JP2005513420A

JP2005513420A - 治療薬をモニタリングするためのプロテアーゼアッセイ

Info

Publication number: JP2005513420A
Application number: JP2003542636A
Authority: JP
Inventors: ガルニク，セルゲイ; ユー，ベテイ; エリクソン，ジヨン・ダブリユー; マーコウイツ，マーテイン
Original assignee: テイボテク・フアーマシユーチカルズ・リミテツド
Priority date: 2001-11-08
Filing date: 2002-11-08
Publication date: 2005-05-12
Also published as: US20050221286A1; EP1446498B1; US7320878B2; EP1446498A2; WO2003040390A3; ATE389029T1; DE60225587T2; WO2003040390A2; CA2466497A1; DE60225587D1; ES2302860T3

Abstract

本発明はサンプル中に存在する有効成分の量または濃度を決定するための生物学的アッセイのさらなる開発および使用に関する。本発明の酵素アッセイはＨＩＶインヒビターのようなレトロウイルスプロテアーゼインヒビターを含むプロテアーゼインヒビターの量または濃度を決定する。

Description

定性的および定量的アッセイは、ライフサイエンスの様々な分野で大変重要である。本発明はサンプル中に存在する有効成分の量または濃度を決定するための生物学的アッセイの使用に関する。特に本発明の酵素アッセイは、ヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼインヒビターのようなレトロウイルスプロテアーゼインヒビターを含むサンプル中のプロテアーゼインヒビターの量または濃度を決定する。

治療薬のモニタリングは、処置効力の追跡に重要な役割を果たす。治療効果を達成するためには、酵素インヒビターとして作用する薬剤を、関与する酵素の十分な阻害を提供する投薬用量で投与すべきである。特定の濃度で患者における薬剤の治療効果をモニタリングするために診断的道具が開発された。

今日、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ）インヒビターに関するモニタリングアッセイは、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）および液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）のような技術に依存している［非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３］。これらの方法は１人の患者サンプル中に数種のインヒビターを同時にモニタリングすることができるが、これらのアッセイは標的酵素の阻害の測定を提供しない。Ｌｅｅｌａｅｔａｌ．はＨＩＶインヒビターを測定するための現在の方法を臨床的な研究室で日常的に利用することはできず、そして簡略化された、より煩雑ではないアッセイが必要であり、そしてさらに開発されることが必要であると報告する［非特許文献４］。

薬剤濃度をモニタリングするための酵素の使用は、例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４に記載された。後者の特許公報は溶液中に挿入されるコートされたピンの使用を開示する。例えばピンを基質でコートすれば、プロテアーゼそして最終的にはインヒビターが溶液中に存在する。ピンの挿入により反応が開始され、そして反応溶液からピンを取り出すことにより酵素反応が止まる。特許文献２はサンプル中に存在するβ−ラクタム抗生物質の濃度をモニタリングするための酵素アッセイの使用を開示する。特許文献１は内在性プロテアーゼインヒビターの濃度を測定するためのアッセイを記載する。

患者のサンプル中に残存するプロテアーゼ活性を測定する方法が記載された［特許文献５；非特許文献５］。残存する酵素活性は薬剤効果および患者のコンプライアンスの尺度である。この種のアッセイは、経路が十分に阻害されるかどうかの情報を提供する。サンプル中の該薬剤のレベルに関する情報は得られない。この種のアッセイは、標的酵素が非−侵襲的様式（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅｍａｎｎｅｒ）で容易に入手でき、そして酵素反応を可能にするために十分な量で該サンプル中に存在する場合にのみ日常的なモニタリングに使用することができる。したがってこの取り組みは、ＨＩＶプロテアーゼが血清中に十分な量で存在しないので、血清のような患者のサンプル中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターをスクリーニングするために直ちに使用することはできない。

ＨＩＶプロテアーゼ活性を測定するための蛍光基質の使用が、例えばＭａｔａｙｏｓｈｉｅｔａｌ．［非特許文献６］、Ｔｙａｇｉｅｔａｌ．［非特許文献７］、Ｔｏｔｈｅｔａｌ．［非特許文献８］およびＷａｎｇｅｔａｌ．［非特許文献９］、ならびに幾つかの特許出願公報［例えば特許文献６；特許文献７、特許文献８を参照にされたい］で記載された。これらの開示はＨＩＶプロテアーゼに及ぼすインヒビターの効果をどのように決定するかを記載する。これらのアッセイは高処理量スクリーニングに有用である。高処理法ではポジティブネガティブスクリーニング、すなわち阻害かまたはそうではないかを行うが、臨床的アッセイは医師が治療に関する結論を引き出すことができるように、治療効力の尺度を提供することが必要である。スクリーニングアッセイでは、調査中の化合物濃度は知られているが、臨床サンプルでは化合物濃度は未知である。

患者の治療の個別化の観点から、生物学的サンプル中の有効成分の量または濃度を決定する柔軟性のある取り組みが必要である。さらに生物活性（ｂｉｏ−ａｃｔｉｖｅ）分子に及ぼす薬剤の代謝産物の効果を説明できるアッセイも必要である。したがって生物活性分子を生物学的サンプルに加え、そして生物活性分子の活性を測定することを含んでなる本発明を創造した。遊離およびタンパク質結合薬剤濃度を決定することの重要性の観点から、本発明はこの必要性に合った分離手法を導入する。
米国特許第４，９１８，００１号明細書米国特許第４，５４６，０７６号明細書米国特許第５，５７６，１７７号明細書国際公開第９９／５４７３４号パンフレット欧州特許第１４８１９３号明細書国際公開第９９／６７４１７号パンフレット欧州特許第４２８０００号明細書欧州特許第５１８５５７明細書Ｔｈｅｒ．ＤｒｕｇＭｏｎｉｔ．２００１，２３（４），３８０Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．ＢＢｉｏｍｅｄＳｃｉ．Ａｐｐｌ（２００１），７５８（２），１２９Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．ＢＢｉｏｍｅｄＳｃｉ．Ａｐｐｌ（２０００），７４０（１），４３Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．２００１，３５（６），７４５Ｔｈｅｒ．ＤｒｕｇＭｏｎｉｔ．２００１，２３（２），９３Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９０，２４７，９５４Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２，２００（１），１４３Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．１９９０，３６（６），５４４Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９９０，３１（４５），６４９３

本発明は、患者のサンプル中に存在する薬剤濃度を決定するための改善された生物−分析方法に関する。より詳細には本方法は生物学的サンプルの阻害効能を定量するための蛍光アッセイに関する。この方法は治療薬モデリング向けて一体化した取り組みで使用して、生物−分析技術を耐性試験および薬物動態学データの結果と結び付けることができる。

本発明は、生物学的サンプル中の有効成分の阻害効能を決定する方法に関し、この方法は：ｉ）生物学的サンプルを提供し；ｉｉ）生物活性分子を提供し；ｉｉｉ）生物活性分子用の試薬を提供し；ｉｖ）生物学的サンプル、生物活性分子および生物活性分子用の試薬を容器に加え；ｖ）シグナルを測定し；ｖｉ）少なくとも１つの参照を用いて調製した参照標準曲線にｖ）のシグナルを関連付けることを含んでる。

本発明に従い、「生物学的サンプル」には生物、すなわちヒトまたは動物に由来し、任意に有効成分を含んでなる任意のサンプルを含む。生物学的サンプルには限定するわけではないが、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、射精液、導乳管洗浄液および毛髪を含む。生物学的サンプルはさらに、培養フラスコ、ウェルおよび他の種類の容器から得たサンプルを含む。該生物該的サンプルは１以上の有効成分を含んでなる。

本発明で使用する「生物活性分子」は、野生型の生物活性分子またはその組換え変更体を含む。組換え変更体は１以上の有効成分に対する耐性を示す突然変異体を含むことができ、蛍光または蛍光消光部分（１つまたは複数）を含むことができ、あるいは融合構築物でもよい。生物活性分子は均一なアッセイを提供するために、標識された基質またはリガンドと共に使用することができる（例えば蛍光共鳴転移、ＦＲＥＴ；生物発光共鳴転移，ＢＲＥＴ）。本発明の生物活性分子は例えば酵素活性（例えばＨＩＶプロテアーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素、ＨＣＶプロテアーゼ（ＨＣＶ、Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶポリメラーゼ、マトリックスメタロプロティナーゼ、レニン、トロンビン）；結合活性または他の種類の相互作用を表す生物分子を意味する。生物活性分子は溶液、例えば緩衝化溶液中に提供することができる。

生物活性分子用の「試薬」には酵素の基質；レセプターのリガンドを含む。試薬はさらにコーファクター、抗体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）等を含む。１つの態様では試薬はＨＩＶプロテアーゼの基質であるか、またはＨＣＶプロテアーゼの基質である。本発明の１つの観点では、生物分子による該基質の転換を蛍光を使用してモニタリングすることができる。試薬は溶液で提供することができる。溶液の例にはバッファー、有機溶媒、有機溶媒を補完した緩衝化溶液を含む。

「有効成分」とは化学品、薬剤、抗体、リガンド、アンチセンス化合物、アプタマー、リボザイム、ペプチド、非−天然ペプチド、タンパク質、ＰＮＡ（ペプチド核酸）および核酸を含む任意の化合物、または少なくとも１つの化合物を含む組成物を意味する。これはさらに投与される時の化合物およびそれらの代謝産物を含んでなる。代謝産物は生理学的条件下で生成し得る。本発明で使用するような有効成分のレベルとは、該サンプル中の該有効成分の量または濃度を意味する。生物学的サンプル中に存在する有効成分は、参照中の有効成分とは異なってもよい。これらの状況下では、生物学的サンプルの阻害効能は、参照標準曲線に由来する有効成分の量または濃度に等しい。この量は例えばｇ、ｍｌ、モルで表すことができる。濃度は例えばｍｌ／ｍｌ、ｇ／ｌ、Ｍ等で表すことができる。

本発明による「マトリックス」には、溶液、バッファー、限定するわけではないが血液、血漿、血清、だ液、脳脊髄液、射精液、導乳管洗浄液もしくは組織ホモジネートを含む生物学的サンプル、またはさらにバッファーで補完された生物学的サンプルを含む。

本発明で使用する「容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）」は限定するわけではないが、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、ウェル、キュベット、容器（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）等を含む。化合物または液体は該容器中で混合することができる。適当には、測定は該容器内で行われる。容器は別れた物体、例えば石英キュベットであることができ、または例えば１６ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートのような多数の形式に配列され得る。

「シグナル」は蛍光、蛍光偏光、時間分解蛍光、発光、時間分解発光、吸収、放射性、共鳴エネルギー転移メカニズム、磁気学を含む生物学的アッセイにより生成される任意の出力を意味する。１つの観点では、出力はアッセイ中に生成される。シグナルの例には吸収、相対蛍光単位等を含む。シグナルは生物活性分子を生物活性分子用の試薬と反応させることにより生成することができる。シグナルは予め定めたインキューベーション期間の終わり、例えば１０分後に測定することができる。シグナルは連続的にモニタリングすることができる。これには規則的な時間間隔でシグナルを記録することを含む。この規則的な時間間隔には例えば予め定めた時間間隔、例えば１０秒毎、５秒毎等を含む。シグナルはシグナルの比率に転換することができる。そのような比率の例には対照反応で生成したシグナルに対して生物学的サンプルにより生成されたシグナルの比率を含む。シグナルは初速度、最大速度、平均速度を含む力学的変数に転換してもよい。

「参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」とは参照標準曲線を調製するために使用する有効成分を意味する。参照は単一化合物または少なくとも２つの化合物の混合物である。該参照は生物学的サンプルと同一のマトリックス中に存在することができる。該参照は必ずしも生物学的サンプル中に存在するものと同じ有効成分である必要はない。１つの取り組みでは、参照として使用する化合物は生物学的サンプル中に存在する有効成分と同じものである。

「生物学的アッセイ」は、酵素反応、レセプターリガンド相互作用、ＤＮＡポリメラーゼ活性、逆転写酵素活性、インテグラーゼ活性、抗原−抗体相互作用等の測定を含む生物活性分子により生成される生物学的効果を測定することに依存するアッセイを意味する。

「関連する」とは測定されたシグナルが参照標準曲線と比較され、この曲線からシグナルを阻害の尺度または参照化合物のレベルに転換することができる。

「参照標準曲線」には限定するわけではないが、シグナルが阻害の尺度に対してプロットされている曲線を含む。阻害の該尺度は、百分率として表すことができる。参照標準曲線はさらに、シグナルが参照の濃度または参照の量に対してプロットされている曲線を含む。参照標準曲線は比率、例えば対照で測定されたシグナルに対して生物学的サンプルを用いて測定したシグナルの比率を、有効成分のレベルに対してプロットすることにより構築してもよい。適当には、該参照標準曲線は特に工程ｉ）〜ｖ）で述べたように本発明の手順に従い調製した。参照標準曲線の調製では、工程ｉ）で生物学的サンプルの代わりに参照を使用する。しかし生物活性分子および生物活性分子用の試薬は、生物学的サンプルの分析に使用するものと同一である。「対応する値」は、参照標準曲線の参照の測定に基づき、参照中に存在する有効成分のシグナル、活性、阻害の割合、レベルを含む。該レベルは濃度（例えばモル（Ｍｏｌａｒ）、ｇ／ｌ、ｇ／ｇ等）または量（モル（ｍｏｌ）、ｇ、ｍｌ、ｍｇ）として表すことができる。

「阻害効能（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｐｏｔｅｎｃｙ）」は、有効成分のレベル、すなわち有効成分の量または濃度として阻害の百分率で表すことができる。生物学的サンプル中に存在する有効成分が、参照標準曲線を確立するために使用した有効成分とは異なるということは本発明の目的である。参照標準曲線を調製するために使用した有効成分が生物学的サンプル中に存在する有効成分と異なる場合、生物学的サンプルの阻害効能は、参照標準曲線を調製するために使用した有効成分に等しい量に関連させることができる。そのような場合、阻害効能は薬剤レベルとして表すことができ、すなわち生物学的サンプルにより生成されたシグナルは、対応する薬剤レベルに関連する。１つの態様では、参照標準曲線を調製するために使用した有効成分は生物学的サンプル中に存在する有効成分と同じである。後者の場合、阻害効能は生物学的サンプル中の有効成分のレベルに等しい。

生物学的サンプル中の有効成分の阻害効能の決定では、工程ｉ）〜ｉｉｉ）を任意の順序に置いてよい。工程ｉｖ）では、各成分を異なる順序で加えることができる。例えばプロテアーゼ活性が本発明の方法に従い決定される場合、３種の成分、生物学的サンプル、プロテアーゼおよびプロテアーゼ用の基質が必要である。これら３種の成分は本発明の目的では、反応が生物活性分子または生物活性分子用の試薬のいずれかで開始するならば、任意の順序で一緒にしてよい。例えば生物学的サンプルを最初に生物活性分子の試薬に加えることができる。この手順では反応は生物活性分子を混合物に加えることにより開始され、そして続いてシグナルが測定される。生物学的サンプルを最初に生物活性分子に加えることができることも明白である。この取り組みでは、反応は生物活性分子用の試薬を加えることにより開始される。当業者には生物学的サンプルを生物活性分子または生物活性分子用の試薬のいずれかに加える上記手順の代わりに、逆も行うことができるということは明白である。例えば生物活性分子を生物学的サンプルに加えることができ、その後に反応混合物は生物活性分子用の試薬で完成する。

ブランクシグナルを測定することができる。これは生物活性分子、例えば酵素なし、または生物活性分子用の試薬なしでの反応を意味する。これらの目的には、生物活性分子または生物活性分子用の試薬は、バッファーにより置き換えることができる。該ブランクシグナルは、参照標準曲線を調製する時または生物学的サンプル中の有効成分の阻害効能を決定する時に測定されたシグナルから引くことができる。該ブランクシグナルは生物活性分子または生物活性分子用の試薬との相互作用なしで試薬により生成されるシグナルに起因する。

対照シグナルを測定することができる。該対照シグナルは参照標準曲線を調製するための生物学的サンプル中またはマトリックス中に有効成分が存在しない時に得られる。該対照シグナルは１００％の値として使用することができる。あるい該対照シグナルは生物学的サンプルで、または参照標準曲線を調製するための参照で生成されたシグナルの比率を得るためにも使用することができる。

１つの取り組みによれば、生物学的サンプルはメタノール、エタノールを含む有機溶媒のような溶媒で処理して、有効成分を含んでなる抽出物を得る。この抽出物、すなわち有効成分を含んでなる溶液を続いて容器に移す。続いてＨＩＶの場合では、阻害効能は容器にプロテアーゼおよびプロテアーゼ用の基質で完成させた後にＨＩＶプロテアーゼの活性を測定することにより決定する。抽出物および生物学的サンプルの両方がアッセイ前に希釈されることが必要かもしれない。１つの観点では、生物学的サンプルまたは抽出物を希釈して対照シグナルの約３０％〜約７０％、興味深いところでは対照のシグナルの約４０％〜約６０％の範囲であるシグナルを得ることができる。

プロテアーゼは野生型の形態であるか、または１以上の突然変異を含むことができる。それらの突然変異はプロテアーゼ活性に影響を及ぼすことができる。１つの態様では、突然変異ＨＩＶプロテアーゼを使用することができる。例えばＨＩＶプロテアーゼは、野生型ＨＩＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｋ０３４５５）と比べてアミノ酸３、１０、２０、２４、３２、３３、３５、３６、３７、４６、４７、５０、５３、５４、５７、５８、６３、７０、７１、７２、７３、７７、８２、８４、８８、８９または９０位の突然変異からなるリストから選択される１以上の突然変異を含んでなることができる。プロテアーゼは緩衝化溶液中で存在できる。緩衝化溶液を使用して溶液のｐＨを反応中、一定に維持し、そしてさらにバッファーのイオン強度を調整するためにイオンを補完する（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）ことができ、そしてさらに例えば酸化防止剤、金属錯化剤、界面活性剤、コ−ファクターまたは溶媒を補完することができる。バッファーの例にはクエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファーを含む。プロテアーゼは生物学的アッセイ中に、約１ピコモル〜約１０マイクロモルの範囲、適当には約１ナノモル〜約１マイクロモルの範囲の濃度で存在することができる。

基質は溶液、緩衝化溶液、有機溶媒またはそれらの混合物中に提供されることができる。１つの取り組みでは、プロテアーゼ溶液および基質溶液を調製するために同じバッファーを使用することができる。酵素活性は、例えば発蛍光性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）、消光（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）発蛍光性または発色性基質を使用して測定することができる。生物活性分子、その試薬および有効成分との間の相互作用を測定するための他の方法は当該技術分野で知られており、そして例えばＦＲＥＴ、ＢＲＥＴに依存し得る。これら後者の方法では、１方または双方の相互作用する化合物を蛍光分子により標識することができる。相互作用により励起した波長の共鳴転移（ｒｅｓｏｎａｎｃｅｔｒａｎｓｆｅｒ）が生じる。本発明の観点において興味深い基質には、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−カルバモイルクマリン、パラニトロアニリド、ベータ−ナフチルアミド、アミノベンゾイル、テトラメチルローダミン、ＥＤＡＮＳ、ＤＡＮＳＹＬ、フルオロセインまたはＤＡＢＣＹＬからなる群から選択される部分を含むそれら化合物を含む。基質はｇａｇ、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ、ｐ１７、ｐ２４またはそれらの組み合わせを含むＨＩＶタンパク質に由来するペプチド骨格を含むことができる。興味深いことには、該ペプチド骨格は２〜３０個のアミノ酸、適当には３〜１５個のアミノ酸、より適当には３〜１０個のアミノ酸を含む。そのような骨格の例には、配列Ｓ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｐ−Ｉ−Ｖ−Ｎ、Ｓ−Ｑ−Ｎ−Ｙ−Ｐ−Ｉ−Ｖ−Ｗ−ＬまたはＳ−Ｑ−Ｎ−Ｙ−Ｐ−Ｉ−Ｖ−Ｑ−Ｋを含み、ここでアミノ酸はそれらの１文字暗号（実践的生化学（ＰｒａｃｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第５版、Ｗｉｌｓｏｎ＆Ｗａｌｋｅｒ編集、ケンブリッジ大学出版、ケンブリッジ、２０００、ｐ３１３）により表す。興味深い骨格はアミノ酸配列Ｐ−Ｉ−Ｖを含んでなる。別の興味深い骨格は４つ組（ｔｅｔｒａｄ）Ｙ−Ｐ−Ｉ−Ｖを含んでなる。興味深い基質はＡ−Ｒ−Ｖ−Ｙ−Ｆ（ＮＯ_２）−Ｅ−Ａ−Ｎｌｅ（Ｎｌｅ、ノルロイシン）である。自己−消光基質も使用することができる（国際公開第９９／５０５７９号パンフレット）。ＨＩＶプロテアーゼを測定するために興味深い基質は、ペプチド骨格中にＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳの組み合わせ；あるいはペプチド骨格にアミノベンゾイルおよびニトロフェニル部分の組み合わせを含んでなるものである。ＨＣＶプロテアーゼを測定する場合、基質はＨＣＶタンパク質の配列に基づき設計することができる。興味深い基質には：（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル（Ｍｃａ）−Ｄ−Ｄ−Ｉ−Ｖ−Ｐ−Ｃ−Ｓ−Ｍ−Ｓ−（２，４−ジニトロフェニル、Ｄｎｐ）ＫおよびＭｃａ−Ｄ−Ｄ−Ｉ−Ｖ−Ｐ−Ｃ−Ｓ−Ｍ−Ｋ（Ｄｎｐ）−Ｒ−Ｒ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９９９，８０，７７−８４）、Ａｃ−Ｄ−Ｔ−Ｅ−Ｄ−Ｖ−Ｖ−Ｐ（Ｎｖａ）−Ｏ−４−フェニルアゾフェニルエステル（Ａｃ、アセチル）（Ｎｖａ、ノルバリン）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，２７０，２６８−２７５）、供与体／受容体カップル５−［（２’−アミノエチル）アミノ］ナフタレンスルホン酸／４−［［４’−（ジメチルアミノ）フェニル］アゾ］安息香酸間の共鳴エネルギー転移に基づく内部消光デプシペプチド発蛍光基質を含む。Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼの興味深い基質は、デプシペプチド基質の共鳴エネルギー転移に基づく（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２４０，６０−６７）。生物化学アッセイ中、基質は約１ナノモル〜約５００ミリモルの範囲、興味深いことには約１マイクロモル〜約１００ミリモルの範囲、より興味深いことには約１０マイクロモル〜約１ミリモルの濃度で存在することができる。

測定方法は室温で行うことができ、温度が制御されたインキューベーション基礎構造の必要性を排除する。室温は約１７℃〜約３０℃の範囲の温度を含む。１つの取り組みでは、これは約２０℃〜約２６℃の範囲である。１つの取り組みでは、反応は約２５℃で行う。しかしアッセイは他の温度、例えば約３０℃〜約４５℃の範囲で、１つの態様では約３５〜約４０℃の間または約３７℃で行うこともできる。

インキューベーションの期間は、最高１日であることができる。１つの取り組みではインキューベーション期間は短く、そして約１５秒〜約２時間の範囲、興味深いことには該期間は約３０秒〜約６０分の範囲である。該インキューベーション期間中、シグナルをモニタリングすることができる。該シグナルは予め定めた時間間隔で連続して、または１つの時間間隔でモニタリングすることができる。

インキューベーション中の容量は最高１０ｍｌであることができる。興味深い容量は約１０μｌ〜５ｍｌ、適当には約２０μｌ〜約２ｍｌ、より適当には約２５μｌ〜約５００μｌの範囲である。マイクロタイタープレートでは興味深い容量は、約２５μｌ〜約３００μｌの範囲である。

生物学的サンプルのシグナルは、参照標準曲線上のデータと比較することができる。該参照標準曲線は、各々が定めた薬剤濃度を含んでなる種々の参照サンプルのシグナルを測定することにより得ることができる。該参照は溶液、バッファー、有機溶媒等のようなマトリックス中に存在することができる。１つの観点では、参照は生物学的サンプルと同じマトリックス中に存在する。該参照標準曲線は異なる参照を使用して調製することができ、各々が同じ有効成分を含むが異なる濃度である。該参照標準曲線は少なくとも１つの参照、適当には各々が異なる濃度の有効成分を有する少なくとも２つの参照；より適当には各々が異なる濃度の有効成分を有する少なくとも３つの参照を使用して調製することができる。１つの観点では、参照標準曲線は各々が異なる濃度を有する同じ有効成分の４〜８種の参照を使用して調製される。参照標準曲線を得るために使用する有効成分は、生物学的サンプル中に存在する有効成分と同じであることができる。参照標準曲線を使用して、本発明の方法はサンプル中に存在する有効成分の具体的濃度または量に対して生成したシグナルを関連づけることが可能となる。この参照標準曲線は任意の化合物または化合物の混合物を使用して調製することができる。最終的に生物学的サンプル中の有効成分の阻害効能は、存在する有効成分とは無関係に、そしてそれらの相互作用の様式とは無関係に、生物学的サンプルの全阻害能力の尺度である。例えば酵素インヒビターについて、該相互作用の様式には不可逆的阻害、または競合、非−競合、抗−競合、強固な結合を含む可逆的阻害または混合阻害を含む。そのような参照標準曲線に基づき、生物学的サンプル中に存在する有効成分（１つまたは複数）のレベルの予想を、有効成分の性質の知識とは無関係に決定することができる。この取り組みは、例えば所定の生物学的経路が既知の有効成分の均等物で遮断されることを示す毒性学に役立つ可能性がある。

本発明の方法に従い分析することができる化合物の例には、硫酸デキストラン、スラミン、ポリアニオン、可溶性ＣＤ４、ＰＲＯ−５４２、ＢＭＳ−８０６、Ｔ２０、Ｔ１２４９、５−ヘリックス、Ｄ−ペプチドＡＤＳ−Ｊ１、ＡＭＤ３１００、ＡＭＤ−３４６５、ＡＭＤ７０４９、ＡＭＤ３４５１、ＴＡＫ７７９、ＳＨＣ−Ｃ（ＳＣＨ３５１１２５）、ＳＨＣ−Ｄ、ＰＲＯ−１４０、ＲＰＲ１０３６１１、フォスカルネット（ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）およびプロドラッグ、ＡＺＴ、３ＴＣ、ＤＤＣ、ＤＤＩ、Ｄ４Ｔ、アバカビル（Ａｂａｃａｖｉｒ）、ＦＴＣ、ＤＡＰＤ、ｄＯＴＣ、ＤＰＣ８１７、ＰＭＥＡ、ＰＭＰＡ（テノホビル）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）、エファビレンズ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）、８および９−ＣｌＴＩＢＯ（チビラピン）、ロビリド（ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、ＴＭＣ−１２５、ダピビリン（ｄａｐｉｖｉｒｉｎｅ）、ＭＫＣ−４４２、ＵＣ７８１、ＵＣ７８２、カプラビリン（Ｃａｐｒａｖｉｒｉｎｅ）、ＤＰＣ９６１、ＤＰＣ９６３、ＤＰＣ０８２、ＤＰＣ０８３、カラノリド（ｃａｌａｎｏｌｉｄｅ）Ａ、ＳＪ−１３６６、ＴＳＡＯ、４”−脱アミノ化ＴＳＡＯ、ＭＶ１５０、ＭＶ０２６０４８、ＳＰ１０９３Ｖ、ＰＤ１２６３３８、ＲＯ−５−３３３５、Ｋ１２、Ｋ３７、Ｌ７０８９０６、Ｌ７３１９８８、Ｓ−１３６０、アンプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）およびプロドラッグＧＷ４３３９０８（ＶＸ−１７５、ホサムプレナビル（ｆｏｓａｍｐｒｅｎａｖｉｒ））、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）、ロピナビル（ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）、パリナビル（ｐａｌｉｎａｖｉｒ）、ＢＭＳ１８６３１６、アタザナビル（ａｔａｚａｎａｖｉｒ）、ＤＰＣ６８１、ＤＰＣ６８４、チプラナビル（ｔｉｐｒａｎａｖｉｒ）、ＡＧ１７７６、モゼナビル（ｍｏｚｅｎａｖｉｒ）、ＧＳ３３３３、ＫＮＩ−４１３、ＫＮＩ−２７２、Ｌ７５４３９４、Ｌ７５６４２５、ＬＧ−７１３５０、ＰＤ１６１３７４、ＰＤ１７３６０６、ＰＤ１７７２９８、ＰＤ１７８３９０、ＰＤ１７８３９２、ＰＮＵ１４０３１５、ＴＭＣ−１１４、マスリン酸（ｍａｓｌｉｎｉｃａｃｉｄ）、Ｕ−１４０６９０、カスタノスペルミン（ｃａｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）、デオキシノジリマイシン（ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎｅ）、ＣＧＰ６４２２２を含む。これらの化合物はキットにも含むことができる。適当には、ＨＩＶプロテアーゼを使用する場合、有効成分は：アンプレナビル、ホサムプレナビル、リトナビル、ネルフィナビル、サキナビル、インジナビル、ロピナビル、パリナビル、ＢＭＳ１８６３１６、アタザナビル、ＤＰＣ６８１、ＤＰＣ６８４、チプラナビル、ＡＧ１７７６、モゼナビル、ＧＳ３３３３、ＫＮＩ−４１３、ＫＮＩ−２７２、Ｌ７５４３９４、Ｌ７５６４２５、ＬＧ−７１３５０、ＰＤ１６１３７４、ＰＤ１７３６０６、ＰＤ１７７２９８、ＰＤ１７８３９０、ＰＤ１７８３９２、ＰＮＵ１４０３１５、ＴＭＣ−１１４かなるリストから選択することができる。

このアッセイを使用して、反応動力学のモニタリングをリアルタイムで行うことができる。この取り組みを使用して、安定な状態の変数、例えば初速度を計算することができる（実践的生化学（ＰｒａｃｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第５版、Ｗｉｌｓｏｎ＆Ｗａｌｋｅｒ編集、ケンブリッジ大学出版、ケンブリッジ、２０００、第７章、ｐ３５７〜４０２）。１つの態様では、反応はシグナルを測定する前に止められる。これは終点測定である。反応は有機溶媒、界面活性剤、酸、塩基を含む作用物質を加えることにより、または温度変化により止めることができる。出力、例えば蛍光は反応を説明するパラメーター、例えば初速度に対して、あるいは阻害の尺度、例えば阻害の百分率または残存活性の百分率に対して再計算することができる。

アッセイは、２以上の生物活性分子を標的とする、生物学的サンプル中に存在する２以上の有効成分を同時に測定するために使用することもできる。この目的には、２以上の異なる基質を使用し、その各々を独立して測定することができる。２以上の参照標準曲線に基づき、２以上の有効成分を定量することができる。例えばＨＣＶプロテアーゼインヒビターおよびＨＩＶプロテアーゼインヒビターを含んでなる生物学的サンプルの阻害効能は、２つの異なる基質を使用して１つのウェル中で測定することができる。１つの基質はＨＩＶプロテアーゼに特異的であり、そしてもう１つの基質はＨＣＶプロテアーゼに特異的である。

本方法のさらなる利点は、血漿タンパク質に結合する有効成分の量を測定することを可能とする点である。多くの化合物がタンパク質に重度に結合し、それらの治療的効力を限定する。ＨＩＶプロテアーゼインヒビターはタンパク質に結合する可能性がある。ＨＩＶプロテアーゼインヒビター結合タンパク質の例は、α−酸性糖タンパク質（ＡＡＧ）である。サンプルを処理して、タンパク質に結合した有効成分から遊離物を分離することができる。この分離は濾過により行うことができる。濾過はゲル、例えばゲル濾過、フィルター、濾紙を使用して、特別なマイクロタイタープレートを使用して行うことができる。透析、加熱、沈殿、遠心、抗体のような当該技術分野の他の技法、および当業者に既知の他の手段を利用することができる。またそのような技術の組み合わせを使用して、非結合有効成分から結合したタンパク質を分離することができる。タンパク質結合画分に対する遊離物の分別は、タンパク質結合に供される化合物、そしてタンパク質濃度または特定のタンパク質の濃度が体液中で経時的に変動する条件においては重要である。遊離と結合との間の化合物の分布の知識は治療の評価に、特に有効成分のみがその標的に接近できるような場合は重要である。

生物活性分子を反応混合物に加えるので、生物活性分子は必ずしもサンプル中に存在する必要はない。本発明の方法はさらに、生物活性分子に容易に接近できないか、あるいは生物流体中に大変少量でしか存在しない、例えばＨＩＶインヒビターを含むことはできるがプロテアーゼは存在しても大変少量でしかない血清の場合のアッセイを提供する。あるいはこの方法は問題の生物活性分子を生物学的サンプルから除去した後に、あるいは生物活性分子を不活性化した後に使用してもよい。後者の取り組みは、該生物活性分子の濃度が個体間で変動する場合に価値があり得る。除去または不活性化は、限定するわけではないが有機溶媒、塩、界面活性剤、ｐＨまたは熱変性による沈殿を含む様々な方法により達成することができる。

１つの取り組みでは、本発明のアッセイは均一であり、短い回転時間を有し、そして多数のサンプルの平行処理を促進する。本発明のアッセイはキュベットに基づく形式で、またはマルチウェル形式、例えばマイクロタイタープレートで行うことができる。

アッセイの設計は、アッセイが生物学的サンプル中の酵素を阻害する有効成分の存在、すなわちレベルを決定し、そして特に処置中の個体ならびに臨床試験にかけられている個体中の有効成分をモニタリングするために適するようなものである。濃度の決定は化合物の投薬用量が治療効果を提供するために十分高いかどうかの証拠を提供する。

また本発明は、生物活性分子、該生物活性分子用の試薬、および場合により有効成分を含んでなるキットに関する。生物活性分子、試薬および有効成分は別個の容器に存在することができる。生物活性分子、試薬および有効成分は凍結乾燥することができる。キットはさらに酵素反応用のバッファーを含んでなる容器が補完され得る。キットが凍結乾燥成分からなる場合、該キットはさらに該凍結乾燥粉末を溶解するための１以上の溶液を補完することができる。このキットは１以上の有効成分を含んでなる１以上の容器を含んでもよい。参照標準曲線を調製するために必要な有効成分を含んでなる容器は、場合によりプロテアーゼまたはプロテアーゼ用の基質を含むことができる。

癌およびＨＩＶのような疾患における別のレベルの複雑さは、処置に対する耐性が頻繁に発生することである。このような状態には耐性試験と一緒に薬剤レベルの頻繁なモニタリングが必要である。したがって患者に循環しているＨＩＶビリオン群の表現型の変化を監視する方法が開発された（例えば国際公開第９７／２７４８０号パンフレット）。他の表現型アッセイにはウィットブロウ（Ｗｉｔｖｒｏｕｗ）（国際公開第０１／５７２４５号パンフレット）、バイロロジック（Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ）（国際公開第９７／２７３１９号パンフレット）およびバイオアライアンス（Ｂｉｏａｌｌｉａｎｃｅ）（国際公開第０２／３８７９２号パンフレット）に記載されているものを含む。Ａｎｔｉｖｉｒｏｇｒａｍ（商標）（国際公開第９７／２７４８０号パンフレット）は、「野生型」株と比較したウイルス群の薬剤感受性を予測する。この試験サービスでは、ウイルスの成長を５０％阻害する薬剤濃度（ＩＣ_５０）をインビトロで決定する。「野生型」ウイルスのＩＣ_５０に対する患者血液サンプル中のウイルスのＩＣ_５０の比は、その患者におけるウイルスの薬剤感受性における倍数変化（ｈｏｌｄｃｈａｎｇｅ）である。患者が持つ物質をインビトロ条件下で成長させる別の表現型アッセイは遺伝子型の決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）である。遺伝子型決定のアッセイは配列変化に基づく耐性の発生を予測する。遺伝子型決定のアッセイに関する１つの改善は、仮想表現型決定（ＶｉｒｔｕａｌＰｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）（国際公開第０１／７９５４０号パンフレット）と呼ばれ、ここで患者のウイルスの遺伝子型がデータベースに保存されている遺伝子型のコレクションと比較され、そしてそれに対応する表現型が保存される。これらのアッセイは患者の薬剤効果の正確な決定およびウイルスの耐性の発生を提供するが、循環している薬剤レベルに関する情報は提供されない。したがって本発明の方法に従い薬剤レベルの決定を耐性試験に連結させることは本発明の１つの観点である。薬剤レベルを耐性試験と連結することは、治療効力のさらなる証拠を提供することができる。

最小血漿濃度またはトラフ（ｔｒｏｕｇｈ）濃度は、薬剤効果を克服するために薬剤標的がモジュレーションに供される疾患または状態の処置中に重要となり得る。この状況の例は、ＨＩＶのような感染性疾患、細菌感染および癌に見いだされる。例えば薬剤の存在がＨＩＶプロテアーゼに突然変異圧を生じて薬剤治療から逸脱させ、そして不十分な阻害濃度がそのような逸脱を促進する。患者における薬剤レベルの測定およびこの値を使用してトラフレベルを決定することは、治療的に効果のある濃度を生じるために十分高い投薬用量を得るのに重要となり得る。

本発明の手順を使用して決定された有効成分の濃度を薬理学的モデルに使用して、個体中の薬物プロフィールを説明する薬物動態学的パラメーターの予測を提供することができる。個体群薬物動態学モデルを使用して、トラフ薬剤レベルを１人の患者サンプルから決定することができる。ＨＩＶ−感染患者の大群が同じ抗ウイルス剤を同じ用量で１日に３回受容すると仮定しよう。個体群における薬剤の平均の血漿濃度−時間プロフィールは、図１（太線）に示すように見える。しかし薬物動態学的プロセス（吸収、分布、排除）の個体間の変動により、個々の曲線は点線で示すように典型的なプロフィールとは実質的に異なる。すべての個体の曲線がプロットされれば、それらは垂直棒により記録される範囲を覆うことができる。同じグラフ上ならば、個体の最小有効濃度（ＭＥＣｓ）（破線の水平線が例を与える、図１）が提供され、それらは同じ範囲を覆うだろう。患者のある画分の薬剤濃度は、それらのＭＥＣ未満に落ち、そしてこれは治療的成果を減少させ、そして恐らくは薬剤耐性を導く可能性がある。個々の患者のトラフレベルを引き続き使用して、投与間隔中に治療に有効な用量を達成するために必要な薬剤レベルを算出することができる。

本発明の方法および結果、例えば薬剤の濃度は、トラフレベル（Ｃ_ｔ）、最大濃度（Ｃ_ｍａｘ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、排除速度等を含む個体における薬剤の薬理学的パラメーターを決定するために使用することができる。したがって測定されたレベルを個体群薬物動態学モデルに入力し、そしてＣ_ｔ、Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣのような薬物動態学的変数を算出することができる（国際公開第０２／２３１８６号パンフレット）。これらの薬理学的変数を使用して、例えば特定用量の潜在的毒性、薬剤に対する暴露時間（例えば放射性化学品の場合）、を予想し、または最小濃度を見いだすことができる。

効果的な処置を達成するために、薬剤への個体の暴露、例えばトラフ濃度、ＡＵＣは特定レベルを越えなければならない。このレベルはウイルス群の性質により決定される薬剤耐性（ホールドレジスタンス（ｆｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、ＩＣ_５０、ＩＣ_９０、その他）に対する薬剤の暴露（トラフレベル、ＡＵＣ、その他）の比率は、治療の成功を予測するものである。この比率はＩＱ（阻害指数：ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｑｕｏｔｉｅｎｔ）（ＩＱ＝Ｃ_ｔ／ＩＣ_５０）として表すことができる。このＩＱ値はタンパク質結合について調整した値を得るためにさらに標準化することができる（標準化ＩＱ、ＮＩＱ）。この調整された値を得る１つの取り組みは、個体群に関する平均Ｃ_ｔ、および参照株、すなわち参照の研究用ＨＩＶ株についての有効成分に関するＩＣ_５０を決定することである。これら後者２つの値の商で（Ｃ_ｔ／ＩＣ_５０）参照を得る。標準化ＩＱは商：［（Ｃ_ｔ／ＩＣ_５０）］患者／［（Ｃ_ｔ／ＩＣ_５０）］参照により提供される。

１つの態様では、本発明は阻害指数（ＩＱ）を決定する方法を提供し、ここでトラフレベルは本明細書に記載する方法にしたがい決定される生物学的サンプル中に存在する有効成分のレベルに基づく。ＩＱはさらに標準化することができる。

本発明はさらに治療を計画する方法を提供し、この方法は：本明細書に記載する方法に従い生物学的サンプル中に存在する有効成分のレベルを測定し、該有効成分に関するトラフレベルを決定し、個体群動力学モデルを使用して該有効成分に関する投薬用量を再計算して投与間隔中に最小有効量を越える有効成分レベルを達成することを含んでなる。

さらなる開発では、患者サンプル中に見いだされる濃度を電気的にサーバーに伝達し、ここで薬物動態学的値を個体群に基づく方法を介して決定することができる。これらの値、すなわち薬物動態学的データおよび薬剤レベルを耐性データと連結させて治療効力の一体化された測定を提供することができる。さらに提供された情報を使用して十分な臨床効果を達成するための治療を計画する。これらのデータは処理後、例えば処置している医師に戻すことができる。

アッセイは動物における薬剤レベルを分析し、そして動物を対象とした薬物動態学的実験に使用することができる。

１つの観点では、本発明は生物学的サンプルの阻害効能を決定する方法に関し、この方法は（ａ）生物学的サンプルを得、標的生物活性分子を含んでなる容器を提供し、生物学的サンプルを該容器に加えて混合物を得、混合物に物活性分子の試薬を加え、そしてシグナルを測定し、（ｂ）シグナルを、少なくとも１つの参照サンプルを用いて調製した参照標準曲線に関連付け、ここで参照サンプルは生物学的サンプルと同じマトリックスを有し、マトリックスには場合により定めた濃度の有効成分が補完され、そして参照サンプルのシグナルは（ａ）に従い決定される。

アッセイ手順は酵素、基質およびインヒビター間の相互作用を監視するために使用することができるが、等しくレセプターとリガンド；レセプターとアンタゴニスト；レセプターとアゴニスト；抗原と抗体間の相互作用を監視するためにも使用することができる。基質の代わりにレセプター分子、リガンドと相互作用する有効成分の分析は、本発明の分析法に好適である。

１つの態様では、酵素を使用して患者サンプルの薬剤レベルをモニタリングするために、本発明のアッセイは当該技術分野に柔軟性のある、迅速で、標準化をし易い、経済的および均一なアッセイを加える。多くのアッセイを平行して行うことができ、研究室間の変動は反応を行うために必要な要素を含むキットを提供することにより制限され得る。
実施例
本実施例および添付する図面は、本発明を具体的に説明する。それらの具体的説明の目的は、本発明の範囲を制限するとは解釈されない。

血清サンプル中のＨＩＶＰＲインヒビター（ヒト免疫不全インヒビター、ＨＩＶ；ＰＲ、プロテアーゼ）の測定
以下の化合物を本分析に使用した（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−イル−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−３−［［（４−アミノフェニル）スルホニル］（２−メチルプロピル）アミノ］−２−ヒドロキシ−１−（フェニルメチル）プロピル］−カルバメート、（化合物１、ＣＡＳ２０６３６−９９−１）；（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−イル−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−３−［（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルスルホニル）（２−メチルプロピル）アミノ］−２−ヒドロキシ−１−（フェニルメチル）プロピル］−カルバメート、（化合物２、ＣＡＳ３３３７９８−２７−９）および（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−イル−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−［［（メトキシフェニル）スルホニル］（２−メチルプロピル）アミノ］−１−（フェニルメチル）プロピル］−カルバメート、（化合物３、ＣＡＳ２０６３６−００−７）。本発明の方法は米国特許第５，８４３，９４６号明細書に記載されているような他のスルホンアミドを用いても使用することができる。正常なイヌ血清の４種のアリコートを、ＨＩＶＰＲインヒビター化合物１でスパイクし、それぞれ１０、１００、１０００および１０，０００ｎＭの最終濃度とした（後に被検サンプルと呼ぶ）。別にイヌ血清の８種のアリコートを使用して参照標準曲線を作成した。これら８種を０〜１００ｎＭの異なる濃度の化合物１でスパイクした。すなわち化合物１は参照標準曲線を調製するための参照として使用した。すべてのサンプル中の血清タンパク質は、６６（容量／容量）％メタノール（ＭｅＯＨ）を使用して沈殿させた。１部の血清サンプルに２部のＭｅＯＨを加え、混合し、そして１６，１００ｇで３０分間遠心した。上清を回収し、そしてアッセイ前に少なくとも２週間、−２０℃で保存した。６０μｌをキュベットアッセイに使用し、２４μｌをプレートリーダーアッセイに使用する。被検サンプルから得た抽出物の１：２〜１：１２０の６連続希釈物をアッセイ前に調製した。インヒビターを含まない正常なイヌ血清のメタノール抽出物を希釈に使用した。

プレートリーダーアッセイについては、以下の条件を使用した：バッファーは５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、ｐＨ４．５、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０から調製した。基質は上記バッファー中に２０μＭの最終濃度で存在した。使用した基質はＨＩＶプロテアーゼの天然基質に基づく。これはｐ１７−ｐ２４ｇａｇタンパク質の部分（Ｐ_４−Ｐ_４’）を含む。Ｒ−Ｅ（ＥＤＡＮＳ）−Ｓ−Ｑ−Ｎ−Ｙ−Ｐ−Ｉ−Ｖ−Ｑ−Ｋ（ＤＡＢＣＹＬ）−Ｒ−ＯＨは低い蛍光しか表さないが、Ｙ−Ｐ結合でのＨＩＶプロテアーゼによる開裂で蛍光を増す（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４７，９５４−９５８）。酵素、野生型ＨＩＶ−１プロテアーゼは上記バッファー（５０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５、２ｍＭＤＴＴ、２００ｍＭＮａＣｌ）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）中に４〜５ｎＭの最終濃度で存在する。プロテアーゼの突然変異体を含め、他の形態のＨＩＶプロテアーゼを使用することもできると考えるべきである。

アッセイは室温（ＲＴ）で行う。８８μｌのバッファー（酵素を含む）を分配し、そして２４μｌの血清抽出物または血清抽出希釈物を、マルチ−チャンネルピペッターを使用して加えた。反応は基質を含む８８μｌのバッファーを加えることにより開始し、そして蛍光の増加を継時的にモニタリングした（図２）。参照標準曲線は、代わりに２４μｌの参照を使用してこの方法に従い調製した。対照反応は、任意のプロテアーゼインヒビターの抽出された血清ボイド（ｖｏｉｄ）からなった。各ウェルについてプレートリーダーソフトウェアにより算出された基質開裂の初速度（図３）は、阻害濃度の逆比例であった。対照サンプルの初速度が１００％のシグナルを提供し、そしてインヒビターを含む参照標準曲線ならびに被検サンプルからのサンプルについて比を決定するために使用した（サンプルシグナル／対照シグナルの比）。

蛍光増加の初速度は、各化合物１希釈物についてモニタリングして（図２、カラム１および２）、参照標準曲線（図４、５）を得た。参照標準曲線は、比（サンプルシグナル／対照シグナル）を各化合物１希釈物の薬剤濃度と関連させる。比で表される阻害の測定は、対応する化合物１の濃度の予想を提供する。例えば図２のカラム９および１０に提示される被検サンプル中のインヒビターの濃度は、図６に示すようなプレートリーダーソフトウェアを使用して算出することができる。最終的な計算について、０．５に最も近い比を与える２つの濃度を平均した。結果として算出された濃度は、１，１０９ｎＭであり、このサンプル中の実際の濃度−１，０００ｎＭに匹敵した。参照標準曲線は任意のプロテアーゼインヒビターまたはそれらの混合物を使用して調製できることに注目されたい。

上記アッセイは異なるＨＩＶプロテアーゼインヒビター間を識別しないが、信頼性があり、しかも正確なＨＩＶプロテアーゼ阻害の測定を提供し、そして同時に生物学的サンプル中の阻害活性のレベルを提供する。このアッセイ形式は生物学的サンプル中に存在するプロテアーゼインヒビターの総量を決定する。さらにアッセイは実施例３に例示するようにタンパク質に結合したインヒビターの割合に関する証拠を提供することができる。

実施例１に記載したようなインヒビター濃度の測定は、精度および正確さを評価するために５回の異なる日で行った。結果を図７に与える。

本発明の原理は、生物活性分子を妨害する任意の種類の化合物に使用することができる。当業者が本発明の作業の別の段取りを知っていることは明らかである。

ＭｅＯＨの効果
メタノール抽出は、ＬＣ−ＭＳによるヒト血清中のＨＩＶＰＲインヒビター濃度の測定に通常に使用されている。血清タンパク質は７５％ＭｅＯＨで沈殿する。高濃度のメタノールは酵素に基づくアッセイを妨害する可能性があるので、インヒビターの抽出に使用するＭｅＯＨ濃度を６６％に下げた。以下の試験を行って６６％ＭｅＯＨと７５％ＭｅＯＨでの抽出を比較した。化合物１および２の混合物を、９μＭおよび０．９μＭ濃度で調製し、そして６６および７５％ＭｅＯＨで実施例１に記載のように抽出した。結果を表１にまとめる。表１で“Ｅｘｔ”は抽出を意味する。

タンパク質が結合した薬剤対総薬剤濃度の決定
多くの実験から、ほとんどのＨＩＶＰＲインヒビターは高度に血漿タンパク質を結合する（例えばアンプレナビル、ネルフィナビル、サキナビルおよびリトナビルについては９０〜９９％、そしてインジナビル（ＩＤＶ）については約６０％）。タンパク質の結合効果は薬剤効能に影響を及ぼすので、血漿タンパク質が結合した薬剤対非結合薬剤濃度を測定する簡単な方法を開発した。以下のプロトコールを使用して非結合薬剤濃度を測定した：
５５０μｌの正常ヒト血清を、最終濃度１μＭのプロテアーゼインヒビターＳＣ−５２１５１でスパイクした。実施例１に記載するように総インヒビター濃度を測定するために、５０μｌのアリコートを使用した。ＳＣ−５２１５１を使用してカリブレーション曲線を作成した。

５００μｌのスパイクした血清サンプルを、ミクロコン（ｍｉｃｒｏｃｏｎ）−１０微量濃縮器に乗せ、そして＠５０００ｘｇで室温にて５分間回転させた。素通り画分（添加した５０μｌの〜１０％）を、実施例１に記載したプロトコールに従い６６％メタノールで抽出した。濾液はプロテアーゼインヒビターの非結合画分を含む。メタノール抽出物の異なる希釈物を調製し、そしてミクロタイターリーダーアッセイを行って非結合または遊離薬剤濃度を実施例１に記載のように測定した。総インヒビター濃度の場合のように（実施例１）、非結合薬剤濃度は参照薬剤濃度に等しい阻害活性として提示する（この場合、カリブレーション曲線から引き出されたｎＭでのＳＣ−５２１５１濃度に等しい阻害活性）。

本発明の方法を使用して、遊離対総薬剤濃度の比を決定し、そして百分率で表すことができる。

遊離インジナビル濃度（３６．５％）は文献で示されるデータ（４０％）と良く合致する。ヒト血清では、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターは主にα−酸性糖タンパク質に結合する。これらの実験で測定した遊離薬剤濃度は、アルファ−酸性糖タンパク質に対する薬剤の結合定数に逆比例する。Ｋ_ａは結合定数である。

ＩＤＶＳＣ−５２１５１ＡＡＧ結合に関するＫ_ａ（１０^６Ｍ^−１）結合しない２．３

時間の関数としての有効成分の血漿濃度（ｍｇ／ｌ）である。ＭＥＣは最小有効濃度である。時間は時（ｈｏｕｒｓ）で表す。血漿薬剤濃度はＭＥＣと毒性レベルの間で変動する。ＨＩＶプロテアーゼによる基質の開裂のリアルタイムでの蛍光マイクロタイタープレートリーダー中でのモニタリングである。各四角（Ａ１からＨ１０）は、時間の関数（Ｘ−軸）として蛍光（Ｙ−軸）の進行曲線を表す。アッセイは実施例の部で記載したように行った。各曲線の傾斜は酵素反応の初速度を表す。Ａ列はインヒビター無しの対照を含む。カラム１および２は、カリブレーション曲線を作成するために使用した異なる濃度の化合物１でスパイクしたイヌ血清の抽出物を含む。カラム３および４；５および６；７および８；９および１０は、それぞれ１００ｎＭ、１０ｎＭ、１０，０００ｎＭおよび１，０００ｎＭの化合物１、２および３でスパイクしたイヌ血清を含む。Ｂ〜Ｈ列はスパイクした血清の右に示すような希釈物を含む。希釈は１：１２０（Ｂ列）から１：１（Ｈ列）に変化する。詳細については実施例１を参照にされたい。プレートリーダーソフトウェアによる直線回帰を使用して算出した基質開裂の初速度である。基質開裂は蛍光マイクロタイタープレートリーダー中でリアルタイムでモニタリングした。異なる濃度の化合物１でスパイクしたイヌ血清の抽出物を使用した。相対蛍光単位（ＲＦＵ、Ｙ−軸）は、時間の関数としてモニタリングした（秒、Ｘ−軸）。参照標準曲線の計算、データはさらにタイトルをつけた方法の正確さをさらに具体的に説明する。Ｓａ：サンプル；ｎＭでの濃度；値：（ＲＦＵ／分）ｘ１０００で；ＳｔＤｅｖ（標準偏差）：（ＲＦＵ／分）ｘ１０００で；ＣＶ％：変動係数；平均値：（ＲＦＵ／分）ｘ１０００での平均値；比：Ｓａ０１の平均値に対するＳａＯＸの平均値。Ｘは２〜８である（図を参照にされたい）。ｎＭでのインヒビター濃度（Ｘ−軸）対対照サンプルに対する試験サンプルの比（ＲＦＵ値の比として表す、Ｙ−軸）に関する典型的な参照標準曲線。被検体濃度の計算を表す。被検体の計算はプレートリーダーソフトウェアにより自動的に行った。被検体について算出した濃度は図２のカラム９および１０に与える。データはサンプルが分析前に希釈される必要があることを示す。この場合、６〜６０の間の希釈が最適である（ＳｔＤｅｖ＝標準偏差；Ａｄｊ．Ｒｅｓｕｌｔ＝希釈について調製した結果）。方法の精度および正確さを表す。５回の独立した実験を５回の異なる日に行って方法の正確さおよび再現性を評価した。Ｅｘｐ．：実験。各決定の誤差はカッコ内に示し、そして決定されたインヒビター濃度とスパイクしたインヒビター濃度との間の差異を％で表す。

【配列表】

Claims

生物学的サンプル中の有効成分の阻害効能を決定する方法であって；ｉ）生物学的サンプルを提供し；ｉｉ）生物活性分子を提供し；ｉｉｉ）生物活性分子用の試薬を提供し；ｉｖ）生物学的サンプル、生物活性分子および生物活性分子用の試薬を容器に加え；ｖ）シグナルを測定し；ｖｉ）少なくとも１つの参照を用いて調製した参照標準曲線にｖ）のシグナルを関連付けることを含んでいる上記方法。
生物活性分子がプロテアーゼであり、そして生物活性分子用の試薬が基質である、請求項１に記載の方法。
生物学的サンプルが有効成分としてＨＩＶインヒビターを含んでなり、プロテアーゼがＨＩＶプロテアーゼであり、そして基質がＨＩＶプロテアーゼの基質である、請求項２に記載の方法。
基質がＥＤＡＮＳおよび／またはＤＡＢＣＹＬ部分を含んでなる、請求項３に記載の方法。
基質がＲ−Ｅ（ＥＤＡＮＳ）−Ｓ−Ｑ−Ｎ−Ｙ−Ｐ−Ｉ−Ｖ−Ｑ−Ｋ（ＤＡＢＣＹＬ）−Ｒ−ＯＨである、請求項４に記載の方法。
ＨＩＶプロテアーゼが少なくとも１つの突然変異を含んでなる、請求項３に記載の方法。
シグナルが蛍光である請求項１または２のいずれかに記載の方法。
容器がマウチ−ウェルプレート中のウェルである、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
生物学的サンプルを容器に加える前に希釈する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
工程ｉｖ）の前に、生物学的サンプル中の有効成分のタンパク質結合およびタンパク質非結合画分が分離されている、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
生物学的サンプル中の有効成分のタンパク質結合およびタンパク質非結合画分が、沈殿、濾過、透析および遠心から選択される処理を介して分離される、請求項１０に記載の方法。
生物学的サンプルが可逆性インヒビターを含んでなる、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
参照標準曲線を決定するための参照が、生物学的サンプルと同じ生物学的マトリックスを有する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
阻害効能が薬剤濃度または薬剤量として表される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
薬剤濃度または薬剤量が請求項１４に従い決定されることを特徴とする、個体群薬物動態学モデルを使用して個体の薬剤のトラフレベルを決定する方法。
請求項１４に従い決定された個体の薬剤のトラフレベルを使用して、生物学的サンプル中の薬剤の阻害指数を決定する方法。
請求項１５に従い個体の薬剤のトラフレベルを決定し、個体群動力学モデルを使用して薬剤に関する投薬用量を再計算し、投与間隔の間に最小有効量を越える薬剤レベルを達成することを含んでなる治療の計画方法。
生物活性分子、少なくとも１つの有効成分、生物活性分子用の試薬を含んでなるキット。
生物学的サンプル中の有効成分の阻害効能を決定する方法であって：（ａ）生物学的サンプルを得、生物活性分子を含んでなる容器を提供し、生物学的サンプルを該容器に加えて混合物を得、混合物にＨＩＶプロテアーゼのＲ−Ｅ（ＥＤＡＮＳ）−Ｓ−Ｑ−Ｎ−Ｙ−Ｐ−Ｉ−Ｖ−Ｑ−Ｋ（ＤＡＢＣＹＬ）−Ｒ−ＯＨを加え、そして蛍光シグナルを測定し、（ｂ）シグナルを、少なくとも１つの参照サンプルを用いて調製した参照標準曲線に関連付け、ここで参照サンプルは生物学的サンプルと同じマトリックスを有し、マトリックスには場合により定めた濃度の有効成分が補完され、そして参照サンプルのシグナルは（ａ）に従い測定される上記方法。