JPH07503795A - フローサイトメータにおいて粒子カウントの決定に用いる方法および材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５、上記粒子を細胞試料中の細胞に付着しないように処理しであることを特徴と する請求の範囲ｌ記載の方法。

レセプターに結合することを必要とする。ウィルスは細胞に進入し、この外皮ま フローサイトメータにおいて粒子カウントの決定に用いる方法および材料本発明 は、２種以上の異なる粒子を含む流体中に懸濁された粒子の単位容積あたりの総 数を正確に測定する方法に関する。さらに特に、本発明は、フローサイトメータ システムで血液細胞の単位試料容積あたりの血球カウントを決定することに関し 、ここでフローサイトメータは分析している試料を含む懸濁液の容積を評価せず かつ関連する血液細胞はＣＤ４１Ｊンパ球である。さらに、本発明は、試料を分 析する間品質制御チェ’７りとして加えられた粒子の使用に関する。

現在一般にヒト免疫不全ウィルス（ｒｆ（ＩＶＪ）と称せられるＨＴＬＶＩＩ■ 即ちヒ）Ｔ細胞白血病ＩＩＩ型ウィルスは、ヒト免疫不全症候群またはエイズの 原因物質であると認識されている。アメリカ合衆国および他の国々において取り 上げられている流行性と考えられているエイズの慢性の性質が、ヒトの末梢血液 中のウィルス抗原およびこのような抗原に対する抗体を確実に一貫して検出する ため診断免疫検出法を開発するための過度の（ｓｕｒｆｅｄ）努力および研究に より熟考されている。著しい方法で、モノクローナル抗体手法がこのような免疫 検出法を開発するため記録されている。

ＨＩ　Ｖは、レトロウィルス群のウィルスに属する。レトロウィルスは、ポジテ ィブストランディノド（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）　ＲＮＡおよび 、ウィルスＲＮＡをＤＮＡに転化するのに用いられる逆転写酵素と称せられる特 定の酵素を核中に保持する。これは、ＤＮＡをＲＮＡに転写する細胞転写の古典 的方法を転換する（ｒｅｖｅｒｓｅ）。

ＣＤ４リンパ球の表面のタンパク質か１１１　Ｖに対するレセプターまたは結合 部位として作用するため、ＨＩ　ＶかＣＤ４リンパ球に結合することは知られて いる［Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ　ＡＧ等、Ｎａｔｕｒｅ　３１２＋７６３−７６７　 （１９８５）　］　、また、ＨＩＶは、他の細胞、例えば単球、組織マクロファ ージ、並びに脳、を髄および末梢神経中の細胞に結合し、攻撃することができる 。ＨＩＶのライフサイクルは、ウィルスがホスト患者中に例えば性行為または輸 血を介して進入し、次に単球およびリンパ球上のウィルスＲＮＡ核をＤＮＡに転 化し、これはホスト細胞ゲノムに含まれる。ホスト細胞の膜が破壊されて新たな ウィルス粒子がヒト血液系中に放出されるまで、新たなウィルス粒子が一定量で 生成する。

現在モノクローナル抗体を用いて、ヒトがエイズ疾患にががっているがまたはそ のウィルスに免疫学的に露出されているかを判断することができる診断検ｉは商 業的に入手しつる。疾患の高い感染性および現在その治癒が科学的可能性の範囲 内にないという事実は、生存ウィルスおよびヒト免疫系に対する悪影響を、好結 果か得られる診断試験を開発することができるように研究することの困難性を増 す。

現在、絶対ＣＤ４カウントは、臨床ＨＩ　Ｖ疾患の進行の一般に受け入れられた 予測である。この測定の現在の方法は、多段階試料調製を必要とし、ＣＤ４リン パ球の割合と絶対リンパ球ノ功ントとの両方を決定することに関する累積的誤差 ををすることか知られている。この問題を解決するために試みられた１つの方法 は、１９９１年６月１９日のイタリア国フローレンスにおける第７回エイズ国際 会議における「ポスター」に示された。しがし、開示された方法は不完全であっ た。この理由は、方法を教示せず、方法を実施することを可能とじなかったため である。

同様に、他のものは、２種以上の望ましくない粒子を含む流体中に懸濁された粒 子の単位容積あたりの細胞カウントを測定することの一般的問題を解決するため 異なる方法および装置を提供しようと試みた。１つの方法は、ｃｒｏｎｅｒの米 国特許第４．９８９．９７８号明細書に記載されている。しがし、この方法は、 細胞および不所望な粒子の所定の既知の容積を分析して不所望な粒子の容積を最 初の所定の容積から減じて単位容積あたりの細胞の正確なカウントを提供しなけ ればならないことを必要とする。

さらに一般的に、他のものは、試験を行い、フローサイトメトリー装置の較正を 行う方法で種々の希釈剤に複数の粒子を添加した。従来技術がこのような開示を 多く含むが、このような例の２つは、ＲｅｃＬｅｎｗａｌｄ等の米国特許第４． ７０４．８９１号およびＲｙａｎの米国特許第４．３３１．８６２号である。さ らに、分析前に標準粒子を細胞懸濁液に加えることにより、「ビルトイン」基準 マークを設け、これを用いて種々の装置条件下で得られた分布に相関させること ができる。Ｆｌｏｗ　ＣｙＬｏｍｅＬｒｙ　ａａｄ　Ｓｏｒｔｉｎｇ、　Ｊｏｔ ＋ｎ　ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ出版社、１９７９において、このビルトイン手 法は、Ｊｅｎｓｅｎ等、ＭｕｌＬｉｐａｒａｍｅＬｅｒ　Ｆｌｏｗ　ＣｙＬｏｍ ｅｔｒｙ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｔｏｗａｒｄ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ@ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ　５ｑｕａＩＩｏｕｓ　Ｃｅ１ｌ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａにより 教示されている。１９７７年５月６〜７日のＡｕＬｏ＋ａａＬｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｃｙｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｉｍａｇｅ　Ａｎａｌｙｓ ｉｓの自動化についての第２回国際会議議事録。しかし、これらの一般的な文献 は、試料容積あたりの細胞カウントの測定の問題を記載していない。

本発明において、分析している試料を含む懸濁液の容積を測定しない装置で細胞 試料の容積あたりの細胞の総数を探知する方法を提供し、上記方法は：ａ）第１ 先散乱信号を有する既知の量の粒子を、第１光散乱信号とは異なる第２先散乱信 号ををする既知の量の粒子と混合して試料容積あたりの粒子の一定の１度を有す るｌＪｉ＆を得：ｂ）上記細胞懸濁液の未知の容積部分の上記粒子および細胞の 各々を光線を通過させ、上記粒子および細胞に少なくとも１つの前進光散乱パタ ーンを生じさせ、Ｃ）上記懸濁液の上記未知容積部分の細胞数および粒子の数を 既知方法でカランｌ−Ｌ；ｄ）懸濁液の上記部分における粒子および細胞の数を 、上記細胞試料に添加した粒子の既知の皿に相関させることにより、試料の容積 あたりの細胞の全数を決定することを特徴とする。

本発明は、分析している試料を含む懸濁液の容積を測定せず、最初の全体の既知 容積を分析しない装置で細胞試料の単位容積あたりの全細胞数を正確に測定する 方法に関する。細胞のカウントを別個の粒子のカウントと相関させて最初の容積 あたりの細胞のカウントを決定する。本方法は、細胞を感知するため光散乱トリ ガーを用い、関連する細胞および添加した別個の粒子をカウントし、同じく関連 する細胞と添加した別個の粒子とを識別するため光散乱と蛍光の二目盛分析（ｔ ｗｏ　５ｃａｌｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用する。さらに好ましい例において 、関連する細胞を、蛍光モノクローナル抗体で標識する。

−例において、この方法は、既知量の別個の粒子の懸濁液を既知容量の細胞試料 と混合して試料容積あたり一定濃度の粒子を含む懸濁液を得；上記懸濁液の一部 分の細胞および粒子の数をカウントし；試料の単位容積あたりの細胞の全数を決 定することを含む。

一例において、この方法は、既知量の別個の粒子の懸濁液を既知容量の細胞試料 と混合して試料容積あたり一定１度の粒子を含む懸濁液を得；上記懸濁液の一部 分の細胞および粒子の数をカウントし；試料の単位容積あたりの細胞の全数を決 定することを含む。上記決定は、上記部分のカウントした細胞かける懸濁液中の 粒子の上記既知量の数対試料容積かける上記部分中のカウントした粒子の数を相 関させることにより得られる。

他の例において、本発明の方法は、第１光散乱信号を有する既知量の粒子の懸濁 液を、第１光散乱信号とは異なる第２光散乱信号を有する既知の容量の細胞試料 と混合して試料容積あたり一定濃度の粒子を有する懸濁液を得；上記の粒子およ び細胞のそれぞれを上記細胞懸濁液、順次光線に通し、各上記粒子および細胞は 少な（とも１つの前方光散乱パターンを発生し；上記懸濁液の部分の細胞および 粒子の数をカウントし；試料の単位容積あたりの細胞の総数を、上記細胞試料に 加えられた粒子の既知の量に粒子および細胞の数を相関させることにより決定す ることを含む。

この方法を用いることにより、細胞試料に、細胞の処理により行われる１つ以上 の容積希釈処理を施すことができる。さらに特に、最初の細胞試料容積が既知で ある場合には、細胞試料は分析することができるか、スティンまたはモノクロー ナル抗体によりタグ化された関連する細胞を持つかまたは最初の細胞試料容積を 未知の容積に希釈するような他の方法を施すことができる。

さらに、本発明は、カウンティング装置の操作パラメータが明細書（ｓｐｅｃｉ ｆｉｃａＬｉｏｎ）内であることを確実にしてすべての望ましい粒子を正確に感 知し、一方間時に細胞懸濁液の単位容積あたりのカウントを決定する品質制御方 法を提供する。

細胞試料と一緒に蛍光粒子を用いることより、フローサイトメータは粒子および 細胞が光散乱および蛍光により分析されるように設定したパラメータに対し作動 する光散乱を用いることができる。細胞および粒子が分析中光散乱および蛍光に より感知される場合には、フローサイトメータが試料の分析中適切に作動してい たことが確かめられる。

好適例において、本発明の方法はさらに、粒子の上記光散乱パターンおよび蛍光 信号を、最小装置性能（ｍｉｎｉ＋ｍｕｍ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　ｐｅｒｆｏ ｒｍａｎｃｅ）のしきい値を示す所定の比率に対して相関させ、所定の比率が得 られない場合には、上記装置の操作を調節し、この間粒子は、測定された比率か 上記所定の比率に到達するまで入射光内にあり、これにより装置が細胞懸濁液中 の粒子および細胞を分析する付加的工程を含む。

分析されている試料を含む懸濁液の容積を測定しない装置において細胞試料の単 位容積あたりの細胞の総数を決定するために、既知の容積の試料を用いて開始す ることが必要である。単位容積あたりの細胞カウントを決定する正確さは部分的 に、試料容積の測定の正確さに部分的に依存する。

単位容積あたり関連する細胞の数を迅速に得るために、全血を溶解し、当業者に 知られている方法により、赤血球を除去することが好ましい。これらの方法は、 低浸透圧溶解、酸溶解、並びに磁性粒子または異質細胞集団から選択された集団 を分類し分離するため抗体でＶｉ覆したミクロスフイアを用いることを含む。溶 解方法の選択の唯一の制限要因は、白血球の完全性を保存することである。さら に特に、本発明の好適例において、全血の溶解の好ましい方法は、クールター社 のエビソクス　ディビジョンにより供給されるクールター（登録商標）イムノプ レツブ　エビソタス（登録商標）による方法である（クールターおよびエピツク スは、アメリカ合衆国バイアレア州フロリダ所在のクールター社の登録商標であ る）。当業者に知られているように、この好ましい溶解方法は、低浸透圧溶解で ある。

フロー９イトメータが全血中の関連する白血球および赤血球との間の区別が可能 であるが、全血試料の評価は、光散乱トリガーを用いる際には分析するのに長時 間を必要とする。長時間は、赤血球および白血球の両者を分析しなければならな い→ノ゛イトメータにより決まる。さらに特に、正常の血液中の白血球のカウン トは、リンパ球の！１２０〜４０％でマイクロリットル（μＬ）あたり５．００ ０〜１１．０００であり、赤血球はマイクロリットル（μＬ）あたり４．　００ ０．　０００〜ｓ、ｏｏｏ、ｏｏｏである。従って、ｓ、ｏｏｏのリンパ球のカ ウントを数えるために、約１千万〜３千万の細胞を分析する。

全血を溶解した後、残りの白血球を次に、当業者に知られている方法により同定 する。このような同定手段には、染色、リガンド、プローブおよびモノクローナ ル抗体が含まれる。染色、リガンド、プローブまたはモノクローナル抗体の選択 により、関連する選択された白血球の細目を同定し迅速な方法により正確に識別 することができる。

細胞試料の最初の容積を測定した後、知られている数の別個の粒子を、随意に溶 解し、標識した関連する白血球を同定した血液試料に加える。

当業者に知られている生物学的および可塑性別個粒子を本発明において用いるこ とができる。別個粒子は、希釈される担体並びにカウントする装置の試験プロー ブに関して不活性である必要がある。さらに、別個粒子は０〜３０℃の普通の作 業温度において安定でなければならない。不安定粒子は、ヒストグラム位置でシ フトする傾向があり、試料容積あたりの細胞の測定に対して不明確に寄与する。

本発明の重要な特徴は、粒子が関連する細胞に類似する性質の特徴を有する必要 がないことである。さらに特に、粒子は関連する細胞の容積、大きさ、蛍光、光 散乱、インピーダンス、またはクールター不透明性を再現する必要がない。細胞 の特徴と異なる特徴を有する粒子を用いると、細胞の数の重複が除去されて誤っ たまたは不正確の結果を発生させる。

好ましくは、別個粒子の密度は細胞の密度に近くなければならない。さらに特に 、粒子の密度は１．　０グラム／ミリリツトルより大きくなければならない。こ れは好都合である。この理由は、密度が試料中の細胞と実質的に不均衡である場 合には、別個粒子が、すぐに分析されない場合に試料中に沈降する傾向があるか らである。このように、別個粒子が細胞の密度と実質的に不均衡である場合には 、不均一な混合物を分析することができず、これは単位容積あたりの細胞の数の 不正確な決定の一因となる。従って、粒子の密度が細胞試料の密度と２０％以上 異なる場合は、細胞−粒子懸濁液を調製の３０分以内に分析しなければならない 。さらに好ましくは、粒子の密度は、細胞と５％未満で異ならなければならず、 細胞−粒子懸濁液を調製して４時間以内に分析しなければならない。

本発明の好ましいタイプの粒子はプラスチック微小球である。このような小球は 、はぼ均一な直径で製造するのがよく、発蛍光剤または他のマーキング剤が表面 に結合するのに適する表面特性を有するのがよい。０゜５〜２０μの直径を有す るほぼ球形の小球を形成することができる。小球は通常固体形態でつくられるが 、これらは内側が中空であり小嚢または他の微小担体とすることができる。さら に、小球は、本発明においての作用をするために、完全な球形である必要はない 。プラスチック材料例えばポリスチレン、ポリアクリルアミドおよび他のラテッ ス材料を用いて小球をつくることができ、また他のプラスチック材料例えばポリ 塩化ビニル、ポリプロピレン等も用いることができる。

プラスチック粒子を用いる場合には、これらを処理して、プラスチック粒子が細 胞−粒子試料中の細胞に接着するのを防止し、かつプラスチ・ツク粒子が互いに 凝集するのを防止する必要がある。これらの２つの障害を除去して粒子が別個の ままであり、正確に区別することができるようでなければならない。

プラスチック粒子が、関連する細胞に接着することを防止するために、粒子をこ の傾向を解消するような物質でＶｉｉするのがよい。このような物質には、ウシ 血清アルブミン、糖脂質、ポリビニルピロリドンまたはプラスチック粒子の生化 学反応性を変化させて関連する細胞に結合させないようにする他の物質が含まれ る。本発明の目的のため、ウソ血清アルブミンを用いるのが好ましい。

プラスチック粒子の凝集は、別個プラスチック粒子の表面変化に起因すると考え られる。この現象は、前記被覆処理により解決することができることを見出した 。しかし、さらに、担体のｐＨが凝集問題の解決に寄与すると考えられる。さら に、非イオン性活性剤を用いることがこの問題の解決に寄与すると考えられる。

粒子の貯蔵および懸濁液の媒質として用いられる担体は、選択された粒子材料お よびカウンティング装置のタイプに化学的および物理的に適合しなければならな い。従って、導電性の変化を用いてカウントを計算するこれらのカウンティング 装置で用いるためには、担体は導電性でなければならない。導電性の原理を用い るカウンティング装置を使用する当業者は、担体の導電率は、装置の示したカウ ントに大きく影響することかわかる。従って、担体の標準の導電率が用いられ、 塩化ナトリウムの０．８％等等モル塵の導電率である。

一方、光散乱原理を用いるこれらのカウンティング装置に関して、担体は、光学 的に伝導性である（または透明、即ち極めて低い吸収係数を有する）必要がある 。しかし、光散乱原理を用いるカウンティング装置を用いる当業者は、あるプラ スチック粒子、例えばＤＮＡチェックビーズを用いる際に、これらは凝集する傾 向があることがわかる。前記したように、凝集は別個のプラスチック粒子の静電 気的引力に起因し、これは担体中の塩１度に関連する。従って、このような粒子 を光散乱装置に用いる際には、担体はプラスチック粒子の凝集を発生させない。

本発明の好適例において、担体は加えられた別個粒子の密度に等しいかまたはこ れより大きくなければならない。好ましくは、担体の密度は０〜１５％であり、 さらに好ましくは別個粒子の密度より０〜５％大きい。担体密度が別個粒子と実 質的に不均衡である場合には、粒子は担体溶液の底に沈むかまたは上部に浮く傾 向があり、この結果、不均質粒子懸濁液となる。均質な粒子懸濁液は、既知のカ ウントの粒子を細胞試料に加える操作を容易にするのに望ましい。

さらに好ましくは、担体はグリセロールの水溶液を含み、最も好ましくは１７〜 ２１容量％の水溶液を含む。しかし、当業者に知られているように、他の既知の 媒体、例えばスクロース、フィコールハイバック（登録［１）　（７アマシアＬ Ｋ、Ｂバイオテクノロジー製）およびパーコール（登録商標）（ファマシアし、 　Ｋ、Ｂバイオテクノロジー製）を用いて担体密度を増加させることができる。

ＤＮＡチェックビーズか選択した粒子である際には、担体は、１．０３グラム／ ミリリツトルから５％以内の差異である密度を有する。

粒子および担体の寿命を最大にし、さらに粒子の凝集を防止するために、担体の ｐＨは担体中の粒子および他の添加物に適合することが重要である。ラテックス 材料の粒子と一緒に用いるためには、例えば、一般に６．　０〜８．　０の範囲 内のｐＨか受け入れられ、好ましい範囲は６．９〜７．３であることを見出した 。

担体のｐＨが高すぎるかまたは低すぎる場合は、ラテックス粒子が凝集し、これ により粒子の既知の総数が減少し、さらに凝集体の大きさが、粒子をカウントす る装置の能力の範囲外まで増加することを見出した。凝集という用語は広く用い られ、粒子のダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）およびトリブレット（け１ｐｌｅｌ ）の形成を含み、これははるかに大きい粒子の凝集の形成として有害であると考 えられる。

さらに、担体中に低いが十分な濃度の保存剤を含んで細菌および菌類の担体中ま たは粒子上での成長を防止するのか好ましい。さらに特に、保存剤は、凝集をお こすかまたは蛍光を加えることにより背景ノイズ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｎｏ ｉｓｅ）を増加させない殺菌剤であるのか好ましい。担体の他の成分および粒子 材料と相溶性である任意の添加剤が受け入れられるが、保存剤をモノアルデヒド 例えばホルムアルデヒドまたはジアルデヒド例えばグルタルアルデヒドを含む有 機アルデヒド；有機アルコールを含むアルコール、例えば脂肪族および環式アル コール、例えばフェノール、トルエン、エタノールおよびプロパツールを含むア ルコール；およびフッ化ナトリウムおよびアジ化ナトリウムから成る群から選ぶ のが好ましい。さらに好ましくは、選択された添加剤はホルムアルデヒドであり 、担体液体の容積の約０．５〜２．５％の範囲内、好ましくは１．０％の量で用 いる。

適切な界面活性剤を加えた場合には、担体の安定性を増加させることができる。

しかし、選択された界面活性剤は、関連する細胞に有害に作用してはならない。

好ましくは、このような界面活性剤は、非イオン型であり、粒子凝集を最小にす るのに必要な最小の量で存在する。担体中に界面活性剤が多すぎると泡が発生し 、また細胞の破壊が発生し、一方界面活性剤か少なすぎると所望の程度の安定性 が得られない。

既知のカウントの粒子を細胞試料に加える好ましい操作は、別個粒子を含む担体 の選択された容積をピペットで入れることを含む。単位容積あたりの細胞カウン トを決定する正確さは、部分的にこの粒子懸濁液の容積測定の正確さに依存する 。この方法により、細胞試料に加えることができるビーズの数は、１％以内と知 られている。しかし、既知のカウントの粒子を細胞試料に加える当業者に知られ ている任意の方法を用いることができる。

未知の容積部の細胞試料および粒子を、別個粒子の数および関連する細胞の数を 測定するのに有効な方法により分析する。この方法は、光散乱トリガーリング、 次に光散乱およびフローサイトメータでの蛍光測定を含む。

代表的なフローサイトメータ装置において、細胞および他の別個粒子は液体流に 流され、従ってそれぞれの細胞および粒子は好ましくは１度に１つ、物理的およ び化学的特徴の１つ以上を測定する検出領域を通過する。

感知方法は、良く知られたクールター原理；蛍光；吸光：光散乱、消光：蛍光偏 向および蛍光信号波形に基づいた粒子容積に関連する電気的インピーダンスを含 む。これらの感知方法の任意の１つ以上を用いて分析の設定された特定のパラメ ータを活性化することができる。

討議を確実化する目的および例示的目的のため、フローサイトメータに言及し、 ここで細胞および粒子の液体流を、シース流体中で覆って、細胞および粒子の流 れがこの流れに対して直角に向けられた入射光を通って流れる際に流れを水力学 的に集中させる。細胞および粒子が光線を通過するので、各細胞および粒子に関 連する光特性は、装置のオペレータにより最適に選択される分析の設定される特 定のパラメータを誘導する。蛍光および光散乱が光学的信号であるが、パラメー タ設定のトリガーとして用いた際には、それぞれは異なる作用および効果を有す る。

光散乱トリが−を用いた際には、入射光を通過する各細胞および粒子は、接合シ リコンフォトダイオード（ｊｕｎｃｔｉｏｎ　５ｉｌｉｃｏｎ　ｐｂｏＬｏｄｉ ｏｄｅ）により感知される。

光散乱か粒子の大きさ、形状、密度、色素の取り込みおよび粒度により影響され るため、０れらの１つ以上の基準を用いて細胞分析を活性化することができる。

このようにして、細胞分析を、細胞および粒子をこれらの基準の上限または下限 しきい値に合わせるのに細胞および粒子を必要とすることにより活性化する。

蛍光トリが−を用いる際には、蛍光を有するこれらの細胞および粒子のみが、光 信号を電気信号に変換する増ｆ合型光電管により感知される。蛍光細胞および粒 子は入射光を吸収し、入射光源と異なる波長の蛍光信号を発生する。蛍光は、照 度および信号強度の均一性により影響される。照度均一性は光源の安定性および その空間強度分布と関連付けられる。蛍光信号強度は、種々の装置特性に依存し 、励起光強度、試料流速、光源および染料の励起スペクトル、染料の激動率、光 検出オプティックスの収光および透過効率および光検出器の感度が含まれる。こ のようにして、細胞および粒子分析を、粒子に蛍光信号強度の上限または下限し きい値を満足することを要求することにより活性化する。

本発明の目的のために、粒子検出方法は光散乱トリガーを含む。これにより、懸 濁液中のすべての粒子を、設定した選択パラメータにより分析することができる 。さらに、光散乱トリガーは、蛍光染色の信号強度に依存せず、これは細胞上で 細胞基準により変化することができる。さらに特に、光散乱トリが−を用いるこ とは、２通りの利益を与える。

第１に、細胞を分析する際に、光散乱トリガーは、細胞試料中の３つのタイプの 白血球を区別する可能性を提供し、さらに、マーカーまたはタグを用いることに より、選択された白血球のクラスター表示を検出することができる。

第２に、光散乱トリガーを用いることにより、装置性能の現場での品質管理が可 能になる。さらに特に、装置は最初に細胞および別個の粒子を、これらの特徴に より左右されるが、光散乱により感知し、測定の設定されるあるパラメータをト リガーする。このようなパラメータ設定は、光散乱および１つ以上の他の感知特 性の同時測定を含む。これは、すべての粒子が検出され、これにより試料懸濁液 中の粒子および細胞の正確な再現を提供するという利点を有する。

さらに、光散乱ｌ・リガーは、試料懸濁液の分析中、装置のオペレータが、装置 が性能明細書（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）内で作 動し、試料懸濁液を分析していることの保ＸｉＥを持つことができる利点を存す る。さらに特に、試料懸濁液を分析している間、技術者は、ヒストグラムにおけ る適切な位置で既知の別個の粒子および既知の別個の粒子の信号強度の増幅を検 出し、報告する性能により、装置の配列を確かめ、所要に応じて調整することが できる。

これらのパラメータは、制限された量の関連する細胞を含むかまたは制限された 鳳であるかまたは装置により検出されるｒダ染物を含む試料懸濁液を分析する間 は明らかでない。基本的に、オペレータは、分析している量測定によりフォーカ スして機械か正確に作動していることを決定することにより分析を確認すること ができる。

最も好ましい例において、試料管濁液を、光散乱および蛍光の同時測定により分 析して、光散乱のみまたは蛍光のみの測定より顕著に正確な細胞の感知を提供す る。従って、赤血球を溶解した細胞懸濁液中の蛍光粒子およびＣＤ４リンパ球の 蛍光マーカーを用いる際には、別個の粒子および関連する細胞の光散乱をトリが −し、光散乱および蛍光で検出を確認することにより品質管理を確かめることか できる。これらの２つの信号を相関することにより、照度の均一性、信号強度お よび関連する細胞と別個の粒子との間の区別の改善を確実にすることができる。

本発明の最も好ましい例において、細胞−粒子懸濁液をさらに分析して、白血球 の３つの主な集団（即ちリンパ球、単球および顆粒球）を区別し、さらに単一ア ッセイによりＣＤ４リンパ球を決定する。この例において、蛍光トリガーリング は有利でない。この理由は、すべての関連する細胞および粒子が、正確でかつ再 現性の測定ができる蛍光強度を有するとは限らないがらである。

粒子および細胞の測定は、懸濁液が流れの定常状態に達した後に行うしこれによ り、懸濁液流の水力学的不安定性を除去することができる。これらの不安定性は 、粒子および細胞がきっ（またはゆるく結合している際には分析の最初および最 後に最も明らかである。さらに、定常状態流動の間、懸濁液は測定を妨げる傾向 がある気泡をほとんど含まない。粒子分布の頻度がほぼ等しい場合には、定常流 速が達成される。これは、単位容積あたりの細胞カウントを決定するのに最も正 確な間隔を提供し、この結果正確さは９５％より大である。

本発明の特徴および利点を以下の制限するものでない実施例によりさらに十分に 示す。

実施例１ プラスチックミクロスフイアの製造 材料 １、測定できる程度の蛍光強さを有するプラスチックミクロスフイア２、グリセ ロール、ＡＣ３ ３、マンニトール、ＡＣ３ ４、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３５％溶液）５、−１’、）Ｌ、Ｌフルデ ヒド（３６％）、ＡＣ３６、脱イオン化蒸留水 工程 ■、プラスチックミクロスフイアを０．１％ＢＳＡ＋１％マンニトールを含む水 に懸濁させ、周囲条件で、６０分間、揺動しながら１置した。

２　プラスチックミクロスフイアを、揺りバケット型の遠心分離機を用いて、周 囲条件で、５分間、１００ＯＲＰＭ（１０００ＲＰ’？ｌ’、遠心分離シタ。

３、上澄みを除去して廃棄した。

４　プラスチックミクロスフイアを０．　１．９ｆｉＢＳＡ＋］％マンニトール を含む水に再び懸濁させ、周囲条件で、６０分間、揺動しながら１置した。

５−晩揺動することを除いて、段階２，３．及び４を繰り返した。

６、段階２及び３を繰り返した。

７　すべでのプラスチックミクロスフイアの１部に対して、ｏ、１％ＢＳＡ＋１ ％マンニトール＋１．０％ホルムアルデヒド＋２０％グリセロールを含む水５０ 部（瓶詰溶液）割合で、プラスチックミクロスフイアを再び懸濁した。

８　ガラス瓶に移して、５分間超音波処理をした。

９　遂次稀釈して、１００μ　あたり１０．０００プラスチツクミクロスフイア （→−／−１００）かある瓶詰溶液を製造した。

実施例２ ＣＤ４リンパ球Ｊｌｌ定用試ｆ４￥濁液の製造及び分析１、全血試料１００μ　 を１２Ｘ７５ｍｍのポリプロピレン試験管に入れた。

２、ＣＤ、ｌリンパ球細胞に標識をつけるために用いられるＣＤ４モノクローナ ル抗体試薬ｌＯμ　を上記の試験管に加えてｌｌｌ！濁液を形成し、この懸濁液 をかきまぜた。

３、周囲条件で１０分間培養を続けた。

４　懸濁液を溶解して赤血球を除去した。

５　実施例１で記載したように処理した１００．０００のプラスチックミクロス フイアを加えた。

６、試料をかきまぜて再び試験管の高さの５０％までにした。

７、分析の前直ちに、５秒間、かきまぜて再び試験管の高さの５０２６までにし た。

８　次にいＥＰＩＣ３（登録商標）プロファイル　エリト　サイトメータを用い て、当業者に知られているフローサイトメトリー法によって、試ｆ４！ｌＩ濁液 を分析し、試料単位容積あたりＣＤ４リンパ球のカウントを得た。

実施例３ 培養された白血球細胞試ｆ４の製造及び分析全血の代わりに培養された白血球細 胞１００μ　を使用し、がっ、ＣＤ４モノクローナル抗体試薬の代わりにヨード 化プロビデイウム試薬を使用することを除いて、実施例２の方法を繰り返した。

　２０分間培養して非生存細胞にヨウ素を結合させた後、実施例の段階４乃至８ を繰り返した。この結果、試料単位容積あたり生存培養細胞の数を得た。

実施例４ 網状赤血球試料管濁液の製造及び分析 全血の使用量が１００μ　ではなくて単に２μ　であること、及びＣＤ４試薬の 代わりにチアシル　オレンジのような網状赤血球試薬を使用することを除いて、 実施例２の方法を繰り返した。約１０分間の培養をしてから、実施例２の段階５ 乃至８を繰り返した。この結果、試料単位容積あたり網状赤血球の数を得た。

本発明を特定の具体例及び組成によって説明したが、本発明の範囲に従うと、数 多くの変形、変化及び具体化力呵能である。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成　６年　８月１２ 日

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．分析している試料を含む懸濁液の容積を測定しない装置で細胞試料の単位容 積あたり細胞総数を探知する方法において、ａ．第１光散乱信号を有する既知の 量の位子を、第１光散乱信号と異なる第２光散乱信号を有する既知容積の細胞試 料と混合して、試料容積あたり一定の位子濃度を有する懸濁液を得； ｂ．上記細胞懸濁液の未知の容積部分の中で上記位子及び細胞それぞれを順次に 光線を通過させて、上記粒子及び細胞のそれぞれが少なくとも一つの前進光散乱 パターンを生じさせ； ｃ．上記懸濁液の上記未知容積部分中の細胞数及び位子数をカウントし；ｄ．上 記細胞試料に加えられた既知量の粒子に対して、上記懸濁液分中の粒子及び細胞 の数を相関させて、試料の単位容積あたりの細胞の総数を決定することを特徴と する細胞試料の単位容積あたり細胞総数の測定方法。
2. ２．上記の細胞数及び位子数のカウンティングを光散乱トリガーを使用するフロ ーサイトメータによって行うことを特徴とする請求の範囲１記載の方法。
3. ３．上記の粒子と細胞試料中細胞との密度差が２０％より少ないことを特徴とす る請求の範囲１又は２記載の方法。
4. ４．さらに（ｅ）位子の蛍光信号及び上記光散乱パターンを装置性能の量小限界 を表す所定の比に相関させ；（ｆ）所定の比が得られなかった場合には、位子を 入射光線の中に置きながら、測定比が上記所定の比に達するまで、上記の装置の 操作を調節することを特徴とする、細胞試料の単位容積あたり細胞の総数を測定 する中、カウンティング装置の操作パラメーターを規定範囲内に維持することを 更に含み、かつ、上記粒子の蛍光が既知の波長を有する請求の範囲１又は２記載 の方法。
5. ５．上記位子を細胞試料中の細胞に付着しないように処理してあることを特徴と する請求の範囲１記載の方法。