ES2951936T3 - Ensayos moleculares digitales - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se proporcionan sistemas, dispositivos y métodos para la medición rápida y precisa de analitos mediante ensayo de eventos de unión, mediante medición directa y digital de eventos de unión de analito/informador resueltos individualmente. Los sistemas, dispositivos y métodos de ensayo molecular digital descritos en el presente documento son capaces de realizar lecturas partícula por partícula utilizando moléculas indicadoras ópticas que detectan e informan la unión de una única molécula de analito, e informan cada unión en formato binario. Dichos sistemas, dispositivos y métodos de ensayo molecular digital son útiles en una variedad de aplicaciones, como en dispositivos electrónicos móviles para uso en el campo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayos moleculares digitales
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE.UU No. 62/470,303, presentada el 12 de marzo, 2017.
Los diagnósticos en el punto de atención y otros ensayos que se pueden realizar en el campo son una necesidad apre­ miante. Si pudieran eliminarse las demoras y los gastos asociados con el envío de ensayos tales como pruebas de diag­ nóstico, especialmente análisis de sangre, a laboratorios dedicados para su análisis, las respuestas podrían hacerse de manera más eficiente y efectiva. Los laboratorios clínicos ofrecen pruebas de diagnóstico mediante la realización de en­ sayos bioquímicos en instrumentos de mesa de precisión. Los esfuerzos para miniaturizar estos instrumentos o replicar su función en dispositivos electrónicos móviles están plagados de dificultades. En muchos casos los resultados son inutilizables.
El documento de Patente US2009258371 se refiere a un método para detectar niveles muy bajos de analito dentro de una muestra de fluido de película delgada contenida en una cámara de espesor delgado.
Lo que se necesita son puntos de atención económicos, pero precisos, tales como pruebas de diagnóstico que proporcio­ nen resultados rápidos y precisos, por ejemplo, médicos y sus pacientes.
La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. En la presente memoria se proporcionan métodos para la medición rápida y precisa de analitos mediante el ensayo de sucesos de unión, mediante la medición digital directa de sucesos de unión de analito/indicador resueltos individualmente. Los métodos de ensayo molecular digital descritos en la presente memoria son capaces de leer partícula por partícula utilizando moléculas indicadoras ópticas que detectan reportan la unión de una sola molécula de analito y reportan cada unión en formato binario. Dichos métodos de ensayo molecular digital son útiles en una variedad de aplicaciones, tales como en dispositivos electrónicos móviles para su uso en el campo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una ilustración conceptual de un ensayo analógico.
La Figura 2 es un diagrama conceptual de procedimientos de ensayo analógicos.
La Figura 3 es una simulación de resultados de ensayos analógicos.
La Figura 4 es un diagrama conceptual de parte de un sistema de ensayo molecular digital.
La Figura 5 es un diagrama conceptual de parte de un sistema de ensayo molecular digital alternativo.
La Figura 6 es un diagrama conceptual de datos de imagen del ensayo molecular digital.
La Figura 7 es una imagen de datos de ensayos moleculares digitales.
La Figura 8 es una simulación de resultados de ensayos moleculares digitales.
La Figura 9 muestra un dispositivo electrónico móvil con un lector de chip de ensayo clip-on.
La Figura 10 muestra los códigos que pueden incorporarse en un ensayo molecular digital.
La Figura 11 muestra el efecto de las variaciones en el espesor del volumen del indicador sobre las moléculas indicadoras. En esta figura 1 representa el volumen del indicador; 2 representa la superficie de un dispositivo de registro, 3 representa una molécula indicadora, y 4 representa una trayectoria óptica desde la molécula indicadora hasta el dispositivo de regis­ tro.
La Figura 12 muestra volúmenes de indicadores delgados y propiedades de los mismos. En esta figura 1 representa el volumen del indicador; 2 representa la superficie de un dispositivo de registro, 3 representa una molécula indicadora, 4 representa una trayectoria óptica desde la molécula indicadora hasta el dispositivo de registro, y 5 representa una partícula más grande que está unida a, o contiene, la molécula indicadora 4.
La Figura 13 muestra la aplicación de métodos de ajuste de curvas a espectros ópticos. El eje horizontal se refiere a la longitud de onda en nm y el eje vertical se refiere a la intensidad de una señal óptica.
La Figura 14 muestra gráficos de isotermas de unión para una molécula indicadora de unión fuerte (curva superior) y una molécula indicadora de unión débil (curva inferior).
La Figura 15 muestra el efecto del error en la determinación de la concentración del analito a una baja saturación de la molécula indicadora. El eje horizontal es la concentración del analito, y el eje vertical es la proporción entre la concentra­ ción de la molécula indicadora unida y la total. Las flechas horizontales y verticales oscuras indicadas con 1 representan una determinación "correcta" de la concentración de la molécula indicadora y la concentración del analito. Las flechas horizontales y verticales claras indicadas con 2 representan una determinación "incorrecta" de la concentración de la molécula indicadora y la concentración del analito.
La Figura 16 muestra el efecto del error en la determinación de la concentración del analito a una alta saturación de la molécula indicadora. El eje horizontal es la concentración del analito, y el eje vertical es la proporción entre la concentra­ ción de la molécula indicadora unida y la total. Las flechas horizontales y verticales oscuras indicadas con 1 representan una determinación "correcta" de la concentración de la molécula indicadora y la concentración del analito. Las flechas horizontales y verticales claras indicadas con 2 representan una determinación "incorrecta" de la concentración de la molécula indicadora y la concentración del analito.
Descripción detallada de la descripción
Aunque existe una gran demanda para realizar ensayos bioquímicos en dispositivos electrónicos móviles, los intentos de miniaturizar simplemente los ensayos convencionales y realizarlos fuera del entorno controlado de los laboratorios clínicos profesionales no han tenido éxito en el pasado. Los ensayos bioquímicos convencionales no se pueden miniaturizar de manera confiable porque son mediciones inherentemente analógicas.
Los ensayos digitales eliminan las incertidumbres inherentes a los ensayos analógicos en al menos tres formas: (1) los ensayos digitales se basan en sucesos binarios que son altamente resistentes al ruido analógico; (2) los ensayos digitales eliminan los errores que se originan de la fracción desconocida de moléculas de ensayo inactivas en un ensayo analógico; (3) los ensayos digitales eliminan los problemas asociados con la falta de homogeneidad espacial, tal como la iluminación no uniforme.
Considérese, por ejemplo, un ensayo antígeno-anticuerpo diseñado para medir la concentración de antígeno en una muestra que se mezcla con una concentración conocida de anticuerpos. El ensayo tiene una lectura óptica en la que los anticuerpos que se unen al antígeno emiten una señal óptica diferente a la de los que no lo hacen. (Por ejemplo, es posible que los anticuerpos libres no emitan ninguna señal). Dada la afinidad de la unión antígeno-anticuerpo, se puede usar una señal de lectura óptica masiva para estimar la concentración de antígeno.
Se puede hacer que este procedimiento funcione razonablemente bien en un entorno de laboratorio profesional con es­ trictos controles de calidad. Sin embargo, falla estrepitosamente cuando se realiza con dispositivos móviles en un entorno de campo. Los ensayos bioquímicos analógicos convencionales son delicados y dan resultados muy imprecisos cuando se realizan en teléfonos móviles, tabletas y dispositivos similares.
Un problema es que, sin protocolos de laboratorio estrictos, una gran fracción de la concentración de anticuerpos supues­ tamente conocida puede ser inactiva. En un entorno de campo, entre el 10 % y el 100 % de los anticuerpos pueden volverse inactivos debido a una manipulación inadecuada, contaminación, desnaturalización y otros problemas. Peor aún, se desconoce la fracción de anticuerpos inactivos. No es observable y representa un error sistemático que no puede eliminarse promediando los datos observados. La fracción de anticuerpos libres y la fracción de anticuerpos inactivos se confunde; sus señales son indistinguibles.
Los ensayos digitales reducen o eliminan este problema al contar los sucesos de unión individuales entre el analito y la molécula indicadora, tal como el antígeno y el anticuerpo o las secuencias de nucleótidos complementarias, en lugar de promediar los resultados de millones de ellos. Los dispositivos móviles son muy adecuados para los ensayos digitales porque incluyen cámaras de alta calidad capaces de muestrear millones de sucesos bioquímicos, tanto como uno por píxel o decenas de millones por exposición. Los dispositivos móviles también incluyen una potencia de procesamiento significativa para el análisis de imágenes y capacidades de comunicación para reportar los resultados y descargar el procesamiento si es necesario.
Los ensayos digitales seleccionan características en una imagen y las clasifican como válidas o nulas. Las características nulas incluyen cualquier cosa en una imagen que no cumpla con los criterios específicos de posición, brillo, longitud de onda o forma, por ejemplo. Los anticuerpos inactivos son una fuente común de características nulas, pero la iluminación irregular de la muestra, la alineación óptica imprecisa, las irregularidades de la muestra, todos problemas comunes en un entorno móvil y en otros escenarios con controles inadecuados, también contribuyen. En un ensayo digital, las caracte­ rísticas nulas se descartan para el análisis de datos; solo las características válidas contribuyen a los resultados del ensayo. Las características válidas se cuentan como unidas o libres, y esas son las únicas posibilidades. Sí o no; uno o cero. Si, en un ensayo digital, 463 características válidas se cuentan como unidas y 886 características se cuentan cómo libres, entonces la fracción unida es 463 / (463 886) = 463 / 1349 = 0,343 Este tipo de resultado proviene de un proceso digital. Cuando se combina con una afinidad de unión de analito conocida, proporciona la concentración de analito deseada. La fracción de sucesos clasificados como nulos no hace ninguna diferencia en el resultado.
Es útil tener en cuenta que es el ensayo en sí mismo el que es digital. Este concepto no tiene nada que ver con la omnipresente digitalización de resultados analógicos. Las señales producidas por ensayos analógicos pueden digitalizarse para su análisis o almacenamiento, pero la digitalización de una señal analógica no puede eliminar los errores sistemáticos que están "incrustados" en ella. Como una analogía, los registros musicales realizados con equipos analógi­ cos retienen chasquidos y silbidos estáticos, inseparables de la música en un proceso de registro analógico, incluso si el registro se almacena digitalmente.
Volviendo ahora a las figuras, la Figura 1 es una ilustración conceptual de un ensayo analógico. Una cubeta contiene una muestra. La muestra puede ser una solución que contenga antígeno y anticuerpos, por ejemplo. Los anticuerpos pueden marcarse de modo que, al unirse a una molécula de antígeno, el complejo anticuerpo-antígeno recién formado emita una señal óptica cuando sea interrogado por una excitación óptica. La señal óptica puede ser una medición espectral; es decir, la intensidad de la luz versus la longitud de onda. La cubeta, aunque puede contener un volumen de muestra pequeño, solo unos pocos mililitros es un tamaño común, contiene muchos billones de anticuerpos y moléculas de antígeno. El espectro observado es una combinación de espectros emitidos por billones de complejos de anticuerpo-antígeno marca­ dos y unidos. Pero, una fracción desconocida de los anticuerpos no funciona; no pueden unirse al antígeno porque están atrapados en agregados, desnaturalizados o tienen otros problemas.
La Figura 2 es un diagrama conceptual de procedimientos de ensayo analógicos. El ensayo comienza con una concen­ tración de antígeno desconocida mezclada con una concentración de anticuerpo. Se desconoce la proporción de anti­ cuerpos activos (listos y capaces de unirse al antígeno) a anticuerpos inactivos (incapaces o no disponibles para unirse al antígeno). En un entorno de laboratorio profesional, los técnicos capacitados que siguen procedimientos estrictos en un entorno controlado pueden mantener alta o al menos constante la proporción de activo a inactivo. Sin embargo, en un entorno de campo o punto de atención, la proporción de anticuerpos activos a inactivos es mucho más baja y, lo que es peor, totalmente inconsistente.
Los anticuerpos activos se unen al antígeno a una velocidad determinada por: la afinidad antígeno-anticuerpo, la concen­ tración de antígeno y la concentración desconocida de anticuerpos activos.
La Figura 3 es una simulación de resultados de ensayos analógicos. El espectro masivo (curva sólida pesada) representa lo que se observa ("SALIDA DE ESPECTRO") en un ensayo analógico. Las numerosas curvas discontinuas claras repre­ sentan espectros de sucesos de unión de un solo antígeno-anticuerpo. Sin embargo, estos espectros no son observables en un ensayo analógico. En la simulación de la Figura 3, los anticuerpos activos libres emiten luz alrededor de una longitud de onda de 495 nm, mientras que los anticuerpos activos unidos emiten luz alrededor de una longitud de onda de 505 nm. Un número desconocido de anticuerpos inactivos no emiten luz. Esto significa que el espectro masivo no proporciona información suficiente para medir el número de anticuerpos unidos como una fracción de todos los anticuerpos activos.
La situación es peor en un experimento real porque los anticuerpos inactivos aún pueden emitir luz, pero esa luz no proporciona información sobre la unión al antígeno. Simplemente contribuye al error sistemático.
La Figura 4 es un diagrama conceptual de parte de un sistema de ensayo molecular digital. El ensayo molecular digital ilustrado en la Figura 4 muestra un ejemplo en el que la microscopía de campo oscuro móvil realizada con la cámara de un teléfono inteligente, por ejemplo, captura una imagen de un inmunoensayo tipo sándwich de nanopartículas plasmónicas. En este ensayo, un sustrato de reflexión interna total (TIR) se recubre con nanopartículas plasmónicas funcionalizadas con anticuerpos de captura diseñados para unirse a un antígeno de interés. Se introducen nanopartículas plasmónicas adicionales, funcionalizadas con anticuerpos iguales o diferentes (es decir, diseñadas para unir una parte equivalente del antígeno o una parte diferente), junto con el antígeno de interés en una muestra. La luz de excitación se introduce en el sustrato desde un borde. Los anticuerpos unidos emiten señales ópticas diferentes a las de los anticuerpos libres e inac­ tivos. Los anticuerpos pueden estar inactivos debido a muchos factores, tal como la degradación o, más comúnmente, la agregación. Las diferentes señales pueden aparecer en una imagen como diferentes tamaños, brillo, espectros, formas, etcétera, y clasificarse como activas o nulas considerando uno o más de estos factores.
La Figura 5 es también un diagrama conceptual de parte de un sistema de ensayo molecular digital; es una alternativa del ejemplo anterior en el que el sustrato TIR se recubre con nanopartículas plasmónicas funcionalizadas con secuencias de nucleótidos de captura de DNA o RNA, complementarias a parte del DNNRNA del analito de interés. Se introducen nanopartículas plasmónicas adicionales, funcionalizadas con diferentes cDNNcRNA (es decir, diseñadas para unirse a otra sección del DNNRNA del analito), junto con el DNNRNA del analito en una muestra. Las secuencias de DNNRNA unidas emiten señales ópticas diferentes a las de los anticuerpos libres e inactivos.
La Figura 6 es un diagrama conceptual de datos de imágenes de ensayos moleculares digitales; es decir, parte de una imagen capturada por la cámara de un dispositivo móvil que funciona como un microscopio de campo oscuro. La imagen incluye manchas producidas por complejos antígeno-anticuerpo unidos, manchas de anticuerpos libres, manchas de an­ ticuerpos inactivos o nulos y una zona defectuosa que puede ser un área de la imagen que está defectuosa por varias razones. La iluminación de la imagen puede no ser uniforme, incluso lejos de ser uniforme. Siempre que se conozca el patrón de iluminación espacial, al registrar una imagen en la longitud de onda de iluminación, por ejemplo, los resultados en cualquier punto de la imagen pueden normalizarse a la iluminación conocida.
La Figura 7 es una representación de datos de ensayos moleculares digitales obtenidos por una cámara de dispositivo móvil que funciona como microscopio. La figura es menos impresionante cuando se muestra en escala de grises, como se muestra en esta descripción, en comparación con la imagen en color original, por lo que se mejoró manualmente para enviarla en blanco y negro. Se han dibujado círculos blancos alrededor de puntos en la imagen que corresponden a anticuerpos activos. Todos los demás puntos en la imagen son anticuerpos nulos o inactivos. De los anticuerpos activos, 4 de 11 están unidos; estos se representan a modo de ejemplo con un círculo gris alrededor del blanco. La identificación de activo frente a nulo y unido frente a libre se realiza mediante un software de análisis de imágenes. El análisis de imágenes se puede realizar en el dispositivo móvil. Alternativamente, el dispositivo móvil puede enviar la imagen a otro procesador. Puede enviar la imagen a un servidor virtual en la nube informática, por ejemplo.
Como un ejemplo de procesamiento de imágenes para distinguir los anticuerpos unidos de los libres en un ensayo mole­ cular digital, la Figura 8 es una simulación de resultados de ensayos digitales. La Figura 8 representa espectros de seis puntos en una imagen de un ensayo digital. El criterio para unido versus libre es si el espectro de un punto se encuentra por encima o por debajo de los 500 nm de longitud de onda. Los puntos con espectros que no caen en el intervalo que se muestra en la figura son nulos. De arriba a abajo, los espectros corresponden a puntos de sitios de anticuerpos libres, libres, unidos, inactivos (nulo), libres y unidos. Hay dos resultados positivos, tres negativos y uno nulo. Por lo tanto, la fracción de anticuerpos unidos es 2/5. Como se mencionó anteriormente, un experimento real se complica por las señales ópticas de los anticuerpos inactivos. Por lo tanto, los criterios de selección pueden ser más complicados que el centro espectral por encima o por debajo de una cierta longitud de onda. Los criterios pueden incluir bandas espectrales estre­ chas, criterios de intensidad, forma espectral y forma espacial como ejemplos.
Los criterios de selección también tienen en cuenta el conocimiento de un patrón de iluminación espacial. La intensidad medida en una longitud de onda de emisión se normaliza mediante la intensidad de iluminación a una longitud de onda de excitación en el mismo lugar en una imagen. Esto elimina los problemas de falta de homogeneidad espacial que afectan a las mediciones analógicas. El ensayo procede digitalmente partícula por partícula considerando "ENTRADA DE EXCI­ TACIÓN" y "SALIDA DE ESPECTRO" para cada partícula. El resultado para una partícula dada solo puede ser 0 o 1.
Los ensayos moleculares digitales se pueden realizar con dispositivos móviles como se ilustra en la Figura 9 que muestra un dispositivo electrónico móvil con un lector de chip de ensayo clip-on. El lector de chips de ensayo puede incluir com­ ponentes ópticos que adaptan la cámara del dispositivo móvil para imágenes de campo oscuro, por ejemplo. El chip de ensayo está diseñado para recibir una solución de analito y se puede recubrir previamente con anticuerpos.
Dado que un ensayo digital se basa en imágenes y análisis de imágenes, los códigos pueden colocarse en un chip de ensayo y leerse a partir de las mismas imágenes utilizadas para medir los sucesos de unión. La Figura 10 muestra los códigos que pueden incorporarse en un ensayo digital. Los ejemplos incluyen códigos de barras, códigos de respuesta rápida (QR), puntos cuánticos que emiten luz en longitudes de onda diseñadas, indicadores de temperatura, humedad, exposición a la luz, exposición a gases de nanopartículas y otros datos ambientales. También se pueden incluir marcas de identificación que representen tipos de ensayos particulares o identificación de muestras.
Los ejemplos comentados anteriormente se presentan utilizando la unión antígeno-anticuerpo. El antígeno y los anticuer­ pos se pueden unir a moléculas indicadoras ópticas para la lectura del ensayo. Los ensayos que implican otros mecanis­ mos de entrecruzamiento también se pueden realizar digitalmente. Por ejemplo, los ensayos basados en la hibridación de fragmentos de DNA o RNA unidos a moléculas indicadoras ópticas pueden realizarse como ensayos moleculares digitales en los que los fragmentos de DNA o RNA complementarios toman el lugar de las moléculas de antígeno y anti­ cuerpo. Como un ejemplo, una primera parte de una secuencia corta de DNA se puede unir a un indicador óptico y una segunda parte de la secuencia corta de DNA se puede unir a otro indicador óptico. Cuando la primera y la segunda parte se unen a una secuencia de DNA complementaria más larga, los dos indicadores ópticos se acercan y, por lo tanto, emiten una señal óptica diferente en comparación con cuando están más separados. Este tipo de ensayo puede usarse para detectar la secuencia de DNA complementaria.
En conclusión, es una tontería utilizar un dispositivo móvil como sustituto de la instrumentación de laboratorio profesional con ensayos analógicos. Los ensayos moleculares digitales permiten la lectura partícula por partícula de las interacciones individuales entre las moléculas de analitos individuales y las moléculas indicadoras, lo que hace irrelevantes los proble­ mas prácticos que acompañan a los ensayos tradicionales. Aprovechando las capacidades de imagen y procesamiento de imágenes de los dispositivos móviles para proporcionar resultados de diagnóstico que reducen o eliminan las fuentes comunes de errores sistemáticos que se encuentran en los ensayos analógicos, los ensayos moleculares digitales permi­ ten evaluaciones en el campo, tal como pruebas de diagnóstico en el punto de atención que ayudan a los médicos y pacientes a obtener información de salud crítica de forma rápida y económica, y la recopilación y el análisis de datos en una amplia gama de aplicaciones.
Términos y definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que normalmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
Como se usa en la presente memoria, los términos a continuación tienen los significados indicados.
Cuando se describen intervalos de valores, y se utiliza la notación "de m ... a n2" o "entre m ... y n2" , donde m y n2 son los números, entonces, a menos que se especifique lo contrario, esta notación pretende incluir los números mismos y el intervalo entre ellos. Este intervalo puede ser integral o continuo entre e incluyendo los valores finales. A modo de ejemplo, el intervalo "de 2 a 6 carbonos" pretende incluir dos, tres, cuatro, cinco y seis carbonos, ya que los carbonos vienen en unidades enteras. Compárese, a modo de ejemplo, el intervalo "de 1 a 3 μM (micromolar)", que pretende incluir 1 μM, 3 μM y todo lo que se encuentre en el medio hasta cualquier número de cifras significativas (por ejemplo, 1,255 μM, 2,1 μM, 2,9999 μM, etc.).
El término "aproximadamente", tal y como se usa en la presente memoria, pretende calificar los valores numéricos que modifica, denotando dicho valor como variable dentro de un margen de error. Cuando no se menciona ningún margen de error particular, tal como una desviación estándar de un valor medio dado en un gráfico o tabla de datos, el término "aproximadamente" debe entenderse como el intervalo que abarcaría el valor indicado y el intervalo que se incluiría re­ dondeando hacia arriba o hacia abajo también a esa cifra, teniendo en cuenta las cifras significativas.
El término "precisión", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para referirse a la proximidad de un valor indicado o estimado del valor real. Una medición, observación o estimación inexacta se desvía del valor real. Una medición, observación o estimación precisa no se desvía del valor real.
El término "analito" o "molécula de analito", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir una molécula o partícula cuya presencia o ausencia, o cantidad, en una muestra se desconoce originalmente, y para la cual sería útil el conocimiento de la presencia o ausencia, o cantidad, contenida en una muestra. Los ejemplos de analitos incluyen biomoléculas, tales como: péptidos, proteínas, citocinas y priones; anticuerpos y fragmentos de los mis­ mos; ácidos nucleicos (DNNRNA) y partículas que los contienen, tales como las histonas; pequeñas moléculas orgánicas y bioinorgánicas, tales como carbohidratos, lípidos, hormonas e intermediarios y productos del metabolismo; macromoléculas, tales como macrociclos, biopolímeros (por ejemplo, oligosacáridos, polifenoles y plásticos); y virus, partículas vira­ les, productos virales (por ejemplo, virokinas). Un analito también se puede categorizar como un biomarcador, es decir, una composición y/o molécula o un complejo de composiciones y/o moléculas que se asocia con un estado biológico de un organismo (por ejemplo, una afección tal como una enfermedad o un estado de no enfermedad) y puede reportar la presencia de enfermedad, lesión o daño celular o del organismo. Cuando dichos marcadores se unen a un anticuerpo o a un fragmento del mismo, pueden denominarse antígenos. Los valores para niveles significativos (por ejemplo, normales y anormales) de analitos detectados por los ensayos moleculares digitales descritos en la presente memoria serán cono­ cidos por los expertos en la técnica relevante.
El término "detector de área", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se refiere a un dispositivo de registro que puede registrar una imagen de una fuente, es decir, registrar no solo la intensidad de una señal óptica entrante, sino también el origen de una señal óptica. Ejemplos comunes de detectores de área son cámaras de televisión, cámaras SLR digitales y cámaras de teléfonos celulares.
El término "chip de ensayo", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se refiere a una micromatriz de moléculas indicadoras (por ejemplo, moléculas indicadoras ópticas) colocadas o depositadas de otro modo sobre una superficie indicadora, opcionalmente encerradas dentro de una cubeta plana relativamente delgada, tal como un portaob­ jetos, que puede exponerse a una muestra que contiene analito de modo que se pueda observar la interacción entre los elementos de captura de las moléculas indicadoras ópticas y el analito. Las técnicas para la producción de chips de ensayo son conocidas en la técnica. Un chip de ensayo puede comprender como moléculas indicadoras ópticas nanopartículas plasmónicas funcionalizadas con anticuerpos, proteínas, DNA, RNA, etc.
El término "lector de chips de ensayo", tal y como se utiliza en la presente memoria, solo o en combinación, se refiere a un sistema o dispositivo para observar y registrar señales de un chip de ensayo. Un lector de chips de ensayo puede ser parte de un sistema de ensayo molecular digital como se describe en la presente memoria, y normalmente comprende una cámara para recibir un chip de ensayo, un dispositivo de registro tal como un sensor de imagen (por ejemplo, una cámara), un medio para transmitir los datos recopilados del ensayo a la memoria y, opcionalmente, una fuente de luz tal como un diodo emisor de luz (LED). Además, el lector de chips de ensayo puede contener hardware de microfluidos tal como bombas, canales, cámaras para soluciones, válvulas, mezcladores y similares; y hardware y/o software para realizar al menos algún análisis de los datos. En ciertas realizaciones, un lector de chips de ensayo puede acoplarse con un teléfono inteligente u otro dispositivo móvil y usarse como parte de un sistema de ensayo portátil; los lectores de chips y microplacas miniaturizados son conocidos en la técnica.
El término "isoterma de unión", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se refiere al grado de unión de las moléculas indicadoras unidas a las moléculas de analito a diferentes concentraciones de analito. En general, el grado de unión, que se puede definir como la proporción de moléculas indicadoras unidas/moléculas indicadoras totales, aumenta con el aumento de la concentración del analito y finalmente se aproxima a 1, ya que casi todas las moléculas indicadoras están unidas a las moléculas del analito.
El término "agrupamiento", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se refiere a la combinación de señales de dos o más píxeles en una sola señal. El agrupamiento se puede utilizar cuando se puede sacrificar la resolución espacial para mejorar la relación señal-ruido. "Agrupamiento 2x2", a modo de ejemplo, se refiere a la agrupa­ ción de píxeles en cuadrados de 2x2 y la suma de las señales de los píxeles contenidos en cada cuadrado.
El término "biomolécula", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, incluye cualquier tipo de molécula orgánica o bioinorgánica para la que se desea la detección (ya sea cualitativa o cuantitativa), incluyendo, pero no limitada a, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, azúcares, mono y polisacáridos, lípidos, lipoproteínas, células com­ pletas y similares.
El término "cámara", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un tipo de sensor de imagen para registrar imágenes visuales, por ejemplo, como imágenes digitales. Una "cámara de megapíxeles" es una cámara que puede registrar un millón o múltiplos de un millón de píxeles por imagen. Muchas cámaras de teléfonos inteligentes comprenden cámaras de diez megapíxeles o más.
El término "interfaz de comunicación", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un medio para transferir datos desde un dispositivo o sistema como se usa en la presente memoria a otro dispositivo o sistema. Los ejemplos de interfaces de comunicaciones inalámbricas incluyen las utilizadas en dispositivos inalámbricos tales como teléfonos mó­ viles, por ejemplo, tecnologías celulares, wi-fi y Bluetooth.
El término "concentración", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se refiere a la cantidad de un soluto en una solución por unidad de volumen de solución. La concentración se puede especificar en unidades de concentración molar, es decir, número de moles de soluto por litro de solución, o concentración numérica, es decir, número de moléculas de soluto por litro de solución. La concentración molar y la concentración numérica se pueden interconvertir fácilmente. Como se usa en la presente memoria, el término "concentración" se amplía para incluir sistemas fuera de la definición tradicional de "solución", por ejemplo, sistemas que contienen moléculas unidas a un soporte sólido.
El término "deconvolución", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir un método para determinar, a partir de una señal óptica colectiva que se compone de señales ópticas individuales de una pluralidad de moléculas indicadoras ópticas, las señales ópticas individuales de las moléculas indicadoras ópticas indivi­ duales. La deconvolución puede utilizar técnicas de ajuste de curvas para determinar las características espectrales indi­ viduales de moléculas indicadoras ópticas individuales que se superponen parcialmente en una región espectral y que se han combinado para formar un único espectro colectivo. La deconvolución puede utilizar técnicas de ajuste de curvas para determinar imágenes individuales a partir de moléculas indicadoras ópticas individuales que se superponen parcial­ mente en una región espacial de un detector y que se han combinado para formar una única imagen colectiva. Se enten­ derá que las técnicas de deconvolución son particularmente útiles para pequeños grupos de moléculas indicadoras ópti­ cas.
El término "detectar" o "detección", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir un método de determinación de la existencia, presencia o hecho de un analito en una muestra.
El término "divergencia" indica la desviación de la perpendicularidad que es acomodada por el dispositivo de registro. Un dispositivo de registro de tipo detector de área idealizado aceptará solo rayos de luz que sean perpendiculares al plano del detector. Los detectores de área reales permitirán que los rayos de luz lleguen en un ángulo con respecto a la perpen­ dicular. Aunque esta función puede aumentar la relación señal-ruido (dado que el detector acepta más rayos de luz), también disminuye la resolución espacial, dependiendo del tamaño del ángulo de divergencia permitido, y el tamaño del píxel del detector de área y la distancia entre el detector de área y el plano de muestra.
El término "incubar", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir un proceso de exposición de moléculas indicadoras a una muestra que puede contener potencialmente una molécula de analito.
El término "oblongo", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir un volumen que tiene dimensiones desiguales. Los ejemplos de volúmenes oblongos incluyen prismas o cilindros para los cuales la distancia entre las caras de los extremos es significativamente mayor o significativamente menor que las dimensiones paralelas a las caras de los extremos. Otro ejemplo de un volumen oblongo es un elipsoide en el que un eje es significa­ tivamente mayor o significativamente menor que otro eje.
El término "trayectoria óptica", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir la trayectoria desde la molécula indicadora hasta el detector.
El término "molécula indicadora óptica" o, de manera equivalente, "indicador óptico", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir una molécula indicadora que es capaz de registrar la presencia o ausencia, o la cantidad o concentración de una molécula de analito, con una señal óptica. La presencia o ausencia de la molécula del analito (opcionalmente, en ciertos formatos de ensayo, con otra molécula indicadora óptica) en contacto con la molécula indicadora óptica, induce un cambio en la señal óptica. Una molécula indicadora óptica unida al analito ("mo­ lécula indicadora óptica unida") emitirá una señal diferente que una molécula indicadora óptica no unida al analito ("molé­ cula indicadora óptica libre").
El término "señal óptica", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir una señal que se origina a partir de una molécula indicadora óptica. La señal óptica puede caer en el intervalo visible del espectro o fuera del intervalo visible del espectro. La señal puede ser, por ejemplo:
• longitud de onda de la luz;
• intensidad de la señal;
• brillo.
• la forma de una señal o espectro;
• la presencia o ausencia de bandas espectrales;
• el coeficiente de extinción de una banda de absorción;
• la Amax de una banda de absorción;
• el rendimiento cuántico de una banda de emisión; o
• la anisotropía de fluorescencia de una banda de emisión.
La señal óptica de una molécula indicadora óptica puede cambiar tras la unión de una molécula de analito. El cambio en la señal óptica tras la unión puede ser uno de los siguientes:
• un desplazamiento en el centro de un espectro por encima o por debajo de una longitud de onda específica;
• un desplazamiento en la longitud de onda de máxima intensidad (Amax);
• un cambio en el tamaño o intensidad de la señal;
• un aumento o disminución del brillo;
• un cambio en la forma de la señal;
• la presencia o ausencia de bandas espectrales;
• un cambio en la forma de un espectro.
• un cambio en el coeficiente de extinción de una banda de absorción;
• un cambio en la Amax de una banda de absorción;
• un cambio en el rendimiento cuántico de una banda de emisión; y
• un cambio en la anisotropía de fluorescencia de una banda de emisión.
El término "píxel", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se refiere a un área en un detector de área, por ejemplo, un sensor de imagen, cuya señal puede medirse independientemente de otros píxeles. Los detec­ tores de área se dividen normalmente en una cuadrícula bidimensional de píxeles, con el tamaño de cada píxel y el recuento de píxeles en las dos direcciones, determinados por el fabricante del detector de área.
El término "precisión", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para referirse a la estimación de error que se asocia con un valor reportado o estimado. Una medición, observación o estimación de baja precisión se asocia con un alto grado de incertidumbre sobre la cercanía de este número al valor real. Una medición, observación o estimación de alta precisión se asocia con un bajo grado de incertidumbre sobre la cercanía de este número al valor real. La precisión a menudo se puede cuantificar mediante el uso de barras de error en gráficos o intervalos para valores numéricos. Por ejemplo, un valor estimado que se reporta como 10,5 ± 0,1 indica que es muy probable que el valor real esté entre 10,4 y 10,6; con una probabilidad pequeña pero distinta de cero de que el valor verdadero esté fuera de este intervalo.
Los términos "proteína", "polipéptido", "péptido" y "oligopéptido" se usan indistintamente en la presente memoria e incluyen cualquier composición que incluya dos o más aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico. Se apreciará que los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos normalmente denominados los 20 aminoácidos naturales. Además, los polipéptidos pueden incluir uno o más aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, que se modifican por cualquier medio conocido en la técnica (ya sea de forma natural o no natural). Los ejemplos de modifi­ caciones de polipéptidos incluyen, por ejemplo, mediante glicosilación u otra modificación postraduccional. Las modifica­ ciones que pueden estar presentes en los polipéptidos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a: acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un grupo hemo, unión covalente de un polinucleótido o derivado de polinucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces covalentes entrecruzados, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicación, glicosila­ ción, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por RNA de transferencia, tal como arginilación y ubiquitinación.
El término "análisis cualitativo", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir un método para determinar la ausencia o presencia de una molécula de analito en una muestra. En algunas realizaciones, un método de análisis cualitativo reporta la presencia o ausencia de una sola molécula de analito en una muestra. En algunas realizaciones, un método de análisis cualitativo reporta incorrectamente la ausencia de analito en una muestra que contiene analito a un nivel por debajo de un cierto umbral.
El término "análisis cuantitativo", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir un método para determinar la cantidad de una molécula de analito en una muestra.
El término "dispositivo de registro", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se refiere a un dispositivo para registrar una señal óptica. En ciertas realizaciones, la señal óptica se convierte en una señal eléctrica. En ciertas realizaciones, el dispositivo de registro es un dispositivo de carga acoplada ("CCD"). En ciertas realizaciones, el dispositivo de registro es un dispositivo semiconductor de óxido de metal complementario ("CMOS").
El término "molécula indicadora", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir una molécula que puede reportar la presencia o ausencia, o la cantidad o concentración de una molécula de analito, y sola o en combinación con otra molécula indicadora, produce una señal detectable en un ensayo molecular digital. Nor­ malmente, una molécula indicadora se unirá a una molécula de analito, y el complejo molécula indicadora/molécula de analito diferirá significativamente en una o más propiedades espectrales. Las moléculas indicadoras pueden ser anticuer­ pos o fragmentos de los mismos, ácidos nucleicos, proteínas y péptidos, cualquiera de los cuales puede modificarse química o bioquímicamente. Las moléculas indicadoras también pueden ser moléculas quiméricas que comprenden un resto de origen bioquímico y un resto sintético; los ejemplos incluyen una nanopartícula plasmónica funcionalizada con anticuerpos y una nanopartícula plasmónica funcionalizada con nucleótidos. Las moléculas indicadoras pueden ser aptámeros basados en ácidos nucleicos o péptidos.
El término "volumen del indicador", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir el volumen del dispositivo de medición en el que se colocan las moléculas indicadoras. El volumen del indicador puede ser sustancialmente el mismo que el del compartimento de la muestra, o el volumen del indicador puede ser menor. En ciertas realizaciones, la dimensión del volumen del indicador que es paralelo a la trayectoria óptica para las moléculas indicadoras será pequeña. En ciertas realizaciones, el volumen del indicador constituirá una monocapa.
El término "muestra", tal y como se usa en la presente memoria, solo o en combinación, se usa para describir una com­ posición que contiene el analito de interés. Una muestra a menudo estará en un fluido, por ejemplo, solución acuosa. Una muestra puede ser química o biológica. Sangre, plasma, agua de una fuente a analizar, extractos de muestras de tejido vegetal, animal o humano, son ejemplos de muestras biológicas. Una muestra química sería aquella que no contenga material de origen biológico, tal como una muestra de agua que contenga desechos petroquímicos o industriales. Las muestras biológicas extraídas de un organismo pueden incluir, pero no se limitan a, las siguientes: sangre, suero, plasma, orina, moco, saliva, esputo, heces y otras secreciones fisiológicas, así como extractos de tejidos y cualquier otro consti­ tuyente del cuerpo que pueda contener la partícula objetivo de interés. También son de interés otras muestras similares, tales como el cultivo de células o tejidos o el caldo de cultivo.
Una muestra biológica puede ser fresca o almacenada (por ejemplo, sangre o fracción de sangre almacenada en un banco de sangre). La muestra biológica puede ser un fluido corporal obtenido expresamente para los ensayos de esta invención o un fluido corporal obtenido para otro fin que puede ser una submuestra para los ensayos de esta invención. En una realización, la muestra biológica es sangre completa. Puede obtenerse sangre completa del sujeto usando procedimientos clínicos estándar. En otra realización, la muestra biológica es plasma. El plasma se puede obtener a partir de muestras de sangre total mediante centrifugación de sangre anticoagulada. Dicho proceso proporciona una capa leucocitaria de componentes de glóbulos blancos y un sobrenadante del plasma. En otra realización, la muestra biológica es suero. El suero se puede obtener por centrifugación de muestras de sangre completa que se hayan recogido en tubos que no contengan anticoagulante. Se permite que la sangre se coagule antes de la centrifugación. El líquido amarillento-rojizo que se obtiene por centrifugación es el suero. En otra realización, la muestra es orina. La muestra se puede pretratar según sea necesario mediante dilución en una solución tampón apropiada, heparinizada, concentrada si se desea o frac­ cionada mediante varios métodos, incluyendo, pero no limitado a, ultracentrifugación, fraccionamiento mediante cromato­ grafía líquida de rendimiento rápido (FPLC) o precipitación de proteínas que contienen apolipoproteína B con sulfato de dextrano u otros métodos. Puede usarse cualquiera de una serie de soluciones tampón acuosas estándar a pH fisiológico, tales como fosfato, Tris o similares.
El término "saturación", tal y como se usa en la presente memoria, en referencia a los fenómenos de unión, se refiere a un estado en el que casi todas las moléculas indicadoras están unidas a moléculas de analito. Una característica de una condición de saturación es que un aumento en la concentración del analito provoca un pequeño aumento en el grado de unión de las moléculas indicadoras.
El término "teléfono inteligente", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una computadora personal de mano con un sistema operativo móvil y una conexión de red celular de banda ancha móvil integrada para comunicación de voz, SMS y datos de Internet y, por lo general, wi-fi.
El término "computadora de tableta" o "tableta", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una computadora personal portátil delgada y plana, por lo general con un sistema operativo móvil, una pantalla táctil LCD, una batería recargable y una interfaz de comunicación inalámbrica (opcionalmente, celular).
Aplicaciones
Los métodos, sistemas y dispositivos de ensayo molecular digital descritos en la presente memoria son útiles en una variedad de campos y aplicaciones. Ninguno de los sistemas y dispositivos descritos en la presente memoria son parte de la invención reivindicada. En particular, los ensayos moleculares digitales serían útiles en "el campo", es decir, en un entorno portátil. Por ejemplo, los ensayos moleculares digitales serían útiles en la evaluación y el diagnóstico médico y la detección de patógenos, particularmente en áreas remotas, áreas desatendidas o de difícil acceso (por ejemplo, debido a un conflicto violento), áreas afectadas por una epidemia y en otros ejemplos donde el acceso a equipos de ensayo tradicionales y/o profesionales es limitado. También serían útiles dentro de un hospital o clínica, o en un entorno de visitas domiciliarias, donde podrían realizarse o usarse en el punto de atención o junto a la cama.
Los ensayos moleculares digitales serían igualmente útiles en un entorno veterinario como en un médico, ya sea en un consultorio veterinario, en un rancho o granja, o en cualquier lugar donde se encuentren animales que necesiten pruebas. También podrían usarse en aplicaciones hortícolas o agrícolas para analizar plantas o suelos en busca de patógenos o microorganismos simbióticos, o detectar otros genotipos y fenotipos de interés.
Los ensayos moleculares digitales también podrían usarse para analizar el agua en busca de contaminación, por ejemplo, por bacterias, algas u hongos, o productos tóxicos de los mismos; por el petróleo o sus productos y derivados, y residuos industriales). Dichos ensayos serían útiles para las pruebas de seguridad de los alimentos y para usos agrícolas, tales como pruebas de campo o de instalaciones de procesamiento para patógenos, toxinas, adulterantes, contaminantes y plagas.
Ensayos
Muchos tipos de ensayos bioquímicos son adaptables al formato de ensayo molecular digital descrito en la presente memoria. Los ejemplos incluyen: inmunoensayos en los que la captura y unión de un antígeno por un anticuerpo o un fragmento del mismo; ensayos de hibridación en los que se utilizan uno o más segmentos de DNA o RNA complementarios al analito de DNNRNA de interés para capturar el analito; y ensayos de unión de ligandos en los que se usa una pareja de unión con un receptor, enzima u otra proteína, o viceversa, como agente de captura para el analito asociado (por ejemplo, proteína o fragmento de la misma).
Se apreciará que los inmunoensayos y los ensayos de hibridación pueden emplear un formato de sándwich en el que se emparejan las parejas de unión, por ejemplo, se utilizan anticuerpos o cDNNRNA, para la misma molécula de analito, por ejemplo, un antígeno o DNNRNA objetivo. Por tanto, la descripción abarca pares de parejas de unión, por ejemplo, anti­ cuerpos, en los que ambos anticuerpos son específicos de la misma molécula, por ejemplo, el mismo antígeno, y en los que uno o ambos miembros del par comprenden una molécula indicadora óptica como se describe en la presente memo­ ria. La combinación de múltiples elementos de captura e indicadores todavía comprende una disposición productora de señales que, aunque comprende múltiples moléculas indicadoras ópticas, todavía puede denominarse molécula indica­ dora óptica.
En la molécula indicadora se pueden usar pares de parejas de unión de captura y pares de parejas de unión de detección, por ejemplo, anticuerpos de captura y detección o pares de nucleótidos. Por lo tanto, aunque los ensayos moleculares digitales descritos en la presente memoria permiten la detección de analitos sin marcajes, en algunas realizaciones se utiliza un protocolo de ensayo heterogéneo en el que, normalmente, se utilizan dos parejas de unión, por ejemplo, dos anticuerpos o dos secuencias de DNA o RNA. Una pareja de unión es una pareja de captura, normalmente inmovilizada sobre un soporte sólido, tal como una nanopartícula plasmónica, y la otra pareja de unión es una pareja de unión de detección, normalmente con un marcador detectable unido, tal como otra nanopartícula plasmónica. Los anticuerpos y los pares de anticuerpos están disponibles comercialmente y también pueden diseñarse y prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica.
Las moléculas indicadoras se pueden unir a una superficie indicadora, ya sea por adsorción no específica o por enlace covalente específico. La carga de moléculas indicadoras se determinará en gran parte por la concentración de las molé­ culas indicadoras en la solución de preparación. Las soluciones más concentradas proporcionarán una mayor densidad de moléculas indicadoras, mientras que al mismo tiempo aumentarán el recuento de grupos de moléculas indicadoras que contienen dos o más partículas. Este último efecto no es fatal para una operación exitosa: los grupos más pequeños de moléculas indicadoras se pueden analizar con las técnicas de ajuste de curvas que se describen a continuación, mientras que los grupos más grandes que no son adecuados para estas técnicas se pueden marcar como inactivos. Teniendo en cuenta los objetivos conflictivos de aumentar el número de moléculas indicadoras y mantener un número manejablemente pequeño de grupos de moléculas indicadoras, una carga de un máximo de aproximadamente 1 molécula indicadora por micrómetro cuadrado resultará ser óptima en ciertas realizaciones. Para la detección de una sola molécula, sería útil una densidad que equivaldría a no más de una molécula de analito (unida a la molécula indicadora óptica) por píxel.
El análisis mediante ensayos de sándwich se puede realizar con un procedimiento de varias etapas: la superficie indica­ dora que se ha funcionalizado con moléculas de captura se expone al analito. Una determinada fracción de moléculas de captura se unirá al analito, dependiendo de la concentración del analito. En una segunda etapa, la superficie indicadora se expone a una solución con moléculas de detección. Solo aquellas moléculas de captura que se han unido a un analito en la primera etapa se unirán a las moléculas de detección en la segunda etapa. Una clara ventaja de este método es que las moléculas de captura y detección se pueden elegir para optimizar la señal óptica que se suministra desde el conjunto de molécula de captura/analito/molécula de detección, en comparación con la molécula de captura libre.
Los métodos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para identificar un estado de interés fenotípico o genotípico asociado con un estado patológico clínicamente diagnosticado. Dichos estados patológicos incluyen, por ejemplo, cáncer, enfermedad cardiovascular, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune, enfermedad neurológica, enfer­ medad infecciosa y trastornos relacionados con el embarazo. Alternativamente, los estados de salud pueden detectarse utilizando marcadores.
Los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar para detectar la variación genética. La variación genética en la presente memoria puede incluir, pero no se limita a, una o más sustituciones, inversiones, inserciones, deleciones o mutaciones en secuencias de nucleótidos (por ejemplo, DNA y RNA) y proteínas (por ejemplo, péptidos y proteínas), una o más microdeleciones, uno o más alelos raros, polimorfismo, polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), polimorfismo genético a gran escala, tales como inversiones y translocaciones, diferencias en la abundancia y/o número de copias (por ejemplo, variantes del número de copias, CNVs) de una o más moléculas de nucleótidos (por ejemplo, DNA), trisomía, monosomía y reordenamientos genómicos. En algunas realizaciones, la variación genética puede estar relacionada con metástasis, presencia, ausencia y/o riesgo de una enfermedad, tal como cáncer, variabilidad farmacocinética, toxicidad de fármacos, sucesos adversos, reaparición y/o presencia, ausencia o riesgo de rechazo de trasplante de órganos en el sujeto. Por ejemplo, los cambios en el número de copias en el gen HER2 influye si una paciente con cáncer de mama responderá o no al tratamiento con Herceptin. De manera similar, la detección de un aumento en el número de copias del cromosoma 21 (o 18, o 13, o los cromosomas sexuales) en la sangre de una mujer embarazada puede usarse como un diagnóstico no invasivo del síndrome de Down (o el síndrome de Patau o el síndrome de Edwards) en un feto. Un ejemplo adicional es la detección de alelos de un órgano trasplantado que no están presentes en el genoma del receptor: monitorear la frecuencia o el número de copias de estos alelos puede identificar señales de posible rechazo del órgano.
Dispositivos y sistemas de medición, no forma parte de la invención reivindicada
Los métodos de ensayo molecular digital descritos en la presente memoria emplean un dispositivo o sistema de medición, cualquiera de los cuales comprende las partes necesarias para el análisis de muestras. El dispositivo de medición contiene un compartimento de muestras, en el que se introducen las muestras, ya sea mediante la adición directa de la muestra de interés, o mediante la inserción de una cubeta o portaobjetos, que a su vez contiene la muestra de interés. El compar­ timento de la muestra proporciona además un componente que contiene moléculas indicadoras, cuya función es unirse al analito de interés y producir una señal óptica. Para los diseños que se basan en métodos de emisión, el dispositivo de medición proporciona un dispositivo de iluminación para la excitación de los cromóforos contenidos en las moléculas indicadoras. El dispositivo de medición contiene un dispositivo de registro (por ejemplo, un sensor de imagen, por ejemplo, una cámara digital), que detecta y registra la señal óptica de las moléculas indicadoras. Finalmente, el dispositivo de medición puede contener componentes adicionales, tales como controles para la operación, un dispositivo para mostrar o reportar los resultados de análisis y una interfaz con una computadora externa. La presencia de varios componentes opcionales y sus especificaciones pueden diferir entre varios diseños de dispositivos de medición.
El sistema o dispositivo como un todo puede incorporar un soporte para orientar el dispositivo para añadir o retirar mues­ tras de manera conveniente. El sistema se puede acoplar a un dispositivo informático móvil. El dispositivo informático móvil podría ser un teléfono inteligente, un ordenador portátil, una tableta o un dispositivo informático portátil similar. En algunos ejemplos, el dispositivo informático móvil incluye todos los componentes necesarios, tales como: pantalla, un procesador, una memoria e instrucciones de programa almacenadas en la memoria y ejecutables por el procesador, para permitir la ejecución altamente automatizada de etapas tales como: (i) introducción de la muestra, (ii) excitación óptica, (iii) preselección opcional de la muestra para evaluar la calidad de la muestra y el tiempo de exposición óptimo, (iv) registro de una imagen por el dispositivo de registro, (v) sustracción del sesgo de detección, si es necesario, (vi) digitalización de la señal del detector, (vii) registro de la señal digital en memoria no volátil, (viii) reciclaje del detector, si es necesario, y (ix) procesamiento de la señal digital. Las funciones podrían incluir además determinar el resultado del ensayo digital y transmitir el resultado en forma visual al usuario final.
El uso de un teléfono inteligente u otro dispositivo informático móvil como instrumento de detección para ensayos mole­ culares digitales permite sistemas económicos, portátiles y multifuncionales para realizar ensayos en el campo, es decir, fuera del laboratorio. Las aplicaciones pueden incluir sistemas de diagnóstico en el punto de atención para medir la carga viral, el estado nutricional, los biomarcadores de enfermedades o los contaminantes ambientales sin necesidad de trans­ portar una muestra a un laboratorio central. Dichas pruebas podrían realizarse en residencias privadas, instalaciones de salud global, en instalaciones policiales y clínicas médicas. El dispositivo informático móvil puede conectarse a Internet, lo que permitirá combinar los datos del sensor con la información del paciente y la localización geográfica. Se puede proporcionar conectividad a una instalación de computación externa para la interpretación de datos, mapeo geográfico y demográfico, construcción y mantenimiento de bases de datos y envío de notificaciones a autoridades y expertos médicos remotos. Los dispositivos de medición digitales compactos y operables en campo liberarán los ensayos de los requisitos para los técnicos capacitados en los laboratorios. En su lugar, cualquiera podría realizar estos ensayos, debido al tamaño y la asequibilidad del sistema de detección.
Biosensores, no forma parte de la invención reivindicada
Los sistemas o dispositivos de ensayo molecular digital como se describe en la presente memoria comprenden elementos que pueden denominarse "biosensores". Un biosensor es un dispositivo que utiliza moléculas biológicas (por ejemplo, una o más enzimas, anticuerpos o secuencias de nucleótidos) para detectar la presencia de sustancias químicas. Se pueden usar muchos tipos de biosensores en un ensayo molecular digital. Un biosensor normalmente consiste en un componente de captura (a menudo denominado "biorreceptor") y un componente indicador ("biotransductor"), que juntos comprenden una molécula indicadora como se describe en la presente memoria, así como un sistema que incluye un detector, un procesador y una pantalla, y opcionalmente otros elementos tales como un amplificador de señal, una lente de aumento y una fuente de luz. La interacción entre (típicamente la unión de) el analito y el elemento de captura produce una altera­ ción en el elemento indicador, que emite una señal fisicoquímica medible. Esta interacción produce una señal que indica la presencia o concentración del analito objetivo en la muestra.
Los componentes indicadores, tal y como se describen en la presente memoria, incluyen transductores ópticos que inclu­ yen nanopartículas plasmónicas, otros sistemas de resonancia de plasmones superficiales localizados (LSPR), sistemas de dispersión de plasmones, cristales fotónicos y cualquier otra tecnología que pueda detectar una sola molécula y pro­ ducir una señal óptica.
Los elementos de captura pueden ser biomoléculas naturales o diseñadas, tal como un anticuerpo o fragmento (Fab, Fv o scFv) o dominio (VH, VHH) del mismo, o un ácido nucleico (una o más secciones de DNA o RNA complementario al analito de interés).
El elemento de captura se une al elemento indicador, por ejemplo, mediante funcionalización y deposición en capas, o atrapamiento en una matriz, por ejemplo, un hidrogel o xerogel tal como sol-gel. La superficie del sensor a la que se unen las moléculas indicadoras (que comprenden elementos de captura e indicadores), denominada "superficie indicadora", puede ser, por ejemplo, polímero o vidrio; o vidrio recubierto de metal o teniendo nanopartículas metálicas (por ejemplo, oro o plata; también se han utilizado otros metales tales como titanio, cromo y cobre) que componen el elemento indicador. Esta superficie forma o se alinea a lo largo de al menos una pared de una cámara o celda de flujo, dentro o a través de la cual pasa la solución de analito.
En un ejemplo de un biosensor de nanopartículas plasmónicas, la cámara o celda de flujo puede estar hecha de vidrio o polímero; la superficie indicadora de vidrio o polímero puede llevar nanopartículas de oro funcionalizadas con elementos de captura, aplicadas mediante métodos conocidos en la técnica. Para el análisis con microscopía de campo oscuro, la luz pasa a través del borde de la superficie indicadora de vidrio o polímero, ortogonal al plano de la superficie indicadora.
Compartimiento de muestras
El dispositivo de medición proporciona un compartimento de muestra adecuado para la introducción de una muestra de interés. Los dispositivos de medición que emplean técnicas de medición óptica se beneficiarán de un compartimento de muestra que es oblongo, con una dimensión corta. La trayectoria de la luz para la señal óptica desde las moléculas indicadoras hasta el dispositivo de registro se alineará en paralelo con la dimensión corta. Esta orientación minimizará la absorción y la dispersión de la señal óptica que causaría problemas en las trayectorias ópticas más largas. Este criterio permite el uso de compartimentos de muestra prismáticos o cilíndricos.
Volumen del indicador
El compartimento de la muestra comprende un componente, denominado volumen del indicador, que contiene moléculas indicadoras. Este componente evita la necesidad de añadir moléculas indicadoras a la muestra de interés y, en cambio, permitirá el reciclaje de las moléculas indicadoras. Más importante aún, las moléculas indicadoras se mantendrán en una disposición sustancialmente estacionaria, de modo que las moléculas indicadoras inactivas puedan identificarse y regis­ trarse antes del uso clínico del dispositivo de medición.
En algunas realizaciones, el volumen del indicador está definido por un recinto físico que retiene las moléculas indicadoras dentro de sí mismo. El recinto físico puede ser poroso, para permitir el paso del analito al volumen del indicador para el contacto con la molécula indicadora. En algunas realizaciones, el volumen del indicador no está definido por un recinto físico; en su lugar, se pueden proporcionar otros medios para retener las moléculas indicadoras dentro del volumen del indicador y mantener la molécula indicadora estacionaria.
En ciertas realizaciones, las moléculas indicadoras están asociadas con un soporte tridimensional. En un diseño, las moléculas indicadoras se unen covalentemente al soporte tridimensional. Alternativamente, las moléculas indicadoras no están unidas covalentemente al soporte tridimensional, sino que están impregnadas en el soporte tridimensional de tal manera que impiden la difusión desde el soporte tridimensional. En dicho diseño, las moléculas indicadoras quedan sus­ tancialmente atrapadas en el soporte tridimensional y son estacionarias.
El volumen del indicador será preferiblemente estrecho en la dimensión que es perpendicular a la trayectoria óptica para las moléculas indicadoras. Esta geometría proporciona una ventaja importante: es poco probable que la trayectoria óptica de una primera molécula indicadora encuentre una segunda molécula indicadora antes de llegar al dispositivo de registro. Esto se muestra en la Figura 11. En la Figura 11 (a), se muestra un volumen del indicador estrecho con un dispositivo de registro a la derecha y una disposición no uniforme de las moléculas indicadoras en el volumen del indicador. Se verá que, en esta geometría, las trayectorias ópticas desde las moléculas indicadoras hasta el dispositivo de registro están bien separados. Por el contrario, en la Figura 11 (b) se muestra un volumen del indicador ancho. En esta geometría, al menos una molécula indicadora se superpone con una segunda molécula indicadora. Esta superposición es desfavorable por dos razones: (a) la segunda molécula indicadora puede reabsorber parcialmente la señal de la primera molécula indicadora, lo que provoca un error, y (b) la identificación de las moléculas indicadoras inactivas, que requiere una medi­ ción precisa de la señal libre y unida de las moléculas indicadoras, se hará más complicada.
El grado de superposición de las trayectorias ópticas se puede estimar a partir de una pequeña cantidad de parámetros que definen el volumen del receptor, incluyendo la distribución particular de las moléculas indicadoras (aleatorias, semialeatorias, agregadas, ordenadas), la concentración y el tamaño efectivo de las moléculas indicadoras y el grosor del vo­ lumen del indicador. En ciertas realizaciones de la descripción, sustancialmente todas las trayectorias ópticas entre las moléculas indicadoras y el dispositivo de registro no encuentran ninguna otra molécula indicadora. En ciertas realizacio­ nes, sustancialmente todas las trayectorias ópticas entre las moléculas indicadoras y el dispositivo de registro se encuen­ tran como máximo con otra molécula indicadora.
En algunas realizaciones, el volumen del indicador es lo suficientemente delgado como para permitir una sola capa para las moléculas indicadoras. En este diseño, la superposición de trayectorias ópticas no es posible, ya que todas las molé­ culas indicadoras están sustancialmente en un plano perpendicular a la trayectoria óptica y paralelo al dispositivo de registro, como se muestra en la Figura 12 (a). Se pueden usar varias técnicas de monocapa para obtener dicho sistema, tal como el uso de moléculas activas de superficie. El entrecruzamiento de moléculas activas de superficie puede hacer que las moléculas indicadoras sean estacionarias. La discusión de las superficies indicadoras se presenta a continuación en detalle.
Cabe señalar que la distancia preferida de aproximación más cercana para las trayectorias ópticas de diferentes moléculas indicadoras está determinada no solo por el tamaño de las moléculas indicadoras (que pueden determinar si una trayec­ toria óptica de una molécula penetra en una segunda molécula), sino también por la resolución espacial del detector y, en particular, el tamaño del píxel. Idealmente, cada molécula indicadora estará separada por al menos un píxel de cualquier molécula indicadora colindante, para identificar más fácilmente las moléculas indicadoras inactivas y observar la señal óptica de las moléculas indicadoras activas. Además, dependiendo de la divergencia de las trayectorias ópticas que entran en el dispositivo de registro, puede ser deseable una separación mucho mayor. Esto se muestra en la Figura 12(b), para el cual se ha aumentado la distancia entre el volumen del indicador y el dispositivo de registro, para mayor claridad, y para el cual una pequeña divergencia, pero distinta de cero, de la señal óptica que entran en el dispositivo de registro. Será evidente que, incluso aunque las moléculas indicadoras no se superpongan físicamente entre sí, las señales ópticas de moléculas indicadoras estrechamente espaciadas pueden superponerse potencialmente.
Para minimizar la superposición entre trayectorias ópticas de diferentes moléculas indicadoras, será evidente que serán ventajosas características y técnicas que minimicen la agregación de moléculas indicadoras o, por el contrario, aumenten la separación entre moléculas indicadoras. En una realización, las moléculas indicadoras individuales se acoplarán a partículas más grandes, tales como microesferas o micropartículas o nanopartículas. El acoplamiento de moléculas indi­ cadoras a partículas más grandes tenderá a aumentar la distancia media entre las moléculas indicadoras, debido al ta­ maño de las partículas más grandes. Esto se representa en la Figura 12 (c), en la que las moléculas indicadoras 3 están unidas a, o dentro de, partículas más grandes 5.
Superficie indicadora
En determinadas realizaciones, el compartimento de la muestra comprende una superficie indicadora para la unión de moléculas indicadoras. La superficie indicadora está orientada perpendicularmente a la dimensión más corta de un com­ partimento de muestra oblongo, para minimizar la trayectoria óptica desde la molécula indicadora hasta el dispositivo de registro. Esta disposición de las moléculas indicadoras permite una fácil unión de las moléculas indicadoras a un soporte sólido y, además, proporciona un volumen del indicador estrecho, lo que es beneficioso por las razones discutidas ante­ riormente.
La superficie indicadora se orienta frente a una ventana que es sustancialmente transparente a la señal producida por las moléculas indicadoras. La superficie indicadora transparente puede contactar una guía de ondas adecuada para micros­ copía de campo oscuro. En ciertas realizaciones, la superficie indicadora comprende una capa metálica. En ciertas reali­ zaciones adicionales, la capa metálica es adecuada para la resonancia de plasmones superficiales. La superficie indica­ dora y la ventana transparente se pueden localizar en las dos caras de los extremos de un compartimento de muestras prismático o, alternativamente, en las dos caras de los extremos de un compartimento de muestras cilíndrico. En ciertas realizaciones, las caras de los extremos son paralelas y proximales, aproximándose o formando un portaobjetos de en­ sayo o un chip de ensayo.
Moléculas indicadoras
Los dispositivos y sistemas de medición comprenden, y los métodos descritos en la presente memoria emplean, una variedad de moléculas indicadoras. En una realización, se emplea un solo tipo de molécula indicadora, que proporcionará una respuesta de unión de buen comportamiento a varias concentraciones de analitos. Alternativamente, se pueden em­ plear dos o más moléculas indicadoras diferentes que tienen diferentes afinidades por el mismo analito, que pueden acomodar un intervalo más amplio de concentración de analito que un dispositivo de medición que tiene un solo tipo de molécula indicadora, como se describe con más detalle a continuación. En ciertas realizaciones, se proporcionan dos o más moléculas indicadoras diferentes que tienen afinidades por diferentes analitos.
Las moléculas indicadoras pueden comprender un cromóforo. En determinadas realizaciones, el cromóforo se ha unido covalentemente a la molécula indicadora; alternativamente, puede unirse a la molécula indicadora mediante funcionalización, por ejemplo, a la superficie de un punto cuántico o nanopartícula plasmónica. En ciertas realizaciones, el cromóforo absorbe radiación electromagnética. En ciertas realizaciones, el cromóforo absorbe radiación electromagnética en una región espectral elegida entre visible y ultravioleta. Alternativamente, el cromóforo puede dispersar la radiación electro­ magnética. En ciertas realizaciones, el cromóforo es luminiscente. En ciertas realizaciones, el cromóforo es fluorescente. En ciertas realizaciones, el cromóforo es fosforescente.
En ciertas realizaciones de la descripción, cada una de las moléculas indicadoras puede comprender un cromóforo que proporciona una señal óptica tras la unión del analito. La señal óptica puede ser un cambio en el coeficiente de extinción de una banda de absorción, un cambio en la Amax de una banda de absorción, un cambio en el rendimiento cuántico de una banda de emisión, un cambio en la anisotropía de fluorescencia de una banda de emisión, un desplazamiento en el centro de un espectro por encima o por debajo de una longitud de onda especificada, longitud de onda de máxima inten­ sidad (Amax), un cambio en el tamaño o intensidad de la señal, un aumento o disminución en el brillo, un cambio en la forma de la señal, la presencia o ausencia de bandas espectrales; y un cambio en la forma de un espectro.
En ciertas realizaciones de la descripción, la señal óptica es provocada por una interacción entre el analito y el cromóforo. En ciertas realizaciones, la señal óptica es provocada indirectamente por la unión del analito a la molécula indicadora. En ciertas realizaciones, la unión del analito por la molécula indicadora induce un cambio conformacional que afecta una propiedad de absorción o emisión del cromóforo. En ciertas realizaciones, la unión del analito por la molécula indicadora induce una interacción entre un cromóforo en el analito y un cromóforo en la molécula indicadora.
En ciertas realizaciones de la descripción, la molécula indicadora comprende dos cromóforos. En determinadas realiza­ ciones, la unión de un analito por la molécula indicadora induce un cambio geométrico en la molécula indicadora que aumenta una interacción no radiativa entre los dos cromóforos. En ciertas realizaciones, la unión de un analito por la molécula indicadora induce un cambio geométrico en la molécula indicadora que disminuye una interacción no radiativa entre los dos cromóforos. En ciertas realizaciones, la interacción no radiativa es la extinción de la fluorescencia. En ciertas realizaciones, la interacción no radiativa es transferencia de energía de fluorescencia. En ciertas realizaciones, la interac­ ción no radiativa es transferencia de energía de fosforescencia. En ciertas realizaciones, la interacción no radiativa es transferencia de energía de resonancia acoplada a plasmones.
En ciertas realizaciones, el cromóforo es una nanopartícula plasmónica y/o un punto cuántico. La nanopartícula plasmónica y/o el punto cuántico pueden funcionalizarse para llevar un elemento de captura. Cuando el elemento de captura es una molécula biológica tal como un anticuerpo, nucleótido, péptido o fragmento del mismo, el elemento de captura-cromóforo se convierte en una molécula indicadora óptica y un biosensor. El contacto con (por ejemplo, la unión de) un analito, tal como un antígeno o un nucleótido complementario, cambia la masa de, induce un cambio en las propiedades espectrales de las nanopartículas, debido a efectos tales como la transferencia de electrones, la transferencia de energía, la resonancia de plasmón y los cambios en la masa y la movilidad de la partícula.
Moléculas indicadoras inactivas
Los métodos descritos en la presente memoria se adaptan a una determinada fracción de moléculas indicadoras que están inactivas, es decir, la señal óptica de estas moléculas indicadoras inactivas está ausente o es sustancialmente diferente de la mayor parte de las moléculas indicadoras. Este comportamiento puede deberse al fallo de una molécula indicadora para unirse al analito. Alternativamente, una molécula indicadora puede unirse al analito pero no produce una señal óptica, o produce una señal óptica que es sustancialmente diferente del resto de moléculas ópticas.
En ciertas realizaciones, el sistema utiliza una nanopartícula como molécula indicadora. La nanopartícula puede volverse inactiva al agregarse con otras nanopartículas.
En determinadas realizaciones de la descripción, una molécula indicadora inactiva comprende proteínas individuales (in­ cluyendo anticuerpos) que se han agregado, un péptido o proteína que no se ha plegado correctamente, un péptido o proteína que comprende un residuo incorrecto, un cromóforo defectuoso.
El número de moléculas indicadoras inactivas puede permanecer sustancialmente constante durante la vida útil operativa del dispositivo de medición, particularmente en los casos en los que las moléculas indicadoras inactivas tienen una com­ posición defectuosa. También es posible que la cantidad de moléculas inactivas aumente durante la vida útil operativa del dispositivo de medición, debido al deterioro químico de las moléculas indicadoras, en particular el deterioro fotoquímico provocado por la exposición repetida de alta intensidad a fuentes de luz, o la agregación de proteínas que forman parte de la molécula indicadora.
Las moléculas indicadoras inactivas se pueden identificar por un cambio en el comportamiento óptico: ya sea que no produzcan una señal óptica al exponerse a las moléculas del analito, o que produzcan una señal óptica al exponerse a las moléculas del analito que sea significativamente diferente de la mayor parte de las moléculas indicadoras.
En ciertas realizaciones, la pluralidad de moléculas indicadoras se distribuye aleatoriamente. En ciertas realizaciones, la pluralidad de moléculas indicadoras comprende agregados de moléculas indicadoras. En ciertas realizaciones, la plurali­ dad de moléculas indicadoras comprende un ordenamiento geométrico regular en una o más dimensiones. En ciertas realizaciones, cada molécula indicadora está asociada con una zona de exclusión, dentro de la cual no se localiza ninguna otra molécula indicadora.
Dispositivo de registro y microscopio., no forma parte de la invención reivindicada
Se proporciona un dispositivo de registro para registrar la señal óptica de las moléculas indicadoras. En determinadas realizaciones, la señal óptica de las moléculas indicadoras pasa a través de una ventana transparente del compartimento de la muestra. En ciertas realizaciones, el dispositivo de registro será un sensor de imagen, tal como una cámara. Una cámara CMOS (semiconductor de óxido de metal complementario), por ejemplo, es útil porque puede leer cada píxel individualmente; además, las cámaras CMOS consumen muy poca energía, lo que les permite durar más cuando se usan como parte de un dispositivo en el campo. Casi todas las cámaras de los teléfonos inteligentes tienen cámaras CMOS, muchas con una resolución de más de 10 megapíxeles, lo que las hace útiles en los métodos, sistemas y dispositivos descritos en la presente memoria.
En determinadas realizaciones de la descripción, el dispositivo de registro permite la observación de una o más señales del compartimento de muestra. En determinadas realizaciones, cada una de una pluralidad de señales se origina en una región diferente del compartimento de muestra. En determinadas realizaciones, cada señal de la pluralidad de señales se origina a partir de un píxel en una cuadrícula geométrica regular que se extiende por el compartimento de la muestra.
En determinadas realizaciones, los píxeles de un dispositivo de registro están dispuestos en una matriz rectangular o cuadrada. En determinadas realizaciones, los píxeles de un dispositivo de registro están dispuestos en una matriz cua­ drada de 512 x 512, una matriz cuadrada de 1024 x 1024, una matriz cuadrada de 2048 x 2048 o una matriz cuadrada de 4096 x 4096. En ciertas realizaciones, la señal de cada píxel se registra por separado de todos los demás píxeles. En ciertas realizaciones, la señal de conjuntos de píxeles de 2 x 2 se agrupa.
El dispositivo de medición puede permitir la observación de una pluralidad de señales de diferentes regiones de la plura­ lidad de moléculas indicadoras. En ciertas realizaciones adicionales, las diferentes regiones de la pluralidad de moléculas indicadoras están dispuestas en una cuadrícula regular. Alternativamente, la señal óptica individual de sustancialmente todas las moléculas indicadoras puede observarse sin interferencia de ninguna otra molécula indicadora.
En ciertas realizaciones, el dispositivo de registro puede capturar píxeles individuales y/o moléculas indicadoras indivi­ duales. El uso de nanopartículas plasmónicas/puntos cuánticos como sustratos a los que se funcionalizan los elementos de captura facilita esta detección. Usado en combinación con una lente de aumento, el dispositivo de registro podría detectar señales aún más pequeñas. Dichas lentes son bien conocidas en la técnica.
El dispositivo de registro puede utilizar cualquier técnica conocida en la técnica para la detección y cuantificación de complejos de molécula indicadora/analito. Los dispositivos de registro pueden utilizar métodos de emisión y absorción óptica que se combinan con el diseño de la molécula indicadora.
El dispositivo de registro puede realizar mediciones de absorción óptica. Por ejemplo, la unión con una molécula indica­ dora puede acoplarse con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) que produce un producto coloreado en presencia de un analito. Cuando el ELISA se funcionaliza en una nanopartícula plasmónica o un punto cuántico, la presencia y la cantidad de analito se reportarían, por ejemplo, mediante la longitud de onda, la intensidad, etc. de una característica de absorción; y produciría una señal de cada nanopartícula en lugar de una señal masiva.
Alternativamente, la salida óptica podría incluir la emisión de fluorescencia del fluoróforo en la molécula indicadora o acoplada con la molécula indicadora que es excitada por una fuente de luz. La presencia y cantidad de analito se reportaría entonces por la intensidad de la emisión de fluorescencia. El fluoróforo podría estar cerca de una superficie, tal como un cristal fotónico, de modo que se mejore la emisión de fluorescencia. Se pueden emplear múltiples fluoróforos para ajustar la señal de fluorescencia a un resultado deseable. Por lo tanto, la señal óptica puede modularse mediante transferencia de excitación entre dos o más fluoróforos.
El rendimiento cuántico de fluorescencia y fosforescencia, el desplazamiento de Amax y la anisotropía se contemplan en esta descripción. Para las mediciones de anisotropía, se pueden introducir polarizadores en la trayectoria óptica de exci­ tación o emisión, o en ambas. Una fuente de luz se puede acoplar con los métodos de emisión. La fuente de luz puede ser una fuente de banda ancha convencional, un diodo emisor de luz o un láser, y puede aplicarse a la muestra directa­ mente o mediante un dispositivo de selección de longitud de onda, tal como una rejilla, para optimizar la excitación. La luz se puede dirigir a través de un componente de reflexión interna total que incorpora una guía de ondas y forma la base de la superficie indicadora, proporcionando así una excitación de campo oscuro.
En algunas realizaciones, el medio de ensayo óptico podría incluir una superficie configurada para dispersión Raman mejorada en superficie (SERS). Por lo tanto, la salida óptica podría incluir dispersión Raman de la fuente de luz por moléculas indicadoras en la superficie SERS. La presencia y cantidad de analito se reportaría entonces por la intensidad de la dispersión Raman.
Identificación de moléculas indicadoras inactivas
En la presente memoria se proporcionan métodos para identificar moléculas indicadoras inactivas, denominados "método de identificación". Para ciertos sistemas, dos soluciones, la primera sin analito y la segunda con una alta concentración de analito, se pondrán en contacto secuencialmente con la superficie indicadora. Se apreciará que estas dos soluciones provocarán una ausencia de unión del analito por la molécula indicadora y una casi saturación de la unión del analito por la molécula indicadora, respectivamente. Las imágenes se registran usando el dispositivo de registro y se hace una com­ paración entre las imágenes para las condiciones sin analito y saturadas con analito. Las moléculas indicadoras que no cumplen los criterios de selectividad se marcan como inactivas.
En el caso de la inactivación debida a la agregación de nanopartículas, la identificación de las moléculas indicadoras inactivas será sencilla. La formación de agregados será evidente en la inspección visual de las imágenes del dispositivo de registro y no requerirá el procedimiento "sin analito" y "saturado con analito" descrito anteriormente.
El método de identificación mantiene un registro de la localización de las moléculas indicadoras en el dispositivo de me­ dición. La localización de las moléculas indicadoras se puede referenciar mediante coordenadas x/y, por ejemplo, en relación con una cuadrícula geométrica apropiada en el dispositivo de medición, o en relación con las coordenadas de píxeles en el dispositivo de registro. El registro de moléculas indicadoras inactivas se puede mantener en una memoria de computadora no volátil.
El método de identificación proporcionará criterios para etiquetar moléculas indicadoras como inactivas. Los criterios se establecen para lograr un equilibrio entre la eliminación del uso de moléculas indicadoras que se comportan mal y el mantenimiento de un recuento suficientemente alto de moléculas indicadoras para los requisitos particulares de precisión y sensibilidad del dispositivo de medición. Para eliminar el sesgo y habilitar el etiquetado automático, se puede elegir un umbral numérico, basado en el tipo de señal óptica que se observa. Solo a modo de ejemplo, una determinada molécula indicadora puede sufrir un desplazamiento en la Amax de emisión al unirse a una molécula de analito, y el Amax se desplaza en 20 nanómetros (nm) para la mayor parte de los compuestos en este ejemplo. Se puede elegir un umbral de un despla­ zamiento de 5 nm para este ejemplo particular.
Para satisfacer los requisitos de precisión y sensibilidad, el umbral numérico se puede elegir para excluir una determinada fracción de moléculas indicadoras. Haciendo referencia al ejemplo anterior, se puede observar un desplazamiento de Amax de 12 nm para el 95% de las moléculas indicadoras. Un umbral de Amax de 12 nm puede entonces elegirse para retener el 95% de las moléculas indicadoras como activas y descartar el 5% de las moléculas indicadoras como inactivas.
Se puede aplicar una variedad de criterios para asignar un estado inactivo. Es importante destacar que se puede elegir cualquier criterio para asignar moléculas indicadoras como inactivas. Dado que la unión de cualquier molécula indicadora es independiente de todas las demás moléculas indicadoras, la eliminación de una molécula indicadora del grupo de moléculas indicadoras activas no afecta el comportamiento de las moléculas restantes.
Si se indica, el método de identificación descrito anteriormente se puede repetir periódicamente durante la vida útil ope­ rativa de un dispositivo de medición. Esta práctica será especialmente beneficiosa para los dispositivos indicadores cuyo rendimiento es susceptible de deteriorarse con el tiempo. Idealmente, el método de identificación requerirá una cantidad mínima de intervención del operador, con el dispositivo de medición realizando automáticamente todas las etapas reque­ ridas. En el caso de las moléculas indicadoras basadas en nanopartículas, las imágenes pueden registrarse periódica­ mente y cualquier agregación que se pueda producir con el tiempo puede identificarse mediante un software de compa­ ración de patrones.
El método de identificación también puede comprender las etapas de someter el dispositivo de medición a una o más soluciones que contengan concentraciones intermedias de analito. Esto será particularmente importante para la medición cuantitativa del analito, para el cual se contempla un intervalo de saturación de la molécula indicadora. Mediante el uso de varias soluciones, que abarcan un intervalo de concentraciones de analito, se puede construir una curva de calibración para hacer coincidir mejor los datos de informes ópticos con la concentración de analito.
Un beneficio clave del uso de señales espacialmente resueltas de un campo de moléculas indicadoras es que las regiones del dispositivo de registro que son particularmente problemáticas pueden marcarse como tales y descartarse en análisis posteriores. Esto incluye no solo los casos de moléculas indicadoras inactivas, es decir, anticuerpos plegados de forma incorrecta, sino también cualquier región que presente dificultades. Esto puede incluir puntos superpuestos de dos o más moléculas indicadoras estrechamente espaciadas, o moléculas indicadoras cuyos estados libre y unido son poco distin­ guibles, por cualquier motivo. La unión de cada molécula indicadora individual es independiente de todas las demás, y descartar un pequeño conjunto de señales ópticas puede mejorar la exactitud o la precisión, mientras que la sensibilidad solo se ve afectada ligeramente.
Exactitud /precisión / sensibilidad
Se espera que la exactitud de los métodos de medición digital descritos sea al menos tan buena como la de los métodos analógicos convencionales. Los métodos de medición digital minimizarán o eliminarán varias fuentes de error, que por definición es la fuente de baja exactitud. A modo de ejemplo, una fuente de error surge de las moléculas indicadoras que están inactivas: no se unen a la molécula del analito o se unen a la molécula del analito y no proporcionan la señal óptica esperada. Cualquiera de las dos situaciones, si no se tiene en cuenta, introduce un error en la estimación de la concen­ tración del analito, ya que la señal observada será inferior a la esperada.
Se espera que la precisión de los métodos de medición digital descritos sea al menos tan buena como la de las mediciones analógicas convencionales. Los métodos convencionales, que observan una señal masiva de la totalidad de las moléculas indicadoras, pueden proporcionar estimaciones de precisión utilizando varios métodos estadísticos y numéricos en la mayoría de los casos, pero no en todos.
Considérese el sistema tal como el representado en la Figura 3, que contiene una colección de moléculas indicadoras que comprenden un cromóforo. El desplazamiento espectral observado de la señal masiva será el promedio de todos los desplazamientos (si los hay) y puede ser bastante pequeño para concentraciones de analito pequeñas. Este desplaza­ miento puede ser difícil de discernir, especialmente considerando la ampliación de la curva debido a los diferentes microambientes que rodean a cada cromóforo.
Por el contrario, utilizando el ensayo molecular digital y observando los desplazamientos espectrales para cada molécula indicadora, las moléculas indicadoras libres mostrarán un desplazamiento cero, mientras que las moléculas indicadoras unidas mostrarán un desplazamiento completo. No hay estado intermedio. Naturalmente, no todos los cromóforos se desplazarán en el mismo valor, pero el valor esperado y el intervalo se pueden determinar antes del uso en el campo. Las moléculas indicadoras con valores atípicos se pueden descartar como inactivas.
Se espera que la relación señal/ruido para los métodos digitales descritos sea al menos tan buena como la de los métodos convencionales. Para la detección masiva, las concentraciones más pequeñas de analitos darán lugar a una señal masiva más débil. Para la detección digital, las concentraciones más pequeñas de analitos darán lugar a un número menor de señales discretas, cada una de las cuales tendrá la misma intensidad o valor.
Ajuste de curvas
Las señales individuales para moléculas indicadoras discretas, mostradas como simulaciones en la Figura 8, se prestan a técnicas de ajuste de curvas que pueden mejorar la relación señal-ruido. La señal de cada molécula indicadora activa caerá en cualquiera de las dos regiones del espectro, para las cuales se pueden construir curvas libres de ruido idealiza­ das (correspondientes a las curvas de la Figura 8), en base al conocimiento previo de la molécula indicadora. Dado que cada indicador solo puede estar libre o unido, la señal observada de una molécula indicadora puede asignarse como libre o unida. Esto contrasta con muchas aplicaciones de ajuste de curvas, para las cuales se debe acomodar la superposición de las señales de dos o más estados, en proporciones variables, para modelar la señal observada.
Un ejemplo de ajuste de curva se muestra en la Figura 13. La emisión de dos señales, mostrada en gris, se suma con la adición simulada de "ruido" para formar una señal neta observada, que se muestra en negro. Las señales son similares a las presentadas en la Figura 7, y la línea discontinua vertical en la Figura 12 corresponde a la misma delineación de la molécula indicadora unida al analito y sin analito a 500 nm que se discutió para la Figura 8. Las técnicas de ajuste de curvas pueden, dada la señal observada, estimar las señales individuales que se combinaron para dar la señal general. Las señales observadas que comprenden un pequeño número de señales individuales bien separadas se pueden evaluar mediante el ajuste de curvas con alta exactitud y precisión de ajuste de curvas. Además, debido a la naturaleza digital de la unión, es decir, la molécula indicadora está unida al analito o está libre de analito, una sola molécula indicadora puede proporcionar solo una de las dos señales posibles, correspondientes a los estados unido al analito y libre de analito, sin un estado intermedio posible. En el ejemplo mostrado en la Figura 12, la señal observada se puede atribuir claramente a dos moléculas indicadoras, una con emisión por debajo de 500 nm y la otra con emisión por encima de 500 nm, que corresponden a una molécula indicadora unida al analito y otra libre de analito. La propiedad digital de este experimento simplificará sustancialmente el proceso de ajuste de curvas.
Además, el uso de técnicas de ajuste de curvas puede resultar ventajoso para manejar dos o más moléculas indicadoras cuyas señales ópticas no se pueden resolver espacialmente. En el caso de dos moléculas indicadoras, cuyas señales no se pueden resolver entre sí, son posibles cuatro estados: (a) ambos receptores unidos; (b) ambos receptores libres; y (c) y (d): un indicador libre (se puede esperar que los dos últimos estados tengan señales ópticas similares pero no necesa­ riamente idénticas). Esta situación es necesariamente más compleja que la molécula indicadora individual; sin embargo, sigue siendo muy manejable, en comparación con la señal óptica de las muestras masivas.
Los métodos de ajuste de curvas se pueden usar para manejar dos o más moléculas indicadoras cuyas señales ópticas se resuelven espacialmente parcialmente, es decir, las señales ópticas de las dos o más moléculas indicadoras se ex­ tienden de manera desigual a lo largo de varios píxeles. Se puede esperar que este escenario sea más común que la superposición espacial exacta de dos o más moléculas indicadoras, especialmente para dispositivos de registro con píxeles finamente espaciados. Este escenario puede beneficiarse del ajuste de la curva de no un solo espectro de un solo píxel (o un espectro sumado de una colección de píxeles estrechamente espaciados), pero en cambio una colección de espectros individuales de una colección de píxeles estrechamente espaciados, combinados con perfiles para los puntos (parcialmente superpuestos).
Isoterma de unión
La relación entre el recuento de moléculas indicadoras unidas y la concentración de analito, conocida como "isoterma de unión", es compleja e indirecta. En resumen, la relación de moléculas indicadoras unidas/totales aumenta asintóticamente a 1 a medida que aumenta la concentración de analito libre. (Por lo general, el analito está presente en exceso, en com­ paración con una concentración mucho más pequeña de molécula indicadora, por lo que la concentración de analito libre y la concentración total de analito son aproximadamente iguales. Esta aproximación se utilizará a lo largo de esta discu­ sión). Una molécula indicadora de mayor afinidad se unirá a una mayor proporción de molécula de analito en cualquier concentración de analito dada. Es importante destacar que la concentración total de la molécula indicadora se refiere únicamente a la molécula indicadora activa.
Se muestra en la Figura 14 dos curvas isotérmicas de unión. El eje horizontal corresponde a la concentración del analito, y el eje vertical corresponde a la relación de molécula indicadora unida/total. Las líneas curvas representan las dos iso­ termas de unión, que determinan la relación de molécula indicadora unida/total a cualquier concentración de analito dada. Para cada curva, la relación receptor unido/total se aproxima asintóticamente a 1 a medida que aumenta la concentración del analito, y a medida que la molécula indicadora se acerca a la saturación, es decir, la mayoría de las moléculas indica­ doras se unen a una molécula de analito. La curva superior oscura corresponde a una molécula indicadora de mayor afinidad, y la curva inferior corresponde a una molécula indicadora de menor afinidad. Será evidente que la afinidad de la molécula indicadora por el analito desempeñará un papel importante en la facilidad de cuantificar analitos en diferentes intervalos de concentración de analitos.
En la Figura 14, el eje vertical (relación de la molécula indicadora unida/total) es la variable dependiente, y la concentración del analito es la variable independiente, ya que la relación unida/total depende de la concentración del analito. A efectos analíticos, el gráfico se utiliza a la inversa; es decir, la relación unida/total se obtiene del experimento, y se localiza en el eje vertical. A partir del gráfico y la curva de isoterma de unión, la concentración de analito libre correspondiente se encuentra en el eje horizontal. Visualmente, este proceso se puede entender dibujando una línea horizontal desde la relación unida/total observada en el eje y hasta la curva de isoterma, y dibujando una línea vertical al eje x, para encontrar la concentración del analito. (En la práctica, este proceso se realiza matemática o numéricamente; sin embargo, el análisis de errores aún se mantiene).
La Figura 15 corresponde a una muestra con una concentración de analito libre de aproximadamente 0,10, lo que corres­ ponde a una relación unida/total de aproximadamente 0,72. Esta condición se indica en la isoterma de unión como un círculo sólido. Una determinación "correcta" de 0,72 para la relación unida/total, en el eje vertical, se traza horizontalmente hasta la isoterma de unión y hacia abajo hasta el eje horizontal. Este proceso está indicado por dos flechas negras. El resultado de subestimar la relación unida/total en aproximadamente un 5 % se muestra con dos flechas grises, con un círculo gris correspondiente en la isoterma de unión.
La Figura 16 corresponde a una muestra con una concentración de analito libre más alta de aproximadamente 0,40, correspondiente a una relación unida/total de aproximadamente 0,92, y nuevamente marcada con un círculo sólido en la isoterma de unión. Una determinación correcta se indica con dos flechas negras, como en el ejemplo anterior. La subes­ timación de la relación unida/total en un 5% se muestra otra vez con flechas grises y un círculo gris. En este ejemplo, una subestimación del 5 % en la relación unida/total conduce a un error sustancial de aproximadamente el 40 % en la con­ centración del analito. La diferencia de comportamiento entre la Figura 15 y la Figura 16 se debe a la diferente pendiente del gráfico de isoterma de unión en los dos puntos representados en estos dos gráficos, y esta propagación de errores será más grave a concentraciones más altas de analito, donde la curva de isoterma de unión es más plana.
Los dispositivos analíticos que utilizan la unión molecular para la cuantificación de analitos son susceptibles a otra fuente de error: en muchos casos, no todas las moléculas indicadoras son activas para la unión del analito. Esto provoca un error en la estimación de la relación unida/total que, como se describió anteriormente, puede propagarse en un error sustancial en la concentración estimada del analito.
A modo de ejemplo, considérese un dispositivo de medición en el que el 10% de las moléculas indicadoras están inactivas. La saturación de las moléculas indicadoras producirá solo el 90 % de la señal máxima esperada, ya que el 10 % de las moléculas indicadoras no logran proporcionar una señal óptica (ya sea porque falla la unión al analito o porque falla el complejo receptor/analito para producir una señal óptica). La inspección de las Figuras 15 y 16 revelará el error sustancial que se introducirá en las mediciones, particularmente a concentraciones de analito más altas. Hasta cierto punto, este error se puede abordar mediante la selección previa de dispositivos de medición en condiciones de saturación para esti­ mar la señal máxima, que se utilizará como punto de referencia para futuras mediciones. Sin embargo, este procedimiento no es ideal, ya que nunca se puede lograr la saturación total.
En la Figura 14 se muestran dos curvas isotérmicas de unión. La curva oscura superior corresponde a una molécula indicadora de mayor afinidad. La ventaja de usar esta molécula indicadora es que se puede lograr una saturación casi completa a una concentración relativamente baja: a 0,40 nM, la molécula indicadora está saturada en un 90 %. La des­ ventaja es que esta molécula indicadora es útil para cuantificar concentraciones más pequeñas de aproximadamente 0,10 nM, ya que la región poco profunda de la curva de isoterma de unión está sujeta a un error significativo, como se explicó anteriormente.
Por el contrario, la curva de luz inferior, que corresponde a una molécula indicadora de menor afinidad, es útil para cuantificar un intervalo más amplio de concentraciones de muestra, ya que la curva es relativamente pronunciada para todo el intervalo. Sin embargo, la molécula indicadora alcanza como máximo una saturación del 70 % en este intervalo, y será difícil lograr la determinación de la señal correspondiente a una saturación del 100 %.
Los métodos de ensayo molecular digital descritos en la presente memoria pueden incluir la etapa de dilución de la mues­ tra, lo que mejorará la precisión de la concentración estimada del analito al reducir la susceptibilidad de la medición a errores en la concentración de la molécula indicadora unida/total. A modo de ejemplo, considérese la muestra descrita anteriormente, cuyo comportamiento de unión se representa en la Figura 15. Debido al alto grado de saturación de la molécula indicadora, la curva de isoterma de unión es muy poco profunda en la región alrededor de la concentración del analito de 0,40 y, por lo tanto, la determinación de la concentración del analito es muy susceptible a incluso pequeños errores en la concentración de la molécula indicadora unida/total. Esta proporción se hace más precisa mediante medi­ ciones digitales, como se discutió anteriormente; sin embargo, sería preferible, desde el principio, que la determinación de la concentración del analito no fuera tan susceptible a errores en la concentración de la molécula indicadora unida/total.
Considérese el efecto de una dilución de cuatro veces de esta muestra, es decir, la adición de un volumen suficiente de soluto para que la concentración del analito caiga de 0,40 a 0,10. Como resultado de esta dilución, el comportamiento de unión estaría ahora representado por la Figura 14. Debido a la curva de isoterma de unión más pronunciada en la región alrededor de la nueva concentración de analito de 0,10, la determinación de la concentración de analito es mucho menos susceptible a errores en la concentración de indicador unido/total.
Las propiedades de sensibilidad de las mediciones digitales hacen que la etapa de la dilución de la muestra sea un procedimiento atractivo para mejorar la precisión. Será fácilmente evidente que la precisión de una medición "analógica" masiva de la concentración de la molécula indicadora unida se verá afectada por la dilución de la muestra. Pasando de la Figura 14 a la Figura 13, la concentración de la molécula indicadora unida cae de 0,92 a 0,72, lo que representa una caída del 22 % en la concentración unida. Una señal analógica masiva que es proporcional a la concentración de la molécula indicadora unida disminuiría en magnitud en un 22 %. Es casi seguro que esta caída en la magnitud iría acompañada de un aumento en la relación señal-ruido, ya que la magnitud del ruido permanecería constante. Por lo tanto, el aumento de la precisión debido al efecto de la isoterma de unión descrito anteriormente se verá contrarrestado por una disminución de la precisión debido al empeoramiento de la relación señal-ruido en la determinación de la concentración del indicador unido.
Por el contrario, las mediciones digitales son mucho menos sensibles a este deterioro de la relación señal-ruido con la dilución. Como se discutió anteriormente, un recuento reducido de moléculas indicadoras unidas afecta las mediciones digitales de manera diferente a las mediciones analógicas. En lugar de debilitar la señal masiva de las mediciones analó­ gicas y, por lo tanto, empeorar la relación señal-ruido, una disminución del recuento de moléculas indicadoras unidas simplemente reducirá el recuento de señales ópticas discretas que recibe el dispositivo indicador. Es importante destacar que la intensidad de cada una de estas señales ópticas discretas permanecerá sin cambios.
Por esta razón, los métodos de dilución para mejorar la precisión descritos anteriormente no van acompañados de una disminución de la precisión debido a los efectos analógicos de señal-ruido y, por lo tanto, resultarán beneficiosos para las mediciones digitales. Los métodos de medición pueden incluir una etapa de dilución previa de una muestra antes de introducirla en el dispositivo de medición. Alternativamente, los métodos de medición pueden, después de reportar una concentración de analito, indicar al usuario que una medición repetida de la muestra mejoraría la precisión y pueden asesorar al usuario sobre el nivel de dilución recomendado.
Los métodos de medición pueden incluir una preselección rápida de una muestra que está optimizada para proporcionar rápidamente una estimación de baja precisión de la concentración del analito, con el fin de sugerir una dilución óptima.
En muchos usos previstos para los métodos descritos, se han establecido umbrales o puntos de corte que corresponden a valores críticos. Estos umbrales o puntos de corte pueden corresponder a niveles regulatorios establecidos por las leyes ambientales, o a niveles críticos de biomarcadores que corresponden a ciertas condiciones de salud. Los métodos de medición pueden ajustar los parámetros de escaneo recomendados y el nivel de dilución para proporcionar condiciones de medición adecuadas para el uso previsto.
En determinadas realizaciones, el dispositivo de medición puede proporcionar un mecanismo para la dilución automática de una muestra. Esto se puede lograr expulsando una fracción de una muestra existente, seguido de la introducción de soluto para dilución. Esto también se puede lograr introduciendo una nueva muestra que se haya diluido previamente con soluto.
En determinadas realizaciones, el nivel de dilución recomendado puede calcularse mediante un dispositivo informático, ya sea incorporado en el dispositivo de medición o conectado al dispositivo de medición. El dispositivo informático puede proporcionar el nivel de dilución recomendado al operador a través de una interfaz (tal como una pantalla, una copia impresa o un informe de voz sintetizado). El dispositivo informático también puede controlar directamente el dispositivo de medición para realizar cualquiera de las etapas necesarias para analizar automáticamente una muestra diluida, sin necesidad de la intervención del usuario.
En ciertas realizaciones, los umbrales o puntos de corte pueden preestablecerse en el dispositivo informático, ya sea en forma de firmware, que puede actualizarse opcionalmente en el caso de que cambie un umbral o punto de corte, o en forma de software. Además, el software operativo puede solicitar al usuario que introduzca más información sobre la muestra que se está midiendo. Por ejemplo, en el caso de la medición de biomarcadores, el usuario puede ingresar parámetros de historial para un sujeto, tal como edad, peso, sexo y similares, que pueden alterar un umbral o punto de corte y que, por lo tanto, pueden influir en la precisión que se requiere para una medición dada.
Ejemplos
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1: inmunoensayo de sándwich plasmónico
En la presente memoria se describe una implementación del ensayo molecular digital en un formato de inmunoensayo de anticuerpo dual. Los inmunoensayos de anticuerpos duales se utilizan ampliamente en los ensayos clínicos clásicos y se pueden obtener fácilmente pares de anticuerpos estándar para esta aplicación. Para la detección, el acoplamiento de plasmones entre nanopartículas metálicas, que se unirán a través del analito en el inmunoensayo tipo sándwich, propor­ ciona una lectura robusta de la unión de la molécula del analito a las partículas. El acoplamiento de plasmones ofrece una gran fortaleza en el sentido de que la longitud de onda de dispersión de las partículas acopladas puede diferir sustancial­ mente de las longitudes de onda de dispersión de partículas individuales, lo que lleva a distintos cambios de color fácil­ mente discernibles a nivel de partícula individual por color, incluso en la cámara de un teléfono celular.
En este ejemplo, las nanopartículas de oro esféricas (por ejemplo, entre 10 nm y 100 nm de diámetro) pueden funcionar bien. Para los propósitos presentes, la detección sin marcaje es innecesaria y la detección se logra mediante la nanopartícula metálica secundaria como potenciador de la señal. Esto implica la unión de otra nanopartícula (oro) a través de un segundo anticuerpo que da como resultado un acoplamiento plasmónico entre las dos nanopartículas que conduce a desplazamientos espectrales marcados. Esta estrategia se ha utilizado en la detección de cambios conformacionales en proteínas y moléculas de DNA y permitirá una fácil detección de la unión de un solo analito en imágenes adquiridas con cámaras simples, tales como las que están disponibles en los teléfonos celulares. El cambio de color mejorado debido a la segunda nanopartícula depende del tamaño de la segunda nanopartícula, así como de la distancia efectiva entre las nanopartículas. La separación entre partículas (anticuerpo I-analito-anticuerpo II) esperada en nuestro ensayo será de 20­ 30 nm y está dentro de los límites del acoplamiento plasmónico efectivo. Si bien normalmente usamos nanopartículas de oro de 40 nm, la dependencia de la disminución exponencial en el acoplamiento plasmónico con la distancia entre partí­ culas del tamaño de la segunda nanopartícula (es decir, las nanopartículas más pequeñas muestran una rápida disminu­ ción en el acoplamiento plasmónico en comparación con las más grandes) permite aún más el ajuste fino del desplaza­ miento espectral mediante el uso de nanopartículas de oro grandes.
La formación de imágenes de campo oscuro es una forma apropiada de monitorear la luz dispersada de pares de partí­ culas individuales en el ensayo. La microscopía de campo oscuro es una técnica óptica en la que la muestra no se ilumina directamente. En su lugar, la luz dispersa se utiliza para la visualización de objetos que da como resultado una intensidad de fondo casi negra que genera un contraste muy mejorado entre los objetos y el fondo. De hecho, los materiales nanoplasmónicos producen una gran cantidad de fotones sin parpadeo ni fotoblanqueo, fenómenos que estropean la detección basada en fluorescencia que se usa comúnmente en los ensayos de biodetección convencionales, permitiendo así la observación de partículas individuales con una configuración óptica simple.
La clave del ensayo molecular digital es la evaluación individual de cada partícula en el campo de visión. Esto se puede lograr de varias maneras, pero una forma implica la comparación de imágenes antes y después, en la que la partícula de captura se dispone primero (aleatoriamente o en patrones) sobre un sustrato. Se obtienen imágenes de las partículas ordenadas antes de la introducción de la muestra, lo que proporciona la información "antes". A continuación, la muestra fluye hacia la cámara junto con el anticuerpo secundario marcado. En una captura exitosa del analito, una partícula se­ cundaria marcada se asociará con la partícula de captura, lo que dará lugar a un cambio definido en el brillo y el color. Cada partícula en la imagen anterior se caracterizará para determinar que tiene el brillo y el color esperados de las partí­ culas de captura única. Cualquier partícula agregada o alterada de otro modo se ignorará en el análisis posterior. Después de la captura del analito, se analizan todas las imágenes de los objetos en las localizaciones de buenas partículas de captura. Se utiliza un criterio estadístico para la interpretación de imágenes para distinguir las capturas de analitos fallidos (por ejemplo, partículas agregadas o unidas de forma no específica) de las capturas de analitos limpios. El análisis de fondo y la corrección de errores se mejoran al incluir partículas no funcionalizadas como marcadores fiduciales. Estos se pueden usar para detectar la infiltración exitosa de solvente, la exposición al aire o cualquiera de una variedad de otros modos de fallo que pueden inutilizar partes del campo de partículas. En los ensayos masivos, este tipo de errores simple­ mente degradan la señal. Pero en el formato de ensayo molecular digital, dichos errores se pueden eliminar antes de tiempo. De hecho, en muchos experimentos de obtención de imágenes de fluorescencia de una sola molécula, es común que grandes regiones del campo de visión no se puedan usar por varias razones, pero con muchas moléculas buenas en el medio, los experimentos aún pueden ejecutarse con éxito.
Ejemplo 2: Ensayo de hibridación plasmónica
En una modificación del ejemplo anterior, la hibridación de sondas de ácido nucleico unidas a la superficie se combina con el acoplamiento plasmónico entre nanopartículas para proporcionar un ensayo molecular digital para analitos de ácido nucleico. Se modifica una superficie con un primer oligonucleótido al que se ha unido una primera nanopartícula. La modificación de la superficie se puede realizar por adsorción no covalente o por unión covalente. La secuencia del primer oligonucleótido se elige para hibridarse con una primera secuencia complementaria que está contenida en el ácido nu­ cleico del analito deseado. La exposición de la superficie modificada induce entonces la hibridación del analito con la primera secuencia oligonucleotídica corta. En este punto se introduce un segundo oligonucleótido al que se le añade una segunda nanopartícula. La secuencia del segundo oligonucleótido se elige para hibridar con una segunda secuencia complementaria que está contenida en el ácido nucleico del analito deseado, con la primera y la segunda secuencias complementarias suficientemente separadas entre sí para permitir la hibridación simultánea tanto de la primera como de la segunda secuencia de oligonucleótidos.
El ensamblaje supramolecular provocado por la hibridación del ácido nucleico del analito con la primera y la segunda secuencia de oligonucleótidos puede diseñarse para acercar la primera y la segunda nanopartícula, como para el inmunoensayo de tipo sándwich descrito anteriormente. Aunque no es estrictamente necesario para el diseño exitoso de este sistema, la adopción de estructuras helicoidales canónicas por parte del nucleótido del analito hibridado simplificará la geometría molecular y facilitará la elección de parámetros tales como la longitud de la secuencia y la naturaleza y locali­ zación de la unión a las nanopartículas.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar la presencia o concentración de al menos un analito en una muestra, que comprende: incubar al menos un tipo de moléculas indicadoras ópticas con al menos un tipo de moléculas de analito, en una imagen de una pluralidad de señales emitidas por al menos un tipo de moléculas indicadoras ópticas incubadas con al menos un tipo de moléculas de analito,
para cada tipo de moléculas indicadoras ópticas, determinar en la imagen qué moléculas indicadoras ópticas están activas y cuáles están inactivas;
determinar el número de moléculas indicadoras ópticas activas discretas unidas a moléculas de analito ("moléculas indi­ cadoras ópticas activas unidas") y el número de moléculas indicadoras ópticas activas discretas no unidas al analito ("moléculas indicadoras ópticas libres") en la imagen mediante la resolución individual de moléculas indicadoras ópticas unidas y libres; y
determinar la presencia o concentración del analito a partir del número de moléculas indicadoras ópticas activas unidas como una fracción de, o en proporción a una fracción del número total de moléculas indicadoras ópticas activas.
2. El método de la reivindicación 1, en el que se determina la concentración del al menos un analito.
3. El método de la reivindicación 2, en el que el analito se elige de:
• una secuencia de nucleótidos; y
• un antígeno.
4. El método de la reivindicación 3, en el que la molécula indicadora óptica comprende un elemento de captura elegido de:
• una o más secuencias de nucleótidos que se unen al analito; y
• un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une al analito.
5. El método de la reivindicación 4, en el que cada molécula indicadora óptica comprende una nanopartícula plasmónica.
6. El método de la reivindicación 5, en el que la molécula indicadora óptica comprende una o más secuencias de nucleótidos funcionalizadas en una o más nanopartículas plasmónicas.
7. El método de la reivindicación 5, en el que la molécula indicadora óptica comprende uno o más anticuerpos funcionalizados en una o más nanopartículas plasmónicas.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la señal de la molécula indicadora óptica se elige de:
• longitud de onda de la luz;
• intensidad de la señal;
• brillo;
• la forma de una señal o espectro; y
• la presencia o ausencia de bandas espectrales.
9. El método de la reivindicación 8, en el que las moléculas indicadoras ópticas unidas y libres se resuelven indivi­ dualmente mediante:
• un desplazamiento en el centro de un espectro por encima o por debajo de una longitud de onda específica;
• un cambio en el tamaño o intensidad de la señal;
• un aumento o disminución del brillo;
• un cambio en la forma de la señal;
• la presencia o ausencia de bandas espectrales; y
• un cambio en la forma de un espectro.
10. El método de la reivindicación 9, en el que la señal emitida por la molécula indicadora óptica es la longitud de onda de la luz, y las moléculas indicadoras ópticas unidas y libres se resuelven individualmente mediante un desplaza­ miento en el centro de un espectro por encima o por debajo de una longitud de onda especificada.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el método emplea un ensayo de tipo sándwich.
12. El método de la reivindicación 11, en el que un primer tipo de moléculas indicadoras ópticas se fijan a una super­ ficie (la superficie indicadora) de manera que cada molécula indicadora óptica fijada se puede resolver espacialmente, y el primer tipo de moléculas indicadoras ópticas comprende un elemento de captura para un analito funcionalizado en una nanopartícula plasmónica.
13. El método de la reivindicación 12, en el que se añade un segundo tipo de moléculas indicadoras ópticas con o después de la muestra, y el segundo tipo de moléculas indicadoras ópticas comprende un elemento de captura para el analito funcionalizado en una nanopartícula plasmónica.
14. El método de la reivindicación 13, en el que el analito es un antígeno, y cada molécula indicadora óptica com­ prende como elemento de captura un anticuerpo o un fragmento del mismo.
15. El método de la reivindicación 13, en el que el analito es una secuencia de nucleótidos, y cada molécula indica­ dora óptica comprende como elemento de captura una o más secuencias de nucleótidos complementarias a la secuencia de nucleótidos del analito.
16. El método de la reivindicación 1, en el que el método se realiza en un sistema de ensayo molecular digital que comprende un dispositivo móvil.
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