BR112019018869A2 - método para determinar a presença ou concentração de pelo menos um analito em uma amostra, método para determinar a presença ou concentração de antígeno em uma amostra, método para determinar a presença ou concentração de uma sequência de nucleotídeos alvo em uma amostra e sistema de ensaio digital para determinar uma concentração de analito em uma amostra - Google Patents
método para determinar a presença ou concentração de pelo menos um analito em uma amostra, método para determinar a presença ou concentração de antígeno em uma amostra, método para determinar a presença ou concentração de uma sequência de nucleotídeos alvo em uma amostra e sistema de ensaio digital para determinar uma concentração de analito em uma amostra Download PDFInfo
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Abstract
trata-se de sistemas, dispositivos e métodos para a medição rápida e precisa de analitos através de ensaio de eventos de ligação, por medição direta e digital de eventos de ligação de repórter/analito individualmente resolvidos. os sistemas, dispositivos e métodos de ensaio molecular digital revelados no presente documento têm capacidade para leitura de partícula por partícula com o uso de moléculas repórteres ópticas que detectam e relatam a ligação de uma única molécula de analito e relatam cada ligação em formato binário. tais sistemas, dispositivos e métodos de ensaio molecular digital são úteis em uma diversidade de aplicações, tais como em dispositivos eletrônicos móveis para uso no campo.
Description
MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA OU CONCENTRAÇÃO DE PELO MENOS UM ANALITO EM UMA AMOSTRA, MÉTODO PARA DETEPMINAR A PRESENÇA OU CONCENTRAÇÃO DE ANTÍGENO EM UMA AMOSTRA, MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA OU CONCENTRAÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS ALVO EM UMA AMOSTRA E SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL PARA DETERMINAR UMA CONCENTRAÇÃO DE ANALITO EM UMA AMOSTRA
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o beneficio de prioridade do pedido provisório n° U.S. 62/470.303, depositado em 12 de março de 2017, cuja revelação é aqui incorporada a titulo de referência como se estivesse escrita no presente documento em sua totalidade.
[002] O diagnóstico no local de prestação do tratamento e outros ensaios realizáveis no campo são uma necessidade premente. Se o atraso e os gastos associados ao envio de ensaios, tais como testes de diagnóstico, especialmente testes sanguíneos, a laboratórios dedicados para análise pudessem ser eliminados, respostas poderíam ser efetuadas de modo mais eficiente e eficaz. Os laboratórios entregam testes de diagnóstico realizando-se ensaios bioquímicos em instrumentos de teste em bancada de precisão. Os esforços para miniaturizar esses instrumentos ou replicar sua função em dispositivos eletrônicos móveis apresentam muita dificuldade. Em muitos casos, os resultados são inutilizáveis.
[003] O que é necessário é um local de prestação do tratamento pouco dispendioso, porém preciso, tais como testes de diagnóstico que forneçam resultados rápidos e precisos, por exemplo, para médicos e seus pacientes.
[004] São fornecidos no presente documento sistemas, dispositivos e métodos para a medição rápida e
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2/82 precisa de analitos por ensaio de eventos de ligação, por medição digital direta de eventos de ligação de analito/repórter individualmente resolvidos. Os sistemas, dispositivos e métodos de ensaio molecular digital revelados no presente documento têm capacidade de leitura partícula por partícula com o uso de moléculas repórteres ópticas que detectam e relatam a ligação de uma única molécula de analito, e relatam cada tal ligação em formato binário. Tais sistemas, dispositivos e métodos de ensaio molecular digital são úteis em uma variedade de aplicações, tais como em dispositivos eletrônicos móveis para uso no campo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [005] A Figura 1 é uma ilustração conceituai de um ensaio analógico.
[006] A Figura 2 é um diagrama conceituai de procedimentos de ensaio analógico.
[007] A Figura 3 é uma simulação de resultados de ensaio analógico.
[008] A Figura 4 é um diagrama conceituai de parte de um sistema de ensaio molecular digital.
[009] A Figura 5 é um diagrama conceituai de parte de um sistema de ensaio molecular digital alternativo.
[0010] A Figura 6 é um diagrama conceituai de dados de imagem de ensaio molecular digital.
[0011] A Figura 7 é uma imagem de dados de ensaio molecular digital.
[0012] A Figura 8 é uma simulação de resultados de ensaio molecular digital.
[0013] A Figura 9 mostra um dispositivo eletrônico móvel com um leitor de chip de ensaio com clipe.
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3/82 [0014] A Figura 10 ilustra códigos que podem ser incorporados em um ensaio molecular digital.
[0015] A Figura 11 mostra o efeito de variações na espessura de volume de repórter nas moléculas repórteres. Nessa Figura, 1 representa o volume de repórter; 2 representa a superfície de um dispositivo gravador, 3 representa uma molécula repórter, e 4 representa um caminho óptico a partir da molécula repórter para o dispositivo gravador.
[0016] A Figura 12 mostra volumes de repórter finos e propriedades dos mesmos. Nessa Figura, 1 representa o volume de repórter; 2 representa a superfície de um dispositivo gravador, 3 representa uma molécula repórter, 4 representa um caminho óptico a partir da molécula repórter para o dispositivo gravador, e 5 representa uma partícula maior que é ligada a, ou contém, a molécula repórter 4.
[0017] A Figura 13 mostra a aplicação de métodos de ajuste de curva aos espectros ópticos. O eixo geométrico horizontal se refere ao comprimento de onda em nm, e o eixo geométrico vertical se refere à intensidade de um sinal óptico.
[0018] A Figura 14 mostra plotagens de isoterma de ligação para uma molécula repórter que se liga fortemente (curva superior) e uma molécula repórter que se liga fracamente (curva inferior).
[0019] A Figura 15 mostra o efeito de erro na determinação de concentração de analito em saturação de molécula repórter baixa. O eixo geométrico horizontal é a concentração de analito, e o eixo geométrico vertical é a razão entre ligação/concentração de molécula repórter total. As setas horizontais e verticais escuras indicadas por 1 representam uma determinação correta da concentração de
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4/82 molécula repórter e da concentração de analito. As setas horizontais e verticais claras indicadas por 2 representam uma determinação incorreta da concentração de molécula repórter e da concentração de analito.
[0020] A Figura 16 mostra o efeito de erro na determinação de concentração de analito em saturação de molécula repórter alta. O eixo geométrico horizontal é a concentração de analito, e o eixo geométrico vertical é a razão entre ligação/concentração de molécula repórter total. As setas horizontais e verticais escuras indicadas por 1 representam uma determinação correta da concentração de molécula repórter e da concentração de analito. As setas horizontais e verticais claras indicadas por 2 representam uma determinação incorreta da concentração de molécula repórter e da concentração de analito.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA REVELAÇÃO [0021] Embora haja uma grande demanda para realização de ensaios bioquímicos em dispositivos eletrônicos móveis, tentativas para simplesmente miniaturizar ensaios convencionais e realizar os mesmos fora do ambiente controlado de laboratórios clínicos profissionais não foram bem-sucedidas no passado. Os ensaios bioquímicos convencionais não podem ser miniaturizados de maneira confiável porque os mesmos são medições inerentemente analógicas.
[0022] Os ensaios digitais eliminam incertezas inerentes de ensaios analógicos de pelo menos três maneiras: (1) ensaios digitais se baseiam nos eventos binários que são altamente resistentes a ruído analógico; (2) ensaios digitais eliminam erros que se originam da fração desconhecida de moléculas de ensaio inativas em um ensaio analógico; (3)
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5/82 ensaios digitais eliminam problemas associados à não homogeneidade espacial, tal como iluminação não uniforme.
[0023] Considere, por exemplo, um ensaio de antígeno - anticorpo projetado para medir a concentração de antígeno em uma amostra que é misturada com uma concentração de anticorpos conhecida. O ensaio tem uma leitura óptica na qual os anticorpos que se ligam ao antígeno emitem um sinal óptico diferente daqueles que não se ligam. Anticorpos não ligados podem não emitir sinal, por exemplo.) Dada a afinidade de ligação ao antígeno - anticorpo, um sinal de leitura óptico em massa pode ser usado para estimar a concentração de antígeno.
[0024] Esse procedimento pode ser feito para funcionar razoavelmente bem em uma configuração de laboratório profissional com controles de qualidade rigorosos. Entretanto, o mesmo falha completamente, quando realizado com dispositivos móveis em uma configuração de campo. Os ensaios bioquímicos analógicos convencionais são delicados e fornecem resultados extremamente imprecisos quando realizados em telefones celulares, computadores do tipo tablet e dispositivos similares.
[0025] Um problema consiste no fato de que sem protocolos laboratoriais rigorosos, uma grande fração da concentração de anticorpos supostamente conhecida pode estar inativa. Em uma configuração de campo entre 10% e 100% dos anticorpos podem se tornar inativos devido ao manuseio inadequado, contaminação, desnaturação e outros problemas. Pior ainda, a fração de anticorpos inativos é desconhecida. A mesma é não observável e representa um erro sistemático que não pode ser eliminado calculando-se a média dos dados
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6/82 observados. A fração de anticorpos não ligados e a fração de anticorpos inativos é confundida; seus sinais são indistinguíveis .
[0026] Os ensaios digitais reduzem ou eliminam esse problema contando-se eventos de ligação individuais entre analito e molécula repórter, tais como antígeno e anticorpo ou sequências de nucleotídeos complementares, em vez de calcular a média dos resultados de milhões deles. Os dispositivos móveis são bem adequados para ensaios digitais porque os mesmos incluem câmeras de alta qualidade com capacidade de amostragem de milhões de eventos bioquímicos - no máximo um por pixel ou dezenas de milhões por exposição. Os dispositivos móveis também incluem potência de processamento significativa para análise de imagens e capacidades de comunicação para relatar resultados e descarregar processamento, se necessário.
[0027] Os ensaios digitais selecionam recursos em uma imagem e classificam os mesmos como válidos ou nulos. Os recursos nulos incluem qualquer coisa em uma imagem que não atenda aos critérios específicos para posição, luminosidade, comprimento de onda ou formato, por exemplo. Os anticorpos inativos são uma fonte comum de recursos nulos, porém iluminação de amostra irregular, alinhamento óptico impreciso, irregularidades de amostra - são problemas comuns em uma configuração móvel e, em outros cenários com controles inadequados - também contribuem. Em um ensaio digital, os recursos nulos são descartados para a análise de dados; apenas recursos válidos contribuem para análise de resultados. Os recursos válidos são contados como ligados ou não ligados, e essas são as únicas possibilidades. Sim ou não; um ou zero. Se, em um ensaio digital, 463 recursos válidos são contados
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7/82 como ligados e 886 recursos são contados como não ligados, então a fração de ligação é 463/ ( 463 + 886 ) = 463/1.349 = 0,343. Esse tipo de resultados se origina de um processo digital. Quando o mesmo é combinado com afinidade de ligação ao analito conhecida, ele fornece a concentração de analito desejada. A fração de eventos classificada como nula não faz diferença no resultado.
[0028] É útil manter em mente que é o próprio ensaio que é digital. Esse conceito não tem nada a ver com a digitalização ubíqua de resultados analógicos. Os sinais produzidos por ensaios analógicos podem ser digitalizados para análise ou armazenamento, porém a digitalização de um sinal analógico não pode remover erros sistemáticos que são inseridos no mesmo. Como uma analogia, gravações musicais feitas com equipamento analógico retêm estalos estáticos e assobios - inseparáveis da música em um processo de gravação analógico - mesmo se a gravação for armazenada digitalmente.
[0029] Referindo-se agora às Figuras, a Figura 1 é uma ilustração conceituai de um ensaio analógico. Um cadinho contém uma amostra. A amostra pode ser uma solução que contém antígeno e anticorpos, por exemplo. Os anticorpos podem ser marcados de modo que, mediante a ligação a uma molécula de antígeno, o complexo de anticorpo - antígeno recém-formado emita um sinal óptico quando interrogado por uma excitação óptica. O sinal óptico pode ser uma medição espectral; isto é intensidade de luz versus comprimento de onda. O cadinho, mesmo que possa reter um pequeno volume de amostra, apenas alguns mililitros é um tamanho comum, contém muitos bilhões de anticorpos e moléculas de antígeno. O espectro observado é um compósito de espectros emitidos por bilhões de complexos de
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8/82 anticorpo - antigeno marcados ligados. Porém, uma fração desconhecida dos anticorpos não funciona; eles não podem se ligar ao antigeno pelo fato de que os mesmos estão presos em agregados, desnaturados ou têm outros problemas.
[0030] A Figura 2 é um diagrama conceituai de procedimentos de ensaio analógico. O ensaio começa com uma concentração de antigeno desconhecida misturada com uma concentração de anticorpo. A razão entre anticorpos ativos (prontos e com capacidade de ligar ao antigeno) e anticorpos inativos (gue não têm capacidade ou estão indisponíveis para se ligar ao antigeno) não é conhecida. Em uma configuração laboratorial profissional, os técnicos treinados que seguem os procedimentos rigorosos em um ambiente controlado podem manter a razão entre ativos e inativos alta ou pelo menos consistente. Em uma configuração de campo ou de local de prestação do tratamento, entretanto, a razão entre anticorpos ativos e inativos é muito menos e, pior ainda, totalmente inconsistente.
[0031] Os anticorpos ativos se ligam ao antigeno em uma taxa determinada por: a afinidade de antigeno anticorpo, a concentração de antigeno, e a concentração desconhecida de anticorpos ativos.
[0032] A Figura 3 é uma simulação de resultados de ensaio analógico. O espectro em massa (curva sólida pesada) representa o que é observado (SAÍDA DE ESPECTRO) em um ensaio analógico. As inúmeras curvas tracejadas leves representam espectros de únicos eventos de ligação ao antigeno - anticorpo. Entretanto, esses espectros não são observáveis em um ensaio analógico. Na simulação da Figura 3, os anticorpos ativos não ligados emitem luz com comprimento de onda de aproximadamente 495 nm enquanto os anticorpos ativos ligados emitem luz com
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9/82 comprimento de onda de aproximadamente 505 nm. Um número desconhecido de anticorpos inativos não emite luz. Isso significa gue o espectro em massa não fornece informações suficientes para medir o número de anticorpos ligados como uma fração de todos anticorpos ativos.
[0033] A situação é pior em um experimento real porque os anticorpos inativos ainda podem emitir luz, porém essa luz não fornece informações sobre a ligação ao antígeno. Isso apenas contribui para o erro sistemático.
[0034] A Figura 4 é um diagrama conceituai de parte de um sistema de ensaio molecular digital. O ensaio molecular digital ilustrado na Figura 4 mostra um exemplo em que a microscopia de campo escuro móvel realizada com uma câmera de telefone inteligente, por exemplo, captura uma imagem de um imunoensaio do tipo sanduíche de nanopartícuia plasmônica. Nesse ensaio, um substrato de reflexão interna total (TIR) é revestido com nanopartícuias plasmônicas funcionalizadas com anticorpos de captura projetados para se ligar a um antígeno de interesse. As nanopartícuias plasmônicas adicionais, funcionalizadas com os mesmos anticorpos ou anticorpos diferentes (isto é, projetados para se ligar a uma parte equivalente do antígeno, ou a uma parte diferente) são introduzidas, juntamente com o antígeno de interesse em uma amostra. A luz de excitação é introduzida no substrato a partir de uma borda. Os anticorpos ligados emitem sinais ópticos diferentes dos anticorpos não ligados e inativos. Os anticorpos podem estar inativos devido a muitos fatores, tal como degradação ou, mais comumente, agregação. Os sinais diferentes podem aparecer em uma imagem como tamanhos diferentes, luminosidade, espectros, formatos, etc., e podem ser
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10/82 classificados como ativos ou nulos considerando um ou mais desses fatores.
[0035] A Figura 5 também é um diagrama conceituai de parte de um sistema de ensaio molecular digital; é uma alternativa do exemplo acima em que o substrato TIR é revestido com nanopartículas plasmônicas funcionalizadas com sequências de nucleotídeos de captura de DNA ou RNA, complementares à parte do DNA/RNA de analito de interesse. As nanopartículas plasmônicas adicionais, funcionalizadas com cDNA/cRNA diferente (isto é, projetadas para se ligar à outra seção do DNA/RNA de analito) são introduzidas, juntamente com o DNA/RNA de analito em uma amostra. As sequências de DNA/RNA ligadas emitem sinais ópticos diferentes dos anticorpos não ligados e inativos [0036] A Figura 6 é um diagrama conceituai de dados de imagem de ensaio molecular digital; isto é, parte de uma imagem capturada por uma câmera de dispositivo móvel que opera como um microscópio de campo escuro. A imagem inclui pontos produzidos por complexos de antígeno - anticorpo ligados, pontos de anticorpos não ligados, pontos de anticorpos inativos ou nulos e uma zona de defeito que pode ser uma área da imagem que é defeituosa por qualquer uma dentre várias razões. A iluminação da imagem pode ser não uniforme, ainda longe de uniforme. Desde que o padrão de iluminação espacial seja conhecido, gravando-se uma imagem no comprimento de onda de iluminação, por exemplo, os resultados em qualquer ponto na imagem podem ser normalizados para a iluminação conhecida.
[0037] A Figura 7 é uma representação dos dados de ensaio molecular digital obtidos por uma câmera de dispositivo móvel que opera como microscópio. A Figura é menos
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11/82 impressionante quando mostrada em escala de cinza como nesta revelação e, comparação com a imagem colorida original, então ela foi aprimorada manualmente para envio em preto e branco. Círculos brancos foram desenhados ao redor de pontos na imagem que correspondem a anticorpos ativos. Todos os outros pontos na imagem são anticorpos nulos ou inativos. Dos anticorpos ativos, 4 de 11 são ligados; esses são mostrados a título de exemplo com um círculo cinza ao redor do branco. A identificação de ativos versus nulos, e ligados versus não ligados é realizada por software de análise de imagem. A análise de imagem pode ser realizada no dispositivo móvel. De modo alternativo, o dispositivo móvel pode enviar a imagem para outro processador. 0 mesmo pode enviar a imagem para um servidor virtual na nuvem de computador, por exemplo.
[0038] Como um exemplo de processamento de imagem para distinguir anticorpos ligados e não ligados em um ensaio molecular digital, a Figura 8 é uma simulação de resultados de ensaio digital. A Figura 8 representa espectros de seis pontos em uma imagem a partir de um ensaio digital. Os critérios para ligados versus não ligados é se o espectro de um ponto se situa acima ou abaixo de 500 nm no comprimento de onda. Os pontos com espectros que não se situam em uma faixa mostrada na Figura são nulos. De cima para baixo, os espectros correspondem a pontos de sítios de anticorpo não ligados, ligados, inativos (nulos), não ligados e ligados. Há dois resultados positivos, três negativos e um nulo. Desse modo, a fração de anticorpos ligados é 2/5. Conforme mencionado acima, um experimento real é complicado por sinais ópticos a partir de anticorpos inativos. Desse modo, os critérios de seleção podem ser mais complicados que o centro espectral acima ou abaixo de um
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12/82 determinado comprimento de onda. Os critérios podem envolver bandas espectrais estreitas, critérios de intensidade, formato espectral e formato espacial como exemplos.
[0039] Os critérios de seleção também podem levar em consideração o conhecimento de um padrão de iluminação espacial. A intensidade medida em um comprimento de onda de emissão é normalizada pela intensidade de iluminação em um comprimento de onda de excitação no mesmo local em uma imagem. Isso elimina problemas de não homogeneidade espacial que afetam as medições analógicas. O ensaio prossegue digitalmente em uma base partícula a partícula considerando ENTRADA DE EXCITAÇÃO e SAÍDA DE ESPECTRO para cada partícula. O resultado para uma determinada partícula pode ser apenas 0 ou 1.
[0040] Os ensaios moleculares digitais podem ser realizados com dispositivos móveis, conforme ilustrado na Figura 9 que mostra um dispositivo eletrônico móvel com um leitor de chip de ensaio com clipe. O leitor de chip de ensaio pode incluir componentes ópticos que adaptam a câmera de dispositivo móvel para imageamento de campo escuro, por exemplo. O chip de ensaio é projetado para receber solução de analito e pode ser pré-revestido com anticorpos.
[0041] Uma vez que um ensaio digital se baseia no imageamento e análise de imagem, códigos podem ser colocados em um chip de ensaio e lidos a partir das mesmas imagens usadas para medir eventos de ligação. A Figura 10 ilustra código que pode ser incorporado em um ensaio digital. Os exemplos incluem códigos de barras, códigos de resposta rápida (QR), pontos quânticos gue emitem luz em comprimentos de onda projetados repórteres de nanopartícuia de temperatura, umidade, exposição à luz, exposição a gás e outros dados ambientais. A
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13/82 identificação de marcas que representam tipos de ensaio ou identificação da amostra também pode estar incluída.
[0042] Os exemplos discutidos acima são apresentados com o uso de ligação a antígeno - anticorpo. O antígeno e os anticorpos podem ser ligados a moléculas repórteres ópticas para leitura de ensaio. Os ensaios que envolvem outros mecanismos de reticulação também podem ser realizados digitalmente. Por exemplo, os ensaios baseados em hibridização de fragmentos de DNA ou RNA ligados a moléculas repórteres ópticas podem ser realizados como ensaios moleculares digitais em que fragmentos de DNA ou RNA tomam o lugar de moléculas de antígeno e anticorpo. Como um exemplo, uma primeira parte de uma sequência de DNA curta pode ser ligada a um repórter óptico e uma segunda parte da sequência de DNA curta pode ser ligada a outro repórter óptico. Quando a primeira e a segunda parte se ligam a uma sequência de DNA complementar mais longa, os dois repórteres ópticos são aproximados e, portanto, emitem um sinal óptico diferente em comparação a quando estão mais afastados. Esse tipo de ensaio pode ser usado para detectar a sequência de DNA complementar.
[0043] Em conclusão, é uma missão impossível usar um dispositivo móvel como substituto para instrumentação laboratorial profissional com ensaios analógicos. Os ensaios moleculares digitais permitem a leitura partícula a partícula de interações individuais entre moléculas de analito únicas e moléculas repórteres, tornando irrelevantes os problemas práticos relacionados aos ensaios tradicionais. A alavancagem das capacidades de imageamento e processamento de imagens de dispositivos móveis o fornece resultados de diagnóstico que reduzem ou eliminam fontes comuns de erros sistemáticos
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14/82 encontrados em ensaios analógicos, os ensaios moleculares digitais permitem avaliações em campo, tais como testes de diagnóstico de local de prestação do tratamento que ajudam os médicos e pacientes a obter informações de saúde criticas e de maneira rápida e pouco dispendiosa, e a coleta e análise de dados através de uma ampla faixa de aplicações.
TERMOS E DEFINIÇÕES [0044] Exceto quando definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence.
[0045] Conforme usado no presente documento, os termos abaixo têm os significados indicados.
[0046] Quando faixas de valores são reveladas, e a notação a partir de ni ... a n2 ou entre ni ... e n2 é usada, em que ni e n2 são os números, então, a menos que especificado de outro modo, essa notação está destinada a incluir os números em si e a faixa entre os mesmos. Essa faixa pode ser integral ou contínua entre os valores finais e podem incluir os mesmos. A título de exemplo, a faixa de 2 a 6 carbonos está destinada a incluir dois, três, quatro, cinco e seis carbonos, já que os carbonos aparecem em unidades inteiras. Compara-se, a título de exemplo, a faixa de 1 a 3 μΜ (micromolar) , que está destinada a inclui 1 μΜ, 3 μΜ e tudo entre os mesmos até que qualquer número significativo apareça (por exemplo, 1,255 μΜ, 2,1 μΜ, 2,9999 μΜ, etc.).
[0047] O termo cerca de, conforme usado no presente documento, se destina a qualificar os valores numéricos que o mesmo modifica, indicando tal valor como
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15/82 variável dentro de uma margem de erro. Quando nenhuma margem de erro particular, tal como um desvio padrão para um valor médio fornecido em um gráfico ou tabela de dados, é citada, o termo cerca de deve ser entendido de modo a significar que a faixa que pode abranger o valor citado e a faixa que pode ser incluída arredondando-se para cima ou para esse valor também, levando-se em consideração os valores significativos.
[0048] O termo precisão, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para se referir à proximidade de um valor relatado ou estimado a partir do valor verdadeiro. Uma medição, observação ou estimativa imprecisa se desvia do valor verdadeiro. Uma medição, observação ou estimativa precisa não se desvia do valor verdadeiro.
[0049] O termo ou molécula de analito, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever uma molécula ou partícula para a qual a presença ou ausência, ou quantidade, em uma amostra é originalmente desconhecida, e para a qual o conhecimento da presença ou ausência, ou quantidade, contida em uma amostra pode ser útil. Os exemplos de analitos incluem biomoléculas, tais como peptídeos, proteínas, citocinas e prions; anticorpos e fragmentos dos mesmos; ácidos nucleicos (DNA/RNA) e partículas que contêm os mesmos, tais como histonas; moléculas orgânicas pequenas e moléculas bioinorgânicas, tais como carboidratos, lipídios, hormônios, e intermediários e produtos do metabolismo; macromoléculas, tais como macrociclos, biopolímeros (por exemplo, oligossacarídeos, polifenóis e plásticos); e vírus, partículas virais, produtos virais (por exemplo, virocinas). Um analito
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16/82 também pode ser categorizado como um biomarcador, ou seja, uma composição e/ou molécula ou um complexo de composições e/ou moléculas que é associado a um estado biológico de um organismo (por exemplo, uma condição, tal como uma doença ou um estado não patológico) e pode relatar a presença ou ausência de doença, lesão ou danos celulares ou ao organismo. Quando tais marcadores se ligam a um anticorpo ou um fragmento do mesmo, eles podem ser chamados de antígenos. Os valores para níveis significativos (por exemplo, normais e anormais) de analitos detectados pelos ensaios moleculares digitais revelados no presente documento serão conhecidos para aqueles versados na técnica relevante.
[0050] O termo detector de área, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, se refere a um dispositivo de gravação que pode gravar uma imagem a partir de uma fonte, isto é, gravar não apenas a intensidade de sinal óptico de entrada, mas a origem de um sinal óptico. Exemplos comuns de detectores de área são câmeras de televisão, câmeras SLR digitais e câmeras de telefone celular.
[0051] O termo chip de ensaio, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, se refere a um microarranjo de moléculas repórteres (por exemplo moléculas repórteres ópticas) aplicadas em pontos ou, de outro modo, depositadas sobre uma superfície repórter, opcionalmente encerrada no interior de um cadinho plano relativamente fino, tal como uma lâmina, que pode ser exposta a uma amostra que contém analito, de modo que a interação entre os elementos de captura das moléculas repórteres ópticas e o analito possa ser observada. As técnicas para a produção de chips de ensaio são conhecidas na técnica. Um chip de ensaio pode compreender como
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17/82 as moléculas repórteres ópticas, as nanopartícuias plasmônicas funcionalizadas com anticorpos, proteínas, DNA, RNA, etc.
[0052] O termo leitor de chip de ensaio, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, se refere a um sistema ou dispositivo para observar e gravar sinais a partir de um chip de ensaio. Um leitor de chip de ensaio pode fazer parte de um sistema de ensaio molecular digital, conforme revelado no presente documento, e compreende tipicamente uma câmara para receber um chip de ensaio, um dispositivo de gravação, tal como um sensor de imagem (por exemplo, uma câmera), um meio para transmitir os dados coletados a partir do ensaio para a memória, e opcionalmente, uma fonte de luz como um diodo emissor de luz (LED). Adicionalmente, oi leitor de chip de ensaio pode conter hardware microfluídico, tais como bombas, canais, câmaras para soluções, válvulas, misturadores e similares; e hardware e/ou software para realizar pelo menos algumas análises dos dados. Em determinadas modalidades, um leitor de chip de ensaio pode ser acoplado a um telefone inteligente ou outro dispositivo móvel e usado como parte de sistema de ensaio portátil; microplaca miniaturizada e leitores de chip são conhecidos na técnica.
[0053] O termo isoterma de ligação, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, se refere ao grau de ligação de moléculas repórteres ligadas a moléculas de analito em diferentes concentrações de analito. Em geral, o grau de ligação, que pode ser definido como a razão entre moléculas repórteres ligadas/moléculas repórteres totais, aumenta com a concentração de analito aumentada e, eventualmente se aproxima de 1, à medida que quase todas as
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18/82 moléculas repórteres são ligadas a moléculas de analito.
[0054] O termo compartimentalização, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, se refere à combinação de sinais de dois ou mais pixels em um sinal. A compartimentalização pode ser usada quando a resolução espacial pode ser sacrificada a fim de aprimorar a relação sinal-ruído. Compartimentalização 2x2, a título de exemplo, se refere ao agrupamento de pixels em quadrados 2x2, e à soma dos sinais a partir dos pixels contidos em cada quadrado.
[0055] O termo biomolécula, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, inclui qualquer tipo de molécula orgânica ou bioinorgânica para a qual a detecção (qualitativa ou quantitativa) pode ser desejada, incluindo, porém sem limitação, peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, açúcares, mono e polissacarídeos, lipídios, lipoproteínas, células inteiras e similares.
[0056] O termo câmera, conforme usado no presente documento, se refere a um tipo de sensor de imagem para gravar imagens visuais, por exemplo, como imagens digitais. Uma câmera de megapixel é uma câmera que pode gravar um milhão, ou múltiplos de um milhão, de pixels por imagem. Muitas câmeras de telefone inteligente compreendem câmeras de dez megapixels ou mais.
[0057] O termo interface de comunicação, conforme usado no presente documento, se refere a um meio para transferir dados a partir de um dispositivo ou sistema, conforme usado no presente documento para outro dispositivo ou sistema. Os exemplos de interfaces de comunicação sem fio incluem aqueles usados em dispositivos sem fio, tais como telefones móveis, por exemplo, tecnologias celulares, wi-fi e
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Bluetooth.
[0058] O termo concentração, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, se refere à quantidade de um soluto em uma solução por volume de unidade de solução. A concentração pode ser especificada em unidades de concentração molar, isto é número de mois de soluto por litro de solução, ou concentração numérica, isto é, número de moléculas de soluto por litro de solução. A concentração molar e a concentração numérica podem ser prontamente interconvertidas. Conforme usado no presente documento, o termo concentração é expandido para incluir sistemas fora da definição tradicional de solução, por exemplo, sistemas que contêm moléculas ancoradas a um suporte sólido.
[0059] O termo desconvolução, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever um método para determinar, a partir de um sinal óptico coletivo que é composto de sinais ópticos individuais a partir de uma pluralidade de moléculas repórteres ópticas, os sinais ópticos individuais a partir das moléculas repórteres ópticas individuais. A desconvolução pode usar técnicas de ajuste de curva para determinar os recursos espectrais individuais a partir de moléculas repórteres ópticas individuais que se sobrepõem parcialmente ao longo de uma região espectral e que foram combinadas para formar um único espectro coletivo. A desconvolução pode usar técnicas de ajuste de curva para determinar imagens individuais a partir de moléculas repórteres ópticas individuais que se sobrepõem parcialmente em uma região espacial de um detector e que foram combinadas para formar uma única imagem coletiva. Será compreendido que as técnicas de desconvolução são
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20/82 particularmente úteis para pequenos grupos de moléculas repórteres ópticas.
[0060] O termo detectar ou detecção, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever um método para determinação da existência, presença, ou fato de um analito em uma amostra.
[0061] O termo divergência indica o desvio da perpendicularidade que é acomodada pelo dispositivo de gravação. Um dispositivo de gravação do tipo detector de área idealizado irá aceitar apenas raios de luz que sejam perpendiculares ao plano do detector. Os detectores de área reais irão permitir raios de luz que chegam em um ângulo a partir da perpendicular. Embora esse recurso possa aumentar a relação sinal-ruído (uma vez que mais raios de luz são aceitos pelo detector), o mesmo também aumenta a resolução espacial, dependendo do tamanho do ângulo de divergência permitido, e do tamanho do pixel de detector de área e a distância entre o detector de área e o plano de amostra.
[0062] O termo incubar, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever um processo de expor as moléculas repórteres a uma amostra que pode conter potencialmente uma molécula de analito.
[0063] O termo oblongo, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever um volume que tem dimensões desiguais. Os exemplos de volumes oblongos incluem prismas ou cilindros para os quais a distância entre as faces de extremidade é significativamente maior ou significativamente menor que as dimensões paralelas às faces de extremidade. Um exemplo adicional de um volume oblongo é um elipsoide para o qual um eixo geométrico é
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21/82 significativamente maior ou significativamente menos que os outros eixos.
[0064] O termo caminho óptico, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever o caminho a partir da molécula repórter até o detector.
[0065] O termo molécula repórter óptica, ou de modo equivalente, repórter óptico, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever uma molécula repórter que tem capacidade para relatar a presença ou a ausência, ou a quantidade ou concentração de uma molécula de analito com um sinal óptico. A presença ou ausência da molécula de analito (opcionalmente, em determinados formatos de ensaio, com outra molécula repórter óptica) em contato com a molécula repórter óptica, induz uma alteração no sinal óptico. Uma molécula repórter óptica ligada ao analito (molécula repórter óptica ligada) irá emitir um sinal diferente do que uma molécula repórter óptica não ligada ao analito (molécula repórter óptica não ligada).
[0066] O termo sinal óptico, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever um sinal que se origina de uma molécula repórter óptica. O sinal óptico pode cair na faixa visível do espectro, ou fora da faixa visível do espectro. O sinal pode ser, por exemplo:
• comprimento de onda de luz;
• intensidade de sinal;
• luminosidade;
• o formato de um sinal ou espectro;
• a presença ou ausência de bandas espectrais;
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22/82 • o coeficiente de extinção de uma banda de absorção;
• a Àmax de uma banda de absorção;
• o rendimento quântico de uma banda de emissão; ou • a anisotropia de fluorescência de uma banda de emissão.
[0067] O sinal óptico a partir de uma molécula repórter óptica pode alterar mediante a ligação de uma molécula de analito. A alteração no sinal óptico mediante a ligação pode ser uma ou mais das seguintes:
• um desvio no centro de um espectro acima ou abaixo de um comprimento de onda especificado;
• um desvio no comprimento de onda de intensidade máxima (Àmax) ;
• uma alteração no tamanho ou intensidade do sinal;
• um aumento ou diminuição na luminosidade;
• uma alteração no formato do sinal;
• a presença ou ausência de bandas espectrais;
• uma alteração no formato de um espectro.
• uma alteração no coeficiente de extinção de uma banda de absorção;
• uma alteração na Àmax de uma banda de absorção;
• uma alteração no rendimento quântico de uma banda de emissão; e • uma alteração na a anisotropia de fluorescência de uma banda de emissão.
[0068] O termo pixel, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, se refere a uma área ou a um detector de área, por exemplo um sensor de imagem, cujo sinal pode ser medido independentemente de outros pixels. Os detectores de área são comumente divididos em uma grade
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23/82 bidimensional de pixels, com o tamanho de cada pixel, contagem de pixels nas duas direções, determinados pelo fabricante de detector de área.
[0069] O termo precisão, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para se referir à estimativa de erro que é associada a um valor relatado ou estimado. Uma medição de precisão, observação ou estimativa baixa é associada a um alto grau de incerteza sobre a proximidade desse número ao valor real. Uma medição de precisão, observação ou estimativa alta é associada a um baixo grau de incerteza sobre a proximidade desse número ao valor real. A precisão, muitas vezes, pode ser quantificada pelo uso de barras de erros em gráficos ou faixas de valores numéricos. Por exemplo, um valor estimado que é relatado como 10,5 ±0,1 indica que o valor verdadeiro se situa muito provavelmente entre 10,4 e 10,6; com uma pequena chance, porém não nula de que o valor verdadeiro se situe fora dessa faixa.
[0070] Os termos proteína, polipeptídeo, peptídeo e oligopeptídeo, são usados de forma intercambiável no presente documento e incluem qualquer composição que inclua dois ou mais aminoácidos reunidos por uma ligação de peptídeo. Será observado que os polipeptídeos podem conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos comumente denominados como os 20 aminoácidos de ocorrência natural. Além disso, os polipeptídeos podem incluir um ou mais aminoácidos, incluindo os aminoácidos terminais, que são modificados por quaisquer meios conhecidos na técnica (naturalmente ou não naturalmente). Os exemplos de modificações de polipeptídeo incluem, por exemplo, por glicosilação ou outra modificação pós-traducional. As
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24/82 modificações que podem estar presentes no polipeptídeos da presente revelação, incluem, porém sem limitação: acetilação, acilação, ribosilação de ADP, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um polinucleotídeo ou derivado de polinucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado lipídico, ligação covalente de fosfatidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação, gamacarboxilação, glicação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição de aminoácidos mediada por transferência de RNA a proteínas, tais como arginilação e ubiquitinação.
[0071] O termo análise qualitativa, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever um método para determinar a presença ou ausência de uma molécula de analito em uma amostra. Em algumas modalidades, uma análise qualitativa relata a presença ou ausência de uma única molécula de analito em uma amostra. Em algumas modalidades, um método de análise qualitativa relata incorretamente a ausência de analito em uma amostra que contém analito em um nível abaixo de um determinado limiar.
[0072] O termo análise quantitativa, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever um método para determinar a quantidade de uma molécula de analito em uma amostra.
[0073] O termo dispositivo de gravação,
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25/82 conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, se refere a um dispositivo para gravar um sinal óptico. Em determinadas modalidades, o sinal óptico é convertido em um sinal elétrico. Em determinadas modalidades, o dispositivo de gravação é um dispositivo de carga acoplada (CCD). Em determinadas modalidades, o dispositivo de gravação é um dispositivo de semicondutor de óxido de metal complementar (CMOS).
[0074] O termo molécula repórter, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever uma molécula que pode relatar a presença ou ausência, ou a quantidade ou concentração de, uma molécula de analito, e sozinho ou em combinação com outra molécula repórter, produzir um sinal detectável em um ensaio molecular digital. Tipicamente, uma molécula repórter irá se ligar a uma molécula de analito, e a molécula repórter/complexo de moléculas de analito irão diferir significativamente em uma ou mais propriedades espectrais. As moléculas repórteres podem ser anticorpos ou fragmentos dos mesmos, ácidos nucleicos, proteínas e peptídeos, qualquer um dos quais pode ser química ou bioquimicamente modificado. As moléculas repórteres também podem ser moléculas quiméricas que compreendem uma porção química de origem bioquímica e uma porção sintética; exemplos incluem uma nanopartícuia plasmônica funcionalizada por anticorpo e uma nanopartícuia plasmônica funcionalizada por nucleotídeo. As moléculas repórteres podem ser aptâmeros baseados em ácidos nucleicos ou peptídeos.
[0075] O termo volume de repórter, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever o volume do dispositivo de medição no qual as
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26/82 moléculas repórteres se situam. 0 volume de repórter pode ser substancialmente igual ao compartimento de amostra, ou o volume de repórter pode ser menor. Em determinadas modalidades, a dimensão do volume de repórter que é paralelo aos caminhos ópticos para as moléculas repórteres será menor. Em determinadas modalidades, o volume de repórter irá constituir uma monocamada.
[0076] O termo amostra, conforme usado no presente documento, sozinho ou em combinação, é usado para descrever uma composição que contém o analito de interesse. Uma amostra será muitas vezes um fluido, por exemplo, solução aquosa. Uma amostra pode ser química ou biológica. Sangue, plasma, água a partir de uma fonte a ser testada, extratos de amostras de tecidos vegetais, animais ou humanos são exemplos de amostras biológicas. Uma amostra química seria aquela que não contém material de origem biológica, tal como uma amostra de água contendo resíduos petroquímicos ou industriais. As amostras biológicas retiradas de um organismo podem incluir, porém sem limitação, o seguinte: sangue, soro, plasma, urina, muco, saliva, escarro, fezes e outras secreções fisiológicas, assim como extratos de tecidos e/ou quaisquer outros constituintes do corpo que possam conter a partícula alvo de interesse. Outros espécimes similares, tal como cultura celular ou de tecido ou caldo de cultura também são de interesse.
[0077] Uma amostra biológica pode ser fresca ou armazenada (por exemplo, sangue ou fração de sangue armazenada em um banco de sangue). A amostra biológica pode ser um fluido corporal expressamente obtido para a análise desta invenção ou um fluido corporal obtido para outro propósito que pode ser
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27/82 subamostrado para os ensaios desta invenção. Em uma modalidade, a amostra biológica é sangue total. 0 sangue total pode ser obtido a partir do indivíduo com o uso de procedimentos clínicos padrão. Em outra modalidade, a amostra biológica é plasma. 0 plasma pode ser obtido a partir de amostrar de sangue total por centrifugação de sangue anticoagulado. Tal processo fornece um buffy coat de componentes de glóbulos brancos e um sobrenadante do plasma. Em outra modalidade, a amostra biológica é soro. 0 soro pode ser obtido por centrifugação de amostras de sangue total que foram coletadas em tubos que são isentos de anticoagulante. Permite-se que o sangue coagule antes da centrifugação. 0 fluido amarelado-avermelhado obtido por centrifugação é o soro. Em outra modalidade, a amostra é urina. A amostra pode ser pré-tratada conforme necessário por diluição em uma solução tampão adequada, heparinizada, concentrada se desejado, ou fracionada por qualquer número de métodos que incluem, porém sem limitação, ultracentrifugação, fracionamento por cromatografía líquida de alta eficiência (FPLC) ou precipitação de proteínas contendo apolipoproteína B com sulfato de dextrano ou outros métodos. Qualquer uma dentre várias soluções tampão aquosas padrão em pH fisiológico, tal como fosfato, Tris ou similares, pode ser usada.
[0078] O termo saturação, conforme usado no presente documento, em referência ao fenômeno de ligação, se refere a um estado em que quase todas as moléculas repórteres são ligadas a moléculas de analito. Uma característica de uma condição de saturação é que um aumento na concentração de analito causa um pequeno aumento no grau de ligação de moléculas repórteres.
[0079] O termo telefone inteligente, conforme
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28/82 usado no presente documento, se refere um computador pessoal de mão com um sistema operacional móvel e uma conexão de rede celular de banda larga móvel integrada para voz, SMS e comunicação de dados de internet e, tipicamente, wi-fi.
[0080] O termo computador do tipo tablet ou tablet, conforme usado no presente documento, se refere a um computador pessoal portátil plano fino, tipicamente com um sistema operacional móvel, tela sensível ao toque LCD, uma batería recarregável e uma interface de comunicação sem fio (opcionalmente, celular).
MODALIDADES [0081] A invenção é adicionalmente descrita pelas seguintes modalidades.
[0082] Modalidade 1. A revelação fornece um método para determinar a presença ou concentração de pelo menos um analito em uma amostra que compreende:
em uma imagem de uma pluralidade de sinais emitidos por pelo menos um tipo de moléculas repórteres ópticas incubadas com pelo menos um tipo de moléculas de analito, para cada tipo de moléculas repórteres ópticas, determinar o número de moléculas repórteres ópticas discretas ligadas às moléculas de analito (moléculas repórteres ópticas ligadas) e o número moléculas repórteres ópticas discretas não ligadas ao analito (moléculas repórteres ópticas não ligadas) na imagem resolvendo-se individualmente as moléculas repórteres ópticas ligadas e não ligadas; e, determinar a presença ou concentração de analito a partir do número de moléculas repórteres ópticas ligadas como uma fração de, ou como proporcional a uma fração do número total de moléculas repórteres ópticas.
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Modalidade 2. Em determinadas modalidades, a revelação fornece um método para determinar a presença ou concentração de pelo menos um analito em uma amostra que compreende:
em uma imagem de uma pluralidade de sinais emitidos por pelo menos um tipo de moléculas repórteres ópticas incubadas com pelo menos um tipo de moléculas de analito, para cada tipo de moléculas repórteres ópticas, determinar o número de moléculas repórteres ópticas discretas ligadas às moléculas de analito (moléculas repórteres ópticas ligadas) e o número de moléculas repórteres ópticas discretas não ligadas ao analito (moléculas repórteres ópticas não ligadas) na imagem ao:
em certas regiões da imagem, resolver individualmente as moléculas repórteres ópticas ligadas e não ligadas, e em determinadas outras regiões da imagem, em que um grupo de duas ou mais moléculas repórteres ópticas não são resolvidas, realizar uma desconvolução computacional ou matemática que forneça o número de moléculas repórteres ópticas ligadas e moléculas repórteres não ligadas no grupo; e determinar a presença ou concentração de analito a partir do número de moléculas repórteres ópticas ligadas como uma fração de, ou como proporcional a uma fração do número total de moléculas repórteres ópticas.
[0083] Modalidade 3. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que as moléculas repórteres ópticas são arranjadas em uma superfície repórter.
[0084] Modalidade 4. Método, de acordo com a modalidade 3, em que as moléculas repórteres ópticas são
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30/82 arranjadas aleatoriamente.
[0085] Modalidade 5. Método, de acordo com a modalidade 3, em que as moléculas repórteres ópticas são arranjadas em um padrão.
[0086] Modalidade 6. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que a fração de moléculas repórteres ópticas ligadas é determinada a partir do número de moléculas repórteres ópticas não ligadas gravado antes da introdução da amostra.
[0087] Modalidade 7. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que a concentração do pelo menos um analito é determinada.
[0088] Modalidade 8. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a amostra é uma amostra biológica ou química.
[0089] Modalidade 9. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que o analito é escolhido dentre:
• uma sequência de nucleotídeos; e • um antigeno.
[0090] Modalidade 10. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que a molécula repórter óptica compreende um elemento de captura escolhido dentre:
• uma ou mais sequências de nucleotídeos se ligam ao analito; e • um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga ao analito.
[0091] Modalidade 11. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 10, em que cada molécula repórter óptica compreende uma nanopartícuia plasmônica.
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31/82 [0092] Modalidade 12. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 11, em que a molécula repórter óptica compreende uma ou mais sequências de nucleotideos funcionalizadas em uma ou mais nanopartícuias plasmônicas.
[0093] Modalidade 13. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 11, em que a molécula repórter óptica compreende um ou mais anticorpos funcionalizados em uma ou mais nanopartícuias plasmônicas.
[0094] Modalidade 14. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que o sinal a partir da molécula repórter óptica é escolhido dentre:
• comprimento de onda de luz;
• intensidade de sinal;
• luminosidade;
• o formato de um sinal ou espectro; e • a presença ou ausência de bandas espectrais.
[0095] Modalidade 15. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que um sinal é produzido mediante ligação do analito à molécula repórter óptica.
[0096] Modalidade 16. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15, em que outro sinal é produzido mediante ligação do analito à molécula repórter óptica e ligação de uma segunda molécula repórter ao analito.
[0097] Modalidade 17. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 16, em que os sinais produzidos pela molécula repórter óptica ligada e pela molécula repórter óptica não ligada são diferentes.
[0098] Modalidade 18. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, em que as moléculas repórteres ópticas ligadas e não ligadas são individualmente
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32/82 resolvidos por:
• um desvio no centro de um espectro acima ou abaixo de um comprimento de onda especificado;
• uma alteração no tamanho ou intensidade do sinal;
• um aumento ou diminuição na luminosidade;
• uma alteração no formato do sinal;
• a presença ou ausência de bandas espectrais; e • uma alteração no formato de um espectro.
| [0099] Modalidade | 19 | Método, | de | acordo com |
| qualquer uma das modalidades 1 | a | 18, em que | o | sinal emitido |
| pela molécula repórter óptica é | o | comprimento | de | onda de luz. |
| [00100] Modalidade | 20 | Método, | de | acordo com |
qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que as moléculas repórteres ópticas ligadas e não ligadas são individualmente resolvidas por um desvio no centro de um espectro acima ou abaixo de um comprimento de onda especificado.
[00101] Modalidade 21. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 20, em que pelo menos algumas das moléculas repórteres ópticas são afixadas a uma superfície (a superfície repórter) de modo que cada molécula repórter óptica afixada seja espacialmente resolvível.
[00102] Modalidade 22. Método, de acordo com a modalidade 21, em que as moléculas repórteres ópticas afixadas são arranjadas em uma grade ou uma aproximação da mesma.
[00103] Modalidade 23. Método, de acordo com a modalidade 21, em que cada molécula repórter óptica afixada é resolvível como um pixel de um dispositivo de gravação.
[00104] Modalidade 24. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 23, em que moléculas repórteres ópticas ativas e as moléculas repórteres ópticas
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33/82 inativas emitem sinais ópticos diferentes.
[00105] Modalidade 25. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que o método determina o número de moléculas repórteres ópticas ativas discretas ligadas às moléculas de analito (moléculas repórteres ópticas ligadas ativas) e o número de moléculas repórteres ópticas discretas não ligadas ao analito (moléculas repórteres ópticas não ligadas ativas) na imagem.
[00106] Modalidade 26. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 25, em que a iluminação não uniforme da amostra não afeta a determinação da presença ou concentração de analito.
[00107] Modalidade 27. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 26, em que a imagem é gravada em um comprimento de onda de iluminação conhecido.
| [00108] | Modalidade | 28. | Método, | de | acordo com | |
| qualquer | uma das | modalidades 1 | a 27 | ', em que | os resultados em | |
| qualquer | ponto | na imagem são | normalizados na | iluminação | ||
| conhecida | • | |||||
| [00109] | Modalidade | 29. | Método, | de | acordo com | |
| qualquer | uma das | modalidades 1 | a | 28, em que a | intensidade | |
| medida em | um comprimento de onda | de | emissão é | normalizada pela | ||
| intensidade de | iluminação em | um | comprimento | de onda de | ||
| excitação | no mesmo local em uma | imagem. | ||||
| [00110] | Modalidade | 30. | Método, | de | acordo com |
qualquer uma das modalidades 1 a 29, em que defeitos em uma ou mais seções do sensor que gravaram a imagem não afetam a determinação da presença ou concentração de analito.
[00111] Modalidade 31. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 30, em que um tipo de molécula
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34/82 repórter óptica é usado.
[00112] Modalidade 32. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 31, em que mais de um tipo de molécula repórter óptica é usado.
| [00113] | Modalidade | 33. Método, | de acordo | com | |
| qualquer | uma das | modalidades 1 | a 32, em que | o método emprega | |
| um ensaio | do tipo | sanduíche. | |||
| [00114] | Modalidade | 34. Método, | de acordo | com | |
| qualquer | uma das | modalidades 1 | a 33, em que | um primeiro | tipo |
de moléculas repórteres ópticas é afixado a uma superfície (a superfície repórter) de modo que cada molécula repórter óptica afixada seja espacialmente resolvível.
[00115] Modalidade 35. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 34, em que o primeiro tipo de moléculas repórteres ópticas compreende um elemento de captura para um analito funcionalizado em uma nanopartícuia plasmônica.
[00116] Modalidade 36. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 35, em que um segundo tipo de moléculas repórteres ópticas é adicionado com ou após a amostra.
[00117] Modalidade 37. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 36, em que o segundo tipo de moléculas repórteres ópticas compreende um elemento de captura para o analito funcionalizado em uma nanopartícuia plasmônica.
[00118] Modalidade 38. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 37, em que o analito é um antígeno.
[00119] Modalidade 39. Método, de acordo com a modalidade 38, em que cada molécula repórter óptica compreende
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35/82 como o elemento de captura um anticorpo ou um fragmento do mesmo.
[00120] Modalidade 40. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 37, em que o analito é uma sequência de nucleotídeos.
[00121] Modalidade 41. Método, de acordo com a modalidade 40, em que cada molécula repórter óptica compreende como o elemento de captura uma ou mais sequências de nucleotídeos complementares à sequência de nucleotídeos de analito.
[00122] Modalidade 42. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 41, em que o método é realizado em um sistema de ensaio molecular digital que compreende um dispositivo móvel.
[00123] Modalidade 43. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 41, realizado no sistema de ensaio molecular digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 50 a 70.
[00124] Modalidade 44. Método para determinar a presença ou concentração de antígeno em uma amostra que compreende:
em uma imagem de uma pluralidade de sinais emitidos por pelo menos um tipo de moléculas repórteres ópticas que compreendem anticorpos incubados com antígeno, determinar o número de anticorpos ativos discretos ligados ao antígeno (anticorpos ativos ligados) e o número de anticorpos ativos discretos não ligados ao antígeno (anticorpos ativos não ligados) na imagem resolvendo-se individualmente as moléculas repórteres ópticas ligadas e não ligadas; e, determinar a presença ou concentração de antígeno a
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36/82 partir do número de anticorpos ativos ligados como uma fração de, ou como proporcional a uma fração do número total de anticorpos ativos.
[00125] Modalidade 45. Método, de acordo com a modalidade 44, que compreende as limitações, de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 11 e 13 a 39.
[00126] Modalidade 46. Método, de acordo com a modalidade 45, realizado no sistema de ensaio molecular digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 50 a 70.
[00127] Modalidade 47. Método para determinar a presença ou concentração de uma sequência de nucleotídeos alvo em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreende:
em uma imagem de uma pluralidade de sinais emitidos por
a) uma molécula repórter óptica que compreende uma primeira sequência de nucleotídeos de captura complementar a uma primeira parte da sequência de nucleotídeos alvo, e
b) a primeira molécula repórter óptica que compreende a primeira sequência de nucleotídeos de captura complementar à parte da sequência de nucleotídeos alvo e uma segunda molécula repórter óptica que compreende uma segunda sequência de nucleotídeos de captura complementar a uma segunda parte da sequência de nucleotídeos alvo ligada à sequência de nucleotídeos alvo (complexos ligados), determinar o número de sequências de nucleotídeos alvo discretas ligadas às moléculas repórteres ópticas que compreendem a primeira e a segunda partes da sequência de nucleotídeos complementar (complexos ligados);
determinar a presença ou concentração da sequência de nucleotídeos alvo como uma fração de, ou como proporcional
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37/82 ao número de complexos ligados como uma fração do número de moléculas repórteres ópticas total que emitem sinais detectáveis.
[00128] Modalidade 48. Método, de acordo com a modalidade 47, que compreende as limitações, de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 12 e 13 a 37.
[00129] Modalidade 49. Método, de acordo com a modalidade 48, em que o sistema é, de acordo com qualquer uma das modalidades 50 a 70.
[00130] Modalidade 50. Sistema de ensaio digital para determinar uma concentração de analito em uma amostra que compreende:
• um sensor de imagem;
• uma tela que tem capacidade para exibir uma imagem;
• um microprocessador;
• memória;
• software de análise de imagens armazenado na memória e executável processador que tem capacidade para analisar os dados capturados pelo sensor de imagem e classificar digitalmente os dados; e • opcionalmente, uma interface de comunicação.
[00131] Modalidade 51. Sistema de ensaio digital, de acordo com a modalidade 50, em que o sensor de imagem tem capacidade para operar como parte de um microscópio de campo escuro.
[00132] Modalidade 52. Sistema de ensaio digital, de acordo com a modalidade 51, em que o sensor de imagem é uma câmera de megapixel.
[00133] Modalidade 53. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 52, em que o
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38/82 sensor de imagem é câmera de semicondutor de óxido de metal (CMOS) complementar.
[00134] Modalidade 54. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 53, que compreende adicionalmente uma fonte de luz ou outra radiação eletromagnética.
[00135] Modalidade 55. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 54, em que a fonte de luz compreende um diodo emissor de luz (um LED).
[00136] Modalidade 56. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 55, que compreende adicionalmente uma câmara de amostra que é opcionalmente removível.
[00137] Modalidade 57. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 56, que compreende adicionalmente • uma superfície repórter produzida a partir de vidro ou polímero, a um lado das quais as moléculas repórteres ópticas que compreendem nanopartícuias plasmônicas funcionalizadas com elementos de captura foram afixadas; e • um guia de onda que é adequado para microscopia de campo escuro em contato com o lado oposto da superfície repórter.
[00138] Modalidade 58. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 57, em que cada molécula repórter óptica afixada é espacialmente resolvível.
[00139] Modalidade 59. Sistema de ensaio digital, de acordo com a modalidade 58, em que as moléculas repórteres ópticas afixadas são arranjadas em uma grade ou uma aproximação
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39/82 da mesma.
[00140] Modalidade 60. Sistema de ensaio digital, de acordo com a modalidade 58 ou 59, em que cada molécula repórter óptica afixada é resolvível como um pixel de um dispositivo de gravação.
[00141] Modalidade 61. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49-60, em que o elemento de captura é escolhido dentre:
• uma ou mais sequências de nucleotídeos se ligam ao analito; e • um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga ao analito.
[00142] Modalidade 62. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 61, em que o analito é um antígeno.
[00143] Modalidade 63. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 4 9 a 62, em que cada molécula repórter óptica compreende como o elemento de captura um anticorpo ou um fragmento do mesmo.
[00144] Modalidade 64. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 63, em que o analito é uma sequência de nucleotídeos.
[00145] Modalidade 65. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 4 9 a 64, em que cada molécula repórter óptica compreende como o elemento de captura uma ou mais sequências de nucleotídeos complementares à sequência de nucleotídeos de analito.
[00146] Modalidade 66. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 65, em que o microprocessador, memória, sensor de imagem, software, tela
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40/82 que tem capacidade para exibir uma imagem, e interfaces de comunicação são todos compreendidos em um único dispositivo portátil.
[00147] Modalidade 67. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 66, em que a interface de comunicação é sem fio.
[00148] Modalidade 68. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 67, em que o único dispositivo portátil é escolhido dentre um telefone inteligente e um computador do tipo tablet.
[00149] Modalidade 69. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 68, em que o único dispositivo portátil é um telefone inteligente.
[00150] Modalidade 70. Sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 69, que compreende adicionalmente um invólucro para posicionar o telefone inteligente, a câmara de amostra e a fonte de luz em proximidade estreita e estável entre si.
[00151] Além disso, são fornecidos dispositivos que compreendem os elementos acima.
[00152] Modalidade 71. Além disso, é fornecido um sistema de ensaio digital, de acordo com qualquer uma das modalidades, que pode realizar o método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 41, 44, 45, 47 e 48.
[00153] Modalidade 72. Método para realizar um ensaio bioquímico que compreende:
incubar anticorpos com antígeno;
obter uma imagem de uma pluralidade dos anticorpos;
classificar os anticorpos vistos na imagem como ativos ou nulos;
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41/82 classificar os anticorpos ativos como ligados ou não ligados;
determinar o número de anticorpos ligados e não ligados na imagem; e, medir uma concentração de antígeno a partir do número de anticorpos ligados como uma fração do número de anticorpos ativos.
[00154]
Modalidade 73. Método de acordo com a modalidade 72 em que os anticorpos são fixados a uma superfície.
[00155]
Modalidade 74.
Método de acordo com a modalidade 72 em que os anticorpos e o antígeno são marcados com moléculas repórteres ópticas.
[00156]
Modalidade 75.
Método, de acordo com modalidade 72 em que a imagem é obtida com uma camera de dispositivo móvel.
[00157]
Modalidade 76.
Método para realizar um ensaio bioguímico que compreende:
incubar as moléculas repórteres ópticas ligadas uma primeira parte de uma sequência de DNA curta com moléculas repórteres ópticas ligadas a uma segunda parte da sequência de
DNA curta;
obter uma imagem de uma pluralidade das moléculas repórteres ópticas;
classificar complexos moleculares vistos na imagem como ativos ou nulos;
classificar os complexos moleculares ativos como ligados ou não ligados;
determinar o número de complexos ligados e não ligados na imagem; e,
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42/82 medir uma concentração de uma sequência de DNA complementar tanto à primeira como à segunda partes da sequência de DNA curta a partir do número de complexos ligados como uma fração do número de complexos ativos.
[00158] Modalidade 77. Método, de acordo com a modalidade 76, em que as sequências de DNA curtas são ligadas a uma superfície.
[00159] As modalidades adicionais do supracitado são detalhadas abaixo.
APLICAÇÕES [00160] Os métodos, sistemas e dispositivos de ensaio molecular digital revelados no presente documento são úteis em uma variedade de campos e aplicações. Em particular, ensaios moleculares digitais podem ser úteis no campo, ou seja, em uma configuração portátil. Por exemplo, ensaios moleculares digitais podem ser úteis em avaliação médica e diagnóstico e detecção de patógenos, particularmente em áreas remotas, áreas que são subatendidas ou de difícil acesso (por exemplo, devido a conflitos violentos), áreas afetadas por uma epidemia e, em outros casos, em que o acesso ao equipamento de ensaio tradicional e/ou profissionais é limitado. Os mesmos também podem ser úteis dentro de um hospital ou clínica, ou em uma configuração de visita domiciliar, em que eles podem ser realizados ou usados no local de prestação de tratamento ou leito.
[00161] Os ensaios moleculares digitais podem ser igualmente úteis em uma configuração veterinária como médica, seja em uma clínica veterinária, em um rancho ou fazenda ou qualquer local em que os animais que precisem de teste se situem. Os mesmos também podem ser usados em aplicações
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43/82 agrícolas ou hortícolas para testar plantas ou solo em relação a patógenos ou micro-organismos simbióticos, ou detectar outros genótipos e fenótipos de interesse.
[00162] Os ensaios moleculares digitais também devem ser usados para testar água em relação à contaminação, por exemplo, por bactérias, algas ou fungos, ou os produtos tóxicos dos mesmos; por petróleo ou seus produtos e subprodutos e resíduos industriais). Tais ensaios podem ser úteis para testes de segurança alimentar e para usos agrícolas, tais como testes de campo de instalação de processamento para patógenos, toxinas, adulterantes, contaminantes e pragas.
ENSAIOS [00163] Muitos tipos de ensaios são adaptáveis ao formato de ensaio molecular digital revelado no presente documento. Os exemplos incluem: imunoensaios em que a captura e ligação de um antígeno por um anticorpo ou um fragmento do mesmo; ensaios de hibridização em que um ou mais segmentos de DNA ou RNA complementares ao DNA/RNA de analito de interesse são usados para captura do analito; e ensaios de ligação ao ligante em que um parceiro de ligação a um receptor, enzima ou outra proteína, ou vice-versa, é usado como o agente de captura para o analito parceiro (por exemplo, proteína ou fragmento da mesma).
[00164] Será observado que os imunoensaios e os ensaios de hibridização podem empregar um formato de sanduíche em que pares de parceiros de ligação, por exemplo anticorpos ou cDNA/RNA, à mesma molécula de analito, por exemplo, um antígeno ou DNA/RNA alvo, são usados. A revelação desse modo, abrange pares de parceiros de ligação, por exemplo, anticorpos, em que ambos os anticorpos são específicos para a mesma
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44/82 molécula, por exemplo, o mesmo antígeno e, em que um ou ambos os membros do par compreendem uma molécula repórter óptica, conforme descrito no presente documento. A combinação de múltiplos elementos de captura e repórter compreende ainda uma disposição de produção de sinal que, embora compreenda múltiplas moléculas repórteres ópticas, ainda pode ser propriamente chamada de molécula repórter óptica.
[00165] Os parceiros de ligação por captura e pares de parceiros de ligação por detecção, por exemplo, pares de anticorpos ou nucleotídeos, podem ser usados na molécula repórter. Desse modo, embora os ensaios moleculares digitais revelados no presente documento permitam detecção de analitos isenta de marcador, em algumas modalidades, um protocolo de ensaio heterogêneo é usado, em que, tipicamente, dois parceiros de ligação, por exemplo, dois anticorpos ou duas sequências de DNA ou RNA, são usados. Um parceiro de ligação é um parceiro de captura, geralmente imobilizado em um suporte sólido, tal como uma nanopartícuia plasmônica, e o outro parceiro de ligação é um parceiro de ligação por detecção, tipicamente com um marcador detectável fixado, tal como outra nanopartícuia plasmônica. Os anticorpos e pares de anticorpos estão comercialmente disponíveis, e também podem ser projetados e preparados por métodos bem conhecidos na técnica.
[00166] As moléculas repórteres podem ser fixadas a uma superfície repórter, por adsorção não específica ou por ligação covalente específica. O carregamento de moléculas repórteres será determinado, em uma grande parte, pela concentração das moléculas repórteres na solução de preparação. As soluções mais concentradas irão fornecer uma densidade mais alta de moléculas repórteres, enquanto ao mesmo
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45/82 tempo, aumentam a contagem de agrupamentos de moléculas repórteres que contêm duas ou mais partículas. Esse último efeito não é de modo algum fatal para a operação bem-sucedida: agrupamentos menores de moléculas repórteres podem ser analisados com técnicas de ajuste de curva discutidas abaixo, enquanto agrupamentos maiores que não são adequados para essas técnicas podem ser sinalizados como inativos. Considerando os objetivos conflitantes para aumentar a contagem de molécula repórter e manter um número gerenciavelmente pequeno de agrupamentos de moléculas repórteres, um carregamento de um máximo de cerca de 1 molécula repórter por micron quadrado se provará ideal em determinadas modalidades. Para detecção de molécula única, uma densidade que equivalesse a não mais que uma molécula de analito (ligada à molécula repórter óptica) por pixel podería ser útil.
[00167] A análise com o uso de ensaios do tipo sanduíche pode ser realizada com um procedimento de múltiplas etapas: a superfície repórter que foi funcionalizada com moléculas de captura é exposta ao analito. Uma determinada fração de moléculas de captura irá se ligar ao analito, dependendo da concentração de analito. Em uma segunda etapa, a superfície repórter é exposta a uma solução exposta a uma solução com moléculas de detecção. Apenas aquelas moléculas de captura que se ligam a um analito na primeira etapa irão se ligar a moléculas de detecção na segunda etapa. Uma vantagem clara desse método consiste no fato de que as moléculas de captura e detecção podem ser escolhidas a fim de otimizar o sinal óptico que é entregue a partir do conjunto de moléculas de molécula/analitos/moléculas de detecção, em comparação com a molécula de captura não ligada.
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46/82 [00168] Os métodos revelados no presente documento podem ser usados para identificar um estado fenotípico ou genotípico de interesse associado a um estado patológico clinicamente diagnosticado. Tais estados patológicos incluem, por exemplo, câncer, doença cardiovascular, doença inflamatória, doença autoimune, doença neurológica, doença infecciosa e distúrbios relacionados à gravidez. Alternativamente, os estados de saúde podem ser detectados com o uso de marcadores.
[00169] Os métodos revelados no presente documento podem ser usados para detectar variação genética. A variação genética no presente documento pode incluir, porém sem limitação, uma ou mais substituições, inversões, inserções, deleções ou mutações nas sequências de nucleotídeos (por exemplo, DNA e RNA) e proteínas (por exemplo, peptideo e proteína), uma ou mais microdeleções, um ou mais alelos raros, polimorfismo, polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), polimorfismo genético em grande escala, tais como inversões e translocações, diferenças na abundância e/ou número de cópias (por exemplo, variantes de número de cópias, CNVs) de uma ou mais moléculas de nucleotídeo (por exemplo, DNA), trissomia, monossomia e rearranjos genômicos. Em algumas modalidades, a variação genética pode ser relacionada à metástase, presença, ausência e/ou risco de uma doença, tal como câncer, variabilidade farmacocinética, toxicidade de fármaco, eventos adversos, recidiva e/ou presença, ausência ou risco de rejeição de transplante de órgão no indivíduo. Por exemplo, alterações de número de cópias no gene HER2 afetam a possibilidade de um paciente com câncer de mama responder ao tratamento com Herceptina ou não. De modo similar, a detecção de um aumento
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47/82 no número de cópias do cromossomo 21 (ou 18 ou 13 ou cromossomo sexual) no sangue de uma mulher grávida pode ser usada como um diagnóstico não invasivo de Síndrome de Down (ou Síndrome de Patau ou Síndrome de Edwards) em um feto. Um exemplo adicional é a detecção de alelos de um órgão transplantado que não estão presentes no genoma receptor - o monitoramento da frequência ou número de cópias desses alelos pode identificar sinais de potencial rejeição de órgão.
DISPOSITIVOS E SISTEMAS DE MEDIÇÃO [00170] Os métodos de ensaio molecular digital descritos no presente documento empregam um dispositivo ou sistema de medição, cada um dos quais compreende as partes exigidas para análise de amostras. O dispositivo de medição contém um compartimento de amostra, no qual as amostras são introduzidas, por adição direta da amostra de interesse, ou por inserção de um cadinho ou lâmina, que contém propriamente a amostra de interesse. O compartimento de amostra fornece adicionalmente um componente que contém moléculas repórteres, cuja função é se ligar ao analito de interesse e produzir um sinal óptico. Para projetos que dependem dos métodos de emissão, o dispositivo de medição fornece um dispositivo de iluminação para excitação de cromóforos contidos nas moléculas repórteres. O dispositivo de medição contém um dispositivo de gravação (por exemplo, um sensor de imagem, por exemplo uma câmera digital), que detecta e grava o sinal óptico a partir das moléculas repórteres. Finalmente, o dispositivo de medição pode conter componentes adicionais, tais como controles para operação, um dispositivo para exibir ou relatar resultados de análise, e uma interface com um computador externo. A presença dos vários componentes opcionais, e seus específicos, pode
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48/82 diferir entre vários projetos de dispositivos de medição.
[00171] O sistema ou dispositivo como um todo pode incorporar uma quantidade para orientar o dispositivo para adição ou remoção de amostra conveniente. O sistema pode ser acoplado a um dispositivo de computação móvel. O dispositivo de computação móvel pode ser um telefone inteligente, computador de mão, computador do tipo tablet ou um dispositivo de computação portátil similar. Em alguns exemplos, o dispositivo de computação móvel incluir todos os componentes necessários, tais como: visor, um processador, uma memória e instruções de programa armazenadas na memória e executáveis pelo processador, para permitir o desempenho altamente automatizado de etapas, tais como: (i) introdução de amostra, (ii) excitação óptica, (iii) pré-triagem opcional da amostra para avaliar a qualidade de amostra e o tempo de exposição ideal, (iv) gravação de uma imagem pelo dispositivo de gravação, (v) subtração de desvio de detector, se necessário, (vi) digitalização de sinal de detector, (vii) gravação de sinal digital em memória não volátil, (viii) reciclagem de detector, se necessário, e (ix) processamento de sinal digital. As funções podem incluir adicionalmente determinar o resultado do ensaio digital, e transmitir o resultado na forma visual para o usuário final.
[00172] O uso de um telefone inteligente ou outro dispositivo de computação móvel como o instrumento de detecção para ensaios moleculares digitais permite que sistemas pouco dispendiosos, portáteis e multifuncionais realizem ensaios no campo, isto é, fora do laboratório. As aplicações podem incluir sistemas de diagnóstico de local de prestação do tratamento para medir cargas virais, situação nutricional, biomarcadores
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49/82 de doença ou contaminantes ambientais sem a necessidade de transportar uma amostra para um laboratório central. Tais testes podem ser realizados em residências privadas, instalações de saúde global, em instalações de aplicação da lei e clínicas médicas. 0 dispositivo de computação móvel pode se conectar à internet, que irá permitir a combinação de dados de sensor com informações de paciente e localização geográfica. A conectividade com uma instalação de computação externa pode ser fornecida para interpretação de dados, mapeamento geográfico e demográfico, construção e manutenção de banco de dados e entrega de notificações para especialistas médicos e autoridades remotos. Os dispositivos de medição digital operáveis em campo compactos irão liberar os ensaios dos requisitos para técnicos treinados em laboratórios. Em vez disso, esses ensaios podem ser realizados por qualquer pessoa, devido ao tamanho e acessibilidade do sistema de detecção.
BIOSSENSORES [00173] Os sistemas ou dispositivos de ensaio molecular digital conforme revelado no presente documento compreendem elementos que podem ser chamados de biossensores. Um biossensor é um dispositivo que usa moléculas biológicas (por exemplo, uma ou mais enzimas, anticorpos ou sequências de nucleotídeos) para detectar a presença de produtos químicos. Muitos tipos de biossensores podem ser usados em um ensaio molecular digital. Um biossensor consiste tipicamente em um componente de captura (muitas vezes chamado de biorreceptor) e um componente repórter, (biotransdutor) , compreendem em conjunto uma molécula repórter, conforme revelado no presente documento, assim como um sistema que inclui um detector, processador e visor, e
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50/82 opcionalmente outros elementos, tais como um amplificador de sinal, lente de aumento e fonte de luz. A interação entre (tipicamente a ligação de) o analito e do elemento de captura produz uma alteração no elemento repórter, que emite um sinal fitoquímico mensurável. Essa interação produz um sinal que indica a presença ou concentração do analito alvo na amostra.
[00174] Os componentes repórteres, conforme revelado no presente documento, incluem transdutores ópticos que incluem nanopartícuias plasmônicas, outros sistemas de ressonância plasmônica de superfície localizada (LSPR), sistemas de dispersão plasmônica, cristais fotônicos e qualquer outra tecnologia que possa detectar uma molécula única e produzir um sinal óptico.
[00175] Os elementos de captura podem ser biomoléculas naturais ou geneticamente modificadas, tal como um anticorpo ou fragmento (Fab, Fv ou scFv) ou domínio (VH, VHH) do mesmo, ou um ácido nucleico (uma ou mais seções de DNA ou RNA complementar ao analito de interesse) .
[00176] O elemento de captura é fixado ao elemento repórter, por exemplo por funcionalização e deposição em camadas, ou aprisionamento em uma matriz, por exemplo, um hidrogel ou xerogel, tal como sol-gel. A superfície do sensor à qual as moléculas repórteres (que compreendem elementos de captura e repórter) são fixadas, a chamada de superfície repórter, pode ser, por exemplo, polímero ou vidro; ou vidro revestido de metal ou contendo as nanopartícuias de metal (por exemplo ouro ou prata; outros metais, tais como titânio, cromo e cobre também foram usados) que compreendem o elemento repórter. Essa superfície se forma ou é alinhada ao longo de pelo menos uma parede de uma câmara ou célula de fluxo, na ou
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51/82 através da qual a solução de analito é passada.
[00177] Em um exemplo de um biossensor de nanopartícuia plasmônica, a câmara ou célula de fluxo pode ser produzida a partir de vidro ou polímero; a superfície repórter de vidro ou polímero pode suportar nanopartícuias de ouro funcionalizadas com elementos de captura, aplicadas por meio de métodos conhecidos na técnica. Para análise com microscopia de campo escuro, a luz é passada através da borda da superfície repórter de vidro ou polímero, ortogonal ao plano da superfície repórter.
COMPARTIMENTO DE AMOSTRA [00178] O dispositivo de medição fornece um compartimento de amostra adequado para introdução de uma amostra de interesse. Os dispositivos de medição que empregam técnicas de medição óptica irão se beneficiar de um compartimento de amostra que seja oblongo, com uma dimensão curta. O caminho de luz para o sinal óptico a partir das moléculas repórteres até o dispositivo de gravação irá se alinhar paralelo à dimensão curta. Essa orientação irá minimizar a absorção e dispersão do sinal óptico que pode causar problemas para caminhos ópticos mais longos. Esse critério permite o uso de compartimentos de amostra prismáticos ou cilíndricos.
VOLUME DE REPÓRTER [00179] O compartimento de amostra compreende um componente, chamado de volume de repórter, que contém moléculas repórteres. Esse componente evita a necessidade de adicionar moléculas repórteres à amostra de interesse, e irá, em vez disso, permitir a reciclagem das moléculas repórteres. De modo mais importante, as moléculas repórteres serão mantidas em uma
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52/82 disposição substancialmente estacionária, de modo que
| moléculas | repórteres | inativas | possam ser | identificadas | e | |
| gravadas | antes do uso | clínico do | dispositivo | de | medição. | |
| [00180] Em | algumas | modalidades | r | o volume | de | |
| repórter | é definido | por um invólucro físico | que retém | as |
moléculas repórteres dentro do mesmo. 0 invólucro físico pode ser poroso, para permitir a passagem de analito para o volume de repórter para contato com a molécula repórter. Em algumas modalidades, o volume de repórter não é definido por um invólucro físico; em vez disso, outros meios podem ser fornecidos para reter moléculas repórteres dentro do volume de repórter e manter a molécula repórter estacionária.
[00181] Em determinadas modalidades, as moléculas repórteres são associadas a um suporte tridimensional. Em um projeto, as moléculas repórteres são covalentemente ligadas ao suporte tridimensional. Alternativamente, as moléculas repórteres não são covalentemente ligadas ao suporte tridimensional, porém são impregnadas no suporte tridimensional de tal modo que impeçam a difusão do suporte tridimensional. Em tal projeto, as moléculas repórteres são substancialmente aprisionadas no suporte tridimensional, e são estacionárias.
[00182] O volume de repórter será preferencialmente estreito na dimensão que é perpendicular à via óptica para as moléculas repórteres. Essa geometria fornece uma vantagem importante: é improvável que a via óptica a partir de uma primeira molécula repórter encontre uma segunda molécula repórter antes de chegar no dispositivo de gravação. Isso é mostrado na Figura 11. Um volume de repórter estreito é mostrado na Figura 11 (a), com um dispositivo de gravação à
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53/82 direita, e uma disposição não uniforme de moléculas repórteres no volume de repórter. Será observado que, nessa geometria, os caminhos ópticos a partir de moléculas repórteres até o dispositivo de gravação são bem separados. Em contraste, um volume de repórter amplo é mostrado na Figura 11(b). Nessa geometria, pelo menos uma molécula repórter se sobrepõe a uma segunda molécula repórter. Essa sobreposição é desfavorável por duas razões: (a) a segunda molécula repórter pode reabsorver parcialmente o sinal da primeira molécula repórter, causando, desse modo, erro, e (b) a identificação de moléculas repórteres inativas, que exige medição precisa de sinal livre e ligado a partir das moléculas repórteres, se tornará mais complicada.
[00183] O grau no qual o caminho óptico se sobrepõe pode ser estimado a partir de um pequeno número de parâmetros que definem o volume de receptor, incluindo a distribuição particular de moléculas repórteres (aleatórias, semialeatórias, agregadas, ordenadas), a concentração e o tamanho eficaz das moléculas repórteres, e a espessura do volume de repórter. Em determinadas modalidades da revelação, substancialmente todos os caminhos ópticos entre as moléculas repórteres e o dispositivo de gravação não encontram nenhuma outra molécula repórter. Em determinadas modalidades, substancialmente todos os caminhos ópticos entre as moléculas repórteres e o dispositivo de gravação encontram no máximo uma outra molécula repórter.
[00184] Em algumas modalidades, o volume de repórter é suficiente fino a fim de permitir uma única camada para as moléculas repórteres. Nesse projeto, a sobreposição de caminhos ópticos não é possível, uma vez que todas as moléculas
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54/82 repórteres estão substancialmente em um plano perpendicular ao caminho óptico, e paralelo ao dispositivo de gravação, conforme mostrado na Figura 12(a). Várias técnicas de monocamada podem ser usadas para obter tal sistema, tal como o uso de molécula de ativo de superfície. A reticulação das moléculas de ativo de superfície pode tornar as moléculas repórteres estacionárias. A discussão de superfícies repórteres é apresentada abaixo em detalhes.
[00185] Deve-se observar que a distância preferencial da abordagem mais próxima para caminhos ópticos de diferentes moléculas repórteres é determinada não apenas pelo tamanho das moléculas repórteres (que pode determinar se um caminho óptico de uma molécula penetra em uma segunda molécula), mas também pela resolução espacial do detector e, em particular, o tamanho de pixel. De modo ideal, cada molécula repórter será separada por pelo menos um pixel a partir de qualquer molécula repórter vizinha, a fim de identificar mais facilmente as moléculas repórteres inativas e observar o sinal óptico a partir de moléculas repórteres ativas. Além disso, dependendo da divergência dos caminhos ópticos que entram no dispositivo de gravação, uma separação muito maior pode ser desejável. Isso é mostrado na Figura 12(b), para a qual a distância entre o volume de repórter e o dispositivo de gravação foi aumentada, por uma questão de clareza, e para a qual uma pequena divergência, porém diferente de zero do sinal óptico que entra no dispositivo de gravação. Será evidente que, mesmo que as moléculas repórteres não se sobreponham fisicamente, os sinais ópticos de moléculas repórteres estritamente espaçadas podem se sobrepor potencialmente.
[00186] A fim de minimizar a sobreposição entre
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55/82 caminhos ópticos de moléculas repórteres diferentes, será evidente que os recursos e técnicas que minimizam a agregação de moléculas repórteres ou, por outro lado, aumentam a separação entre moléculas repórteres, serão vantajosos. Em uma modalidade, moléculas repórteres individuais serão acopladas a partículas maiores, tais como microesferas ou micropartícuias ou nanopartícuias. 0 acoplamento de moléculas repórteres a partículas maiores tenderá a aumentar a distância média entre moléculas repórteres, devido ao tamanho das partículas maiores. Isso é mostrado na Figura 12(c), em gue as moléculas repórteres 3 são fixadas sobre, ou dentro de partículas maiores 5.
SUPERFÍCIE REPÓRTER [00187] Em determinadas modalidades, o compartimento de amostra compreende uma superfície repórter para fixação de moléculas repórteres. A superfície repórter é orientada perpendicular à dimensão mais curta de um compartimento de amostra oblongo, a fim de minimizar o caminho óptico a partir da molécula repórter até o dispositivo de gravação. Essa disposição de moléculas repórteres permite a fácil fixação de moléculas repórteres a um suporte sólido, e fornece adicionalmente um volume de repórter estreito, que é benéfico pelas razões discutidas acima.
[00188] A superfície repórter é orientada oposta a uma janela que é substancialmente transparente para o sinal produzido pelas moléculas repórteres. A superfície repórter transparente pode entrar em contato com um guia de onda que é adequado para microscopia de campo escuro. Em determinadas modalidades, a superfície repórter compreende uma camada metálica. Em determinadas modalidades adicionais, a camada
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56/82 metálica é adequada para ressonância plasmônica de superfície. A superfície repórter e a janela transparente podem se situar nas duas faces de extremidade de um compartimento de amostra prismático ou, alternativamente, nas duas faces de extremidade de um compartimento de amostra cilíndrico. Em determinadas modalidades as faces de extremidade são paralelas e proximais, se aproximando ou formando uma lâmina de ensaio ou chip de ensaio.
MOLÉCULAS REPÓRTERES [00189] Os dispositivos e sistemas de medição compreendem, e os métodos revelados no presente documento empregam, uma variedade de moléculas repórteres. Em uma modalidade, é empregado um único tipo de molécula repórter, que irá fornecer uma resposta de ligação com bom funcionamento para várias concentrações de analitos. Alternativamente, duas ou mais moléculas repórteres diferentes que têm afinidades diferentes para o mesmo analito, podem ser empregadas, que podem acomodar uma faixa mais ampla de concentrações de analito que um dispositivo de medição que tem um único tipo de molécula repórter, conforme descrito em mais detalhes abaixo. Em determinadas modalidades, duas ou mais moléculas repórteres diferentes que têm afinidades para diferentes analitos são fornecidas.
[00190] As moléculas repórteres podem compreender um cromóforo. Em determinadas modalidades, o cromóforo foi covalentemente fixado à molécula repórter; alternativamente, o mesmo pode se fixar à molécula repórter por meio de funcionalização, por exemplo, à superfície de um ponto quântico ou nanoparticula plasmônica. Em determinadas modalidades, o cromóforo absorve radiação eletromagnética. Em determinadas
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57/82 modalidades, o cromóforo absorve radiação eletromagnética em uma região espectral escolhida dentre visível e ultravioleta. Alternativamente, o cromóforo pode espalhar radiação eletromagnética. Em determinadas modalidades, o cromóforo é luminescente. Em determinadas modalidades, o cromóforo é fluorescente. Em determinadas modalidades, o cromóforo é fosforescente.
[00191] Em determinadas modalidades da revelação, as moléculas repórteres podem compreender, cada uma, um cromóforo gue fornece um sinal óptico mediante a ligação do analito. O sinal óptico pode ser uma alteração no coeficiente de extinção de uma banda de absorção, uma alteração na Amax de uma banda de absorção, uma alteração no rendimento quântico de uma banda de emissão, uma alteração na a anisotropia de fluorescência de uma banda de emissão, um desvio no centro de um espectro acima ou abaixo de um comprimento de onda especificado, comprimento de onda de intensidade máxima (Amax) , uma alteração no tamanho ou intensidade do sinal, um aumento ou diminuição na luminosidade, uma alteração no formato do sinal, a presença ou ausência de bandas espectrais; e uma alteração no formato de um espectro.
[00192] Em determinadas modalidades da revelação, o sinal óptico é causado por uma interação entre analito e cromóforo. Em determinadas modalidades, o sinal óptico é indiretamente causado pela ligação de analito à molécula repórter. Em determinadas modalidades, a ligação do analito pela molécula repórter induz uma alteração conformacional que afeta uma propriedade de absorção ou emissão do cromóforo. Em determinadas modalidades, a ligação do analito pela molécula repórter induz uma interação entre um cromóforo no analito e
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58/82 um cromóforo na molécula repórter.
[00193] Em determinadas modalidades da revelação, a molécula repórter compreende dois cromóforos. Em determinadas modalidades, a ligação de um analito pela molécula repórter induz uma alteração geométrica na molécula repórter que aumenta uma interação não radiativa entre os dois cromóforos. Em determinadas modalidades, a ligação de um analito pela molécula repórter induz uma alteração geométrica na molécula repórter que diminui uma interação não radiativa entre os dois cromóforos. Em determinadas modalidades, a interação não radiativa é arrefecimento brusco por fluorescência. Em determinadas modalidades, a interação não radiativa é transferência de energia por fluorescência. Em determinadas modalidades, a interação não radiativa é transferência de energia por fosforescência. Em determinadas modalidades, a interação não radiativa é transferência de energia de ressonância acoplada a plásmon.
[00194] Em determinadas modalidades, o cromóforo é a nanoparticula plasmônica e/ou um ponto quântico. A nanoparticula plasmônica e/ou ponto quântico podem ser funcionalizados para suportar um elemento de captura. Quando o elemento de captura for uma molécula biológica, tal como um anticorpo, nucleotídeo, peptídeo ou fragmento do mesmo, o elemento de captura de cromóforo se torna uma molécula repórter óptica e um biossensor. O contato com (por exemplo, ligação de) um analito, tal como um antígeno ou nucleotídeo complementar, altera a massa da, induz uma alteração nas propriedades espectrais da nanoparticula, devido aos efeitos, tais como transferência de elétron, transferência de energia, ressonância plasmônica e alterações na massa e mobilidade da
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59/82 partícula .
MOLÉCULAS REPÓRTERES INATIVAS [00195] Os métodos descritos no presente documento acomodam uma determinada fração de moléculas repórteres que está inativa, isto é, o sinal óptico a partir dessas moléculas repórteres inativas é ausente ou substancialmente diferente do volume das moléculas repórteres. Esse comportamento pode ser devido à falha de uma molécula repórter para se ligar ao analito. Alternativamente, uma molécula repórter pode se ligar ao analito, porém não produzir um sinal óptico, ou produzir um sinal óptico que é substancialmente diferente do restante das moléculas ópticas.
[00196] Em determinadas modalidades, o sistema utiliza uma nanopartícuia como uma molécula repórter. Uma nanopartícuia pode se tornar inativa na agregação com outras nanopartícuias.
[00197] Em determinadas modalidades da revelação, uma molécula repórter inativa compreende proteínas individuais (incluindo anticorpos) que têm agregadas, um peptídeo ou proteína que não foi corretamente enovelado, um peptídeo ou proteína que compreende um resíduo incorreto, um cromóforo defeituoso.
[00198] O número de moléculas repórteres inativas pode permanecer substancialmente constante durante a vida útil de operação do dispositivo de medição, particularmente em casos em que as moléculas repórteres inativas têm composição defeituosa. É possível também que o número de moléculas inativas aumente durante a vida útil de operação do dispositivo de medição, devido à deterioração química de moléculas repórteres, particularmente deterioração fotoquímica causada
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60/82 por exposição de alta intensidade repetida a fontes de luz, ou agregação de proteína que forma parte da molécula repórter.
[00199] As moléculas repórteres inativas podem ser identificadas por uma alteração no comportamento óptico: sua falha para produzir um sinal óptico na exposição a moléculas de analito, ou sua produção de um sinal óptico na exposição a moléculas de analito que são significativamente diferentes do volume das moléculas repórteres.
[00200] Em determinadas modalidades, a pluralidade de moléculas repórteres é distribuída aleatoriamente. Em determinadas modalidades, a pluralidade de moléculas repórteres compreende agregados de moléculas repórteres. Em determinadas modalidades, a pluralidade de moléculas repórteres compreende uma ordenação geométrica regular em uma ou mais dimensões. Em determinadas modalidades, cada molécula repórter é associada a uma zona de exclusão, dentro da qual nenhuma outra molécula repórter se situa.
DISPOSITIVO DE GRAVAÇÃO E MICROSCÓPIO [00201] Um dispositivo de gravação é fornecido para gravar o sinal óptico a partir das moléculas repórteres. Em determinadas modalidades, o sinal óptico a partir das moléculas repórteres passa através de uma janela transparente do compartimento de amostra. Em determinadas modalidades, o dispositivo de gravação será um sensor de imagem, tal como uma câmera. Uma câmera CMOS (semicondutor de óxido de metal complementar) , por exemplo, é útil pelo fato de que a mesma pode ler cada pixel individualmente; adicionalmente, as câmeras CMOS consomem muito pouca energia, permitindo que as mesmas durem mais quando usadas como parte de um dispositivo no campo. Quase todas as câmeras de telefone inteligente têm
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61/82 câmeras CMOS, muitas com resolução superior a 10 megapixels, tornando as mesmas úteis nos métodos, sistemas e dispositivos revelados no presente documento.
[00202] Em determinadas modalidades da revelação, o dispositivo de gravação permite a observação de um ou mais sinais a partir do compartimento de amostra. Em determinadas modalidades, cada um dentre uma pluralidade de sinais se origina de uma região diferente do compartimento de amostra. Em determinadas modalidades, cada sinal na pluralidade de sinais se origina de um pixel em uma grade geométrica regular que abrange o compartimento de amostra.
[00203] Em determinadas modalidades, os pixels de um dispositivo de gravação são arranjados em uma matriz retangular ou quadrada. Em determinadas modalidades, os pixels de um dispositivo de gravação são arranjados em uma matriz quadrada 512 x 512, uma matriz quadrada 1.024 x 1.024, uma matriz quadrada 2.048 x 2.048 ou uma matriz quadrada 4.096 x 4.096. Em determinadas modalidades, o sinal a partir de cada pixel é gravado separadamente a partir de todos os outros pixels. Em determinadas modalidades, o sinal de conjuntos de pixels 2 x 2 é compartimentalizado.
[00204] O dispositivo de medição pode permitir a observação de uma pluralidade de sinais de diferentes regiões da pluralidade de moléculas repórteres. Em determinadas modalidades adicionais, as diferentes regiões da pluralidade de moléculas repórteres são dispostas em uma grade regular. Alternativamente, o sinal óptico individual a partir de substancialmente todas as moléculas repórteres pode ser observado sem interferência de qualquer outra molécula repórter.
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62/82 [00205] Em determinadas modalidades, o dispositivo de gravação pode capturar pixels individuais e/ou moléculas repórteres individuais. O uso de nanopartícuias plasmônicas/pontos quânticos como substratos aos quais os elementos de captura são funcionalizados facilita essa detecção. O dispositivo de gravação, usado em combinação com uma lente de aumento, pode detectar sinais ainda menores. Tais lentes são bem conhecidas na técnica.
[00206] O dispositivo de gravação pode usar qualquer técnica que seja conhecida na técnica para detecção e quantificação de molécula repórter/complexos de analito. Os dispositivos de gravação podem usar métodos de absorção e emissão ópticas que são combinados com o projeto de molécula repórter.
[00207] O dispositivo de gravação pode efetuar medições de absorção óptica. Por exemplo, a ligação com uma molécula repórter pode ser acoplada a um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) que produz um produto colorido na presença de um analito. Quando o ELISA é funcionalizado sobre uma nanoparticula plasmônica ou ponto quântico, a presença e quantidade de analito poderíam, então, ser relatadas, por exemplo, pelo comprimento de onda, intensidade, etc. de um recurso de absorção; e podería produzir um sinal a partir de cada nanoparticula em posição a um sinal em massa.
[00208] Alternativamente, a saída óptica pode incluir emissão de fluorescência a partir do fluoróforo na molécula repórter ou acoplado à molécula repórter que é excitada por uma fonte de luz. A presença e quantidade de analito poderíam, então, ser relatadas pela intensidade da emissão de fluorescência. O fluoróforo podería ser proximal a
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63/82 uma superfície, tal como um cristal fotônico, de modo que a emissão de fluorescência seja aprimorada. Múltiplos fluoróforos podem ser empregados para sintonizar o sinal de fluorescência a um resultado desejável. Desse modo, o sinal óptico pode ser modulado por transferência de excitação entre dois ou mais fluoróforos.
[00209] O rendimento quântico de fluorescência e fosforescência, desvio Àmax e anisotropia são previstos nesta revelação. Para medições de anisotropia, polarizadores podem
| ser introduzidos | na | via | óptica | de | excitação | ou | emissão, | ou |
| ambas. Uma fonte | de | luz | pode | ser | acoplada | aos | métodos | de |
| emissão. A fonte | de | luz | pode ser | uma fonte | de | banda larga | ||
| convencional, diodo | emissor de | luz ou laser, | e pode | ser |
entregue para a amostra diretamente ou através de um dispositivo de seleção de comprimento de onda, tal como um retículo, a fim de otimizar a excitação. A luz pode ser direcionada através de um componente de reflexão que incorpora um guia de onda e que forma a base da superfície repórter fornecendo, desse modo, a excitação de campo escuro.
[00210] Em algumas modalidades, o meio de ensaio óptico pode incluir uma superfície configurada para espalhamento Raman intensificado por superfície (SERS). Desse modo, a saída óptica podería incluir espalhamento Raman da fonte de luz por moléculas repórteres na superfície SERS. A presença e guantidade de analito poderíam, então, ser relatadas pela intensidade do espalhamento Raman.
Identificação de moléculas repórteres inativas [00211] São fornecidos no presente documento métodos para identificar moléculas repórteres inativas, chamados de métodos de identificação. Para determinados
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64/82 sistemas, duas soluções, a primeira livre de analito, e a segunda com uma alta concentração de analito, entrarão sequencialmente em contato com a superfície repórter. Será observado que essas duas soluções irão causar uma ausência de ligação de analito pela molécula repórter, e quase saturação da ligação do analito pela molécula repórter, respectivamente. As imagens são gravadas com o uso do dispositivo de gravação, e uma comparação é feita entre as imagens das condições livres de analito e saturadas com analito. As moléculas repórteres que não atendem os critérios de seletividade são marcadas como inativas.
[00212] No caso de inativação devido à agregação de nanopartícuia, a identificação de moléculas repórteres inativas será direta. A formação de agregados será evidente na inspeção visual das imagens do dispositivo de gravação, e não irá exigir o procedimento livre de analito e saturado com analito descrito acima.
[00213] O método de identificação mantém um registro para a localização de moléculas repórteres no dispositivo de medição. A localização das moléculas repórteres pode ser denominada coordenadas x/y, por exemplo, em relação a uma grade geométrica adequada no dispositivo de medição, ou em relação às coordenadas de pixel no dispositivo gravador. O registro de moléculas repórteres inativas pode ser mantido na memória de computador não volátil.
[00214] O método de identificação irá fornecer critérios para marcar moléculas repórteres como inativas. Os critérios são definidos para atingir um equilíbrio entre a eliminação de moléculas repórteres que se comportam de modo insatisfatório do uso, mantendo, ao mesmo tempo uma contagem
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65/82 suficientemente alta de moléculas repórteres para os requisitos de precisão e sensibilidade particulares para o dispositivo de medição. A fim de eliminar o desvio, e permitir a marcação automatizada, um limiar numérico pode ser escolhido, com base no tipo de sinal óptico que é observado. Apenas a título de exemplo, uma determinada molécula repórter pode sofrer um desvio na emissão Àmax na ligação a uma molécula de analito, e Àmax se desvia em 20 nanômetros (nm) para a maior parte dos compostos nesse exemplo. Um limiar de um desvio de 5 nm pode ser escolhido para esse exemplo particular.
[00215] A fim de satisfazer os requisitos para precisão e sensibilidade, o limiar numérico pode ser escolhido a fim de excluir uma determinada fração de moléculas repórteres. Com referência ao exemplo anterior, um desvio Àmax de 12 nm pode ser observado para 95% das moléculas repórteres. Um limiar Àmax de 12 nm pode, então, ser escolhido a fim de reter 95% das moléculas repórteres como ativas, e descartar 5% das moléculas repórteres como inativas.
[00216] Uma variedade de critérios pode ser aplicada para atribuir uma situação inativa. De modo importante, qualquer critério pode ser escolhido para atribuir moléculas repórteres como inativas. Uma vez que a ligação de qualquer uma das moléculas repórteres é independente de todas as outras moléculas repórteres, a eliminação de uma molécula repórter do grupamento de moléculas repórteres ativas não afeta o comportamento das moléculas repórteres restantes.
[00217] Se indicado, o método de identificação descrito acima pode ser repetido periodicamente durante a vida útil de operação de um dispositivo de medição. Essa prática será particularmente benéfica para dispositivos repórteres
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66/82 cujo desempenho é suscetível à deterioração ao longo do tempo. De modo ideal, o método de identificação irá exigir uma quantidade mínima de intervenção de operador, com o dispositivo de medição realizando automaticamente todas as etapas necessárias. Para o caso de moléculas repórteres baseadas em nanopartícuia, as imagens podem ser gravadas periodicamente, e qualquer agregação que possa ocorrer ao longo do tempo pode ser identificada pelo software de correspondência de padrões.
[00218] O método de identificação também pode compreender as etapas de submeter o dispositivo de medição a uma ou mais soluções contendo concentrações intermediárias de analito. Isso será particularmente importante para medição quantitativa de analito, para a qual uma faixa de saturação de molécula repórter é prevista. Com o uso de diversas soluções, que abrangem uma faixa de concentrações de analito, uma curva de calibração pode ser construída para correlacionar melhor os dados de relatório com a concentração de analito.
[00219] Um benefício principal do uso de sinais espacialmente resolvidos a partir de um campo de moléculas repórteres consiste no fato de que regiões do dispositivo de gravação que são particularmente problemáticas podem ser sinalizadas desse modo, e descartadas em análises subsequentes. Isso inclui não apenas casos para moléculas repórteres inativas, isto é, anticorpos enovelados de modo inadequado, porém qualquer região que apresente dificuldades. Isso pode incluir pontos de sobreposição de duas ou mais moléculas repórteres ou moléculas repórteres cujos estados livres e ligados são insatisfatoriamente distinguíveis, por qualquer razão. A ligação de cada molécula repórter individual é independente de todas as outras, e o descarte de um pequeno
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67/82 conjunto de sinais ópticos pode aprimorar a exatidão ou precisão, enquanto causa impacto sobre a sensibilidade apenas marginalmente.
EXATIDÃO/PRECISÃO/SENSIBILIDADE [00220] Espera-se que a precisão para os métodos de medição digital revelados seja pelo menos tão boa quanto para os métodos analógicos convencionais. Os métodos de medição digital irão minimizar ou eliminar várias fontes de erro, que por definição são a fonte de baixa precisão. A titulo de exemplo, uma fonte de erro se origina das moléculas repórteres que são inativas: elas não se ligam à molécula de analito, ou se ligam à molécula de analito e não fornecem o sinal óptico esperado. Qualquer situação, se não levada em consideração, introduz um erro na estimativa da concentração do analito, uma vez que o sinal observado será menor que o esperado.
[00221] Espera-se que a precisão para os métodos de medição digital revelados seja pelo menos tão boa quanto para as medições analógicas convencionais. Os métodos convencionais, que observam um sinal em massa a partir da totalidade de moléculas repórteres, podem fornecer estimativas de precisão com o uso de vários métodos estatísticos e numéricos na maioria, mas não em todos os casos.
[00222] Considere o sistema tal como aquele mostrado na Figura 3, que contém uma coleção de moléculas repórteres que compreendem um cromóforo. O desvio espectral observado do sinal em massa será a média de todos os desvios (se houver), e pode ser bem pequeno, para concentrações de analito pequenas. Esse desvio pode ser difícil de distinguir, considerando especialmente o alargamento de curva devido aos diferentes microambientes que circundam cada cromóforo.
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68/82 [00223] Em contraste, com o uso do ensaio molecular digital, e observando desvios espectrais para cada molécula repórter, as moléculas repórteres livres irão exibir zero desvio, enguanto as moléculas repórteres ligadas irão exibir desvio total. Não há estado intermediário. Naturalmente, nem todos os cromóforos irão desviar pelo mesmo valor, mas o valor e a faixa esperados podem ser determinados antes do uso no campo. As moléculas repórteres com valores distantes podem ser descartadas como inativas.
[00224] Espera-se que a relação sinal-ruído para os métodos digitais revelados seja pelo menos tão boa quanto nos métodos convencionais. Para detecção em massa, concentrações menores de analitos irão levar a um sinal em massa mais fraco. Para detecção digital, concentrações menores de analitos irão levar a um número menor de sinais discretos, cada um dos quais tendo a mesma intensidade ou valor.
AJUSTE DE CURVA [00225] Os sinais individuais para moléculas repórteres discretas, mostrados como simulações na Figura 8, se prestam a técnicas de ajuste de curva que podem aprimorar a relação sinal-ruído. O sinal a partir de cada molécula repórter ativa irá se situar em uma das duas regiões do espectro, para as quais as curvas isentas de ruído idealizadas (correspondendo às curvas na Figura 8) podem ser construídas, com base no conhecimento anterior da molécula repórter. Uma vez que cada repórter pode ser apenas livre ou ligado, o sinal observado a partir de uma molécula repórter pode ser atribuído como livre ou ligado. Isso contrasta com muitas aplicações de ajuste de curva, para as quais a sobreposição dos sinais de dois ou mais estados, em razões variadas, precisa ser acomodada
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69/82 a fim de modelar o sinal observado.
[00226] Um exemplo de ajuste de curva é mostrado na Figura 13. A emissão de dois sinais, mostrada em cinza, é somada, com a adição simulada de ruído para formar um sinal observado bruto, mostrado em preto. Os sinais são similares àqueles apresentados na Figura 7, e a linha tracejada vertical na Figura 12 corresponde ao mesmo esboço de molécula repórter livre de analito e ligada a analito a 500 nm que foi discutido para a Figura 8. As técnicas de ajuste de curva podem, dado o sinal observado, estimar os sinais individuais que combinaram para fornecer o sinal total. Os sinais observados que compreendem um pequeno número de sinais individuais bem separados podem ser avaliados com o uso de ajuste de curva com alta exatidão e precisão de ajuste de curva. Além disso, devido à natureza digital da ligação, isto é, a molécula repórter é ligada ao analito ou é livre do analito, uma única molécula repórter pode fornecer apenas um dos dois sinais possíveis, que correspondem aos estados ligados a analito e livres de analito, sem estado intermediário possível. No exemplo mostrado na Figura 12, o sinal observado pode ser claramente atribuído a duas moléculas repórteres, um com emissão abaixo de 500 nm, e o outro com emissão acima de 500 nm, que corresponde a uma molécula repórter ligada a analito e livre de analito. A propriedade digital desse experimento irá simplificar substancialmente o processo de ajuste de curva.
[00227] Além disso, o uso de técnicas de ajuste de curva pode se provar vantajoso para manipular duas ou mais moléculas repórteres cujos sinais ópticos não podem ser resolvidos espacialmente. No caso de duas moléculas repórteres, cujos sinais não podem ser resolvidos entre si,
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70/82 quatro estados são possíveis: (a) ambos os receptores ligados; (b) ambos os receptores livres; e (c) & (d): um repórter livre (pode-se esperar que os últimos dois estados tenham sinais ópticos similares, mas não necessariamente idênticos) . Essa situação é necessariamente mais complexa que a única molécula repórter; entretanto, ainda é muito gerenciável, em comparação com o sinal óptico das amostras em massa.
[00228] Os métodos de ajuste de curva podem ser usados para manipular duas ou mais moléculas repórteres cujos sinais ópticos são espacialmente resolvidos, isto é, os sinais ópticos a partir das duas ou mais moléculas repórteres são espalhados de modo desigual através de vários pixels. Pode-se esperar que esse cenário seja mais comum que a sobreposição espacial exata de duas ou mais moléculas repórteres, especialmente para dispositivos de gravação com pixels finamente espaçados. Esse cenário pode se beneficiar do ajuste de curva não de um único espectro a partir de um único pixel (ou um espectro somado a partir de uma coleção de pixels estritamente espaçados), mas, em vez disso, uma coleção de espectros individuais a partir de uma coleção de pixels estritamente espaçados, combinada com perfis para os pontos (parcialmente sobrepostos).
ISOTERMA DE LIGAÇÃO [00229] A relação entre a contagem de moléculas repórteres ligadas e a concentração de analito, conhecida como isoterma de ligação, é complexa e indireta. Em resumo, a razão entre moléculas repórteres ligadas/totais aumenta assintoticamente para 1 à medida que a concentração de analito livre aumenta. (Geralmente, o analito está presente em excesso, em comparação com uma concentração muito menos de molécula
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71/82 repórter, então a concentração de analito livre e a concentração de analito total são aproximadamente iguais. Essa aproximação será usada ao longo de toda essa discussão.) Uma molécula repórter de afinidade mais alta pode se ligar a uma proporção mais alta de molécula de analito em qualquer determinada concentração de analito. De modo importante, a concentração de molécula repórter total se refere apenas à molécula repórter ativa.
[00230] As curvas de isoterma de ligação são mostradas na Figura 14. O eixo geométrico horizontal corresponde à concentração de analito, e o eixo geométrico vertical corresponde à razão entre molécula repórter ligada/total. As linhas curvas representam os dois isotermas de ligação, que determinam a razão entre molécula repórter ligada/total em uma determinada concentração de analito. Para cada curva, a razão entre receptor ligado/total se aproxima assintoticamente de 1 à medida que a concentração de analito aumenta, e à medida que a molécula repórter se aproxima de saturação, isto é, quase todas as moléculas repórteres se ligam a uma molécula de analito. A curva escura superior corresponde a uma molécula repórter de afinidade mais alta, e a curva mais baixa corresponde a uma molécula repórter de afinidade mais baixa. Será evidente que a afinidade de molécula repórter para o analito irá desempenhar um papel importante na facilidade de quantificação de analitos em diferentes faixas de concentração de analito.
[00231] Na Figura 14, o eixo geométrico vertical (razão entre molécula repórter ligada/total) é a variável dependente, e a concentração de analito é a variável independente, uma vez que a razão entre ligada/total depende
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72/82 da concentração de analito. Para propósitos analíticos, ο gráfico é usado ao contrário; ou seja, a razão entre ligada/total é obtida a partir do experimento, e se situa no eixo geométrico vertical. A partir do gráfico e da curva de isoterma de ligação, a concentração de analito livre correspondente é encontrada no eixo geométrico horizontal. Visualmente, esse processo pode ser entendido desenhando-se uma linha horizontal a partir da razão entre ligada/total observada no eixo geométrico y até a curva de isoterma, e soltando uma linha vertical no eixo geométrico x, a fim de encontrar a concentração de analito. (Na prática, esse processo é realizado matemática ou numericamente; entretanto, a análise de erro se mantém.) [00232] A Figura 15 corresponde a uma amostra com uma concentração de analito livre de aproximadamente 0,10, que corresponde a uma razão entre ligada/total de aproximadamente 0,72. Essa condição é indicada no isoterma de ligação como um círculo sólido. Uma determinação correta de 0,72 para razão entre ligada/total, no eixo geométrico vertical, é traçada horizontalmente ao isoterma de ligação, e até o eixo geométrico horizontal. Esse processo é indicado por duas setas pretas. O resultado de subestimação da razão entre ligada/total em cerca de 5% é mostrado com duas setas cinzas, com um círculo cinza correspondente no isoterma de ligação.
[00233] A Figura 16 corresponde a uma amostra com concentração de analito livre mais alta de aproximadamente 0,40, que corresponde a uma razão entre ligada/total de aproximadamente 0,92, e novamente marcada com um círculo sólido no isoterma de ligação. Uma determinação correta é indicada com duas setas pretas, tal como o exemplo anterior. A
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73/82 subestimação da razão entre ligada/total em 5% é novamente mostrada com as setas cinzas e o círculo cinza. Nesse exemplo, uma subestimação de 5% na razão entre ligada/total leva a um erro substancial de cerca de 40% na concentração de analito. A diferença no comportamento entre a Figura 15 e a Figura 16 ocorre devido à inclinação diferente do gráfico de isoterma de ligação nos dois pontos mostrados nesses dois gráficos, e essa propagação de erro será mais séria em concentrações de analito mais altas, em que a curva de isoterma de ligação é mais plana.
[00234] Dispositivos analíticos que utilizam ligação molecular para quantificação de analitos são suscetíveis a outra fonte de erro: em muitos casos, nem todas as moléculas repórteres estão ativas para ligação de analito. Isso causa erro na estimativa da razão entre ligada/total que, conforme descrito acima, pode se propagar em erro substancial na concentração de analito estimada.
[00235] A título de exemplo, considera-se um dispositivo de medição em que 10% das moléculas repórteres estão ativas. A saturação de moléculas repórteres irá produzir apenas 90% do sinal máximo esperado, uma vez que 10% das moléculas repórteres falha para fornecer um sinal óptico (devido à falha para se ligar ao analito, ou falha do complexo receptor/analito para produzir um sinal óptico) . A inspeção das Figuras 15 e 16 irá revelar o erro substancial que será introduzido nas medições, particularmente em concentração de analito mais altas. Até certo ponto, esse erro pode ser solucionado por dispositivos de medição pré-triagem sob condições de saturação para estimar o sinal máximo, para ser usado como um teste de desempenho para medições futuras. Entretanto, esse procedimento não é ideal, uma vez gue a
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74/82 saturação total nunca pode ser realizada.
[00236] As curvas de isoterma de ligação são mostradas na Figura 14. A curva escura superior corresponde a uma molécula repórter de afinidade mais alta. A vantagem de usar essa molécula repórter consiste no fato de que a saturação quase completa pode ser obtida a uma concentração relativamente baixa: a 0,40 nM, a molécula repórter é 90% saturada. A desvantagem é que essa molécula repórter é útil para quantificar concentrações menores de cerca de 0,10 nM, uma vez que a região rasa da curva de isoterma de ligação é submetida a erro significativo, conforme discutido acima.
[00237] Em contraste, a curva clara inferior, que corresponde a uma molécula repórter de afinidade mais baixa, é útil para quantificar uma faixa maior de concentrações de amostra, uma vez que a curva é relativamente íngreme para toda a faixa. Entretanto, a molécula repórter atinge no máximo 70% de saturação nessa faixa, e a determinação do sinal que corresponde a 100% de saturação será difícil de atingir.
[00238] Os métodos de ensaio molecular digital revelados no presente documento podem incluir a etapa de diluição da amostra, que irá aprimorar a precisão de concentração de analito estimada reduzindo-se a suscetibilidade da medição a erros na concentração de molécula repórter ligada/total. A título de exemplo, considera-se a amostra discutida acima, cujo comportamento de ligação é mostrado na Figura 15. Devido ao alto grau de saturação de molécula repórter, a curva de isoterma de ligação é muito rasa na região ao redor da concentração de analito de 0,40, e a determinação de concentração de analito é, portanto muito suscetível até mesmo a pequenos erros na concentração de
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75/82 molécula repórter ligada/total. Essa razão se torna mais precisa por medições digitais, conforme discutido acima; entretanto, pode ser preferencial, desde o inicio, gue a determinação da concentração do analito não fosse tão suscetível a erros na concentração de molécula repórter ligada/total.
[00239] Considera-se o efeito de uma diluição de quatro vezes dessa amostra, isto é, a adição de volume de soluto suficiente para que a concentração de analito caia de 0,40 para 0,10. Como resultado dessa diluição, o comportamento de ligação pode ser agora representado pela Figura 14. Devido à curva de isoterma de ligação mais íngreme na região ao redor da nova concentração de analito de 0,10, a determinação de concentração de analito é muito menos suscetível a erros na concentração repórter ligada/total.
[00240] As propriedades de sensibilidade de medições digitais tornam a etapa de diluição da amostra um procedimento atraente para aprimorar a precisão. Será prontamente evidente que a precisão de uma medição analógica em massa de concentração de molécula repórter ligada sofrerá mediante a diluição da amostra. Passando da Figura 14 para a Figura 13, concentração de molécula repórter ligada cai de 0,92 a 0,72, representando uma queda de 22% na concentração ligada. Um sinal analógico em massa que é proporcional à concentração de molécula repórter ligada podería cair em magnitude em 22%. Essa queda de magnitude quase certamente seria acompanhada por um aumento no sinal-ruido, uma vez que a magnitude de ruído podería permanecer constante. Portanto, o aumento na precisão devido ao efeito de isoterma de ligação descrito acima será neutralizado por uma redução na precisão
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76/82 devido ao sinal-ruído piorado na determinação de concentração repórter ligada.
[00241] Em contraste, medições digitais são muito menos sensíveis a essa deterioração de sinal-ruído com diluição. Conforme discutido acima, uma contagem reduzida de moléculas repórteres ligadas afeta medições digitais de modo diferente de medições analógicas. Em vez de enfraquecer o sinal em massa das medições analógicas e, desse modo, piorar o sinalruído, uma contagem reduzida moléculas repórteres ligadas irá reduzir a contagem de sinais ópticos discretos que são recebidos pelo dispositivo repórter. De modo importante, a intensidade de cada um desses sinais ópticos discretos irá permanecer inalterada.
[00242] Por essa razão, os métodos de diluição para aprimorar a precisão, conforme descrito acima, não são acompanhados por uma redução na precisão devido aos efeitos de sinal-ruído analógicos e, portanto, irão se provar benéficos para as medições digitais. Os métodos de medição podem incluir uma etapa de pré-diluição de uma amostra antes da introdução no dispositivo de medição. Alternativamente, os métodos de medição podem, após relatar uma concentração de analito, indicar para o usuário que uma medição repetida da amostra podería aprimorar a precisão, e pode informar adicionalmente o usuário sobre um nível de diluição recomendado.
[00243] Os métodos de medição podem incluir uma pré-triagem rápida de uma amostra que é otimizada para fornecer rapidamente uma estimativa de baixa precisão de concentração de analito, a fim de sugerir uma diluição ideal.
[00244] Em muitos usos previstos para os métodos revelados, foram estabelecidos limiares ou cortes que
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77/82 correspondem a valores críticos. Esses limiares ou cortes podem corresponder aos níveis regulatórios definidos pelas leis ambientais ou aos níveis de biomarcadores críticos que correspondem a determinadas condições de saúde. Os métodos de medição podem ajustar os parâmetros de varredura e o nível de diluição recomendados para fornecer condições de medição que sejam adequadas ao uso pretendido.
[00245] Em certas modalidades, o dispositivo de medição pode fornecer um mecanismo para a diluição automática de uma amostra. Isso pode ser realizado ejetando-se uma fração de uma amostra existente, seguido pela introdução de soluto para diluição. Isso também pode ser realizado introduzindo-se uma nova amostra que foi pré-diluída com soluto.
[00246] Em determinadas modalidades, o nível de diluição recomendado pode ser calculado por um dispositivo de computação, incorporado no dispositivo de medição ou conectado ao dispositivo de medição. O dispositivo de computação pode fornecer o nível de diluição recomendado ao operador por meio de uma interface (como exibição, impressão ou relatório de voz sintetizado). O dispositivo de computação também pode controlar diretamente o dispositivo de medição para realizar quaisquer etapas necessárias para analisar automaticamente uma amostra diluída, sem a necessidade de intervenção do usuário.
[00247] Em determinadas modalidades, os limiares ou cortes podem ser predefinidos no dispositivo de computação, na forma de firmware, que pode ser opcionalmente atualizado no caso de um limiar ou corte mudar, ou na forma de software. Além disso, o software operacional pode solicitar ao usuário mais entrada sobre a amostra que está sendo medida. Por exemplo, no caso da medição de biomarcadores, o usuário pode
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78/82 inserir parâmetros de histórico para um indivíduo, tais como idade, peso, gênero e similares, que podem alertar um limiar ou corte e que podem, portanto, influenciar a precisão que é necessária para uma determinada medição.
EXEMPLOS [00248] A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos.
EXEMPLO 1: IMUNOENSAIO DO TIPO SANDUÍCHE PLASMÔNICO [00249] Em uma implementação, o ensaio molecular digital em um formato de imunoensaio de anticorpo duplo é descrito dual é descrito aqui. Imunoensaios de anticorpo duplos são amplamente usados em ensaios clínicos clássicos, e pares de anticorpo padrão para essa aplicação podem ser prontamente obtidos. Para detecção, o acoplamento de plásmon entre nanopartícuias de metal, que irão se tornar ligadas através do analito no imunoensaio do tipo sanduíche, fornece uma leitura robusta de ligação da molécula de analito às partículas. O acoplamento de plásmon oferece uma grande resistência pelo fato de que o comprimento de onda de espalhamento das partículas pode diferir substancialmente dos comprimentos de onda de espalhamento de partículas individuais, levando a alterações de cores distintas facilmente distinguidas no nível de partícula única por cor — mesmo em uma câmera de telefone celular.
[00250] Nesse exemplo, nanopartícuias de ouro esféricas (por exemplo entre 10 nm e 100 nm de diâmetro) podem funcionar bem. Para os presentes propósitos, a detecção isenta de marcador é desnecessária e a detecção é obtida pela nanopartícuia de metal secundária como um intensificador de sinal. Isso envolve a ligação de outra nanopartícuia (ouro)
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79/82 através de um segundo anticorpo que resulta em um acoplamento plasmônico entre as duas nanoparticulas que levando a marcações para desvios espectrais. Essa estratégia foi utilizada na detecção de alterações conformacionais nas proteínas e moléculas de DNA e irá permitir a detecção fácil de ligação de analito único em imagens adquiridas com o uso de câmeras simples, tais como aquelas disponíveis nos telefones celulares. A alteração de cor aprimorada devido à segunda nanopartícuia depende do tamanho da segunda nanopartícuia, assim como a distância eficaz entre as nanoparticulas. A separação interpartícuias (anticorpo I-analito-anticorpo II) esperada no ensaio será de 20 a 30 nm e se situa dentro dos limites do acoplamento plasmônico eficaz. Embora se use tipicamente nanoparticulas de ouro de 40 nm, a dependência do decaimento exponencial no acoplamento plasmônico com distância interpartícuias no tamanho da segunda nanopartícuia (isto é, nanoparticulas menores mostram a redução rápida no acoplamento plasmônico em comparação com as maiores) permite adicionalmente o ajuste fino do desvio espectral com o uso de nanoparticulas de ouro grandes.
[00251] O imageamento de campo escuro é um modo adequado para monitorar a luz de dispersão de pares de partículas individuais no ensaio. A microscopia de campo escuro é uma técnica óptica em que a amostra não é diretamente iluminada. Em vez disso, a luz dispersa é usada para a visualização de objetos que resulta em uma intensidade de plano de fundo quase preta, levando a um contraste bastante aprimorado entre os objetos e o plano de fundo. De fato, os materiais nanoplasmônicos produzem um grande número de fótons sem intermitência ou fotobranqueamento, fenômenos que
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80/82 prejudicam a detecção baseada em fluorescência que é comumente usada em ensaios de biodetecção convencionais permitindo, desse modo, a observação de partículas individuais com uma convencional óptica simples.
[00252] A chave para o ensaio molecular digital é a avaliação individual de cada partícula no campo de visão. Isso pode ser realizado de várias maneiras, mas uma maneira envolve a comparação de imagens antes e depois, na qual a partícula de captura é primeiramente arranjada (aleatoriamente ou em padrões) em um substrato. As partículas arranjadas são imageadas antes da introdução da amostra, fornecendo as informações 'antes' . A amostra é a seguir fluída para a câmara juntamente com o anticorpo marcado secundário. Em uma captura de analito bem-sucedida, uma partícula de marcador secundária será associada à partícula de captura que leva a uma alteração definida na luminosidade e cor. Cada partícula na imagem antes será caracterizada para determinar que tem a luminosidade e cor esperadas das únicas partículas de captura. Quaisquer partículas agregadas ou, de outro modo, alteradas serão ignoradas nas análises subsequentes. Após a captura de analito, todas as imagens de objetos nos locais de boas partículas de captura são analisadas. Um critério estatístico para a interpretação da imagem é utilizado para distinguir as capturas com falha (por exemplo, partículas agregadas ou não especificamente ligadas) dentre capturas de analito limpas. A análise de fundo e a correção de erros são aprimoradas incluindo-se partículas não funcionalizadas como marcadores fiduciais. Esses podem ser usados para detectar infiltração bem-sucedida de solvente, exposição ao ar ou qualquer um dentre uma variedade de outros modos de falha que podem tornar porções
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81/82 do campo de partícula inutilizáveis. Em ensaios em massa, esses tipos de erros simplesmente degradam o sinal. Mas no formato de ensaio molecular digital, tais erros podem ser removidos antes do tempo. De fato, em muitos experimentos de imageamento de fluorescência de molécula única, é comum que grandes regiões do campo de visão sejam inutilizáveis por várias razões, porém com muitas moléculas boas, os experimentos ainda podem ser executados com de maneira bem-sucedida.
EXEMPLO 2: ENSAIO DE HIBRIDIZAÇÃO PLASMÔNICO [00253] Em uma modificação do exemplo acima, a hibridação de sondas de ácido nucleico ligadas à superfície é combinada com acoplamento plasmônico entre nanopartícuias para fornecer um ensaio molecular digital para analitos de ácido nucleico. Uma superfície é modificada com um primeiro oligonucleotídeo ao qual foi ligada uma primeira nanopartícuia. A modificação da superfície pode ser realizada por adsorção não covalente ou por ligação covalente. A sequência do primeiro oligonucleotídeo é escolhida para hibridizar com uma primeira sequência complementar que está contida no ácido nucleico de analito desejado. A exposição da superfície modificada, então induz a hibridização do analito com a primeira sequência de oligonucleotídeos curta. Nesse ponto, é introduzido um segundo oligonucleotídeo, ao qual é adicionada uma segunda nanopartícuia. A sequência do segundo oligonucleotídeo é escolhida para hibridizar com uma segunda sequência complementar que está contida no ácido nucleico de analito desejado, com a primeira e a segunda sequências complementares suficientemente separadas uma da outra para permitir a hibridização simultânea da primeira e da segunda sequências de oligonucleotídeos.
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82/82 [00254] O conjunto supramolecular causado pela hibridização do ácido nucleico de analito com a primeira e a segunda seguências de oligonucleotídeos pode ser projetado para aproximar a primeira e a segunda nanopartícuias, como para o imunoensaio tipo sanduíche descrito acima. Embora não seja estritamente necessário para o projeto bem-sucedido desse sistema, a adoção de estruturas helicoidais canônicas pelo nucleotídeo de analito hibridizado irá simplificar a geometria molecular e irá facilitar a escolha de tais parâmetros como comprimento de sequência e a natureza e a colocação de fixação às nanopartícuias.
[00255] Todas as referências, patentes ou pedidos U.S ou estrangeiros, citados no pedido são incorporados a título de referência como se escritos no presente documento em sua totalidade. Quando surgirem quaisquer inconsistências, o material literalmente revelado no presente documento irá controlar.
[00256] A partir da descrição anteriormente mencionada, uma pessoa versada na técnica pode verificar facilmente as características essenciais desta invenção, e sem que se afaste do espírito e escopo da mesma, pode efetuar várias alterações e modificações da invenção para adaptar a mesma a vários usos e condições.
Claims (57)
- REIVINDICAÇÕES1. MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA OU CONCENTRAÇÃO DE PELO MENOS UM ANALITO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender:em uma imagem de uma pluralidade de sinais emitidos por pelo menos um tipo de moléculas repórteres ópticas incubadas com pelo menos um tipo de moléculas de analito, para cada tipo de moléculas repórteres ópticas, determinar o número de moléculas repórteres ópticas discretas ligadas às moléculas de analito (moléculas repórteres ópticas ligadas) e o número de moléculas repórteres ópticas discretas não ligadas ao analito (moléculas repórteres ópticas não ligadas) na imagem resolvendo-se individualmente moléculas repórteres ópticas ligadas e não ligadas; e, determinar a presença ou concentração de analito a partir do número de moléculas repórteres ópticas ligadas como uma fração de, ou como proporcional a uma fração do, número total de moléculas repórteres ópticas.
- 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas moléculas repórteres ópticas serem arranjadas em uma superfície repórter.
- 3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelas moléculas repórteres ópticas serem arranjadas aleatoriamente.
- 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelas moléculas repórteres ópticas serem arranjadas em um padrão.
- 5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela fração de moléculas repórteres ópticas ligadas ser determinada a partir do número de moléculasPetição 870190090213, de 11/09/2019, pág. 6/442/11 repórteres ópticas não ligadas gravado antes da introdução da amostra.
- 6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela concentração do pelo menos um analito ser determinada.
- 7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela amostra ser uma amostra biológica ou química.
- 8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo analito ser escolhido dentre:• uma sequência de nucleotideos; e • um antigeno.
- 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela molécula repórter óptica compreender um elemento de captura escolhido dentre:• uma ou mais sequências de nucleotideos que se ligam ao analito; e • um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga ao analito.
- 10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por cada molécula repórter óptica compreender uma nanopartícuia plasmônica.
- 11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela molécula repórter óptica compreender uma ou mais sequências de nucleotideos funcionalizadas em uma ou mais nanopartícuias plasmônicas.
- 12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela molécula repórter óptica compreender um ou mais anticorpos funcionalizados em uma ou mais nanopartículas plasmônicas.Petição 870190090213, de 11/09/2019, pág. 7/443/11
- 13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, caracterizado pelo sinal da molécula repórter óptica ser escolhido dentre:• comprimento de onda de luz;• intensidade de sinal;• luminosidade;• o formato de um sinal ou espectro; e • a presença ou ausência de bandas espectrais.
- 14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por um sinal ser produzido mediante ligação do analito à molécula repórter óptica.
- 15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por um sinal ser produzido mediante ligação do analito à molécula repórter óptica e ligação de uma segunda molécula repórter ao analito.
- 16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelos sinais produzidos pela molécula repórter óptica ligada e pela molécula repórter óptica não ligada serem diferentes.
- 17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelas moléculas repórteres ópticas ligadas e não ligadas serem individualmente resolvidas por:• um desvio no centro de um espectro acima ou abaixo de um comprimento de onda especificado;• uma alteração no tamanho ou intensidade do sinal;• um aumento ou diminuição na luminosidade;• uma alteração no formato do sinal;• a presença ou ausência de bandas espectrais; e • uma alteração no formato de um espectro.
- 18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17,Petição 870190090213, de 11/09/2019, pág. 8/444/11 caracterizado pelo sinal emitido pela molécula repórter óptica ser o comprimento de onda de luz.
- 19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelas moléculas repórteres ópticas ligadas e não ligadas serem individualmente resolvidas por um desvio no centro de um espectro acima ou abaixo de um comprimento de onda especificado.
- 20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por pelo menos algumas das moléculas repórteres ópticas serem afixadas a uma superfície (a superfície repórter) de modo que cada molécula repórter óptica afixada seja espacialmente resolvível.
- 21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelas moléculas repórteres ópticas afixadas serem arranjadas em uma rede ou uma aproximação da mesma.
- 22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por cada molécula repórter óptica afixada ser resolvível como um pixel de um dispositivo de gravação.
- 23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelas moléculas repórteres ópticas ativas e moléculas repórteres ópticas inativas emitirem diferentes sinais ópticos.
- 24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, em que o método é caracterizado por determinar o número de moléculas repórteres ópticas ativas discretas ligadas às moléculas de analito (moléculas repórteres ópticas ativas ligadas) e o número de moléculas repórteres ópticas discretas não ligadas ao analito (moléculas repórteres ópticas ativas não ligadas) na imagem.
- 25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23,Petição 870190090213, de 11/09/2019, pág. 9/445/11 caracterizado pela iluminação não uniforme da amostra não afetar a determinação da presença ou concentração de analito.
26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela imagem ser gravada em um comprimento de onda de iluminação conhecido. 27 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelos resultados em qualquer ponto na imagem serem normalizados na iluminação conhecida. - 28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pela intensidade medida em um comprimento de onda de emissão ser normalizada pela intensidade de iluminação em um comprimento de onda de excitação no mesmo local em uma imagem.
- 29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelos defeitos em uma ou mais seções do sensor, que gravaram a imagem, não afetarem a determinação da presença
ou concentração 30 . de analito. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por um tipo de molécula repórter óptica ser usado. 31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por um tipo de molécula repórter óptica ser usado. 32 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, em que o método é caracterizado por empregar um ensaio do tipo sanduíche. 33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por um primeiro tipo de moléculas repórteres ópticas ser afixado a uma superfície (a superfície repórter) de modo que cada molécula repórter óptica afixada sejaPetição 870190090213, de 11/09/2019, pág. 10/446/11 espacialmente resolvível. - 34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo primeiro tipo de moléculas repórteres ópticas compreender um elemento de captura para um analito funcionalizado em uma nanopartícula plasmônica.
- 35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por um segundo tipo de moléculas repórteres ópticas ser adicionado com ou após a amostra.
- 36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo segundo tipo de moléculas repórteres ópticas compreender um elemento de captura para o analito funcionalizado em uma nanopartícula plasmônica.
37 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35 caracterizado pelo analito ser um antígeno. 38 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36 caracterizado por cada molécula repórter óptica compreender como o elemento de captura um anticorpo ou um fragmento do mesmo. - 39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo analito ser uma sequência de nucleotídeos.
- 40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por cada molécula repórter óptica compreender como o elemento de captura uma ou mais sequências de nucleotídeos complementares à sequência de nucleotídeos de analito.
- 41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que o método é caracterizado por ser realizado em um sistema de ensaio molecular digital que compreende um dispositivo móvel.
- 42. MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA OUPetição 870190090213, de 11/09/2019, pág. 11/447/11CONCENTRAÇÃO DE ANTÍGENO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender:em uma imagem de uma pluralidade de sinais emitidos por pelo menos um tipo de moléculas repórteres ópticas que compreendem anticorpos incubados com antígeno, determinar o número de anticorpos ativos discretos ligados ao antígeno (anticorpos ativos ligados) e o número de anticorpos ativos discretos não ligados ao antígeno (anticorpos ativos não ligados) na imagem resolvendo-se individualmente moléculas repórteres ópticas ligadas e não ligadas; e, determinar a presença ou concentração de antígeno a partir do número de anticorpos ativos ligados como uma fração de, ou como proporcionais a uma fração do, número total de anticorpos ativos.
- 43. MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA OU CONCENTRAÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTIDEOS ALVO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender:em uma imagem de uma pluralidade de sinais emitidos pora) uma molécula repórter óptica que compreende uma primeira sequência de nucleotideos de captura complementar a uma primeira parte da sequência de nucleotideos alvo eb) a primeira molécula repórter óptica que compreende a primeira sequência de nucleotideos de captura complementar à parte da sequência de nucleotideos alvo e uma segunda molécula repórter óptica que compreende uma segunda sequência de nucleotideos de captura complementar a uma segunda parte da sequência de nucleotideos alvo ligada à sequência de nucleotideos alvo (complexos ligados), determinar o número de sequências de nucleotideosPetição 870190090213, de 11/09/2019, pág. 12/448/11 alvo discretas ligadas às moléculas repórteres ópticas que compreendem a primeira e a segunda partes da sequência de nucleotídeos complementar (complexos ligados);determinar a presença ou concentração da sequência de nucleotídeos alvo como uma fração de, ou como proporcional ao, número de complexos ligados como uma fração do número total de moléculas repórteres ópticas que emitem sinais detectáveis.
- 44. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL PARA DETERMINAR UMA CONCENTRAÇÃO DE ANALITO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender:• um sensor de imagem;• uma tela que tem capacidade para exibir uma imagem;• um microprocessador;• memória;• software de análise de imagem armazenado na memória e executável pelo processador que tem capacidade para analisar os dados capturados pelo sensor de imagem e classificar digitalmente os dados; e • opcionalmente, uma interface de comunicação.
- 45. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo sensor de imagem ter capacidade para operar como parte de um microscópio de campo escuro.
- 46. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo sensor de imagem ser uma câmera de megapixel.
- 47. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo sensor de imagem ser câmera de semicondutor de óxido de metal (CMOS) complementar.
- 48. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com aPetição 870190090213, de 11/09/2019, pág. 13/449/11 reivindicação 46, caracterizado por compreender adicionalmente uma fonte de luz ou outra radiação eletromagnética.
- 49. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pela fonte de luz compreender um diodo emissor de luz (um LED).
- 50. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por compreender adicionalmente uma câmara de amostra que é opcionalmente removível.
- 51. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por compreender adicionalmente • uma superfície repórter produzida a partir de vidro ou polímero, em um lado da mesma, moléculas repórteres ópticas que compreendem nanopartículas plasmônicas funcionalizadas com elementos de captura foram afixadas; e • um guia de onda que é adequado para microscopia de campo escuro em contato com o lado oposto da superfície repórter.
- 52. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por cada molécula repórter óptica afixada ser espacialmente resolvível.
- 53. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelas moléculas repórteres ópticas afixadas serem arranjadas aleatoriamente.
- 54. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelas moléculas repórteres ópticas afixadas serem arranjadas em uma rede ou uma aproximação da mesma.
- 55. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por cada molécula repórter óptica afixada ser resolvível como um pixel de um dispositivoPetição 870190090213, de 11/09/2019, pág. 14/4410/11 de gravação.
- 56. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 55, caracterizado pelo elemento de captura ser escolhido dentre:• uma ou mais sequências de nucleotídeos que se ligam ao analito; e • um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga ao analito.
- 57. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo analito ser um antígeno.
- 58. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado por cada molécula repórter óptica compreender como o elemento de captura um anticorpo ou um fragmento do mesmo.
- 59. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo analito ser uma sequência de nucleotídeos.
- 60. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por cada molécula repórter óptica compreender como o elemento de captura uma ou mais sequências de nucleotídeos complementares à sequência de nucleotídeos de analito.
- 61. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo microprocessador, memória, sensor de imagem, software, tela que tem capacidade para exibir uma imagem e interface de comunicação estarem todos compreendidos em um único dispositivo portátil.
- 62. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pela capacidade de comunicação ser sem fio.Petição 870190090213, de 11/09/2019, pág. 15/4411/11
- 63. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo único dispositivo portátil ser escolhido dentre um telefone inteligente e um computador do tipo tablet.
- 64. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo único dispositivo portátil ser um telefone inteligente.
- 65. SISTEMA DE ENSAIO DIGITAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 55, caracterizado por compreender adicionalmente um invólucro para posicionar o telefone inteligente, a câmara de amostra e a fonte de luz em proximidade estreita e estável entre si.
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