MXPA00012843A

MXPA00012843A - Medios y metodo para verificar la terapia antirretroviral con un inhibidor nucleosico de la transcriptasa inversa y guia de decisiones terapeuticas en el tratamiento del vih/sida.

Info

Publication number: MXPA00012843A
Application number: MXPA00012843A
Authority: MX
Inventors: Jeanette Whitcomb
Original assignee: Virologic Inc
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 2002-04-24
Also published as: CN1332804A; AU769927B2; JP2003503004A; EP1015642A1; CN1154747C; BR9912209A; WO1999067427A1; EP1015642A4; WO1999067427A9; CA2341679A1; NZ508981A; AU4961199A

Abstract

La invencion se relaciona con pruebas de resistencia y susceptibilidad a farmacos antivirales a ser utilizadas en la identificacion de regimenes con farmacos efectivos para el tratamiento de la infeccion por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y el sindrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y se relaciona ademas con los medios y metodos de verificacion del progreso clinico de la infeccion por VIH y su respuesta a la terapia antirretroviral, particularmente la terapia con inhibidor de la transcriptasa inversa utilizando ensayos de susceptibilidad fenotipica ensayos genotipicos.

Description

MEDIOS Y MÉTODOS PARA VERIFICAR LA TERAPIA A TIRRETROVIRAL CON UN INHIBIDOR NUCLEOSIDICO DE LA TRANSCRIPTASA INVERSA Y GUIA DE DECISIONES TERAPÉUTICAS EN EL TRATAMIENTO DEL VIH/SIDA CAMPO TÉCNICO Esta invención se relaciona con la susceptibilidad a fármacos antirretrovirales y pruebas de resistencia a ser utilizadas en la identificación de regímenes de fármacos efectivos para el tratamiento de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) . La invención se relaciona además con los medios y métodos para verificar el progreso clínico de la infección por VIH y su respuesta a la terapia antirretroviral utilizando ensayos de susceptibilidad fenotípica o genotípica. La invención también se relaciona con vectores, células huésped y composiciones novedosas para llevar a cabo pruebas de susceptibilidad fenotípica. La invención se relaciona además con el uso de varias metodologías genotípicas para identificar pacientes cuya infección se ha vuelto resistente a un régimen de fármaco antirretroviral particular. Esta invención también se relaciona con la separación de fármacos antirretrovirales candidatos por su capacidad para inhibir virus, secuencias virales seleccionadas y/o proteínas virales. De manera más particular, esta invención se relaciona con la determinación de la resistencia del inhibidor nucleosídico de la transcriptasa inversa utilizando pruebas de susceptibilidad fenotípica y/o pruebas genotípicas.

Antecedentes de la Invención La infección por VIH se caracteriza por altas tazas de recambio viral a través del proceso de la enfermedad, conduciendo eventualmente al agotamiento de CD4 y progreso de la enfermedad. Wei X, Ghosh SK, Taylor ME, et al. (1995) Na ture 343, 117-122 y Ho DD, Naumann, AU, Parelson, AS, et al. (1995) Na ture 33, 123-126. El propósito principal de la terapia antirretroviral es lograr una supresión sustancial y prolongada de la reproducción viral. Lograr un control viral sostenido probablemente implica el uso de terapias secuenciales, cada terapia comprendiendo generalmente combinaciones de tres o más fármacos antirretrovirales. La elección de la terapia inicial y subsecuente deberá, por lo tanto, hacerse sobre una base racional, con el conocimiento de los patrones de resistencia y resistencia cruzada siendo vital parea guiar aquellas decisiones. El razonamiento principal de la terapia combinada se relaciona con la actividad sinérgica o aditiva para lograr una mayor inhibición de la reproducción viral. La tolerancia de los regímenes de fármaco seguirá siendo crítica, sin embargo, en tanto la terapia necesite ser mantenida durante muchos años. 5 En un paciente sin tratar, se reproducen algo así como 1010 nuevas partículas virales por día. Acoplado con la falla de la transcriptasa inversa (RT) del VIH para corregir los errores de transcripción por corrección exonucleolítica, este alto nivel de recambio viral da 10 como resultado 104 a 105 mutaciones por día en cada posición en el genoma del VIH. El resultado es el rápido establecimiento de una variación genotípica extensa. Aunque algunas posiciones patrón o sustituciones de pares de bases pueden ser más propensas a errores (Mansky LM, 15 Temin HM (1995) J Virol 69, 5087-5094) (Scjinazi RF, Lloyd RM, Remanathan CS, et al. (1994) Antimicrob Agents g^ Chemother 38, 268-274), el modelo matemático sugiere que, en cada punto único posible, la mutación puede ocurrir hasta 10,000 veces por día en individuos infectados. 20 Para que ocurra la resistencia al fármaco antirretroviral, la enzima objetivo debe ser modificada preservando a la vez su función en presencia del inhibidor. Las mutaciones puntuales que conducen a la sustitución de un aminoácido pueden dar como resultado un 25 cambio en la forma, tamaño o carga del sitio activo, sitio de unión del sustrato o regiones circundantes de la enzima. Los mutantes resistentes a agentes antirretrovirales han sido detectados a bajos niveles antes del inicio de la terapia. (Mohri H, Singh MK, Ching WTW, et al. (1993) Proc Nati Acad Sci EUA 90, 25-29) (Nájera I, Richman DD, Olivares I, et al. (1994) AIDS Res Hum Retroviruses 10, 1479-1488) (Nájera I, Holguin A, Quiñones-Mateu E, et al. (1995) J Virol 69, 23-31) . Sin embargo, esas cepas mutantes representan solo una pequeña proporción de la carga viral total y pueden tener una reproducción o desventaja competitiva comparada con los virus naturales. (Coffin JM (1995) Science 261, 483-489) . La presión selectiva de la terapia antirretroviral proporciona a esos mutantes resistentes a fármacos una ventaja competitiva y de este modo pasan a representar las cuasiespecies dominantes (Frost SDW, McLean AR (1994) AIDS 8, 323-332) (Reliman P, Boucher CAB, Tíjnagal JMGH (1994) J Gen Virol 75, 341-351) conduciendo finalmente a la resistencia al fármaco y la falla vírológica en el paciente.

Inhibidores N cleosidicos de la Transcriptasa Inversa Siete inhibidores nucleosídicos análogos de la transcriptasa inversa del VIH (zidovudina (ZVD: Retrovir, Glaxo Wellcome, Uxbridge, UK) , zalcitabina (ddC: HIVID, Hoffman-LaRoche, Basle, Suiza), didanosina (ddl: Videx, Bristol-Myers Squibb, Syracuse, NY, EUA) , estavudina (d4T: Zerit, Bristol-Myers Squibb, Syracuse, NY, EUA), y lamivudina (3TC, Epivir) , abacavir (ABC, Ziagen, Glaxo Wellcome), y adefovir (ADV, Preveon, Gilead Sciences) poseen actualmente licencia en Europa y EUA. Adicionalmente, tres NNRTI, nevirapina (Viramune, Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Alemania) y delavirdina (Rescriptor, Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI, EUA) y efavirenz (EPV) tienen licencia en EUA. Todos esos agentes han demostrado al menos actividad antiviral a corto plazo, y, por lo tanto, no es sorprendente que, debido a que ejercen una presión selectiva sobre el VIH, surjan mutantes resistentes al fármaco durante la terapia. Aunque esos fármacos son normalmente utilizados en regímenes combinados, muchos de los datos de resistencia disponibles surgen de estudios de monoterapia en fase I/II. Las mutaciones observadas durante la monoterapia pueden no reflejar exactamente las mutaciones responsables de la resistencia que se desarrollan en presencia de la presión de varios agentes que actúan en el mismo sitio y, en consecuencia, en el mismo gen.

Mutaciones Novedosas Aunque los patrones de mutaciones genotípicas asociadas con cambios en la resistencia fenotípica a los inhibidores de la transcriptasa inversa líderes (RTI) se establecieron de trabajo in vi tro e in vivo, ocasionalmente pueden surgir otras mutaciones de resistencia, raramente reportadas, durante estudios clínicos. Han sido identificados aislados con un patrón único de sustituciones de aminoácido en los codones 62, 75, 77, 116 y 151 en pacientes que reciben terapia combinada prolongada con ZDV más ddl o ddC: esos aislados son resistentes a ambos fármacos y existe resistencia cruzada a la estavudina y resistencia cruzada parcial al 3TC. No ha sido asociado cambio genotípico consistente con la resistencia genotípica al d4T o en realidad, la pérdida del efecto virológico de este compuesto.

Mutaciones a Inhibidores Nucleosídicos de RT Análoga Zidovudina Las variantes del VIH con menor susceptibilidad a la ZDV fueron reportadas por primera vez en 1989; en algunos aislados, se requirieron incrementos mayores de 100 veces en la concentración de ZDV para inhibir la reproducción viral en un 50% (Larder BA, Darby G. Richman DD (1989) Science 243, 1731-1734) . El fenotipo resistente a la ZDV parece ser razonablemente estable in vivo, con el virus resistente siendo algunas veces detectado hasta un año después del cese de la terapia, (Boucher CA, O' Sullivan E, Mulder JW et al. (1992) J Infect Disease 165, 105-110) y a pesar del tratamiento con didanosina (Smith MS, Koerber KL, Pagano JS, (1994) J Infecí Disease 169, 184-188) . El secuenciamiento nucleotídico de la RT del VIH ha revelado un número de mutaciones las cuales pueden influenciar la sensibilidad viral a la ZDV y que pueden utilizarse como marcadores genotípicos para la presencia de resistencia a la ZDV (Kellam P, Boucher CAB, Tijnagal JMGH et al. (1994) J Gen Virol 75, 341-351) (Boucher CAB, Ters ette M, Lange JMA, et al. (1990) Lancet 336, 585-590) (Lopez-Galindez C. Rojas JM, Najera R, et al. (1991) PNAS 88, 4280-4284) . Una gama de mutantes con niveles crecientes de resistencia aparecen en una forma ordenada, con la aparición secuencial de esas mutaciones estando asociadas con reducciones crecientes en la sensibilidad viral a la ZDV (id) (Larder BA, Kellman P, Kemp SD, (1991) AIDS 5, 137-144) . Una sustitución en el codón 70 (Arg70-Lys) puede ser transitoriamente dominante y parece ser crítica para la falla virológica durante la monoterapia con ZDV (DeJong MD, Veenstra J, Stilianakis NI, et al. (1996) PNAS 93, 9501-9506). La terapia continua con ZDV selecciona una mutación adicional en el codón 215, la cual parece ser una variante más estable, han sido descritas ambas sustituciones Thr215-Tyr y Thr215-Phe y pueden coexistir (Mayers DL, McCutchan FE, Sanders-Buell EE, et al. (1992) Acq Imm Def Synd 5, 749- 759) . Por lo tanto pueden aparecer virus con mutaciones adicionales, más comúnmente una sustitución en el codón 41 (Met41-Leu) , seguida por mutaciones adicionales en los codones 67, (Asp67-Asn) y 219 (Lys219-Gln) o la reaparición de la mutación del codón 70 ( id) . Las técnicas de mutagénesis dirigido al sitio han sido utilizadas para evaluar las interacciones resultantes de las diferentes mutaciones (id) . Esas demostrado que la resistencia de alto nivel a la ZDV (CI50 > 1 µM) está asociada típicamente con la presencia de mutaciones múltiples. Aunque frecuentemente sinérgicas, las mutaciones también pueden ser antagónicas. Por ejemplo, se ha notado que una mutación en el codón 74 (Leu74-Val) observada durante la terapia con ddl o ddC es antagónica a la mutación 215 de la ZDV in vi tro, reduciendo el grado de resistencia a la ZDV (St Clair MgH2/ Martin JL, Tudor-Williams G, et al. (1991) Science 253, 1557-1559) . También ha sido reportado el antagonismo de la mutación 215 in vi tro por la mutación del codón 181 seleccionada por la mayoría de los NRRTI y la mutación en el codón 184 observada con la lamivudina y, menos frecuentemente ddC y ddl (Larder BA, (1992) Antimicrob Agents Chemother 36, 2664-2669) (Boucher Cammack N, Schipper P, et al. (1993) Antimicrob Agents Chemother 37, 2231-2234) (Tisdale M, Kemp SD, Parry NR et al. (1993) PNAS 90, 5653-5656) (Larder BA, Kemp SD, Harrigan PR (1995) Science 269, 696-699) (Zhang D, Caliendo AM, Eron JJ, et al. (1994) An timicrob Agen ts Chemother 38, 282-287) . Sin embargo, pueden observarse patrones de mutación novedosos o mutaciones "compensatorias" adicionales in vivo durante la terapia combinada facilitando la resistencia dual o a fármacos múltiples (véase más adelante) . Las cepas virales resistentes a la ZDV exhiben resistencia cruzada a otros análogos nucleosídicos que contienen el grupo 3' -azido tal como la 3' -azido-2' , 3' -didesoxiuridina (AZU) (Rooke R, Parniak MA, Tremblay M, et al. (1991) An timicrob Agents Chermother 35, 988-991) . La resistencia cruzada a la estavudina, un análogo basado en la timidina que carece de la porción 3' -azido, también ha sido reportada por un grupo tanto en una cepa de laboratorio de VIH como en uno de 11 aislados clínicos (ibid) . La mayoría de los investigadores no han encontrado evidencias de que las mutaciones seleccionadas durante la monoterapia con ZDV tengan influencia sobre la sensibilidad a ddl, ddC o 3TC (Rooke R, Tremblay M, Soudeyns H, et al. (1989) AIDS 3, 411-415) (id) (Larder BA, Chesebro B, Richman DD (1990) An timicrob Agen ts Chemother 34, 436-441) (id) (Dimitrov DH, Hollinger FB, Baker CJ, et al. (1993) J Infect Disease 167, 818-823) . Sin embargo, la resistencia a la ddl ha sido raramente reportada después de una terapia prolongada con ZDV (id) (Japour AJ, Chatis PA, Eigenrauch HA, et al. (1991) PNAS 88, 3092-3096) , y un reporte sugerido, por cada disminución de 10 veces en la sensibilidad a la ZDV en aislados clínicos, existe una reducción de 2.2 veces correspondiente en la susceptibilidad a la ddl y una disminución de 2 veces en la sensibilizada a la ddC (Mayers DL, Japour AJ, Arduino JM, et al. (1994) Antimicrob Agen ts Chemother 38, 307-314) . Además, los pacientes con resistencia a la ZDV en estado basal es significativamente menos probable que logren una respuesta de AR? después de la adición de ddC o ddl que aquéllos con virus natural en el estado basal (Holodniy M, Katzenstein D. Mole L, et al. (1996) J Infect Disease 174, 854-857) .

Zalcitabina y Didanosina La resistencia a la ddl es mediada a través de una mutación Leu74?Val la cual produce una reducción de seis veces a 26 veces en la sensibilidad, pero puede restablecer parcialmente la susceptibilidad a la ZDV in vi tro por el antagonismo de la mutación del codón 215.

Esta mutación también reduce la sensibilidad a la ddC alrededor de 10 veces (id) . Se ha reportado que la frecuencia del codón 74 se ha incrementado de cero al inicio de la terapia hasta el 56% a la semana 24 en un grupo de 64 personas con un conteo de células CD4 basal promedio de 129/mm quienes cambiaron a ddl habiendo recibido previamente ZDV (Kozal MJ, Kroodsma K, Winters MA, et al. (1994) Annals Intren Med 121, 263-268) . De manera similar, en una población mezclada de pacientes candidos con tratamiento y que^ experimentaron ZDV con conteos de células CD4 de 200-50/mm que recibieron monoterapia con ddl en el estudio con ACTG 143, 17 de los 26 aislados tuvieron mutaciones en el codón 74 en un año. El codón mutante 74 surgió en solo dos de los 55 pacientes en este estudio que recibieron la terapia combinada con ZDV/ddl (Shafer RW, Iversen AKN, Winters MA, et al. (1995) Infec Disease 172, 70-78). El virus con una mutación en el codón 65 (Lys65?Arg) ha sido aislado de varios paciente que recibieron tratamiento a largo plazo con ddl o con ddC. Este está asociado con un incremento de tres veces a cinco veces en la CI50 de la ddl con una reducción de cinco veces a diez veces en la sensibilidad a la ddC y una reducción de veinte veces en la susceptibilidad a 3TC 3TC (id) (Gu Z, Gao Q, Fang H, et al. (1994) Antimicrob Agen ts Chemother 38, 275-281) . Una mutación en el codón 69 (Thr69?Asp) , que conduce a una reducción de cinco veces en la sensibilidad a la ddC pero no parece resultar en una resistencia cruzada a otros análogos nucleosídicos, es la mutación más frecuente seleccionada por la ddl in vivo (id) (Fitzgibbon JE, Ho ell RM, Haberzettl CA, et al. (1992) Antimicrob Agents Chemother 36, 153-157) . El desarrollo de resistencia a la ddC ha sido recientemente revisada en otra parte (Craig C, Moyle G (1997) AIDS 11, 271-279) .

Terapia Combinada - Zidovudina + Zalcitavina o Didanosina La terapia combinada con ZDV/ddC o ZDV/ddl puede tener influencia sobre la tasa de emergencia de resistencia y puede suprimir alguna de las mutaciones observadas durante la monoterapia pero puede dar como resultado la aparición de patrones de mutación novedosos (y en consecuencia mayor posibilidad comprometida) . Pueden emerger patrones de mutación novedosos durante la terapia combinada. Han sido identificados ocasionalmente aislados con un patrón único de sustituciones de aminoácidos en los codones 62, 75, 77, 116, y 151 en pacientes que recibieron una terapia combinada prolongada con ZDV más ddl o ZDV/ddC alternadas: esos son resistentes a ambos fármacos (id) (Shafer RÑ, Kozal MJ, Winters MA, et al. (1994) J Infect Disease 169, 722-729) (Shirasaka T, Kavlick MF, Ueno T, et al. (1995) PNAS 92, 2398-2402) y confieren resistencia cruzada a la estavudina y resistencia cruzada parcial a 3TC. La frecuencia en personas tratadas durante >1 año con ZDV. ddU fluctúa de 0 a >10% (ibid) . Pueden agregarse fácilmente mutaciones seleccionadas por 3TC (184Val) y nevirapina (181Cys) a este antecedente in vi tro (Shafer RW, Winters MA, Iversen, AKN, et al. (1996) An timicrob Agents Chemother 40, 2887-2890) y 184 Val y 103Asp (para la resistencia a la lovirida) siendo reportada in vivo (Schmidt JC, Cogniaux J, Hermans P, et al. (1996) J Infect Disease 174, 962-968) . Aunque esas mutaciones del virus parecen competir con la reproducción en presencia del fármaco, la probable razón de que esas mutaciones novedosas no se observen durante la monoterapia probablemente se relaciona con su falla para competir con aquellos mutantes que se vuelven dominantes.

La ivudina La resistencia a 3TC ocurre rápidamente in vivo con una sustitución en el codón 184 (más comúnmente Metl84?Val) (id) (Kuritzkes DR, Quinn JB, Benoit SL, et al. (1996) AIDS 10, 975-981) (Barlett JA, Benoit SL, Johnson VA, et al. (1996) Annal Intern Med 125, 161-172) (Eron JJ, Benoit SL, Jemsek J, et al. (1995) NEJM 333, 1662-1669) (Katlama C, Ingrand D, Loveday C, et al. (1996) JAMA 276, 118-125) (Staszewski S, Loveday C, Picazzo JJ, et al. (1996) JAMA 276, 111-117) siendo observada tanto durante la monoterapia como la terapia combinada y su aparición se asocia temporalmente con al menos una falla virológica parcial (id) (Moyle GJ (1996) Drugs 52, 168-185) (Goulden MG, Ca mack N, Hopewell PL, et al. (1996) AIDS 10, 101-102) . Esta mutación conduce a una resistencia de alto nivel a 3TC (un incremento de 500 veces a 1000 veces en la CI5o) , así como alguna resistencia cruzada tanto a la ddl como a la ddC (reducciones de cuatro veces a ocho veces en la susceptibilidad) (id) (Gu Z, Gao Q, Li X, et al. (1992) J Virol 66, 7128-7135) . In vi tro esta mutación puede antagonízar a la ZDV (id) (id) (id) , aunque se ha reportado una resistencia doble a la ZDV/3TC tanto in vitro como en aislados clínicos (id) . Pueden requerirse otras mutaciones, posiblemente compensatorias, tales como en el codón 135 o el 333 para la doble resistencia a la ZDV/3TC; un aspecto que actualmente está bajo investigación (id) . Cuando se agregó 3TC a pacientes pretratados con ZDV en el NUCA3002 de estudio, se desarrolló la resistencia fenotípica a la 3TC en el 82% de los 33 pacientes a la semana 12. De los 10 pacientes con resistencia a la ZDV en la línea basal (de acuerdo a lo definido por una CIso > 0.2 mM) que desarrollaron resistencia a la 3TC, cuatro tuvieron aislados que fueron más sensibles a la ZDV mientras que seis pacientes tuvieron doble resistencia a la ZDV/3TC sugiriendo que la resensibilización viral a la ZDV no es universal in vivo .

Estavudina La selección in vi tro del VIH resistencia a d4T confirmada por mutagénesis dirigida al sitio, ha identificado una mutación en el codón 75 (Val75?Thr) la cual confiere un incremento de siete veces en la CI5o, así como una susceptibilidad reducida tanto a la ddl como a la ddC (Lacey SF, Larder BA (1994) An timicrob Agen t Chemother 38, 1428-1432) . Una mutación en el codón 50 conduce . a una reducción de 30 veces en la sensibilidad a d4T, pero que no parece conferir resistencia cruzada a otros análogos nucleosídicos también ha sido observada in vi tro (Gu Z, Gao Q, Fank H, et al. (1994) Leukemia 8, Suppl. 1, 166-169). In vivo, sin embargo, ha sido reportada una gama de cambios de aminoácido, incluyendo la mutación en el codón 75 pero no la sustitución del codón 50. La disminución máxima en la sensibilidad a d4T observada en 13 pacientes candidos a la ZDV después de 18 a 22 meses fue de 12 veces. Sin embargo, cinco paciente desarrollaron reducciones de nueve veces a 176 veces en la sensibilidad a la ZDV y tres sujetos desarrollaron disminuciones de siete veces a 29 veces en la susceptibilidad a la ddl (Lin PF, Samanta H, Rose RE, et al. (1994) J Infect Disease 170, 1157-1164), sugiriendo que el uso de d4T puede limitar las opciones terapéuticas subsecuentes en algunos pacientes. No se ha establecido un patrón de mutación consistente para la resistencia de d4T, hasta ahora.

Abacavir La selección in vivo de cepas de VIH resistentes al abacavir, confirmada por mutagénesis dirigida al sitio ha mostrado que las mutaciones individuales producen solo resistencia de bajo nivel al abacavir. Se requieren mutaciones múltiples (al menos tres) para producir una resistencia de 10 veces. La M184V es la mutación de resistencia más común seleccionada in vi tro en presencia de abacavir y da como resultado una disminución de 2-5 veces en la susceptibilidad. Además se demostró que las mutaciones en L74V y F115Y contribuyen a la pérdida de susceptibilidad al abacavir (Tisdale M, Alnadaf T, Cousens D (1997) Antimicrob Agent Chemother 41, 1094-1098). Se observaron resistencias cruzadas a la ddC y ddl pero no a la d4T o ZDV. La resistencia en el VIH derivado de poblaciones de virus de pacientes ha sido atribuida a mutaciones previamente asociadas con la resistencia a NRTI. Una combinación de mutaciones de resistencias a la ZDV (M41L, L210W, T215Y) más una mutación de resistencia a 3TC (M184V) mostró una reducción de ocho veces en la susceptibilidad al abacavir. El complejo multinucleosídico de resistencia (A62V, V75I, F77L, Y116F y Q151M) fue asociado con una reducción de 17 veces en la susceptibilidad (Lanier R, Daneho er S, Daluge S, et al. (1998) 2nd International Workshop on HIV Drug Resistence and Treatment Strategies) .

Adefo i Una selección in vi tro en presencia de adefovir dio como resultado una mutación K65R o K70E la cual parece conferir una reducción de 16 ó 9 veces en la susceptibilidad al adefovir. Estudios en pacientes han reportado la aparición de la mutación K70E pero no la mutación K65R. Muchos virus resistentes a la AZT, resistentes a la 3TC y resistencia a múltiples fármacos permanecen insensibles al adefovir (Mulato AS, La y PD, Miller MD et al. (1998) Antimicrob Agent Chemother 42, 1620 - 1628) .

Significado Clínico de la Resistencia La elección de la terapia inicial y posterior para la infección por VIH no deberá estar comprometida en términos de actividad sino que también debe dañarse y basarse en el conocimiento racional de los patrones de resistencia y resistencia cruzada para mantener una amplia base de opciones de terapia futuras. Un objeto de esta invención es proporcionar una prueba de susceptibilidad y resistencia a fármacos capaz de mostrar si una población viral en un paciente es resistente a un fármaco prescrito dado. Otro objeto de esta invención es proporcionar una prueba que permitirá al médico sustituir uno o más fármacos en un régimen terapéutico para un paciente que se ha vuelto resistente a un fármaco o fármacos dados después del curso de una terapia. Otro objeto más de esta invención es proporcionar una prueba que permitirá la selección de un régimen de fármaco efectivo para el tratamiento de infecciones por VIH y/o SIDA. Otro objeto de la invención es proporcionar los medios para identificar los fármacos a los cuales un paciente se ha vuelto resistente, en particular identificar la resistencia a inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa. Otro objeto más de esta invención es proporcionar una prueba y métodos para evaluar la efectividad biológica de compuestos farmacéuticas candidatos que actúen sobre el virus, genes virales y/o proteínas virales especificas, particularmente con respecto a la resistencia viral la fármaco asociados con inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa. También es un objeto de esta invención proporcionar los medios y composiciones para evaluar la resistencia y susceptibilidad antirretroviral del VIH al fármaco. Este y otros objetos de esta invención serán evidentes a partir de la especificación como un todo.

Breve descripción de la Invención La presente invención se relaciona con un método para verificar, utilizando métodos fenotípicos y genotípicos, el progreso clínico de la infección por virus de la inmunodeficiencia humana y sus respuesta a la terapia antiviral. La invención también se basa, en parte, en el descubrimiento de que cambios genéticos en la transcriptasa inversa (RT) del VIH que confiere resistencia a la terapia antirretroviral pueden ser determinados rápidamente de manera directa del ARN del VIH del plasma del paciente utilizando métodos fenotípicos o genotípicos. Los métodos utilizan ensayos basados en amplificación del ácido nucleico, tales como la reacción en cadena de la polimerasa. Aquí, posteriormente, tales ensayos basados en la amplificación del ácido nucleico serán referidos como ensayos basados en la PCR. De manera alternativa, los métodos que evalúan el ácido nucleico viral o proteína viral en ausencia de un paso de amplificación podrían utilizar las enseñanzas de esta invención para verificar y/o modificar la terapia antirretroviral. Esta invención se basa en parte en el descubrimiento de una mutación/inserción en el cordón 69 ya sea sola o en combinación con el codón 41 y en 215 de la transcriptasa inversa del VIH en pacientes tratados con inhibidor nucleosídico de la transcriptasa inversa (NRTI) con los cuales la presencia de las mutaciones se correlacionan con una disminución en la susceptibilidad a d4T, y una disminución en la susceptibilidad a la AZT, ddC, ddl, 3TC y abacavir. Las mutaciones se encontraron en ARN de VIH en plasma después de un periodo de tiempo después del inicio de la terapia. Se encontró que el desarrollo de la mutación/inserción en el codón 69 además de la mutación en el codón 41 y 215 de la RT del VIH era un indicador del desarrollo de resistencia y finalmente de declinación inmunológica. De manera más específica, la mutación/inserción en el codón 69 en la RT (T69SSA, T69SSG, T69SSS) también puede ser asociada con mutaciones asociadas a la resistencia de AZT (por ejemplo, M41L, L210W, T215Y) y 3TC (M184V) o ddl/ddC (L74V) que se correlacionan con una disminución en la susceptibilidad a NRTI, incluyendo una disminución en la susceptibilidad a d4T y una disminución a la susceptibilidad a la AZT, ddC, ddl, 3TC y abacavir. Se encontró que la mutación/inserción en el codón 69 en la RT (T69SSA, T69SSG, T69SSS) puede ser asociada con mutaciones asociadas con resistencia a múltiples NRTI en el codón 62 (por ejemplo A62V) y/o mutaciones novedosas en el codón 75 (por ejemplo V75M) . Se observó por primera vez que la mutación/inserción en el codón 69 (T69SSG) y la mutación en el codón 75 (V75M) estaba asociada con una disminución en la susceptibilidad a d4T (tres veces) y una disminución sustancial en la susceptibilidad a la AZT (treinta veces) . Esta invención se basó en parte en el descubrimiento de mutaciones asociadas con resistencia a múltiples NRTI en los codones 62, 75, 77, 116, y 151 de la RT que se descubrió ocurren en pacientes tratados con inhibidor nucleosídico de la transcriptasa reversible (NRTI) ' en los cuales la presencia de la mutación se correlaciona con una disminución de susceptibilidad a d4T, ddC, ddl y AZT. También se ha descubierto que ocasiones especialmente asociadas con resistencia a: AZT en los codones 41, 67, 210, 215 y 219 (por ejemplo M41L, D67N, L210W, T215Y, K219Q) ; 3TC en el codón 184 (M184V) ; ddC en el codón 69 (T69D) ; o una mutación novedosa en el codón 215 (T215V) pueden acompañar las mutaciones asociadas con resistencia a múltiples NRTI en los codones 62, 75, 77, 116 ó 151, las cuales se correlacionan con una disminución a la susceptibilidad a d4T, ddC, ddl y AZT. Esta invención se basó en parte en el descubrimiento de 4 o más mutaciones asociadas con resistencia a la AZT seleccionadas del grupo que consiste de los codones 41,67,70,210,215 y/o 219 (por ejemplo M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F, K219Q) ya sea solas o en combinación con una mutación del codón 74 (asociadas con resistencia a la ddI-V74I) , 69 (asociada con resistencia a la ddC-T69D) , 75 (V75M, V75S) y/o 219 (K219N) de la transcriptasa inversa del VIH en pacientes tratados con inhibidor nucleosídico de la transcriptasa inversa en las cuales la presencia de las mutaciones se correlaciona con una disminución en la susceptibilidad a d4T. Las mutaciones fueron encontradas en ARN de VIH en plasma después de un periodo de tiempo después del inicio de la terapia con NRTI. Se observó a través de la construcción, por mutagénesis dirigida al sitio, de vectores de prueba de resistencia que contienen la mutación en un solo sitio en el codón 175 (V75I) no alteraron la susceptibilidad a d4T pero incrementaron la susceptibilidad a la AZT. También se observó utilizando la mutagénesis dirigida al sitio que la mutación en un solo sitio en el codón 151 (Q151M) redujo la susceptibilidad a la d4T y AZT. Aún una observación adicional de la presente invención fue que la mutación en un doble sitio en los codones 75 y 151 (V75I + Q151M) redujo la susceptibilidad a la d4T y AZT. También se descubrió utilizando la mutagénesis dirigida el sitio que los vectores de prueba de resistencia que contienen cinco (ejemplo M41L, D67N, K70R, T215Y, K219Q) o seis (ejemplo M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y, K219Q) mutaciones asociadas con resistencia a la AZT mostraron susceptibilidad reducida a d4T y al AZT. También se observó que los vectores de prueba de resistencia que contienen mutaciones en un solo sitio en los codones 62, 69 y 75 (A62V, T69SSA, V75I, V75T) no redujeron la susceptibilidad a d4T. Sin embargo, se observó que la mutación en un solo sitio en el codón 75 (V75I) o (V75T) incrementó la susceptibilidad a la AZT ligeramente. La mutación en un solo sitio T69SSA redujo la susceptibilidad a la AZT ligeramente mientras que la mutación A62V no tuvo efecto sobre la susceptibilidad a la ATZ . En estudios adicionales aún utilizando la mutagénesis dirigida al sitio, se observó que los vectores de prueba de resistencia que contienen mutaciones en dos sitios en los codones 62 y 69 (por ejemplo A62V + T69SSA no redujeron la susceptibilidad a la d4T más que la mutación T69SSA sola, pero redujeron aún más la susceptibilidad a la AZT debido a la mutación T69SSA sola. Todavía en estudios adicionales utilizando mutagénesis dirigida al sitio, se observó que los vectores de prueba de resistencia que contienen mutaciones en dos sitios en los codones 62 y 75 (por ejemplo A62V + V75I) no tuvieron efectos sobre la susceptibilidad a la d4T. También se encontró que la mutación A62V no alteró la susceptibilidad reducida a la AZT causada por la mutación V75I. En estudios adicionales aún utilizando la mutagénesis dirigida al sitio se observó que la combinación de tres mutaciones en los codones 62, 69 y 75 (por ejemplo A62V + T69SSA + V75I) no reduce la susceptibilidad a la d4T más que la mutación T69SSA sola. También se observó en el caso de la combinación de tres mutaciones en los codones 62, 69 y 75 (por ejemplo A62V + T69SSA + V75I) que la mutación V75I suprimió completamente la susceptibilidad reducida a la AZT causada por la combinación de las mutaciones A62V y T69SSA. Todavía en estudios adicionales utilizando la mutagénesis dirigida al sitio, se observó que los vectores de prueba de resistencia que contiene tres mutaciones en los codones 41, 69 y 215, (por ejemplo M41L + T69SSA + T215Y) mostraron una disminución significativa en la susceptibilidad tanto a la d4T como a la AZT. En estudios adicionales aún utilizando la mutagénesis dirigida al sitio, se observó que una combinación de cuatro mutaciones en los codones 41, 62, 69 y 215 (por ejemplo M41L + A62V + T69SSA + T215Y) no redujo la susceptibilidad a la d4T más que la mutación T69SSA sola o el mutante doble T69SSA + A62V. También se observó en el caso de la combinación de cuatro mutaciones en los codones 41, 62, 69 y 215 (por ejemplo M41L + A62V + T69SSA + T215Y) que la combinación de las cuatro mutaciones redujo la susceptibilidad a la AZT más que la combinación de las mutaciones M41L y T215Y solas. En estudios adicionales más utilizando la mutagénesis dirigida al sitio, se observó que una combinación de cinco mutaciones en los codones 41, 62, 69, 184 y 215 (por ejemplo M41L + A62V + T69SSA + M184V + T215Y) no redujo la susceptibilidad a la d4T más que la mutación T69SSA sola o en doble mutante A62V + T69SSA. También se observó en el caso de la combinación de cinco mutaciones en los codones 41, 62, 69, 184 y 215 (por ejemplo M41L + A62V + T69SSA + M184V + T215Y) que la mutación M184V suprimió la susceptibilidad reducida a la AZT causada por la combinación de las mutaciones M41L, A62V, T69SSA y T215Y. En otro estudio más utilizando la mutagénesis dirigida al sitio la mutación T69SSA en una clona de virus de paciente fue revertido (T69SSA - SSA69T) . La reversión de la mutación T69SSA redujo la resistencia la d4T (es decir incrementó la susceptibilidad) y también redujo la resistencia a la AZT (es decir incrementó la susceptibilidad) . En estudios adicionales utilizando la mutagénesis dirigida al sitio, se observó que la introducción de la mutación L210W con mutaciones en 41, 69 y 215 (por ejemplo M41L + T69SSA + T215Y) como resultado dio una disminución sustancial en la susceptibilidad a la AZT en comparación con la disminución de 140 veces en la susceptibilidad observada para la AZT sin la mutación 210. En estudios adicionales utilizando la mutagénesis dirigida al sitio, se observó que cuatro mutaciones en los codones 41, 62, 69 y 215 (por ejemplo M41L + A62V + T69SSA + T215Y) mostraron una disminución sustancial en la susceptibilidad a la AZT (mayor de 1000 veces) y sólo una ligera disminución en la susceptibilidad a los otros NRTI. En otros estudios adicionales utilizando la mutagénesis dirigida al sitio, se observó que la introducción de la mutación L210W con cuatro mutaciones en los codones 41, 62, 69 y 215 (por ejemplo M41L + A62V + T69SSA + T215Y) tuvo poco efecto sobre la susceptibilidad a fármacos y mostró un perfil de resistencia similar al perfil obtenido para cuando únicamente estuvieron presentes las cuatro mutaciones. En estudios adicionales utilizando mutagénesis dirigida al sitio, se observó que la introducción de la mutación T215Y con mutaciones en 62 y 69 (por ejemplo A62V + T69SSA) dio como resultado una disminución sustancial en la susceptibilidad a la AZT (mayor de 1000 veces) comparada con la disminución de 7 veces en la susceptibilidad observada para la AZT sin mutación 215. Se observó también que la introducción de la mutación L74V con mutaciones en 62 y 69 (por ejemplo A62V + T69SSA) dio como resultado una desviación de regreso a la susceptibilidad natural para la AZT. En estudios adicionales utilizando la mutagénesis dirigida al sitio, se observó que la introducción de la mutación V75M con cuatro mutaciones en los codones 41, 69, 210 y 215 (por ejemplo M41L + T69SSA + L210W + T215Y) tuvo poco efecto sobre la susceptibilidad a fármacos y mostró un perfil de resistencia similar al perfil obtenido cuando únicamente estuvieron presentes las cuatro mutaciones. En una modalidad más de la invención, pueden ser utilizados los ensayos basados en la PCR, incluyendo los ensayos fenotípicos y genotípicos para detectar mutaciones en el codón 69 en combinación con mutaciones en otros codones, incluyendo el 41 y/o 215 de la RT del VIH las cuales se correlacionan con un patrón específico de resistencia a terapias antirretrovirales y declinación inmunológica subsecuente. De manera más especifica en otra modalidad más de la invención, pueden ser utilizados ensayos basados en la PCR, incluyendo ensayos fenotípicos y genotípicos para detectar mutaciones en el codón 69 (T69SSA, T68SSG, T69SSS) en combinación con mutaciones en otros codones incluyendo el 41 (M41L) , 210 (L210W) ; 215 (T215Y), 184 (M184V) y/o 74 (L74V) de la RT del VIH, las cuales se correlacionan, como se describió aquí, con un patrón específico de resistencia a terapia antirretrovirales y declinación inmunológica subsecuente. En otra modalidad más de la invención, pueden ser utilizados ensayos basados en la PCR, incluyendo ensayos fenotípicos y genotípicos para detectar mutaciones en los codones 62, 75, 77, 116 ó 151 solas o en combinación con mutaciones en otros codones, incluyendo 41, 67, 210, 215, 219, 184, 69 y/o 215 de la RT del VIH, las cuales se correlacionan, como se describió aquí, con resistencia a terapias antirretrovirales y declinación inmunológica. Los ejemplos de mutaciones de los codones mencionados anteriormente, incluyen, pero no se limitan a (A62V, V75I, F77L, F116Y, Q151M) , y (M41L, D67N, L210W, T215Y, K219Q, M184V/I, T69D, T215Y) . En otra modalidad más de la invención, pueden ser utilizados ensayos basados en la PCR, incluyendo ensayos fenotípicos o genotípicos para detectar cuatro o más mutaciones en la RT en codones en el grupo que consiste de 41, 67, 70, 210, 215 y/o 219 (por ejemplo M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F, K219Q) , ya sea solas o en combinación con una mutación en el codón 74 (V74I), 69 (T69D) , 75 (V75M, V75S) y/o 219 (K218N) de la RT del VIH que se correlacionan, como se describió aquí, con resistencia a la terapia antirretrovirales y declinación inmunológica. Una vez las mutaciones en el codón 69 solas o en combinación con la mutación en el codón 41 y 215 de la RT del VIH en un paciente sometido a terapia antirretroviral con NRTI, debe ser considerada una alteración en el régimen terapéutico. De manera similar, una vez que han sido detectadas mutaciones en el codón 69 y/o 41, 210, 215, 184 y/o 74 en un paciente sometido a cierta terapia antirretroviral con NRTI, debe ser considerada una alteración en "el régimen terapéutico. De manera similar, una vez qué han sido detectadas mutaciones en el codón 62, 75, 77, 116 y/o 151 solas o en combinación con mutaciones asociadas con resistencia al AZT 3TC, ddC o una mutación T215V en un paciente sometido a cierta terapia antirretroviral con NRTI, debe ser considerada una alteración en el régimen terapéutico. De manera similar, una vez que han sido detectadas cuatro o más mutaciones asociadas con resistencia a la AZT seleccionadas del grupo que consiste de 41, 67, 70, 210, 215 y/o 219 solas o en combinación en el codón 74 (V74I), 69 (T69D) , 75 (V75M, V75S) y/o 219 (K219N) en el paciente sometido a cierta terapia antirretroviral con NRTI, debe ser considerada una alteración en el régimen terapéutico. En los ensayos basados en PCR, incluyendo los ensayos fenotípicos y genotípicos, pueden ser utilizados para detectar mutaciones en el codón 69 en combinación con otros codones, incluyendo el 41 y/o 215 de la RT del VIH que se correlacionan con un patrón de resistencia específico a terapias antirretrcvirales y declinación inmunológica subsecuente. De manera similar, los ensayos basados en PCR, incluyendo los ensayos fenotípicos y genotípicos, pueden ser utilizados para detectar mutaciones en el codón 69 en combinación con mutaciones en otros codones incluyendo el 41, 210, 215, 184 y/o 74 de la RT del VIH que se correlacionan con un patrón específico de resistencia a terapias antirretrovirales y declinación inmunológica subsecuente. Los ensayos basados en la PCR, incluyendo los ensayos fenotípicos y genotípicos, pueden ser utilizados para detectar mutaciones en el codón 69 en combinación con mutaciones en otros codones, incluyendo el 62 y/o 75 de la RT del VIH que se correlacionan con un patrón específico de resistencia a terapias antirretrovirales y declinación inmunológica subsecuente. Los ensayos basados en la PCR, incluyendo los ensayos fenotípicos y genotípicos, pueden ser utilizados para detectar mutaciones en el codón 62, 75, 77, 116 y 151 en solas o en combinación con mutaciones en otros codones, incluyendo el 41, 67, 210, 214, 219, 184, 69 y/o T215V de la RT del VIH que se correlacionan con un patrón específico de resistencia a terapias antirretrovírales y declinación inmunológica subsecuente. El tiempo al cual deberá hacerse una modificación del régimen terapéutico, después de la evaluación de la terapia antirretroviral utilizando ensayos basados en la PCR, puede depender de varios factores incluyendo la carga viral del paciente, conteo de CD4 e historia de tratamiento anterior. En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para evaluar la efectividad de un fármaco nucleosídico antirretroviral para la transcriptasa inversa que comprende: (a) introducir un vector de prueba de resistencia que comprende un segmento derivado del paciente y un gen indicador en un una célula huésped; (b) cultivar la célula huésped del paso (a) ; (c) medir la expresión del gen indicador en una célula huésped objetivo donde la expresión del gen indicador depende del segmento derivado del paciente; y (d) comparar la expresión del gen indicador del paso (c) con la expresión del gen indicador medida cuando los pasos (a)-(c) se llevan a cabo en ausencia del fármaco anti-VIH NRTI, donde una concentración de la prueba del fármaco anti- VIH, NRTI, estuvo presente en los pasos (a) - (c) ; en los pasos (b) - (c) ; o en el paso (c) . Esta invención también proporciona un método para evaluar la efectividad de la terapia no nucleosídica antirretroviral de la transcriptasa inversa en un paciente, que comprende: (a) desarrollar una curva estándar de susceptibilidad al fármaco para un fármaco anti-VIH NRTI; (b) determinar la susceptibilidad al fármaco Anti-VIH NRTI en el paciente utilizando la prueba de susceptibilidad descrita anteriormente; y (c) comparar la susceptibilidad al fármaco anti-VIH NRTI en el paso (b) con la curva estándar determinada en el paso (a), donde una disminución en la susceptibilidad al anti-VIH NRTI indica el desarrollo de resistencia al fármaco anti-VIH en el paciente. Esta invención también proporciona un método para evaluar la efectividad biológica de un compuesto farmacéutico antirretroviral para el VIH candidato, que comprende: (a) introducir un vector de prueba de resistencia que comprende un segmento derivado de un paciente y un gen indicador en una célula huésped; (b) cultivar la célula huésped del paso (a) ; (c) medir la expresión del gen indicador en una célula huésped objetivo, donde la expresión del gen indicador depende del segmento derivado del paciente; y (d) comparar la expresión del gen indicador del paso (c) con la expresión del gen indicador medida cuando los pasos (a) - (c) se llevan a cabo en ausencia del compuesto farmacéutico antiviral candidato, donde la concentración de prueba del compuesto farmacéutico antiviral candidato está presente en los pasos (a) - (c) ; en los pasos (b) - (c) ; o en el paso (c) . La expresión del gen indicador en el vector de prueba de resistencia en la célula objetivo depende finalmente de la acción de las secuencias del segmento derivado del paciente. El gen indicador puede ser funcional o no funcional. En otro aspecto, esta invención está dirigida a pruebas de susceptibilidad y resistencia a fármacos antirretrovirales para el VIH/SIDA. Se identifican los vectores de prueba de resistencia particulares de la invención para utilizarse en la prueba de susceptibilidad y resistencia de fármacos antirretrovirales para el VIH/SIDA. En otro aspecto más, esta invención proporciona la identificación y evaluación de la efectividad biológica de los compuestos antirretrovirales terapéuticos potenciales para el tratamiento del VIH y/o SIDA. En otro aspecto, la invención está dirigida a un vector de prueba de resistencia novedoso que comprende un segmento derivado del paciente que comprende además una o más mutaciones sobre el gen de la RT y un gen indicador.

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1 Vector de Prueba de Resistencia. Una representación esquemática del vector de prueba de resistencia que comprende un segmento derivado de un paciente y un gen iniciador.

Figura 2 Dos Ensayos Celulares. Representación esquemática del ensayo. Se generó un vector de prueba de resistencia clonando el segmento derivado del paciente en un vector viral del gen indicador. El vector de prueba de resistencia se cotransfectó entonces con un vector de expresión que produce la proteína envolvente del virus de la leucemia murina (MLV) , anfotrópíca, u otras proteínas virales o celulares que permiten la infección. Se produjeron partículas virales pseudotipificadas que contenían los productos del gen de la proteasa (PR) y la transcriptasa inversa (RT) codificados por las secuencias derivadas del paciente. Las partículas se cosecharon y utilizaron entonces para infectar células frescas. Utilizando secuencias de PR y RT defectuosas se demostró que la actividad de la luciferasa depende de la PR y RT funcionales. Se agregaron inhibidores de la PR a las células después de la transfección y de este modo están presentes durante la maduración de la partícula. Se agregaron los inhibidores de la RT, por otro laso, a las células al momento o antes de la infección por la partícula viral. El ensayo se efectuó en ausencia de fármaco y en presencia de fármaco sobre un amplio intervalo de concentraciones. Se determinó la cantidad de luciferasa y se calculó el porcentaje (%) de inhibición a las diferentes concentraciones de fármaco probadas.

Figura 3 Ejemplos de Perfiles Fenotípicos de Susceptibilidad al Fármaco. Los datos se analizaron graficando el por ciento de inhibición de la actividad de la luciferasa contra logio de la concentración (uM) . Esta gráfica se utilizó para calcular la concentración de fármaco que se requiere para inhibir la reproducción del virus en un 50% (CI50) o en un 95% (CI95) . Las desviaciones en las curvas de inhibición hacia concentraciones de fármaco más altas se interpretaron como evidencia de resistencia al fármaco. Se muestran tres curvas típicas para un inhibidor nucleosídico de la transcriptasa inversa (AZT) , un inhibidor no nucleosídico de la transcriptasa inversa (delavirdina) , y un inhibidor de proteasa (ritonavir) . Una reducción en la susceptibilidad (resistencia) al fármaco se reflejó en una desviación en la curva de susceptibilidad al fármaco hacia concentraciones de fármaco mayores (a la derecha) en comparación con una muestra (de pretratamiento) basal o un control de virus susceptible al fármaco, tal como el PNL4-3 o HXB-2, cuando no estuvo disponible una muestra basal.

Figura 4 Aislados de pacientes resistentes a la d4T: Mutaciones de Resistencia a Múltiples NRTI . Esos cuatro virus exhibieron susceptibilidad reducida a la d4T (4-12 veces) y contienen mutaciones de la RT asociadas con resistencias a múltiples NRTI (A62V, V75I, F77L, F116Y, Q151M) . Algunos virus también contienen mutaciones asociadas específicamente con resistencia a la AZT (M41L, D67N, L210W, T215Y, K219Q) , 3TC (M184V/I) , o ddC (T69D) , o una mutación previamente no descrita (T215V) . Las mutaciones para los virus de prueba se listan más adelante en el perfil del virus de prueba. Las mutaciones dentro de paréntesis indican que la población de virus estuvo comprendida de una mezcla de naturales y mutantes. El genotipo descrito aquí es parcial. Para una descripción completa del genotipo del paciente, véase por ejemplo 3.

Figura 5 Aislados de Pacientes Resistentes a la d4T: Mutaciones/Inserciones de T69SSX. Esos cuatro virus exhiben susceptibilidad reducida a la d4T (2-10 veces) y contienen mutaciones/inserciones previamente no descritas en la RT (T69SSA, T69SSG, T69SSS) . Esos virus también contienen mutaciones asociadas con resistencia a la AZT (M41L, L210W, T215Y) y 3TC (M184V/I) o ddl/ddC (L74V) .

Algunos virus también contienen una mutación asociada con resistencia a múltiples NRTI (A62V) y/o una mutación no descrita anteriormente (V75M) . Las mutaciones para los virus de prueba se listan más adelante en el perfil del virus de prueba. Las mutaciones dentro de paréntesis indican que la población de virus estuvo comprendida de una mezcla de naturales y mutantes. El genotipo descrito aquí es parcial. Para una descripción completa del genotipo del paciente, véase por ejemplo 4.

Figura 6 Aislados de Pacientes Resistentes a la d4T: Mutaciones Asociadas con Resistencia a la AZT. Esos cuatro virus exhiben susceptibilidad reducida a la d4T (3-6 veces) y contienen 4 o más mutaciones asociadas con resistencias a la AZT (M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F, K219Q) . Algunos virus también contienen mutaciones asociadas con resistencia a la ddl (V74I) , ddC (T69D) o una mutaciones anteriormente no descritas (V75M, V75S, K219N) . Las mutaciones para los virus de prueba se listan más adelante en el perfil del virus de prueba. El genotipo descrito aquí es parcial. Para una descripción completa del genotipo del paciente, véase por ejemplo 5.

Figura 7 Mutaciones Dirigidas al Sitio: Mutaciones Asociadas con Resistencia a Múltiples NRTI. Los vectores de prueba de resistencia que contienen mutaciones en un solo sitio (V75E), (Q151M) y dos sitios (V75I+Q151M) fueron construidos por mutagénesis dirigida al sitio. Se muestra la susceptibilidad fenotípica a la d4T y AZT de los vectores de prueba de resistencia que contienen esas mutaciones dirigidas al sitio. Panel de la izquierda: la mutación Q151M redujo la susceptibilidad a la d4T aproximadamente tres veces. La mutación V75I no alteró la susceptibilidad a la d4T. Panel de la derecha: la mutación Q151M redujo la susceptibilidad a la AZT aproximadamente cinco veces. La mutación V75I incrementó la susceptibilidad a la AZT aproximadamente dos veces Figura 8 Mutaciones Dirigidas al Sitio: Mutaciones Asociadas con Resistencia a la AZT. Los vectores de prueba de resistencia que contienen cinco (M41L, D67N, K70R, T215Y, K219Q) o seis (M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y, K219Q) mutaciones asociadas con resistencia a la AZT se construyeron por mutagénesis dirigida al sitio. Se muestra la susceptibilidad fenotípica a la d4T y AZT de los vectores de prueba de resistencia que contienen esas mutaciones dirigidas al sitio. Panel de la izquierda: vectores de prueba de resistencia que contienen cinco o seis mutaciones asociadas con la resistencia a la AZT fueron aproximadamente dos veces menos susceptibles a la d4T que el vector de prueba de resistencia control. Panel de la derecha: los vectores de prueba de resistencia que contienen cinco o seis mutaciones asociadas con resistencia a la AZT fueron aproximadamente 75-180 veces menos susceptibles a la AZT que el vector de prueba de resistencia control.

Figura 9 Mutaciones Dirigidas al Sitio: Mutaciones Únicas en los Aminoácidos 62, 69 y 75 de la RT. Los vectores de prueba de resistencia que contienen mutaciones en un solo sitio (A62V, T69SSA, V75I, V75T) , fueron construidas por mutagénesis dirigida al sitio. Se muestra la susceptibilidad fenotípica a la d4T y AZT de los vectores de prueba de resistencia que contienen esas mutaciones dirigidas al sitio. Panel de la izquierda: las mutaciones T69SSA y V75T no reducen la susceptibilidad a la d4T apreciablemente (menos de dos veces) . Las mutaciones A64V y V75I no tuvieron efecto sobre la susceptibilidad a la d4T. Panel de la derecha: las mutaciones V75I y V75T incrementaron la susceptibilidad a la AZT ligeramente (aproximadamente dos veces) . La mutación T69SSA redujo la susceptibilidad a la AZT ligeramente (aproximadamente dos veces) . La mutación A64V no tuvo efecto sobre la susceptibilidad a la AZT.

Figura 10 Mutaciones Dirigidas al Sitio: Mutaciones Múltiples en los Aminoácidos 62, 69 y 75 de la RT. Los vectores de toda la resistencia que contiene mutaciones en dos sitios (A62V + T69SSA) , (A62V + V75I) y en tres sitios (A62V + T69SSA + V75I) se construyeron con mutagénesis dirigida al sitio. Se muestra la susceptibilidad fenotípica a la d4T y AZT de los vectores de- prueba de resistencia que contienen esas mutaciones dirigidas al sitio. Paneles de la Izquierda: una combinación de las mutaciones A62V y T69SSA no redujo la susceptibilidad a la d4T más que la mutación T69SSA sola. Sin embargo, esas dos mutaciones produjeron la susceptibilidad a la AZT en aproximadamente seis veces. Paneles centrales: una combinación de las mutaciones A62V y V75I no tuvo efecto sobre la susceptibilidad a la d4T. La mutación A62V no alteró el nivel reducido de susceptibilidad a la AZT causado por la mutación V75I. Paneles de la Derecha: una combinación de las mutaciones A62V, T69SSA, y V75I no reduce la susceptibilidad a la d4T más que la mutación T69SSA sola. La mutación V75I suprimió completamente la resistencia a la AZT causada por la combinación de las mutaciones A62V y T69SSA.

Figura 11 Clonas del paciente 285: Reversión Dirigida al Sitio T69SSA. Se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para revertir la mutación T69SSA en una clona molecular de un vector de prueba de resistencia preparado de una muestra del paciente 285. Se muestra la susceptibilidad fenotípica a la d4T y AZT de la clona original (T69SSA) y la clona revertida (SSA69T) . Panel de la izquierda: reversión de la mutación T69SSA redujo la resistencia a la d4T aproximadamente tres veces. Panel de la derecha: la reversión de la mutación T69SSA redujo la resistencia a la AZT en aproximadamente treinta veces.

Figura 12 Clonas del paciente 770: +/- T69SSA+V75M. El vector de prueba de resistencia reunido, derivado de la muestra del paciente 770 fue heterogénea consistiendo de variantes con o sin las mutaciones T69SSG y V75M. Se muestra la susceptibilidad fenotípíca a la d4T y AZT de los vectores de prueba de resistencia con o sin esas mutaciones. Panel de la izquierda: esquemas del vector de prueba de resistencia que contienen las mutaciones T69SSG y V75M fueron más de tres veces más resistentes a la d4T que las clonas sin estas mutaciones. Panel de la derecha: las clonas del vector de prueba de resistencia que contienen las mutaciones T69SSG y V75M fueron aproximadamente treinta veces más resistentes a la AZT que las clonas sin esas mutaciones.

Figura 13 Mutaciones Dirigidas al Sitio: mutaciones múltiples en los aminoácidos 41, 62, 69, 184 y 215 de la RT. Los vectores de prueba de resistencia que contienen tres (M41L + T69SSA + T215Y) cuatro (M41L + A62V + T69SSA + T215Y) o cinco (M41L + A62V + T69SSA + M184V + T215Y) mutaciones se construyeron con mutagénesis dirigida al sitio. Se muestra la susceptibilidad fenotípica a un panel de 6 NRTI (AZT, ddC, DDI, 3TC, d4T y abacavir) de vectores de prueba de resistencia que contienen esas mutaciones dirigidas al sitio. La M41L + T69SSA + T215Y redujo significativamente la susceptibilidad a todos los NRTI probados (2-150 veces) . La adición de A62V dio como resultado una reducción adicional a la susceptibilidad a la AZT, d4T y ddl pero no tuvo efecto sobre la susceptibilidad a 3TC, ddC y abacavir. El vector de prueba de resistencia con M41L + A62V + T69SSA + M184V + T215Y" fue más susceptible a la AZT, d4T y ddl que el vector de prueba de resistencia con las cuatro mutaciones M41L + A62V + T69SSA + T215Y. La adición de M184V condujo a una reducción en la susceptibilidad a 3TC pero no tuvo efecto sobre la susceptibilidad a la ddC o abacavir.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se relaciona con métodos para verificar el progreso clínico de la infección por VIH en pacientes que reciben terapia antirretroviral, particularmente terapia antirretroviral con inhibidor nucleosídico de la transcriptasa inversa. En una modalidad, la presente invención se proporciona para un método para evaluar la efectividad de la terapia antirretroviral de un paciente que comprende (i) recolectar una muestra biológica de un paciente infectado por VIH; y (ii) determinar si la muestra biológica comprende el ácido nucleico que codifica para la RT del VIH que tiene una mutación en una o más posiciones en la RT. Las mutaciones se correlacionan positivamente con alteraciones en la susceptibilidad/resistencia fenotípica. En una modalidad específica, la invención proporcione un método para evaluar la efectividad de la terapia antirretroviral con NRTI de un paciente que comprende (i) recolectar una muestra biológica de un paciente infectado por VIH; y (ii) determinar si la muestra biológica comprende el ácido nucleico que codifica para la RT del VIH que tiene una mutación en el codón 69. Esta invención estableció, utilizando un ensayo de susceptibilidad fenotípica, que las mutaciones en el codón 69 solas o en combinación con la mutación en el codón 41 y 215 de la transcriptasa inversa del VIH se correlaciona con una disminución a la susceptibilidad en d4T. En otra modalidad específica, la invención proporciona un método para evaluar la efectividad de la terapia antirretroviral con NRTI de un paciente que comprende (i) recolectar una muestra biológica en un paciente infectado por VIH; y (ii) determinar si la muestra biológica comprende el ácido nucleico que codifica para la RT del VIH que tiene una o más mutaciones en codones seleccionados del grupo que consiste de 62, 75, 77, 116 y/o 151. Esta invención estableció, utilizando el ensayo de susceptibilidad fenotípica, que las mutaciones en los codones seleccionados del grupo que consiste de 62, 75, 77, 116 y/o 151 solas o en combinación con una o más mutaciones en los codones seleccionados del grupo que consiste 41, 67, 210, 215, 219, 184, 69 y/o T215V de la transcriptasa inversa del VIH se correlacionan con una disminución de la susceptibilidad a la d4T (incremento de la resistencia) . Bajo las circunstancias anteriores, el perfil de susceptibilidad/resistencia fenotípica y el perfil fenotípico del virus del VIH que infecta al paciente ha sido alterado reflejando algunos cambios en la respuesta al agente antirretroviral. En el caso de la terapia antirretroviral con NRTI, el virus del VIH que infecta al paciente puede ser resistente a uno o más pero no a otro de los NRTI como se describe aquí. Por lo tanto, puede ser deseable que después de detectar la mutación, incrementar la dosis de agente retroviral, cambiar a otro agente antirretroviral, o agregar uno o más agentes antirretrovirales al régimen terapéutico del paciente. Por ejemplo, si el paciente estaba siendo tratado con estavudina (d4T) cuando la mutación 62, 75, 77, 116 y/o 151 sola o en combinación con una o más mutaciones en los codones seleccionados del grupo que consiste de 41, 67, 210, 215, 219, 184, 69 y/o T215 surgió, el régimen terapéutico del paciente puede ser alterado de manera deseable (i) cambiando a un agente antirretroviral NRTI diferente y detener el tratamiento con d4T; o (ii) incrementar la dosis de d4T; o (ii) agregar otro agente antirretroviral al régimen terapéutico del paciente. La efectividad de la modificación en la terapia puede ser evaluada verificando la carga viral tal como por el número de copias de ARN del VIH. Una disminución en el número de copias de ARN del VIH se correlaciona positivamente con la efectividad de un régimen de tratamiento. La frase "se correlaciona positivamente", como se utiliza aquí, indica que un resultado particular es más probable que otras conclusiones. Otra modalidad específica no limitante, preferida de la invención es la siguiente: un método para evaluar la efectividad de la terapia con NRTI de un paciente que comprende (i) recolectar una muestra biológica de un paciente infectado por VIH; (ii) amplificar el ARN que codifica para el VIH en la muestra biológica convirtiendo el ARN a ADNc y amplificar las secuencias del VIH utilizando cebadores del VIH que dan como resultado .un producto de la PCR que comprende el gen de la RT; (ii) efectuar la PCR utilizando cebadores que dan como resultado un producto de la PCR que comprenda codones naturales o mutante 69 y 41 y 215 y (iv) determinar, vía los productos de la PCR la presencia o ausencia de una mutación en el codón 69 ó 41 ó 215 o los tres. Otra modalidad específica, no limitante, preferida, de la invención es la siguiente: un método para evaluar la efectividad en la terapia con NRTI de un paciente, que comprende (i) recolectar una muestra de plasma de un paciente infectado por VIH; (ii) amplificar el ARN que codifica para el VIH en la muestra de plasma convirtiendo el ARN a ADNc y amplificar las secuencias del VIH utilizando cebadores del VIH que dan como resultado un producto de la PCR que comprende un gen de la RT; (ii) efectuar el PCR utilizando cebadores que den como resultado productos de la PCR que comprendan codones naturales o mutaciones en los codones seleccionados del grupo que consiste de 62, 75, 77, 116 y 151 y/o una o más mutaciones en codones seleccionados del grupo que consiste de 41, 67, 210, 215, 219, 184, 69; y (iv) determinar, vía los productos de la PCR, la presencia o ausencia de una mutación en el codón 62,75,77,116 y 151 y/o una o más mutaciones en los codones seleccionados del grupo que consiste de 41,67,210,215,219,184, 69. Otra modalidad específica no limitante, preferida, de la invención es la siguiente: un método para evaluar la efectividad de la terapia con NRTI de un paciente que comprende (i) recolectar una muestra de plasma de un paciente infectado por VIH; (ii) amplificar el ARN que codifica para el VIH en la muestra de plasma conviertiendo el ARN a ADNc y amplificando las secuencias de VIH utilizando cebadores de VIH que den como resultado un producto de la PCR que comprende el gen de la RT; (ii) efectuar la PCR utilizando cebadores que den como resultado productos de la PCR que comprendan codones naturales o mutaciones en los codones 69, 41, 210, 215, 184 ó 74; (iv) determinar, los productos de la PCR, la presencia o ausencia de una mutación en el codón 69 (T69SSAm T69SSG, T69SSS) y 41 (M41L) , 210 (L210W) , 215 (T215YJ , 184 (M184V) ó 74 (L74V) . Otra modalidad específica, no limitante, preferida, más de la invención es la siguiente: un método para evaluar la efectividad de la terapia con NRTI de un paciente que comprende (i) recolectar una muestra de plasma en un paciente infectado por VIH; (ii) amplificar el ARN que codifica para el VIH en la muestra de plasma que convierta el ARN a ADNc y amplificando las secuencias de VIH utilizando cebadores del VIH que den como resultado un producto de la PCR que comprende el gen de la RT; (iii) efectuar la PCR utilizando cebadores que den como resultado productos de la PCR que comprendan codones naturales o mutaciones en los condones 41, 67, 70, 210, 215 y 219; y (iv) determinar, vía los productos de la PCR, la presencia o ausencia de una mutación en el codón 41 (M41L) , 67 (D67N) , 70 (K70R) ; 210 (L210W) , 215 (T215Y/F) , y 219 (K219Q) . La presencia en el codón 69 y 41 y 215 de la RT del VIH indica que la efectividad de la terapia con NRTI actual o perspectiva puede requerir alteración, puesto que, como lo muestra esta invención, la mutación en el codón 69 reduce la susceptibilidad a la d4T. Utilizando los métodos de esta invención, estaría indicado el cambio en la terapia con NRTI. De manera similar, utilizando los medios y métodos de esta invención, la presencia de la mutación en los codones 62, 75, 77, 116 y/o 151 de la RT del VIH indica que la efectividad de la terapia con NRTI actual o perspectiva puede requerir alteración debido a que, como lo muestra esta invención, la mutación en los codones 62, 75, 77, 116 y/o 151 reduce la susceptibilidad a la d4T. de manera similar, utilizando los medios y métodos de esta invención, la presencia de la mutación/inserción en el codón 69 (T69SSA, T69SSG, Y69SSS) y 41 (M41L), 210/L210W) , 215 (T215Y) , 184 (M184V) o 74 (L74V) de la RT del VIH indica que la efectividad con la terapia actual y prospectiva puede requerir alteración, debido a que como lo muestra esta invención, la mutación/inserción en el codón 69 sola o en combinación con la mutación en los codones 41, 210, 215, 184 ó 74 reduce la susceptibilidad a la d4T. Otra modalidad específica, no limitante, preferida, de la invención es la siguiente: un método para evaluar la efectividad de la terapia antirretroviral de un paciente infectado por VIH que comprende: (a) recolectar una muestra biológica de un paciente infectado por VIH; y (b) determinar si la muestra biológica comprende el ácido nucleico que codifica para la transcriptasa inversa del VIH que tiene una mutación en cuatro o más codones seleccionados del grupo que consiste de 41, 67, 70, 210, 215 y 219 solas o en combinación con mutaciones en los codones 74 (V74I) , 69 (T69D) , 75 (V75M, V75S) o 219 (K219N) . Utilizando el ensayo de susceptibilidad fenotípica, se observó que la presencia de las cuatro o más mutaciones se correlaciona positivamente con una susceptibilidad reducida a la d4T. Utilizando el ensayo de susceptibilidad fenotípica, se observó que la presencia de cuatro o más mutaciones se correlaciona positivamente con la resistencia a la d4T. en otra modalidad, los codones mutantes 41, 67, 70, 210, 215 y 219 de la RT de la VIH codifican para 41L, 67N, 70R, 210W, 215Y/F y 219Q. En una modalidad más, la transcriptasa inversa tiene una mutación en el codón V74I, T69D, V75M, V25S, K219N o una combinación de las mismas además de cuatro o más mutaciones en los codones 41, 67, 70, 210, 215 y 219 de la RT del VIH. Otra modalidad específica, no limitante, preferida, de la invención es la siguiente: un método para evaluar la efectividad antirretroviral de un paciente infectado por VIH que comprende (a) recolectar una muestra biológica de un paciente infectado por VIH; y (b) determinar si la muestra biológica comprende el ácido nucleico que codifica para la transcríptasa inversa del VIH que tiene una mutación en uno más codones seleccionados del grupo que consiste de 67, 75, 77, 116 y 151 solas o en combinación con una mutación en uno o más codones seleccionados del grupo que consiste de (E6D, K20R, A33I, T39A, E44D, S68G, Y115F, I167V, E138A, G196A, I202V, T215V, D218E, y T240K) . Utilizando el ensayo de susceptibilidad fenotípica, se observó que , la presencia de las mutaciones en los codones 62, 75, 77, 116 y 151 solas o en combinación con las mutaciones en los codones 62, 75, 77, 116 y 151 de la RT del VIH produce una disminución a la susceptibilidad a la d4T. Esta invención proporciona un método para evaluar la efectividad de la terapia antirretroviral de un paciente infectado por VIH que comprende: (a) recolectar una muestra biológica de un paciente infectado por VIH; y (b) determinar si la muestra biológica comprende el ácido nucleico que codifica para la transcriptasa inversa del VIH que tiene una mutación/inserción en el codón (T69SSA, T89SSg, T69SSS) sola o en combinación con mutaciones en uno o más codones seleccionados del grupo que consiste de V75M, A158S, K20R, V21I, K102M, V179I, V241L, 12831, E297R, E6D, Q174R, D177E, R284K, A288S, E2941D. Utilizando el ensayo de susceptibilidad fenotípica, se observó que la presencia de la mutación/inserción en el codón 69 se correlaciona positivamente con una disminución en la susceptibilidad a la d4T. Esta invención proporciona un método para evaluar la efectividad de la terapia antirretroviral de un paciente infectado por VIH que comprende: (a) recolectar una muestra biológica de un paciente infectado por VIH; y (b) determinar si la muestra biológica comprende el ácido nucleico que codifica para la transcríptasa inversa del VIH que tiene una mutación en cuatro o más codones seleccionados del grupo que consiste de 41, 67, 70, 210, 215 y 219 sola o en combinación con mutaciones en uno o más codones seleccionados del grupo que consiste de P1L, P9R, K20R, T39D, K43E, E44D, K64Y,V75M/S, G99R, L109V, V118I, K173E/T, I202T, R211H/T, D218E, K219N, H221Y, L228H, L283I, R284K y A288T. Utilizando el ensayo de susceptibilidad fenotípica, se observó que la presencia de mutaciones en cuatro o más codones seleccionados del grupo que consiste de 41, 67, 70, 210, 215 y 219 puede correlacionarse positivamente con una disminución en la susceptibilidad a la d4T. Esta invención también proporciona los medios y métodos para utilizar el vector de prueba de resistencia que contiene un gen del VIH que comprende además una mutación de NRTI para la selección de fármacos. De manera más particular, la invención describe el vector de prueba de resistencia que comprende la transcriptasa inversa del VIH que contiene mutaciones en los codones 69 y 41 y 215 para seleccionar fármacos. La invención también describe el vector de toda la resistencia que comprende la transcriptasa inversa del VIH que tiene mutaciones en los codones seleccionados del grupo que consiste de 62 , 75, 77, 116 y 151 y/o 41, 67, 70, 210, 215 y 219. La invención también describe el vector de prueba de resistencia que comprende la transcriptasa inversa del VIH que comprende mutaciones en cuatro o más codones seleccionados del grupo que consiste de 41, 67, 70, 210, 215 y 219. La invención se relaciona además con vectores novedoso, células huésped y composiciones para el aislamiento e identificación del mutante resistente al inhibidor nucleosídico de la transcriptasa inversa del VIH-1 y el uso de tales vectores, células huésped y composiciones para llevar a cabo la selección de fármacos antivirales. Esta invención también se relaciona con la selección de fármacos candidatos por su capacidad para inhibir al mutante. Esta invención proporciona un método para identificar un compuesto, el cual es capaz de afectar la función de la transcriptasa inversa del VIH-1 que comprende poner en contacto el compuesto con los polipéptidos que comprenden toda o parte de la transcriptasa inversa del VIH-1 donde el codón 69 es cambiado para codificar para la inserción de los aminoácidos residuales SSS, SSG o SSA en lugar de la treonina, donde una unión positiva indica que el compuesto es capaz de afectar la función de la transcriptasa inversa. Esta invención proporciona un método para identificar un compuesto el cual es capaz de afectar la función de la transcriptasa inversa del VIH-1 que comprende poner en contacto el compuesto con los polipéptidos que comprenden toda o parte de la transcriptasa inversa del VIH-1 donde uno o más de los codones seleccionados del grupo que consiste de 62, 75, 77, 116 y 151 es cambiado para codificar para un aminoácido residual diferente a la alanina, valina, fenilalanina, fenilalanina y glutamina respectivamente, donde una unión positiva indica que el compuesto es capaz de afectar la función de la transcriptasa inversa. Esta invención también proporciona un método para identificar un compuesto el cual es capaz de afectar la función de la transcriptasa inversa del VIH-1, que comprende poner en contacto el compuesto con un polipéptido que comprende una porción de la transcriptasa inversa del VIH-1 donde cuatro o más codones seleccionados del grupo que consiste de 41, 67, 70, 210, 215 y 219 son cambiados para codificar para un aminoácido residual diferente a la metion'ina, ácido aspártico, lisina, leucina, treonina, o lisina respectivamente, donde una unión positiva indica que el compuesto es capaz de afectar la función de la transcriptasa inversa. Como se utiliza aquí, "segmento derivado del paciente" abarca los segmentos derivados de humanos y varias especies animales. Tales especies incluyen, pero no se limitan a chimpancés, ganado, gatos y perro. Los segmentos derivados del paciente también pueden ser incorporados en vectores de prueba de resistencia utilizando cualquiera de las técnicas de clonación alternativas expuestas en detalle en la solicitud internacional PCT No. PCT/US97/01609, presentada en Enero 29, 1997, la cual se incorpora aquí como referencia. Por ejemplo, la clonación vía la introducción de sitios de restricción de la clase II tanto en el esqueleto plasmídico como en los segmentos derivados del paciente o por clonación con el cebador del uracilo ADN glicosilasa. El segmento derivado del paciente puede ser obtenido por cualquier método de clonación molecular o amplificación genética, o amplificaciones de los mismos, o mediante la introducción de sitios receptores de la secuencia del paciente, como se describe más adelante, en los extremos del segmento derivado del paciente a ser introducido en el vector de prueba de resistencia. Por ejemplo, en un método de amplificación tal como la PCR, pueden ser incorporados sitios de restricción que corresponden a los sitios receptores de la secuencia del paciente en los extremos de los cebadores utilizados en la reacción PCR. De manera similar, en un método de clonación molecular, tal como la clonación del ADNc pueden incorporarse sitios de restricción en los extremos de los cebadores utilizados para la primera o segunda síntesis de la hebra de ADNc, o en un método tal como la reparación de 1 cebador de ADN, ya sea que el ADN esté clonado o no clonado, pueden incorporarse sitios de restricción en los cebadores utilizados para la reacción de reparación. Los sitios receptores de la secuencia del paciente en los cebadores se diseñaron para mejorar la representación de los segmentos derivados del paciente. Los conjuntos de vectores de prueba de resistencia que tienen los sitios receptores de la secuencia del paciente designados proporcionan la representación de los segmentos derivados del paciente que pueden ser representados en un vector de prueba de resistencia solo. "Vector de Prueba de Resistencia" significa uno o más vectores los cuales tomados juntos contiene ADN o ARN que comprende un segmento derivado del paciente y un gen indicador. Los vectores de prueba de resistencia se preparan como se describe en la Solicitud Internacional PCT No. PCT/US97/01609, presentada en Enero 29, 1997, la cual se incorpora aquí como referencia, introduciendo sitios receptores de la secuencia del paciente, amplificando o clonando los segmentos derivados del paciente e insertando las secuencias amplificadas o clonadas precisamente en los vectores virales del gen indicador en los sitios receptores de la secuencia del paciente. De manera alternativa, un vector de prueba de resistencia (también referido como un sistema de vector de prueba de resistencia) se prepara introduciendo sitios receptores de la secuencia del paciente en un vector de empaque, amplificando o clonando segmentos derivados del paciente e insertando las secuencias amplificadas o clonadas precisamente en el vector de empaque en los sitios receptores de la secuencia del paciente y cotrasfectando ese vector de empaque con un vector viral del gen indicador. "Indicador o gen indicador", como se describe en la' Solicitud Internacional PCT No. PCT/US97/01609, presentada en Enero 29, 1997 se refiere a un ácido nucleico que codifica para una proteína, estructura de ADN o ARN que directamente o a través de una reacción da lugar a un aspecto medible o notable, por ejemplo, un color o luz de una longitud de onda medible o en el caso del ADN o ARN, utilizado como un indicador un cambio o generación de la estructura de ADN o ARN específica. Los ejemplos preferidos de un gen indicador son el gen lacZ de E. coli que codifica para la ß-galactosidasa, el gen luc que codifica para la luciferasa ya sea de, por ejemplo, Photonis pyralis (la luciérnaga) o Renilla renoformis (trinitaria de mar) , el gen phoA de E. coli que codifica para la fosfatasa alcalina, proteína fluorescente verde y gen CAT bacteriano que codifica para la cloranfenicol acetiltransferasa. El indicador o gen indicador puede ser funcional o no funcional tal como se describe en la Solicitud Internacional PCT No. PCT/US97/01609, presentada en Enero 29, 1997. Las pruebas de susceptibilidad y resistencia fenotípica al fármaco de esta invención puede llevarse a cabo en una o más células huésped como se describe en la Solicitud Internacional PCT No. PCT/US97/01609, presentada en Enero 29, 1997, la cual se incorpora aquí como referencia. La susceptibilidad viral al fármaco se determina como la concentración del agente antiviral a la cual un porcentaje dado de la expresión del gen indicador es inhibida (por ejemplo la CI50 para un agente antiviral es la concentración a la cual el 50% de la expresión del gen indicador es inhibida) . Puede desarrollarse una curva estándar para la susceptibilidad al fármaco de un fármaco antiviral dado para un segmento antiviral que es un segmento antiviral de laboratorio estándar o de un paciente candido al fármaco (es decir un paciente que no ha recibido ningún fármaco antiviral) utilizando el método descrito en la solicitud de patente mencionada anteriormente. De manera correspondiente, la resistencia viral al fármaco es una disminución en la susceptibilidad viral al fármaco para un paciente dado medida comparando la susceptibilidad al fármaco con un estándar dado o haciendo una o más mediciones secuenciales en el mismo paciente con tiempo, de acuerdo a lo determinado por el incremento de la inhibición de la expresión del gen indicador (es decir la disminución de la expresión del gen indicador) .

Los fármacos antivirales que son agregados al sistema de prueba se agregan a tiempos seleccionados dependiendo del objetivo del fármaco antiviral. Por ejemplo, en el caso de inhibidores de la proteasa del VIH, incluyendo el saquinavir, ritonavir, indinavir, y nalfinavir, ellos se agregan a células huésped de empaque al momento de o inmediatamente después de su transfección con un vector de prueba de resistencia, a un intervalo de concentraciones apropiadas. Los inhibidores de la transcriptasa inversa del VIH, incluyendo la AZT, ddl, ddC, d4T, 3TC, nevirapina y delavirdina, se agregan a las células huésped objetivo al momento o antes de la infección por las partículas virales del vector de prueba de resistencia, a un intervalo apropiado de concentración. De manera alternativa, los fármacos antivirales pueden estar presentes a través del ensayo. La concentración de prueba se selección a un intervalo de concentraciones el cual está típicamente entre aproximadamente 0.1 nm y aproximadamente 100 µm y de manera más específica para cada uno de los siguientes fármacos: AZT, de aproximadamente 6 nM hasta aproximadamente 400 µM; ddl, de aproximadamente 15 nM hasta aproximadamente 1,000 µM; 3TC, de aproximadamente 9 nM hasta aproximadamente 600 µM; d4T, de aproximadamente nM hasta aproximadamente 400 µM; ddC, de aproximadamente 15 nM hasta aproximadamente 1,000 µM; nevirapina, de aproximadamente 0.7 nM hasta aproximadamente 50 µM; delavirdina, de aproximadamente 0.07 nM hasta aproximadamente 5 µM; saquinavir, de aproximadamente 0.02 nM hasta aproximadamente 1.5 µM; indinavir, de aproximadamente 0.02 nM hasta aproximadamente 1.5 µM; nelfinavir, de aproximadamente 0.02 nM hasta aproximadamente 1.5 µM; y ritonavír, de aproximadamente 0.05 nM hasta aproximadamente 3 µM. En otra modalidad de esta invención, se probó un compuesto antirretroviral de NRTI candidato en la prueba de susceptibilidad a la resistencia fenotípica al fármaco utilizando el vector de prueba de resistencia que comprende la RT que tiene mutaciones en el codón 69 y 41 y 215. En otra modalidad de esta invención, se probó un compuesto antirretroviral NRTI candidato en la prueba de susceptibilidad y resistencia fenotípica al fármaco utilizando el vector de prueba de resistencia que comprende RT que tiene mutaciones en uno o más codones seleccionados del grupo que consiste de 62, 75, 77, 116 y/o 151. En otra modalidad de esta invención, se probó un compuesto antirretroviral NRTI candidato en la prueba de susceptibilidad y resistencia fenotípica al fármaco utilizando el vector de prueba de resistencia que comprende la RT que tiene mutaciones en cuatro o más codones seleccionados del grupo que consiste de M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F y K219Q) . En otra modalidad de esta invención, se probó un compuesto antirretroviral NRTI candidato en la prueba de susceptibilidad y resistencia fenotípica al fármaco utilizando el vector de prueba de resistencia que comprende la RT que tiene mutaciones en el codón 69 (ya sea T69SSA, T68SSG, T69SSS) , M41L y T215Y y mutación en uno o más codones seleccionados del grupo que consiste de M184V/I, L74V, A62V, V75M. El compuesto antirretroviral candidato se agregó al sistema de prueba a un intervalo apropiado de concentraciones y en el paso de transfección. De manera alternativa, puede ser probado más de un compuesto antiviral candidato o un compuesto antiviral candidato puede ser probado en combinación con un fármaco antiviral apropiado tal como la AZT, ddl, ddC, d4T, 3TC, delavirdina, nevirapina, saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir o un compuesto que esté siendo sometido a ensayos químicos tal como abacavir, o amprenavir o efavirenz. La efectividad del antiviral candidato será evaluada midiendo la expresión o inhibición del gen indicador. En otro aspecto de esta modalidad, la prueba de susceptibilidad y resistencia al fármaco puede ser utilizada para seleccionar mutantes virales. Después de la identificación de los mutantes resistentes a cualesquiera de los antirretrovirales conocidos o antirretrovirales candidatos, los mutantes resistentes son aislados y el ADN es analizado. De este modo puede montarse una biblioteca de mutantes virales resistentes que permitan la selección de antirretrovirales NRTI candidatos, solos o en combinación. Esto permitirá a un experto en la técnica identificar antirretrovirales NRTI efectivos y diseñar regímenes" terapéuticos efectivos.

Materiales y Métodos Generales La mayoría de las técnicas utilizadas para construir vectores, y células transfectadas o infectadas, son ampliamente practicadas en la técnica, y la mayoría de los practicantes están familiarizados con los materiales de los recursos estándar que describen condiciones y procedimientos específicos. Sin embargo, por conveniencia, los siguientes párrafos pueden servir como una directriz. Los "plásmidos" y "vectores" se designaron por medio de una p seguida por letras y/o números. Los plásmidos iniciales aquí se encuentran comercialmente disponibles, disponibles públicamente sobre una base no restringida, o pueden ser construidos a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. Además, los plásmidos equivalentes a aquéllos descritos en son conocidos en la técnica y serán evidentes a aquéllos expertos en la técnica. La construcción de vectores de construcción emplea las técnicas de ligación y restricción estándar las cuales son bien comprendidas en la técnica (véase Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience or Manitis et al., (1992) in Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold, Spring Harbor Laboratory, N.Y.). Los plásmidos aislados, secuencias de ADN, u oligonucleótidos sintetizados son escindidos, manipulados y relegados en la forma deseada. Las secuencias de todos los constructos de ADN que incorporan ADN sintético fueron confirmadas por el análisis de secuencia del ADN (Sanger et al. (1977) Proc. Nati. Acad. Sci 74, 5463-5467) . "Digestión" del ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa sólo en ciertas secuencias, sitios de restricción, en el ADN. Las diferentes enzimas de restricción utilizadas aquí se encuentra comercialmente disponibles y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos son conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Para propósitos, típicamente se utilizan 1 µg de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 µl de solución amortiguadora. De manera alternativa, se utiliza un exceso de enzima de restricción para asegurar la digestión completa del sustrato de ADN. Tiempos de incubación de aproximadamente una hora hasta dos "horas a aproximadamente 37 °C son trabajables, aunque pueden ser toleradas variaciones. Después de cada incubación, la proteína es removida con una fracción de fenol/cloroformo, y puede ser seguida por extracción con éter, y el ácido nucleico recuperado de las fracciones acuosas por precipitación con etanol. Si se desea, puede efectuarse la separación por tamaño de los fragmentos escindidos por electroforesis sobre gel de poliacrilamida o gel de agarosa utilizando técnicas estándar. Una descripción general de las separaciones por tamaño se encuentra en Methods of Enzymology 65:499-560 (1980). Los fragmentos escindidos por restricción pueden hacerse romos en el extremo tratándolos con un fragmento grande de ADN polimerasa de I (Klenow) de E. coli en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxinucleotido (dNTP) utilizando tiempo de incubación de aproximadamente 15 a 25 minutos a 200C en 50 Tris nM (pH 7.6), NaCl 50 mM, MgCl2 6 mM, DTT 6 mM y 5-10 dNTP. El fragmento de Klenow se llena en los extremos adherentes 5' pero se redigiere proyectando hebras únicas 3 ' , aún cuando estén presentes cuatro dNTP. Si se desea, puede efectuarse la reparación selectiva proporcionando sólo uno de los dNTP, o con dNTP seleccionados, dentro de las limitaciones dictadas pon la naturaleza de los extremos adherentes. Después del tratamiento con Klenow, la mezcla es extraída con fenol/cloroformo y precipitada con etanol. El tratamiento bajo condiciones apropiadas con nucleasa Si o con Bal-31 da como resultado la hidrólisis de cualquier porción de una sola hebra. Las ligaciones se efectúan en volúmenes de 15-50 µl bajo las siguientes condiciones y temperaturas estándar: Tris-Cl 20 mM, pH 7.5, MgC12 10 mM, DTT 10 mM, BSA 33 mg/ml, NaCl 10 mM- 50 mM, y cualquiera de Atp 40 µM, y 0.01-0.02 unidades (Weiss) de ADN ligasa T4 a 0°C (para la ligación del "extremo adherente") o ATP 1 mM, 0.3-0.6 unidades (Weiss) de ADN ligasa T4 a 14°C (para la ligación del "extremo romo". Las ligaciones del "extremo adherente" intramolecular se efectúan usualmente a 33-100 µg/ml de las concentraciones totales de ADN (concentración total del extremo de 5-100 mM) . las ligaciones intramoleculares del extremo romo (que usualmente emplea un exceso molar de 10-30 veces de enlazante) se efectúan a una concentración total de extremo de 1 µM.

La "Expresión transitoria" se refiere a la expresión no amplificada dentro de aproximadamente un día a tres semanas de la transfección. El tiempo óptimo para la expresión transitoria de una proteína heteróloga deseada particular puede variar dependiendo de varios factores incluyendo, por ejemplo, cualesquier factores de transfección que puedan ser empleados, los mecanismos de control translacional y la célula huésped. La expresión transitoria ocurre cuando el plásmido particular que ha sido transfectado funciona, es decir, es transcrito y traducido. Durante este tiempo, el ADN plasmídico que ha entrado a la célula es transferido al núcleo. El ADN está en un estado no integrado, libre dentro del núcleo. La transcripción del plásmido absorbido por la célula ocurre dentro de este periodo. Después de la transcripción, el ADN plásmidico puede ser degradado o diluido por división celular. Ocurre la integración aleatoria dentro de la cromatina celular. En general, los vectores que contienen secuencias promotoras y control que son derivadas de especies compatibles con la células huésped son utilizados con la célula huésped particular. Los promotores adecuados para utilizarse con huéspedes procarióticos incluyen de manera ilustrativa a los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos promotores son adecuados. Además de procariotes, también pueden ser utilizados microbios eucarióticos tales como cultivos de levaduras. La levadura Saccharomyces cerevisiae, o levadura de hornear común es el microorganismo eucariótico más comúnmente utilizado, aunque un número de otras cepas están comúnmente disponibles. Los promotores que controlan la transcripción de los vectores en células huésped de mamífero pueden obtenerse de varias fuentes, por ejemplo, los genomas de virus tales como: polioma, virus de simio 40 (SV40) , adenovirus, retrovirus, virus de la hepatititis B y de manera preferible citomegalovirus, o de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo el promotor de la ß-actina. Los promotores primarios y tardíos del virus SV40 se obtienen de manera conveniente como un fragmento de restricción SV40 el cual también contiene el origen de reproducción viral SV40. El promotor inicial inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente con un fragmento de restricción de HindIII. Por supuesto, también son útiles aquí los promotores de la célula huésped o especies relacionadas. Los vectores utilizados aquí pueden contener un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Un gen de selección codifica para una proteína, necesariamente para la sobrevivencia o crecimiento de una célula huésped transformada con el vector. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para célula de mamífero incluyen al gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen de la ornitina descarboxilasa, el gen de resistencia a múltiples fármacos (mdr) , el gen de la adenosina deaminasa, y el gen de la glutamina sintasa. Cuando tales marcadores seleccionables son transformados exitosamente de una célula huésped de mamífero, la célula huésped de mamífero transformado puede sobrevivir si es colocada bajo presión selectiva. Existen dos categorías distintas ampliamente utilizadas de regímenes de selección. La primera categoría se basa en un metabolismo celular y el uso de una línea celular mutante que carece de la capacidad para crecer independiente de un medio suplementado. La segunda categoría se refiere a una selección dominante, la cual se refiere a un esquema de selección utilizado en cualquier tipo de célula y que no requiere el uso de una línea célula mutante. Esos esquemas típicamente utilizan un fármaco para contrarrestar el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que tienen un gen novedoso expresarían una proteína que contiene la resistencia al fármaco y sobreviviría a la selección. Los ejemplos de tal selección dominante utilizan los fármacos neomicina (Southern y Berg 1982) J. Molec. Appl. Genet. 1, 327), ácido micofenólico (Mulligan y Berg (1980) Science 209, 1422), o higromicina (Sudgen et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 410-413). Los tres ejemplos dados anteriormente emplean genes bacterianos bajo el control eucariótico para llevar la resistencia al fármaco apropiado neomicina (G418 o genticina) , xgpt (ácido micofenólico) o hidromicina, respectivamente. "Transfección" significa la inducción del ADN en una célula huésped de modo que el ADN sea expresado, es decir expresado funcionalmente o de otro modo; el ADN también puede reproducirse ya sea como un elemento extracromosomal o por integración cromosomal. A menos que se establezca otra cosa, el método utilizado aquí para la transformación de las células huésped es el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb (1973) Virology 52, 456-457. Los métodos alternativos para la transfección son la electroporación, el método de DEAE-dextran, lipofección y biolísticos (Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press) . Las células huésped pueden ser transfectadas con los vectores de expresión de la presente invención y cultivadas en medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para inducir a los promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes. Las células huésped se cultivan en F12:DMEM (Gibco) 50:50 con glutamina agregada y sin antibióticos. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares son aquéllas previamente utilizada con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes a aquéllos expertos en la técnica. Los siguientes ejemplos simplemente ilustran el mejor modo hasta ahora conocido para practicar la invención, pero no deberán constituirse limitantes de la invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes citadas en esta especificación se incorporan como referencia en su totalidad como si cada publicación o. solicitud de patente individual fuese indicada específica e individualmente aquí incorporada como referencia.

EJEMPLO 1 Prueba de susceptibilidad y resistencia fenotípica al fármaco utilizando vectores de prueba de resistencia Las pruebas de susceptibilidad y resistencia fenotípica al fármaco se llevaron a acabo utilizando los métodos descritos en la Solicitud Internacional PCT No.

PCT/US97/01609, presentada en Enero 29, 1997, la cual se incorpora por lo tanto como referencia. En esos experimentos, segmentos derivados de pacientes que corresponden a las regiones que codifican para la proteasa y transcriptasa inversa del VIH fueron segmentos derivados del paciente amplificados por el método de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) utilizando el ARN viral aislado de las partículas virales presentes en el suero de individuos infectados con VIH o fueron mutantes naturales del tipo VIH-1 hechas por mutagénesis dirigida al sitio de una clona original del ADN del vector de prueba de resistencia. El aislamiento del ARN viral se efectuó utilizando procedimientos estándar (por ejemplo, el sistema de aislamiento de ARN total, TNAgents, Promega, Madison Wi o RNAzol, Telest, Friendswood, TX) . El protocolo RT-PCR fue dividido en dos pasos. Se utilizó una transcriptasa inversa retroviral [por ejemplo transcriptasa inversa MuLV de Moloney (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ) , o transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis de las aves (AMV) , (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ] para copiar el ARN viral en ADNc. El ADNc fue amplificado utilizando una ADN polimerasa termoestable [por ejemplo Taq (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ) , PrimeZyme (aislada de Thermus brockianus, Biometra, Gottingen, Alemania) ] o una combinación de polimerasas termoestables como se describe para efectuar la "PCR larga" (Barnes, W.M., (1994) Proc. Nati. Acad, Sci, USA 91, 2216-2220) [por ejemplo el sistema de PCR de alta fidelidad expandido (Taq + Pwo), (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN) o el equipo de PCR GeneAmp XI (Tth + Vent) , (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ) ] . Los cebadores, el cebador Apal (PDSApa) y el cebador Agel (PDSAge) utilizados para amplificar los segmentos derivados del paciente de "prueba" contenían secuencias que dieron como resultado los sitios de reconocimiento de Apal y Agel que están siendo introducidos en los términos 3' y 5' del producto de la PCR, respectivamente como se describe en la Solicitud Internacional PCT/US97/01609, presentada en Enero 29, 1997. Los vectores de prueba de resistencia que incorporan los segmentos derivados del paciente de "prueba" se construyeron como se describe en la Solicitud Internacional PCT No. PCT/US97/01609, presentada en Enero 29, 1997 utilizando un producto de ADN amplificado de 1.5 kB preparado por RT-PCR utilizando ARN viral como patrón y los nucleótidos PDSApa (1) y PDSAge (2) como cebadores, seguido por la digestión con Apal y Agel o el isosquizímero PINAI . Para asegurar que el ADN plasmídico corresponda al vector de prueba de resistencia resultante que comprende una muestra representativa de las especies virales del VIH presentes en el suero de un paciente dado, se reunieron muchos (>100) transformantes de E. coli independientes obtenidos en la construcción de un vector de prueba de resistencia dado y se utilizaron para la preparación del ADN plasmídico. Un vector de expresión de empaque que codifica para un producto anfotrópico del gen MuLV 4070A permite la producción en una célula huésped del vector de prueba de resistencia de partículas virales del vector de prueba de resistencia que pueden infectar eficientemente las células objetivo humanas. Los vectores de prueba de resistencia que codifican para todos los genes de VIH con la excepción del MulV fueron utilizados para transfectar una células huésped de empaque (un vez transfectada la célula huésped es referida como una célula huésped de vector de prueba de resistencia) . El vector de expresión de empaque que codifica para el producto amfotrófico del gen MuLV 4070A se utilizó con el vector de prueba de resistencia para permitir la producción en la célula huésped del vector de prueba de resistencia de partículas virales de vector de prueba de resistencia pseudotipificadas como infecciosas.

Las pruebas de resistencia efectuadas con vectores de prueba de resistencia se llevaron a cabo utilizando células huésped de empaque y células huésped objetivo que consistían de la línea celular de riñon embriónico humano 293 (Cell Culture Facility, UC San Francisco, SF, CA) o la línea de células T leucémicas de Jurkat (Arthur Weiss, UC San Francisco, SF, CA) . Las pruebas de resistencia se llevaron a cabo con vectores de prueba de resistencia utilizando dos tipos de célula. Las partículas virales del vector de prueba de resistencia se produjeron por medio de una primera célula huésped (la célula huésped del vector de prueba de resistencia) que se preparó transfectando una célula huésped de empaque con el vector de prueba de resistencia y el vector de expresión de empaque. Las partículas vírales del vector de prueba de resistencia fueron entonces utilizadas para infectar una segunda célula huésped (la célula huésped objetivo) en la cual se midió la expresión del gen indicador. Se construyeron vectores de prueba de resistencia que contiene un cásete del gen de luciferasa funcional y las células huésped fueron transfectadas con el ADN del vector de prueba de resistencia. Los vectores de prueba de resistencia contenían secuencias de transcriptasa inversa y proteasa derivadas del paciente que fueron susceptibles o resistentes a los agentes antivírales, tales como los inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nucleosídícos de la transcriptasa inversa e inhibidores de la proteasa. Las partículas virales del vector de prueba de resistencia producidas transfectando el ADN del vector de prueba de resistencia en células huésped, ya sea en presencia o ausencia de inhibidores de proteasa, fueron utilizadas para infectar a las células huésped objetivo que crecen en ausencia de NRTI o NNRTI o en presencia de concentraciones crecientes del fármaco. La cantidad de actividad de luciferasa producida en células huésped infectadas en presencia de fármaco fue comparada con la cantidad de luciferasa producida en células huésped objetivo infectadas en ausencia de fármaco. La resistencia al fármaco se midió como la cantidad de fármaco requerida para inhibir el 50% de la actividad de la luciferasa detectada en ausencia de fármaco (concentración inhibidora del 50%, CI50) . Los valores de la CI50 se determinaron graficando el por ciento de inhibición del fármaco contra el loglO de la concentración del fármaco. Las células huésped fueron sembradas en discos de un diámetro de 10 cm y fueron transfectadas varios días después del cultivo con ADN del plásmido del vector de prueba de resistencia y el vector de expresión de la envoltura. Las transfecciones se efectuaron utilizando un procedimiento de precipitación con fosfato de calcio. Los medios de cultivo celular que contenían el ADN precipitado fueron reemplazados con medio fresco, de una a 24 horas, después de la transfección. Los medios de cultivo celular contenían las partículas virales del vector de prueba de resistencia fueron cosechados de uno a cuatro días después de la transfección y fueron pasados a través de un filtro de 0.45 mM antes de ser almacenados a -80°C. los niveles de proteína de la cápsula del VIH (p24) en los medios de cultivo celular cosechado se determinaron por un método EIA de acuerdo a lo descrito por el fabricante (SIAC; Frederick, MD) . Antes de la infección, las células objetivo (293 y 293/T) fueron cultivadas en medios de cultivo celular. Se efectuaron infecciones control utilizando medios de cultivo celulares de transfecciones mock (sin ADN) o transfecciones que contenían el ADN del plásmido del vector de prueba de resistencia sin el plásmido de expresión de la envoltura. De uno a tres o más días después de la infección los medios fueron removidos y se agregó amortiguador de lisis celular (Promega) a cada pozo. Los lisados celulares fueron ensayados para determinar la actividad de luciferasa (Figura 3) . El efecto inhibidor del fármaco fue determinado utilizando la siguiente ecuación: % de inhibición de la luciferasa = 1- (RLUluc [fármaco] -s-RLUluc) x 100 donde RLUluc [fármaco] es la unidad de luz relativa de la actividad de la luciferasa en células infectadas en presencia de fármaco RLUluc es la Unidad de Luz Relativa de la actividad de la luciferasa en células infectadas en ausencia de fármaco. Los valores del CI50 se obtuvieron de las curvas sigmoidales que fueron generadas a partir de los datos graficando el por ciento de inhibición del por ciento de inhibición de la luciferasa contra el loglO de la concentración del fármaco. Las curvas de inhibición del fármaco se muestran en (Figura 3) .

Ejemplo 2 Correlación de la Susceptibilidad Fenotípica y Análisis Genotípico Análisis de la susceptibilidad fenotípica de muestras de VIH del paciente Los vectores de prueba de resistencia se construyeron como se describió en el ejemplo 1. Los vectores de prueba de resistencia o clonas derivadas de los conjuntos de vectores de prueba de resistencia, se probaron en un ensayo fenotípico para determinar de manera exacta y cuantitativa el nivel de susceptibilidad a un panel de fármacos antirretrovirales. Este panel de fármacos antirretrovirales puede comprender miembros de las clases conocidas como inhibidores análogos nucleosídicos de la transcriptasa inversa (NRTI), inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa (NRTI) , e inhibidores de la proteasa (PRI) . El panel de fármacos puede expandirse a menos fármacos o pueden volverse disponibles en la medida que se vuelvan disponibles nuevos fármacos o nuevos objetivos de fármacos. Se determinó la CI50 para cada conjunto de vectores de prueba de resistencia para cada fármaco probado. Se examinó y comparó el patrón de susceptibilidad a todos los fármacos probados con patrones de susceptibilidad conocidos. Una muestra de paciente puede ser examinada adicionalmente para los cambios genotípicos correlacionados con el patrón de susceptibilidad observado.

Análisis genotípico de muestras de VIH del paciente Los ADN vector de pruebas de resistencia, ya sea reunidos o clones, se analizaron por cualquiera de los métodos genotípicos descritos en el Ejemplo 2. En una modalidad de la invención, las secuencias de la muestra de VIH del paciente se determinaron utilizando la amplificación del ARN viral, RT/PCR y secuenciamiento automatizado del terminador de la cadena ABI. La secuencia que se determinó se comparó con las secuencias control presentes en la base de datos o se comparó con una muestra del paciente antes del inicio de la terapia si estaba disponible. El genotipo se examinó para secuencias diferentes a la secuencia de control o pretratamiento y correlacionó con el fenotipo observado.

Análisis de susceptibilidad genotípica de mutantes dirigidos al sitio. Los cambios genotípicos que se observó se correlacionan con cambios en los patrones genotípicos de susceptibilidad a fármacos se evaluaron mediante la construcción de vectores de pruebas de resistencia que contenían la mutación específica sobre un antecedente genético natural (susceptible al fármaco) definido. Las mutaciones pueden ser incorporadas solas y/o en combinación con otras mutaciones de resistencia a fármacos conocidas que se piensan modulan la susceptibilidad del VIH a ciertos fármacos o clases de fármacos. Las mutaciones se introdujeron en el vector de prueba de resistencia a través de cualquiera de los métodos ampliamente conocidos para la mutagénesis dirigida al sitio. En una modalidad de esta invención, se utilizó el método PCR con megacebador para la mutagénesis dirigida al sitio. Se probó entonces un vector de prueba de resistencia que contenía las mutaciones específicas utilizando el ensayo de susceptibilidad fenotípica descrito anteriormente y se comparó el perfil de susceptibilidad con el de un vector de prueba de resistencia (susceptible a fármacos) natural definido genéticamente que carece de mutaciones específicas. Los cambios observados en el patrón de susceptibilidad fenotípica a los fármacos antirretrovirales probados se atribuyeron a las mutaciones específicas introducidas en el vector de prueba de resistencia.

EJEMPLO 3 Correlación de la Susceptibilidad Fenotípica Y Análisis Genotípico : Resistencia a la D4T Asociada con Mutaciones de Resistencia Múltiples Fármacos (MDR) Análisis Fenotípico de los Vectores de Prueba de Resistencia de los Pacientes 96-136, 97-240, 98-955 y 98-960. Los vectores de prueba de resistencia se construyeron de acuerdo a lo descrito en el ejemplo 1 de muestras de los pacientes designados como 96-136, 97-240, 98-955 y 98-960. Los pacientes 136 y 240 habían sido previamente tratados con regímenes que incluían d4T por varios periodos de tiempo. La historia de exposición al fármaco de los pacientes 95 y 960 se desconoció. Los aislados de ARN viral y RT/PCR se utilizaron para generar segmentos derivados del paciente que comprendieron secuencias virales que codifican para toda la PR y los aa 1-313 de la RT . Los segmentos derivados del paciente se insertaron en un vector viral del gen indicador para generar vectores de prueba de resistencia designados como RTV-136, RTV-240, RTV-955 y RTV-960. Los RTV fueron probados utilizando un ensayo de susceptibilidad fenotípica para determinar exacta y cuantitativamente el nivel de susceptibilidad a un panel de fármacos antirretrovirales. Este panel de fármacos antirretrovirales comprendió miembros de las clases conocidas como NRTI (AZT, 3TC, d4T, ddl, ddC, y abacavir), NNRTI (delavirdina y nevirapina), y PRI (indinavir, nelfinavir, ritonavir, y saquinavir) . Se determinó un CI50 por cada fármaco probado. La susceptibilidad del virus del paciente a cada fármaco se examinó y comparó con patrones de susceptibilidad conocidos. Se observó una disminución en la susceptibilidad d4T en comparación con un RTV control natural en cada uno de esos RTV reunidos. Las muestras del paciente se examinaron adicionalmente para detectar cambios genotípicos que pudieran estar asociados con el patrón observado de susceptibilidad a la d4T.

Determinación del genotipo de los ADN del RTV del paciente Los ADN del RTV fueron analizados por el secuenciamiento automatizado por terminador en la cadena ABI. La secuencia nucleotídica fue comparada con la secuencia de consenso de un VIH-1 clase B natural (HIV Sequence Datábase Los Alamos, NM) . La secuencia nucleotídica fue examinada por secuencias que son diferentes a la secuencia control. El RTV-136 tuvo mutaciones en M41L, D67N, V75I, V75I, F116Y, Q151M, M184V, T200A, y T215Y. Todas las mutaciones en el RTV-136 estuvieron presentes como una mezcla de aminoácidos naturales y mutantes en cada posición. El RTV-240 tuvo mutaciones en A62V, S68G, V75I, F77L, F116Y, E138A, Q151M, y M184V. El RTV-955 tuvo mutaciones en E6D, K20R, V35I, A62V, D67N, T69D, V75I, F776, K101E, K103N, Y115F, F116Y, Q151M, I167V, Y181C, M184V, G190A, I202V, R211K, F214L, T215V, y K219Q. Las mutaciones en las posiciones 101, 103, 181 y 190 estuvieron presentes como una mezcla de aminoácidos naturales y mutantes en cada posición. El RTV-960 tuvo mutaciones en A33I, T39A, M41L, E44D, D67N, T69D, K103N, Q151M, M184I, G190A, L210W, R211K, T215Y, D218E, T240K, y A288S. Las mutaciones en A62V, V75I, F77L, F116Y, y Q151M ya habían sido anteriormente descritas como aquéllas que dan como resultado una resistencia cruzada de amplio espectro a los NRTI y se conocen como mutaciones de resistencia a múltiples fármacos (MDR) . Todos esos ADN de RTV tuvieron una o varias de esas mutaciones MDR. Además, algunos de los ADN de los RTV tuvieron mutaciones asociadas con la resistencia a la AZT (M41L, D67N, L210W, T215Y, y K2190) , resistencia a la ddC (T69D) , resistencia a NNRTI (K101E, K103N, Y181C, y G190A) , resistencia a 3TC (M184V) , o mutaciones previamente no caracterizadas (E6D, K20R, A33I, T39A, E44D, S68G, Y115F, I167V, E138A, G196A, I202V, T215V, D218E, y T240K) . Las mutaciones en V35I, R211K, y F214L son polimorfismos conocidos de las variantes naturales (sensibles al fármaco) del VIH.

Mutagénesis dirigida al sitio Se construyeron vectores de pruebas de resistencia que contenían la mutación Q151M únicamente y en combinación con mutaciones de resistencia al fármaco V75I que se sabe modulan la susceptibilidad del VIH a los NRTI. Las mutaciones fueron introducidas en el vector de prueba de resistencia utilizando el método de PCR con megacebador para la mutagénesis dirigida al sitio. (Sakar G y Sommar SS (1994) Biotechniques 8(4), 404-407). Se probó un vector de prueba de resistencia que contenía la mutación Q151M (Q151M-RTV) utilizando ensayo de susceptibilidad fenotípica descrito anteriormente y los resultados fueron comparados con un vector de prueba de resistencia definido genéticamente que era el tipo natural en la posición 151. El patrón de susceptibilidad fenotípica al NRTI, d4T y Q151M-RTV estuvo alterado en comparación con el natural. Con el contexto de un antecedente natural de otro tipo (es decir, mutación Q151M sola) , el Q151M-RTV fue menos susceptible a la d4T que el RTV control natural. También se observaron cambios significativos en la susceptibilidad a la AZT, ddC y ddl en el Q151M-RTV. La mutación Q151M también fue introducida en un RTV que contenía una mutación en V75I. La adición de la mutación V75I sobre Q151M antecedente dio como resultado un incremento en la susceptibilidad a la AZT y una disminución en la susceptibilidad a la d4T. La mutación V75I sola no tuvo efecto sobre la susceptibilidad a la d4T y dio como resultado un incremento en la susceptibilidad a la AZT. También se construyeron RTV que contenían mutaciones en A62V únicamente y en combinación con la V75I. Esos RTV no mostraron diferencias en su susceptibilidad a la d4T, en comparación con una RTV natural, sin embargo, ambos mostraron un ligero incremento en la susceptibilidad a la AZT.

EJEMPLO 4 Correlación de la Susceptibilidad Fenotípica y el Análisis Genotípico: Resistencia a la d4T asociada con Inserciones en el Aminoácido 69 en la Transcriptasa Inversa Análisis Fenotípico de los vectores de prueba de Resistencia de los Pacientes 97-621, 97-285, 98-690, 98-770 y 98-771 Los vectores de prueba de resistencia se construyeron como se describió en el Ejemplo 1 a partir de muestras de pacientes designados 97-621, 97-285, 98-690, 98-770 y 98-771. Las muestras de los pacientes 285 y 690 son muestras en serie obtenidas del mismo paciente a intervalos de 6 meses. Los pacientes 285/690, 770 y 771 habían sido tratados previamente con regímenes que incluían d4T durante varios periodos de tiempo. La historia de exposición al fármaco para el paciente 621 se desconocía.

Historias de los Pacientes sobre muestras de Virus con Inserciones 69SSX El paciente VL#770 (JCW) fue tratado inicialmente con terapia con AZT. A continuación se agregó ddC al régimen, y los dos fármacos se dieron durante un periodo de aproximadamente 8 meses. Durante un periodo de 15 meses, el tratamiento fue desconocido y el paciente VL#770 (JCW) fue tratado durante aproximadamente 2 1/2 años con una combinación de AZT y 3TC. El paciente VL#285/690 (JWA) fue tratado con monoterapia con AZT durante aproximadamente 1 año y 9 meses antes de cambiar a la monoterapia con ddl durante un periodo de 8 meses. El regreso a la monoterapia con AZT durante 1 año 3 meses y a continuación fue tratado con ddC durante casi 2 años. El tratamiento fue cambiado a una combinación de AZT y 3TC durante casi un año y a continuación fue cambiado por una combinación de d4T/3TC/NFV durante un periodo de aproximadamente 9 meses. El paciente VL#771 (BMM) fue inicialmente tratado con una combinación de AZT, ddC y PRI, RTV. A continuación se agregó 3TC a esta combinación hasta que el tratamiento fue cambiado a d4T y RTV. Este tratamiento continuó durante aproximadamente 6 meses y a continuación fue cambiado a una combinación de 3TC/d4T/ddI y RTV. Hubo un periodo de aproximadamente 6 meses en el cual no se recibió tratamiento. Este fue seguido por tratamiento con ÁZT, 3TC y ddl. La combinación fue entonces cambiada a 3TC, d4T e IDV. El paciente VL#1057 (DHW) fue tratado con monoterapia con AZT durante aproximadamente 3 años antes de ser cambiado a la monoterapia con ddl durante un año. Hubo un periodo de aproximadamente 8 meses en el cual no se recibió tratamiento. Este fue seguido por el tratamiento con AZT y 3TFC durante 1 año. El tratamiento con AZT continuo pero la 3TC fue reemplazada por d4T y se agregó PRI, IDV. La d4T fue cambiada nuevamente a 3TC durante un periodo breve hasta que fue reemplazada por el NNRTI, DEL. El aislamiento del ARN viral y RT/PCR se utilizaron para generar los segmentos derivados del paciente que comprendían las secuencias virales que codifican para toda la PR y los aa 1-313 de la RT. Los segmentos derivados del paciente fueron insertados en un vector viral del gen indicador de vectores de prueba de resistencia designados como RTV-621, RTV-285, RTV-690, RTV-770 y RTV-771. Las RTV fueron probados utilizando susceptibilidad fenotípica para determinar exacta y cuantitativamente el nivel de susceptibilidad de un panel de fármacos antirretrovirales. Este panel de fármacos antirretrovirales comprendió miembros de las clases conocidas como NRTI (AZT, 3TC, d4T, ddl, ddC, y abacavir), NNRTI (delavirdina y nevirapina), y PRI (indinavir, nelfinavir, ritonavir y saquinavir) . Se determinó una CI50 para cada fármaco probado. La susceptibilidad del virus del paciente a cada fármaco se examinó y comparó con patrones de susceptibilidad conocidos. Se observó una disminución a la susceptibilidad a la d4T en comparación con un RTV control natural en cada uno de esos protocolos de RTV. Las muestras de paciente se examinaron aún más para cambios genotípicos que pudieron estar asociados con el patrón observado de susceptibilidad a la d4T.

Determinación del genotipo de los ADN de RTV de los pacientes Los ADN de RTV se analizaron por secuenciamiento automatizado del terminador de la cadena ABI. La secuencia nucleotídica fue comparada con la secuencia de consenso de un VIH-1 clase B natural (HIV Sequence Datábase Los Alamos, NM) . La secuencia nucleotídica fue examinada para secuencias que sean diferentes de la secuencia control. El RTV-621 tuvo mutaciones en M41L, A62V, T69SSS*, V75M, M184V, L210W y T215Y. La mutaciones del RTV-621 en las posiciones 41, 62 y 75 estuvieron presentes con una mezcla de aminoácidos naturales y mutantes en cada posición. El RTV-285 tuvo mutaciones en M41L, A62V, T69SSA, L74V, A158S, I1778M, M184V, T200A, L210W y T215Y. El RTV-690 tuvo mutaciones en K20R, M41L, A62V, T69SSA, L74V, A158S, I178M, Y181C, G190A, L210W y T215Y. Las mutaciones de las posiciones 158 y 181 estuvieron presentes como una mezcla de aminoácido naturales y mutantes en cada posición. El RTV-770 tuvo mutaciones en V21I, M41L, T69SSG, V75M, K102M, K103R,V179I, M184V, T215Y, V241L, L283I, y E297R. Las mutaciones en las posiciones 69 y 75 estuvieron presentes como una mezcla de aminoácidos naturales y mutantes en cada posición. El RTV-771 tuvo mutaciones en E6D, V35I, M41L, T69SSS, V75M, I135V, Q174R, D177E, M184V, T200I, L210W, R211K, T215Y, R284K, A288S, y E291D. Las mutaciones en las posiciones 174 y 200 estuvieron presentes en una mezcla de aminoácidos naturales y mutantes en cada posición. Todos los ADN del RTV tuvieron una inserción inusual de aminoácidos extra en o alrededor de la posición 69 de la transcriptasa inversa. La descripción se describió aquí como T69SSX, donde X indica una glicina (G) , una serina (S) o una alanina (A) . La mutación en A62V ha sido previamente descrita como un miembro de las mutaciones de resistencia a múltiples fármacos (MDR) que contribuyen a la resistencia cruzada de alto espectro a los NRTI como se describió en el ejemplo 3. Además, todos los ADN de RTV tuvieron un subconjunto de las mutaciones asociadas con la resistencia a la AZT (M41L, D67N, L210W, T215Y y K219Q) , resistencia a la ddC (L74V, L74I, T69D) , resistencia a NNRTI (K103N, Y181C, y G190A) , resistencia la 3TC (M184V) , o mutaciones previamente no caracterizadas (V75M, A158S, K20R, V21I, K102M, V179I, V241L, 12831, E297R, E6D, Q174R, D177E, R284K, A288S, E291D) . Las mutaciones en V35I, K103R, I135V, D177E, I178M, V179I, T200A/I, R211K, y F214L son polimorfismos observados anteriormente de las variantes (sensibles a los fármacos del VIH.

Mutagénesis Inversa Se examinó adicionalmente el papel de la mutación T69SSX en la resistencia a la d4T por el procedimiento comúnmente conocida como mutagénesis inversa. Se aisló una clona funcional del RTV-285 unido que contenía las siguientes mutaciones (M41L, A62V, T69SSA, L74V, A158S, I178M, M184V, T200A, L210W, y T215Y) en la RT. Se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para cambiar específicamente el triplete "SSA" a una sola treonina (T) en la posición 69. Esta reversión, 285-1 (SSA69T) contenía todas las mutaciones presentes en la clona 285-1 excepto por la inserción de SSA en la posición 69. La reversión 285-1 (SSA69T) mostró un incremento significativo en la susceptibilidad tanto a d4T (tres veces) como a la AZT (30 veces) . La evidencia adicional para el papel de la inserción de T69SSX en la resistencia a NRTI proviene del examen de clonas individuales aisladas del RTV-770 reunido. Estuvieron presentes dos clases de clonas en el RTV-770 reunido: la primera clase contenía mutaciones en V21I, M41L, K102M, K103R, V179I, M184V, T215Y, V241L, L283I, y E297R, la segunda clase contenía todas las mutaciones presentes en la primera clase y además tuvo mutaciones en T69SSG y V75M. La segunda clase de mutaciones, aquéllas con mutaciones en 69 y 75, mostraron incrementos significativos a la susceptibilidad a d4T (cuatro veces) y AZT (30 veces) .

Mutagénesis dirigida al sitio Se construyeron vectores de prueba de resistencia que contenían la mutación P69SSA únicamente y en combinación con otras mutaciones de resistencia a fármacos que se sabía o sospechaba modulaban la susceptibilidad del VIH a los NRTI. Las mutaciones fueron introducidas en el vector de prueba de resistencia utilizando el método de PCR con megacebador para la mutagénesis dirigida al sitio. (Sakar G y Sommar SS (1994) Biotechniques 8(4), 404-407). Se probó un vector de prueba de resistencia que contenía la mutación P69SSA (T69SSA-RTV) utilizando el ensayo de susceptibilidad fenotípica descrito anteriormente y los resultados se compararon con los de un vector de prueba de resistencia definido genéticamente que era natural (T) en la posición 69. El T69SSA-RTV mostró una disminución de dos veces en la susceptibilidad a la d4T en comparación con un RTV natural. También se observó un cambio pequeño pero significativo en la susceptibilidad a la AZT en el T69SSA-RTV. La mutación T69SSSA también fue introducida en un RTV que contenía un mutación en V75I. La adición de la mutación V75I sobre la T69SSA antecedente dio como resultado un incremento en la susceptibilidad a la AZT y una disminución en la susceptibilidad a la d4T. La mutación V75I sola no tuvo efecto sobre la susceptibilidad a la d4T y dio como resultado un incremento en la susceptibilidad a la AZT. La mutación T69SSSA también fue introducida en un RTV que contenía un mutación en A62V. La mutación A62V sola no tuvo efecto en la susceptibilidad a ninguno de los inhibidores de la RT probados. La adición de la mutación A64V a la T69SSA antecedente no tuvo efecto sobre la susceptibilidad a la d4T pero dio como resultado una disminución significativa en la susceptibilidad a la AZT (6 veces) .

Se construyó un RTV que contenía mutaciones en A62V, T69SSA, y V75I. El mutante triple mostró únicamente una pequeña disminución en la susceptibilidad a la AZT (2 veces) (la misma que T69SSA sola) y un pequeño (menos de 2 veces) incremento en la susceptibilidad a la AZT. Se construyeron RTV que contenían la inserción T69SSA en conjunto con las mutaciones de resistencia a la AZT y la mutación de resistencia a la AZT M41L, A62V, T215Y y la mutación de resistencia a la 3TC M184V en varias combinaciones. El RTV que contiene mutaciones en M41L, T69SSA y T215Y mostró una disminución significativa en la susceptibilidad tanto a la d4T (5 veces) como a la AZT (160 veces) . La adición de una mutación A64V sobre este antecedente hizo disminuir aún más la susceptibilidad tanto a la d4T (10 veces) como a la AZT (>1000 veces) . La presencia es la mutación M184V no tuvo efecto sobre la susceptibilidad a la d4T pero causó un incremento en la susceptibilidad a la AZT. Se construyó un vector de prueba de resistencia que contenía mutaciones en M41L, T69SSA, T215Y y L210W. La introducción de la mutación L210W en un RTV que contenía las tres mutaciones (M41L, T69SSA, y T215Y) dio como resultado una disminución sustancial en la susceptibilidad a la AZT (mayor de 1000 veces) en comparación con una disminución de 140 veces en la susceptibilidad observada para la AZT en M41L-T69SSA-T215Y-RTV. La mutación L210W tuvo poco efecto sobre la susceptibilidad a los otros NRTI cuando se comparó con M41L-T69SSA-T215Y-RTV. Esa disminución en las susceptibilidades al ddc (3 veces), ddl (3.5 veces), 3TC (17 veces), d4T (10 veces), y abacavir (14 veces) observada para M41L-T69SSA-T215Y-RTV cambió sólo ligeramente cuando se comparó con M41L-T69SSA-T215Y-RTV. La mutación L210W no tuvo efecto adicional sobre la susceptibilidad a los NRTI, DEL (0.13 veces) y NEV (0.42 veces), comparada con M41L-T69SSA-T215Y-RTV, el cual también presentó un ligero incremento a la susceptibilidad a la DEL y NEV. Se construyó un RTV que contenía cuatro mutaciones: M41L, A62V, T69SSA y T215Y. Este vector, M41L-A62V-T69SSA-T215Y-RTV presentó una disminución sustancial en la susceptibilidad a la AZT (mayor de 1000 veces), susceptibilidad natural al ddC (2.1 veces), una ligera disminución a la susceptibilidad a la ddl (3 veces) , una ligera disminución a la susceptibilidad a la 3TC (8 veces), una ligera disminución a la susceptibilidad a la d4T (8 veces), y una ligera disminución a la susceptibilidad al abacavir (10 veces) . El vector presentó un incremento a la susceptibilidad de los NRTI, DEL (0.2 veces) y NEV (0.8 veces).

La mutación L210W también se introdujo en el vector que contenía las cuatro mutaciones; M41L, A62V, T69SSA y T215Y. Este vector, M41L-A62V-T69SSA-T215Y-RTV presentó una disminución sustancial en la susceptibilidad a la AZT (mayor de 1000 veces) , una ligera disminución a la susceptibilidad al ddC (2.1 veces), una ligera disminución a la susceptibilidad al ddl (3 veces) , una disminución moderada en la susceptibilidad a la 3TC (22 veces) , una disminución moderada en la susceptibilidad a la d4T (13 veces), y una disminución moderada en la susceptibilidad al abacavir (16 veces). El vector presentó un incremento a la susceptibilidad a los NRTI, DEL (0.2 veces) y NEV (0.6 veces)'. Las susceptibilidades observadas para M41L-A62V-T63SSA-T215Y-RTV fueron similares a aquéllas observadas para el vector que contiene las mutaciones M41, A62V, T69SSA, y T215Y pero que carece de la mutación L210W. La mutación T215Y también se introdujo en un vector que contenía las mutaciones, A62V y T69SSA. La introducción de la mutación T215Y dio como resultado una disminución sustancial en la susceptibilidad a la AZT (1000 veces) comparada con la de A62V-T69SSA-RTV, la cual presentó sólo una ligera disminución en la susceptibilidad a la AZT (7 veces) . La susceptibilidad a los otros inhibidores fue similar a las susceptibilidades observadas para el vector sin la mutación T215Y. El A62V- T69SSA-T215Y-RTV presentó susceptibilidad natural a la ddC (1.3 veces), una ligera disminución en la susceptibilidad a la ddl (2.5 veces), una disminución moderada a la susceptibilidad a la 3TC (15 veces) , una ligera disminución en la susceptibilidad a la d4T (7 veces) y una ligera disminución en la susceptibilidad al abacavir (10 veces) . El vector presentó incrementos en la susceptibilidad a ambos NNRTI, DEL (0.3 veces) y NEV (0.6 veces) . La mutación L74V también se introdujo en un vector que contenía las mutaciones, A62V y T69SSA. La susceptibilidad a los inhibidores probados fue similar a las susceptibilidades observadas para el vector sin la mutación L74V y similar al vector que contenía la mutación T215Y junto con las mutaciones A62V y T69SSA. El mayor cambio fue una desviación de la susceptibilidad de regreso a la natural observada para la AZT en el A62V-T69SSA-L74V-RTV. El A62V-T69SSA-L74V-RTV presentó susceptibilidad natural a la ddC (1.8 veces), susceptibilidad natural a la ddl (1.9 veces), una ligera disminución en la susceptibilidad a la 3TC (2.5 veces), susceptibilidad natural a la d4T (1.5 veces), y una ligera disminución en la susceptibilidad al abacavir (3 veces) . El vector presentó ligeras disminuciones en la susceptibilidad a ambos NNRTI, DEL (0.4 veces) y NEV (0.3 veces) . Se construyó un RTV que contenía mutaciones: M41L, T69SSA, T215Y, L210W y V75M. La introducción de la mutación V75M en un RTV que contenía las otras cuatro mutaciones (M41L, T69SSA, L210W y T215Y) tuvo poco efecto sobre las susceptibilidades en comparación con el vector sin la mutación V74M. El M41L-T69SSA-T215Y-L210W-V75M-RTV presentó una disminución sustancial en la susceptibilidad a la AZT (mayor de 1000 veces) , una ligera disminución en la susceptibilidad a la ddC (2.9 veces), una ligera disminución en la susceptibilidad a la ddl (3.5 veces), una disminución moderada en la susceptibilidad a la 3TC (17 veces) , una disminución moderada en la susceptibilidad a la d4T (11 veces) , y una disminución moderada en la susceptibilidad al abacavir (19 veces) . El vector presentó un incremento en la susceptibilidad de los NNRTI, DEL (0.25 veces) y NEV (0.5 veces).

Ejemplo 5 Correlación de la Susceptibilidad Fenotípica y el Análisis Genotípico: Resistencia a la d4T Asociada con Combinaciones Complejas de Múltiples Mutaciones de Resistencia a la AZT Análisis Fenotípico de los Vectores de Prueba de Resistencia de los Pacientes 98-757, 98-844, 98-937, 98- 964 y 98-966. Se construyeron los vectores de prueba de resistencia como se describió en el ejemplo 1 a partir de muestras de un paciente designado como 98-757, 98-844, 98-937, 98-964 y 98-966. Todos esos pacientes habían sido previamente tratados con regímenes que incluían d4T durante varios periodos de tiempo. Se utilizó el aislamiento del ARN viral y RT/PCR para generar segmentos derivados del paciente que comprendían las secuencias virales que codificaban para toda la PR y los aa 1-313 de la RT. Los segmentos derivados del paciente fueron insertados en un vector viral del gen indicador para generar vectores de prueba de resistencia designados como RTV-757, RTV-844, RTV-937, RTV-964 y RTV-966. Los RTV fueron probados utilizando un ensayo de susceptibilidad fenotípica para determinar exacta y cuantitativamente el nivel de susceptibilidad a un panel de fármacos antirretrovirales. Este panel de fármacos antirretrovirales comprendió miembros de las clases conocidas como NRTI (AZT, 3TC, d4T, ddl, ddC y abacavir), NNRTI (delavirdina, y nevirapina) , y PRI (indinavir, nelfinavir, ritonavir, y saquinavir) . Se determinó una CI50 para cada fármaco probado. La susceptibilidad del virus del paciente a cada fármaco se examinó y comparó con patrones de susceptibilidad conocidos. Se observó una disminución a la susceptibilidad a la d4T comparada con el RTV natural en cada uno de esos RTV reunidos. Las muestras de los pacientes se examinaron adicionalmente para cambios genotípicos que pudieran estar asociados con el patrón observado de susceptibilidad a la d4T.

Determinación del Genotipo de los ADN de los RTV de los Pacientes El ADN de los RTV se analizaron por secuenciamiento automatizado con terminador de cadena ABI. La secuencia nucleotídica fue comparada con la secuencia de consenso de un VIH-1 clase B natural (HIV Sequence Datábase Los Alamos, NM) . La secuencia nucleotídica fue examinada para encontrar secuencias que son diferentes a la secuencia control. El RTV-757 tuvo mutaciones en V35I, D67N, T69D, K70R, V106A, V108I, L109V, Y181C, V189L, T200A, I202T, R211K, T215F, D218E, K219Q, H221Y, L228H, L283I y R284K. Las mutaciones en las posiciones 106, 108 y 109 estuvieron presentes como una mezcla de aminoácidos naturales o mutantes en cada posición. El RTV-844 tuvo mutaciones en M41L, D67N, I135V, L210W, T215Y, y K219N. El RTV-937 tuvo mutaciones en P1L, P9R, K20R, V35T, K64Y, D67N, K70R, V75M, G99R, I135V, K173E, Y188L, R211H, T215F, D21E, y K219Q. El RTV- 964 tuvo mutaciones en M41L, K43E, D67N, K70R, L74I, V75S, Y181I, R211T, T215Y, D218E, y K219Q. El RTV-966 tuvo mutaciones en K20R, T39D, M41L, E44D, D67N, L74V, A98S, V118I, I135T, K166R, K173T, M184V, G196E, L210W, R211K, T215Y, D218E, K219R, L228H, V245E, K277R, T286A, A288T, V293I. Todos esos ADN de RTV tuvieron un o varias mutaciones previamente asociadas con la resistencia a AZT (M41L, D67N, L210W, T215F/Y, y K219Q/R) , resistencia a la ddC (T69D, L74I/V) , resistencia a NNRTI (V106A, V108I, Y181C/I, y Y188L), resistencia a los 3TC (M184V) , o mutaciones previamente no caracterizadas (P1L, P9R, K20R, T39D, K43E, E44D, K64Y, V75M/S, G99R, L109V, V118I, K173E/T, I120T, R211H/T, D218E, K219N, H221Y, L228H, L283I, R284K, y A288T) . Las mutaciones en (V35I/T, A98S, I135V/T, K166R, G196E, T200A, R211K, F214L, V245E, K277R, T286A, y V293I) son polimorfismos conocidos de las variantes naturales (sensibles a fármacos) del VIH. Las mutaciones responsables de la disminución de la susceptibilidad a la d4T de esas muestras de pacientes no son obvias. Existen muestras de pacientes que contiene muchas de las mismas mutaciones encontradas en esos pacientes que no muestras disminución de la susceptibilidad a la d4T.

Mutagénesis dirigida al sitio Se construyeron vectores de prueba de resistencia que contenían cinco (M41L, D67N, K70R, T215Y, K219Q) o seis (M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y, K219Q) mutaciones asociadas con resistencia a la AZT por mutagénesis dirigida al sitio. Se determinó la susceptibilidad fenotípica a los NRTI. Se observó una disminución significativa a la susceptibilidad a la AZT (75 - 180 veces) y d4T (2 veces) en esos RTV.

Ejemplo 6 Predicción de la Respuesta a los Inhibidores Nucleosídicos de la Transcriptasa Inversa Mediante la Caracterización de Cambios de Aminoácido en la Transcriptasa Inversa del VIH-1 Correlación fenotípica y genotípica de mutaciones en el aminoácido 69 de la Transcriptasa Inversa del VIH-1 En una modalidad de esta invención, se evaluaron cambios en el aminoácido en la posición 69 de la proteína transcriptasa inversa del VIH-1 utilizando el siguiente método que comprende: (1) recolectar una muestra biológica de un sujeto infectado con VIH-1; (ii) evaluar si la muestra biológica contiene ácido nucleico que codifica para la transcriptasa inversa del VIH-1 que tiene una mutación en el codón 69. Una reducción en la susceptibilidad a d4T y una disminución a la susceptibilidad a la AZT está correlacionada con la presencia de una mutación en el codón 69 (T69SSX) sola o sobre un antecedente de otras mutaciones de resistencia a NRTI (por ejemplo M41L, A62V, D67N, K70R, L74V, V57I/M, T215Y/F, K219Q) . La muestra biológica comprende sangre completa, componentes de la sangre incluyendo células nucleares periféricas (PMBC), suero, plasma (preparado utilizando varios anticoagulantes como EDTA, citrato ácido-dextrosa, heparina) biopsias tisulares, fluidos cerebroespinal (CSF) , u otras células, tejidos o fluidos corporales. En otra modalidad, el ácido nucleico del VIH-1 (ARN genómico) o proteína transcriptasa inversa puede aislarse directamente de la muestra biológica o después de la purificación de partículas de virus de la muestra biológica. La evaluación de sí el aminoácido en la posición 69 de la transcriptasa del VIH-1 utó, puede efectuarse utilizando varios métodos, tales como la caracterización directa del ácido nucleico viral que codifica para la transcriptasa inversa o la caracterización directa de la proteína transcriptasa inversa en sí. La definición del aminoácido en la posición 69 de la transcriptasa inversa puede efectuarse por caracterización directa de la proteína transcriptasa inversa por metodologías de secuenciamiento de aminoácidos convencionales o novedosos, reconocimiento de epitopos por anticuerpo u otras proteínas o compuestos de unión específica, de manera alternativa, el aminoácido en la posición 69 de la proteína transcriptasa inversa del VIH-1 puede ser definido caracterizando copias amplificadas del ácido nucleico del VIH-1 que codifica para la proteína transcriptasa inversa. La amplificación del ácido nucleico del VIH-1 puede efectuarse utilizando una variedad de metodologías incluyendo la transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) , NASBA, SDA, RCR, o 3SR como sería sabido por los expertos en la técnica. La evaluación de si el ácido nucleico que codifica para la transcriptasa inversa del VIH tiene una mutación en el codón 69 puede efectuarse por secuenciamiento directo del ácido nucleico utilizando varias metodologías de terminación de la cadena por extensión del cebador (Sanger, ABI/PE y Genética Visible) o escisión de la cadena (Maxam y Gilbert) o métodos de secuenciamiento desarrollados más recientemente tales como el tiempo de la ionización de la desorción con láser ayudada por una matriz al vuelo (MALDI-TOF) o espectometría de masas (Sequenom, Gene Trace Systems) . De manera alternativa, la secuencia del ácido nucleico que codifica para el aminoácido de la posición 69 puede ser evaluada utilizando una variedad de metodologías de hibridación de sonda, tales como el secuenciamiento de hibridación genechip (Affymetrix) , ensayo de sonda lineal (LiPA; Murex) e hibridación diferencial (Chiron) . En una modalidad preferida de esta invención, la evaluación de si el aminoácido de la posición 69 de la transcriptasa inversa del VIH-1 era natural o mutante se llevó a cabo utilizando un ensayo de susceptibilidad fenotípica que utiliza ADN del vector de prueba preparado de la muestra biológica. En una modalidad, se recolectó muestra de plasma, se codificó en el ARN viral, y se utilizó la metodología RT-PCR para amplificar un segmento derivado del paciente que codifica para las regiones de la proteasa y transcriptasa inversa del VIH-1. Los segmentos derivados del paciente amplificados fueron entonces incorporados, vía ligación del ADN y transformación bacteriana, en un vector viral del gen indicador, generando por lo tanto un vector de prueba de resistencia. Se aisló el ADN del vector de prueba de resistencia del cultivo bacteriano y se llevó a cabo un ensayo de susceptibilidad fenotípica como se describió en el ejemplo 1. Los resultados del ensayo de susceptibilidad fenotípica con muestras de paciente que tienen una mutación/inserción T69SSX se muestran en la Figura 5. La secuencia de ácido nucleico (ADN) del paciente derivado de las regiones de la proteasa y transcriptasa inversa del VIH-1 de las muestras de los pacientes 621, 690, 770, 771 se determinó utilizando una metodología de secuenciamiento del ciclo de terminación de la cadena con detección por fluorescencia (ABI/PE) . El método se utilizó para determinar una secuencia de ácido nucleico de consenso que representa la combinación de secuencias de la mezcla de variantes de VIH-1 que existen en una muestra objeto (que representa las cuasiespecies) , y para determinar las secuencias de ácido nucleico de variantes individuales. Los perfiles de susceptibilidad fenotípica de las muestras de los pacientes y los mutantes dirigidos al sitio mostraron una reducción significativa a la susceptibilidad a la d4T (resistencia incrementada) , susceptibilidad a la AZT correlacionada con una mutación en la secuencia de ácido nucleico que codifica para los aminoácidos serína, serina, serina (SSS) , serina, serina, alanina (SSA) o serina, serina, glicina (SSG) en la posición 69 de la transcriptasa inversa del VIH-1 y la presencia de mutaciones en algún subconjunto de las posiciones descritas anteriormente. Esas posiciones incluyen a aquéllas previamente asociadas con resistencia a NRTI (41, 67, 70, 74, 75, 184, 210, 215, y 219) o las otras posiciones que se observaron mutaron en esos pacientes que no habían sido previamente caracterizadas (1, 6, 9, 20, 21, 3, 39, 43, 44 , 64, 68, 99, 109, 115, 118, 138, 158, 167, 173, 174, 177, 179, 196, 202, 211, 218, 221, 228, 240, 241, 283, 284, 288, 291, 297) . Los perfiles de susceptibilidad fenotípica de las muestras de los pacientes con inserciones en 69 mostraron disminución en la susceptibilidad a la AZT, 3TC, ddC, ddl, d4T, y abacavir.

Correlación fenotípica y fenotípica de mutaciones en los aminoácidos 62, 75, 77, 116 y 151 de la Transcriptasa Inversa del VIH-1 Los perfiles de susceptibilidad fenotípica de muestras de paciente y mutantes dirigidos al sitio mostraron disminución a la susceptibilidad a los NRTI (AZT, ddC, ddl, 3TC, d4T y abacavir) cuando las posiciones 62, 75, 77, 116 y 151 o algún subconjunto de esas posiciones contenías los aminoácidos 62V, 751, 77L, 116F o 151M en la transcriptasa inversa de VIH-1. La presencia de mutaciones adicionales en las posiciones 41, 67, 69, 184, 210, 215 y 219 podría modificar aún más (hacer aumentar o diminuir) la susceptibilidad a los NRTI.

Correlación fenotípica y genotípica de las mutaciones previamente asociadas con resistencia a la AZT para la resistencia a la d4T en la transcriptasa inversa del VIH-1 Los perfiles de susceptibilidad fenotípica de las muestras de los pacientes y las muestras dirigidas al sitio mostraron disminuciones significativas en la susceptibilidad a d4T cuando las mutaciones estuvieron presentes en mutaciones previamente correlacionadas con pérdida de susceptibilidad a la AZT (41, 67, 70, 210, 215 y 219) y también en algún subconjunto de posiciones previamente correlacionadas con la pérdida de susceptibilidad a otros NRTI (74, 75, 184) o con mutaciones previamente no caracterizadas observadas en los virus de los pacientes descritos anteriormente (1, 6, 9, 20, 21, 33, 39, 43, 44, 64, 68, 99, 109, 115, 118, 138, 158, 167, 173, 174, 177, 179, 196, 202, 211, 218, 221, 228, 240, 241, 283, 284, 288, 291, 297) .

Tabla de fenotipos asociados con mutaciones específicas introducidas en RTV Reducción del número de veces promedio en el susceptibilidad observada en vectores de prueba de resistencia basados en el VIH que contienen mutaciones específicas (número de réplicas probadas) Reducción del número de veces promedio en el susceptibilidad observada en vectores de prueba de resistencia basados en el VIH que contienen mutaciones específicas (número de réplicas probadas) (continuación) Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada, invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para evaluar la efectividad de la terapia antirretroviral nucleosídica de la transcriptasa inversa de un paciente infectado por VIH, caracterizado porque comprende: (a) recolectar una muestra de plasma de un paciente infectado por VIH; y (b) evaluar si la muestra de plasma contiene el ácido nucleico que codifica para la transcriptasa inversa del VIH que contiene una mutación/inserción en el codón 69; en el cual la presencia se correlaciona con una disminución en la susceptibilidad a la d4T.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la mutación/inserción en el codón 69 codifica para una serina-serina-alanina .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la mutación/inserción en el codón 69 codifica para una serina-serina-glicina.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la mutación/inserción en el codón 69 codifica para una serina-serina-serina .

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la transcriptasa inversa tiene mutaciones adicionales en el codón 41 y en el codón 215.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la mutación en el codón 41 codifica para una leucina (L) y la mutación en el codón 215 codifica para una tirosina (Y) .

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente infectado por VIH está siendo tratado con un agente antírretroviral.

8. Un método para evaluar la efectividad de la terapia antirretroviral de un paciente infectado por VIH, caracterizado porque comprende: (a) recolectar una muestra biológica en paciente infectado por VIH; y (b) evaluar si la muestra biológica comprende el ácido nucleico que codifica para la transcriptasa inversa del VIH que tiene una mutación en uno o más codones seleccionado del grupo que consiste de 62, 75, 77, 116 y 151; en la cual la presencia de la mutación se correlaciona con una disminución en la susceptibilidad a la d4T.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el codón mutante 62 codifica para una valina (V) .

10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el codón mutante 75 codifica para una isoleucina (I) .

11. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el codón mutante 77 codifica para una leucina (L) .

12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el codón mutante 116 codifica para una tirosina (Y) .

13. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el codón mutante 151 codifica para una metionina (M) .

14. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el paciente infectado por VIH está siendo tratado por un agente antirretroviral .

15. El método de ' conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la transcriptasa inversa tiene una mutación adicional en uno o más codones seleccionados del grupo que consiste de 41, 67, 210, 215, 219, 184, 69 y 215 o una combinación de los mismos.

16. El método para evaluar la efectividad biológica de un compuesto farmacéutico antirretroviral para el VIH candidato, caracterizado porque comprende: (a) introducir un vector de prueba de resistencia que comprende un segmento derivado del paciente que comprende además una mutación en uno o más codones seleccionados del grupo que consiste de 62, 75, 77, 116 y 151 y una mutación en uno o más codones seleccionado del grupo que consiste de 41, 67, 210, 215, 219, 184, y/o 69 y un gen indicador en una célula huésped; (b) cultivar la célula huésped del paso (a) ; (c) medir el indicador en una célula huésped objetivo; y (d) comparar la medición del indicador del paso (c) con la medición del indicador medido cuando los pasos (a) - (c) se llevan a cabo en ausencia del compuesto farmacéutico antirretroviral candidato; donde una concentración de prueba del compuesto farmacéutico antirretroviral candidato está presente en los pasos (a) - (c) ; en los pasos (b) - (c) ; o en el paso (c) .

17. Un método para evaluar la efectividad biológica de un compuesto farmacéutico antirretroviral para el VIH candidato caracterizado porque comprende : (a) introducir un vector de prueba de resistencia que comprende un segmento derivado el paciente que comprende además una mutación/inserción en el codón 69 y una mutación en los codones 41 y 215 y un indicador en una célula huésped; (b) cultivar la célula huésped del paso (a) ; (c) medir el indicador en una célula huésped objetivo; y (d) comparar la medición del indicador del paso (c) con la medición del indicador medida cuando los pasos (a) - (c) se llevan a cabo en ausencia del compuesto farmacéutico antirretroviral candidato; donde una concentración del compuesto farmacéutico antirretroviral candidato está presente en los pasos (a) - (c) ; en los pasos (b) - (c) ; o en el paso (c) .

18. Un vector de prueba de resistencia, caracterizado porque comprende un segmento derivado de un paciente con VIH que comprende además la transcriptasa inversa que tiene una mutación en el codón 69 y un gen indicador, donde la expresión del gen indicador depende del segmento derivado del paciente.

19. Un vector de prueba de resistencia, caracterizado porque comprende un segmento derivado de un paciente con VIH que comprende además la transcriptasa inversa que tiene una mutación en uno o más codones seleccionados del grupo que consiste de 62, 75, 77, 116 y 151 y un gen indicador, donde la expresión del gen indicador depende del segmento derivado del paciente.

20. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la transcriptasa inversa tiene mutaciones adicionales en el codón 210.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la mutación en el codón 216 codifica para un triptófano (W) .

22. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la transcriptasa inversa tiene mutaciones adicionales en el codón 62.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la mutación en el codón 62 codifica para una valina (V) .

24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la transcriptasa inversa tiene mutaciones adicionales en' el codón 210.

25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la mutación en el codón 210 codifica para una triptófano (W) .

26. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la transcriptasa inversa tiene mutaciones adicionales en el codón 75.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la mutación en el codón 75 codifica una serina (S) o una metionina (M) .

28. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la transcriptasa inversa tiene mutaciones adicionales en el codón 62 y en el codón 215.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la mutación en el codón 62 codifica para una valina (V) y la mutación en el codón 215 codifica para una tirosina (Y) .

30. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la transcriptasa inversa tiene mutaciones adicionales en el codón 62 y en el codón 74.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la mutación en el codón 62 codifica para una valina (V) y la mutación en el codón 74 codifica para una valina (V) .