CN101680879B - 幼稚白细胞的分析用试剂及分析用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种幼稚白细胞的分析用试剂，其包含损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂、使受损血细胞收缩的助溶剂及核酸染色色素，并且渗透压为10mO sm/kg以上且小于150mO sm/kg。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于对从生物体采集的试样中的白细胞进行分类并计数的试剂及试剂盒。
背景技术
血细胞在骨髓中产生，由未成熟细胞分化、成熟后移动到末梢血液。对于健康的人，末梢血液中不会出现未成熟白细胞(幼稚白细胞)。另一方面，白血病、癌的骨髓转移、多发性骨髓瘤、重症感染症等患者的末梢血液中有时出现幼稚白细胞。因此，将生物试样中的成熟白细胞及幼稚白细胞分类并进行测定在这些疾病的诊断中具有非常重要的意义。
作为用于测定幼稚白细胞的试剂，已知日本特开平10-206423号(专利文献1)中公开的试剂。将混合该试剂和生物试样而得的测定试样导入流式细胞仪，照射特定波长的光，基于得到的光学信息，对检测体中的成熟白细胞和幼稚白细胞进行分类，并分别计数。另外，还可以将幼稚白细胞细分为原粒细胞、幼稚粒细胞等，并分别计数。专利文献1：日本特开平10-206423号公报
发明内容
发明要解决的技术问题
在使用现有试剂的血细胞分析中，例如，使用流式细胞仪测定血细胞时，溶血的红细胞碎片(红细胞影)的信号区域和原粒细胞的信号区域部分重叠。如果使用这样的试剂，则即使是分析不含有原粒细胞的血液试样的情况，也会将红细胞碎片的信号误认为是原粒细胞的信号，不能得到正确的血细胞分析结果。例如在患有多发性骨髓瘤、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、肾小球肾炎、胸膜炎等特定疾病的患者的末梢血液中不含有原粒细胞。但是，如果使用所述现有的试剂对从这些患者采集的末梢血液的血细胞进行分类，则有时在散点图的原粒细胞的信号检测区域中检测出信号。出现这种情况的原因被认为可能是：来自所述特定患者的试样中所含的红细胞与健康的人及所述疾病以外的疾病患者的试样中的红细胞不同，不能顺利地溶血。如果在末梢血液中检测出比实际量多的原粒细胞，则可能不能进行正确的诊断及治疗。需要说明的是，在本说明书中，所谓“红细胞影”，是指血液试样与血液分析用试剂反应而丧失血红素、但没有充分收缩的红细胞。
因此，本发明的课题在于提供一种试剂，其中，即使为从所述特定疾病的患者采集的血液试样，也可以更准确地进行幼稚白细胞的分类及计数。
解决问题的技术方案
为了解决这些问题，本发明人等进行了反复研究，结果发现，通过使幼稚白细胞的分析用试剂的渗透压比现有程度更低，可以解决上述课题。
现有幼稚白细胞的分析用试剂，为了防止幼稚白细胞及成熟白细胞在测定时溶解，认为优选使用具有和这些血细胞相同程度的渗透压的幼稚白细胞的分析用试剂。但是，此次发现，将从患有多发性骨髓瘤、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、肾小球肾炎、胸膜炎等特定疾病的患者采集的生物试样进行分析时，如果使用在现有的技术常识下未考虑的低渗透压的分析用试剂，则来自这些特定患者的生物试样的分析的精度进一步提高。例如，通过使用低渗透压的分析用试剂，可以更明确地区分原粒细胞和溶血的红细胞。另外，令人惊讶的是，即使是从患有所述特定疾病之外的疾病的患者采集的生物试样，使用本发明的分析用试剂时，也和渗透压高的现有试剂一样，可以明确区分幼稚白细胞和成熟白细胞。例如，可知，通过使用本发明的分析用试剂，可以防止红细胞影的出现。即使使用低渗透压的分析用试剂，根据检测体的不同，有时原粒细胞的信号和嗜碱性粒细胞的信号也重叠地被检测出来。因此，即使在健康人的末梢血液中未出现原粒细胞，有时也会被当做出现了原粒细胞，从而不能进行正确的检查。针对原粒细胞的信号和嗜碱性粒细胞的信号重叠这个更深一层的问题，可以通过使幼稚白细胞的分析用试剂的表面活性剂、助溶剂的浓度比现有程度更低的方式进行解决。即，即使是含有较多嗜碱性粒细胞的血液试样，通过使用本发明的试剂，可以更明确地区分嗜碱性粒细胞和原粒细胞。另外，通过降低表面活性剂、助溶剂的浓度，在低渗透压下也可以将成熟白细胞分为至少3类。
本发明的一方面提供一种幼稚白细胞的分析用试剂，其中，包含损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂、使受损血细胞收缩的助溶剂及核酸染色色素，且渗透压为10mOsm/kg以上且小于150mOsm/kg。
本发明的另一方面提供一种幼稚白细胞的分析用试剂盒，其中，包括第1试剂及第2试剂，所述第1试剂含有损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂、使受损血细胞收缩的助溶剂，且渗透压为10mOsm/kg以上且小于150mOsm/kg，所述第2试剂含有核酸染色色素。本发明的再一方面提供对幼稚白细胞进行分类的方法，其包括：将含有损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂、使受损血细胞收缩的助溶剂及核酸染色色素且渗透压为10mOsm/kg以上且小于150mOsm/kg的幼稚白细胞的分析用试剂与可能含有幼稚白细胞的生物试样混合，以对成熟白细胞的核酸进行染色；及测定经上步处理后的幼稚白细胞的至少一种散射光和至少一种荧光，根据所述散射光和荧光的强度差对幼稚白细胞进行分类。
发明效果
通过使用本发明的幼稚白细胞的分析用试剂及试剂盒，即使是患有多发性骨髓瘤、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、肾小球肾炎、胸膜炎等特定疾病的患者的生物试样，与现有试剂相比，也可以更准确地进行幼稚白细胞及成熟白细胞的分类及计数。
附图说明
图1是表示使用本发明的试剂或试剂盒对幼稚白细胞进行分析时可以使用的流式细胞仪的一例的模式图。图2表示实施例1中所得的散点图。图3表示实施例2中所得的散点图。图4表示实施例3中所得的散点图。图5表示实施例4中所得的散点图。图6表示实施例5中所得的散点图。图7表示实施例6中所得的散点图。图8表示实施例7中所得的散点图。图9表示实施例8中所得的散点图。图10表示实施例9中所得的散点图。图11表示实施例10中所得的散点图。符号说明
6：喷嘴21：光源22：准直透镜23：流动池24：聚光镜25：针孔板26：前向散射光检测器27：聚光镜28：分色镜28’：滤光器29：侧向散射光检测器30：针孔板31：侧向荧光检测器2、33、34：放大器35：分析部
具体实施方式
使用本实施方式的幼稚白细胞的分析用试剂(以下也称为“试剂”)时，可以将生物试样中所含的白细胞分为成熟白细胞和幼稚白细胞，并分别计数。另外，可以将成熟白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞等至少3种以上，并分别计数。进而，使用该试剂时，还可以将幼稚白细胞细分为幼稚粒细胞和原粒细胞，并进行精确计数。
在本说明书中，所谓“幼稚白细胞”，是指不存在于健康人的末梢血液中而只存在于骨髓中的未成熟白细胞。作为幼稚白细胞，例如可举出：原粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞等。早幼粒细胞、中幼粒细胞及晚幼粒细胞有时统称为“幼稚粒细胞”。原粒细胞包含骨髓干细胞(CFU-GEMN)、嗜中性粒细胞-巨噬细胞集落形成细胞(CFU-GM)、嗜酸性粒细胞集落形成细胞(CFU-EOS)等白细胞系造血前体细胞。
作为使用本实施方式的试剂进行分析的生物试样，只要是含有白细胞的试样，就没有特别限定，可以例示血液、尿、骨髓穿刺液、通过血浆分离置换法采集的试样等。
本实施方式的试剂包含损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂、使受损血细胞收缩的助溶剂及核酸染色色素，且渗透压为10mOsm/kg以上且小于150mOsm/kg。混合生物试样和试剂时，由于表面活性剂和助溶剂的作用，试样中所含的血细胞的细胞膜受到损伤。表面活性剂较易损伤红细胞和成熟白细胞的细胞膜，较难损伤幼稚白细胞的细胞膜。红细胞及成熟白细胞等受损血细胞在助溶剂的作用下收缩。另一方面，由于幼稚白细胞的细胞膜几乎未被损伤，因此，与红细胞及成熟白细胞相比，更难以发生由助溶剂引起的细胞收缩。受损的血细胞中，由于核酸染色色素的作用，白细胞核容易被强烈染色。但是，未受损的幼稚白细胞很难被染色。另外，由于红细胞不具有核，因此难以被所述核酸染色色素染色。因此，可以分别区分幼稚白细胞、成熟白细胞、红细胞。
本实施方式的试剂的渗透压为10mOsm/kg以上且小于150mOsm/kg，优选为10～100mOsm/kg，更优选为10～60mOsm/kg。该渗透压可以通过将下述成分以下述量进行混合或通过适当调节缓冲剂的浓度而得到，根据要求，也可以通过加入糖类、氨基酸、氯化钠等进行调整。
作为糖类，没有特别限定，可以举出：单糖类(例如葡萄糖、果糖等)、多糖类(例如阿拉伯糖等)、糖醇(例如木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、核醣醇等)等。例如使用木糖醇时，可在试剂中用0～10g/L，更优选为4～8g/L。
作为所述氨基酸，可以举出：缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸等。优选使用甘氨酸及丙氨酸中的任一种或两种。例如使用甘氨酸时，可在试剂中用0～10g/L，更优选为2～6g/L。
损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂优选为非离子表面活性剂，更优选为聚氧乙烯系非离子表面活性剂。该聚氧乙烯系非离子表面活性剂更优选为下式(I)表示的聚氧乙烯系非离子表面活性剂：R1-R2-(CH2CH2O)n-H(I)(式中，R1为碳数9～25的烷基、烯基或炔基，R2为-O-、-COO-或[化1]表示的基团[化1]
n为10～40的整数)。
作为上式(I)表示的表面活性剂，可以举出：聚氧乙烯(15)油基醚、聚氧乙烯(20)油基醚、聚氧乙烯(20)硬脂基醚、聚氧乙烯(15)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚等，可以使用其中1种或多种。
试剂中的表面活性剂的浓度可以根据表面活性剂的种类适当选择。表面活性剂为聚氧乙烯油基醚时，表面活性剂在试剂中的浓度优选为500～15000ppm，更优选为750～10000ppm，进一步优选为1000～2500ppm。在本发明的更优选的实施方式中，将表面活性剂的浓度设定为例如1000～10000ppm这样的较低的浓度。在这样的浓度范围中，作为成熟白细胞的1种的嗜碱性粒细胞的细胞膜的损伤在表面活性剂浓度比较高时也弱，从而可以防止嗜碱性粒细胞受损而使细胞内成分流到细胞外。由此，嗜碱性粒细胞和其它成熟白细胞一样通过核酸染色色素的作用而较易被染色。另一方面，作为幼稚白细胞的一种的原粒细胞的细胞膜由于如上所述未受损伤，因此难以被染色。由此，可以更好地区分嗜碱性粒细胞和原粒细胞。
使用多种表面活性剂时，这些表面活性剂的混合比可以根据表面活性剂的羟基值适当选择。例如，使用羟基值为64.8的聚氧乙烯(15)油基醚和羟基值为52.4的聚氧乙烯(20)油基醚时，优选混合比为1∶9。
作为所述助溶剂，可以举出例如：肌氨酸衍生物、胆酸衍生物、甲基葡聚糖酰胺等。可以使用选自它们中的一种或者多种。作为肌氨酸衍生物，包含以下结构式所示的肌氨酸衍生物及其盐。具体可以举出：N-月桂酰基肌氨酸钠、月桂酰基甲基β-丙氨酸钠、月桂酰基肌氨酸等。作为胆酸衍生物，包含以下结构式所示的胆酸衍生物及其盐。具体可以举出：CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-丙磺酸)、CHAPSO([(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸)等。作为甲基葡聚糖酰胺，可以举出：MEGA8(辛酰基-N-甲基葡糖酰胺)、MEGA9(壬酰基-N-甲基葡糖酰胺)、MEGA10(癸酰基-N-甲基葡糖酰胺)等。
肌氨酸衍生物具有下述结构式。[化2]
(式中，R1为C10-22的烷基，n为1～5。)
胆酸衍生物具有下述结构式。[化3]
(式中，R1为氢原子或羟基。)
甲基葡聚糖酰胺具有下述结构式。[化4]
(式中，n为5～7。)
助溶剂在试剂中的浓度可以根据所使用的助溶剂的种类适当选择。使用肌氨酸衍生物作为助溶剂时，试剂中的助溶剂的浓度优选为50～3000ppm，更优选为100～400ppm。使用胆酸衍生物时，试剂中的助溶剂的浓度优选为50～10000ppm，更优选为50～1300ppm。使用甲基葡聚糖酰胺时，试剂中的助溶剂的浓度优选为500～8000ppm，更优选为500～1100ppm。
另外，作为助溶剂，还可以使用正辛基β-葡萄糖苷、蔗糖单癸酸酯、N-甲酰基甲基亮氨酰丙氨酸等。使用这些助溶剂时，其在试剂中的浓度优选为5～50000ppm，更优选为5～6600ppm。助溶剂可以单独使用，也可以并用两种以上助溶剂。
在本发明的更优选的实施方式中，通过将助溶剂的浓度设定得较低，作为成熟白细胞的一种的嗜碱性粒细胞的细胞膜的损伤在助溶剂浓度比较高时也弱，可以防止嗜碱性粒细胞受损而使细胞内成分流到细胞外。由此，嗜碱性粒细胞和其它成熟白细胞一样通过核酸染色色素的作用而较易被染色。另一方面，作为幼稚白细胞的一种的原粒细胞的细胞膜由于如上所述未受损伤，因此较难被染色。由此，可以更好地区分嗜碱性粒细胞和原粒细胞。
所述核酸染色色素只要可以将核酸染色就没有特别限定，优选为荧光色素。通过使用这种色素，可以使不含有核酸的红细胞几乎不被染色，而使具有核酸的白细胞被强烈染色。根据这种染色强度的差异，可以辨别红细胞和白细胞。另外，具有受到色素可以透过的程度的损伤的细胞膜的成熟白细胞被这种色素强烈染色，但是几乎未受损的幼稚白细胞几乎不被染色。根据这种染色强度的差异，可以区分白细胞中的成熟白细胞和幼稚白细胞。
核酸染色色素可以根据分析中使用的照射光适当选择。例如，优选使用具有下述结构式的色素。(1)具有下式(II)的色素[化5](式中，R1及R2为低级烷基；n为1或2；X-为阴离子；Z为硫原子、氧原子或被低级烷基取代的碳原子)。
上述式(II)中，R1及R2中的低级烷基是指碳数为1～6的直链或支链烷基。作为低级烷基，可以举出例如：甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等，其中优选乙基。Z中的低级烷基如上述。作为Z，优选硫原子。作为X-中的阴离子，可以举出例如：卤素离子(氟、氯、溴或碘离子)、卤化硼离子(BF4 -、BCl4 -、BBr4 -等)、磷化合物离子、卤氧酸离子、含氟硫酸离子、甲基硫酸离子、具有芳香环卤素或含卤素烷基作为取代基的四苯基硼化合物离子等。其中，优选碘离子。
作为上述式(II)的核酸染色色素，优选如下所述的色素。色素A[化6]
(2)具有下式(III)的色素[化7]
(式中，R1及R2为低级烷基；n为1或2；X-为阴离子)。
关于上述式(III)中的R1及R2的低级烷基及X-的阴离子，与上述式(II)中所述的相同。
作为上述式(III)的核酸染色色素，优选如下所述的色素。色素B[化8]
(3)具有下式(IV)的色素[化9]
(式中，R1为氢原子或低级烷基；R2及R3为氢原子、低级烷基或低级烷氧基；R4为氢原子、酰基或低级烷基；R5为氢原子或可被取代的低级烷基；Z为硫原子、氧原子或被低级烷基取代的碳原子；n为1或2；X-为阴离子)。
关于上述式(IV)中的R1的低级烷基，与上述式(II)中所述的相同。R2及R3中的低级烷基和上述相同。低级烷基是指碳数为1～6的烷氧基，可以举出例如：甲氧基、乙氧基、丙氧基等，其中优选甲氧基、乙氧基。需要说明的是，R2及R3优选为氢原子。
在上述式(IV)中，R4中的酰基优选为由脂肪族羧酸衍生的酰基，可以举出例如：乙酰基、丙酰基等，其中优选乙酰基。另外，低级烷基与上述相同。R5中的低级烷基与上述相同，可被取代的低级烷基是指可以被1～3个羟基、卤素原子(氟、氯、溴或碘)等取代的低级烷基，其中优选被一个羟基取代的甲基、乙基。Z中的低级烷基与上述相同，作为Z，优选为硫原子。作为X-中的阴离子，优选为溴离子或BF4 -。
作为上述式(IV)的核酸染色色素，优选以下所述的色素。色素C[化10]
[化11]
[化12]
(4)具有下式(V)的色素[化13]
(式中，X1及X2独立地为Cl或I)
(5)具有下式(VI)的色素(NK-3975)。[化14]
(6)具有下式(VII)的色素(NK-1570)。[化15]
(7)具有下式(VIII)的色素(NK-1049)。[化16]
(8)具有下式(IX)的色素(NK-98)。[化17]
(9)具有下式(X)的色素(NK-141)。[化18]
(10)碘化丙锭或溴化乙锭。(11)乙锭-吖啶异源二聚体、二叠氮基乙锭(ethidium diazide)、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2、一叠氮基乙锭(ethidiummonoazide)、三亚甲基双[[3-[[4-[[(3-甲基苯并噻唑-3-鎓)-2-基]亚甲基]-1，4-二羟基喹啉]-1-基]丙基]二甲基aminium]·四碘化物(TOTO-1)、4-[(3-甲基苯并噻唑-2(3H)-亚基)甲基]-1-[3-(三甲基氨基)丙基]喹啉鎓·二碘化物(TO-PRO-1)、N，N，N’，N’-四甲基-N，N’-双[3-[4-[3-[(3-甲基苯并噻唑-3-鎓)-2-基]-2-亚丙烯基]-1，4-二羟基喹啉-1-基]丙基]-1，3-丙烷二aminium·四碘化物(TOTO-3)、或2-[3-[[1-[3-(三甲基氨基)丙基]-1，4-二羟基喹啉]-4-亚基]-1-丙烯基]-3-甲基苯并噻唑-3-鎓·二碘化物(TO-PRO-3)。
所述色素在试剂中的浓度优选为0.01～500ppm，更优选为0.1～200ppm。所述色素可以单独使用，也可以并用2种以上。
本实施方式的试剂的pH值优选为5.0～9.0，更优选为6.5～7.5，进一步优选为6.8～7.3。试剂的pH值可以通过添加缓冲剂进行调整。作为缓冲剂，可以使用例如HEPES、MOPS(3-吗啉丙磺酸)、MOPSO(2-羟基-3-吗啉丙磺酸)或BES(2-[双(2-羟基乙基)氨基]乙磺酸)等性能良好的缓冲剂、磷酸缓冲剂等。另外，可以使用氢氧化钠等pH调节剂。
本实施方式的试剂可以通过使所述表面活性剂、助溶剂、核酸染色色素和根据需要选择的任意成分以至所述浓度的方式溶解于适当的溶剂中而得到。作为所述适当的溶剂，只要是可以溶解所述成分的溶剂，就没有特别限定，可以举出∶水、乙醇、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)及这些溶剂的混合溶液等。
可以将所述表面活性剂、助溶剂及核酸染色色素如上所述以单独的试剂与生物试样混合而进行幼稚白细胞的分析。或者，可以以包括含有表面活性剂和助溶剂的第1试剂及含有核酸染色色素的第2试剂的试剂盒使用，用于幼稚白细胞的分析。因此，本发明提供一种幼稚白细胞的分析用试剂盒，其中，包括第1试剂及第2试剂，所述第1试剂含有损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂、使受损血细胞收缩的助溶剂，且渗透压为10mOsm/kg以上且小于150mOsm/kg，所述第2试剂含有核酸染色色素。
对于所述第1试剂中的表面活性剂及助溶剂的浓度，为在与第2试剂混合时，至所述幼稚白细胞的分析用试剂中所述的浓度即可。另外，所述第1试剂的渗透压可以通过将表面活性剂及助溶剂溶解于如上所述的适当的溶剂中并根据期望适当调节所述缓冲剂的量而调节到所期望的范围。另外，可以使用上述糖、氨基酸等进行调节。
对于所述第2试剂中的核酸染色色素的浓度，为在与第1试剂混合时，至所述幼稚白细胞的分析用试剂中所述的浓度即可。第2试剂由于可以提高色素的保存稳定性，因此，优选核酸染色色素溶解于乙二醇等有机溶剂中而得的试剂。
所述试剂及试剂盒可以通过与生物试样混合，制备测定用试样，并供给到流式细胞仪中，从而进行幼稚白细胞的分析。生物试样与该试剂或试剂盒的第1试剂和第2试剂的总和的混合比(容量比)优选为1∶10～1∶1000。另外，试剂盒中，第1试剂与第2试剂的混合比(容量比)优选为约1000∶1～10∶1。
使用所述试剂盒时，试剂盒的各试剂与生物试样的混合顺序没有特别限定，优选将第1试剂及第2试剂混合后，再与生物试样混合。
所述试剂或试剂盒与生物试样的混合可以根据试剂适当设定。例如，可以从20～40℃的温度及3～30秒的反应时间中选择。反应温度高时，可以使反应时间变短，反应温度低时，可以使反应时间变长。
在所述分析中使用流式细胞仪时，对在流动池中流动的测定试样中的血细胞照射光，获得散射光及荧光等的光学信息，以此为基础，可以测定血细胞的种类及数目。
具体而言，所述分析可以使用如图1所示的流式细胞仪进行。以下，基于图1，对作为本实施方式的一例的原粒细胞的测定进行详细说明。由喷嘴6喷出的测定用试样流过流动池23的孔部。此时，试样中的血细胞排成一列通过孔部。从光源21发出的光经由准直透镜22照射流过流动池23的血细胞。通过对血细胞照射光，产生侧向散射光、侧向荧光及前向散射光。侧向散射光经由聚光镜27和分色镜28入射到侧向散射光检测器(光电倍增管)29中。侧向荧光经由聚光镜27、分色镜28、滤光器28’和针孔板30入射到侧向荧光检测器(光电倍增管)31中。前向散射光经由聚光镜24和针孔板25入射到前向散射光检测器(光电二极管)26中。
由前向散射光检测器26输出的前向散射光信号、由侧向散射光检测器29输出的侧向散射光信号和由侧向荧光检测器31输出的侧向荧光信号分别由放大器32、放大器33及放大器34放大后输入到分析部35中。
分析部35根据收到的前向散射光信号、侧向散射光信号及侧向荧光信号计算出前向散射光强度、侧向散射光强度及荧光强度。分析部35制作以前向散射光强度及荧光强度为二轴的第一个二维分布图，并在该二维分布图上确定试样中的总白细胞出现的区域(总白细胞区域)。再对出现在该总白细胞区域的细胞制作以侧向散射光强度及荧光强度为二轴的第二个二维分布图。在该二维分布图上设定成熟白细胞出现的区域(成熟白细胞区域)、淋巴细胞出现的区域(淋巴细胞区域)、单核细胞出现的区域(单核细胞区域)、粒细胞出现的区域(粒细胞区域)。进而，确定原粒细胞出现的区域(原粒细胞区域1)及幼稚粒细胞出现的区域(幼稚粒细胞区域)。
接着，制作以侧向散射光及前向散射光为二轴的第三个二维分布图，在该二维分布图上确定原粒细胞出现的区域(原粒细胞区域2)。将在原粒细胞区域1及原粒细胞区域2中出现的细胞数作为试样中所含的原粒细胞数进行计数，将在幼稚粒细胞区域中出现的细胞数作为试样中所含的幼稚粒细胞数进行计数。需要说明的是，由于原粒细胞的细胞尺寸大，为单核，因此，前向散射光强度强而侧向散射光强度弱。另外，由于如上所述几乎未被染色，因此荧光强度弱。由于幼稚粒细胞的细胞尺寸大，核分叶，因此，前向散射光强度及侧向散射光强度强。另外，由于如上所述几乎未被染色，因此荧光强度弱。
本发明还提供一种包括将所述分析用试剂或分析用试剂盒与生物试样混合的幼稚白细胞的分析方法。在本发明的方法的优选实施方式中，上述分析用试剂或将分析用试剂盒的第1试剂和第2试剂混合所得的试剂中的表面活性剂的浓度为500～15000ppm，更优选为750～10000ppm，进一步优选为1000～2500ppm。另外，在本发明的方法的其它优选实施方式中，使用肌氨酸衍生物或其盐作为助溶剂时，上述分析用试剂或将分析用试剂盒的第1试剂和第2试剂混合所得的试剂中的助溶剂的浓度为100～400ppm，使用胆酸衍生物时，该浓度为50～1300ppm，使用甲基葡聚糖酰胺时，该浓度为500～1100ppm。通过这些优选的实施方式，可以更明确地区分生物试样中的嗜碱性粒细胞和原粒细胞。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但是本发明并不限定于以下实施例。
(实施例1)配制以下组成的第1试剂及第2试剂。<第1试剂>聚氧乙烯(20)油基醚(日光Chemicals) 2000ppmN-月桂酰基肌氨酸钠(市售品) 125ppmMOPSO(市售品) 10mM纯化水 1L混合上述各成分，进而加入NaOH调节pH值为7.0。第1试剂的渗透压为20mOsm/kg，导电率为0.78mS/cm。
<第2试剂>核酸染色色素 50ppm乙二醇 1L将色素溶解于乙二醇中，制备第2试剂。需要说明的是，核酸染色色素使用上述色素C。
将第1试剂980μL、第2试剂20μL及从健康人采集的血液试样(嗜碱性粒细胞比率为2.1％，不含有原粒细胞)20μL混合，在35℃下反应19秒，得到测定用试样。使用得到的测定用试样，用图1所示的流式细胞仪测定侧向散射光强度、前向散射光强度及荧光强度。需要说明的是，光源使用红光半导体激光。
基于得到的前向散射光强度及荧光强度，制作以前向散射光强度及荧光强度为二轴的第一个二维分布图(散点图)。基于该第一个二维分布图，确定总白细胞区域。将在所确定的总白细胞区域中出现的细胞数作为试样中所含的总白细胞数进行计数。得到的散点图如图2(1)所示。以所确定的总白细胞区域中出现的细胞为对象，制成以侧向散射光强度及荧光强度为二轴的第二个二维分布图(散点图)及以侧向散射光强度及前向散射光强度为二轴的第三个二维分布图(散点图)。在第二个二维分布图上设定原粒细胞区域1，在第三个二维分布图上设定原粒细胞区域2。得到的散点图如图2(2)及图2(3)所示。接着，将在设定的原粒细胞区域1及原粒细胞区域2中出现的细胞数作为试样中所含的原粒细胞数进行计数。得到的散点图如图2(4)所示。
从图2(1)、(2)、(3)、(4)中可以看出，由于从健康人采集的血液试样中不含有原粒细胞，因此，在散点图的可能出现原粒细胞的区域中不存在信号，另外，也未出现由溶血的红细胞产生的信号。进而，由于嗜碱性粒细胞与其它的成熟白细胞同样也被染色，因此，不出现在原粒细胞区域中。计算相对总白细胞数的原粒细胞的比率(原粒细胞比率＝原粒细胞/总白细胞数×100)时，为0％。需要说明的是，通过肉眼确定的原粒细胞比率也为0％。
(实施例2)制备以下组成的第1试剂。<第1试剂>聚氧乙烯(20)油基醚(日光Chemicals) 1500ppmN-月桂酰基肌氨酸钠(市售品) 225ppmMOPSO(市售品) 10mM纯化水 1L混合上述各成分，进而加入NaOH调节pH值为7.25。第1试剂的渗透压为20mOsm/kg，导电率为0.78mS/cm。
除使用上述第1试剂代替实施例1中使用的第1试剂之外，与实施例1同样操作，对从健康人采集的血液试样进行分析。所得到的散点图如图3(1)、(2)、(3)、(4)所示。
从图3(1)、(2)、(3)、(4)中可以看出，由于从健康人采集的血液试样中不含有原粒细胞，因此，在散点图的可能出现原粒细胞的区域中不存在信号，另外，也未出现由溶血的红细胞产生的信号。进而，由于嗜碱性粒细胞与其它的成熟白细胞同样也被染色，因此，不出现在原粒细胞区域中。相对总白细胞数的原粒细胞的比率(原粒细胞比率＝原粒细胞/总白细胞数×100)为0％。需要说明的是，通过肉眼确定的原粒细胞比率也为0％。
(实施例3)除使用从急性骨髓性白血病的患者采集的含有原粒细胞的血液试样代替从健康人采集的血液试样以外，与实施例1同样操作，进行分析，测定侧向散射光强度、前向散射光强度及荧光强度。所得到的散点图如图4(1)、(2)、(3)、(4)所示。
根据图4(1)、(2)、(3)、(4)的散点图，求出相对总白细胞数的原粒细胞的比率，结果为1.2％。需要说明的是，通过肉眼计数同样的血液试样的原粒细胞比率时，结果为4.0％。
(实施例4～9)制备以下组成的第1试剂及第2试剂。[表1]
将第1试剂980μL、第2试剂20μL及以下任一种血液试样20μL混合，在35℃下反应13秒(实施例4及11中为17.5秒)，得到测定用试样，与实施例1～3同样操作，制作散点图。作为血液试样，使用含有原粒细胞的白血病患者的血液(以下也称为“原粒细胞试样”)、或不含有原粒细胞的多发性骨髓癌患者的血液(红细胞发生溶血不良)(以下也称为“溶血不良试样”)。
得到的散点图如图5～11所示。在图5～11的各图中，(A)表示将原粒细胞试样作为血液试样使用时的散点图，(B)表示将溶血不良试样作为血液试样使用时的散点图。通常，原粒细胞在散点图的“BL”区域被检测出。图5～11的散点图的横轴表示侧向散射光强度，纵轴表示荧光强度。另外，“Ly”表示淋巴细胞出现的区域，“Mo”表示单核细胞出现的区域，“Gran”表示粒细胞出现的区域，“IG”表示幼稚粒细胞出现的区域。根据这些散点图，计算相对总白细胞数的原粒细胞的比率，作为“BL区域”，如图6～11所示。
从图5～11的结果可知，使用本发明的分析用试剂进行测定时，在原粒细胞试样中检测出原粒细胞，在溶血不良试样中，原粒细胞比率为极低的值。另外，在溶血不良试样的测定中，在使用现有的试剂进行检测时可检测出的红细胞影几乎未被检测出。因此，如果使用本发明的试剂，则即使是溶血不良试样，也不会错误地检测出原粒细胞，因此，可以得到正确的测定结果。另外，即使是红细胞影被检测出的情况，原粒细胞区域和红细胞影区域也不会在散点图中重叠(未图示)。即，如果使用本发明的分析用试剂，则即使是从患有多发性骨髓瘤这样的疾病的患者采集的血液，在散点图中红细胞影也不出现在原粒细胞区域中，因此，可以明确区分原粒细胞和红细胞影，可以正确测定幼稚白细胞。
本申请与2007年6月25日申请的日本专利申请特愿2007-166609号及2008年3月27日申请的日本专利申请特愿2008-84137号有关，其专利的权利要求书、说明书、附图及摘要的全部内容均作为参考而并入本说明书中。
Claims (9)
1.幼稚白细胞的分析用试剂，其中，含有聚氧乙烯系非离子表面活性剂、选自肌氨酸衍生物、胆酸衍生物及甲基葡聚糖酰胺中的至少一种的助溶剂、及核酸染色色素，且渗透压为10mOsm/kg以上且小于150mOsm/kg，pH值为6.5～9.0。
2.权利要求1的分析用试剂，其中，所述表面活性剂在分析用试剂中的浓度为500～15000ppm。
3.如权利要求1的分析用试剂，其中，所述聚氧乙烯系非离子表面活性剂为下式(I)表示的聚氧乙烯系非离子表面活性剂，
式中，R1为碳数9～25的烷基、烯基或炔基，R2为-O-、-COO-或[化1]表示的基团：
[化1]
n为10～40的整数。
4.权利要求1的分析用试剂，其中，所述聚氧乙烯系非离子表面活性剂为聚氧乙烯油基醚。
5.权利要求4的分析用试剂，其中，所述聚氧乙烯油基醚为具有n为15～20的权利要求3的式(I)的聚氧乙烯油基醚。
6.权利要求1的分析用试剂，其中，对于所述助溶剂在分析用试剂中的浓度，当助溶剂为肌氨酸衍生物时为100～400ppm，当助溶剂为胆酸衍生物时为50～1300ppm，当助溶剂为甲基葡聚糖酰胺时为500～1100ppm。
7.如权利要求1的分析用试剂，其中，所述核酸染色色素为选自以下色素中的至少一种：
(1)下式(II)表示的色素，
式中，R1及R2为低级烷基；n为1或2；X-为阴离子；Z为硫原子、氧原子或被低级烷基取代的碳原子；
(2)下式(III)表示的色素，
式中，R1及R2为低级烷基；n为1或2；X-为阴离子；
(3)下式(IV)表示的色素，
式中，R1为氢原子或低级烷基；R2及R3为氢原子、低级烷基或低级烷氧基；R4为氢原子、酰基或低级烷基；R5为氢原子或可被取代的低级烷基；Z为硫原子、氧原子或被低级烷基取代的碳原子；n为1或2；X-为阴离子；
(4)下式(V)表示的色素，
式中，X1及X2独立地为C1或I；
(5)下式(VI)表示的色素；
(6)下式(VII)表示的色素；
(7)下式(VIII)表示的色素；
(9)下式(X)表示的色素；
(10)碘化丙锭或溴化乙锭；
(11)乙锭-吖啶异源二聚体、二叠氮基乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2、一叠氮基乙锭、三亚甲基双[[3-[[4-[[(3-甲基苯并噻唑-3-鎓)-2-基]亚甲基]-1，4-二羟基喹啉]-1-基]丙基]二甲基铵]·四碘化物(TOTO-1)、4-[(3-甲基苯并噻唑-2(3H)-亚基)甲基]-1-[3-(三甲基氨基)丙基]喹啉鎓·二碘化物(TO-PRO-1)、N，N，N’，N’-四甲基-N，N’-双[3-[4-[3-[(3-甲基苯并噻唑-3-鎓)-2-基]-2-亚丙烯基]-1，4-二羟基喹啉-1-基]丙基]-1，3-丙烷二铵·四碘化物(TOTO-3)、或2-[3-[[1-[3-(三甲基氨基)丙基]-1，4-二羟基喹啉]-4-亚基]-1-丙烯基]-3-甲基苯并噻唑-3-鎓·二碘化物(TO-PRO-3)。
8.权利要求1的分析用试剂，其中，包括第1试剂及第2试剂，所述第1试剂含有聚氧乙烯系非离子表面活性剂和选自肌氨酸衍生物、胆酸衍生物及甲基葡聚糖酰胺中的至少一种的助溶剂，且渗透压为10mOsm/kg以上且小于150mOsm/kg，pH值为6.5～9.0，所述第2试剂含有核酸染色色素。
9.权利要求1的试剂在制备幼稚白细胞的分析用试剂盒中的用途。
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