CN110462057A - 数字分子测定 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于通过对结合事件的测定、通过对单独地分辨的分析物/报告物结合事件的直接数字测量来快速且准确测量分析物的系统、设备和方法。本文披露的数字分子测定系统、设备和方法能够使用检测和报告单一分析物分子的结合的光学报告分子实现逐个颗粒地读出，并且以二进制格式报告每种这样的结合。此类数字分子测定系统、设备和方法可用于多种应用中，如可用于在实地使用的移动电子设备上。

Description

数字分子测定
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年3月12日提交的美国临时申请号62/470,303的优先权权益，其披露内容通过援引特此并入，如同本文以其全文书写一样。
可在实地执行的定点照护诊断和其他测定是迫切需要的。如果可以消除与派送测定，如诊断测试、特别是血液测试到专用实验室以进行分析相关的延迟和费用，则可以更高效且有效地做出响应。临床实验室通过在精密台式仪器上执行生化测定来提供诊断测试。用于使这些仪器小型化或在移动电子设备上复现其功能的工作是充满困难的。在许多情况下，结果是无法使用的。
例如，需要的是为医生及其患者提供迅速且准确的结果的价廉、但准确的定点照护测定如诊断测试。
本文提供了用于通过对结合事件的测定、通过对单独地分辨的分析物/报告物结合事件的直接数字测量来快速且准确测量分析物的系统、设备和方法。本文披露的数字分子测定系统、设备和方法能够使用检测和报告单一分析物分子的结合的光学报告分子实现逐个颗粒地读出，并且以二进制格式报告每种这样的结合。此类数字分子测定系统、设备和方法可用于多种应用中，如可用于在实地使用的移动电子设备上。
附图说明
图1是模拟测定的概念性展示。
图2是模拟测定程序的概念图。
图3是对模拟测定结果的仿真。
图4是数字分子测定系统的一部分的概念图。
图5是替代性数字分子测定系统的一部分的概念图。
图6是数字分子测定图像数据的概念图。
图7是数字分子测定数据的图像。
图8是对数字分子测定结果的仿真。
图9示出了具有夹式测定芯片读取器的移动电子设备。
图10展示了可以嵌入在数字分子测定中的代码。
图11示出了报告体积厚度对报告分子的影响。在此图中，1表示报告体积；2表示记录设备的表面，3表示报告分子，并且4表示从报告分子到记录设备的光学路径。
图12示出了薄的报告体积及其特性。在此图中，1表示报告体积；2表示记录设备的表面，3表示报告分子，4表示从报告分子到记录设备的光学路径，并且5表示附接至、或含有报告分子4的较大颗粒。
图13示出了曲线拟合法在光学光谱上的应用。水平轴是指波长(nm)，并且垂直轴是指光学信号的强度。
图14示出了针对强结合的报告分子(上部曲线)和弱结合的报告分子(下部曲线)的结合等温线图。
图15示出了在低报告分子饱和度下确定分析物浓度时的误差效应。水平轴是分析物浓度，并且垂直轴是结合的/总的报告分子浓度的比率。用1指示的深色的水平箭头和垂直箭头表示对报告分子浓度和分析物浓度的“正确”确定。用2指示的浅色的水平箭头和垂直箭头表示对报告分子浓度和分析物浓度的“不正确”确定。
图16示出了在高报告分子饱和度下确定分析物浓度时的误差效应。水平轴是分析物浓度，并且垂直轴是结合的/总的报告分子浓度的比率。用1指示的深色的水平箭头和垂直箭头表示对报告分子浓度和分析物浓度的“正确”确定。用2指示的浅色的水平箭头和垂直箭头表示对报告分子浓度和分析物浓度的“不正确”确定。
具体实施方式
尽管对在移动电子设备上执行生物化学测定有很大的需求，但是在过去，简单地使常规测定小型化并且在专业的临床实验室的受控环境之外执行它们的尝试并没有成功。常规的生物化学测定不能可靠地小型化，这是因为它们本质上是模拟测量。
数字测定以至少三种方式消除了模拟测定的固有不确定性：(1)数字测定是基于对模拟噪声具有高度抵抗性的二进制事件；(2)数字测定消除了源自模拟测定中未知分数的无活性测定分子的误差；(3)数字测定消除了与空间不均匀性如非均匀照明相关的问题。
例如，考虑抗原-抗体测定，该测定被设计用于测量与已知浓度的抗体混合的样品中的抗原浓度。该测定具有光学读出，其中结合抗原的抗体发出与未结合抗原的抗体不同的光学信号。(例如，未结合的抗体可能不发出信号。)鉴于抗原-抗体结合的亲和力，可以使用整体光学读出信号来估计抗原浓度。
此程序可以在具有严格的质量控制的专业实验室环境中相当良好地工作。然而，不幸的是，当在实地环境中使用移动设备执行时，它会失败。常规的模拟生物化学测定是脆弱的，并且当在移动电话、平板电脑、和类似设备上执行时产生非常不准确的结果。
一个问题是，在没有严格的实验室方案下，所谓已知浓度的抗体的大部分可能是无活性的。在实地环境中，由于处理不当、污染、变性和其他问题，抗体的从10％至100％可能变为无活性的。更糟糕的是，无活性抗体的分数是未知的。它是不可观测的并且表示通过平均观测数据无法消除的系统误差。未结合的抗体的部分和无活性抗体的分数是混淆的；他们的信号难以区分。
数字测定通过计数分析物与报告分子(如抗原与抗体或互补核苷酸序列)之间的单独结合事件而不是将数百万个它们的结果平均来减少或消除该问题。移动设备非常适合于数字测定，因为它们包括能够对数百万个生化事件进行采样的高质量相机-多达每像素一个或每次曝光数千万个。移动设备还包括用于图像分析的强大处理能力以及用于报告结果和必要时卸载处理的通信能力。
数字测定选择图像中的特征并将其分类为有效或无效。无效特征包括图像中不符合对于例如位置、亮度、波长或形状的特定标准的任何特征。无活性抗体是无效特征的常见来源，但是不规则的样品照明、不精确的光学对准、样品不规则-移动环境中和控制不充分的其他情形中的所有常见问题-也是有贡献的。在数字测定中，无效特征是被数据分析丢弃的；只有有效特征有助于分析结果。将有效特征计数为结合或未结合的，并且这些是唯一的可能性。是或否；1或0。在数字测定中，如果463个有效特征被计数为结合的，并且886个特征被计数为未结合的，则结合的分数为463/(463+886)＝463/1349＝0.343。这种结果来自数字处理。当将它与已知的分析物结合亲和力组合时，它提供所希望的分析物浓度。归类为无效的事件的分数不产生结果上的差异。
有必要记住，测定本身就是数字的。这个概念与普遍的模拟结果数字化毫无关系。通过模拟测定产生的信号可以被数字化以用于分析或存储，但是数字化模拟信号不能去掉“内置(baked in)”于其中的系统误差。作为一个类比，用模拟设备制作的音乐录音保留了静态的砰砰声和嘶嘶声-与模拟录音过程中的音乐不可分割-即使录音是以数字方式存储的。
现转至附图，图1是模拟测定的概念性展示。比色皿含有样品。例如，样品可以是含有抗原和抗体的溶液。可以标记抗体，使得在结合抗原分子时，新形成的抗体-抗原复合物在通过光学激发进行询问时发射光学信号。光学信号可以是光谱测量；即光强度相对于波长。虽然比色皿可以容纳小体积样品，但仅几毫升是常见的大小、含有数十亿的抗体和抗原分子。观测光谱是由数十亿结合的标记抗体-抗原复合物发出的光谱的复合物。但是，未知分数的抗体不起作用；它们不能结合抗原，因为它们阻塞在聚集体中、变性或有其他问题。
图2是模拟测定程序的概念图。该测定以与一定抗体浓度混合的未知抗原浓度开始。活性抗体(准备好且能够结合抗原)与无活性抗体(不能或不可用于结合抗原)的比率是未知的。在专业的实验室环境中，在受控环境中遵循严格程序培训过的技术人员可以保持活性与无活性比率较高或至少一致。然而，在实地或定点照护环境中，活性与无活性抗体的比率低得多，并且更糟糕的是，完全不一致。
活性抗体以由以下确定的速率结合抗原：抗原-抗体亲和力、抗原浓度、以及活性抗体的未知浓度。
图3是对模拟测定结果的仿真。整体光谱(重色实曲线)表示在模拟测定中所观测到的(“光谱输出”)。多个轻色虚曲线表示来自单一抗原-抗体结合事件的光谱。然而，这些光谱在模拟测定中不可观测到。在图3的仿真中，未结合的活性抗体发出495nm波长周围的光，而结合的活性抗体发出505nm波长周围的光。未知数量的无活性抗体不发出光。这意指整体光谱不能提供足够的信息来测量作为所有活性抗体的分数的结合的抗体的数量。
该情况在实际实验中更糟糕，因为无活性抗体仍可能发出光，但此光不能提供关于抗原结合的信息。它仅贡献于系统误差。
图4是数字分子测定系统的一部分的概念图。图4中展示的数字分子测定绘示了一个实例，其中例如用智能手机相机执行的移动暗场显微镜法捕获了等离激元纳米颗粒夹心型免疫测定的图像。在此测定中，将全内反射(TIR)基底涂覆有用被设计用于结合感兴趣抗原的捕获抗体功能化的等离激元纳米颗粒。将用相同或不同抗体(即，被设计为结合抗原的等同部分、或不同部分)功能化的另外的等离激元纳米颗粒与样品中的感兴趣抗原一起引入。将激发光从边缘引入到基底中。结合的抗体发出不同于未结合和无活性的抗体的光学信号。抗体可能由于许多因素如变性或更常见地聚集而是无活性的。不同的信号在图像中可以呈现为不同的大小、亮度、光谱、形状等，并且考虑这些因素中的一个或多个而被分选为活性的或无效的。
图5也是数字分子测定系统的一部分的概念图；它是以上实例的替代方案，其中将TIR基底涂覆有用与感兴趣的分析物DNA/RNA的一部分互补的DNA或RNA的捕获核苷酸序列功能化的等离激元纳米颗粒。将用不同的cDNA/cRNA(即，被设计以结合分析物DNA/RNA的另一区段)功能化的另外的等离激元纳米颗粒与样品中的分析物DNA/RNA一起引入。结合的DNA/RNA序列发出不同于未结合和无活性的抗体的光学信号。
图6是数字分子测定图像数据的概念图；即被作为暗场显微镜操作的移动设备相机捕获的图像的一部分。图像包括由结合的抗原-抗体复合物产生的斑点、来自未结合的抗体的斑点、来自无活性或无效抗体的斑点以及可能是出于多种原因而有缺陷的图像区域的缺陷区。图像的照明可能是非均匀的，甚至远非均匀的。只要例如通过记录照明波长下的图像已知空间照明图案，可以将图像中任何点处的结果相对于已知照明标准化。
图7是通过作为显微镜操作的移动设备相机获得的数字分子测定数据的绘示。该图当以灰度图示出时、在本披露中与原始彩色图像相比时给人印象不太深刻，所以进行了人工增强以便以黑白形式呈递。在图像中的对应于活性抗体的斑点周围绘制了白圆圈。图像中的所有其他斑点是无效或无活性抗体。关于活性抗体，11个中有4个是结合的；这些用在白圆圈周围的灰圆圈举例绘示出。通过图像分析软件执行对活性相对于无效、和结合相对于未结合的鉴定。图像分析可以在移动设备上执行。可替代地，移动设备可以将图像发送至另一个处理器。例如，它可以将图像发送至计算机云中的虚拟服务器。
作为用于区分数字分子测定中的结合的抗体与未结合的抗体的图像处理的实例，图8是对数字测定结果的仿真。图8表示来自数字测定的图像中的六个斑点的光谱。结合相对于未结合的标准是来自斑点的光谱的波长是位于500nm之上还是之下。光谱未落在图中所示范围内的斑点为无效的。从上到下，光谱对应于来自未结合、未结合、结合、无活性(无效)、未结合和结合的抗体位点的斑点。有两个阳性结果、三个阴性和一个无效。因此结合的抗体的分数是2/5。如上所提及的，来自无活性抗体的光学信号使实际实验复杂化。因此，选择标准可能比在一定波长之上或之下的光谱中心更复杂。标准可以涉及例如窄光谱带、强度标准、光谱形状、和空间形状。
选择标准还考虑了空间照明图案的知识。将在发射波长下测量的强度通过图像中相同位置处的激发波长下的照明强度标准化。这消除了困扰模拟测量的空间不均匀性的问题。该测定在逐个颗粒的基础上以数字形式进行，从而考虑每个颗粒的“激发输入”和“光谱输出”。给定颗粒的结果只能是0或1。
可以用如图9中所展示的移动设备进行数字分子测定，图9示出了具有夹式测定芯片读取器的移动电子设备。例如，测定芯片读取器可以包括使移动设备相机适应暗场成像的光学组件。测定芯片被设计用于接收分析物溶液并且可以预先涂覆有抗体。
由于数字测定是基于成像和图像分析，因此可以将编码置于测定芯片上并从用于测量结合事件的相同图像中读出。图10展示了可以嵌入在数字测定中的编码。实例包括条形码，快速响应(QR)码，在工程化波长下发出光的量子点，温度、湿度、光暴露、气体暴露和其他环境数据的纳米颗粒报告物。还可以包括表示特定测定类型或样品标识号的标识标记。
上文讨论的实例使用抗原-抗体结合来呈现。可以将抗原和抗体连接至光学报告分子以进行测定读出。涉及其他交联机制的测定也可以数字方式执行。例如，基于与光学报告分子结合的DNA或RNA片段的杂交的测定可以作为数字分子测定执行，其中互补的DNA或RNA片段代替抗原和抗体分子。例如，短DNA序列的第一部分可以与光学报告物结合，并且短DNA序列的第二部分可以与另一光学报告物结合。当第一部分和第二部分与较长的互补DNA序列结合时，两个光学报告物靠近在一起并且因此发出与它们相距较远时相比不同的光学信号。这种测定可以用于检测互补DNA序列。
总之，对于模拟测定使用移动设备作为专业实验室仪器的替代品是一件徒劳无益的事。数字分子测定允许逐个颗粒地读出单一分析物分子与报告分子之间的单独相互作用，使得与传统测定相关的实际问题无关紧要。利用移动设备的成像和图像处理能力提供减少或消除模拟测定中存在的常见系统误差来源的诊断结果，数字分子测定能够实现实地评估，如帮助医生和患者快速且价廉地获得关键健康信息的定点照护诊断测试，以及在宽范围应用中收集和分析数据。
术语和定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
如在此使用的，以下术语具有指示的含义。
当披露数值范围，以及使用符号“从n1......至n2”或“介于n1......与n2之间”时，其中n1和n2是数字，则除非另外指明，否则此符号旨在包括这些数字本身以及它们之间的范围。此范围可以是在这些端值之间的完整或连续范围，并且包括这些端值。举例来说，范围“从2个至6个碳原子”旨在包括两个、三个、四个、五个以及六个碳原子，因为碳原子是以整数单位出现的。举例来说，将范围“从1μM至3μM(微摩尔)”(旨在包括1μM、3μM，以及这两者之间的所有数)与许多有效数字(例如，1.255μM、2.1μM、2.9999μM等)进行比较。
如在此使用的，术语“约”旨在限定它所修饰的数值，表示这个值为在误差界限之内的变量。当未列出具体误差界限(如图表或数据表中给出的平均值的标准差)时，术语“约”应理解为意指涵盖所列举值的范围以及还有通过四舍五入到该数字而被包括的范围，考虑到了有效数字。
如在此单独或组合使用的，术语“准确度”用于指报告值或估计值与真实值的接近度。不准确的测量值、观测值或估计值偏离真实值。准确的测量值、观测值或估计值不偏离真实值。
如在此单独或组合使用的，术语“分析物”或“分析物分子”用于描述在样品中的存在或不存在、或量最初是未知的，并且对在样品中的存在或不存在、或包含量的了解将是有用的分子或颗粒。分析物的实例包括生物分子，如：肽、蛋白质、细胞因子、和朊病毒；抗体及其片段；核酸(DNA/RNA)和含有它们的颗粒，如组蛋白；小的有机分子和生物无机分子，如碳水化合物、脂类、激素、以及代谢的中间体和产物；大分子，如大环化合物、生物聚合物(例如低聚糖、多酚、和塑料)；以及病毒、病毒颗粒、病毒产物(例如病毒因子)。分析物也可以被分类为生物标记物，即与生物体的生物状态(例如，如疾病或非疾病状态的病状)相关的组合物和/或分子或组合物和/或分子的复合物，并且可以报告疾病、损伤或细胞或器官损害的存在。当此类标记物与抗体或其片段结合时，它们可被称为抗原。通过本文披露的数字分子测定检测的针对分析物的有意义(例如，正常和异常)水平的值对于相关领域中的技术人员来说是已知的。
如在此单独或组合使用的，术语“区域检测器”是指可以记录来自来源的图像，即不仅记录输入光学信号的强度，而且记录光学信号的起点的记录设备。区域检测器的常见实例是电视摄像机、数字SLR相机、和手机相机。
如在此单独或组合使用的，术语“测定芯片”是指点样在或以其他方式沉积在报告表面上的报告分子(例如光学报告分子)的微阵列，任选地包封在相对薄的扁平比色皿如玻片中，该比色皿可以暴露于含有分析物的样品，由此使得可以观测到光学报告分子的捕获元件与分析物之间的相互作用。用于生产测定芯片的技术在本领域中是已知的。测定芯片可包括作为光学报告分子的用抗体、蛋白质、DNA、RNA等功能化的等离激元纳米颗粒。
如在此单独或组合使用的，术语“测定芯片读取器”是指用于观测和记录来自测定芯片的信号的系统或设备。分析芯片读取器可以是如本文披露的数字分子测定系统的一部分，并且典型地包括用于接收分析芯片的室、记录设备如图像传感器(例如，相机)、用于将从测定收集的数据传输到存储器的装置、以及任选的光源，如发光二极管(LED)。另外，测定芯片读取器可以含有微流体硬件，如泵、通道、用于溶液的室、阀门、混合器等；以及用于执行至少一些数据分析的硬件和/或软件。在某些实施例中，测定芯片读取器可以与智能电话或其他移动设备耦合，并且用作便携式测定系统的一部分；小型化微板和芯片读取器在本领域中是已知的。
如在此单独或组合使用的，术语“结合等温线”是指在不同浓度的分析物下结合的报告分子与分析物分子的结合程度。通常，结合程度(可以定义为结合的报告分子/总报告分子的比率)随着分析物浓度的增加而增加，并且最终接近1，因为几乎所有报告分子都与分析物分子结合。
如在此单独或组合使用的，术语“分箱(binning)”是指将来自两个或更多个像素的信号组合成一个信号。当可以牺牲空间分辨率以便提高信噪比时，可以使用分箱。示例来说，“2x2分箱”是指将像素分组到2x2正方形中，并且对来自每个正方形中包含的像素的信号求和。
如在此单独或组合使用的，术语“生物分子”包括可能希望检测(定性或定量)的任何类型的有机分子或生物无机分子，包括但不限于肽、蛋白质、核酸、糖、单糖和多糖、脂质、脂蛋白、全细胞等。
如在此使用的，术语“相机”是指一种用于记录例如作为数字图像的视觉图像的图像传感器类型。“百万像素相机”是一种可以每个图像记录一百万个像素或数百万个像素的相机。许多智能手机相机包含1000万像素或更多像素的相机。
如在此使用的，术语“通信接口”是指用于将数据从如在此使用的设备或系统传输到另一个设备或系统的装置。无线通信接口的实例包括在无线设备，如移动电话的中使用的那些接口，例如蜂窝、wi-fi和蓝牙技术。
如在此单独或组合使用的，术语“浓度”是指每单位体积溶液的溶液中溶质的量。浓度可以以摩尔浓度，即每升溶液中溶质的摩尔数、或数量浓度，即每升溶液的溶质分子数的单位来指定。摩尔浓度和数量浓度可以容易地相互转换。如在此使用的，术语“浓度”扩展到包括在“溶液”的传统定义之外的体系，例如含有系接至固体支持物上的分子的体系。
如在此单独或组合使用的，术语“去卷积”用于描述用于从由来自多个光学报告分子的单独光学信号构成的集合光学信号确定来自单独光学报告分子的单独光学信号的方法。去卷积可以使用曲线拟合技术来确定来自单独光学报告分子的单独光谱特征，这些单独光谱特征在光谱区上部分重叠并且已经组合形成单一集合光谱。去卷积可以使用曲线拟合技术来确定来自单独光学报告分子的单独图像，这些单独图像在检测器的空间区中部分重叠并且已经组合形成单一集合图像。应理解，去卷积技术对于小组光学报告分子是特别有用的。
如在此单独或组合使用的，术语“检测(detect)”或“检测(detection)”用于描述确定样品中分析物的出现、存在或实情的方法。
术语“发散性”指示由记录设备所适应的垂直度偏离。理想化的区域检测器型记录设备将仅接受垂直于检测器平面的光线。实际区域检测器将允许以相对于垂直方向的一定角度到达的光线。尽管此特征可以增加信噪比(因为由检测器接受更多的光线)，但它也降低了空间分辨率，这取决于允许的发散角的大小、以及区域检测器像素的大小和区域检测器与样品平面之间的距离。
如在此单独或组合使用的，术语“孵育”用于描述将报告分子暴露于可能含有分析物分子的样品的过程。
如在此单独或组合使用的，术语“椭圆形”用于描述具有不等尺寸的体积。椭圆形体积的实例包括棱柱或圆柱体，其端面之间的距离明显大于或明显小于平行于端面的尺寸。椭圆形体积的另一个实例是椭圆体，其中一个轴明显大于或明显小于其他轴。
如在此单独或组合使用的，术语“光学路径”用于描述从报告分子到检测器的路径。
如在此单独或组合使用的，术语“光学报告分子”或等同地“光学报告物”用于描述能够通过光学信号报告分析物分子的存在或不存在、或量或浓度的报告分子。与光学报告分子接触的分析物分子(任选地，在某些测定形式中，伴有另一种光学报告分子)的存在或不存在诱导光学信号的变化。与分析物结合的光学报告分子(“结合的光学报告分子”)将发出与未与分析物结合的光学报告分子(“未结合的光学报告分子”)不同的信号。
如在此单独或组合使用的，术语“光学信号”用于描述源自光学报告分子的信号。光学信号可以落在光谱的可见范围内、或者在光谱的可见光范围之外。信号可以是，例如：
·光的波长；
·信号的强度；
·亮度；
·信号或光谱的形状；
·光谱带的存在或不存在；
·吸收带的消光系数；
·吸收带的λmax；
·发射带的量子产率；或
·发射带的荧光各向异性。
来自光学报告分子的光学信号可以在结合分析物分子时发生变化。结合时光学信号的变化可能是以下之一：
·光谱中心在指定波长之上或之下的偏移；
·最大强度的波长(λmax)的偏移；
·该信号的大小或强度的变化；
·亮度的增加或减小；
·该信号的形状的变化；
·光谱带的存在或不存在；
·光谱的形状的变化。
·吸收带的消光系数的变化；
·吸收带的λmax的变化；
·发射带的量子产率的变化；以及
·发射带的荧光各向异性的变化。
如在此单独或组合使用的，术语“像素”是指区域检测器，例如图像传感器上的区域，其信号可以独立于其他像素测量。区域检测器通常被划分为二维像素网格，其中每个像素的大小、以及两个方向上的像素计数由区域检测器制造商决定。
如在此单独或组合使用的，术语“精度”用于指与报告值或估计值相关联的误差估计量。低精度测量值、观测值或估计值与关于此数字与实际值的接近度的高不确定度相关联。高精度测量值、观测值或估计值与关于此数字与实际值的接近度的低不确定度相关联。通常可以通过在图表上使用误差条或数值范围来定量精度。例如，报告为10.5±0.1的估计值表明真实值很可能在10.4与10.6之间；真实值超出此范围的可能性很小但非零。
术语“蛋白质”、“多肽”、“肽”和“寡肽”在本文中可互换使用并且包括包含通过肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的任何组合物。应了解，多肽可含有除通常称为20种天然存在的氨基酸的20种氨基酸之外的氨基酸。另外，多肽可包含通过本领域已知的任何手段(无论是天然的还是非天然的)修饰的一个或多个氨基酸，包括末端氨基酸。多肽修饰的实例包括例如通过糖基化、或其他翻译后修饰。可以存在于本披露的多肽中的修饰包括但不限于：乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移-RNA介导的至蛋白质的氨基酸添加如精氨酸化和泛素化。
如在此单独或组合使用的，术语“定性分析”用于描述用于确定样品中分析物分子的不存在或存在的方法。在一些实施例中，定性分析方法报告样品中单一分析物分子的存在或不存在。在一些实施例中，定性分析方法不正确地报告在含有低于某一阈值的水平的分析物的样品中分析物的不存在。
如在此单独或组合使用的，术语“定量分析”用于描述用于确定样品中分析物分子的量的方法。
如在此单独或组合使用的，术语“记录设备”是指用于记录光学信号的设备。在某些实施例中，光学信号被转换为电信号。在某些实施例中，记录设备是电荷耦合(“CCD”)设备。在某些实施例中，记录设备是互补金属氧化物半导体(“CMOS”)设备。
如在此单独或组合使用的，术语“报告分子”用于描述可以报告分析物分子的存在或不存在、或量或浓度的分子，并且单独或与另一报告分子组合地在数字分子测定中产生可检测信号。典型地，报告分子将与分析物分子结合，并且报告分子/分析物分子复合物将在一种或多种光谱特性方面显著不同。报告分子可以是抗体或其片段、核酸、蛋白质、和肽，其中任何一种都可以是经化学或生物化学修饰的。报告分子也可以是包含生化来源部分和合成部分的嵌合分子；实例包括抗体功能化的等离激元纳米颗粒和核苷酸功能化的等离激元纳米颗粒。报告分子可以是基于核酸或肽的适配子。
如在此单独或组合使用的，术语“报告体积”用于描述报告分子位于其中的测量设备的体积。报告体积可以与样品隔室基本相同，或者报告体积可以更小。在某些实施例中，与报告分子的光学路径平行的报告体积的尺寸将是小的。在某些实施例中，报告体积将构成单层。
如在此单独或组合使用的，术语“样品”用于描述含有感兴趣分析物的组合物。样品通常是流动的，例如水性溶液。样品可以是化学的或生物的。来自待测试源的血液、血浆、水，来自植物、动物或人组织样品的提取物是生物样品的实例。化学样品可以是不含生物来源材料的样品，如含有石油化学产品或工业废料的水样品。从生物体抽取的生物样品可包括但不限于以下物质：血液、血清、血浆、尿液、粘液、唾液、痰、粪便和其他生理分泌物，以及组织的提取物，和/或可能含有感兴趣的靶颗粒的身体的任何其他成分。其他类似的样本如细胞或组织培养物或培养液也是令人感兴趣的。
生物样品可以是新鲜的或储存的(例如储存在血库中的血液或血液级分)。生物样品可以是明确获得用于本发明的测定的体液或出于另一目的而获得的体液，可以对其进行二次取样以用于本发明的测定。在一个实施例中，生物样品是全血。可以使用标准临床程序从受试者获得全血。在另一个实施例中，生物样品是血浆。可以通过离心抗凝血从全血样品中获得血浆。这种方法提供白细胞成分的血沉棕黄层和血浆的上清液。在另一个实施例中，生物样品是血清。可以通过离心已经收集在不含抗凝血剂的管中的全血样品来获得血清。在离心之前允许血液凝结。通过离心获得的淡黄色-微红流体是血清。在另一个实施例中，样品是尿液。样品可以根据需要通过在适当的缓冲溶液中稀释、肝素化、浓缩(若需要)、或通过任意种方法分级来进行预处理，这些任意种方法包括但不限于超速离心、通过快速高效液相色谱(FPLC)分级、或用硫酸葡聚糖或其他方法沉淀含有蛋白质的载脂蛋白B。可以使用生理pH下的许多标准水性缓冲溶液中的任一种，如磷酸盐、Tris等。
如在此关于结合现象使用的，术语“饱和”是指几乎所有报告分子与分析物分子结合的状态。饱和条件的特征是分析物浓度的增加引起报告分子结合程度的小幅增加。
如在此使用的，术语“智能手机”是指具有移动操作系统和用于语音、SMS和互联网数据通信的集成移动宽带蜂窝网络连接、并且典型地是wi-fi的手持式个人计算机。
如在此使用的，术语“平板计算机”或“平板电脑”是指薄的扁平便携式个人计算机，典型地具有移动操作系统、LCD触摸屏显示器、可再充电电池、和无线(任选地，蜂窝)通信接口。
实施例
本发明进一步通过以下实施例来描述。
实施例1.本披露提供了一种用于确定样品中至少一种分析物的存在或浓度的方法，该方法包括：
在由与至少一种类型的分析物分子一起孵育的至少一种类型的光学报告分子发出的多个信号的图像中，
对于每种类型的光学报告分子，通过单独地分辨结合的光学报告分子和未结合的光学报告分子来确定该图像中与分析物分子结合的离散光学报告分子(“结合的光学报告分子”)的数量和未与分析物结合的离散光学报告分子(“未结合的光学报告分子”)的数量；并且，
根据该结合的光学报告分子的数量将分析物的存在或浓度确定为占光学报告分子总数量的分数、或确定为与占光学报告分子总数量的分数成比例。
实施例2.在某些实施例中，本披露提供了一种用于确定样品中至少一种分析物的存在或浓度的方法，该方法包括：
在由与至少一种类型的分析物分子一起孵育的至少一种类型的光学报告分子发出的多个信号的图像中，
对于每种类型的光学报告分子，通过以下方式来确定该图像中与分析物分子结合的离散光学报告分子(“结合的光学报告分子”)的数量和未与分析物结合的离散光学报告分子(“未结合的光学报告分子”)的数量：
在该图像的某些区中，单独地分辨结合的光学报告分子和未结合的光学报告分子，并且
在该图像的其中一组两个或更多个光学报告分子不能分辨的某些其他区中，执行提供该组中结合的光学报告分子的数量和未结合的光学报告分子的数量的计算或数学去卷积；并且
根据该结合的光学报告分子的数量将分析物的存在或浓度确定为占光学报告分子总数量的分数、或确定为与占光学报告分子总数量的分数成比例。
实施例3.如实施例1或2中任一项所述的方法，其中这些光学报告分子排列在报告表面上。
实施例4.如实施例3所述的方法，其中这些光学报告分子是随机排列的。
实施例5.如实施例3所述的方法，其中这些光学报告分子以图案排列。
实施例6.如实施例1-5中任一项所述的方法，其中该结合的光学报告分子的分数是根据在引入该样品之前记录的未结合的光学报告分子的数量确定的。
实施例7.如实施例1-6中任一项所述的方法，其中该至少一种分析物的浓度被确定。
实施例8.如实施例1-7中任一项所述的方法，其中该样品是生物或化学样品。
实施例9.如实施例1-8中任一项所述的方法，其中该分析物选自：
·核苷酸序列；以及
·抗原。
实施例10.如实施例1-9中任一项所述的方法，其中该光学报告分子包含选自以下的捕获元件：
·结合该分析物的一种或多种核苷酸序列；以及
·结合该分析物的抗体或其片段。
实施例11.如实施例1-10中任一项所述的方法，其中每个光学报告分子包含等离激元纳米颗粒。
实施例12.如实施例1-11中任一项所述的方法，其中该光学报告分子包含功能化在一个或多个等离激元纳米颗粒上的一种或多种核苷酸序列。
实施例13.如实施例1-11中任一项所述的方法，其中该光学报告分子包含功能化在一个或多个等离激元纳米颗粒上的一种或多种抗体。
实施例14.如实施例1-13中任一项所述的方法，其中来自该光学报告分子的该信号选自：
·光的波长；
·信号的强度；
·亮度；
·信号或光谱的形状；以及
·光谱带的存在或不存在。
实施例15.如实施例1-14中任一项所述的方法，其中一种信号在分析物与该光学报告分子结合时产生。
实施例16.如实施例1-15中任一项所述的方法，其中另一种信号在分析物与该光学报告分子结合并且第二报告分子与该分析物结合时产生。
实施例17.如实施例1-16中任一项所述的方法，其中由该结合的光学报告分子和该未结合的光学报告分子产生的这些信号是不同的。
实施例18.如实施例1-17中任一项所述的方法，其中这些结合的光学报告分子和未结合的光学报告分子通过以下方式来单独地分辨：
·光谱中心在指定波长之上或之下的偏移；
·该信号的大小或强度的变化；
·亮度的增加或减小；
·该信号的形状的变化；
·光谱带的存在或不存在；以及
·光谱的形状的变化。
实施例19.如实施例1-18中任一项所述的方法，其中由该光学报告分子发出的该信号是光的波长。
实施例20.如实施例1-19中任一项所述的方法，其中这些结合的光学报告分子和未结合的光学报告分子通过光谱中心在指定波长之上或之下的偏移来单独地分辨。
实施例21.如实施例1-20中任一项所述的方法，其中将这些光学报告分子中的至少一些附连至表面(该报告表面)上，由此使得每个附连的光学报告分子是空间上可分辨的。
实施例22.如实施例21所述的方法，其中这些附连的光学报告分子以网格或近似网格排列。
实施例23.如实施例21所述的方法，其中每个附连的光学报告分子可分辨为记录设备的一个像素。
实施例24.如实施例1-23中任一项所述的方法，其中活性光学报告分子和无活性光学报告分子发出不同的光学信号。
实施例25.如实施例1-24中任一项所述的方法，其中该方法确定该图像中与分析物分子结合的离散活性光学报告分子(“结合的活性光学报告分子”)的数量和未与分析物结合的离散光学报告分子(“未结合的活性光学报告分子”)的数量。
实施例26.如实施例1-25中任一项所述的方法，其中该样品的非均匀照明不影响该对分析物的存在或浓度的确定。
实施例27.如实施例1-26中任一项所述的方法，其中该图像是在已知照明波长下记录的。
实施例28.如实施例1-27中任一项所述的方法，其中将该图像中的任何点处的结果相对于该已知照明标准化。
实施例29.如实施例1-28中任一项所述的方法，其中将在发射波长下测量的强度通过图像中相同位置处的激发波长下的照明强度标准化。
实施例30.如实施例1-29中任一项所述的方法，其中记录该图像的传感器的一个或多个区段中的缺陷不影响该对分析物的存在或浓度的确定。
实施例31.如实施例1-30中任一项所述的方法，其中使用了一种类型的光学报告分子。
实施例32.如实施例1-31中任一项所述的方法，其中使用了多于一种类型的光学报告分子。
实施例33.如实施例1-32中任一项所述的方法，其中该方法采用夹心型测定。
实施例34.如实施例1-33中任一项所述的方法，其中将第一类型的光学报告分子附连至表面(该报告表面)上，由此使得每个附连的光学报告分子是空间上可分辨的。
实施例35.如实施例1-34中任一项所述的方法，其中该第一类型的光学报告分子包含功能化在等离激元纳米颗粒上的针对分析物的捕获元件。
实施例36.如实施例1-35中任一项所述的方法，其中第二类型的光学报告分子与该样品一起或在该样品之后添加。
实施例37.如实施例1-36中任一项所述的方法，其中该第二类型的光学报告分子包含功能化在等离激元纳米颗粒上的针对该分析物的捕获元件。
实施例38.如实施例1-37中任一项所述的方法，其中该分析物是抗原。
实施例39.如实施例38所述的方法，其中每个光学报告分子包含作为该捕获元件的抗体或其片段。
实施例40.如实施例1-37中任一项所述的方法，其中该分析物是核苷酸序列。
实施例41.如实施例40所述的方法，其中每个光学报告分子包含作为该捕获元件的与该分析物核苷酸序列互补的一种或多种核苷酸序列。
实施例42.如实施例1-41中任一项所述的方法，其中该方法在包括移动设备的数字分子测定系统上执行。
实施例43.如实施例1-41中任一项所述的方法，该方法在如实施例50-70中任一项所述的数字分子测定系统上执行。
实施例44.一种用于确定样品中抗原的存在或浓度的方法，该方法包括：
在由与抗原一起孵育的至少一种类型的包含抗体的光学报告分子发出的多个信号的图像中，通过单独地分辨结合的光学报告分子和未结合的光学报告分子来确定该图像中与抗原结合的离散活性抗体(“结合的活性抗体”)的数量和未与抗原结合的离散活性抗体(“未结合的活性抗体”)的数量；并且，
根据该结合的活性抗体的数量将抗原的存在或浓度确定为占活性抗体总数量的分数、或确定为与占活性抗体总数量的分数成比例。
实施例45.如实施例44所述的方法，该方法包括如实施例3-11和13-39中任一项的限制。
实施例46.如实施例45所述的方法，该方法在如实施例50-70中任一项所述的数字分子测定系统上执行。
实施例47.一种用于确定样品中靶核苷酸序列的存在或浓度的方法，该方法包括：
在由以下发出的多个信号的图像中：
a)包含与该靶核苷酸序列的第一部分互补的第一捕获核苷酸序列的光学报告分子，以及
b)包含与该靶核苷酸序列的一部分互补的第一捕获核苷酸序列的该第一光学报告分子和包含与该靶核苷酸序列的第二部分互补的第二捕获核苷酸序列的第二光学报告分子，该第一光学报告分子和第二光学报告分子与该靶核苷酸序列结合(“结合复合物”)，
确定与包含该第一部分和该第二部分的该互补核苷酸序列的光学报告分子结合的离散靶核苷酸序列(“结合复合物”)的数量；
将该靶核苷酸序列的存在或浓度确定为结合复合物的数量占发出可检测信号的光学报告分子总数量的分数、或确定为与该结合复合物的数量占该总数量的分数成比例。
实施例48.如实施例47所述的方法，该方法包括如实施例3-12和13-37中任一项的限制。
实施例49.如实施例48所述的方法，其中该系统是如实施例50-70中任一项所述的。
实施例50.一种用于确定样品中分析物的浓度的数字测定系统，该数字测定系统包括：
·图像传感器；
·能够显示图像的屏幕；
·微处理器；
·存储器；
·图像分析软件，该图像分析软件存储在该存储器中并且由能够分析由该图像传感器捕获的数据和数字分类数据的该处理器可执行；以及
·任选地，通信接口。
实施例51.如实施例50所述的数字测定系统，其中该图像传感器能够作为暗场显微镜的一部分操作。
实施例52.如实施例51所述的数字测定系统，其中该图像传感器是百万像素相机。
实施例53.如实施例49-52中任一项所述的数字测定系统，其中该图像传感器是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机。
实施例54.如实施例49-53中任一项所述的数字测定系统，该数字测定系统另外包括光或其他电磁辐射的源。
实施例55.如实施例49-54中任一项所述的数字测定系统，其中该光源包括发光二极管(LED)。
实施例56.如实施例49-55中任一项所述的数字测定系统，该数字测定系统另外包括任选地可移除的样品室。
实施例57.如实施例49-56中任一项所述的数字测定系统，该数字测定系统另外包括
·由玻璃或聚合物制成的报告表面，该报告表面的一侧已附连包含用捕获元件功能化的等离激元纳米颗粒的光学报告分子；以及
·适合于暗场显微镜法的波导，该波导与该报告表面的相反侧接触。
实施例58.如实施例49-57中任一项所述的数字测定系统，其中每个附连的光学报告分子是空间上可分辨的。
实施例59.如实施例58所述的数字测定系统，其中这些附连的光学报告分子以网格或近似网格排列。
实施例60.如实施例58或59所述的数字测定系统，其中每个附连的光学报告分子可分辨为记录设备的一个像素。
实施例61.如实施例49-60中任一项所述的数字测定系统，其中该捕获元件选自：
·结合该分析物的一种或多种核苷酸序列；以及
·结合该分析物的抗体或其片段。
实施例62.如实施例49-61中任一项所述的数字测定系统，其中该分析物是抗原。
实施例63.如实施例49-62中任一项所述的数字测定系统，其中每个光学报告分子包含作为该捕获元件的抗体或其片段。
实施例64.如实施例49-63中任一项所述的数字测定系统，其中该分析物是核苷酸序列。
实施例65.如实施例49-64中任一项所述的数字测定系统，其中每个光学报告分子包含作为该捕获元件的与该分析物核苷酸序列互补的一种或多种核苷酸序列。
实施例66.如实施例49-65中任一项所述的数字测定系统，其中该微处理器、存储器、图像传感器、软件、能够显示图像的屏幕、以及通信接口全部包括在单一便携式设备中。
实施例67.如实施例49-66中任一项所述的数字测定系统，其中该通信能力是无线的。
实施例68.如实施例49-67中任一项所述的数字测定系统，其中该单一便携式设备选自智能电话和平板计算机。
实施例69.如实施例49-68中任一项所述的数字测定系统，其中该单一便携式设备是智能电话。
实施例70.如实施例49-69中任一项所述的数字测定系统，该数字测定系统另外包括用于将该智能电话、样品室、和光源定位成紧密且稳定地接近的壳体。
该提供了包括以上元件的设备。
实施例71.还提供了一种如实施例#-#中任一项所述的数字测定系统，该数字测定系统可以执行如实施例1-41、44、45、47、和48中任一项所述的方法。
实施例72.一种用于执行生物化学测定的方法，该方法包括：
将抗体与抗原一起孵育；
获得这些抗体中的多个抗体的图像；
将该图像中看到的这些抗体分类为活性的或无效的；
将活性抗体分类为结合的或未结合的；
确定该图像中结合的抗体和未结合的抗体的数量；并且，
根据该结合的抗体的数量将抗原的浓度测量为占活性抗体数量的分数。
实施例73.如实施例72所述的方法，其中，这些抗体附接至表面。
实施例74.如实施例72所述的方法，其中这些抗体和抗原是用光学报告分子标记的。
实施例75.如实施例72所述的方法，其中该图像是用移动设备相机获得的。
实施例76.一种用于执行生物化学测定的方法，该方法包括：
将与短DNA序列的第一部分结合的光学报告分子和与该短DNA序列的第二部分结合的光学报告分子一起孵育；
获得这些光学报告分子中的多个光学报告分子的图像；
将该图像中看到的分子复合物分类为活性的或无效的；
将活性分子复合物分类为结合的或未结合的；
确定该图像中结合的复合物和未结合的复合物的数量；并且，
根据该结合的复合物的数量将与该短DNA序列的该第一部分和该第二部分互补的DNA序列的浓度测量为
占活性复合物数量的分数。
实施例77.如实施例76所述的方法，其中这些短DNA序列结合至表面。
下文详述了上文的另外的实施例。
应用
本文披露的数字分子测定方法、系统和设备可用于多种领域和应用中。特别地，数字分子测定在“实地”中，即在便携式环境中是有用的。例如，数字分子测定将在医疗评估和诊断以及病原体检测中，特别是在偏远地区、服务不足或难以接近(例如由于暴力冲突)的地区、受流行病影响的地区中、以及在对传统测定设备和/或专业人员的接近受到限制的其他情况下是有用的。它们在医院或诊所内或在家庭访问环境中也是有用的，在那里它们可以在照护点或床边执行或使用。
数字分子测定在兽医学环境中是与在医学中同样有用的，无论是在兽医办公室中、在牧场或农场上、还是在需要测试的动物所在的任何地方。它们还可以用于园艺或农业应用，以测试植物或土壤中的病原体或共生微生物、或检测其他感兴趣的基因型和表型。
数字分子测定也可用于测试水的污染，例如通过细菌、藻类或真菌、或其毒性产物；通过石油或其产品和副产品、以及工业废物)。此类测定可用于食品安全测试和农业用途，如对病原体、毒素、掺杂物、污染物、和害虫的田间或加工设施测试。
测定
许多类型的生物化学测定可适于本文披露的数字分子测定形式。实例包括：免疫测定，其中抗原被抗体或其片段捕获和结合；杂交测定，其中将一个或多个与感兴趣的分析物DNA/RNA互补的DNA或RNA区段用于捕获分析物；以及配体结合测定，其中将针对受体、酶或其他蛋白质的结合配偶体(或反之亦然)用作配偶体分析物(例如，蛋白质或其片段)的捕获剂。
应了解，免疫测定和杂交测定可以采用夹心形式，其中使用了结合配偶体对，例如，针对相同分析物分子(例如抗原或靶DNA/RNA)的抗体或cDNA/RNA。因此，本披露涵盖结合配偶体对，例如抗体，其中两种抗体对相同分子(例如，相同抗原)是特异性的，并且其中该对中的一个或两个成员构成如本文所述的光学报告分子。多个捕获元件和报告元件的组合仍构成产生信号的布置，该布置虽然包含多个光学报告分子，但其本身仍可称为光学报告分子。
捕获结合配偶体和检测结合配偶体对，例如捕获和检测抗体或核苷酸对，可用于报告分子中。因此，尽管本文披露的数字分子测定允许对分析物的无标记检测，但在一些实施例中，使用异质测定方案，其中典型地使用两个结合配偶体，例如两种抗体或两种DNA或RNA序列。一种结合配偶体是捕获配偶体，通常固定在固体支持物如等离激元纳米颗粒上，并且另一种结合配偶体是检测结合配偶体，典型地具有附接的可检测标记，如另一种等离激元纳米颗粒。抗体和抗体对是可商购获得的，并且也可通过本领域中熟知的方法设计和制备。
报告分子可以通过非特异性吸附、或通过特异性共价连接附接至报告表面。报告分子的负载在很大程度上取决于制备溶液中报告分子的浓度。更浓缩的溶液将提供更高密度的报告分子，而同时增加了含有两个或更多个颗粒的报告分子簇的计数。后一种效应对成功的操作绝不是致命的：可以使用下面讨论的曲线拟合技术分析较小的报告分子簇，而不适合于这些技术的较大簇可以被标记为无活性的。考虑到增加报告分子计数和维持易于管理的少量报告分子簇的相互矛盾的目标，在某些实施例中证明每平方微米最多约1个报告分子的负载是最佳的。对于单分子检测，等同于每个像素不超过一个分析物分子(与光学报告分子结合的)的密度将是有用的。
使用夹心测定的分析可以通过多步骤程序执行：将已经用捕获分子功能化的报告表面暴露于分析物。根据分析物浓度，一定分数的捕获分子将与分析物结合。在第二步中，将报告表面暴露于具有检测分子的溶液中。只有那些在第一步中与分析物结合的捕获分子才会在第二步中与检测分子结合。该方法的明显优点是可以选择捕获分子和检测分子，以便与未结合的捕获分子相比优化从捕获分子/分析物/检测分子组装体递送的光学信号。
本文披露的方法可用于鉴定与临床诊断的疾病状态相关联的感兴趣的表型或基因型状态。此类疾病状态包括例如癌症、心血管疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、神经性疾病、感染性疾病和妊娠相关病症。可替代地，可以使用标记物检测健康状态。
本文披露的方法可用于检测遗传变异。本文的遗传变异可包括但不限于核苷酸序列(例如，DNA和RNA)和蛋白质(例如，肽和蛋白质)中的一个或多个取代、翻转、插入、缺失、或突变，一个或多个微缺失，一个或多个稀有等位基因，多态性，单核苷酸多态性(SNP)，大规模遗传多态性，如翻转和易位，一个或多个核苷酸分子(例如，DNA)的丰度和/或拷贝数的差异(例如，拷贝数变异，CNV)，三体性，单体性和基因组重排。在一些实施例中，遗传变异可能与受试者中的疾病如癌症的转移、存在、不存在、和/或风险，药代动力学变异性，药物毒性，不良事件，复发和/或器官移植排斥的存在、不存在或风险相关。例如，HER2基因的拷贝数变化会影响乳腺癌患者是否对赫赛汀治疗有应答。类似地，检测来自孕妇的血液中21号染色体(或18、或13、或性染色体)拷贝数的增加可用作针对未出生的婴儿中的唐氏(Down′s)综合征(或巴特氏(Patau′s)综合征或爱德华氏(Edwards′)综合症)的非侵入性诊断法。另一个实例是检测移植器官的受体基因组中不存在的等位基因-监测这些等位基因的频率、或拷贝数可以鉴定潜在器官排斥的征象。
测量设备和系统
本文所述的数字分子测定方法采用测量设备或系统，其中任一者包括分析样品所需的部件。测量设备包括样品隔室，通过直接添加感兴趣样品、或通过插入比色皿或玻片(其本身包含感兴趣样品)将样品引入到该样品隔室中。样品隔室进一步提供含有报告分子的组件，这些报告分子的功能是与感兴趣分析物结合并产生光学信号。对于依赖于发射方法的设计，测量设备提供用于激发报告分子中包含的发色团的照明设备。测量设备包括记录设备(例如图像传感器，例如数字相机)，该记录设备检测并记录来自报告分子的光学信号。最后，测量设备可以包括附加组件，如用于操作的控件、用于显示或报告分析结果的设备、以及与外部计算机的接口。各种任选的组件的存在及其细节可在测量设备的各种设计之间不同。
整个系统或设备可以并入用于定向设备以方便添加或移除样品的底座。该系统可以耦合到移动计算设备。移动计算设备可以是智能手机、手持式计算机、平板计算机或类似的便携式计算设备。在一些实例中，移动计算设备包括所有必要的组件，如：显示器、处理器、存储器和存储在存储器中并且由处理器可执行的程序指令，以实现对如下列步骤的高度自动化执行：(i)引入样品，(ii)光学激发，(iii)任选地预筛选样品以评价样品质量和最佳暴露时间，(iv)通过记录设备记录图像，(v)如果需要，减去检测器偏差，(vi)对检测器信号数字化，(vii)将数字信号记录在非易失性存储器中，(viii)如果需要，再循环检测器，以及(ix)处理数字信号。功能可以进一步包括确定数字测定的结果，并且将结果以视觉形式传达给最终用户。
使用智能手机或其他移动计算设备作为用于数字分子测定的检测仪器允许价廉、便携且多功能的系统在实地(即，在实验室外)进行测定。应用可包括用于测量病毒负载量、营养状况、疾病生物标记物、或环境污染物而无需将样品运送到中心实验室的定点照护诊断系统。此类测试可以在私人住宅、全球健康设施中、在执法站、和医疗诊所中进行。移动计算设备可以连接到互联网，这将能够将传感器数据与患者信息和地理位置组合。可以提供与外部计算设施的连接以便于数据解释、地理和人口统计绘图、数据库构建和维护、以及向远程医疗专家和当局递送通知。紧凑的可实地操作数字测量设备将使测定免除对实验室中培训过的技术人员的需求。而是，这些测定由于检测系统的大小和可承受性而可以由任何人进行。
生物传感器
如本文披露的数字分子测定系统或设备包括可称为“生物传感器”的元件。生物传感器是使用生物分子(例如，一种或多种酶、抗体或核苷酸序列)来检测化学物质的存在的设备。许多种生物传感器可用于数字分子测定中。生物传感器典型地由以下组成：一起构成如本文披露的报告分子的捕获组件(通常称为“生物受体”)和报告组件(“生物换能器”)、以及包括检测器、处理器和显示器的系统、和任选的其他元件，如信号放大器、放大透镜和光源。分析物与捕获元件之间的相互作用(典型地是这两者的结合)产生报告元件的改变，该报告元件输出可测量的物理化学信号。此相互作用产生指示样品中靶分析物的存在或浓度的信号。
如本文披露的报告组件包括光学换能器，包括等离激元纳米颗粒、其他局部表面等离激元共振(LSPR)系统、等离激元散射系统、光子晶体、以及可以检测单个分子并产生光学信号的任何其他技术。
捕获元件可以是天然的或工程化的生物分子，如抗体或片段(Fab、Fv或scFv)或其结构域(VH、VHH)、或核酸(一个或多个针对感兴趣分析物的互补DNA或RNA区段)。
捕获元件附接至报告元件，例如通过功能化和分层沉积、或包埋在基质中，例如水凝胶或干凝胶，如溶胶-凝胶。报告分子(包括捕获元件和报告元件)所附接的传感器的表面(称为“报告表面”)可以是例如聚合物或玻璃；或者以金属涂覆或携带包含报告元件的金属纳米颗粒(例如金或银；还已使用了其他金属，如钛、铬和铜)的玻璃。此表面沿着分析物溶液所进入或通过的室或流动池的至少一个壁形成或对齐。
在等离激元纳米颗粒生物传感器的实例中，室或流动池可以由玻璃或聚合物制成；玻璃或聚合物报告表面可以携带经由本领域中已知的方法施加的用捕获元件功能化的金纳米颗粒。对于使用暗场显微法的分析，使光通过玻璃或聚合物报告表面的边缘、与报告表面的平面正交。
样品隔室
测量设备提供适合于引入感兴趣样品的样品室。采用光学测量技术的测量设备将受益于具有一个短的尺寸的椭圆形样品隔室。光学信号的从报告分子到记录设备的光路将与短的尺寸对齐。此取向将使对于较长光学路径将引起问题的光学信号的吸收和色散最小化。此标准允许使用棱柱形或圆柱形样品隔室。
报告体积
样品隔室包含称为报告体积的组件，该组件含有报告分子。此组件消除了将报告分子添加到感兴趣样品中的需要，并且反而能够使报告分子再循环。更重要的是，报告分子将保持在基本上静止的布置中，使得可以在临床使用测量设备之前鉴定和记录无活性报告分子。
在一些实施例中，报告体积由物理外壳限定，该物理外壳将报告分子保留在其自身内。物理外壳可以是多孔的，以允许分析物进入报告体积中以与报告分子接触。在一些实施例中，报告体积不是由物理外壳限定的；而是，可以提供其他手段以将报告分子保留在报告体积内并使报告分子保持静止。
在某些实施例中，报告分子与三维支持物缔合。在一种设计中，报告分子与三维支持物共价结合。可替代地，报告分子不与三维支持物共价结合，而是以阻碍从三维支持物扩散的方式浸渗在三维支持物中。在这种设计中，报告分子基本上被截留在三维支持物中，并且是静止的。
报告体积优选地在垂直于报告分子的光学路径的尺寸上是窄的。此几何形状提供了重要的优点：来自第一报告分子的光学路径在到达记录设备之前不太可能遇到第二报告分子。这在图11中示出。在图11(a)中示出了窄的报告体积，其中记录设备朝右，并且报告分子在报告体积中不均匀布置。可以看出，在此几何结构中，从报告分子到记录设备的光学路径很好地分开。相比之下，在图11(b)中示出了宽的报告体积。在此几何结构中，至少一个报告分子与第二报告分子重叠。此重叠就以下两个原因而言是不利的：(a)第二报告分子可以部分地重吸收来自第一报告分子的信号，从而引起误差，和(b)需要准确测量来自报告分子的游离信号和结合信号的对无活性报告分子鉴定将变得更加复杂。
光学路径重叠的程度可以根据限定受体体积的少量参数估计，这些参数包括报告分子的特定分布(随机、半随机、聚集、有序)、报告分子的浓度和有效大小、以及报告体积的厚度。在本披露的某些实施例中，报告分子与记录设备之间的基本上所有光学路径都不会遇到其他报告分子。在某些实施例中，报告分子与记录设备之间的基本上所有光学路径遇到至多一个其他报告分子。
在一些实施例中，报告体积足够薄，以实现报告分子的单层。在此设计中，由于所有报告分子基本上在垂直于光学路径的平面中，并且平行于记录设备，因此光学路径的重叠是不可能的，如图12(a)中所绘示。可以使用各种单层技术来获得这种系统，如使用表面活性分子。表面活性分子的交联可使报告分子为静止的。下面详细呈现对报告表面的讨论。
应注意的是，不同报告分子的光学路径的优选的最接近距离不仅由报告分子的大小(该大小可以确定一个分子的光学路径是否穿透第二分子)而且还由检测器的空间分辨率、特别是像素大小决定。理想地，每个报告分子将与任何相邻报告分子分开至少一个像素，以便最容易地鉴定无活性报告分子并观测来自活性报告分子的光学信号。此外，根据进入记录设备的光学路径的发散性，可能希望更大的间距。这在图12(b)中示出，为了清楚起见，对其增加了报告体积与记录设备之间的距离，并且其中进入记录设备的光学信号的发散性小但非零。清楚的是，虽然报告分子彼此不物理重叠，但来自紧密间隔的报告分子的光学信号也可能重叠。
为了使不同报告分子的光学路径之间的重叠最小化，清楚的是，使报告分子的聚集最小化或相反地增加报告分子之间的间距的特征和技术将是有利的。在一个实施例中，将单独的报告分子联接到较大的颗粒，如微米球或微米颗粒、或纳米颗粒。由于较大颗粒的大小，报告分子与较大颗粒的联接将倾向于增加报告分子之间的平均距离。这在图12(c)中绘示出，其中报告分子3附接在较大颗粒5上、或内部。
报告表面
在某些实施例中，样品隔室包括用于附接报告分子的报告表面。报告表面垂直于椭圆形样品隔室的最短尺寸取向，以使从报告分子到记录设备的光学路径最小化。报告分子的这种布置允许报告分子容易地附接到固体支持物上，并且进一步提供窄的报告体积，这就上述原因而言是有益的。
报告表面被定向为与窗口相对，该窗口对由报告分子产生的信号基本上是透明的。透明报告表面可以接触适合于暗场显微镜法的波导。在某些实施例中，报告表面包括金属层。在某些另外的实施例中，金属层适合于表面等离激元共振。报告表面和透明窗口可以位于棱柱形样品隔室的两个端面上，或者可替代地，位于圆柱形样品隔室的两个端面上。在某些实施例中，端面是平行且接近的，从而近似或形成测定玻片或测定芯片。
报告分子
测量设备和系统包括多种报告分子，并且本文披露的方法采用多种报告分子。在一个实施例中，采用单一类型的报告分子，这将提供对各种浓度的分析物的良好表现的结合应答。可替代地，可以采用对相同分析物具有不同亲和力的两种或更多种不同的报告分子，这可以比具有单一类型的报告分子的测量设备适应更大范围的分析物浓度，如下面进一步详细描述的。在某些实施例中，提供了对不同分析物具有亲和力的两种或更多种不同的报告分子。
报告分子可包含发色团。在某些实施例中，发色团已共价附接至报告分子；可替代地，它可以经由功能化附接至报告分子上，例如，附接至量子点或等离激元纳米颗粒的表面上。在某些实施例中，发色团吸收电磁辐射。在某些实施例中，发色团吸收选自可见光和紫外光的光谱区中的电磁辐射。可替代地，发色团可以散射电磁辐射。在某些实施例中，发色团是发光的。在某些实施例中，发色团是荧光的。在某些实施例中，发色团是磷光的。
在本披露的某些实施例中，报告分子可各自包含在分析物结合时提供光学信号的发色团。光学信号可以是吸收带的消光系数的变化、吸收带的λmax的变化、发射带的量子产率的变化、发射带的荧光各向异性的变化、光谱中心在指定波长之上或之下的偏移、最大强度的波长(λmax)、信号的大小或强度的变化、亮度的增加或减小、信号的形状的变化、光谱带的存在或不存在；以及光谱的形状的变化。
在本披露的某些实施例中，光学信号由分析物与发色团之间的相互作用引起。在某些实施例中，光学信号由分析物与报告分子的结合间接引起。在某些实施例中，报告分子对分析物的结合诱导构象变化，该构象变化影响发色团的吸收或发射特性。在某些实施例中，报告分子对分析物的结合诱导分析物上的发色团与报告分子上的发色团之间的相互作用。
在本披露的某些实施例中，报告分子包含两个发色团。在某些实施例中，报告分子对分析物的结合诱导报告分子的几何变化，该几何变化增加了两个发色团之间的非辐射相互作用。在某些实施例中，报告分子对分析物的结合诱导报告分子的几何变化，该几何变化降低了两个发色团之间的非辐射相互作用。在某些实施例中，非辐射相互作用是荧光淬灭。在某些实施例中，非辐射相互作用是荧光能量转移。在某些实施例中，非辐射相互作用是磷光能量转移。在某些实施例中，非辐射相互作用是等离激元耦合的共振能量转移。
在某些实施例中，发色团是等离激元纳米颗粒和/或量子点。等离激元纳米颗粒和/或量子点可以被功能化以携带捕获元件。当捕获元件是生物分子如抗体、核苷酸、肽、或其片段时，发色团-捕获元件变成光学报告分子、和生物传感器。与分析物，如抗原或互补核苷酸接触(例如，对该分析物的结合)诱导了纳米颗粒的光谱特性的变化，这是由于如电子转移、能量转移、等离激元共振的效应、以及颗粒质量和流动性的变化。
无活性报告分子
本文所述的方法适应一定分数的无活性报告分子，即来自这些无活性报告分子的光学信号不存在或基本上不同于大部分报告分子。此行为可能是由于报告分子未能与分析物结合。可替代地，报告分子可以与分析物结合但不产生光学信号，或产生与其余部分的光学分子基本上不同的光学信号。
在某些实施例中，该系统利用纳米颗粒作为报告分子。纳米颗粒在与其他纳米颗粒聚集时可能变得无活性。
在本披露的某些实施例中，无活性报告分子包括聚集了的单独蛋白质(包括抗体)、未正确折叠的肽或蛋白质、包含不正确残基的肽或蛋白质、有缺陷的发色团。
在测量设备的操作寿命期间、特别是在无活性报告分子具有缺陷组成的情况下，无活性报告分子的数量可以保持基本恒定。由于报告分子的化学劣化、特别是由反复高强度暴露于光源引起的光化学劣化，或形成报告分子的一部分的蛋白质的聚集，非活性分子的数量也可能在测量设备的操作寿命期间增加。
无活性报告分子可以通过光学行为的变化来鉴定：他们未能在暴露于分析物分子时产生光学信号，或者它们在暴露于分析物分子时产生的光学信号与大部分报告分子明显不同。
在某些实施例中，多个报告分子是随机分布的。在某些实施例中，多个报告分子包含报告分子的聚集体。在某些实施例中，多个报告分子在一个或多个维度上包括规则的几何排序。在某些实施例中，每个报告分子与禁区相关联，在禁区内没有其他报告分子。
记录设备和显微镜
提供记录设备以记录来自报告分子的光学信号。在某些实施例中，来自报告分子的光学信号通过样品隔室的透明窗口。在某些实施例中，记录设备将是图像传感器，如相机。例如，CMOS(互补金属氧化物半导体)相机是可用的，因为它可以单独读取每个像素；另外，CMOS相机消耗非常小的功率，这允许它们在作为实地设备的一部分使用时持续更长时间。几乎所有智能手机相机都具有CMOS相机，许多具有超过1000万像素的分辨率，使得它们可用于本文披露的方法、系统和设备中。
在本披露的某些实施例中，记录设备允许观测来自样品隔室的一个或多个信号。在某些实施例中，多个信号中的每一个源自样品隔室的不同区。在某些实施例中，多个信号中的每个信号源自跨越样品隔室的规则几何网格中的像素。
在某些实施例中，记录设备的像素布置成长方形或正方形阵列。在某些实施例中，记录设备的像素布置成512x 512正方形阵列、1024x 1024正方形阵列、2048x 2048正方形阵列、或4096x 4096正方形阵列。在某些实施例中，来自每个像素的信号与所有其他像素分开记录。在某些实施例中，来自2x 2组像素的信号被分箱在一起。
测量设备可以允许观测来自多个报告分子的不同区的多个信号。在某些另外的实施例中，多个报告分子的不同区设置在规则网格中。可替代地，可以观测到来自基本上所有报告分子的单独光学信号而不受任何其他报告分子的干扰。
在某些实施例中，记录设备可以捕获单独像素和/或单独报告分子。使用等离激元纳米颗粒/量子点作为捕获元件功能化到其上的基底有利于此检测。与放大透镜结合使用，记录设备可以检测甚至更小的信号。此类透镜在本领域中是熟知的。
记录设备可以使用本领域中已知的任何技术来检测和定量报告分子/分析物复合物。记录设备可以使用与报告分子设计配对的光学吸收和发射方法。
记录设备可以进行光学吸收测量。例如，与报告分子的结合可以与在分析物存在下产生有色产物的酶联免疫吸附测定(ELISA)偶联。当将ELISA功能化到等离激元纳米颗粒或量子点上时，然后将通过例如吸收特征的波长、强度等来报告分析物的存在和数量；并且将产生来自每个纳米颗粒的信号而不是整体信号。
可替代地，光输出可包括通过光源激发、来自报告分子上或与报告分子偶联的荧光团的荧光发射。然后将通过荧光发射的强度报告分析物的存在和数量。荧光团可以在一表面，如光子晶体近侧，由此使得增强荧光发射。可以采用多个荧光团来将荧光信号调谐到期望的结果。因此，可以通过两个或更多个荧光团之间的激发转移来调节光学信号。
在本披露中设想了荧光和磷光量子产率、λmax偏移、和各向异性。对于各向异性测量，可以将偏振器引入到激发光学路径或发射光学路径、或两者中。光源可以与发射方法偶联。光源可以是常规的宽带光源、发光二极管、或激光，并且可以直接或经由波长选择设备(如光栅)递送到样品，以便优化激发。可以将光引导通过并入波导并形成报告表面的基部的全内反射组件，从而提供暗场激发。
在一些实施例中，光学测定介质可包括被配置用于表面增强拉曼散射(SERS)的表面。因此，光输出可以包括SERS表面上的报告分子对光源的拉曼散射。然后将通过拉曼散射的强度报告分析物的存在和数量。
对无活性报告分子的鉴定
本文提供了用于鉴定无活性报告分子的方法，称为“鉴定方法”。对于某些系统，将使两种溶液(第一种不含分析物，并且第二种具有高浓度分析物)与报告物表面顺序接触。应了解，这两种溶液将分别导致报告分子的分析物结合的不存在、和报告分子的分析物结合的近饱和。使用记录设备记录图像，并且在无分析物和分析物饱和条件的图像之间进行比较。将符合选择标准的报告分子标记为无活性。
在由于纳米颗粒聚集而失活的情况下，对无活性报告分子的鉴定将是直截了当的。聚集体的形成在目视检查来自记录装置的图像时将是明显的，并且不需要上面概述的“无分析物”和“分析物饱和”程序。
鉴定方法保持对报告分子在测量设备中的位置的记录。报告分子的位置可以通过x/y坐标，例如相对于测量设备中的适当几何网格、或相对于记录器设备上的像素坐标来提及。无活性报告分子的记录可以保持在非易失性计算机存储器上。
鉴定方法将提供用于将报告分子标记为无活性的标准。对标准进行设定以在消除使用中表现不佳的报告分子与保持足够高的报告分子计数以满足测量设备的特定准确度和灵敏度要求之间取得平衡。为了消除偏差、并实现自动化标记，可以基于观测到的光学信号的类型选择数值阈值。仅举例来说，某种报告分子在结合分析物分子时可能经历发射λmax的偏移，并且对于本实例中的大部分化合物，λmax偏移20纳米(nm)。可能选择5nm偏移的阈值用于该特定实例。
为了满足准确度和灵敏度的要求，可以选择数值阈值以排除一定分数的报告分子。参考先前的实例，对于95％的报告分子，可以观测到12nm的λmax偏移。然后可以选择12nm的阈值λmax以保留95％的作为活性的报告分子，并且丢弃5％的作为无活性的报告分子。
可以应用多种标准来分配无活性状态。重要的是，可以选择任何标准以将报告分子分配为无活性。由于任何一个报告分子的结合独立于所有其他报告分子，因此从活性报告分子库中消除报告分子不会影响剩余分子的行为。
如果需要，可以在测量设备的操作寿命期间周期性地重复上述鉴定方法。此做法对于性能易于随时间劣化的报告设备是特别有益的。理想地，鉴定方法需要最少量的操作员干预，其中测量设备自动化执行所有必需的步骤。对于基于纳米颗粒的报告分子的情况，可以周期性地记录图像，并且可以通过模式匹配软件鉴定可能随时间发生的任何聚集。
鉴定方法还可以包括使测量设备经受含有中等浓度的分析物的一种或多种溶液的步骤。这对于分析物的定量测量尤其重要，其中设想了一系列报告分子饱和度。通过使用跨越一系列分析物浓度的若干种溶液，可以构建校准曲线以更好地匹配光学报告数据与分析物浓度。
使用来自报告分子场的空间上可分辨信号的关键益处是记录设备的特别成问题的区可以同样标记，并在随后的分析中丢弃。这不仅包括无活性报告分子，即不当折叠的抗体的情况，而且还包括任何存在困难的区的情况。这可能包括来自两个或更多个紧密间隔的报告分子的重叠斑点，或者无论出于何种原因其游离状态和结合状态难以区分的报告分子。每个单独报告分子的结合独立于所有其他报告分子，并且丢弃一小组光学信号可以提高准确度或精度，而仅略微影响灵敏度。
准确度/精度/灵敏度
预期所披露的数字测量方法的准确度将至少与常规模拟方法的一样好。数字测量方法将最小化或消除若干个误差来源，根据定义，这些误差来源是低准确度的来源。举例来说，一个误差来源产生自无活性的报告分子：它们不与分析物分子结合，或与分析物分子结合但不能提供预期的光学信号。如果不考虑这任一情况，则会在分析物浓度的估计中引入误差，这是因为观测信号将低于预期的。
预期所披露的数字测量方法的精度将至少与常规模拟测量的一样好。观测来自全部报告分子的整体信号的常规方法可以在大多数但不是所有情况下使用各种统计和数值方法来提供精确估计值。
考虑如图3中所绘示的系统的系统，该系统含有包含发色团的报告分子的集合。观测到的整体信号的光谱偏移将是所有偏移(如果有的话)的平均值，并且对于小的分析物浓度可能非常小。此偏移可能难以辨别，特别是考虑到由于每个发色团周围的不同微环境导致的曲线变宽。
相比之下，使用数字分子测定，并且观测每个报告分子的光谱偏移，游离的报告分子将显示零偏移，而结合的报告分子将显示完全偏移。没有中间状态。当然，并非所有发色团都会偏移相同的值，但是可以在实地使用之前确定预期的值和范围。具有异常值的报告分子可以作为无活性丢弃。
预期所披露的数字方法的信噪比将至少与常规方法一样好。对于整体检测，较小浓度的分析物将导致较弱的整体信号。对于数字检测，较小浓度的分析物将导致较少数量的离散信号，每个离散信号具有相同的强度或值。
曲线拟合
如图8中的仿真所示的离散报告分子的单独信号适合可以提高信噪比的曲线拟合技术。来自每个活性报告分子的信号将落在基于先前对报告分子的了解可以构建理想化的无噪声曲线(对应于图8中的曲线)的光谱的两个区中的任一个中。由于每个报告物只能是游离的或结合的，因此可以将来自报告分子的观测信号分配为游离的或结合的。这与许多曲线拟合应用形成对比，对于这些曲线拟合应用，必须适应来自两个或更多个状态的信号的不同比率的叠加，以便对观测信号进行建模。
曲线拟合的一个实例如图13中所示。将以灰色示出的来自两个信号的发射相加，并仿真添加“噪声”以形成以黑色示出的净观测信号。信号类似于图7中所呈现的那些信号，并且图12中的垂直虚线对应于已对于图8讨论的在500nm处对不含分析物的和结合分析物的报告分子的相同描绘。在给定观测信号的情况下，曲线拟合技术可以估计经组合给出整体信号的单独信号。可以使用曲线拟合、以高准确度和精度的曲线拟合来评价包含少量良好分离的单独信号的观测信号。此外，由于结合的数字性质，即报告分子与分析物结合或不含分析物，因此单一报告分子只能提供对应于结合分析物状态和不含分析物状态的两种可能信号中的一种，而没有中间状态可能。在图12中所示的实例中，观测信号可以清楚地归因于两种报告分子，一种具有500nm之下的发射，并且另一种具有500nm之上的发射，这两种报告分子对应于结合分析物的报告分子和不含分析物的报告分子。该实验的数字特性将大大简化曲线拟合过程。
此外，可证明曲线拟合技术的使用有利于处理其光学信号不能在空间上分辨的两个或更多个报告分子。在信号无法相互分辨的两个报告分子的情况下，有四种状态是可能的：(a)两个受体均结合；(b)两个受体均游离；以及(c)和(d)：一个报告物游离(可以预期最后两个状态具有相似但不一定相同的光学信号)。此情况必然比单一报告分子更复杂；然而，与来自整体样品的光学信号相比，它仍然是非常易于管理的。
曲线拟合方法可用于处理光学信号在空间上被部分地分辨(即，来自两个或更多个报告分子的光学信号不均匀地散布在多个像素上)的两个或更多个报告分子。可以预期，此情形将比来自两个或更多个报告分子的恰好空间重叠更常见，特别是对于具有精细间隔的像素的记录设备。此情形可以受益于对来自紧密间隔像素的集合的单独光谱的集合与(部分重叠)斑点的特征谱的组合的曲线拟合，而不是对来自单一像素的单一光谱(或来自紧密间隔像素的集合的累加光谱)的曲线拟合。
结合等温线
结合的报告分子的计数与分析物的浓度之间的关系(称为“结合等温线”)是复杂和间接的。简而言之，随着游离分析物浓度的增加，结合的/总的报告分子的比率渐近地增加至1。(通常，与非常小浓度的报告分子相比，分析物过量存在，因此游离分析物浓度和总分析物浓度大致相等。在本讨论中将使用此近似值。)在任何给定的分析物浓度下，较高亲和力的报告分子将与较高比例的分析物分子结合。重要的是，报告分子总浓度仅是指活性报告分子。
图14中示出的是两条结合等温线曲线。水平轴对应于分析物浓度，并且垂直轴对应于结合的/总的报告分子的比率。曲线表示两条结合等温线，这两条结合等温线确定了在任何给定分析物浓度下的结合的/总的报告分子比率。对于每条曲线，随着分析物浓度增加，并且随着报告分子接近饱和，即几乎每个报告分子均与分析物分子结合，结合的/总的受体比率渐近地接近1。上部黑色曲线对应于较高亲和力的报告分子，并且下部曲线对应于较低亲和力的报告分子。清楚的是，报告分子对分析物的亲和力将在定量不同范围的分析物浓度下的分析物的容易度方面起重要作用。
在图14中，因为结合的/总的比率取决于分析物浓度，所以垂直轴(报告分子的结合的/总的比率)是因变量，并且分析物浓度是独立变量。出于分析目的，将图表反向使用；也就是说，结合的/总的比率是从实验中获得的，并且位于垂直轴上。根据图表和结合等温曲线，在水平轴上找到相应的游离分析物浓度。在视觉上，可以通过以下方式来理解此过程：从观测到的y轴上的结合的/总的比率到等温曲线绘制水平线，并且将垂直线下降到x轴，以便找到分析物浓度。(实际上，此过程是以数学或数字方式完成的；然而，误差分析仍然成立。)
图15对应于具有大约0.10的游离分析物浓度的样品，该游离分析物浓度对应于大约0.72的结合的/总的比率。此状况在结合等温线上指示为实心圆圈。将在垂直轴上对于结合的/总的比率“正确”确定的0.72水平地画线至结合等温线，并且向下画线至水平轴。此过程通过两个黑色箭头指示。低估约5％的结合的/总的比率的结果用两个灰色箭头示出，在结合等温线上具有相应的灰色圆圈。
图16对应于具有大约0.40的较高游离分析物浓度的样品，该游离分析物浓度对应于大约0.92的结合的/总的比率，并且同样在结合等温线上用实心圆圈标记出。与先前实例一样，用两个黑色箭头指示正确确定。同样用灰色箭头和灰色圆圈示出低估5％的结合的/总的比率。在此实例中，5％的结合的/总的比率低估导致分析物浓度的约40％的实质性误差。图15与图16之间的行为差异是由于在这两个图表中绘示的两个点处的结合等温线图的斜率不同，并且在较高浓度的分析物(其中结合等温曲线更平坦)下此误差传播将更严重。
利用分子结合来定量分析物的分析设备易受另一个误差来源的影响：在许多情况下，并非所有报告分子都对分析物的结合具有活性。这导致估计结合的/总的比率的误差，如上所概述，该误差可以传播到估计的分析物浓度的实质性误差。
举例来说，考虑一种测量设备，其中10％的报告分子是无活性的。报告分子的饱和将仅产生90％的预期最大信号，因为10％的报告分子不能提供光学信号(由于未能结合分析物，或者受体/分析物复合物未能产生光学信号)。对图15和16的检查将揭示特别是在较高分析物浓度下将引入到测量中的实质性误差。在某种程度上，可以通过在饱和条件下预先筛选测量设备来估计最大信号来解决此误差，该最大信号将用作未来测量的基准。然而，此程序并不理想，因为绝不可能实现完全饱和。
图14中示出的是两条结合等温线曲线。上部黑色曲线对应于较高亲和力的报告分子。使用此报告分子的优点是可以在相对低的浓度下实现几乎完全饱和：在0.40nM下，报告分子是90％饱和的。缺点是此报告分子可用于定量约0.10nM的较小浓度，因为如上所讨论的，结合等温曲线的平缓区产生显著误差。
相比之下，下部的浅曲线(对应于较低亲和力的报告分子)可用于定量较大范围的样品浓度，因为曲线在整个范围内相对陡峭。然而，报告分子在此范围内达到至多70％的饱和度，并且难以实现对应于100％饱和度的信号的确定。
本文披露的数字分子测定方法可包括样品稀释步骤，该步骤通过降低测量对结合的/总的报告分子浓度误差的易感性来提高估计分析物浓度的精度。举例来说，考虑上面讨论的样品，其结合行为在图15中绘示出。由于报告分子饱和度高，因此结合等温曲线在0.40的分析物浓度周围的区中非常平缓，并且因此对分析物浓度的确定易受结合的/总的报告分子浓度的甚至小误差的影响。如上所讨论的，通过数字测量使该比率更精确；然而，从一开始，优选对分析物浓度的测定不易受结合的/总的报告分子浓度误差的影响。
考虑对此样品四倍稀释的影响，即添加足够体积的溶质以使分析物的浓度从0.40降至0.10。作为此稀释的结果，结合行为现将通过图14表示。由于在0.10的新分析物浓度周围的区中的结合等温曲线较陡峭，因此对分析物浓度的确定更不易受结合的/总的报告分子浓度误差的影响。
数字测量的灵敏度特性使得样品稀释步骤成为提高精度的有吸引力的程序。容易清楚的是，在样品稀释时，结合的报告分子浓度的整体“模拟”测量的精度将受到影响。从图14转到图13，结合的报告分子浓度从0.92降至0.72，这表示结合浓度下降22％。与结合的报告分子浓度成比例的整体模拟信号的幅度将下降22％。此幅度的下降几乎肯定伴随着信噪比的增加，因为噪声的幅度将保持不变。因此，由于上述的结合等温线效应导致的精度增加将被由于在确定结合的报告物浓度中信噪比变差导致的精度降低所抵消。
相比之下，数字测量对稀释时信噪比的劣化更不敏感。如上所讨论的，结合的报告分子的计数减少会影响数字测量，这与模拟测量不同。在不是削弱模拟测量的整体信号并因此使信噪比变差的情况下，结合的报告分子的计数减少将仅减少由报告设备接收的离散光学信号的计数。重要的是，这些离散光学信号中的每一个的强度将保持不变。
由于此原因，如上所述提高精度的稀释方法不会伴随由于模拟信噪效应导致的精度降低，并且因此证明对数字测量是有益的。测量方法可包括在引入到测量设备之前预稀释样品的步骤。可替代地，在报告分析物浓度之后，测量方法可以向用户指示样品的重复测量将提高精度，并且可以进一步通知用户所推荐的稀释水平。
测量方法可以包括对样品的快速预筛选，该预筛选被优化以快速提供分析物浓度的低精度估计值，以便建议最佳的稀释。
在为所披露的方法设想的许多用途中，已经建立了对应于临界值的阈值或截止值。这些阈值或截止值可以对应于环境法规定的监管水平、或对应于某些健康状况的关键生物标记物水平。测量方法可以调整所推荐的扫描参数和稀释水平，以便提供足以满足预期用途的测量条件。
在某些实施例中，测量设备可以提供用于自动稀释样品的机构。此举可以通过喷射一定分数的现有样品，然后引入溶质进行稀释来完成。此举也可以通过引入已经用溶质预稀释的新样品来完成。
在某些实施例中，所推荐的稀释水平可以通过计算设备计算，该计算设备并入到测量设备中或连接到测量设备。计算设备可以经由界面(如显示器、打印输出、或合成语音报告)向操作员提供所推荐的稀释水平。计算设备还可以直接控制测量设备以执行自动化分析稀释样品所需的任何步骤，而无需用户干预。
在某些实施例中，阈值或截止值可以在计算设备中预先设定，该预先设定呈固件的形式(该固件在阈值或截止值变化的情况下可任选地更新)，或者呈软件的形式。此外，操作软件可以提示用户对正在测量的样品的进一步输入。例如，在测量生物标记物的情况下，用户可以输入受试者的历史参数，如年龄、体重、性别等，这些历史参数可能改变阈值或截止值并且因此可以影响给定测量所要求的精度。
实例
本发明进一步通过如下实例说明。
实例1：等离激元夹心免疫测定
在此描述了数字分子测定在双抗体免疫测定形式中的一种实施方式。双抗体免疫测定广泛用于经典临床测定中，并且可以容易地获得用于此应用的标准抗体对。对于检测，将经由夹心免疫测定中的分析物变为有联系的金属纳米颗粒之间的等离激元耦合提供了对分析物分子与颗粒的结合的稳健读出。等离激元耦合提供了很大的优势，因为耦合颗粒的散射波长可以与单独颗粒散射波长显著不同，从而导致在单一颗粒水平下通过颜色容易辨别的明显颜色变化-甚至在手机相机上。
在此实例中，球形金纳米颗粒(例如直径在10nm与100nm之间)可以很好地起作用。出于本发明的目的，无标记检测是不必要的，并且通过二级金属纳米颗粒作为信号增强剂实现了检测。这涉及另一纳米颗粒(金)通过第二抗体的结合，该结合导致两个纳米颗粒之间的等离激元耦合，从而导致显著的光谱偏移。此策略已被用于检测蛋白质和DNA分子的构象变化，并且能够实现对使用简单相机(如手机上可用的相机)获取的图像中的单一分析物结合的容易检测。由于第二纳米颗粒导致的增强的颜色变化取决于第二纳米颗粒的大小以及纳米颗粒之间的有效距离。在我们的测定中预期的颗粒间间距(抗体I-分析物-抗体II)将是20-30nm并且是在有效等离激元耦合的限值内。虽然我们典型地使用40nm金纳米粒子，但等离激元耦合随颗粒间距离的指数衰减对第二纳米颗粒大小的依赖性(即，与较大的纳米颗粒相比，较小的纳米颗粒显示出等离激元耦合的快速减小)进一步允许通过使用大的金纳米颗粒微调光谱偏移。
暗场成像是在测定中监测来自单独颗粒对的散射光的一种适当方式。暗场显微法是一种光学技术，其中样品不直接被照射。而是，将散射光用于物体的可视化，该散射光产生近黑色背景强度，从而导致对象与背景之间的对比度大大增强。实际上，纳米等离激元材料产生大量光子而没有闪烁或光漂白(破坏常规生物传感测定中常用的基于荧光的检测的现象)，因此能够通过简单的光学设置观测单独颗粒。
数字分子测定的关键是对视野中每个颗粒的单独评价。这可以通过多种方式实现，但是一种方式涉及之前和之后图像比较，其中将捕获颗粒首先(随机地或以图案形式)排列在基底上。在引入提供“之前”信息的样品之前对排列颗粒进行成像。接着将样品与二级标记抗体一起流入室中。在成功的分析物捕获中，二级标记颗粒将与捕获颗粒缔合，从而导致亮度和颜色的明确变化。将对之前图像中的每个粒子进行表征以确定它具有单一捕获颗粒的预期亮度和颜色。在随后的分析中将忽略任何聚集或以其他方式改变的颗粒。在分析物捕获后，分析良好捕获颗粒位置处的所有对象图像。利用用于图像解释的统计标准来区分失败的捕获(例如聚集的或非特异性结合的颗粒)与未载分析物的捕获。通过包括作为基准标记的非功能化颗粒来增强背景分析和误差校正。这些可以用于感测溶剂的成功渗透、空气暴露、或可能使颗粒场的一部分不可用的多种其他失败模式中的任一种。在整体测定中，这些种类的误差仅会使信号降质。但是在数字分子测定形式中，可以提前去除此类误差。实际上，在许多单分子荧光成像实验中，由于各种原因，视野的大区域通常是不可用的，但是在其间具有大量良好分子的情况下，实验仍然可以成功地进行。
实例2：等离激元杂交测定
在上述实例的变型中，将表面结合的核酸探针的杂交与纳米颗粒之间的等离激元耦合组合，以提供用于核酸分析物的数字分子测定。用其上已附接了第一纳米颗粒的第一寡核苷酸修饰表面。表面修饰可以通过非共价吸附、或通过共价结合执行。选择第一寡核苷酸的序列以与包含在所希望分析物核酸中的第一互补序列杂交。然后，修饰表面的暴露诱导分析物与第一短寡核苷酸序列的杂交。此时，引入其上添加了第二纳米颗粒的第二寡核苷酸。选择第二寡核苷酸的序列以与包含在所希望分析物核酸中的第二互补序列杂交，其中第一互补序列和第二互补序列彼此充分分开以允许第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列的同时杂交。
由分析物核酸与第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列杂交引起的超分子组装可以设计成使第一纳米颗粒和第二纳米颗粒紧密接近，如对上文所述的夹心免疫测定那样。尽管对于此系统的成功设计来说不是严格必需的，但是杂交的分析物核苷酸采用规范的螺旋结构将简化分子几何结构，并且有利于选择如序列长度和与纳米颗粒附接的性质和位置的参数。
本申请中引用的所有参考文献、专利或申请(美国或外国)均通过援引特比并入，如同本文以其全文书写一样。在出现任何不一致的情况下，以本文字面上披露的材料为准。
通过以上的说明，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特征并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以对本发明作出不同变化和修改，以使它适应不同用途和条件。

Claims (65)

1.一种用于确定样品中至少一种分析物的存在或浓度的方法，该方法包括：
在由与至少一种类型的分析物分子一起孵育的至少一种类型的光学报告分子发出的多个信号的图像中，
对于每种类型的光学报告分子，通过单独地分辨结合的光学报告分子和未结合的光学报告分子来确定该图像中与分析物分子结合的离散光学报告分子(“结合的光学报告分子”)的数量和未与分析物结合的离散光学报告分子(“未结合的光学报告分子”)的数量；并且，
根据该结合的光学报告分子的数量将分析物的存在或浓度确定为占光学报告分子总数量的分数、或确定为与占光学报告分子总数量的分数成比例。
2.如权利要求1所述的方法，其中这些光学报告分子排列在报告表面上。
3.如权利要求2所述的方法，其中这些光学报告分子随机地排列。
4.如权利要求2所述的方法，其中这些光学报告分子以图案排列。
5.如权利要求2所述的方法，其中该结合的光学报告分子的分数是根据在引入该样品之前记录的未结合的光学报告分子的数量确定的。
6.如权利要求5所述的方法，其中该至少一种分析物的浓度被确定。
7.如权利要求6所述的方法，其中该样品是生物样品或化学样品。
8.如权利要求7所述的方法，其中该分析物选自：
·核苷酸序列；以及
·抗原。
9.如权利要求8所述的方法，其中该光学报告分子包含选自以下的捕获元件：
·结合该分析物的一种或多种核苷酸序列；以及
·结合该分析物的抗体或其片段。
10.如权利要求9所述的方法，其中每个光学报告分子包含等离激元纳米颗粒。
11.如权利要求10所述的方法，其中该光学报告分子包含功能化在一个或多个等离激元纳米颗粒上的一种或多种核苷酸序列。
12.如权利要求10所述的方法，其中该光学报告分子包含功能化在一个或多个等离激元纳米颗粒上的一种或多种抗体。
13.如权利要求11或权利要求12所述的方法，其中来自该光学报告分子的该信号选自：
·光的波长；
·信号的强度；
·亮度；
·信号或光谱的形状；以及
·光谱带的存在或不存在。
14.如权利要求13所述的方法，其中一种信号在分析物与该光学报告分子结合时产生。
15.如权利要求14所述的方法，其中一种信号在分析物与该光学报告分子结合并且第二报告分子与该分析物结合时产生。
16.如权利要求15所述的方法，其中由该结合的光学报告分子和该未结合的光学报告分子产生的这些信号是不同的。
17.如权利要求16所述的方法，其中这些结合的光学报告分子和未结合的光学报告分子通过以下方式来单独地分辨：
·光谱中心在指定波长之上或之下的偏移；
·该信号的大小或强度的变化；
·亮度的增加或减小；
·该信号的形状的变化；
·光谱带的存在或不存在；以及
·光谱的形状的变化。
18.如权利要求17所述的方法，其中由该光学报告分子发出的该信号是光的波长。
19.如权利要求18所述的方法，其中这些结合的光学报告分子和未结合的光学报告分子通过光谱中心在指定波长之上或之下的偏移来单独地分辨。
20.如权利要求19所述的方法，其中将这些光学报告分子中的至少一些附连至表面(该报告表面)上，由此使得每个附连的光学报告分子是空间上可分辨的。
21.如权利要求20所述的方法，其中这些附连的光学报告分子以网格或近似网格排列。
22.如权利要求21所述的方法，其中每个附连的光学报告分子可分辨为记录设备的一个像素。
23.如权利要求21所述的方法，其中活性光学报告分子和无活性光学报告分子发出不同的光学信号。
24.如权利要求23所述的方法，其中该方法确定该图像中与分析物分子结合的离散活性光学报告分子(“结合的活性光学报告分子”)的数量和未与分析物结合的离散光学报告分子(“未结合的活性光学报告分子”)的数量。
25.如权利要求23所述的方法，其中该样品的非均匀照明不影响该对分析物的存在或浓度的确定。
26.如权利要求25所述的方法，其中该图像是在已知照明波长下记录的。
27.如权利要求25所述的方法，其中将该图像中的任何点处的结果相对于该已知照明标准化。
28.如权利要求23所述的方法，其中将在发射波长下测量的强度通过图像中相同位置处的激发波长下的照明强度标准化。
29.如权利要求23所述的方法，其中记录该图像的传感器的一个或多个区段中的缺陷不影响该对分析物的存在或浓度的确定。
30.如权利要求23所述的方法，其中使用了一种类型的光学报告分子。
31.如权利要求30所述的方法，其中使用了多于一种类型的光学报告分子。
32.如权利要求31所述的方法，其中该方法采用夹心型测定。
33.如权利要求32所述的方法，其中将第一类型的光学报告分子附连至表面(该报告表面)上，由此使得每个附连的光学报告分子是空间上可分辨的。
34.如权利要求33所述的方法，其中该第一类型的光学报告分子包含功能化在等离激元纳米颗粒上的针对分析物的捕获元件。
35.如权利要求34所述的方法，其中第二类型的光学报告分子与该样品一起或在该样品之后添加。
36.如权利要求35所述的方法，其中该第二类型的光学报告分子包含功能化在等离激元纳米颗粒上的针对该分析物的捕获元件。
37.如权利要求35所述的方法，其中该分析物是抗原。
38.如权利要求36所述的方法，其中每个光学报告分子包含作为该捕获元件的抗体或其片段。
39.如权利要求35所述的方法，其中该分析物是核苷酸序列。
40.如权利要求39所述的方法，其中每个光学报告分子包含作为该捕获元件的与该分析物核苷酸序列互补的一种或多种核苷酸序列。
41.如权利要求1所述的方法，其中该方法在包括移动设备的数字分子测定系统上执行。
42.一种用于确定样品中抗原的存在或浓度的方法，该方法包括：
在由与抗原一起孵育的至少一种类型的包含抗体的光学报告分子发出的多个信号的图像中，通过单独地分辨结合的光学报告分子和未结合的光学报告分子来确定该图像中与抗原结合的离散活性抗体(“结合的活性抗体”)的数量和未与抗原结合的离散活性抗体(“未结合的活性抗体”)的数量；并且，
根据该结合的活性抗体的数量将抗原的存在或浓度确定为占活性抗体总数量的分数、或确定为与占活性抗体总数量的分数成比例。
43.一种用于确定样品中靶核苷酸序列的存在或浓度的方法，该方法包括：
在由以下发出的多个信号的图像中：
a)包含与该靶核苷酸序列的第一部分互补的第一捕获核苷酸序列的光学报告分子，以及
b)包含与该靶核苷酸序列的一部分互补的第一捕获核苷酸序列的该第一光学报告分子和包含与该靶核苷酸序列的第二部分互补的第二捕获核苷酸序列的第二光学报告分子，该第一光学报告分子和第二光学报告分子与该靶核苷酸序列结合(“结合复合物”)，
确定与包含该第一部分和该第二部分的该互补核苷酸序列的光学报告分子结合的离散靶核苷酸序列(“结合复合物”)的数量；
将该靶核苷酸序列的存在或浓度确定为结合复合物的数量占发出可检测信号的光学报告分子总数量的分数、或确定为与该结合复合物的数量占该总数量的分数成比例。
44.一种用于确定样品中分析物的浓度的数字测定系统，该数字测定系统包括：
·图像传感器；
·能够显示图像的屏幕；
·微处理器；
·存储器；
·图像分析软件，该图像分析软件存储在该存储器中并且由能够分析由该图像传感器捕获的数据和数字分类数据的该处理器可执行；以及
·任选地，通信接口。
45.如权利要求44所述的数字测定系统，其中该图像传感器能够作为暗场显微镜的一部分操作。
46.如权利要求45所述的数字测定系统，其中该图像传感器是百万像素相机。
47.如权利要求46所述的数字测定系统，其中该图像传感器是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机。
48.如权利要求46所述的数字测定系统，该数字测定系统另外包括光或其他电磁辐射的源。
49.如权利要求47所述的数字测定系统，其中该光源包括发光二极管(LED)。
50.如权利要求49所述的数字测定系统，该数字测定系统另外包括任选地可移除的样品室。
51.如权利要求50所述的数字测定系统，该数字测定系统另外包括
·由玻璃或聚合物制成的报告表面，该报告表面的一侧已附连包含用捕获元件功能化的等离激元纳米颗粒的光学报告分子；以及
·适合于暗场显微镜法的波导，该波导与该报告表面的相反侧接触。
52.如权利要求44所述的数字测定系统，其中每个附连的光学报告分子是空间上可分辨的。
53.如权利要求52所述的数字测定系统，其中这些附连的光学报告分子随机地排列。
54.如权利要求53所述的数字测定系统，其中这些附连的光学报告分子以网格或近似网格排列。
55.如权利要求52所述的数字测定系统，其中每个附连的光学报告分子可分辨为记录设备的一个像素。
56.如权利要求44-55中任一项所述的数字测定系统，其中该捕获元件选自：
·结合该分析物的一种或多种核苷酸序列；以及
·结合该分析物的抗体或其片段。
57.如权利要求56所述的数字测定系统，其中该分析物是抗原。
58.如权利要求57所述的数字测定系统，其中每个光学报告分子包含作为该捕获元件的抗体或其片段。
59.如权利要求56所述的数字测定系统，其中该分析物是核苷酸序列。
60.如权利要求59所述的数字测定系统，其中每个光学报告分子包含作为该捕获元件的与该分析物核苷酸序列互补的一种或多种核苷酸序列。
61.如权利要求56所述的数字测定系统，其中该微处理器、存储器、图像传感器、软件、能够显示图像的屏幕、以及通信接口全部包括在单一便携式设备中。
62.如权利要求61所述的数字测定系统，其中该通信能力是无线的。
63.如权利要求62所述的数字测定系统，其中该单一便携式设备选自智能电话和平板计算机。
64.如权利要求63所述的数字测定系统，其中该单一便携式设备是智能电话。
65.如权利要求44-55中任一项所述的数字测定系统，该数字测定系统另外包括用于将该智能电话、样品室、和光源定位成彼此紧密且稳定地接近的壳体。
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