장치에 통합되거나 측정 장치에 연결된 컴퓨팅 장치에 의해 계산될 수 있다. 컴퓨팅 디바이스는 인터페이스 (예를 들어, 디스플레이, 인쇄출력 또는 합성된 음성 리포트) 를 통해 오퍼레이터에게 권장 희석 수준을 제공할 수 있다. 컴퓨팅 디바이스는 또한 사용자 개입에 대한 필요없이 희석된 샘플을 자동으로 분석하는 데 필요한 임의의 단계들을 수행하도록 측정 장치를 직접 제어할 수 있다.
특정 실시형태에서, 임계값 또는 컷오프는 컴퓨팅 디바이스에서 임계값 또는 컷오프가 변경되는 경우 선택적으로 업데이트될 수 있는 펌웨어의 형태로, 또는 소프트웨어의 형태로 미리 설정될 수 있다. 또한, 운영 소프트웨어는 측정되고 있는 샘플에 대한 추가 입력을 위해 사용자를 재촉할 수 있다. 예를 들어, 바이오마커의 측정의 경우, 사용자는 연령, 체중, 성별 등과 같은, 임계값 또는 컷오프를 변경시킬 수 있고 따라서 주어진 측정에 필요한 정밀도에 영향을 줄 수 있는, 대상에 대한 이력 파라미터들을 입력할 수 있다.
실시예
본 발명은 이하의 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예 1: 플라스몬 샌드위치 면역분석
이중 항체 면역분석 형식의 디지털 분자 분석의 한 구현이 여기에 기술되어 있다.　 이중 항체 면역 분석은 고전적인 클리닉 분석에서 널리 사용되며, 이러한 적용을 위한 표준 항체 쌍들이 쉽게 획득될 수 있다. 검출을 위해, 샌드위치 면역 분석에서 분석물을 통해 연결될 금속 나노입자들 사이의 플라즈몬 커플링은 입자들에 대한 분석물 분자의 결합의 강력한 판독을 제공한다. 플라즈몬 커플링은 커플링된 입자의 산란 파장이 개별 입자 산란 파장과 실질적으로 다를 수 있어, 휴대 전화 카메라에서도 단일 입자 수준에서 색상별로 뚜렷한 색 변화를 쉽게 판별할 수 있다는 점에서 큰 강점을 제공한다.
이 예에서, 구형 금 나노 입자 (예를 들어, 직경 10 nm 내지 100 nm) 는 잘 작동할 수 있다. 본 목적을 위해, 무표지 검출은 불필요하고, 신호 증강제로서 2 차 금속 나노 입자에 의해 검출이 달성된다. 　이것은 제 2 항체를 통한 다른 나노 입자 (금) 의 결합을 수반하여 두 개의 나노 입자 사이에 플라즈몬 결합을 야기하며 스펙트럼 시프트로 마킹되는 것을 야기한다. 이 전략은 단백질과 DNA 분자의 형태 변화를 감지하는 데 사용되었으며, 휴대 전화에서 사용 가능한 카메라와 같은 간단한 카메라를 사용하여 획득한 이미지에서 단일 분석물 결합의 용이한 검출을 가능하게 할 것이다. 　제 2 나노 입자로 인한 강화된 색 변화는 제 2 나노 입자의 크기 뿐아니라 나노 입자들 사이의 유효 거리에 의존한다. 본 분석에서 예상되는 입자 간 분리 (항체 I-분석물-항체 II) 는 20-30 nm 일 것이고 효과적인 플라즈몬 커플링의 한계 내에 있다. 우리는 일반적으로 40 nm 금 나노 입자를 사용하지만, 제 2 나노 입자의 크기에 대한 입자 간 거리에 따른 플라즈몬 커플링에서의 지수적 붕괴의 의존성 (즉, 더 작은 나노 입자는 더 큰 나노 입자에 비해 플라즈몬 커플링의 급격한 감소를 나타낸다) 은 추가로 큰 금 나노 입자를 사용하여 스펙트럼 시프트의 미세 조정을 허용한다.
암시야 이미징은 분석에서 개별 입자 쌍들로부터의 산란광을 모니터링하는 하나의 적절한 방법이다. 암시야 현미경법은 샘플이 직접 조명되지 않는 광학 기술이다. 대신, 산란된 빛은 물체와 배경 간의 크게 향상된 콘트라스트를 야기하는 거의 흑색 배경 강도를 야기하는 물체의 시각화에 사용된다. 실제로, 나노플라즈몬 물질은 깜빡임 또는 광표백, 즉 기존의 바이오 센싱 분석에 일반적으로 사용되는 형광 기반 검출을 손상시키는 현상 없이 많은 수의 광자를 산출하며, 따라서, 간단한 광학 설정으로 개별 입자들의 관찰을 가능하게 한다.
디지털 분자 분석의 핵심은 시야에서의 각 입자의 개별적 평가이다. 이것은 다양한 방식으로 달성될 수 있지만, 한가지 방법은 이미지 비교 전후에 수반되며, 여기서 포획 입자가 기판 상에 (무작위로 또는 패턴으로) 먼저 배열된다.　 배열된 입자는 '이전 (before)' 정보를 제공하는 샘플의 도입 전에 이미징된다.　 다음으로, 샘플은 이차 표지된 항체와 함께 챔버로 흐른다.　 성공적인 분석물 포획에서, 2 차 표지 입자는 포획 입자와 연관되어 밝기 및 색상의 정의된 변화를 초래한다.　 이전 이미지에서의 각각의 입자는 그것이 단일 포획 입자의 예상된 밝기 및 색상을 갖는다고 결정하도록 특성화될 것이다.　 임의의 응집되거나 달리 변경된 입자는 후속 분석에서 무시될 것이다.　 분석물 포획 후, 우수한 포획 입자의 위치에 있는 물체의 모든 이미지가 분석된다.　 이미지 해석에 대한 통계적 기준은 깨끗한 분석물 포획들로부터 실패한 것 (예를 들어, 응집되거나 비특이적으로 결합된 입자) 을 구별하기 위해 사용된다. 기능화되지 않은 입자를 기준 마커로 포함함으로써 백그라운드 분석 및 오류 정정이 향상된다.　 이것들은 용매의 성공적인 침투, 공기 노출, 또는 입자 필드의 일부를 사용할 수 없게 만드는 다양한 다른 실패 모드를 감지하는 데 사용될 수 있다. 벌크 분석에서, 이러한 종류의 오류는 단순히 신호를 열화시킨다.　 그러나 디지털 분자 분석 형식에서는 이러한 오류는 미리 제거될 수 있다. 사실, 많은 단일 분자 형광 이미징 실험에서, 여러 가지 이유로 시야의 넓은 영역을 사용할 수 없는 것이 일반적이지만, 그 사이에 많은 양의 좋은 분자가 있으면 실험은 여전히 성공적으로 실행될 수 있다.
실시예 2: 플라스몬 혼성화 분석
상기 예의 변형에서, 표면-결합된 핵산 프로브의 혼성화는 나노 입자 사이의 플라즈몬 커플링과 조합되어 핵산 분석물에 대한 디지털 분자 분석을 제공한다. 표면은 제 1 나노 입자가 부착된 제 1 올리고 뉴클레오티드로 변형된다. 표면 변형은 비공유 흡착 또는 공유 결합에 의해 수행될 수 있다. 제 1 올리고뉴클레오티드의 서열은 원하는 분석물 핵산에 함유된 제 1 상보적 서열과 혼성화되도록 선택된다. 이어서, 변형된 표면의 노출은 제 1 짧은 올리고 뉴클레오티드 서열과의 분석물의 혼성화를 유도한다. 이 시점에서, 제 2 나노 입자가 첨가된 제 2 올리고뉴클레오티드가 도입된다. 제 2 올리고뉴클레오티드의 서열은 원하는 분석물 핵산에 함유된 제 2 상보적 서열과 혼성화되도록 선택되며, 제 1 및 제 2 상보적 서열은 서로 충분히 분리되어 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 서열 모두의 동시 혼성화를 가능하게 한다.
제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 서열과 분석물 핵산의 혼성화에 의해 야기된 초분자 조립체는 상기 기재된 샌드위치 면역 분석에서와 같이, 제 1 및 제 2 나노 입자를 근접하게 하도록 설계될 수 있다. 이 시스템의 성공적인 설계에 반드시 필요한 것은 아니지만, 혼성화된 분석물 뉴클레오티드에 의한 표준 나선형 구조의 채택은 분자 지오메트리를 단순화하고, 서열 길이 및 나노 입자에 대한 부착의 성질 및 배치와 같은 파라미터들의 선택을 용이하게 할 것이다.
본 출원에 인용된 미국 또는 외국의 모든 참고문헌, 특허 또는 출원은 그 전체가 본원에서 기재된 바처럼 참조로 포함된다. 불일치가 발생하는 경우, 문자 그대로 본원에 개시된 자료가 우선한다.
전술한 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 용이하게 확인할 수 있고, 본 발명의 취지 및 범주 벗어나지 않고 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 본 발명의 다양한 변형 및 수정을 가할 수 있다.

Claims (65)

  1. 샘플에서의 적어도 하나의 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법으로서,
    적어도 하나의 유형의 분석물 분자들로 배양된 적어도 하나의 유형의 광학 리포터 분자들에 의해 방출된 복수의 신호들의 이미지에서,
    각 유형의 광학 리포터 분자들에 대해, 상기 이미지에서 어느 광학 리포터 분자들이 활성 및 비활성인지 결정하는 단계;
    결합된 및 결합되지 않은 광학 리포터 분자들을 개별적으로 분해함으로써 상기 이미지에서 분석물 분자들에 결합된 이산 활성 광학 리포터 분자들 (“결합된 활성 광학 리포터 분자들”) 의 수 및 분석물에 결합되지 않은 이산 활성 광학 리포터 분자들 (“결합되지 않은 활성 광학 리포터 분자들”) 의 수를 결정하는 단계; 및
    활성 광학 리포터 분자들의 총수의 분율, 또는 분율에 대한 비례로서 결합된 활성 광학 리포터 분자들의 수로부터 분석물의 존재 또는 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 분석물의 농도가 결정되는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 분석물은:
    * 뉴클레오티드 서열; 및
    * 항원
    으로부터 선택되는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 광학 리포터 분자는:
    * 상기 분석물과 결합하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들; 및
    * 상기 분석물과 결합하는 항체 또는 그의 단편
    으로부터 선택되는 포획 엘리먼트를 포함하는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    각각의 광학 리포터 분자는 플라즈몬 나노입자를 포함하는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 광학 리포터 분자는 하나 이상의 플라즈몬 나노입자들로 기능화된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들을 포함하는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 광학 리포터 분자는 하나 이상의 플라즈몬 나노입자들로 기능화된 하나 이상의 항체들을 포함하는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 광학 리포터 분자로부터의 신호는:
    * 광의 파장;
    * 신호의 강도;
    * 밝기;
    * 신호 또는 스펙트럼의 형상; 및
    * 스펙트럼 대역들의 존재 또는 부재
    로부터 선택되는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 결합된 및 결합되지 않은 광학 리포터 분자들은:
    * 특정된 파장 위 또는 아래로의 스펙트럼의 중심의 시프트;
    * 상기 신호의 크기 또는 강도의 변화;
    * 밝기의 증가 또는 감소;
    * 상기 신호의 형상의 변화;
    * 스펙트럼 대역들의 존재 또는 부재; 및
    * 스펙트럼의 형상의 변화
    에 의해 개별적으로 분해되는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 광학 리포터 분자에 의해 방출된 신호는 광의 파장이고,
    상기 결합된 및 결합되지 않은 광학 리포터 분자들은 특정된 파장 위 또는 아래로의 스펙트럼의 중심의 시프트에 의해 개별적으로 분해되는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 샌드위치형 분석을 채용하는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    제 1 유형의 광학 리포터 분자들은 각각의 부착된 광학 리포터 분자가 공간적으로 분해가능하도록 리포터 표면에 부착되고,
    상기 제 1 유형의 광학 리포터 분자들은 플라즈몬 나노입자로 기능화된 분석물에 대한 포획 엘리먼트를 포함하는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    제 2 유형의 광학 리포터 분자들은 상기 샘플과 함께 또는 상기 샘플 뒤에 첨가되고,
    상기 제 2 유형의 광학 리포터 분자들은 플라즈몬 나노입자로 기능화된 분석물에 대한 포획 엘리먼트를 포함하는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 분석물은 항원이고,
    각각의 광학 리포터 분자는 항체 또는 그의 단편을 상기 포획 엘리먼트로서 포함하는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 분석물은 뉴클레오티드 서열이고,
    각각의 광학 리포터 분자는 상기 분석물 뉴클레오티드 서열에 상보적인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들을 상기 포획 엘리먼트로서 포함하는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 방법은 모바일 디바이스를 포함하는 디지털 분자 분석 시스템상에서 수행되는, 분석물의 존재 또는 농도를 결정하기 위한 방법.
  17. 샘플에서의 분석물의 농도를 결정하기 위한 디지털 분석 시스템으로서,
    * 이미지 센서;
    * 이미지를 디스플레이할 수 있는 스크린;
    * 마이크로프로세서;
    * 메모리;
    * 상기 메모리에 저장되고 상기 이미지 센서에 의해 캡쳐된 데이터를 분석하고 데이터를 디지털적으로 분류할 수 있는 상기 프로세서에 의해 실행가능한 이미지 분석 소프트웨어; 및
    * 선택적으로, 통신 인터페이스
    를 포함하고,
    * 한쪽 측면에 포획 엘리먼트들로 기능화된 플라즈몬 나노입자들을 포함하는 광학 리포터 분자들이 부착된, 유리 또는 폴리머로 제조된 리포터 표면; 및
    * 상기 리포터 표면의 반대 측면과 접촉하는 암시야 현미경에 적합한 도파관
    을 추가로 포함하고,
    각 부착된 광학 리포터 분자는 개별적으로 분해되고, 활성 또는 비활성으로 결정되어질 수 있는, 디지털 분석 시스템.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 분석물은 항원이고,
    각각의 광학 리포터 분자는 항체 또는 그의 단편을 상기 포획 엘리먼트로서 포함하는, 디지털 분석 시스템.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 분석물은 뉴클레오티드 서열이고,
    각각의 광학 리포터 분자는 상기 분석물 뉴클레오티드 서열에 상보적인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들을 상기 포획 엘리먼트로서 포함하는, 디지털 분석 시스템.
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