ES2302860T3 - Ensayo de proteasas para la monitorizacion terapeutica de farmacos. - Google Patents

Abstract

Método para determinar la potencia inhibidora de un inhibidor del VIH en una muestra biológica, que comprende: i) utilizar una muestra biológica de un paciente; ii) proporcionar una molécula bioactiva en la que la molécula bioactiva es una proteasa del VIH; iii) proporcionar un reactivo para la molécula bioactiva en el que el reactivo es un sustrato para la proteasa del VIH, siendo R-E(EDANS)-S-Q-N-Y-P-I-V-Q-K(DABCYL)-R-OH; iv) añadir la muestra biológica, la molécula bioactiva y el reactivo para una molécula bioactiva a un contenedor; v) determinar una señal; vi) relacionar la señal de v) con una curva patrón de referencia preparada con al menos una referencia.

Description

Ensayo de proteasas para la monitorización terapéutica de fármacos.

Los ensayos cualitativos y cuantitativos son de gran importancia en diferentes campos de las ciencias de la vida. La presente invención se refiere al uso de ensayos biológicos para determinar la cantidad o la concentración de un principio activo presente en una muestra. En particular, el ensayo enzimático de la presente invención determina la cantidad o la concentración de inhibidores de proteasas, incluyendo inhibidores de proteasas retrovirales tales como inhibidores de proteasas del virus de la inmunodeficiencia humana, en una muestra.

La monitorización terapéutica de fármacos desempeña un importante papel en el seguimiento de la eficacia de tratamientos. Con el fin de alcanzar un efecto terapéutico, los fármacos que actúan como inhibidores enzimáticos deben administrarse en dosificaciones que proporcionen inhibición suficiente de la enzima implicada. Las herramientas de diagnóstico se han desarrollado para monitorizar el efecto terapéutico de fármacos en un paciente a una determinada concentración.

Los ensayos de monitorización actuales para los inhibidores del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana, VIH) se basan en técnicas tales como la cromatografía de capa fina (CCF), cromatografía líquida de alta presión (HPLC), espectrometría de masas (EM) y cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (LC-EM) [Ther. Drug Monit. 2001, 23(4), 380; J. Chromatogr. B Biomed Sci. Appl (2001), 758(2), 129; J. Chromatogr. B Biomed Sci. Appl (2000), 740(1), 43]. Aunque estos métodos pueden monitorizar simultáneamente varios inhibidores en una única muestra del paciente, estos ensayos no proporcionan una medición de la inhibición de la enzima diana. Leela y cols. informan de que los métodos actuales para determinar los inhibidores del VIH no están disponibles de manera rutinaria en un laboratorio clínico y que se necesita un ensayo simplificado, menos tedioso y que todavía necesita desarrollarse. [Ann. Pharmacother. 2001, 35(6), 745].

El uso de enzimas para monitorizar concentraciones del fármaco se describió en por ejemplo los documentos US 4.918.001, US 4.546.076, US 5.576.177 y WO 99/54734. La última publicación de patente da a conocer el uso de alfileres recubiertos que se insertan en una disolución. Por ejemplo, si los alfileres están recubiertos con un sustrato, entonces la proteasa y finalmente el inhibidor están presentes en la disolución. Con la inserción de los alfileres comienza la reacción y la extracción de los alfileres del vaso de reacción para la reacción enzimática. El documento US 4.546.076 da a conocer el uso de un ensayo enzimático para monitorizar la concentración de antibióticos \beta-lactámicos presentes en una muestra. El documento US 4.918.001 describe un ensayo para medir la concentración de inhibidores de proteasas endógenos.

Se han descrito métodos en los que se mide la actividad proteasa residual presente en una muestra de paciente [véase por ejemplo el documento EP148193; Ther. Drug Monit. 2001, 23(2), 93]. La actividad enzimática residual es una medición del efecto farmacológico y el cumplimiento del paciente. Este tipo de ensayo proporciona información sobre si la ruta se inhibe suficientemente. No se obtiene información con respecto al nivel de dicho fármaco en la muestra. Este tipo de ensayo solamente puede usarse para monitorizar de manera rutinaria si la enzima diana es accesible fácilmente de manera no invasiva y si está presente en dicha muestra en cantidades suficientes para permitir una reacción enzimática. Por tanto, este enfoque no puede usarse fácilmente para detectar inhibidores de proteasas del VIH presentes en una muestra de paciente tal como suero, puesto que la proteasa del VIH no está presente en cantidades suficientes en suero.

El uso de sustratos fluorescentes para medir la actividad de proteasas del VIH se describió en por ejemplo Matayoshi y cols. [Science 1990, 247, 954], Tyagi y cols. [Anal. Biochem. 1992, 200(1), 143], Toth y cols. [Int. J. Pept. Protein Res. 1990, 36(6), 544] y Wang y cols. [Tetrahedron 1990, 31(45), 6493] y en varias publicaciones de patentes [véanse por ejemplo los documentos WO99/67417; EP428000, EP518557]. Estas descripciones describen cómo determinar el efecto de inhibidores sobre la proteasa del VIH. Estos ensayos son útiles para la detección de alto rendimiento. Mientras que en las estrategias de alto rendimiento se realiza una detección positiva negativa, es decir inhibición o no, los ensayos clínicos necesitan proporcionar una medición de la eficacia terapéutica con el fin de permitir al facultativo sacar conclusiones relacionadas con el tratamiento. En ensayos de detección se conoce la concentración del compuesto en investigación, sin embargo, en muestras clínicas se desconoce la concentración del compuesto.

En vista de la individualización del tratamiento del paciente, existe una necesidad de un enfoque flexible para determinar la cantidad o la concentración de un principio activo en una muestra biológica. Además, existe una necesidad de un ensayo que también pueda explicar el efecto de metabolitos de fármacos sobre la molécula bioactiva. Por tanto se preparó la presente invención, que comprende añadir la molécula bioactiva a una muestra biológica y medir la actividad de la molécula bioactiva. En vista de la importancia de determinar la concentración de fármacos libres y unidos a proteína, la presente invención introduce un procedimiento de separación para satisfacer esta necesidad.

La presente invención se refiere a un método bioanalítico mejorado para determinar concentraciones de fármacos presentes en una muestra de paciente. Más específicamente, el método se refiere a un ensayo de fluorescencia para cuantificar la potencia inhibidora de una muestra biológica. El método puede usarse en un enfoque integrado con respecto a los resultados de unión, modelado terapéutico de fármacos de técnicas bioanalíticas con pruebas de resistencia y datos farmacológicos.

La invención se refiere a un método para determinar la potencia inhibidora de un inhibidor del VIH en una muestra biológica, que comprende: i) utilizar una muestra biológica de un paciente; ii) proporcionar una molécula bioactiva en la que la molécula bioactiva es una proteasa del VIH; iii) proporcionar un reactivo para la molécula bioactiva en el que el reactivo es un sustrato para la proteasa del VIH, siendo R-E(EDANS)-S-Q-N-Y-P-I-V-Q-KDABCYL)-R-OH; iv) añadir la muestra biológica, la molécula bioactiva y el reactivo para una molécula bioactiva a un contenedor; v) determinar una señal; vi) relacionar la señal de v) a una curva patrón de referencia preparada con al menos una referencia.

Según la presente invención una "muestra biológica" incluye cualquier muestra derivada de un organismo, es decir un ser humano o un animal, que comprende opcionalmente un principio activo. Una muestra biológica incluye, pero no se limita a sangre, suero, plasma, saliva, líquido cefalorraquídeo, eyaculado, lavado ductal mamario y pelo. Una muestra biológica incluye además muestras obtenidas a partir de frascos de cultivo, pocillos y otros tipos de contenedores. Dicha muestra biológica puede comprender uno o más principios activos.

Una "molécula bioactiva" usada en la presente invención incluye moléculas bioactivas de tipo natural o versiones recombinantes de las mismas. Las versiones recombinantes pueden incluir mutaciones indicativas de la resistencia a uno o más principios activos, pueden incluir resto(s) fluorescente(s) o de extinción de fluorescencia o pueden ser un constructo de fusión. La molécula bioactiva puede usarse junto con sustratos o ligandos marcados con el fin de proporcionar un ensayo homogéneo (por ejemplo transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, FRET; transferencia de energía por resonancia bioluminiscente, BRET). Una molécula bioactiva de la presente invención significa cualquier molécula biológica que muestra por ejemplo actividad enzimática, por ejemplo proteasa del VIH, transcriptasa inversa del VIH, proteasa del VHC (VHC, virus de la hepatitis C), polimerasa del VIH, metalo-proteinasas de matriz, renina, trombina; actividad de unión u otro tipo de interacción. Una molécula bioactiva puede proporcionarse en una disolución por ejemplo, una disolución tamponada.

Un "reactivo" para una molécula bioactiva incluye sustratos para enzimas; ligandos para receptores. Un reactivo incluye además, cofactores, anticuerpos, aptámeros etc. En una realización el reactivo es un sustrato para la proteasa del VIH o un sustrato para la proteasa del VHC. En un aspecto de la invención, la conversión de dicho sustrato en la molécula bioactiva puede monitorizarse usando fluorescencia. El reactivo puede proporcionarse en una disolución. Los ejemplos de disoluciones incluyen tampones, disolventes orgánicos, disoluciones tamponadas completadas con disolventes orgánicos.

Un "principio activo" significa cualquier compuesto, incluyendo un compuesto químico, fármaco, anticuerpo, ligando, compuesto antisentido, aptámero, ribozima, péptido, péptido no natural, proteína, APN (ácido péptidonucleico) y ácidos nucleicos o una composición que incluye al menos un compuesto. Ésta comprende además los compuestos tal como se administran y sus metabolitos. Los metabolitos pueden generarse en condiciones fisiológicas. Tal como se usa en la presente invención, el nivel de un principio activo significa la cantidad o la concentración de dicho principio activo en dichas muestra. El principio activo presente en la muestra biológica puede diferir del principio activo en la referencia. En estas circunstancias, la potencia inhibidora de la muestra biológica es igual a una cantidad o una concentración de principio activo derivada de una curva patrón de referencia. La cantidad puede expresarse como, por ejemplo, g, ml, mol. La concentración puede expresarse por ejemplo como ml/ml, g/l, M y similares.

Una "matriz" según la presente invención incluye una disolución, un tampón, una muestra biológica que incluye pero no se limita sangre, plasma, suero, saliva, líquido cefalorraquídeo, eyaculado, lavado ductal mamario u homogeneizados tisulares o una muestra biológica completada además con un tampón.

Un "contenedor" tal como se usa en la invención incluye pero no se limita a un vaso, un pocillo, una cubeta, un recipiente, etc. Los compuestos o líquidos pueden mezclarse en dicho contenedor. De manera adecuada, la determinación se realiza en dicho contenedor. El contenedor puede ser una entidad separada por ejemplo una cubeta de cuarzo o puede estar dispuesta en un formato múltiple tal como por ejemplo una placa de 16 pocillos, una placa de 96 pocillos, una placa de 384 pocillos.

Una "señal" significa cualquier salida generada mediante el ensayo biológico que incluye fluorescencia, polarización de fluorescencia, fluorescencia resuelta en el tiempo, luminiscencia, luminiscencia resuelta en el tiempo, absorbancia, radiactividad, mecanismos de transferencia de energía por resonancia, magnetismo. En un aspecto, la salida se genera durante el ensayo. Los ejemplos de señales incluyen unidades de fluorescencia relativa, absorbancia y similares. La señal puede ser generada haciendo reaccionar la molécula bioactiva con el reactivo para la molécula bioactiva. Una señal puede determinarse al final de un periodo de incubación definido previamente, por ejemplo tras 10 minutos. Una señal puede monitorizarse continuamente. Esto incluye que a intervalos de tiempo regulares se registra una señal. Este intervalo de tiempo regular incluye por ejemplo intervalos de tiempo definidos previamente, por ejemplo, cada 10 segundos, cada 5 segundos y similares. Una señal puede convertirse en una razón de señales. Los ejemplos de tales razones incluyen la razón de una señal generada mediante una muestra biológica con respecto la señal generada en una reacción control. Una señal puede convertirse en variables cinéticas que incluyen la velocidad inicial, velocidad máxima, velocidad media.

Una "referencia" significa un principio activo que se utiliza para preparar la curva patrón de referencia. La referencia es un único compuesto o una mezcla de al menos dos compuestos. Dicha referencia puede estar presente en una matriz idéntica a la de la muestra biológica. Dicha referencia no necesita ser necesariamente el mismo principio activo que está presente en la muestra biológica. En un enfoque, el compuesto utilizado como referencia es el mismo que el principio activo presente en la muestra biológica.

Un "ensayo biológico" significa un ensayo que se basa en la determinación de los efectos biológicos generados mediante una molécula bioactiva, incluyen la determinación de una reacción enzimática, una interacción receptor-ligando, actividad ADN polimerasa, actividad transcriptasa inversa, actividad integrasa, interacciones antígeno-anticuerpo y similares.

"Relacionar" significa que la señal determinada se compara con una curva patrón de referencia, curva a partir de la que puede convertirse la señal en una medición de la inhibición o en un nivel de compuesto de referencia.

La "curva patrón de referencia" incluye pero no se limita a una curva en la que la señal se traza frente a la medición de inhibición. Dicha medición de inhibición puede expresarse como un porcentaje. La curva patrón de referencia incluye además curvas en las que la señal se traza frente a una concentración de referencia o una cantidad de referencia. Una curva patrón de referencia también puede construirse trazando una razón, por ejemplo una razón de la señal determinada con la muestra biológica con respecto a la señal determinada con el control, frente a un nivel de un principio activo. De manera adecuada, dicha curva patrón de referencia se ha preparado según el procedimiento de la presente invención en particular como las etapas i) a v) enumeradas. En la preparación de una curva patrón de referencia se usa una referencia en lugar de una muestra biológica, en la etapa i). Sin embargo, la molécula bioactiva y el reactivo para una molécula bioactiva son idénticos a los usados para el análisis de la muestra biológica. El "valor correspondiente" incluye la señal, la actividad, el porcentaje de inhibición, el nivel de principio activo presente en la referencia basándose en la determinación de la referencia en la curva patrón de referencia. Dicho nivel puede expresarse como una concentración (por ejemplo Molar, g/l, g/g etc.) o como una cantidad (mol, g, ml, mg,...).

La "potencia inhibidora" puede expresarse como un porcentaje de inhibición, como un nivel de principio activo, es decir una cantidad o una concentración de principio activo. Este es un objeto de la presente invención, que el principio activo presente en la muestra biológica puede diferir del principio activo utilizado para establecer una curva patrón de referencia. Si el principio activo utilizado para preparar la curva patrón de referencia difiere del principio activo en la muestra biológica, la potencia inhibidora de la muestra biológica puede relacionarse con una cantidad equivalente del principio activo utilizado para preparar la curva patrón de referencia. En tal caso, la potencia inhibidora puede expresarse como un nivel de fármaco, es decir la señal generada mediante una muestra biológica se relacionará con un nivel de fármaco correspondiente. En una realización, el principio activo utilizado para preparar la curva patrón de referencia es el mismo que el principio activo presente en la muestra biológica. En este último caso, la potencia inhibidora es equivalente al nivel del principio activo en la muestra biológica.

En la determinación de la potencia inhibidora de un principio activo en una muestra biológica, las etapas i) a iii) pueden colocarse en cualquier orden. En la etapa iv), los componentes respectivos pueden añadirse en diferentes órdenes. Por ejemplo, si una actividad proteasa se determina según los métodos de la presente invención, se necesitan tres componentes, una muestra biológica, una proteasa y un sustrato para la proteasa. Estos tres componentes pueden mezclarse en cualquier orden, siempre que para el fin de la presente invención, la reacción se inicie con o bien la molécula bioactiva o bien el reactivo para la molécula bioactiva. Por ejemplo, la muestra biológica puede añadirse en primer lugar al reactivo de la molécula bioactiva. En este procedimiento, la reacción se inicia añadiendo la molécula bioactiva a la mezcla y la determinación posterior de la señal. Esta claro que también la muestra biológica puede añadirse en primer lugar a la molécula bioactiva. En este enfoque, la reacción se inicia mediante la adición del reactivo para la molécula bioactiva. Estará claro para el experto en la técnica que en el procedimiento anterior en lugar de añadir la muestra biológica a cualquiera de la molécula bioactiva o el reactivo de la molécula bioactiva, también puede realizarse lo inverso. Por ejemplo, la molécula bioactiva puede añadirse a la muestra biológica, después de lo cual se completa la mezcla de reacción con un reactivo de la molécula bioactiva.

Puede determinarse una señal en blanco. Esto significa una reacción sin molécula bioactiva, por ejemplo la enzima, o sin reactivo para la molécula bioactiva. Para estos fines, la molécula bioactiva o el reactivo para la molécula bioactiva puede sustituirse por un tampón. Dicha señal en blanco puede restarse de la señal determinada cuando se prepara la curva patrón de referencia o cuando se determina la potencia inhibidora de un principio activo en una muestra biológica. Dicha señal en blanco representa la señal generada mediante el reactivo sin interacción con la molécula bioactiva o reactivo para la molécula bioactiva.

Puede determinarse una señal de control. Dicha señal de control se obtiene cuando no está presente ningún principio activo en la muestra biológica o en la matriz para preparar la curva patrón de referencia. Dicha señal de control puede usarse como un valor al 100%. Alternativamente dicha señal de control puede usarse para obtener razones de las señales generadas con las muestras biológicas o con las referencias para preparar la curva patrón de
referencia.

Según un enfoque, la muestra biológica se trata con un disolvente, tal como un disolvente orgánico que incluye metanol, etanol, para obtener un extracto que comprende principios activos. El extracto, es decir la disolución que comprende principios activos, se transfiere posteriormente a un contenedor. Posteriormente, en el caso del VIH, puede determinarse la potencia inhibidora midiendo la actividad de la proteasa del VIH tras completar el contenedor con la proteasa y un sustrato para la proteasa. Tanto el extracto como la muestra biológica pueden necesitar dilución antes del ensayo. En un aspecto, la muestra biológica o el extracto pueden diluirse para obtener una señal que oscila desde aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 70% de la señal de control, de manera interesante desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 60% de la señal de control.

La proteasa puede ser una forma de tipo natural o contener una o más mutaciones. Esas mutaciones pueden influir en la actividad proteasa. En una realización puede utilizarse una proteasa del VIH mutante. Por ejemplo, la proteasa del VIH puede comprender una o más mutaciones seleccionadas de las lista que consiste en mutaciones en la posición de aminoácido 3, 10, 20, 24, 32, 33, 35, 36, 37, 46, 47, 50, 53, 54, 57, 58, 63, 70, 71, 72, 73, 77, 82, 84, 88, 89 ó 90 frente a la proteasa del VIH de tipo natural (número de registro Genbank K 03455). La proteasa puede estar presente en una disolución tamponada. Se usa una disolución tamponada para mantener el pH de la disolución constante durante la reacción y puede completarse además con iones para ajustar la fuerza iónica del tampón y puede completarse además con, por ejemplo, antioxidantes, agentes quelantes metálicos, detergentes, cofactores o disolventes. Los ejemplos de tampones incluyen tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato. La proteasa puede estar presente en una concentración que oscila desde aproximadamente 1 picomolar hasta aproximadamente 10 micromolar, de manera adecuada que oscila desde aproximadamente 1 nanomolar hasta aproximadamente 1 micromolar, durante el ensayo biológico.

El sustrato también puede proporcionarse en una disolución, una disolución tamponada, un disolvente orgánico o mezclas de los mismos. En un enfoque, puede usarse el mismo tampón para preparar la disolución de la proteasa y la disolución de sustrato. La actividad enzimática puede medirse usando, por ejemplo, un sustrato fluorogénico, cromogénico o fluorogénico extinguido. Otros métodos para medir interacciones entre una molécula bioactiva, su reactivo y un principio activo se conocen en la técnica y pueden basarse, por ejemplo, en FRET, BRET. En estos últimos enfoques, uno o ambos de los compuestos que interaccionan pueden marcarse mediante una molécula fluorescente. La interacción da como resultado una transferencia por resonancia de la longitud de onda excitada. Los sustratos que son de interés en vista de la presente invención incluyen los compuestos que incluyen un resto seleccionado del grupo que consiste en 7-amino-4-metilcumarina, 7-amino-4-carbamoilcumarina, paranitroanilida, beta-naftilamida, aminobenzoílo, tetrametilrodamina, EDANS, DANSYL, fluoresceína o DABCYL. El sustrato puede contener una estructura peptídica derivada de las proteínas del VIH que incluyen gag, proteasa, transcriptasa inversa, integrasa, p17, p24 o combinaciones de las mismas. De manera interesante, dicha estructura peptídica contiene de 2 a 30 aminoácidos, de manera de adecuada de 3 a 15 aminoácidos, de manera más adecuada de 3 a 10 aminoácidos. Los ejemplos de tales estructuras incluyen las secuencias S-Q-N-T-P-I-V-N, S-Q-N-Y-P-I-V-W-L ó S-Q-N-Y-P-I-V-Q-K, en las que los aminoácidos se representan por su código de una letra (Practical Biochemistry, 5ª edición, Ed. Wilson & Walker, Cambridge University Press, Cambridge, 2000, pág. 313). Una estructura interesante comprende la secuencia de aminoácidos P-I-V. Otra estructura interesante comprende la tétrada Y-P-I-V. Un sustrato interesante es AR-V-Y-F(NO_{2})-E-A-Nle(Nle, norleucina). También pueden usarse sustratos de autoextinción (documento WO 99/50579). Los sustratos interesantes para medir la proteasa del VIH incluyen los que comprenden combinaciones de DABCYL y EDANS en una estructura peptídica; o la combinación de restos de aminobenzoílo y nitrofenilo en una estructura peptídica. En el caso de que se determine la proteasa del VHC, los sustratos pueden diseñarse basándose en la secuencia de las proteínas del VHC. Sustratos interesantes incluyen: (7-metoxicumarin-4-il)acetil (Mca)-D-D-I-V-P-C-S-M-S-(2,4-dinitrofenil, Dnp) K y Mca-D-D-I-V-P-C-S-M-K(Dnp)-R-R (J. Virol. Meth. 1999, 80, 77-84), éster Ac-D-T-E-D-V-V-P(Nva)-O-4-fenilazofenílico (Ac, acetilo) (Nva, norvalina) (Anal. Biochem. 1999, 270, 268-275), sustratos fluorogénicos depsipeptídicos extinguidos internamente basándose en la transferencia de energía por resonancia entre la pareja donador/aceptor ácido 5-[(2'-aminoetil)amino]naftalenosulfónico/ácido 4-[[4'-(dimetilamino)fenil]azo]benzoico. Sustratos interesantes para la proteasa del virus de la hepatitis C se basan en la transferencia de energía por resonancia de sustratos depsipeptídicos (Anal. Biochem. 1996, 240, 60-67). Durante el ensayo biológico, el sustrato puede estar presente en una concentración que oscila desde aproximadamente 1 nanomolar hasta aproximadamente 500 milimolar, de manera interesante que oscila desde aproximadamente 1 micromolar hasta aproximadamente 100 milimolar, de manera más interesante desde aproximadamente 10 micromolar hasta aproximadamente 1 milimolar.

El método de determinación puede realizarse a temperatura ambiente evitando la necesidad de una infraestructura de incubación de temperatura controlada. Temperatura ambiente incluye temperaturas en el intervalo de desde aproximadamente 17ºC hasta aproximadamente 30ºC. En un enfoque, esta oscila desde aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 26ºC. En un enfoque, la reacción se lleva a cabo a aproximadamente 25ºC. Sin embargo, los ensayos también pueden realizarse a otras temperaturas por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 30ºC hasta aproximadamente 45ºC, en una realización entre aproximadamente 35 hasta aproximadamente 40ºC o a aproximadamente 37ºC.

El periodo de incubación puede ser de hasta 1 día. En un enfoque, el periodo de incubación es corto y oscila desde aproximadamente 15 segundos hasta aproximadamente 2 horas, de manera interesante dicho periodo oscila desde aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 60 minutos. Durante dicho periodo de incubación la señal puede controlarse. Dicha señal puede controlarse continuamente, en intervalos de tiempo definidos previamente o en un único intervalo de tiempo.

El volumen durante la incubación puede ser de hasta 10 ml. Un volumen interesante oscila desde aproximadamente 10 \mul hasta 5 ml, de manera adecuada desde aproximadamente 20 \mul hasta aproximadamente 2 ml, de manera más adecuada desde aproximadamente 25 \mul hasta aproximadamente 500 \mul. En una placa de microtitulación, un volumen interesante oscila desde aproximadamente 25 \mul hasta aproximadamente 300 \mul.

La señal de la muestra biológica puede compararse con los datos en una curva patrón de referencia. Dicha curva patrón de referencia puede obtenerse midiendo las señales de una variedad de muestras de referencia cada una comprendiendo una concentración de fármaco definida. Dicha referencia puede estar presente en una matriz tal como una disolución, un tampón, un disolvente orgánico y similares. En un aspecto, la referencia está presente en la misma matriz que la muestra biológica. Dicha curva patrón de referencia puede prepararse usando diferentes referencias, conteniendo cada una el mismo principio activo pero a concentración diferente. Dicha curva patrón de referencia puede preparase usando al menos una referencia, de manera adecuada al menos dos referencias, cada una teniendo una concentración diferente de principio activo; de manera más adecuada al menos tres referencias, teniendo cada una una concentración diferente de principio activo. En un aspecto, la curva patrón de referencia se prepara usando de 4 a 8 referencias diferentes del mismo principio activo, cada una teniendo una concentración diferente. El principio activo utilizado para obtener una curva patrón de referencia puede ser el mismo que el principio activo presente en la muestra biológica. Con el uso de una curva patrón de referencia, el método de la presente invención hace posible relacionar la señal generada con una concentración o cantidad específica del principio activo presente en la muestra. Esta curva patrón de referencia puede prepararse usando cualquier compuesto o mezcla de compuestos. Por consiguiente, la potencia inhibidora de un principio activo en una muestra biológica es una medición de la capacidad inhibidora total de una muestra biológica independientemente de los principios activos presentes e independientemente de su modo de interacción. Para los inhibidores enzimáticos dicho modo de interacción incluye inhibición irreversible o inhibición reversible, incluyendo inhibición competitiva, no competitiva, anti-competitiva, de unión fuerte o mixta. Basándose en una curva patrón de referencia de este tipo, puede determinarse una estimación del nivel de principio(s) activo(s) presente(s) en una muestra biológica, independientemente del conocimiento de la naturaleza de los principios activos. Este enfoque puede ser útil, por ejemplo, para la toxicología indicando que una ruta bioquímica dada está bloqueada con un equivalente de un principio activo conocido.

Los ejemplos de compuestos que pueden analizarse según los métodos de la presente invención incluyen sulfato de dextrano, suramina, polianiones, CD4 soluble, PRO-542, BMS-806, T20, T1249, 5-hélice, D-péptido ADS-J1, AMD 3100, AMD-3465, AMD7049, AMD3451, TAK 779, SHC-C(SCH351125), SHC-D, PRO-140, RPR103611, foscarnet y profármacos, AZT, 3TC, DDC, DDI, D4T, Abacavir, FTC, DAPD, dOTC, DPC 817, PMEA, PMPA (tenofovir), nevirapina, delavirdina, efavirenz, 8 y 9-Cl TIBO (tivirapina), lovirida, TMC-125, dapivirina, MKC-442, UC781, UC782, capravirina, DPC961, DPC963, DPC082, DPC083, calanolida A, SJ-1366, TSAO, TSAO 4''-desaminado, MV150, MV026048, SP1093V, PD126338, RO-5-3335, K12, K37, L708906, L731988, S-1360, amprenavir y profármaco GW433908 (VX-175, fosamprenavir), ritonavir, nelfinavir, saquinavir, indinavir, lopinavir, palinavir, BMS186316, atazanavir, DPC 681, DPC 684, tipranavir, AG1776, mozenavir, GS3333, KNI-413, KNI-272, L754394, L756425, LG-71350, PD161374, PD173606, PD177298, PD178390, PD178392, PNU140135, TMC-114, ácido maslínico, U-140690, castanospermina, desoxinojirimicina, CGP64222. Estos compuestos también pueden estar incluidos en un kit. De manera adecuada, si se utiliza la proteasa del VIH, el principio activo puede seleccionarse de la lista que comprende: amprenavir, fosamprenavir, ritonavir, nelfinavir, saquinavir, indinavir, lopinavir, palinavir, BMS186316, atazanavir, DPC681, DPC684, tipranavir, AG1776, mozenavir, GS3333, KNI-413, KNI-272, L754394, L756425, LG-71350, PD161374, PD173606, PD177298, PD178390, PD178392, PNU140135, TMC-114.

Con el uso de este ensayo puede realizarse la monitorización de las cinéticas de reacción a tiempo real. Con el uso de este enfoque pueden calcularse las variables en estado constante, por ejemplo la velocidad inicial (Practical Biochemistry, 5ª edición, Ed. Wilson & Walker, Cambridge University Press, Cambridge, 2000, capítulo 7, pág. 357-402). En una realización, la reacción se para antes de la determinación de la señal. Esto es una determinación en el punto final. Una reacción puede pararse añadiendo un agente que incluye un disolvente orgánico, detergente, ácido, base o cambios de temperatura. La salida, por ejemplo, de fluorescencia puede volver a calcularse con respecto a parámetros que describen la reacción, por ejemplo la velocidad inicial o con respecto mediciones de inhibición, por ejemplo el porcentaje de inhibición o el porcentaje de actividad residual.

El ensayo también puede usarse para determinar simultáneamente 2 o más principios activos, presentes en una muestra biológica, seleccionados como diana frente a 2 o más moléculas bioactivas. Para este fin, 2 o más sustratos diferentes pueden usarse, cada uno de los cuales puede medirse independientemente. Basándose en 2 o más curvas patrón de referencia, pueden cuantificarse los dos o más principios activos. Por ejemplo, la potencia inhibidora de la muestra biológica que comprende tanto un inhibidor de proteasas del VHC como un inhibidor de proteasas del VIH, puede determinarse en un único pocillo, usando dos sustratos diferentes. Un sustrato es específico para la proteasa del VIH y otro sustrato es específico para la proteasa del VHC.

Una ventaja adicional del presente método es que permite determinar la cantidad de principios activos unidos a las proteínas plasmáticas. Muchos compuestos se unen fuertemente a proteínas, limitando su eficacia terapéutica. Los inhibidores de proteasas del VIH pueden unirse a proteínas. Un ejemplo de un inhibidor de proteasas del VIH que se une a proteínas es la \alpha-glucoproteína ácida (AAG). La muestra puede tratarse para separar los principios activos unidos a proteínas de los libres. Esta separación puede realizarse mediante filtración. La filtración puede realizarse usando geles por ejemplo filtración en gel, filtros, papeles de filtro, usando placas de microtitulación especiales. Otras técnicas están disponibles en la técnica, tales como diálisis, calentamiento, precipitación, centrifugación, anticuerpos y otros medios conocidos por el experto en la técnica. También pueden usarse combinaciones de dichas técnicas para separar el principio activo unido a proteína del no unido. La diferenciación de la fracción libre con respecto a la unida a proteínas puede ser importante para compuestos que se someten a la unión a proteínas y en condiciones en las que la concentración de proteínas o la concentración de una proteína particular varía con el tiempo en un fluido corporal. El conocimiento de la distribución de los compuestos entre libres y unidos puede ser importante para evaluar un tratamiento, especialmente si solamente el principio activo es accesible a su diana.

Puesto que la molécula bioactiva se añade a la mezcla de reacción, la molécula bioactiva no necesita estar presente necesariamente en la muestra. El método de la presente invención proporciona además un ensayo para los casos en los que la molécula bioactiva no es accesible fácilmente o está presente en una concentración demasiado baja en un fluido biológico como por ejemplo suero, que puede contener inhibidores del VIH, pero solamente una cantidad muy baja, si acaso alguna de la proteasa. Alternativamente, el método puede usarse tras la eliminación de la muestra biológica la molécula bioactiva correspondiente o tras la inactivación de la molécula bioactiva. Estos últimos enfoques pueden ser valiosos en los casos en los que la concentración de dicha molécula bioactiva varía entre individuos. La eliminación o la inactivación puede conseguirse mediante diferentes métodos que incluyen pero no se limitan a precipitación mediante disolventes orgánicos, sales, detergentes, cambios de pH o desnaturalización térmica.

En un enfoque, el ensayo de la presente invención es homogéneo, tiene un tiempo de renovación corto y facilita el procesamiento paralelo de múltiples muestras. El ensayo de la presente invención puede llevarse a cabo en un formato basado en cubeta o en un formato de múltiples pocillos, por ejemplo una placa de microtitulación.

El ensayo se diseña de tal modo que determina la presencia, es decir el nivel de principios activos que inhiben la enzima en muestras biológicas y es especialmente adecuado para monitorizar principios activos en individuos en tratamiento así como en individuos sometidos a ensayos clínicos. La determinación de la concentración puede proporcionar pruebas de si la dosificación del compuesto es los suficientemente alta para proporcionar un efecto terapéutico.

La presente descripción también se refiere a un kit que comprende una molécula bioactiva, un reactivo para dicha molécula bioactiva y opcionalmente un principio activo. La molécula bioactiva, el reactivo y el principio activo pueden estar presentes en contenedores separados. La molécula bioactiva, el reactivo y el principio activo pueden estar liofilizados. El kit puede completarse además con un contenedor que comprende un tampón para la reacción enzimática. Dicho tampón puede proporcionarse como un polvo liofilizado. Si el kit está compuesto por los componentes liofilizados, dicho kit puede completarse además con una o más soluciones para la disolución de dichos polvos liofilizados. El kit puede contener uno o más contenedores que comprenden uno o más principios activos. El contenedor que comprende el principio activo, necesario para preparar una curva patrón de referencia, puede contener opcionalmente la proteasa o el sustrato para la proteasa.

Otro nivel de complejidad en enfermedades como el cáncer y el VIH es la aparición frecuente de resistencia al tratamiento. Estos últimos estados requieren una monitorización frecuente de los niveles de fármaco junto con la prueba de resistencia. Por tanto, se han desarrollado métodos que monitorizan las alteraciones fenotípicas en la población de viriones del VIH que circulan en el paciente (por ejemplo, el documento WO 97/27480). Otros ensayos de fenotipado incluyen los descritos en Witvrouw (documento WO 01/57245), Virologic (documento WO97/27319) y Bioalliance (documento WO 02/38792). El Antivirogram® (documento WO97/27480) calcula la susceptibilidad farmacológica de la población vírica cuando se compara con las cepas de "tipo natural". En este servicio de prueba, la concentración de fármaco que inhibe el crecimiento del virus en el 50% (CI_{50}) se determina in vitro. La razón de CI_{50} del virus en una muestra de sangre de un paciente con respecto a la CI_{50} del virus de "tipo natural" es el cambio en la susceptibilidad farmacológica del virus en ese paciente. Una alternativa para los ensayos fenotípicos en los que el material que porta el paciente se hace crecer en condiciones in vitro, es el genotipado. Los ensayos de genotipado calculan la aparición de resistencia basándose en las variaciones de secuencias. Una mejora con respecto a los ensayos genotípicos se denomina fenotipado virtual (documento WO 01/79540) en el que el genotipo de un virus de un paciente se compara con una colección de genotipos presentes en una base de datos y para los que se almacenan los fenotipos correspondientes en una base de datos. Estos ensayos proporcionan una determinación precisa del efecto farmacológico y la aparición de resistencia del virus en un paciente, pero no se proporciona información sobre los niveles de fármaco circulantes. Por tanto, es un aspecto de la presente invención unir las determinaciones del nivel de fármaco, según los métodos de la presente invención, con la prueba de resistencia. La unión de la determinación de los niveles de fármaco con la prueba de resistencia puede proporcionar una prueba adicional de la eficacia del tratamiento.

La concentración plasmática mínima o la concentración mínima puede ser crítica durante el tratamiento de enfermedades o estados en los que la diana farmacológica se somete a modulación con el fin de superar el efecto farmacológico. Ejemplos de este último fenómeno se encuentran en las enfermedades infecciosas como VIH, infecciones bacterianas y cáncer. Por ejemplo, la presencia de fármacos genera presión mutacional sobre la proteasa del VIH para que escape del tratamiento farmacológico y la concentración insuficiente de inhibidor facilita tal escape. La determinación del nivel de fármaco en un paciente y el uso de este valor para determinar el nivel mínimo pueden ser importantes para obtener dosificaciones lo suficientemente altas para proporcionar una combinación terapéuticamente eficaz.

La concentración de un principio activo, determinada usando el procedimiento de la presente invención, puede usarse en modelos farmacológicos para proporcionar estimaciones de parámetros farmacocinéticos que describen el perfil farmacológico en un individuo. Con el uso de modelos farmacocinéticos de poblaciones, el nivel de fármaco mínimo puede determinarse a partir de una única muestra de un paciente. Se supone que un gran grupo de pacientes infectados por VIH reciben el mismo fármaco antirretroviral en la misma dosis tres veces al día. El perfil concentración plasmática promedia-tiempo del fármaco en la población de pacientes puede parecer tal como se muestra en la figura 1 (línea en negrita). Sin embargo, debido a la variabilidad interindividual de los procesos farmacocinéticos (absorción, distribución, eliminación), las curvas individuales pueden diferir de los perfiles típicos, tal como se ejemplifica mediante la línea de puntos. Si se trazan todas las curvas individuales, pueden cubrir un intervalo marcado por las barras verticales. Si sobre la misma gráfica, se proporcionan concentraciones eficaces mínimas (CEM) (una línea discontinua horizontal da un ejemplo, figura 1), también cubrirán el mismo intervalo. La concentración de fármaco en una fracción de los pacientes puede disminuir por debajo de su CEM y esto reduce el resultado terapéutico y posiblemente conduce a la resistencia al fármaco. El nivel mínimo de un paciente individual puede usarse posteriormente para calcular el nivel de fármaco requerido para alcanzar dosis terapéuticamente eficaces durante el intervalo de dosificación.

Los métodos y resultados de la presente invención, por ejemplo la concentración de un fármaco, pueden usarse para determinar parámetros farmacológicos del fármaco en un individuo, incluyendo niveles mínimos (C_{t}), concentración máxima (C_{max}), el área bajo la curva (AUC), velocidad de eliminación, etc. Por tanto, el nivel determinado puede entrar en un modelo farmacocinético de poblaciones y pueden calcularse las variables farmacocinéticas tales como C_{t}, C_{max}, AUC (documento WO 02/23186). Estas variables farmacológicas pueden usarse para calcular por ejemplo la posible toxicidad de una dosis determinada, el tiempo de exposición a un fármaco (por ejemplo en caso de compuestos radioquímicos) o la concentración mínima encontrada.

Con el fin de obtener un tratamiento eficaz, la exposición de un individuo a un fármaco, por ejemplo la concentración mínima, AUC, debe superar un cierto nivel. Este nivel se determina mediante la naturaleza de la población del virus. La razón de la exposición al fármaco (nivel mínimo, AUC, otros) con respecto a la resistencia al fármaco (resistencia, CI_{50}, CI_{90}, otros) predice el éxito del tratamiento. Esta razón puede expresarse como el IQ (cociente inhibidor) (IQ = C_{t}/CI_{50}.). Este valor de IQ puede normalizarse adicionalmente para obtener un valor ajustado de la unión a proteínas (IQ normalizado, NIQ). Un enfoque para obtener este valor ajustado es determinar la C_{t} media para una población y la CI_{50} para un principio activo para una cepa de referencia, es decir una cepa de VIH de laboratorio de referencia. El cociente de estos últimos dos valores da (C_{t}/CI_{50})_{referencia}. El IQ normalizado se proporciona mediante el cociente: [(C_{t}/CI_{50})]_{paciente}/[(C_{t}/CI_{50})]_{referencia}.

En una realización, la presente invención proporciona un método para determinar el cociente inhibidor (IQ), en el que el nivel mínimo se basa en el nivel del principio activo presente en una muestra biológica determinado según los métodos descritos en el presente documento. El IQ puede normalizarse adicionalmente.

La invención proporciona además un método de diseño de un tratamiento, comprendiendo el método: determinar el nivel de un principio activo presente en una muestra biológica según los métodos descritos en el presente documento, determinar el nivel mínimo para dicho principio activo, volver a calcular la dosificación para dicho principio activo usando un modelo cinético de poblaciones para conseguir niveles de principio activo que superan la dosis mínima eficaz durante el intervalo de dosificación.

En un desarrollo adicional, la concentración encontrada en la muestras de un paciente puede transmitirse electrónicamente a un servidor en el que se determinan los valores farmacocinéticos mediante métodos basados en poblaciones. Estos valores, es decir datos farmacocinéticos y niveles de fármaco pueden unirse a los datos de resistencia para proporcionar una medición integrada de la eficacia del tratamiento. La información proporcionada puede usarse además para diseñar un tratamiento con el fin de conseguir suficiente efecto clínico. Estos datos, tras el procesamiento, pueden transferirse de nuevo, por ejemplo al facultativo responsable.

El ensayo puede usarse para analizar niveles de fármaco en animales y estudios farmacocinéticos en animales.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método de determinación de la potencia inhibidora de una muestra biológica, comprendiendo el método: (a) obtener una muestra biológica, proporcionar un contenedor que comprende una molécula bioactiva diana, añadir la muestra biológica a dicho contenedor para obtener una mezcla, añadir un reactivo de la molécula bioactiva a la mezcla y determinar una señal, (b) relacionar la señal a una curva patrón de referencia preparada con al menos una muestra de referencia, en el que la muestra de referencia tiene la misma matriz que la muestra biológica, completándose opcionalmente la matriz con un principio activo a una concentración definida y en el que la señal de la muestra de referencia se ha determinado según (a).

El procedimiento de ensayo puede usarse para monitorizar interacciones entre la enzima, el sustrato y el inhibidor, pero igualmente también entre receptor y ligando; receptor y antagonista; receptor y agonista; antígeno y anticuerpo. Para el análisis de principios activos que interaccionan con moléculas de receptor, se prefieren ligandos en vez de sustratos para el método de análisis de la presente invención.

En una realización, el ensayo de la presente invención añade a la técnica un ensayo flexible, rápido, fácil de normalizar, económico y homogéneo para monitorizar niveles de fármaco en muestras de pacientes usando una enzima. Pueden llevarse a cabo múltiples ensayos en paralelo y puede limitarse la variación entre laboratorios proporcionando kits que contienen los elementos necesarios para realizar la reacción.

Figuras

Figura 1: Concentración plasmática de principio activo (mg/l) en función del tiempo. CEM es la concentración eficaz mínima. El tiempo se expresa en horas. La concentración plasmática de fármaco debe variar entre la CEM y el nivel tóxico.

Figura 2: Monitorización de la escisión del sustrato mediante la proteasa del VIH en tiempo real en un lector de fluorescencia en placas de microtitulación. Cada cuadrado (A1 a H10) representa las curvas de progreso de la fluorescencia (eje Y) en función del tiempo (eje X). El ensayo se llevó a cabo tal como se describe en la parte experimental. La pendiente de cada curva representa la velocidad inicial de la reacción enzimática. La fila A contiene muestras control sin inhibidor. Las columnas 1 y 2 contienen extractos de suero de perro a los que se les añadieron adiciones conocidas de una concentración diferente del compuesto 1 utilizado para generar una curva de calibración. Las columnas 3 y 4; 5 y 6; 7 y 8; 9 y 10, contienen suero de perro al que se le añadió adiciones conocidas de 100 nM, 10 nM, 10.000 nM, y 1.000 nM del compuesto 1, 2 y 3 respectivamente. Las filas B a H contienen diluciones del suero al que se le añadieron adiciones conocidas tal como se indica en la derecha. Las diluciones varían desde 1:120 (fila B) hasta 1:1 (fila H). Véase el ejemplo 1 para los detalles.

Figura 3: Velocidad inicial de escisión del sustrato calculada usando una regresión lineal mediante un programa para lectores de placas. La escisión del sustrato se monitorizó en tiempo real en un lector de fluorescencia de placas de microtitulación. Se usaron los extractos de suero de perro a los que se les añadieron adiciones conocidas de concentraciones diferentes del compuesto 1. Las unidades de fluorescencia relativa (UFR, eje Y) se monitorizaron en función del tiempo (segundos, eje X).

Figura 4: Cálculo de una curva patrón de referencia, los datos ilustran además la precisión del método titulado. Sa: muestra; concentración en nM; Valores: en (UFR/min.) x 1000; StDev (desviación estándar): en (UFR/min.) x 1000; CV%: coeficiente de variación; Valor medio: valor medio en (UFR/min.) x 1000; Razón: razón del valor medio de SaOX con respecto al valor medio de Sa01. X es de 2 a 8 (véase la figura).

Figura 5. Curva patrón de referencia típica que relaciona la concentración de inhibidor en nM (eje X) con la razón de la muestra de prueba en comparación con una muestra control (expresada como una razón de valores UFR, eje Y).

Figura 6: Cálculo de la concentración de analito. El cálculo del analito se realiza automáticamente mediante el programa para lectores de placas. La concentración se calculó para el analito presente en las columnas 9 y 10 en la figura 2. Los datos muestran que puede necesitarse diluir las muestras antes del análisis. En el presente caso, una dilución entre 6 y 60 es óptima. (StDev = desviación estándar; Result. Aj. = resultado ajustado para la dilución).

Figura 7: Exactitud y precisión del método. Se realizaron cinco experimentos independientes en cinco fechas diferentes para evaluar la exactitud y la reproducibilidad del método.

Exp.: experimento. El error de cada determinación se muestra en paréntesis y representa la diferencia entre la concentración de inhibidor medida y la concentración de inhibidor a la que se le añade adiciones conocidas en %.

Ejemplos

El presente ejemplo y los dibujos adjuntos ilustran la presente invención. Su fin ilustrativo no se construye como limitativo del alcance de la invención.

Ejemplo 1 Determinación del inhibidor de PR del VIH (inhibidor de la inmunodeficiencia humana, VIH; PR, proteasa), de la concentración en muestras de suero

Se usaron los siguientes compuestos en el presente análisis (3R,3aS,6aR)-hexahidrofuro[2,3-b]furan-3-il-N-[(1S,
2R)-3-[[(4-aminofenil)sulfonil](2-metilpropil)amino]-2-hidroxi-1-(fenilmetil)propil]-carbamato, (compuesto 1, CAS 206361-99-1); (3R,3aS,6aR)-hexahidrofuro[2,3-b]furan-3-il-N-[(1S,2R)-3-[(1,3-benzodioxol-5-ilsulfonil)(2-metil-
propil)amino]-2-hidroxi-1-(fenilmetil)propil]-carbamato (compuesto 2, CAS 333798-27-9) y (3R,3aS,6aR)-hexahidrofuro[2,3-b]furan-3-il-N-[(1S,2R)-2-hidroxi-3-[[(4-metoxifenil)sulfonil](2-metilpropil)amino]-1-(fenilmetil)pro-
pil]-carbamato (compuesto 3, CAS 206362-00-7). El método de la presente invención también puede usarse con otras sulfonamidas tal como se describe en la patente estadounidense 5.843.946. Se añadieron adiciones conocidas del compuesto 1 de inhibidor de PR VIH a cuatro alícuotas de suero de perro normal, hasta una concentración final de 10, 100, 1.000 y 10.000 nM (denominado más adelante como muestras de analito) respectivamente. Se usaron otras 8 alicuotas de suero de perro para generar una curva patrón de referencia. A estas 8 alicuotas se les añadió adiciones conocidas de una concentración diferente del compuesto 1 desde 0 hasta 100 nM. Por tanto, se usó el compuesto 1 como referencia para preparar una curva patrón de referencia. Se precipitaron las proteínas séricas en todas las muestras, usando metanol (MeOH) al 66% (v/v). A una parte de la muestra sérica se le añadieron dos partes de MeOH, se mezcló y se centrifugó a 16.100 g durante 30 min. Se recuperó el sobrenadante y pudo almacenarse durante al menos 2 semanas a -20ºC antes del ensayo. Se utilizan 60 \mul para el ensayo con cubetas o se utilizan 24 \mul para el ensayo con lector de placas. Se prepararon antes del ensayo seis diluciones en serie de 1:2 a 1:120 de los extractos, obtenidos a partir de las muestras de analito. Se utilizó para la dilución el extracto de metanol de suero de perro normal sin inhibidor.

Para el ensayo con lector de placas se usaron las siguientes condiciones: se preparó el tampón de acetato de sodio (NaOAc) 50 mM, pH 4,5, ditiotreitol (DTT) 2 mM, cloruro de sodio (NaCl) 200 mM, Tween 20 al 0,01%. El sustrato estaba presente a una concentración final de 20 \muM en el tampón anterior. El sustrato usado se basa en un sustrato natural para la proteasa del VIH. Contiene una porción (P_{4}-P_{4}') de la proteína p17-p24 gag. R-E(EDANS)-S-Q-N-Y-P-I-V-Q-K(DABCYL)-R-OH solamente presenta baja fluorescencia, sin embargo la fluorescencia aumenta tras la escisión mediante la proteasa del VIH del enlace Y-P (Science, 1989, 247, 954-958). La enzima, proteasa del VIH-1 de tipo natural, estaba presente en el tampón anterior (NaOAc 50 mM, pH 4,5, DTT 2 mM, NaCl 200 mM), Tween 20 al 0,01%) a una concentración final de 4-5 nM. Debe apreciarse que también pueden usarse otras formas de proteasa del VIH, incluyendo las formas mutantes de la proteasa.

El ensayo se realiza a temperatura ambiente (TA). Se administraron 88 \mul de tampón (que contiene la enzima) y se añadieron 24 \mul de extracto de suero o dilución de extracto de suero, usando un pipeteador de múltiples canales. Se inició la reacción añadiendo 88 \mul de tampón que contenía sustrato y se monitorizó con el tiempo el aumento de fluorescencia (figura 2). Se preparó la curva patrón de referencia según este método usando esta vez 24 \mul de referencia. La reacción control que consistía en suero extraído estaba desprovista de cualquier inhibidor de proteasas. La velocidad inicial de la escisión del sustrato, que se calculó mediante el programa para lectores de placas para cada pocillo (figura 3) era inversamente proporcional a la concentración del inhibidor. La velocidad inicial de la muestra control proporcionó una señal del 100% y se usó para determinar la razón con respecto la muestras a partir de la curva patrón de referencia así como a partir de muestras de analito, que contenían un inhibidor (razón señal de muestra/señal de control).

Se monitorizó la tasa inicial del aumento de fluorescencia para cada dilución del compuesto 1 (figura 2, columnas 1 y 2) para proporcionar una curva patrón de referencia (figuras 4, 5). La curva patrón de referencia une la razón (señal de muestra/señal de control) a la concentración de fármaco para cada dilución del compuesto 1. La medición de inhibición, expresada como una razón, proporciona una estimación de la concentración del compuesto 1 correspondiente. Por ejemplo, la concentración de inhibidor en la muestra de analito que está presente en las columnas 9 y 10 en la figura 2, puede calcularse usando un programa para lectores de placas tal como se muestra en la figura 6. Para el cálculo final se promediaron las dos concentraciones que dieron la razón más próxima a 0,5. La concentración calculada resultante era de 1.109 nM, comparable con la concentración real en esta muestra - 1.000 nM. Obsérvese que la curva patrón de referencia puede prepararse usando cualquier inhibidor de proteasas o mezclas de los mismos.

Aunque el ensayo anterior no discrimina entre los diferentes inhibidores de proteasas del VIH, proporciona una determinación fidedigna y precisa de la inhibición de proteasas del VIH y simultáneamente el nivel de la actividad inhibidora en la muestra biológica. Este formato de ensayo determina la cantidad total del inhibidor de proteasas presente en una muestra biológica. Además, el ensayo puede proporcionar una prueba sobre el porcentaje del inhibidor unido a proteína tal como se da como ejemplo en el ejemplo 3.

La determinación de la concentración de inhibidor tal como se describe en el ejemplo 1, se realizó en cinco días diferentes para evaluar la precisión y la exactitud. Los resultados se presentan en la figura 7.

El principio de la presente invención puede usarse para cualquier tipo de compuesto que interfiera con una molécula bioactiva. Será evidente que el experto en la técnica conocerá diferentes enfoques de realización de la presente invención.

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Ejemplo 2 Efecto de MeOH

La extracción de metanol se usa comúnmente para la determinación de concentraciones de inhibidor de PR VIH en suero humano mediante LC-EM. Se precipitan las proteínas séricas con MeOH al 75%. Puesto que la alta concentración de metanol puede interferir con los ensayos basados en enzimas, se reduce la concentración de MeOH utilizada para la extracción de inhibidores hasta el 66%. Se realizó la siguiente prueba para comparar la extracción de MeOH al 66% y MeOH al 75%. Se prepararon mezclas del compuesto 1 y 2 a las concentraciones de 9 \muM y 0,9 \muM y se extrajeron con MeOH al 66 y 75% tal como se describió en el ejemplo 1. Los resultados se resumen en la tabla 1. "Ext" significa extracción en la tabla 1.

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TABLA 1

1

Ejemplo 3 Determinación de la concentración de fármaco total frente al unido a proteína

Según múltiples estudios la mayoría de los inhibidores de PR VIH están muy unidos a proteína plasmática (por ejemplo el 90-99% para amprenavir, nelfinavir, saquinavir y ritonavir y aproximadamente el 60% para indinavir (IDV)). Puesto que la unión a proteína afecta a la potencia farmacológica, se desarrolló un método simple para la determinación de la concentración de fármaco unido a proteína frente al no unido. Se usó el siguiente protocolo para medir la concentración de fármaco no unido:

A 550 \mul de suero humano normal se le añadieron adiciones conocidas del inhibidor de proteasas SC-52151 a una concentración final de 1 \muM. Se usó una alicota 50 \mul para la determinación de la concentración de inhibidor total tal como se describió en el ejemplo 1. Se usó SC-52151 para generar una curva de calibración.

Se cargaron 500 \mul de muestra de suero a la que se le añadieron adiciones conocidas en un microconcentrador microcon-10 y se centrifugó a 5000 x g, a temperatura ambiente durante 5 min. Se extrajo el flujo a través de la fracción (\sim10% de la carga, 50 \mul) con metanol al 66% según el protocolo descrito en el ejemplo 1. El filtrado contiene la fracción no unida de los inhibidores de proteasas. Se prepararon diferentes diluciones de extracto de metanol y se realizó el ensayo en lectores de placas de microtitulación para determinar la concentración de fármaco libre o la no unida tal como se describió en el ejemplo 1. Como en el caso de la concentración de inhibidor total (ejemplo 1), la concentración de fármaco no unido está presente como una actividad inhibidora equivalente a la concentración de fármaco de referencia (en este caso la actividad inhibidora equivalente a una concentración de SC-52151 en nM derivada de la curva de calibración).

Usando los métodos de la presente invención, puede determinarse la razón de la concentración de fármaco total frente al libre y expresarse como un porcentaje.

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TABLA 2 Porcentaje de inhibidor de proteasas del VIH en muestra no unido a proteínas

2

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La concentración de indinavir libre (36,5%) concuerda con los datos presentes en la bibliografía (40%). En suero humano, los inhibidores de proteasas del VIH están unidos principalmente a \alpha-glucoproteína ácida. La concentración de fármaco libre determinada en estos experimentos es inversamente proporcional a la constante de unión del fármaco a \alpha-glucoproteína ácida. K_{a} es la constante de unión.

20

<110> Tibotec Pharmaceuticals Ltd.

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<120> ENSAYO DE PROTEASAS PARA LA MONITORIZACIÓN TERAPÉUTICA DE FÁRMACOS

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<130> TIP 031 seq listing

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<140>

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<141>

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<150> US 60/331117

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<151> 08-11-2001

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<160> 10

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sustrato

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<400> 1

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\sa{Ser Gln Asn Thr Pro Ile Val Asn}

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<210> 2

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sustrato

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<400> 2

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\sa{Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Trp Leu}

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sustrato

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<400> 3

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\sa{Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Lys}

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<210> 4

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<211> 3

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sustrato

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<400> 4

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\sa{Pro Ile Val}

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<210> 5

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sustrato

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<400> 5

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\sa{Tyr Pro Ile Val}

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<210> 6

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sustrato

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\sa{Ala Arg Val Tyr Phe Glu Ala}

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<210> 7

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sustrato

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\sa{Asp Asp Ile Val Pro Cys Ser Met Ser Lys}

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<210> 8

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sustrato

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\sa{Asp Asp Ile Val Pro Cys Ser Met Lys Arg Arg}

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<210> 9

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sustrato

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\sa{Asp Thr Glu Asp Val Val Pro}

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<210> 10

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sustrato

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<400> 10

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\sa{Arg Glu Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Lys Arg}

Claims (14)

1. Método para determinar la potencia inhibidora de un inhibidor del VIH en una muestra biológica, que comprende: i) utilizar una muestra biológica de un paciente; ii) proporcionar una molécula bioactiva en la que la molécula bioactiva es una proteasa del VIH; iii) proporcionar un reactivo para la molécula bioactiva en el que el reactivo es un sustrato para la proteasa del VIH, siendo R-E(EDANS)-S-Q-N-Y-P-I-V-Q-K(DABCYL)-R-OH; iv) añadir la muestra biológica, la molécula bioactiva y el reactivo para una molécula bioactiva a un contenedor; v) determinar una señal; vi) relacionar la señal de v) con una curva patrón de referencia preparada con al menos una referencia.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la proteasa del VIH comprende al menos una mutación.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la señal es fluorescencia.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el contenedor es un pocillo en una placa de múltiples pocillos.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la muestra biológica se diluye antes de añadirla al contenedor.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 que comprende, en el que antes de la etapa iv) la fracción unida a proteína y la fracción no unida a proteína del principio activo en la muestra biológica se separan.

7. Método según la reivindicación 6, en el que la fracción unida a proteína y la fracción no unida a proteína del principio activo en la muestra biológica se separa a través de un procedimiento seleccionado de precipitación, filtración, diálisis y centrifugación.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la muestra biológica comprende un inhibidor reversible.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la referencia para determinar la curva patrón de referencia tiene la misma matriz biológica que la muestra biológica.

10. Método según cualquier reivindicación 1 ó 2, en el que la potencia inhibidora se expresa como la concentración de fármaco o como una cantidad de fármaco.

11. Método según la reivindicación 10, que comprende además determinar un nivel mínimo de un inhibidor del VIH en un individuo usando un modelo farmacocinético de poblaciones.

12. Método según la reivindicación 11, que comprende además determinar el cociente inhibidor de un inhibidor del VIH en una muestra biológica, usando el nivel mínimo del inhibidor del VIH en un individuo.

13. Método según la reivindicación 11, que comprende además diseñar un tratamiento, determinando el nivel mínimo de un inhibidor del VIH en un individuo, volviendo a calcular la dosificación para el inhibidor del VIH usando un modelo cinético de poblaciones, consiguiendo los niveles de inhibidor del VIH superar la dosis eficaz mínima durante el intervalo de dosis.

14. Método para determinar la potencia inhibidora de un inhibidor del VIH en una muestra biológica, comprendiendo el método: (a) utilizar una muestra biológica de un paciente, proporcionar un contenedor que comprende una proteasa del VIH, añadir la muestra biológica a dicho contenedor para obtener una mezcla, añadir R-E(EDANS)-S-Q-N-Y-P-I-V-Q-K(DABCYL)-R-OH de la proteasa del VIH a la mezcla y determinar una señal de fluorescencia, (b) relacionar la señal con una curva patrón de referencia preparada con al menos una muestra de referencia, en el que la muestra de referencia tiene la misma matriz que la muestra biológica, completándose opcionalmente la matriz con un inhibidor del VIH a una concentración definida y en el que la señal de la muestra de referencia se ha determinado según (a).