ES2312436T3 - Metodos para medir la resitencia a los farmacos. - Google Patents

Metodos para medir la resitencia a los farmacos. Download PDF

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Abstract

Un método de determinación de un fenotipo virtual de un virus de inmunodeficiencia humana que comprende: a) obtener una secuencia genética de dicho virus. b) identificar al menos un patrón de mutación en dicha secuencia genética donde dicha secuencia genética comprende al menos una mutación, y donde dicha al menos una mutación o patrón de mutación está asociado con la resistencia a al menos una terapia, c) buscar una base de datos de genotipo para entradas de genotipos con un patrón de mutación similar a al menos uno de los patrones de mutación identificados en la secuencia genética en b) d) correlacionar cada entrada de genotipo con un patrón de mutación similar con un fenotipo en una base de datos de fenotipo, y, e) calcular el número de veces de la resistencia virtual de dicho virus a partir de todos los fenotipos de la base de datos identificados.

Description

Métodos para medir la resistencia a los fármacos.
Campo de invención
La presente invención concierne a métodos y sistemas para predecir la resistencia de una enfermedad a un agente terapéutico. Más específicamente, la invención proporciona métodos para predecir la resistencia a los fármacos correlacionando la información genotípica con perfiles fenotípicos. La invención además se relaciona con métodos y sistemas para diseñar, optimizar y evaluar la eficiencia de un régimen terapéutico basado en el genotipo de la enfermedad que afecta al paciente.
Antecedentes de la invención
Las técnicas para determinar la resistencia de un patógeno o célula maligna a un agente terapéutico están volviéndose cada vez más importantes. Por ejemplo, a pesar de las grandes ventajas de los tratamientos existentes contra infecciones virales tales como infección HIV, cáncer e infecciones bacterianas, muchos pacientes experimentan el fracaso del tratamiento o reducida eficacia en el tiempo. En muchos casos esto es debido al patógeno, célula maligna, bacteria, virus u otro estado de la enfermedad mutando y/o desarrollando una resistencia al tratamiento.
Por ejemplo, todos los fármaco en el campo de HIV fueron descubiertos y desarrollados en un período de 15 años, comenzando con AZT. A comienzos del año 2000, 15 agentes diferentes anti HIV-1 habían sido aprobados por la FDA. Inicialmente, y debido a la pérdida de fármacos alternativos, estos agentes fueron administrados exclusivamente, como monoterapia. Aunque un efecto antiviral temporal fue observado, todos los compuestos perdieron su efectividad en el tiempo. En 1989, Larder y otros publicó un artículo en Science, 246, 1155-8, que identificó un número de mutaciones que causaron resistencia del HIV-1 a AZT. Desde entonces, la investigación ha demostrado que una de las razones principales detrás del fracaso del tratamiento para todos los fármacos antivirales es el desarrollo de resistencia del virus al fármaco.
La resistencia a los fármacos y mutaciones resistentes a los fármacos se desarrollan porque retrovirus tales como HIV no tienen un mecanismo de reparación cuando sintetizan nuevas cadenas de ácidos nucleicos. Esto permite para la generación continua de un número de variantes genéticas en una población viral de replicación. Más importante aún, los cambios genéticos pueden alterar la configuración de las moléculas de transcriptasa reversa (RT) y proteasa (PR) de tal manera que no son más susceptibles a la inhibición por los compuestos desarrollados a esos blancos. Si la terapia antiretroviral es continuada y si la replicación viral no es completamente suprimida, la selección de variantes genéticas es inevitable y la población viral se vuelve resistente al fármaco.
De cara al fracaso de la monoterapia y motivado por un número de ensayos clínicos, en la primera mitad de la década del 90 la estrategia de tratamiento cambió a terapia de combinación, es decir, administración de mezclas de fármacos antivirales. En ese momento existía todavía solamente una clase de fármacos disponibles - inhibidores de transcriptasa reversa análogos de nucleósidos (NRTIS). Como resultado, el estándar de cuidado se volvió dos nucleósidos, típicamente AZT+ddl, o AZT+ddC. La terapia de combinación dual proporcionada incrementó el control de la replicación viral, haciendo más difícil a los virus desarrollar cepas resistentes o mutaciones y, como resultado, proporcionó extendidos beneficios clínicos a los pacientes.
En 1995, otro hito fue alcanzado con la aprobación del primero de los inhibidores de proteasa (PI). Estos inhibidores mostraron mayor potencia que los nuleósidos, pero de nuevo fueron propensos a resistencia cuando se usaron solos. Su combinación con dos análogos de nucleósidos, sin embargo, parecía proporcionar el control sobre el virus que todo el mundo había estado buscando. La terapia de combinación triple usando dos nucleósidos (más comúnmente AZT+3TC) más un inhibidor de proteasa (típicamente indinavir) aún continúa siendo el estándar más común de cuidado en los países desarrollados.
Estas combinaciones altamente activas han tenido un enorme efecto en la calidad de vida y la supervivencia de los pacientes. Esto ha resultado en menos hospitalizaciones y reintegración de los pacientes a la sociedad. En un considerable número de pacientes, la carga viral ha sido reducida por debajo del límite de detección durante períodos prolongados.
En años recientes, sin embargo, se ha vuelto claro que aún pacientes que son tratados con la terapia triple que incluye un inhibidor de proteasa muchas veces el tratamiento de experiencia fracasa. Los datos sugieren que hasta la mitad de los pacientes con terapia de combinación no logran o no mantienen la supresión de la replicación del virus. En algunos casos, puede ser que aún en la terapia triple del estado del arte es insuficiente para interrumpir la replicación viral. Como resultado, se desarrollan cepas de los virus resistentes a los fármacos.
Otro factor que contribuye a la dificultad para mantener la supresión de la replicación del virus ha sido la pura imposición de tomar hasta 20 píldoras cada día, a momentos fijos, con o sin alimentos, días tras días. Es simplemente poco realista esperar que las personas se adhieran a tales regímenes demandantes y severos indefinidamente. Pero si los pacientes no se adhieren, el precio puede ser alto. Una inmersión en los niveles de sangre de cualquiera de las medicaciones da al virus una oportunidad para replicarse y desarrollar cepas resistentes a los fármacos. Como tal, durante el curso de la infección, cepas virales resistentes a los fármacos pueden emerger muy rápidamente particularmente para las infecciones retrovirales tales como HIV-1. Además, no todas las infecciones HIV-1 se originan con un tipo salvaje, cepa sensible al fármaco a partir de la cual la resistencia al fármaco podrá emerger. Con el incremento en la prevalencia de cepas resistentes a los fármacos viene el incremento en infecciones que realmente comienza con cepas resistentes a los fármacos. Las infecciones con resistencia a los fármacos pre-existentes inmediatamente reducen las opciones de fármacos para el tratamiento con fármacos y enfatiza la importancia de la información de la resistencia a los fármacos para optimizar la terapia inicial para estos pacientes. Además, como el número de agentes antiretrovirales disponibles se ha incrementado, así se tiene el número de posibles combinaciones de fármacos y terapias de combinación. Sin embargo, no es fácil para los médicos establecer la combinación óptima para un individuo. Previamente, la única guía de tratamiento que ha tenido un uso extendido ha sido basada en la carga viral y, donde es posible, la historia de tratamiento del paciente. El objetivo de los médicos es mantener la carga viral tan baja como sea posible. Un incremento en la carga viral es una alerta que el control de la replicación viral está siendo perdido y que es requerido un cambio en la terapia. La carga viral, sin embargo, no proporciona información o guía con relación a cuales fármacos debe usarse.
El conocimiento de los patrones de resistencia de los diferentes inhibidores y la historia de tratamiento de los pacientes pueden ayudar. La emergente resistencia es altamente predictiva del fracaso del tratamiento. En efecto, mientras existe una variedad de factores que pueden contribuir al fracaso de la terapia con el fármaco, la resistencia al fármaco de HIV-1 está casi siempre involucrada. Sin embargo, las interacciones entre las diferentes mutaciones virales relacionadas con diferentes inhibidores es tan compleja que seleccionando la combinación de tratamiento óptima con solamente una historia de tratamiento a seguir está lejos del ideal. Los fármacos pueden ser eliminados innecesariamente y fármacos inefectivos pueden ser introducidos. Aún si el virus es resistente justo a una de los tres fármacos en un régimen de tratamiento, este puede permitir que tenga lugar un bajo-nivel de replicación viral y el desarrollo de cepas virales resistentes a los otros dos fármacos.
Está claro que aunque existen muchos fármacos disponibles para usar en terapias de combinación, la selección puede rápidamente ser agotada y el paciente puede rápidamente experimentar progresión clínica o deterioro si son tomadas decisiones erróneas de tratamiento. La clave para ajustar, terapia individualizada queda en el efectivo perfil de las poblaciones de virus de pacientes individuales en términos de sensibilidad o resistencia a los fármacos disponibles. Esto significará el advenimiento de verdaderamente terapia individualizada.
El objetivo del monitoreo de la resistencia es proporcionar la información necesaria para posibilitar a los médicos prescribir la combinación de fármacos más óptima para el paciente individual. En la actualidad, existen dos aproximaciones diferentes para medir la resistencia:
La primera aproximación involucra la fenotipificación, la cual mide directamente la sensibilidad real de un patógeno de pacientes o células malignas a agentes terapéuticos particulares. Por ejemplo, la prueba del fenotipo HIV-1 mide directamente la resistencia al fármaco de HIV-1, detectada como la habilidad del HIV, tomado de un paciente, para crecer en el laboratorio en presencia de un fármaco. El fenotipo es medido, por ejemplo expresado como IC_{50} o como el número de veces de resistencia para una fármaco particular, la cual es definida como la concentración de fármaco requerida para matar la mitad de los viriones en una muestra. Esto es comparado a la IC_{50} para el fármaco usando virus tipo salvajes. El fenotipo es usualmente descrito o puede ser expresado en términos de veces de incremento en IC_{50} para cada uno de los fármaco.
Existen tres tipos principales de metodologías para la fenotipificación. Uno de esos tipos es el ensayo de reducción de placas. Una desventaja de ese método es que este no detecta las cepas de NSI. Otro método de fenotipificación incluye ensayos de inhibición del crecimiento de PBMC p24 (Japour, A.J., Mayers, T.L., Johnson, V.A., Kuritzkes, D.R., Beckett, L.A., Arduino, J.M., Lane, J., Black, R.J., Reichelderfer, P.S., D'Aquila, R.T., Crumpacker, C.S., The RV-43 Study Group & The ACTG Virology Committee Resistance Working Group. 1993. Antimicrob. Agents Chemother.37, 1095-1101). Un problema con esta técnica es que el cultivo del virus a partir de PBMC es muy lento y laborioso. Además, este pierde la precisión de otras técnicas y porque depende de células humanas primarias para el crecimiento de los virus, la automatización del ensayo y alto rendimiento es virtualmente imposible. Aún otro método es el ensayo de recombinación de virus (Kellam, P. & Larder, B.A. 1994. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 23-30). El método recombinante tiene ventajas sobre los ensayos previamente mencionados en que este reduce la cantidad de selección que tiene lugar durante el crecimiento del virus en el laboratorio, es más rápido, más reproducible, modificable para la automatización y de alto rendimiento, y todos los fármacos disponibles pueden ser probados en un ensayo.
La segunda aproximación para medir la resistencia involucra pruebas de genotipificación que detectan cambios genéticos específicos (mutaciones) en el genoma viral el cual conlleva a cambios de aminoácidos en al menos una de las proteínas virales, conocidas o sospechosas de estar asociada con la resistencia.
Existen un número de técnicas para conducir la genotipificación, tales como los ensayos de mutación puntuales basados en la hibridización y secuenciación de ADN. Los ensayos de mutación puntuales comunes incluyen PCR cebador-específico (Larder BA, Kellam P & Kemp, SD 1991. AIDS 5: 137-144, hibridización diferencial (Eastman, P.S., Urdea, M., Besemer, D., Stempien, M & Kolberg, J. 1995. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Human Retrovirol. 9, 264-273), Ensayo de Sonda Lineal (LiPA^{TM}, Innogenetics) (Stuyver, L., Wyseur, A., Rombout, A., Louwagie, J., Scarcez, T., Verhofstede, C., Rimland, D., Schinazi, R. F. & Rossau, R. 1997. Antimicrob. Agents Chemotherap. 41, 284-291), y secuenciación de circuito de genes (Affymetrix)(D'Aquila, R.T. 1995. Clin. Diagnost. Virol. 3, 299-316). Los ensayos de mutaciones puntuales pueden solamente proporcionar una pequeña parte selecta de la imagen de resistencia. La secuenciación de ADN, sin embargo, proporciona información en los nucleótidos en la región del genoma secuenciado. Esto significa que cambios en el genoma pueden ser detectados. Sin embargo, en la actualidad, sigue siendo difícil interpretar los resultados de una prueba genotípica para proporcionar conclusiones significativas acerca de la resistencia del agente terapéutico. La ventaja de fenotipificación sobre la genotipificación es que la fenotipificación es una medida directa de cualquier cambio en la sensibilidad que resulta a partir de todas las mutaciones que han ocurrido, y cualquier interacción entre ellas. Como tal, esto es el patrón de oro de la prueba de resistencia. Las desventajas de la fenotipificación son que es compleja, larga para ejecutar, (generalmente 4 semanas) y, por lo tanto, más cara que la genotipificación. La fenotipificación 
\hbox{de esta manera, no es una manera práctica de diseñar
terapia de paciente.}
En la WO 99/67427 se describe una lista de mutaciones conocidas para influenciar en la sensibilidad de HIV a la terapia con fármacos. El método usa la amplificación del ácido nucleico y estableció (usando un ensayo de susceptibilidad fenotípica) que las mutaciones en algunos codones están correlacionadas con una disminución en la susceptibilidad al fármaco específico.
En AIDS, vol 12, suppl 4, Nov 1998, página S11 es divulgado un estudio general de aislamientos de HIV de perfiles de resistencia fenotípicos y genotípicos de inhibidores de proteasas utilizando una prueba para la susceptibilidad fenotípica de los fármacos antiretrovirales, el llamado método Antivirogram® basado en virus recombinantes derivados del ARN plasmático.
En Nucleic Acids Research páginas 271-274 de 1998, Jeanpierre y otros, divulgaron un análisis de correlación genotipo-fenotipo relacionado a un cáncer usando una base de datos computarizada de mutaciones de línea germinal (70 entradas) y somáticas (28 entradas) del gene WT1 reportado en la literatura.
La importancia de la velocidad por la cual un médico puede ser informado del perfil de resistencia del paciente puede ser demostrada por el siguiente ejemplo hipotético pero realista, el cual resalta la necesidad para reducir la complejidad y mejorar el tiempo de ejecución para evaluar la resistencia. Suponiendo que la terapia de combinación triple de primera-línea reduce la carga viral a límites indetectables durante un periodo de tiempo. La carga viral entonces comienza a incrementarse como un resultado del desarrollo de la resistencia. Sin información de la resistencia, el médico puede hacer un juicio basado en la historia de tratamiento del paciente, y cambiar uno o más de los fármacos. Como resultado la carga viral es, de nuevo, reducida pero el nuevo régimen de tratamiento es sub-óptimo así la replicación viral continúa bajo la presión de selección de fármacos y la resistencia rápidamente se desarrolla una vez más. Consecuentemente, el control de la replicación viral se pierde y algunos de los 15 fármacos disponibles han sido "agotados".
Aunque los ensayos de genotipificación pueden ser ejecutados más rápidamente, un problema con la genotipificación es que existen ahora más de 100 mutaciones individuales con evidencia de un efecto en la susceptibilidad a los fármacos HIV-1 y otras nuevas están siendo constantemente descubiertas, en paralelo con el desarrollo de nuevos fármacos y estrategias de tratamiento. La relación entre estas mutaciones puntuales, eliminaciones e inserciones y la actual susceptibilidad del virus a la terapia con fármacos es extremadamente complejo e interactivo. Un ejemplo de esta complejidad es la mutación M184V que confiere resistencia a 3TC pero invierte la resistencia a AZT. La mutación 333D/E, sin embargo, invierte este efecto y puede conducir a una resistencia dual AZT/3TC.
Consecuentemente, la interpretación de los datos genotípicos es tanto altamente compleja y críticamente importante. Ha habido un número de diferentes aproximaciones a este reto de interpretación. Por ejemplo, armado con el conocimiento de las principales mutaciones a la resistencia asociadas con cada fármaco y la historia de tratamiento reciente del paciente, un médico toma una decisión como el tratamiento óptimo. Para asistir al médico a tomar esos juicios, varios paneles de opinión de expertos han sido convocados y han publicado guías, por ejemplo el Resistance Collaborative Group. Además, algoritmos basados en reglas constituyen otra aproximación. Es esencialmente una versión formalizada de lo anterior con tablas que dan las mutaciones las cuales están asociadas con la resistencia a cada uno de los fármacos. Estas pueden ser simples tablas impresas o la información puede ser usada para desarrollar un algoritmo de computadora basado en reglas. Sin embargo, dado el gran número de mutaciones que están involucradas en la resistencia a los fármacos antiretrovirales y dadas las complejas interacciones entre las mutaciones, la deficiencia de la genotipificación es la interpretación confiable y la aplicación clínica de los resultados. Como más fármacos se hacen disponibles y como más mutaciones están involucradas en el desarrollo de la resistencia, el "manual" o interpretación basado en reglas de datos crudos del genotipo se hace rápidamente imposible debido a un incremento en la complejidad.
Por lo tanto, el reto principal involucrado con la genotipificación es mejorar la interpretación de los resultados. La tecnología identificará algunos (es decir, ensayos de mutación puntual) o todas las mutaciones (es decir, secuenciación de ADN) que ha ocurrido pero que entonces requiere una interpretación sofisticada para predecir que efecto neto de estas mutaciones podría ser sobre la susceptibilidad de la población de virus a los varios agentes terapéuticos. Un médico podría entonces tener que combinar esta información con toda la otra información relacionada con el paciente y decidir que significa todo esto en términos de selección de fármacos para el tratamiento de su paciente individual.
Es por lo tanto un objetivo de la presente invención proporcionar métodos para mejorar la interpretación de los resultados genotípicos.
Es un objetivo adicional de la invención proporcionar métodos para determinar (o predecir) un fenotipo basado en un genotipo.
Es también un objetivo adicional de la invención proporcionar métodos para predecir la resistencia de un patógeno o una célula maligna a una terapia o agente terapéutico.
Es también un objetivo adicional de la invención predecir la resistencia de un paciente a la terapia.
Es también un objetivo de la invención proporcionar métodos para evaluar la efectividad o la eficiencia de una terapia o para optimizar una terapia al paciente.
Resumen de la invención
Una solución de los problemas expuestos anteriormente involucra nuevos métodos para medir la resistencia a los fármacos correlacionando la información genotípica con los perfiles fenotípicos.
En la presente invención, los métodos traen juntos el conocimiento de ambas bases de datos genotípicos y fenotípicos, y determina un valor del número de veces de la resistencia fenotípica (virtual) sin realmente tener que hacer el ensayo fenotípico. La base de datos genotípica contiene las mutaciones en los virus HIV evaluados comparados con el virus HIV de referencia (tipo salvaje). La base de datos fenotípica contiene valores de resistencia fenotípica para los virus HIV evaluados, con una determinación del número de veces de la resistencia comparados con el virus HIV de referencia (tipo salvaje). Como se describió debajo, este análisis puede ser hecho comparando la secuencia del virus HIV bajo ensayo, por ejemplo a partir de muestras de pacientes, contra las secuencias almacenadas y seleccionando "secuencias similares". La información fenotípica es entonces colectada para aquellas "secuencias similares" y la resistencia en número de veces media o promedio puede ser calculada a partir de los valores fenotípicos seleccionados. Este valor es llamado "Número de veces de la Resistencia Virtual", la cual conduce al "Fenotipo Virtual".
Descripción detallada de la invención
De acuerdo a una primera realización la presente invención se relaciona con un método para determinar o predecir un fenotipo virtual de un virus de inmunodeficiencia humana por ejemplo en una muestra biológica, que comprende:
a)
obtener una secuencia genética a partir de dicho virus.
b)
identificar al menos un patrón de mutación en dicha secuencia genética donde dicha secuencia genética comprende al menos una mutación, y donde al menos una mutación dicha o patrón de mutación está asociado con la resistencia a al menos una terapia o agente terapéutico,
c)
buscar una base de datos de genotipo para entradas de genotipos con un patrón de mutación similar a al menos uno de los patrones de mutación identificados en la secuencia genética en b)
d)
correlacionar cada entrada de genotipo con un patrón de mutación similar con un fenotipo en una base de datos de fenotipo, y
e)
calcular el número de veces de la resistencia virtual de dicho virus a partir de todos los fenotipos de la base de datos identificados.
La misma metodología del método descrito anteriormente puede ser usada por ejemplo para evaluar la terapia aplicada actualmente o para predecir resistencia de un paciente a una terapia.
Por lo tanto, de acuerdo a otra realización, la presente invención se relaciona con un método para evaluar la efectividad de la terapia de un paciente o para monitorear una terapia de un paciente que comprende:
a)
proporcionar una muestra biológica a partir de un paciente,
b)
obtener una secuencia genética a partir virus de la inmunodeficiencia humana en dicha muestra biológica,
c)
identificar al menos un patrón de mutación en dicha secuencia genética donde dicha secuencia genética comprende al menos una mutación, donde al menos dicha mutación está asociada con la resistencia a al menos una terapia que está actualmente siendo administrada al paciente,
d)
buscar una base de datos de genotipo para entradas de genotipo con un patrón de mutación similar a al menos uno de los patrones de mutación identificados en la secuencia genética en c)
e)
correlacionar dicha entrada de genotipo con un patrón de mutación similar con un fenotipo en una base de datos de fenotipo,
f)
calcular el número de veces de la resistencia virtual de dicho virus a partir de todos los fenotipos de la base de datos identificados.
g)
obtener una serie de fenotipos repitiendo los pasos b) hasta e) para cada terapia que está siendo actualmente administrada al paciente, y,
h)
evaluar la efectividad de la terapia del paciente a partir de series de fenotipos.
También, la invención se relaciona con un método para optimizar la terapia para un paciente, que comprende:
a)
proporcionar una muestra biológica a partir de un paciente
b)
obtener una secuencia genética a partir de un virus de inmunodeficiencia humana en dicha muestra biológica,
c)
identificar al menos un patrón de mutación en dicha secuencia genética donde dicha secuencia genética comprende al menos una mutación, donde al menos dicha mutación está asociada con la resistencia a al menos una terapia,
d)
buscar una base de datos de genotipo para entradas de genotipos con un patrón de mutación similar a al menos uno de los patrones de mutación identificados en la secuencia genética en c)
e)
correlacionar dicha entrada de genotipo con un patrón de mutación similar con un fenotipo en una base de datos de fenotipo,
f)
calcular el número de veces de la resistencia virtual de dicho virus a partir de todos los fenotipos de la base de datos de identificados.
g)
obtener una serie de fenotipos repitiendo los pasos b) hasta e) para un grupo de terapias, y,
h)
optimizar la terapia para el paciente a partir de las series de fenotipos.
Aunque se describieron los ejemplos con respecto a los virus, particularmente HIV, la presente invención tiene una amplia aplicabilidad para cualquier estado de enfermedad donde es deseado correlacionar la información genotípica con los perfiles fenotípicos. Un experto en el arte podría fácilmente tomar la siguiente discusión de la invención con el virus HIV y a través del ejercicio de rutina aplicar con habilidad esta invención a otras enfermedades (tales como otras infecciones virales, células malignas, cáncer, infecciones bacterianas, otros patógenos, y similares) para correlacionar la información genotípica para predecir la respuesta fenotípica, evaluar la resistencia a fármacos, y eventualmente desarrollar un régimen de tratamiento de los fármacos para un paciente particular. Un experto en el arte podrá también conocer que muchas especies de virus comprenden muchas cepas por ejemplo el HIV comprende aparte de HIV-1 también HIV-2 y ambos grupos son además divididos en grupos por ejemplo, pero no limitados a grupos O ó M para HIV-1.
Por lo tanto, de acuerdo a otra realización, la presente invención se relaciona con un método para predecir la resistencia de virus de inmunodeficiencia humano a la terapia que comprende:
a)
proporcionar una muestra biológica a partir de un paciente que contiene un virus de inmunodeficiencia humana
b)
obtener una secuencia genética a partir de dicho virus
c)
identificar al menos un patrón de mutación en dicha secuencia genética donde dicha secuencia genética comprende al menos una mutación, donde al menos dicha mutación está asociada con la resistencia a al menos una terapia,
d)
buscar una base de datos de genotipo para entradas de genotipos con un patrón de mutación similar para el patrón de mutación identificado en la secuencia genética en c)
e)
correlacionar dicha entrada de genotipo con un patrón de mutación similar con un fenotipo en una base de datos de fenotipo,
f)
obtener una serie de fenotipos repitiendo los pasos b) hasta e) para un grupo de terapia, y,
g)
predecir la resistencia del paciente a la terapia partir de las series de fenotipos.
Los métodos anteriores deberán ser interpretados como métodos de diagnóstico, por lo tanto, la invención también proporciona kits diagnósticos para ejecutar cada uno de los métodos de la invención.
Deberá ser entendido que los principios y métodos proporcionados por esta solicitud están destinados a proporcionar al médico que impone el tratamiento un medio para optimizar o seleccionar la terapia que será más exitosa. El principio es de particular relevancia para el tratamiento(o monitoreo de la terapia) de las infecciones virales. Estos estados de enfermedades están sujetos a regímenes de terapia complejos y que varían continuamente y por lo tanto el paciente bajo tratamiento necesita experimentar frecuente monitoreo de la terapia para seguir el efecto del fármaco o para optimizar o seleccionar el manejo óptimo del paciente.
Los métodos de la presente invención determinan un fenotipo sin realmente tener que hacer la prueba fenotípica. Dentro de este significado, el término "determinar" es intercambiado con "predecir" o "diagnosticar".
Un "paciente" puede ser cualquier organismo, particularmente un humano u otro mamífero, que sufre de una enfermedad o en necesidad o deseo de un tratamiento para una enfermedad. Un paciente incluye cualquier mamífero, incluyendo animales de granja o animales domésticos, e incluye humanos de cualquier edad o estado de desarrollo.
Una "muestra biológica" puede ser cualquier material obtenido en una manera directa o indirecta a partir de un paciente que comprende un agente que produce una enfermedad o que causa una enfermedad. Dicho agente que produce una enfermedad es capaz de ser secuenciado. Al respecto los términos de muestra biológica y agentes que producen una enfermedad y agentes que causan una enfermedad son intercambiados en la invención. Una muestra biológica puede ser obtenida a partir de, por ejemplo, saliva, semen, leche de mama, sangre, plasma, heces, orina, muestras de tejidos, muestras de mucosa, células en cultivo de células, células que pueden ser además cultivadas, etc. Las muestras biológicas también incluyen muestras de biopsias. En una realización, para un paciente infectado con HIV, cualquier muestra biológica que contenga el virus puede ser usada. En una realización, para un paciente infectado con un virus, cualquier muestra biológica que contenga el virus puede ser usada en cualquiera de los métodos de la invención. Preferiblemente dicho virus es un retrovirus. Preferiblemente la muestra biológica contiene un virus seleccionado de HIV, HCV-(Virus de la Hepatitis C) y HBV (Virus de la Hepatitis B).
"HIV" es el virus de la inmunodeficiencia humana, el cual es un retrovirus. "Retrovirus" es cualquier virus ARN que utiliza la transcriptasa reversa durante su ciclo de vida. "HCV" es el virus de la hepatitis humana, el cual es un virus ARN. "HBV" es el virus de la hepatitis B humana, el cual es un virus ADN, pero que comparte algunas características de los retrovirus, ya que también exhibe una actividad transcriptasa reversa por la cual el ARN genómico es traducido al ADN en el virus.
De acuerdo a todavía otra realización preferida, la muestra biológica en cualquiera de los métodos puede contener células, células de tejidos.
En una realización, un ácido nucleico blanco o proteína a partir de la cual una secuencia genética o secuencia de proteína puede ser derivada está presente en la muestra biológica.
Una "secuencia genética" es cualquier secuencia que contenga al menos un nucleótido. Un nucleótido por ejemplo, puede ser representado por las letras A, C, T o G. Una combinación de nucleótidos, puede ser representada, por ejemplo, por otras letras tales como R, Y, M etc. Los aminoácidos son representados por su propio código. Una perspectiva general de las abreviaturas usadas para los ácidos nucleicos y aminoácidos puede ser encontrada en Alberts, B., Bay, D. Lewis, J., Raff, M.,Roberts, K., Watson, J. The Molecular Biology of the Cell Garland publishing, New York, 1994.
Las secuencias genéticas como son usadas a partir de este momento pueden referirse a la secuencia completa de un agente que produce una enfermedad o al menos un segmento de la secuencia de un agente que produce una enfermedad. La secuencia de una proteína blanco particular puede ser obtenida tanto secuenciando el código de ácido nucleico para la proteína blanco o secuenciando la propia proteína. La secuenciación de la proteína puede ser obtenida por ejemplo pero no limitado a la degradación química de Edman clásica ("Sequence determination" Edman P. Mol. Biol. Biochem. Biophys. 1970, 8, 211-255). Esta química puede también ser completamente automatizada. Técnicas nuevas que incluyen la espectroscopía de masa también permiten el análisis de la secuencia de una proteína bajo investigación ("Mass spectroscopy from genomes to proteomics" Yates J. Trends in genetics 2000, 16, 5-8) Alternativamente la secuencia de una proteína blanco puede ser obtenida usando protocolos de secuenciación clásicos por ejemplo protocolos de terminación de la cadena de extensión (Técnica de Sanger)(("DNA sequencing with chain terminating inhibitors" Sanger F., Nichler., Coulson A. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977, 74, 5463-5467) o protocolos de corte de cadena. Las metodologías particulares de secuenciación fueron desarrolladas, por ejemplo, por Visible Genetics. Deberá ser entendido que nuevas aproximaciones han sido desarrolladas para descifrar la secuencia de un ácido nucleico blanco que incluye pero no está limitado a la espectrometría de masa, MALDI-TOF (espectroscopía de ionización desorción mediante láser asistida por matriz tiempo de vuelo)("Differential sequencing with mass spectroscopy" Graber J, Smith C., Cantor C. Genet. Anal. 1999, 14, 215-219.) análisis de circuito (técnicas basadas en hibridización)(Multiplexed biochemical assays with biological chips. Fodor S P; Rava R P; Huang X C; Pease A C; Holmes C P; Adams C L Nature 1993, 364, 555-6). Deberá ser apreciado 
\hbox{que la secuencia de ácido nucleico cubre la
secuenciación de ambos ADN y ARN.}
El término "codón" donde quiera que sea usado en la presente invención se relaciona con la posición del aminoácido presente en esa localización específica del gen investigado. Por ejemplo una mutación en el codón 90 del gen de la proteasa se refiere a un aminoácido alterado en la posición 90 en la cadena de proteína comparado con el gen del tipo salvaje.
El ácido nucleico puede estar presente en la muestra biológica en una forma libre y/o soluble, o puede ser encapsulado por proteínas, tales como en virus. En realizaciones preferidas de la invención, el ácido nucleico puede estar presente en una célula, tal como una célula de tejido.
El término "patógeno" puede relacionarse con cualquier bacteria, virus, hongos o cualquier otro microorganismo o organismo multicelular el cual causa un estado de enfermedad en otro organismo. Dicho otro organismo preferiblemente es un mamífero, más preferiblemente un mamífero humano. Sin embargo dicho otro organismo puede también ser una planta o una célula de planta donde dicho patógeno causa un estado de enfermedad.
El término "fenotipo" puede incluir cualquier propiedad observable de un organismo o agente que produce una enfermedad que es producido por el genotipo en conjunto con el medio ambiente. En una realización, el fenotipo se refiere a la resistencia de un agente que produce una enfermedad a al menos una terapia. Por lo tanto, los métodos de la invención determinan un fenotipo de un agente que produce una enfermedad hacia al menos una terapia o agente terapéutico.
La expresión "fenotipo virtual" se relaciona con un fenotipo de una muestra que es obtenida a través de la determinación del genotipo de dicha muestra, dicho genotipo es usado para la correlación en una base de datos para buscar mediante el apareamiento de genotipos para el cual un fenotipo correspondiente es conocido. A partir de esta colección de fenotipos el fenotipo de la muestra es calculado.
Los métodos de la invención pueden ser repetidos para cada posible terapia o agente terapéutico conocido o sospechoso de estar asociado con la resistencia, o hacia el cual una resistencia puede esperarse que aparezca. Como tal, de acuerdo a otra realización de la invención, el fenotipo de una muestra biológica puede presentarse como una lista de fenotipos contra o con respecto a terapias individuales o agentes terapéuticos individuales. Esto es además ilustrado en la sección de ejemplos.
La expresión "resistencia fenotípica" comprende la resistencia de una célula, virus, o células infectadas viralmente para una terapia evaluada, agente terapéutico o fármaco.
El término "resistencia" como es usado a partir de este momento, pertenece a la capacidad de resistencia, sensibilidad, susceptibilidad, o efectividad de una terapia contra una enfermedad.
El término "terapia" incluye pero no esta limitado a un fármaco, composición farmacéutica, bactericida, fungicida, antibiótico, o anticáncer, antiviral, anti-bacteriano anti-fúngico, anti-parasitario o cualquier otro compuesto o composición que pueda ser usada en la terapia o el tratamiento terapéutico. La terapia también incluye tratamiento, tal como terapia de genes o terapia de radiación, útil para el tratamiento o mejora de una enfermedad en un paciente. La terapia, como es usada a partir de este momento, también incluye las terapias de combinación.
La presente invención puede también ser aplicada para determinar el fenotipo de células (tejidos) normales o células no malignas para investigar su comportamiento hacia una terapia particular o agente terapéutico.
El término "mutación" como es usado a partir de este momento, abarca tanto las mutaciones genéticas y epigenéticas de la secuencia genética del agente que causa la enfermedad. Un cambio genético incluye, pero no está limitado a, (i) sustituciones de base: polimorfismos de nucleótido único, transiciones, transversiones, sustituciones y (ii) mutaciones de desplazamiento de marco: inserciones repetidas o eliminaciones. Cambios epigenéticos incluyen, pero no están limitados a, alteraciones de ácidos nucleicos, por ejemplo, metilación de ácidos nucleicos. Por ejemplo (cambios en) la metilación de residuos de citosina en la secuencia genética completa o solamente en parte de la secuencia genética. En la presente invención, las mutaciones pueden también ser consideradas al nivel de la secuencia de aminoácido, y comprende, pero no esta limitado a, sustituciones, eliminaciones o inserciones de
aminoácidos.
La "secuencia control" o "tipo salvaje" es la secuencia de referencia a partir de la cual está basada la existencia de las mutaciones. Por ejemplo, una secuencia control para HIV es HXB2. Este genoma viral comprende 9718 bp y tiene un número de acceso en el Genbank en NCBI M38432 o K03455 (número gi: 327742).
La secuencia de referencia o tipo salvaje para usar en la invención en el campo de las enfermedades específicas, infecciones o enfermedades causadas por patógenos específicos puede ser fácilmente obtenida de las bases de datos disponibles públicamente. Por ejemplo, la influencia de las mutaciones en la etiología del cáncer puede ser ejemplificada por las mutaciones que influyen el efecto del gen supresor del tumor tales como p53, TGF-beta, NF-1, WT-1 y Rb. También, mutaciones presentes en oncogenes tales como Ras, c-myc, c-raf, neu, y IL-2, y genes reparadores, por ejemplo, metilguanosil y metiltransferasa pueden causar cambios en el fenotipo y/o efecto del fármaco.
En otra realización, una mutación que es una metilación de ácidos nucleicos puede ocurrir en la posición 5 de la citosina dentro del CpG-dinucleótido. En general, el CpG dinucleótido está insuficientemente representado a través de todo el genoma del mamífero, pero este puede encontrarse cerca de la frecuencia esperada en pequeñas áreas de genoma de alrededor de un kilobase, llamado islas CpG. Aunque las islas CpG responden solamente a alrededor de 1% del genoma completo y 15% de los sitios CpG genómicos totales, estas regiones contienen aproximadamente 50% de los dinucleótidos CpG no metilados. La metilación, puede por ejemplo, impactar estados de enfermedad, tales como X Frágil y el síndrome Rett, y también en el perfil de los fármacos. Ver por ejemplo, Robertson y otros, Nature Reviews,2000 vol 1, p. 11-19, y Esteller M. y otros New England Journal of Medicine 2000, Vol 343:19, p.1350-1354.
La expresión de "al menos una mutación que correlaciona para la resistencia a al menos una terapia" incluye, pero no está limitada a, mutaciones y combinación de mutaciones en una secuencia genética que influye en la sensibilidad de un agente que causa una enfermedad a una terapia. La al menos una mutación puede influir en la sensibilidad a una terapia específica, por ejemplo, un fármaco, o un grupo de terapias. La al menos una mutación puede, por ejemplo, incrementar y/o disminuir la resistencia de un agente que produce una enfermedad a una terapia. La al menos una mutación, puede también, por ejemplo, incrementar y/o disminuir la influencia de otras mutaciones presentes en una secuencia genética que efectúa la sensibilidad de un agente que produce la enfermedad a una terapia.
En una realización, la al menos una mutación que correlaciona la resistencia a al menos una terapia incluye mutaciones o combinaciones de mutaciones que son conocidas o sospechosas de influir en la sensibilidad a una terapia. Listas de mutaciones conocidas o sospechosas de influir en la sensibilidad de un agente que produce una enfermedad a una terapia puede ser encontrado, por ejemplo, en la literatura científica, patentes, y solicitudes de patentes, por ejemplo Schinazi, R.F., Larder, B.A. & Mellors, J.W. 1997. Int. Antiviral News. 5, 129-142 (1997); WO 00/78996; WO 99/67427; WO 99/61658; US 6,087,093; WO 00/73511; y Solicitud de Patente U.S. No. serie 09/580/491, Solicitud de Patente U.S. No. serie 09/589,167 y "Método y sistema para predecir la resistencia del agente terapéutico y para definir las bases genéticas de la resistencia a los fármacos usando redes neurales".
Ejemplos de mutaciones conocidas o sospechosas de influir en la sensibilidad de un agente que produce una enfermedad a una terapia puede también ser encontrado en la Internet en htpp:/hiv-web.lanl.gov; htpp://hivdb.stanford.edu/
hiv/; o http://www.viral-resistance.com.
Ejemplos adicionales de mutaciones presentes en el dominio RT de HIV que confiere resistencia a un inhibidor de transcriptasa reversa incluye, pero no están limitados a, 69 C, 69 V, 69 T, 75A, 101I, 103T, 103N, 184T, 188H, 190E, 219N, 219Q, 221Y, 221I, y 233V. Ejemplos adicionales de mutaciones presentes en el dominio PR de HIV que confiere resistencia a un inhibidor de la transcriptasa reversa incluye, pero no están limitados a, 24M, 48A, y 53L. Una mutación puede efectuar resistencia solo o en combinación con otras mutaciones. La terapia específica, por ejemplo un fármaco antiretroviral, para el cual una mutación puede efectuar resistencia puede ser determinada por un experto en el arte, por ejemplo, usando el ensayo de monitoreo de resistencia fenotípica tal como, el ANTIVIROGRAM®.
Existen diferentes posibilidades para representar mutaciones en secuencias en la forma de patrones de mutación, algunos de los cuales son explicados en detalle en la sección de ejemplos.
La expresión "identificar un patrón de mutación" en una secuencia genética se relaciona con la identificación de mutaciones en una secuencia genética bajo prueba comparado con una secuencia de tipo salvaje la cual conduce a un cambio en los ácidos nucleicos o aminoácidos o que conduce a la expresión alterada de la secuencia genética o la expresión alterada de la proteína codificada por la secuencia genética o la expresión alterada de la proteína bajo el control de dicha secuencia genética.
Un "patrón de mutación" comprende al menos una mutación que influencia la sensibilidad de al menos un agente que causa una enfermedad a al menos una terapia. Como tal, un patrón de mutación puede consistir solamente en una única mutación. Alternativamente un patrón de mutación puede consistir en al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco mutaciones.
De acuerdo todavía a otra realización un patrón de mutación es una lista o combinación de mutaciones o una lista de combinaciones de mutaciones que influyen en la sensibilidad de al menos un agente que causa una enfermedad a al menos una terapia. Un patrón de mutación puede ser construido, por ejemplo por la búsqueda de una secuencia genética para la ocurrencia de cada mutación de una serie de mutaciones. La existencia de una mutación o la existencia de una de un grupo de mutaciones puede entonces ser notada. El patrón de mutación es construido, por ejemplo, una vez que una secuencia genética es buscada para la ocurrencia de cada mutación en las series. En una realización, un patrón de mutación es construido usando un grupo de mutaciones que correlaciona la resistencia a una terapia, construyendo por tanto un patrón de mutación que es específico a una terapia. En una realización adicional, un patrón de mutación es construido buscando mutaciones en una secuencia genética donde las mutaciones son unidas por al menos un operador lógico seleccionado de AND, OR, NOT, y NOR.
En una realización la invención se relaciona con cualquiera de los métodos descritos en la invención donde el patrón de mutación comprende al menos dos mutaciones conocidas o sospechosas para estar asociadas con la resistencia a al menos una terapia.
Además, la presente invención también se relaciona con la identificación de "al menos un patrón de mutación" en una secuencia. Deberá estar claro a partir de lo siguiente, que para cada muestra biológica (o para cada secuencia genética derivada de dicha muestra biológica) algunos (es decir, más de uno) patrones de mutación pueden ser identificados hacia una terapia única o un agente terapéutico único.
En una realización de la invención, la secuencia bajo prueba es alineada con la secuencia tipo salvaje y el alineamiento o diferencias en el alineamiento son almacenados en un medio computarizado o una base de datos. Alternativamente, un patrón de mutación puede ser obtenido a partir de un alineamiento, representado por los aminoácidos mutados y sus posiciones en el(los) polipéptido(s). Deberá estar claro que el hombre experto en el arte conoce diferentes maneras de representar y/o manejar la información de alineamientos de secuencia que incluyen el uso de algoritmos y programas de computadora conocidos ("Bioinformatics: A practical guide to the analisys of genes and proteins" Eds. Baxenavis and Ouellete, 1998, John Wiley and Sons, New York. Capítulo 7 "Sequence alignment and database searching" G. Shuler, Capítulo 8 Práctico "Aspect of multiple sequence alignment". A Baxenavis y Capítulo 9 "Phylogenetic analysis" M. Hershkovitz and D. Leipe). Un ejemplo práctico de alineamientos de múltiples secuencias es la construcción de un árbol filogenético. Un árbol filogenético visualiza la relación entre diferentes secuencias y puede usarse para predecir futuros eventos y retrospectivamente idear un origen común. Este tipo de análisis puede usarse para predecir una sensibilidad similar del fármaco para una muestra pero también puede usarse para descifrar el origen de diferentes muestras de pacientes (es decir, el origen de la cepa viral).
De acuerdo a realizaciones preferidas de cualquiera de los métodos de la invención, el patrón de mutación similar es identificado alineando la secuencia genética de una célula o un patógeno en la muestra biológica con la secuencia genética WT de dicha célula o patógeno.
De acuerdo a otra realización, "Agrupamiento Discreto" es usado para determinar cuando las secuencias son "similares". "Similar" en este contexto no significa "exactamente" por igual, ya que ninguna secuencia única se aparea a otras. Más bien, "similar", en este contexto significa "que tiene mutaciones similares" o "que tiene mutaciones que tienen el mismo efecto hacia la resistencia contra fármacos inhibidores". Para ser capaces de definir los patrones de mutaciones que fueron considerados como "que tienen el mismo efecto", una base de datos patrón que está relacionada al fármaco puede construirse. Los patrones de mutación referidos aquí son llamados "puntos calientes". El término "punto caliente" es aquí definido como una combinación de mutaciones que confiere resistencia a un fármaco definido.
Los puntos calientes describen mutaciones o agrupaciones de mutaciones (generalmente combinadas por "OR" (|) o "AND" (&) operadores lógicos) que están relacionadas con un cierto fármaco inhibidor. Una fármaco puede tener 1, 2, 3, 4 o más puntos calientes unidos a este. Otras operaciones lógicas puede ser "NOT", "NOR" etc. y la posibilidad para identificar INSERTOS y ELIMINACIONES en la secuencia de ADN.
Un ejemplo simplificado, por ejemplo, una tabla de puntos caliente usados para evaluar la resistencia de secuencias de HIV hacia diferentes fármacos pueden representarse como sigue:
Fármaco{}\hskip1,5cm # {}\hskip2,5cm Punto caliente
A
1 {}\hskip1,5cm (mutaciónD | mutaciónE) & (mutaciónF | mutaciónG)
\quad
2 {}\hskip1,5cm mutaciónH | mutaciónI
\quad
3 {}\hskip1,5cm mutaciónJ & mutaciónK
\quad
4 {}\hskip1,5cm mutaciónZ | mutaciónX) & mutaciónV
\vskip1.000000\baselineskip
B
1 {}\hskip1,5cm mutaciónL
\quad
2 {}\hskip1,5cm mutaciónM & mutaciónN
\quad
3 {}\hskip1,5cm mutaciónO & mutaciónP) | mutaciónQ
\vskip1.000000\baselineskip
C
1 {}\hskip1,5cm mutaciónR
\quad
2 {}\hskip1,5cm mutaciónS | mutaciónT
Posteriormente, cada secuencia de virus HIV que es evaluada es "perfilada" evaluando la secuencia contra todos los puntos calientes disponibles, para todos los fármacos inhibidores involucrados. Este análisis produce un perfil por fármaco para la secuencia de interés.
En una realización, para cada punto caliente que se aparea, la secuencia recibe un "1"; para cada punto caliente que no se aparea, consigue un "0". Para una secuencia dada bajo prueba, el resultado será:
Fármaco\hskip1,5cmPerfil
A
1010 aplican puntos calientes 1 y 3, puntos calientes 2 y 4 no para el fármaco A.
B
001 aplica punto caliente 3, puntos calientes 1 y 2 no para el fármaco B.
C
10 aplica punto caliente 1, punto caliente 2 no para el fármaco C.
Como tal, la expresión "perfil de terapia" o "perfil de fármaco" se relaciona con la presentación de una secuencia genética como se explicó anteriormente. El término "perfil del fármaco o terapia" es la combinación del patrón de mutación correspondiente a la resistencia a un fármaco o terapia única.
En otras palabras, un perfil de terapia puede darse para cada fármaco. En el ejemplo del fármaco A anterior, el punto caliente 1 y 3 se relaciona con la resistencia al fármaco A y son asignados un valor de 1. En contraste, el punto caliente 2 y 4 no lo son y son asignados un valor de 0, de esta manera el perfil es "1010". Este procedimiento puede verse como una forma de agrupamiento. Sin embargo, ya que los elementos de la agrupación (0 y 1) están basados en los grupos pre-definidos (puntos calientes) este método es usualmente referido como "agrupamiento discreto".
La presente invención de esta manera se relaciona con cualquiera de los métodos de la invención donde el agrupamiento discreto es usado para identificar secuencias similares o donde la búsqueda de agrupaciones es usada para determinar patrones de mutación similar.
De acuerdo a la realización preferida, esta invención se relaciona con un método para determinar un fenotipo virtual de un virus de inmunodeficiencia humana que comprende:
a)
obtener una secuencia genética de dicho virus de la inmunodeficiencia humana.
b)
identificar al menos una mutación en dicha secuencia genética donde dicha mutación es comprendida dentro de al menos un patrón de mutación,
c)
buscar una base de datos de genotipo para entradas de genotipos similares que comprende dicha mutación en al menos dicho patrón de mutación
d)
correlacionar dicha entrada de genotipo con un fenotipo en una base de datos de fenotipo, y
e)
calcular el número de veces de la resistencia virtual de dicho virus a partir de todas las bases de datos de fenotipo identificados.
De acuerdo a otra realización preferida, la invención se relaciona con un método para evaluar la eficiencia de una terapia al paciente o para evaluar u optimizar una terapia que comprende la obtención de una muestra biológica que contiene un virus de la inmunodeficiencia humana de un paciente, además comprende al menos los pasos a) al e) del método anteriormente descrito.
La invención además se relaciona con los métodos anteriormente descritos donde el patrón de mutación está asociado con la resistencia a una terapia o fármaco. En los métodos anteriormente descritos, los pasos b) al e) pueden repetirse para obtener una serie de fenotipos para un grupo de terapias o fármacos.
La invención además se relaciona con los métodos anteriormente descritos donde dicho patrón de mutación comprende al menos dos mutaciones unidas con un operador lógico, además caracterizado en que al menos dos patrones de mutación están asociados con la resistencia a una terapia.
La invención además se relaciona con los métodos anteriormente descritos donde dichos patrones de mutación están unidos con un operador lógico que define un perfil de terapia y donde dicho perfil de terapia es representado por una secuencia, dicha secuencia es representada por unas series de 1 y/o 0 donde 1 representa la presencia de un patrón de mutación en el perfil de terapia y 0 la ausencia de un patrón de mutación en el perfil de terapia.
Debe ser entendido que los principios y métodos como se puntualizó en la solicitud son muy dinámicos. Las bases de datos son frecuentemente actualizadas para incorporar nuevas mutaciones lo que mejora la exactitud de la determinación. El número y las combinaciones de mutaciones presentes en el sistema son actualizadas en un base regular (cada 3 a 4 meses). Esto es necesario para incorporar mutaciones identificadas recientemente o combinaciones que mejoran la ejecución del sistema. Tomando menos mutaciones (o puntos calientes) una persona será aún capaz de calcular el fenotipo, sin embargo, a partir de una perspectiva estadística la ejecución del sistema será inferior. Además esta actualización regular es requerida para anticipar el efecto de los fármaco que son añadidos a la lista y que pueden tener su propia lista de mutaciones que causan resistencia a ese fármaco.
La persona versada en el arte será consciente de aquellas mutaciones o combinaciones de mutaciones que influyen en la eficacia del fármaco. La información aquí puede ser encontrada en la Internet htpp://hiv-web.lanl.gov, htpp://hivdb.stanford.edu/hiv/o http://www.viral-resistance.com o en los artículos por ejemplo Schinazi, R.F., Larder, B.A. & Mellors, J.W. 1997. Int. Antiviral News. 5, 129-142 (1997). Además listas de mutaciones son proporcionadas en algunas solicitudes de patentes.(Means and methods for monitoring protease inhibitor antiretroviral therapy and guiding therapeutic decisions in the treatment of HIV/AIDS (WO 00/78996), Means and methods for monitoring nucleoside reverse transcriptase inhibitor antiretroviral therapy guiding therapeutic decisions in the treatment of HIV/AIDS (WO 99/67427) Means and methods for monitoring non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor antiretroviral therapy(WO 99/61658), Methods for detection of drug-induced mutations in the reverse transcriptase gene (US 6,087,093), New mutational profiles in HIV-1 reverse transcriptase correlated with phenotypic drug resistance (WO 00/73511) and New mutational profiles in HIV-1 reverse transcriptase correlated with phenotypic drug resistance (US Pat. Ser. Nº:09/580/491).
En la presente invención, después de determinar los puntos calientes o la terapia para una secuencia bajo prueba, una base de datos de genotipos puede ser consultada para secuencias similares a la secuencia bajo escrutinio. Esta consulta puede ser hecha usando búsquedas de agrupamientos.
La expresión "base de dato de genotipo" se relaciona con los diversos tipos de bases de datos donde la información de la secuencia es almacenada. De acuerdo a una realización de la invención, la base de datos de genotipo almacena secuencias completas o parciales de nucleótidos. De acuerdo a otras realizaciones de la invención la base de datos de genotipos almacena la secuencia de nucleótidos unida a sus traducciones de aminoácidos o almacena secuencias de nucleótidos unidas a al menos una lista de mutaciones particulares. Estas mutaciones son con respecto a una secuencia de referencia. También esas mutaciones pueden ser al nivel de nucleótidos o al nivel de los aminoácidos. Estas listas pueden incluir todas las mutaciones con respecto a una secuencia de referencia o puede contener una selección de mutaciones.
La información proporcionada a la base de datos de genotipos por lo tanto puede estar también en la forma de una secuencia completa o parcial de ácidos nucleicos relacionados con una muestra biológica o puede ser en la forma de una lista de mutaciones particulares representando una secuencia particular de ácidos nucleicos relacionados con una muestra biológica. Por lo tanto, el término "entrada de genotipo" se relaciona con cualquier forma en la cual la información es proporcionada a la base de datos de genotipos.
Por ejemplo, de acuerdo a la presente invención, una manera preferida de listar mutaciones en la base de datos de genotipos es listar mutaciones las cuales son conocidas o sospechosas estar asociadas con la resistencia a una terapia particular o agente terapéutico. Como tal, cada entrada de genotipo en la base de datos de genotipos puede estar unida a varias listas de mutaciones que ocurren en la secuencia genética relacionada con una muestra biológica, cada una de esas listas representativa para las mutaciones que son conocidas o sospechosas de estar asociadas con la resistencia a una terapia particular o agente terapéutico hacia el cual una resistencia es conocida o puede esperarse que
aparezca.
Con indiferencia del método usado para seleccionar "secuencias similares", una vez que una selección de secuencias similares es encontrada, la aplicación consulta la base de datos del genotipo para los datos de genotipos pertenecientes a aquellas secuencias. La base de datos de genotipos puede ser construida de tal manera que una entrada de una base de datos de una secuencia genética (relacionada con una muestra biológica) se una a un fenotipo. Alternativamente los fenotipos en una base de datos de fenotipos pueden estar unidos a otros medios de presentación de la información de secuencia de nucleótidos, por ejemplo un patrón de mutación o un perfil de mutación para una terapia, agente terapéutico o fármaco. Alternativamente, bases de datos que relacionan genotipo/fenotipo pueden ser usadas en cualquiera de los métodos de la invención para correlacionar la información genotípica con la fenotípica. En una realización este proceso es hecho para cada terapia, agente terapéutico o fármaco, de nuevo usando la búsqueda de agrupamiento. La consulta regresa a una selección de resultados fenotípicos para cada terapia, agente terapéutico o fármaco listado. Un análisis estadístico puede ser ejecutado en la base de datos para eliminar valores atípicos y el número de veces de resistencia virtual puede ser calculado. Por ejemplo, por fármaco, la media del log (valores del número de veces de la resistencia) pueden ser usados para calcular el número de veces de la resistencia virtual y la interpretación de esos números generará un Fenotipo Virtual. El fenotipo virtual (valor del número de veces de la resistencia) puede entonces además ser usado para clasificar el virus como Sensible (S), Intermedio (I) o Resistente(R).
La "resistencia" es determinada usando los protocolos descritos en el ensayo Antivirogram® (WO 97/27480). La resistencia es determinada con respecto a una cepa de referencia de laboratorio HIV LAI/IIIB. La diferencia en los IC_{50} entre la muestra del paciente y la cepa viral de referencia es determinada como un cociente. Este cambio del número de veces en IC_{50} es reportado e indicativo del perfil de resistencia de un cierto fármaco. Basado en los cambios de IC_{50}, los valores de corte han sido establecidos para distinguir una muestra de ser sensible o resistente a un cierto fármaco.
La expresión "base de datos que relaciona genotipo/fenotipo" se refiere a una base de datos que trae juntos el conocimiento de ambas bases de datos genotípica y fenotípica. La base de datos genotípica, por ejemplo, contiene información de una secuencia genética con respecto a al menos un agente que produce una enfermedad. La información de una secuencia genética puede variar a partir de la secuencia completa de un agente que produce enfermedad a un segmento de la secuencia de un agente que produce una enfermedad, a un patrón de mutación. Por ejemplo, la secuencia genética de los virus HIV evaluados o el patrón de mutación de los virus HIV evaluados. La base de datos fenotípica contiene valores de resistencia fenotípica a al menos un agente que produce una enfermedad evaluado para al menos una terapia. Por ejemplo, los valores de resistencia fenotípica de los virus HIV evaluados, con una determinación del número de veces de la resistencia comparada al virus HIV de referencia (tipo
salvaje).
En una realización, por ejemplo, los métodos pueden ser usar diferentes bases de datos de genotipos y fenotipos. Como una muestra es corrida durante el análisis, la entrada de la secuencia identificada y su correspondiente fenotipo son encontrados y "transferidos" a una "Base de datos Central de Llamadas". Este centro de llamadas es una tercera base de datos, donde los resultados feno-genotipo son combinados y usados para el cálculo del número de veces de la resistencia virtual y la generación del reporte. Esta base de datos es una base de datos de correlación.
En una realización, en una base de datos que relaciona genotipos/fenotipos, las entradas de datos son combinadas para producir una representación "2D" para cada muestra: (x_{i}, y_{i}) donde x_{i} representa el resultado fenotípico, y_{i} el genotípico. En otra realización, las entradas de datos son combinadas para producir una representación "3D" para cada muestra (x_{i}, y_{i}, z_{i}) donde x_{i} representa el resultado fenotípico, y_{i} el genotípico, y z_{i} otra información con respecto a la muestra, tal como un número de muestra.
Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con cualquiera de los métodos descritos donde una base de datos que relaciona genotipo/fenotipo es usada para correlacionar al menos una entrada de genotipo con un patrón de mutación similar con un fenotipo en dicha base de datos.
De acuerdo a la realización preferida, la presente invención proporciona una interpretación abarcadora y confiable de la información genotípica interrogando la parte del genotipo de una base de datos que relaciona genotipo/fenotipo para patrones de de mutaciones idénticos o similares a aquel de la muestra del paciente bajo estudio. Una vez que los apareamientos son encontrados, los correspondientes fenotipos son accedidos y la información fenotípica, los cambios en la IC_{50} para las varios fármacos, es mezclado y promediado para producir un perfil fenotípico. Este perfil, en una realización de la invención, puede estar basado en los datos de cientos o miles de fenotipos reales con los mismos patrones de mutaciones. En otra realización, la región RT-PR del genoma HIV-1 de una muestra de paciente es secuenciado y la secuencia es usada en los métodos de la invención para interpretar la información del genotipo. El fenotipo virtual puede entonces usarse para diseñar una terapia, la cual puede ser uno o más fármacos. En una realización adicional, el software registrado puede usarse para interpretar la información del genotipo de acuerdo a los métodos de la invención.
En una realización, un fenotipo más exacto puede ser obtenido construyendo un patrón de mutación usando mutaciones que han sido validadas. Uno de los expertos en el arte reconocerá que existen numerosos métodos de validación si una mutación se correlaciona a la resistencia a al menos una terapia, que incluye pero no están limitados a experimentos de fenotipo, tales como el ANTIVIROGRAM (Virco, Bélgica) y estudios clínicos, (WO 97/27480).
En otra realización, el número y las combinaciones de mutaciones usadas para construir un patrón de mutación podrá ser actualizado en una base regular. Esto puede ser hecho para incorporar mutaciones identificadas recientemente o combinaciones las cuales pueden mejorar la ejecución del sistema. En otra realización, un fenotipo puede ser calculado a partir de al menos una mutación usada para construir un patrón de mutación, sin embargo, a partir de una perspectiva estadística un fenotipo más exacto puede resultar de un número mayor de mutaciones.
De acuerdo a una realización adicional, en cualquiera de los métodos de la invención el fenotipo de dicha muestra biológica puede expresarse como una media del número de veces-cambio en la resistencia hacia al menos una terapia, donde dicha media de número de veces-cambio de la resistencia es calculada a partir de la base de datos de fenotipo(s)
de al menos una entrada de genotipo con un patrón de mutación similar. Preferiblemente, el fenotipo de dicha muestra biológica hacia al menos una terapia o agente terapéutico es expresado como un IC_{50}. Los valores IC son concentraciones inhibitorias, donde la IC_{50} representa la concentración de un fármaco definido que produce la mitad del rendimiento de la señal comparado con una corrida blanco que no comprende fármacos.
La invención además se relaciona con un método para generar un reporte donde dicho reporte comprende el fenotipo determinado (o predicho) usando cualquiera de los métodos de la invención. Algunos ejemplos de reportes son ilustrados en la sección de ejemplos. El reporte puede contener el fenotipo de una muestra biológica contra al menos una terapia o agente terapéutico. Preferiblemente el fenotipo de una muestra biológica contra algunas terapias o agentes terapéuticos son listados en dicho reporte.
El término "proveedor del cuidado de la salud" se entiende que incluye cualquier persona profesional autorizada o entrenada para tratar o tomar los datos del paciente y/o las muestras. Tales personas incluyen pero no están limitadas a médicos, doctores, clínicos, trabajadores de cuidado de la salud, enfermeras, técnicos, laboratoristas, etc.
La Figura 10 proporciona un diagrama de flujo ejemplarizante para determinar un fenotipo virtual. En una realización, los varios pasos y operaciones de la Figura 10 pueden ser ejecutadas por el sistema 40 de determinación del fenotipo en el ambiente del sistema de la Figura 11 para evaluar la resistencia de un paciente a una terapia, o diseñar u optimizar una terapia para un paciente, por ejemplo, con HIV.
Como se ilustró en la Figura 10, en una realización el proceso comienza con la obtención de al menos una secuencia genética de un paciente (paso 100). Una secuencia genética puede obtenerse por un proveedor de cuidado de la salud, laboratorio, o cualquier otra entidad. En una realización, de al menos una secuencia genética, que incluye secuencias genéticas tomadas en varios momentos o una historia de secuencia de un paciente puede ser almacenado en un base de datos, tal como la base de datos local 46 del sistema de determinación del fenotipo 40. (ver Figura
11).
Como parte del cálculo de un fenotipo virtual, un patrón de mutación de la secuencia genética puede ser determinado (paso 110) para al menos una terapia. Como parte de este paso el sistema 40 de determinación del fenotipo puede incluir datos de la mutaciones que correlacionan para la resistencia de al menos una terapia. Los datos de mutación pueden ser accedidos desde una base de datos local 46 y/o una(s) base(s) de datos pública 52.
Una base de datos que relaciona genotipo/fenotipo es entonces buscada para al menos una secuencia genética similar a la secuencia genética del paciente (paso 120). Todas las secuencias similares son identificadas. Esto puede ser logrado buscando para un patrón de mutación similar al patrón de mutación determinado en el paso 110 o, por ejemplo, comparando la secuencia genética del paciente a las secuencias de la base de datos que relaciona genotipo/fenotipo usando secuencias de alineación. La base de datos que relaciona genotipo/fenotipo puede ser accedida a partir de un base de datos local 46 y/o 46 y/o base(s) de datos pública 52.
Como se ilustró en la Figura 10, una base de datos de fenotipo es obtenido para cada secuencia genética similar identificada a partir de la base de datos que relaciona genotipo/fenotipo (paso 130). Un fenotipo para la secuencia genética del paciente es entonces calculada a partir de todas las bases de datos de fenotipos identificados (paso
140).
La información puede entonces ser retransmitida al proveedor de cuidado de la salud o usada en la determinación de otra información, tal como evaluar resistencia de un paciente a una terapia, o diseñar u optimizar una terapia para un paciente. La información resultante puede entonces ser retransmitida al proveedor de cuidado de la salud. La Figura 11 es un ambiente del sistema ejemplar en el cual las características y los métodos de la invención pueden ser implementados (por ejemplo, los métodos como los mostrados en la Figura 10). Como se ilustró en la Figura 11, un canal 30 de comunicación es proporcionado para facilitar la transferencia de datos entre varios componentes del sistema y entidades. Estos componentes y entidades pueden incluir, por ejemplo, uno o más proveedores de cuidado de la salud 12A-12N quienes interactúan con o tratan pacientes (no mostrados), un sistema 40 de determinación de fenotipo, y una o más bases de datos públicas 52.
El canal de comunicación 30 puede ser implementado a través de cualquier canal único o combinación de canales que permitan la comunicación entre diferentes personas, computadoras o localidades. El canal de comunicación puede ser cualquier sistema que permita la comunicación entre las diferentes entidades ilustradas en la Figura
11.
Cada uno de los proveedores de cuidado de la salud 12A-12N, por ejemplo, colecta las muestras biológicas de cada paciente o pacientes, y determina una secuencia genética o tiene un secuencia genética determinada, donde tal dato es sometido al análisis por el sistema 40 de determinación del fenotipo.
En una realización, el sistema 40 de determinación del fenotipo puede ser implementado a través de cualquier combinación de hardware, software y/o firmware. Por ejemplo el sistema 40 de determinación del fenotipo puede ser implementado a través del uso de una computadora personal, una estación de trabajo, un servidor o cualquier plataforma informática. Software o instrucciones programadas pueden también proporcionarse para el control de las operaciones de la plataforma informática, consistente con los principios de esta invención.
Como se ilustró en la Figura 11, el sistema 40 de determinación del fenotipo puede también incluir una base 46 de datos local para almacenar los datos del paciente incluyendo los datos de la secuencia genética. La base de datos local 46 puede también almacenar los datos de mutación y/o datos que relacionan los datos de genotipo/fenotipo, los datos de mutación y/o datos que relacionan genotipo/fenotipo pueden ser accedidos desde una o más bases de datos pública 52 por el sistema 40 de determinación de fenotipo.
En consistencia con los métodos de la presente invención, el sistema 40 de determinación del fenotipo es configurado para proporcionar información con respecto a al menos uno de: fenotipo, valoración de la resistencia de un paciente a una terapia, y diseño u optimización de una terapia para pacientes tratados por los médicos 12A-12N. La información puede ser enviada por el sistema 40 a los médicos 12A-12N en numerosos formatos (por ejemplo, reportes escritos, archivo electrónico, pantalla gráfica, etc.) y pueden proporcionarse a los médicos en base a tasas o como un servicio libre o auxiliar.
Debe entenderse que el método como se subrayó en los Ejemplos es apto para el análisis del efecto de las alteraciones genéticas, y los consecuentes cambios proteicos, en el gen de la proteasas y la transcriptasa reversa de HIV. Debe apreciarse que el método es igualmente bien adaptable para analizar diferentes genes o grupos de genes presentes en el HIV, o cualquier otro organismo de origen viral, procariótico o eucariótico, implicado en los diagnósticos clínicos o en la farmacogenética.
Descripción de las Figuras
Figura 1: El reporte de la Figura 1 proporciona la siguiente información para ayudar a los médicos a interpretar los datos genotípicos y desarrollar un régimen de tratamiento:
1.
Las primeras dos columnas da nombres comerciales y genéricos de los fármacos.
2.
La parte superior del diagrama tiene una representación gráfica de las mutaciones en la región de la proteasa del genoma.
3.
Debajo de esto es la misma información para la región de la transcriptasa reversa.
4.
La tercera columna simplemente indica si fueron encontradas o no las mutaciones que afectan la susceptibilidad para esa fármaco particular.
5.
La cuarta columna indica el número de muestras en la base de datos que aparean el patrón de mutaciones en la muestra del virus, para cada fármaco.
6.
La quinta columna tiene una representación código-color del rango de susceptibilidades fenotípicas encontradas en la base de datos.
7.
Finalmente el promedio IC_{50} para todos los apareamientos en la base de datos es presentada para cada fármaco.
Figura 2: Una predicción de un Reporte Fenotípico usando la Presente Invención.
Figura 3: Valor Predictivo de la presente invención.
Figura 4: Sección del genoma de HIV cubierto por el ensayo Antivirogram ®.
Figura 5: Representación esquemática de acuerdo a una realización de monitoreo de resistencia.
Figura 6: es un diagrama esquemático de la búsqueda del patrón ejemplar. Los números indicados para cada mutación (N) indican la N observada en el análisis de la base de datos ilustrada en la Tabla 1.
Figura 7: Representa los resultados de la búsqueda fenotípica para el virus con diferentes agrupaciones de mutaciones de resistencia AZT. La gráfica muestra la media (o), el error estándar (\blacksquare) y 95% límites de confidencia 1000 para cada agrupación.
Figura 8: Es una correlación entre el fenotipo actual y el virtual predicho por la computadora. Un análisis de regresión lineal se muestra para cuatro grupos de datos aleatorios independientes que comprenden 500 muestras cada uno.
Figura 9(a)&(b): son una descripción del coeficiente de probabilidades de fracaso para lograr una reducción de la carga viral por debajo de 400 copias de ARN viral/ml.
Figura 10(a)&(b):
10 (a)
es un diagrama de flujo ejemplar para determinar un fenotipo, de acuerdo con los métodos de la invención.
10(b)
es un diagrama de flujo ejemplar de una realización para ejecutar los pasos 110 a 130 de la figura 10 (a).
Figura 11: una representación ejemplar de un ambiente del sistema en el cual las características y los métodos de la invención pueden ser implementados.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Definición de una secuencia
Una secuencia consiste de un número de nucléotidos. Los nucleótidos son representados por las letras A, C, T y G. A, C, T y G son las bases de una secuencia. Otras letras como R, Y, M etc. simbolizan una combinación de dos o más bases.
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1
2
Grupos de 3 nucleótidos forman un codón. Estos codones son traducidos a aminoácidos y luego son comparados a una secuencia de referencia para determinar las mutaciones. Una mutación es una diferencia entre la secuencia de referencia y la secuencia evaluada.
La secuencia de referencia de nucleótido original se parece a esta (el ejemplo muestra solamente la sección de proteasa que contiene 99 amino ácidos o 297 nucleótidos. La sección de transcriptasa inversa contiene 400 aminoácidos o 1200 nucleótidos.):
3
Esta es la sección de proteasa de la secuencia bajo evaluación:
4
Las diferencias son subrayadas. Después de la traducción en aminoácidos y la comparación, los resultados se parecen a esto:
5
Las flechas y figuras con el fondo gris oscuro son las posiciones dentro de la sección de la proteasa. Las letras con el fondo gris medio muestran los aminoácidos en la secuencia de referencia. El fondo gris claro muestra la secuencia bajo evaluación: espacios vacíos significa que el aminoácido es el mismo como en la secuencia de referencia, los aminoácidos en letras negritas y en cuadros son las mutaciones que son conocidas o sospechosas de estar asociadas con la resistencia a la terapia o fármacos.
En este caso, las mutaciones serían: 10I, 20R, 36I etc., donde el número representa la posición y la letra de aminoácido que ha mutado.
Cálculo del Fenotipo Virtual
Para calcular el Fenotipo Virtual, el concepto de "secuencias similares" necesita ser explicado.
Para determinar la similitud entre secuencias, no puede aparear justamente los nucleótidos o aminoácidos, porque ellos no siempre se aparean completamente. Esto es debido a un número de mutaciones no documentadas que pueden encontrarse en cualquier secuencia y al hecho de que diferentes combinaciones de nucleótidos conducen al mismo aminoácido.
Para ser capaces de comparar, nosotros definimos puntos de anclaje, o "Puntos-calientes" como ellos son llamados. Para cada fármaco, un número de puntos-calientes es definido y continuamente actualizado.
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Ejemplo
6 
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En este ejemplo, existen 10 descripciones de puntos calientes relacionadas con el fármaco en cuestión.
Para comparar las secuencias, una lista de perfiles (un perfil por fármaco que es evaluado) es determinada para cada secuencia. El perfil es determinado preservando los conteos de los puntos calientes apareados y no apareados por fármaco.
En el ejemplo anterior, si una secuencia pudiera aparear los puntos calientes 2, 5, 6, 7 y 9, la secuencia tendría un perfil para este fármaco igual a "0100111010". Cada nuevo perfil es almacenado dentro de la base de datos.
Es declarado cada punto-caliente que preserva el conteo de las secuencias que aparea las mutaciones. Usando esta información, el sistema es capaz de recuperar todas las secuencias que tienen exactamente el mismo perfil haciendo una intersección de los grupos que aparean y subsecuentemente sustrayendo los grupos que no aparean. En lugar de usar grupos de secuencias, los sistemas usan los correspondientes grupos de datos de fenotipo; esto incrementa la ejecución del sistema.
El próximo paso es recuperar los resultados fenotípicos para aquellas secuencias. Ellas varían entre ninguna y bien por encima de 20.000. En esos resultados fenotípicos, unos pocos cálculos son ejecutados, por ejemplo número de veces de resistencia medio o promedio puede ser calculado:
1. 7
2. El log de la desviación estándar de todos los valores del número de veces de la resistencia es calculado:
Donde n es la cantidad de determinaciones fenotípicas y x contiene los valores del número de veces de la resistencia individual.
3. La media de todos los valores del Número de veces de la Resistencia es calculada.
4. Los valores atípicos son determinados usando un valor de 3Ò; esos son los valores del Número de veces de la Resistencia que son mayores que (media + (3 x STD))o menor que (media-(3 x STD)).
5. El Número de veces de la Resistencia medio corregido es calculado en todos los datos menos en los valores atípicos.
Este valor corregido es reportado y usado para determinar la resistencia junto con el valor de corte que corresponde para ese fármaco. Todos los valores calculados son almacenados junto con los perfiles para los que fueron calculados.
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Ejemplo 2
Un ejemplo de una realización de la presente invención puede ser descrito por los siguientes pasos:
1.
La secuencia gag-RT-PR es entrada en una computadora como una hilera de texto;
2.
El programa de computadora escanea la secuencia para todas las mutaciones, y "lista" todas aquellas que son conocidas o se sospecha que juegan un papel en el desarrollo de la resistencia al fármaco;
3.
Las mutaciones son entonces listadas contra cada una de los fármacos para los cuales ellos afectan la sensibilidad;
4.
Para cada fármaco, el programa de computadora interroga una base de datos de genotipos para las muestras previas con secuencias o mutaciones iguales o similares, relacionadas con ese fármaco. Las mutaciones primarias, aquellas mutaciones iniciales que tiene un efecto discernible en la resistencia del fármaco, son buscadas primero en la base de datos individualmente. Las mutaciones secundarias, aquellas que tienen efectos sutiles en la resistencia o incremento de la aptitud viral, son buscadas en grupos. Típicamente habrá cientos de registros que aparean el patrón de mutaciones para cada fármaco;
5.
Cada vez que un apareamiento es encontrado, por ejemplo, una muestra previa con el patrón igual o similar de mutaciones AZT, el programa de computadora localiza el fenotipo para esa muestra en la base de datos de fenotipos Virco y lo almacena (expresado como un cambio en IC_{50}).
6.
Finalmente, de nuevo para cada fármaco, el programa calcula el cambio promedio en IC_{50} de todos los ejemplos que ha encontrado y resume la distribución de sensibilidades como el porcentaje que fueron sensibles (resistencia es improbable), intermedio (resistencia es incierta)o resistencia (resistencia es probable); y
7.
El programa puede entonces generar un reporte final que lista, para cada fármaco a su vez:
A)
Los nombres del fármaco.
B)
Las mutaciones encontradas en el genotipo que afectan la sensibilidad para ese fármaco.
C)
El número de genotipos en la base de datos Virco para el cual el dato de fenotipo es disponible.
D)
La proporción de esas que fueron sensibles, intermedios o resistentes para esa fármaco.
E)
La puntuación de sensibilidad media - como un cambio en la IC_{50}.
La invención también proporciona, en una realización, un método de evaluación de la efectividad de una terapia en un paciente determinando si el fenotipo de una muestra biológica está terapéuticamente en un rango de efecto. Un rango terapéuticamente efectivo toma en cuenta, entre otras variables, la terapia o terapias que están siendo examinadas, las características del paciente individual tales como farmacocinéticas del paciente, y resistencia del agente que causa una enfermedad. Un experto en el arte puede calcular un rango terapéuticamente efectivo usando, por ejemplo, rangos efectivos en terapia publicados y modelos farmacocinéticos (Ver por ejemplo, Solicitud de Patente Europea No. 00/203200.1, presentada en Septiembre 15, 2000). La invención también proporciona métodos para optimizar la terapia para un paciente y diseñar la terapia para un paciente. En una realización, el artesano experto puede optimizar y/o diseñar una terapia comparando los fenotipos determinados usando los métodos de la invención y seleccionando la terapias o terapias que podrían ser las más efectivas para el tratamiento de un paciente.
La Figura 1 representa un reporte de muestra producida usando la presente invención.
Estudios han mostrado que el presente método inventivo es más de 90% exacto en predecir el fenotipo actual usando una base de datos de genotipos y fenotipos actual. Ya que más datos son adicionados a la base de datos, los cambios de encontrar grandes números de apareos exactos para el patrón de mutación de un individuo podrá incrementar y el nivel de exactitud puede ser aún mayor.
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Ejemplo 3
En el caso mostrado en la Figura 2, por ejemplo, la población de virus es probable que responda a didanosina, zalcitabina y estavudina (del NRTI), no a AZT, 3TC y posiblemente no a abacavir. Una respuesta es probable para cualquiera de los NNRTI pero el fármaco con más probabilidad de ser efectivo es efavirenz. Los virus de pacientes serán muy probablemente resistentes al inhibidor de proteasa nelfinavir y más probablemente son sensibles a amprenavir.
La distribución de las sensibilidades de los apareamientos de fenotipos puede generalmente capacitar a los médicos, independientemente de las enfermedades estudiadas, para seleccionar entre los fármacos alternativos que el sistema predice cual será efectivo para minimizar los cambios de resistencia. Con respecto a HIV, por ejemplo, dos inhibidores de proteasa pueden tener una puntuación idéntica para el cambio predicho en la IC_{50}, sugiriendo sensibilidad, pero uno puede tener un más amplio margen de datos, incluyendo algunos ejemplos donde había resistencia. El médico puede entonces seleccionar el fármaco sin la evidencia de resistencia en la base de datos.
Esta puntuación de sensibilidad media es altamente predictiva del fenotipo real y es por tanto una variable predictiva confiable de a cuales fármacos el paciente responderá o no responderá en el grupo clínico. Ver figura 3.
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Ejemplo 4
En otra realización, la presente invención puede usarse con ensayos de monitoreo de la resistencia fenotípica, tal como los ensayos recombinantes conocidos, en la administración clínica de enfermedades que desarrollan resistencia, incluyendo el HIV y otras infecciones virales, cáncer, infecciones bacterianas, y similares. Un sistema de monitoreo de resistencia particularmente útil es un ensayo recombinante conocido como el Antivirogram®. El Antivirogram® es un ensayo recombinante altamente automatizado, de alto rendimiento, de segunda generación que puede medir la susceptibilidad, especialmente la susceptibilidad viral, para todos los fármacos disponibles, particularmente fármacos antiretrovirales (inhibidores de transcriptasa reversa e inhibidores de proteasa) al mismo tiempo. (Hertogs K. de Bethune MP, Miller V y otros. Antimicrob Agents Chemother, 1998; 42 (2): 269-276).
El proceso completo puede ser dividido en tres fases: biología molecular, transfección y prueba de susceptibilidad. El proceso es resumido debajo y en la Figura 4.
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Biología Molecular
\bullet
Fragmentos de ARN viral extraídos de muestra de sangre de pacientes.
\bullet
ADN complementario (ADNc) de la secuencia gag-PR-RT, a través del codón 400 formado a través de la transcripción reversa.
\bullet
Secuencia Gag-PT-RT multiplicada usando dos rondas de PCR.
\bullet
Purificación de fragmentos de ADN.
\bullet
Creación de clon proviral de laboratorio con secuencia gag-PR-RT suprimida.
\bullet
Inserción del clon en los plásmidos bacterianos para la reproducción de grandes cantidades.
\vskip1.000000\baselineskip
Transfección
Este es el proceso por el cual los genes son transferidos a la célula.
1.
Las secuencias gag-PR-RT de la muestra del paciente y los fragmentos de plásmidos son mezclados con CD4+, células MT4.
2.
La electroporación tiene lugar: las células son sometidas a una corta (milisegundos), pero fuerte corriente en una cubeta que produce aperturas transitorias en la membrana celular, a través de la cual ambos fragmentos de ADN gag-PR-RT y el fragmento de plásmido entran.
3.
En una proporción relativamente pequeña de las células, ambos fragmentos se encontraran y probablemente apoyados por una enzima celular, recombinan para formar un genoma completo HIV-1 que puede ahora ser convertido dentro de las partículas de virus infecciosos.
4.
El virus recombinante es entonces crecido en este cultivo celular durante aproximadamente 8 días, hasta que alcance un suficiente nivel el efecto citopatogenético o CPE.
5.
El medio es entonces centrifugado para separar las células y el sobrenadante contiene grandes cantidades de virus recombinante - la cosecha del stock de virus.
6.
El virus es entonces titulado para obtener una concentración conocida.
\vskip1.000000\baselineskip
Evaluación de la susceptibilidad
En esta fase, es determinado si los diferentes inhibidores de HIV-1 son aún capaces de inhibir la replicación de los virus recombinantes mencionados anteriormente.
1.
Diferentes concentraciones de los agentes antivirales son colocados en los 384 micropozos de un placa de evaluación de microtítulo. Algunos pozos son usados para cada concentración y los resultados medios son usados para incrementar la fiabilidad.
2.
Un grupo de dilución del stock de virus recombinante o el virus control del tipo salvaje es añadido a cada micropozo.
3.
Un grupo de dilución de células MT4 que contienen un sistema de gen reportero fluorescente es también añadido a cada pozo.
4.
La placa es incubada por 3 días durante el tiempo en el cual el virus recombinante se replicará en las células MT4 a menos que sean inhibidas por el fármaco antiviral. La replicación dispara el gen reportero, el cual produce proteínas la cuales fluorescen.
5.
La cantidad de replicación viral a cada concentración del fármaco es medida por espectrometría computarizada, con relación a los controles de virus tipo salvaje.
6.
La susceptibilidad del virus a cada fármaco es expresada como un cambio del número de veces en la IC_{50} relativa al virus tipo salvaje.
7.
Un reporte es preparado el cual proporciona esos datos para cada fármaco con un incremento en la IC_{50} de menos de 4 clasificaron como susceptibles, entre 4 y 10 clasificaron como intermedios y por encima de 10 como resistentes.
El proceso completo es altamente automatizado y usa la robótica del estado del arte para asegurar la consistencia y alto rendimiento total.
Existe otro ensayo que permite la evaluación simultánea de la susceptibilidad de inhibidores de transcriptasa reversa e inhibidores de proteasa en una mayor escala: Virologic's Phenosense assay (Petropoulos, CJ, Parkin NT, Limilo KL, y otros. Antimicrob Agents Chemother, 2000; 44(4):920-928). El ensayo puede ser descrito como sigue:
1.
Fragmentos de ARN viral son extraídos de la muestra de sangre de pacientes.
2.
El ADN complementario (ADNc) de la secuencia gag-Pr-RT para el codón 300 es formado a través de la transcripción reversa.
3.
Las secuencias de transcriptasa reversa (RT) y proteasa (Pr) son multiplicadas usando PCR.
4.
Secuencias RT-Pr muestras son ligadas (unidas) a provirus con secuencias RT-Pr suprimidas y un gen indicador, luciferasa es insertado en el gen de la envoltura de HIV-1 suprimido.
5.
Estos vectores virales recombinantes, juntos con un plásmido que porta las proteínas de la envoltura del virus de leucemia murina, son transferidos en las células humanas en presencia de concentraciones variantes de inhibidores de proteasa.
6.
Las partículas virales que son formadas son cosechadas y se les permite infectar las células blanco en un segundo momento en presencia de varias concentraciones de inhibidores RT.
La susceptibilidad de las secuencias virales para inhibidores RT e inhibidores de proteasa es calculada midiendo la actividad de la luciferasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Se desea proporcionar a los médicos y personas que viven con enfermedades, en particular HIV/AIDS, la más exacta, confiable y útil información acerca de la enfermedad de la persona individual para ayudarlos a tomar la decisión más informada acerca de la estrategia de tratamiento óptima y diseñar estrategias de tratamiento. Los métodos de la presente invención representados en una realización por el VircoGEN^{TM} II, y el Antivirogram^{TM}, tiene un lugar en la administración clínica de las enfermedades, tales como HIV/AIDS. La selección de cual(es) ensayo(s) diagnóstico(s) a usar y cuando es para hacerlo el médico y su paciente depende de un número de diferentes factores.
Las recomendaciones para pruebas de resistencia son incluidas en varias guías de tratamiento que incluyen aquellas del US Department of Health and Human Services y la International AIDS Society. Ellos no hacen ninguna recomendación de cual prueba usar diferente de las guías DHHS que declaran que el uso de ambas pruebas es útil para las personas con historias de tratamiento complejas. El uso tanto de la fenotipificación y la genotipificación es generalmente considerado como la aproximación más confiable para la evaluación de la resistencia.
Algunas situaciones clínicas donde la prueba de la resistencia podría ser de valor son listadas debajo con alguna razón para el tipo de prueba a usar.
La siguiente tabla da los ejemplos de situaciones clínicas donde la evaluación de la resistencia puede ser considerada.
TABLA 1
8
9
10
Ejemplo 6
Fuente de muestras y análisis de susceptibilidad
Muestras de plasma fueron obtenidas de pacientes y sometidas a laboratorios para evaluación de rutina de la susceptibilidad del fármaco. Estas fueron coleccionadas fundamentalmente de USA, Canadá y Europa, aunque muestras de América del Sur, Sudeste Asiático y Sudáfrica están también representadas en la base de datos. Debido a la naturaleza de la colección de esas muestras, nosotros fuimos capaces de obtener terapia compresiva e historias clínicas de la mayoría de los pacientes involucrados - aunque la mayoría fueron de diferentes pacientes individuales. ARN viral fue extraído de esas muestras y convertido a ADNc por transcripción reversa. posteriormente, un fragmento de 1.7 kb del genoma de HIV-1 que abarca parte del gag, la proteasa y los primeros 400 codones de RT fue amplificado por PCR^{1}. Estos amplicones fueron directamente secuenciados por el secuenciador ABI automatizado y el fenotipo de susceptibilidad del fármaco fue determinado para 14 fármacos antiretrovirales individuales usando un ensayo de virus recombinante. Las secuencias de texto fueron importadas directamente en la base de datos, como fueron la IC_{50} y valores de número de veces de la resistencia para cada fármaco.
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Desarrollo de base de datos y derivación de fenotipo virtual
La base de datos de genotipo-fenotipo fue desarrollada en un ambiente RAD (Desarrollo de Rápida Aplicación) usando Apple Macintosh. La programación fue en "4^{ta} Dimensión" (4D); una base de datos relacional multi-entrelazada, gráfica, de 32-bit. La base de datos corrientemente corre sobre un PowerMAc G4, 400 MHz, 256 MB RAM. Para los propósitos del análisis; el software asumió que la mezcla de un tipo salvaje y aminoácido mutante en un residuo particular era mutante. Para un total de 108 individuos, diferentes cambios de aminoácidos fueron usados en el procedimiento de búsqueda (en un total de 56 posiciones únicas). Este fue roto en 39 cambios en la proteasa y 69 en RT (32 para los inhibidores RT no nucleósidos y 37 para los análogos de nucleósidos). Las siguientes mutaciones, agrupadas por clases de fármacos, fueron incluidas en la maquinaria de búsqueda. Los inhibidores de proteasa: 10F/I/R/V, 20I/M/R/T, 24I, 30N, 32I, 33F/I/M/V, 36I, 46I/L, 47L, 48V, 50V, 54L/M/V, 71T/V, 73A/C/S, 77I, 82A/F/S/T, 84A/V, 88D/S, 90M. Análogos de nucleósidos: 41L,44A/D, 62A, 65R, 67N, 69D/N, inserción 69, 70R, 74 V/I, 75A/I/M/T, 77L, 100I, 115F, 116Y, 118I, 151M, 181C, 184I/T/V, 208Y, 210W, 211K/Q, 215F/Y, 219E/N/Q, 333D/E. NNRTIs:98G/S, 100I, 101E/I/P/Q, 103N/Q/R/S/T, 106A/I/L,108I, 179D/E, 181C/I/V, 188C/H/L, 189I, 190A/E/S, 225H, 233V, 236L, 238T. En el momento de este estudio, la base de datos comprendió muestras \sim 45,000 fenotipadas y \sim 35000 genotipadas, de las cuales >15,000 tuvieron ambos genotipo y fenotipo.
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Análisis DAP de muestras clínicas
Datos de la carga viral de las muestras clínicas de 191 pacientes quienes participaron en el estudio de fenotipificación prospectivo de HIV-1 VIRA 3001 fueron analizados de acuerdo al plan de análisis de datos del grupo colaborativo de resistencia internacional. Los datos fenotípicos y genotípicos completos estaban disponibles para esos pacientes, quienes recibieron un total de 635 fármacos antiretrovirales. El parámetro de análisis fue el fracaso virológico a la semana 16, definido como ARN HIV-1 plasmático por encima de 400 copias/ml. La regresión logística fue usada para modelar este parámetro. En los modelos univariables, la puntuación de la sensibilidad genotípica total (análisis de genotipo) o la puntuación de la sensibilidad fenotípica (análisis de fenotipo virtual y fenotipo real) fueron los únicos factores en el modelo. Mientras que en los modelos multivariables, la línea base de la carga viral plasmática de HIV-1 y el número de nuevos fármacos en el régimen de tratamiento fueron añadidos como covariables extra. Para calcular la puntuación de sensibilidad genotípica, mutaciones particulares, o grupos de mutaciones, fueron usadas para diseñar la resistencia o susceptibilidad para cada fármaco antiretroviral en el régimen (estas fueron predefinidas por el grupo colaborativo de resistencia). La puntuación de sensibilidad fenotípica para ambos fenotipos actuales y fenotipos virtuales fueron basados en el cambio del número de veces en IC_{50} con relación a un control de virus susceptible, tipo salvaje. La puntuación fenotípica total fue definida como el número de fármacos susceptibles en el
régimen.
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Derivación del "fenotipo virtual"
Primeramente, las regiones de proteasa y transcriptasa reversa (RT) del genoma de HIV-1 fueron secuenciadas por métodos estándares. Estas regiones codifican para las enzimas blancos de los fármacos antiretrovirales actuales y las mutaciones aquí pueden conferir resistencia a los fármacos. Las mutaciones asociadas con la resistencia presente en la secuencia fueron identificadas y entonces el software buscó una base de datos que relaciona genotipo/fenotipo para las muestras archivadas con un patrón de mutación similar para cada fármaco (una mezcla de tipo salvaje y aminoácido mutante es tratado como mutante completamente). Debido a la talla sustancial de la base de datos, típicamente cientos o miles de apareamientos fueron encontrados. El software entonces recuperó el dato fenotípico para cada uno de los genotipos que aparean fármaco por fármaco, ejecutó una transformación logarítmica y calculó el número de veces de cambio en la resistencia promedio transformado.
Al igual que con el fenotipo actual en el cual está basado, este fue expresado como un cambio del número de veces en la concentración inhibitoria a 50% (IC_{50}) comparado con un valor de 1.0 para virus tipo salvaje completamente sensibles. La Figura 6 muestra en diagrama como una búsqueda de este tipo fue ejecutada, usando mutaciones que influyen en la resistencia a la zidovudina (AZT) como un ejemplo. Esta ilustración es para un virus que tiene cualquier combinación de mutaciones 41 L, 184V o I y 215Y o F. Unas series de búsquedas primero encuentran todas las muestras que individualmente contienen cada una de las mutaciones y entonces por un proceso de inclusión, son identificadas todas las muestras que contienen las tres mutaciones ilustradas.
La información que corresponde a la base de datos para esas mutaciones de resistencia específica a AZT es mostrada en la Tabla 2. Esta ilustra ejemplos de las primeras 13255 muestras genotípicamente-apareadas encontradas en la base de datos para mutaciones únicas y múltiples en los codones RT HIV-1,41, 184 y 215. Un número de características interesantes son indicadas en esta Tabla. En particular, el efecto fenotípico de una mutación depende del contexto genético en el cual este ocurre. En este ejemplo simple de solamente esas tres mutaciones, los virus con 41L pueden tener un incremento promedio en el rango de resistencia de 1.3-veces a > 27 veces. Así, la simple detección de la presencia (o ausencia) de una mutación dada puede ser no informativa o incluso engañosa. Además, el efecto de las mutaciones no es simplemente aditivo - los efectos moduladores de las mutaciones M184V o I (disminución de susceptibilidad a AZT) y/o la mutación 41L (que incrementa la susceptibilidad a AZT) en los virus con las mutaciones 215Y o F pueden ser discernidos de la Tabla X (rango 6.2 a 27.7 veces). Este análisis es considerablemente menos sofisticado que el sistema de fenotipo virtual ya que este representa grupos de muestras donde solamente la inclusión de tres mutaciones específicas han ocurrido, en vez de inclusión adicional y exclusión de otras
mutaciones.
TABLA 2 Ejemplo de Método para Derivación de Fenotipos Virtuales de AZT (usando solamente tres mutaciones)
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En la actual derivación de un Fenotipo Virtual para AZT, un total de 18 mutaciones fue examinada en este modo.
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Identificación de agrupaciones genéticas con distintos fenotipos
Si los procesos de búsqueda estaban funcionando apropiadamente, grandes series de agrupaciones genéticas fenotípicamente distintas deben ser identificadas. Cada uno de estas debe tener fenotipos distinguibles con solamente variabilidad modesta de la susceptibilidad. Esto fue evaluado examinando las agrupaciones genéticas formadas por las combinaciones de mutaciones AZT descritas en la Tabla 2. Además de esas mutaciones, agrupaciones fueron identificadas que también contenían mutaciones de resistencia AZT adicionales (Fig 7). Las búsquedas de la base de datos fueron ejecutadas usando muestras con mutaciones de resistencia AZT específica, con o sin mutaciones de resistencia 3TC, 184V o I. Los números de muestras en cada agrupación genética fueron como sigue: WT (tipo salvaje, susceptible),3798; 184(184V/I), 777; 215 (215Y/F),175; 215 184(215Y/F y 184V/I), 70; 2M (41L y 215Y/F), 243; 2M 184(41L, 215Y/F y 184V/I); 186; 3M(41L, 210W y 215Y/F), 289; 3M 184(41L, 210W, 215Y/F y 184V/I); 4M (41L, 67N, 210W y 215Y/F), 358; 4M 184(41L, 67N, 210W, 215Y/F y 184V/I),84.
Esto ilustra un número de puntos importantes considerando las búsquedas de la base de datos. Primeramente, agrupaciones genéticas diferentes tienen distintos perfiles de susceptibilidad (indicado por los valores del número de veces de la resistencia media, junto con el error estándar y 95% de intervalos de confidencia). Este rango de valores de un nivel de susceptibilidad ligeramente reducido (virus encubridor de la mutación 184V) a casi 100-veces incrementa, debido a múltiples mutaciones que confieren resistencia AZT. En segundo lugar, en cada caso, la inclusión de la mutación 184 V junto con las mutaciones de resistencia a AZT, causó una reducción sustancial en la magnitud predicha de resistencia a AZT. Los datos claramente muestran que el sistema de reconocimiento del patrón puede predecir una susceptibilidad alterada debido a las interacciones de las mutaciones.
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Correlación entre el fenotipo predicho y real
El fenotipo virtual fue validado en un número de maneras. Primeramente, entre 2700 y 8700 muestras tipo genotípicamente salvaje fueron evaluadas para cada fármaco. Como se anticipó, el cambio del número de veces predicho estaba cerca de uno para todos los fármacos examinados, con un rango de 0.66-1.69 veces. Luego, la relación cuantitativa entre los fenotipos predichos y fenotipos reales fue investigada. 5000 muestras clínicamente derivadas de USA fueron aleatoriamente seleccionadas de la base de datos de resistencia de 1999 hacia delante y las predicciones fenotípicas obtenidas de los perfiles genotípicos para cada fármaco fueron comparados con fenotipos reales en 10 subgrupos aleatorios de 500 muestras cada uno. Esto resultó en aproximadamente 70,000 determinaciones en total. Análisis de regresión lineal independientes fueron entonces ejecutados en cada uno de estos grupos de datos (cuatro de esos análisis son mostrados en la Fig. 8). Esto mostró una buena correlación entre el fenotipo virtual (cambio del número de veces promedio en valor IC_{50}) y fenotipo de susceptibilidad al fármaco real, con una pendiente promedio de 0.83 (rango 0.81-0.85), intercepto de 0.05 (rango 0.02-0.07) y coeficiente de correlación promedio de 0.87 (rango 0.86-0.89) a través de diez grupos de 500 muestran clínicas.
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El fenotipo virtual predice la respuesta clínica
El valor predictivo del fenotipo virtual fue también evaluado. Para dirigir esto, nosotros ejecutamos un análisis retrospectivo de datos clínicos y virológicos del estudio clínico, VIRA 3001. Cohen, C., y otros, XIII International AIDS Conference. Durban. (2000). Esto es un ensayo clínico aleatorio completado recientemente, que demostró el efecto positivo de la información de resistencia al fármaco fenotípica en la respuesta virológica en pacientes quienes habían fracasado un régimen terapéutico conteniendo PI. Muestras de 191 pacientes en este estudio fueron re-analizadas para evaluar la relación entre el fenotipo virtual (de la secuencia genética) y resultados virológicos a las 16 semanas. Los valores predictivos de fenotipo, fenotipo virtual y genotipo con interpretación "basada en reglas" fueron analizados de acuerdo a un plan de análisis de datos (DAP) usado por el grupo colaborativo de resistencia internacional para re-análisis de los ensayos clínicos. DeGruttola V., y otros, Antiviral Therapy 5, 41-48 (2000). Este sistema de análisis comprende aproximaciones estadísticas univariables y multivariables y requiere el uso de una lista de mutaciones "basadas en reglas" para la interpretación genotípica. Los resultados de este análisis son mostrados en la Fig. 9. La regresión logística fue usada para modelar el parámetro del fracaso virológico en la semana 16 (definido como ARN HIV-1 plasmástico por encima de 400 copias/ml). Modelos univariables (a) o multivariables (b) fueron usados para el fenotipo de susceptibilidad al fármaco (fenotipo), fenotipo virtual (virtual) o genotipo. La puntuación de la sensibilidad fenotípica (PSS) o puntuación de la sensibilidad genotípica (GSS) calculada fueron obtenidas separadamente para una pendiente como la censada (DAC) o pendientes como análisis de fracasos (DAF). Los resultados del análisis de regresión son mostrados en la Figura 9 como una relación de posibilidades (OR) o fracasos para lograr una reducción viral por debajo de 400 copias/ml, con el 95% de intervalo de confianza (CI).
En el modelo univariable, el análisis del genotipo (pendiente como la censada, DAC) fue una variable predictiva significativa de respuesta con una relación de posibilidades (OR) de 0.69 (CI=0.51-0.93), p=0.015 (Fig. 9a). Sin embargo, el genotipo no fue una variable predictiva significativa de respuesta en el modelo multivariable, OR=0.81 (CI=0.57-1.14), p=0.22 (Fig. 9b). En contraste, el fenotipo virtual fue altamente significativo en ambos modelos, también usando el análisis DAC con una susceptibilidad de corte de 4-veces para todos los fármacos en el modelo univariable, el OR=0.38 (CI=0.25-0.6), p<0.0001 y en el modelo multivariable el OR=0.52 (CI=0.31-0.87), p=0.013. Usando los cortes biológicos, fármaco-específicos, recientemente definidos el poder predictivo del fenotipo virtual fue aún más significativo. Larder, B,A. & Harrigan, P. R., Fifth International Congress on Drug Therapy in HIV infection, Glasgow (2000). El OR en el modelo univariable fue 0.39 (CI=0.26-0.58), p<0.0001, y en el modelo multivariable el OR=0.49 (CI=0.31-0.76). p=0.0014. El análisis DAF (pendientes como fracasos) mostró superioridad consistente para el fenotipo predicho sobre el genotipo aunque el nivel de significación fue correspondientemente menor para todas las categorías.

Claims (21)

1. Un método de determinación de un fenotipo virtual de un virus de inmunodeficiencia humana que comprende:
a)
obtener una secuencia genética de dicho virus.
b)
identificar al menos un patrón de mutación en dicha secuencia genética donde dicha secuencia genética comprende al menos una mutación, y donde dicha al menos una mutación o patrón de mutación está asociado con la resistencia a al menos una terapia,
c)
buscar una base de datos de genotipo para entradas de genotipos con un patrón de mutación similar a al menos uno de los patrones de mutación identificados en la secuencia genética en b)
d)
correlacionar cada entrada de genotipo con un patrón de mutación similar con un fenotipo en una base de datos de fenotipo, y,
e)
calcular el número de veces de la resistencia virtual de dicho virus a partir de todos los fenotipos de la base de datos identificados.
2. Un método diagnóstico para evaluar la efectividad de una terapia de un paciente que comprende:
a)
proporcionar una muestra biológica de un paciente,
b)
obtener una secuencia genética de un virus de la inmunodeficiencia humana en dicha muestra biológica,
c)
identificar al menos un patrón de mutación en dicha secuencia genética donde dicha secuencia genética comprende al menos una mutación, donde al menos dicha mutación está asociada con la resistencia a al menos una terapia que está actualmente siendo administrada al paciente,
d)
buscar una base de datos de genotipo para entradas de genotipos con un patrón de mutación similar a al menos un patrón de mutación identificado en la secuencia genética en c)
e)
correlacionar dichas entradas de genotipo con un patrón de mutación similar con un fenotipo en una base de datos de fenotipos,
f)
calcular el número de veces de la resistencia virtual de dicho virus a partir de todos los fenotipos de la base de datos identificados.
g)
obtener una serie de fenotipos repitiendo los pasos b) hasta e) para cada terapia que está siendo actualmente administrada al paciente,
h)
evaluar la efectividad de la terapia del paciente a partir de series de fenotipos.
3. Un método diagnóstico para optimizar la terapia para un paciente, que comprende:
a)
proporcionar una muestra biológica de un paciente
b)
obtener una secuencia genética de un virus de inmunodeficiencia humana en dicha muestra biológica,
c)
identificar al menos un patrón de mutación en dicha secuencia genética donde dicha secuencia genética comprende al menos una mutación, y donde dicha al menos una mutación o patrón de mutación está asociado con la resistencia a al menos una terapia,
d)
buscar una base de datos de genotipo para entradas de genotipos con un patrón de mutación similar a al menos un patrón de mutación identificado en la secuencia genética en c)
e)
correlacionar dicha entrada de genotipo con un patrón de mutación similar con un fenotipo en una base de datos de fenotipo,
f)
calcular el número de veces de la resistencia virtual de dicho virus a partir de todos los fenotipos de la base de datos identificados.
g)
obtener una serie de fenotipos repitiendo los pasos b) hasta e) para un grupo de terapias, y,
i)
optimizar la terapia para el paciente a partir de las series de fenotipos.
\newpage
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4. Un método diagnóstico para predecir la resistencia de un virus de inmunodeficiencia humana a la terapia que comprende:
a)
proporcionar una muestra biológica a partir de un paciente, que contiene un virus de inmunodeficiencia humana,
b)
obtener una secuencia genética a partir de dicho virus,
c)
identificar al menos un patrón de mutación en dicha secuencia genética donde dicha secuencia genética comprende al menos una mutación, y donde al menos dicha mutación o patrón de mutación está asociada con la resistencia a al menos una terapia
d)
buscar una base de datos de genotipos para entradas de genotipos con un patrón de mutación similar a al menos un patrón de mutación identificado en la secuencia genética en c)
e)
correlacionar dichas entradas de genotipos con un patrón de mutación similar con fenotipo en una base de datos de fenotipos,
f)
obtener una serie de fenotipos repitiendo los pasos b) hasta e) para un grupo de terapias, y,
g)
predecir la resistencia del paciente a la terapia a partir de series de fenotipos.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde dicho virus es obtenido a partir de una muestra biológica seleccionada de una muestra de sangre, una muestra de biopsia, una muestra plasmática, una muestra de saliva, una muestra de tejido, y una muestra de mucosa o de fluido corporal.
6. El método de la reivindicación 5, donde la secuencia genética de HIV comprende la secuencia genética de la región de la proteasa del genoma de HIV y/o secuencia genética de la región de la transcriptasa reversa del genoma de HIV.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el patrón de mutación comprende al menos dos mutaciones conocidas o sospechosas para estar asociadas con la resistencia a al menos una terapia.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el patrón de mutación similar es identificado por alineamiento de la secuencia genética de una célula o un patógeno en la muestra biológica con la secuencia genética WT de dicha célula o patógeno.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la búsqueda de agrupamientos es usada para determinar patrones de mutación similares.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde una base de datos que relaciona genotipo/fenotipo es usada para correlacionar las al menos dos entradas de genotipo con un patrón de mutación similar con un fenotipo en dicha base de datos.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el fenotipo de dicha muestra biológica es (expresado como) un cambio del número de veces promedio en la resistencia hacia al menos una terapia, donde dicho número de veces de la resistencia media es calculada a partir del fenotipo de la base de datos de al menos una entrada de genotipo con un patrón de mutación similar.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el fenotipo de la célula o patógeno en la muestra biológica es expresado como una IC_{50}.
13. Un método de generar un reporte, donde dicho reporte comprende el fenotipo determinado(predicho) usando cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Un método de determinar un fenotipo virtual de un virus de inmunodeficiencia humana que comprende:
a)
obtener una secuencia genética de dicho virus
b)
identificar al menos una mutación en dicha secuencia genética donde dicha mutación está comprendida dentro de al menos un patrón de mutación,
c)
buscar una base de datos de genotipos para entradas de genotipos similares que comprende dicha mutación en dicho al menos un patrón de mutación
d)
correlacionar dichas entradas de genotipos con un fenotipo en una base de datos de fenotipos, y,
e)
calcular el número de veces de la resistencia virtual de dicho virus a partir de todos los fenotipos de las bases de datos identificados.
\global\parskip1.000000\baselineskip
15. Un método de acuerdo a la reivindicación 14 donde dicho patrón de mutación está asociado con la resistencia a una terapia.
16. Un método de acuerdo a la reivindicación 14 ó 15 donde dicho patrón de mutación comprende al menos dos mutaciones unidas con un operador lógico.
17. Un método de acuerdo a las reivindicaciones 14-16, donde al menos dos patrones de mutación están asociados con la resistencia a una terapia.
18. Un método de acuerdo a la reivindicación 17 donde dichos patrones de mutación están unido con un operador lógico definiendo un perfil de terapia.
19. Un método de acuerdo a la reivindicación 18, donde dicho perfil de terapia es representado por una secuencia.
20. Un método de acuerdo a la reivindicación 19, donde dicha secuencia es representada por una serie de 1 y/o 0.
21. Un método de acuerdo a la reivindicación 20 donde 1 representa la presencia de un patrón de mutación en el perfil de terapia y 0 la ausencia de un patrón de mutación en el perfil de terapia.
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