PL186473B1 - Sposób oceny in vitro chemioterapii HIV u pacjentów HIV dodatnich oraz sposób oznaczania fenotypowej wrażliwości lekowej poszczególnych szczepów HIV u pacjenta na inhibitory co najmniej dwóch enzymówkodowanych przez gen pol HIV - Google Patents
Sposób oceny in vitro chemioterapii HIV u pacjentów HIV dodatnich oraz sposób oznaczania fenotypowej wrażliwości lekowej poszczególnych szczepów HIV u pacjenta na inhibitory co najmniej dwóch enzymówkodowanych przez gen pol HIVInfo
- Publication number
- PL186473B1 PL186473B1 PL97328069A PL32806997A PL186473B1 PL 186473 B1 PL186473 B1 PL 186473B1 PL 97328069 A PL97328069 A PL 97328069A PL 32806997 A PL32806997 A PL 32806997A PL 186473 B1 PL186473 B1 PL 186473B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hiv
- inhibitors
- patient
- protease
- wild
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 121
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 68
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 86
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 82
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 74
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 37
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 34
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 29
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 26
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 claims description 24
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 claims description 24
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 16
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 15
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 claims description 14
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 13
- NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N Ritonavir Natural products C=1C=CC=CC=1CC(NC(=O)OCC=1SC=NC=1)C(O)CC(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229960000311 ritonavir Drugs 0.000 claims description 11
- NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N ritonavir Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N 0.000 claims description 11
- 229960001936 indinavir Drugs 0.000 claims description 10
- CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N indinavir Chemical compound C([C@H](N(CC1)C[C@@H](O)C[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H]2C3=CC=CC=C3C[C@H]2O)C(=O)NC(C)(C)C)N1CC1=CC=CN=C1 CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N 0.000 claims description 10
- NQDJXKOVJZTUJA-UHFFFAOYSA-N nevirapine Chemical compound C12=NC=CC=C2C(=O)NC=2C(C)=CC=NC=2N1C1CC1 NQDJXKOVJZTUJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229960001852 saquinavir Drugs 0.000 claims description 10
- QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N saquinavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN1C[C@H]2CCCC[C@H]2C[C@H]1C(=O)NC(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C1=CC=CC=C1 QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N 0.000 claims description 10
- ZNFFMCYSMBXZQU-NSHDSACASA-N 5-chloro-8-methyl-7-(3-methyl-but-2-enyl)-6,7,8,9-tetrahydro-2h-2,7,9a-triaza-benzo[cd]azulene-1-thione Chemical compound C1N(CC=C(C)C)[C@@H](C)CN2C(=S)NC3=CC=C(Cl)C1=C32 ZNFFMCYSMBXZQU-NSHDSACASA-N 0.000 claims description 9
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 claims description 9
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 9
- SWUARLUWKZWEBQ-VQHVLOKHSA-N phenethyl caffeate Chemical compound C1=C(O)C(O)=CC=C1\C=C\C(=O)OCCC1=CC=CC=C1 SWUARLUWKZWEBQ-VQHVLOKHSA-N 0.000 claims description 8
- SWUARLUWKZWEBQ-UHFFFAOYSA-N phenylethyl ester of caffeic acid Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C=CC(=O)OCCC1=CC=CC=C1 SWUARLUWKZWEBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229950011282 tivirapine Drugs 0.000 claims description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 229940124524 integrase inhibitor Drugs 0.000 claims description 7
- 239000002850 integrase inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 5
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 229960000689 nevirapine Drugs 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 claims description 3
- 108010002459 HIV Integrase Proteins 0.000 claims description 3
- PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N Mecamylamine hydrochloride Chemical compound Cl.C1CC2C(C)(C)C(NC)(C)C1C2 PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 claims description 3
- 230000001788 irregular Effects 0.000 claims description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 3
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- CJPLEFFCVDQQFZ-UHFFFAOYSA-N loviride Chemical compound CC(=O)C1=CC=C(C)C=C1NC(C(N)=O)C1=C(Cl)C=CC=C1Cl CJPLEFFCVDQQFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229950006243 loviride Drugs 0.000 claims description 2
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims 13
- 239000011435 rock Substances 0.000 claims 1
- AWGBKZRMLNVLAF-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-n,2-dihydroxybenzamide Chemical compound ONC(=O)C1=CC(Br)=CC(Br)=C1O AWGBKZRMLNVLAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 4
- 101150031639 IV gene Proteins 0.000 abstract 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 89
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 32
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 30
- 229960002555 zidovudine Drugs 0.000 description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 description 13
- XNKLLVCARDGLGL-JGVFFNPUSA-N Stavudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1C=C[C@@H](CO)O1 XNKLLVCARDGLGL-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 12
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 12
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 12
- WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N Zalcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 9
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 9
- 238000009104 chemotherapy regimen Methods 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- WHBIGIKBNXZKFE-UHFFFAOYSA-N delavirdine Chemical compound CC(C)NC1=CC=CN=C1N1CCN(C(=O)C=2NC3=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C3C=2)CC1 WHBIGIKBNXZKFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 101150104269 RT gene Proteins 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- BXZVVICBKDXVGW-NKWVEPMBSA-N Didanosine Chemical compound O1[C@H](CO)CC[C@@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 BXZVVICBKDXVGW-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 4
- ZDSRFXVZVHSYMA-CMOCDZPBSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZDSRFXVZVHSYMA-CMOCDZPBSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 3
- -1 ddl Chemical compound 0.000 description 3
- 229960002656 didanosine Drugs 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 3
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000002259 anti human immunodeficiency virus agent Substances 0.000 description 2
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 229960005319 delavirdine Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229940063627 rescriptor Drugs 0.000 description 2
- 229940064914 retrovir Drugs 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 229940098802 viramune Drugs 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 101000878595 Arabidopsis thaliana Squalene synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100067649 Caenorhabditis elegans gta-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101710170658 Endogenous retrovirus group K member 10 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710186314 Endogenous retrovirus group K member 21 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710162093 Endogenous retrovirus group K member 24 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710094596 Endogenous retrovirus group K member 8 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710177443 Endogenous retrovirus group K member 9 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010010369 HIV Protease Proteins 0.000 description 1
- 229940099797 HIV integrase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010016183 Human immunodeficiency virus 1 p16 protease Proteins 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 102100034347 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 102220570933 N-acetylgalactosamine-6-sulfatase_M41L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001536628 Poales Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241001303601 Rosacea Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 244000126002 Ziziphus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000008529 Ziziphus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 229960004748 abacavir Drugs 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000009096 combination chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000019700 dicalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000003084 hiv integrase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000003874 inverse correlation nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 description 1
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- WTTIBCHOELPGFK-LBPRGKRZSA-N r82150 Chemical compound C1N(CC=C(C)C)[C@@H](C)CN2C(=S)NC3=CC=CC1=C32 WTTIBCHOELPGFK-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 201000004700 rosacea Diseases 0.000 description 1
- 102200131341 rs267607614 Human genes 0.000 description 1
- 102220011161 rs727504317 Human genes 0.000 description 1
- 102200069353 rs8103142 Human genes 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229960001203 stavudine Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 108010068794 tyrosyl-tyrosyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 229960000523 zalcitabine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
- Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation
Abstract
Sposób oceny in vitro chemioterapii H IV u pacjentów H IV dodatnich o raz sposób oznaczania fenotypowej wrazliwosci lekowej poszczególnych szczepów H iV u pacjenta na inhibitory co najmniej dwóch enzymów kodowanych przez gen pol H IV PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku są sposób oceny in vitro chemioterapii HIV u pacjentów HIV dodatnich oraz sposób oznaczania fenotypowęj wrażliwości lekowej poszczególnych szczepów HIV u pacjenta na inhibitory co najmnig' dwóch enzymów kodowanych przez gen pol HIV.
Do dnia dzisiejszego opracowano kilka trybów chemioterapii pacjentów zakażonych HIV. Niektóre z tych trybów leczenia zostały zaakceptowane do użytku klinicznego, a inne nadal są w trakcie testów klinicznych. Można więc przyjąć, że w niedalekiej przyszłości liczba akceptowanych trybów chemioterapii będzie stopniowo wzrastać. Coraz częściej stosuje się terapię skojarzoną czyli leczenie wieloma lekami, ze względu na rozwój odmian HIV opornych na leki podczas leczenia. Jakkolwiek wykazano, że tryby chemioterapii wywierają wpływ na wirusowe (obciążenie wirusem), immunologiczne i kliniczne parametry choroby HIV, to doświadczenie praktyczne uczy, iż ten wpływ jest przemijający. W szczególności stwierdzono, że szczepy HIV zakażające indywidualnego pacjenta po chwili zaczynają wykazywać obniżoną wrażliwość na lek lub połączenie leków, którymi jest leczony ten pacjent. Ustanie skuteczności chemioterapii może zmieniać się z pacjenta na pacjenta, z leku na lek, albo z połączenia leków na połączenie leków. Zdecydowanie ustalono, że ustanie skuteczności
186 473 konkretnego rodzaju chemioterapii może być związane z genotypowym profilem zmian aminokwasów w genomie szczepów HIV zakażających pacjenta. To prawdopodobnie czyni te szczepy HIV mniej wrażliwymi na chemioterapię. Gdy zakażonego pacjenta poddaje się kilku trybom chemioterapii przez przedłużony okres czasu, w genomie zakażającego szczepu HIV pojawiają się bardziej złożone profile zmian aminokwasów, co obecnie uniemożliwia racjonalne kierunki dalszego leczenia zakażonego pacjenta. Jak zasugerowano w powyższych wyjaśnieniach, można rutynowo oznaczyć zmiany genotypowe pojawiające się w szczepach HIV eksponowanych na różne chemioterapie, włącznie ze stosowaniem jednego lub wielu leków przeciw HTV, jednakże dotychczas lekarzowi przepisującemu chemioterapię było niezwykle trudno stwierdzić na podstawie tych wyników, czy jest czy też nie jest rozsądne rozpoczynać lub kontynuować konkretny tryb chemioterapii. Innymi słowy, informacja genotypowa, dostępna tylko w ograniczonym zakresie, nie może być rutynowo tłumaczona na informację fenotypową, co umożliwiło by lekarzowi podjęcie istotnej decyzji co do chemioterapii korzystnej dla pacjenta. Problem ten pojawia się także w przypadku pacjentów jeszcze nie leczonych, ale zakażonych szczepami HTV opornymi na lek.
Monitorowanie obciążenia wirusem stało się rutynowym aspektem leczenia HIV. Jednakże sama liczba obciążenia wirusem nie może być użyta jako podstawa do decydowania, który lek, sam lub w połączeniu z innymi, może zostać użyty.
Leczenie skojarzone staje się coraz częściej wybieranym trybem chemioterapii. Kiedy osoba biorąca połączenie leków zacznie doświadczać tego, iż przestają one działać, niemożliwe jest stwierdzenie, który konkretnie lek w tym połączeniu przestał działać. Nie można po prostu zastąpić wszystkich leków, ze względu na ograniczoną liczbę leków obecnie dostępnych. Ponadto, jeżeli nawet zmieni się cały tryb chemioterapii, można zrezygnować z jednego lub większej liczby leków aktywnych w przypadku konkretnego pacjenta. Ponadto jest możliwe, że wirusy wykazujące oporność na konkretny inhibitor, mogą także wykazywać w różnym stopniu oporność krzyżową na inne inhibitory. ,
Najlepiej byłoby aby za każdym razem, gdy osoba ma test obciążenia wirusem i gdy wykryje się wzrost obciążenia wirusem, przeprowadzić także test wrażliwości/oporności lekowej. Do czasu opracowania skutecznej terapii, prowadzenie leczenia choroby HlV będzie wymagało takiego testu.
Obecnie istnieje sposób fenotypowania, opierający się na izolacji wirusa z osocza w obecności donorowych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMCs), oraz równoczesnego fenotypowania w tych komórkach (Japour, A. J. i inni (1993) Antimicrobial Agents and Chemotheraphy; tom 37, nr 5, str. 1095-11θ1). Ten sposób wspólnego hodowania, zalecany przez AIDS Clinical Trial Group (ACTG), szczególnie dla fenotypowania oporności na AZT (którego synonimem jest zidowudyna/Retrovir (Retrovir jest znakiem towarowym)), jest czasochłonny, kosztowny i także zbyt złożony, aby stosować go rutynowo.
Test fenotypowy na wirusie zrekombinowanym, służący do oceny wrażliwości HIV Typ 1, ograniczający się do inhibitorów odwrotnej transkryptazy (RT), został opracowany przez Kellam, P. i Larder, B.A. (Antimicrobial Agents and Chemotheraphy; (1994), tom 38, nr 1, str. 23-30). Procedura ta umożliwia generowanie żywych wirusów poprzez homologiczną rekombinację pochodzącej z PCR puli sekwencji kodujących RT do niezakaźnego klonu prowirusa z wydeletowaną sekwencją RT, pHIVARTBstEn. Badanie dwóch pacjentów w trakcie leczenia zidowudyną wykazało, że taki sposób umożliwił wytworzenie wirusów wykazujących dokładnie ten sam genotyp i fenotyp, jak pierwotnie zakażający PBL DNA. Jednakże ta procedura obejmuje izolację wirusa pacjenta przez wspólne hodowanie osocza pacjenta lub PBMCs pacjenta z donorowymi PBMCs. Taka wcześniejsza hodowla wirusa może zmienić pierwotny skład wirusa. Ponadto sposób ten, pomimo iż pozwala oznaczyć wrażliwość izolatów na poszczególne inhibitory, nie dostarcza lekarzowi informacji czy można kontynuować obecny tryb chemioterapii, czy zmienić leczenie.
Poza tym, gdy badany jest tylko jeden enzym kodowany przez gen pol, sposób ten nie nadaje się do łatwej oceny fenotypowej leczenia skojarzonego, zazwyczaj obejmującego stosowanie jednej proteazy i 2 inhibitorów RT.
18(6473
Procedura umiejscowionej PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy) użyta w teście na wirusie zrekombinowanym może prowadzić do sytuacji, gdy zrekombinowany wirus nie w pełni odzwierciedla sytuację w przypadku szczepów HIV zakażających badanego pacjenta. Problem ten tkwi w homologji sekwencji DNA i minimalnym stopniu homologii wymaganym do rekombinacji homologicznej w komórkach ssaczych (C. Rubnitz, J. i Subramini, S. (1984) Molecular and Cellular Biology·, tom 4, nr 11, str. 2253-2258). Zatem osoba wykonująca test fenotypowy oparty na zrekombinowanym wirusie powinna upewnić się, że tak dużo jak tylko jest to możliwe materiału pacjenta zostało namnożone oraz, że zachodzi maksymalna rekombinacja.
Tak więc osoba wykonująca test powinna upewnić się, że w stosowanych procedurach ekstrakcji RNA i umiejscowionej PCR materiał genetyczny wirusa jest namnożony w taki sposób, że namnożony materiał maksymalnie odzwierciedla różnorodność genetyczną badanego pacjenta.
Obecnie w praktyce klinicznej istnieje mocno odczuwana potrzeba (a) oznaczania szybkiego i na rutynowych podstawach fenotypowej wrażliwości lekowej szczepów HIV zakażających konkretnego pacjenta, (b) przetwarzania tak uzyskanych danych w informację łatwą do zrozumienia, oraz (c) na podstawie wspomnianej informacji rozpoczęcia, kontynuacji lub modyfikacji chemioterapii przepisanej temu konkretnemu pacjentowi.
Zgodny z wynalazkiem sposób oceny in vitro chemioterapii HIV u pacjentów HIV dodatnich polega na tym, że transfekuje się wrażliwe na zakażenie HIV linie komórkowe sekwencją z genu pol HIV, otrzymaną poprzez wyizolowanie wirusowego RNA z próbki materiału biologicznego od pacjenta i odwrotne transkrybowanie żądanego regionu tego genu pol, oraz konstruktem HIV-DNA z wydeletowaną wspomnianą sekwencją, hoduje się transfekowane komórki, z wytworzeniem podstawowej puli chimerycznych wirusów, ocenia się fenotypową wrażliwość chimerycznych wirusów na inhibitor enzymu kodowanego przez gen pol HIV i wyznacza się jej wartość, sporządza się zestaw danych zawierających wartość wrażliwości dla chimerycznych wirusów i odpowiadającą jej wartość dla chimerycznego dzikiego szczepu HTV, powtórnie ocenia się wrażliwość dla co najmniej dwóch innych inhibitorów i sporządza się łącznie co najmniej trzy takie zestawy danych, przedstawia się te zestawy danych w dwuwymiarowej łub trójwymiarowej postaci graficznej takiej, że różnica pomiędzy wartościami wrażliwości wirusów chimerycznych i szczepu dzikiego, w przypadku każdego zestawu danych, stanowi widoczną miarę oporności podstawowej puli wirusów chimerycznych na leczenie danym inhibitorem, oraz wybiera się optymalny inhibitor lub optymalne inhibitory na podstawie graficznego obrazu tak zmierzonych wartości oporności.
Sposób według wynalazku jest przydatny dla lekarzy w leczeniu pacjentów na podstawie fenotypowej wrażliwości lekowej szczepów ludzkiego HIV na inhibitory jednego lub większej liczby enzymów kodowanych przez gen pol HIV.
Sposób według wynalazku dostarcza informacji fenotypowej o konkretnych pacjentach zakażonych HIV, w szerokim zakresie, oszczędnie i szybko. Sposób można stosować we wszystkich obecnie dostępnych trybach chemioterapii i oczekuje się, że również będzie go można stosować w przyszłych trybach chemioterapii.
Sposób według wynalazku dostarcza lekarzowi danych fenotypowych na temat szczepów HIV zakażających pacjenta, które to dane mogą być natychmiast użyte, aby stwierdzić czy rozpocząć, kontynuować lub czy też zmienić konkretny tryb chemioterapii.
Korzystnie zestaw danych przedstawia się na wykresie wielokątowym lub pseudokołowym, gdzie:
(a) szereg znormalizowanych osi rozchodzi się promieniowo z początku układu, przy estawowi danych lub inhibitorowi lub ich kombinacji;
czym każda oś odpowi ___/4o ιο/Ίηοτηπ -iUUU J VUA1VXUW 4Λ* (b) osie są znormalizowane tak, że wartości wrażliwości dla dzikiego HIV na różne inhibitory są równe na każdej osi, przy czym reprezentujące dane punkty dla dzikiego HIV ewentualnie nanosi się i łączy z utworzeniem wielokąta foremnego, którego wierzchołki leżą na osiach i którego środek jest zdefiniowany przez początek układu;
(c) na każdą z osi nanosi się reprezentujący daną punkt przedstawiający wartość wrażliwości podstawowej puli wirusów chimerycznych HTV na inhibitor odpowiadający tej osi, przy czym reprezentujące dane punkty dla puli wirusów chimerycznych ewentualnie łączy się
186 473 z utworzeniem wielokąta foremnego lub nieforemnego, którego kształt przedstawia oporność podstawowej puli wirusów chimerycznych na szereg inhibitorów.
Wykres wielokątny lub pseudokołowy ma taką zaletę, że charakteryzuje oporność pacjenta na szereg leków, której miarą jest stopień rozbieżności pomiędzy wielokątem przedstawiającym pulę chimerycznych wirusów HIV u pacjenta a wielokątem przedstawiającym szczep dziki. Pola wielokątów będą zazwyczaj różnić się w jednych obszarach bardziej niż w innych, co w każdym z przypadków wskazuje na większy lub mniejszy stopień oporności na inhibitor, którego oś przechodzi przez rozpatrywany obszar.
Tak więc zgodnie ze sposobem według wynalazku uwzględnia się podstawową pulę chimerycznych wirusów HIV i dostarcza mapę oporności tej puli wobec kilku inhibitorów. W ten sposób mapa lub wykres dostarcza technicznej charakterystyki takiego aspektu puli wirusów chimerycznych, którego nie można uzyskać drogą obecnie przeprowadzanych pomiarów.
W korzystnym rozwiązaniu kąty pomiędzy znormalizowanymi osiami są równe.
Ponadto korzystnie każda oś ma skalę logarytmiczną.
Ponadto korzystnie, gdy występują niecentralne, reprezentujące dane punkty w wielokącie chimerycznym, wskazują one na inhibitory, których przydatność można określić jako małą lub żadną dla pacjenta, podczas gdy reprezentujące dane punkty leżące w obrębie, na lub w pobliżu zewnętrznej strony wielokąta szczepu dzikiego wskazują na inhibitory, których przydatność można określić jako znacząco korzystną dla pacjenta.
Kiedy przedstawia się na wykresie wartości dla najgorszych przypadków wraz z wartościami dla chimerycznych i dzikich HIV, zazwyczaj wielokąt nieforemny zawiera w sobie wielokąty chimeryczne i szczepu dzikiego. Określenie „nieeenrrahiy” użyte powyżej oznacza reprezentujący daną punkt leżący stosunkowo blisko granicy najgorszego przypadku i stosunkowo daleko od wielokąta szczepu dzikiego. Podobnie określenie „w pobliżu zewnętrznej strony wielokąta szczepu dzikiego” odnosi się do względnej bliskości w stosunku do wielokąta szczepu dzikiego w porównaniu z odległością od granicy najgorszego przypadku.
Sposób zdefiniowany powyżej jest ograniczony w takim sensie, że mierzalna oporność na inhibitor zależy od zakresu stosowanych wartości stężenia inhibitora. Ponadto należy próbować zminimalizować skutki różnorodności biologicznej. A zatem pożądane jest uzyskanie wartości dla maksymalnej lub występującej w najgorszym przypadku mierzalnej oporności, gdy można stwierdzić, że dany inhibitor nie jest skuteczny. To stężenie, np. 100 μΜ, jest zazwyczaj najwyższym stężeniem, które można stosować w testach, ale może także wynikać z badań farmakologicznych, toksykologicznych lub farmakokinetycznych. Porównanie poziomu oporności badanego pacjenta i najwyższej mierzalnej oporności umożliwia określenie, jaki jest znaczący poziom oporności badanego pacjenta. Najwyższą mierzalną oporność i rzeczywistą oporność można przedstawić na wykresie słupkowym w sposób opisany poniżej.
W kolejnym korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, każdy z trzech lub więcej zestawów danych zawiera ponadto mierzalną dla najgorszego przypadku wartość oporności na dany inhibitor, przy czym te wartości dla najgorszego przypadku przedstawia się na tym wykresie tak, że reprezentujący dane punkt dla puli wirusów chimerycznych można porównać z danymi zarówno dla szczepu dzikiego, jak i dla najgorszego przypadku, co umożliwia określenie wartości względnej dla inhibitora w konkretnym przypadku.
Doświadczenia na ponad 150 pacjentach wykazały bliski związek pomiędzy rozwojem oporności a historią terapii, co przedstawiono poniżej w przykładach. Stwierdzono korelację pomiędzy danymi otrzymanymi zgodnie z wynalazkiem a danymi uzyskanymi zgodnie ze znanymi technikami izolacji wirusa i fenotypowania.
Sposób według wynalazku można więc stosować do indywidualnego i bardziej racjonalnego prowadzenia chemioterapii HIV. Zatem zastosowanie sposobu według wynalazku w połączeniu z odpowiednim podawaniem leków przeciw HIV powinno ostatecznie doprowadzić do poprawienia leczenia i przeżywalności pacjentów zakażonych wirusem HIV.
Sposób według wynalazku znajduje szczególne zastosowanie w przypadku gdy konkretny pacjent otrzymuje wiele różnych leków, a opiekujący się nim lekarz nie może łatwo zinterpretować profilu jego mutacji.
186 473
Sposób ceenyyin vzOocheimoeeaapii HIV upcceentów fflV dddatnich może obejmować etapy: (a) okresowe oznaczanie fenotypowej wrażliwości szczepów HIV u pacjenta w sposób opisany powyżej; (b) wydawanie instrukcji odnośnie prowadzenia chemioterapii wybranym inhibitorem, jeżeli szczepy HIV u pacjenta pozostają wrażliwe na wybraną chemioterapię; albo (c) odnośnie wyboru innego inhibitora, jeżeli i gdy wrażliwość pierwotnego inhibitora zmniejsza się.
Temu ujawnionemu tu narzędziu klinicznemu nadano określenie „Antivirogram®” i to określenie będzie używane poniżej w opisie. Narzędzie to dostarcza lekarzowi jasnego obrazu względnych zmian i względnej wrażliwości dla różnych inhibitorów, które są stosowane lub mogą być stosowane w klinicznym prowadzeniu indywidualnych pacjentów zakażonych HIV.
Przez HIV ogólnie rozumie się tutaj HIV-1. Jednakże wynalazek można także stosować w przypadku HIV-2.
Korzystnie, równocześnie oznacza się fenotypo^ją wrażliwość wirusów chimerycznych na inhibitory co najmniej dwóch enzymów kodowanych przez gen pol HIV.
Zgodny z wynalazkiem sposób oznaczania fenotypowej wrażliwości lekowej poszczególnych szczepów HIV u pacjenta na inhibitory co najmniej dwóch enzymów kodowanych przez gen pol HIV polega na tym, że transfekuje się wrażliwą na zakażenie HIV linię komórkową sekwencją z genu pol HIV, otrzymaną poprzez wyizolowanie wirusowego RNA z próbki materiału biologicznego pacjenta i odwrotne trpeskryOowpeih żądanego regionu tego genu pol, oraz konstruktem HIV-DNa z wydeletowaną wspomnianą sekwencją, hoduje się traesfhkowane komórki, z wytworzeniem podstawowej puli chimerycznych wirusów, oraz ocenia się fenotypową wrażliwość chimerycznych wirusów na inhibitory enzymów kodowanych przez gen pol HIV.
Żądaną sekwencję z genu pol izoluje się z próbki materiału biologicznego uzyskanego od pacjenta, u którego oznacza się fenotypową wrażliwość na lek. Do tej izolacji żądanej sekwencji można użyć wielu różnych materiałów biologicznych.
Zatem materiał biologiczny można wybrać z osocza, surowicy lub wolnego od komórek płynu ustrojowego wybranego z płynu spermy lub płynu pochwowego. Osocze jest szczególnie korzystne i ma szczególne zalety w porównaniu z użyciem PBMCs w znanych rozwiązaniach opisanych powyżej.
AithrndtyWnih jako materiał biologiczny można stosować pełną krew, do której dodano stabilizatora RNA.
W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku, jako materiał biologiczny można stosować stały materiał tkankowy wybrany z tkanki mózgowej i tkanki węzłów limfatycznych, albo innej tkanki pobranej przez biopsję.
Jak wykazano pdniOeC, jeżeli do izolacji pożądanej sekwencji używa się takiego materiału biologicznego jak osocze, to można użyć minimalnej objętości osocza, zazwyczaj około 100-250 μΐ, a zwłaszcza około 200 μΐ.
Ponadto korzystnie dwa wybrane enzymy wybiera się z RT, proteazy i integrazy HIV.
RNA wirusowy korzystnie izoluje się znanymi sposobami, np. sposobem według Boom, R. i inni (Journal of Clinical Microbiology (1990), tom 28, nr 3, str. 495-503).
W przypadku osocza, surowicy i wolnych od komórek płynów ustrojowych można także użyć zestawu QIAamp® viral RNA kit produkowanego przez grupę przedsiębiorstw Qipghe.
Korzystnie jako linię komórkową wrażliwą na zakażenie HIV stosuje się linię komórek T CD4+.
Ponadto korzystnie jako linię komórek T CD4+ stosuje się linię komórkową MT4 lub HeLa CD4+.
Odwrotną transkrypcję można przeprowadzić z użyciem dostępnego w handlu zestawu, takiego jak GeneAmp® Reverse Trdescriatpse Kit produkowanego przez Perkin Elmer.
Żądany region genu pol pacjenta poddaje się odwrotnej transkrypcji z użyciem specyficznego startera pasującego do końca 3'.
W przypadku, gdy sekwencja mająca ulec odwrotnej transkrypcji jest sekwencją kodującą odwrotną transkryptazę lub odwrotną transkryptazę i proteazę, starterem pasującym
186 473 do końca 3' jest korzystnie OUT3: 5'-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-3' SEQ ID NO: 1).
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, odwrotnej transkrypcji poddaje się gen RT HIV i gen proteazy HIV pacjenta używając startera OUT3 i odwrotnej transkryptazy pozbawionej, metodami inżynierii genetycznej, aktywności RNa-zy H, tak że całkowity transkrybowany RNA przekształca się w cDNA i nie ulega rozkładowi. Taką odwrotną transkryptazę, modyfikowaną metodami inżynierii genetycznej, odwrotną transkryptazę Expand (Expand jest znakiem towarowym), można uzyskać z Boehringer Mannheim GmbH.
Odwrotna transkryptaza Expand® jest polimerazą DNA działający na matrycy RNA. Enzym jest modyfikowaną metodami inżynierii genetycznej odwrotną transkryptazą mysiego wirusa białaczki Moloneya (M-MuLV-RT). Punktowa mutacja w sekwencji RNazy H zmniejsza aktywność RNazy H do niewykrywalnego poziomu. Użycie odwrotnej transkryptazy modyfikowanej metodami inżynierii genetycznej umożliwia uzyskanie większych ilości transkryptów cDNA o pełnej długości.
Po odwrotnej transkrypcji przetranskrybowany DNA amplifikuje się przy użyciu techniki PCR.
Korzystnie, produkt odwrotnej transkrypcji amplifikuje się przy użyciu umiejscowionej PCR.
Korzystnie, w przypadku gdy wybranym regionem jest region RT, umiejscowioną PCR przeprowadza się za pomocą wewnętrznych i zewnętrznych starterów, jak opisali Kellam, P. i Larder, B.A. (1994, patrz wyżej). W przypadku gdy wybrany region obejmuje geny RT i proteazy, specyficzne użyte startery są kombinacją OUT 3/IN 3 (pasujący do końca 3') i RVP 5 (pasujący do końca 5').
Starter rVp 5 (Maschera, B i inni Journal of Virology, 69, 5431-5436) ma sekwencje: 5'-GGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGG-3' (SEQ ID NO: 2).
Amplifikację przedstawiono schematycznie na fig. 3 i opisano bardziej szczegółowo w przykładzie 2.
Amplifikacja cDNA proteazy obejmuje procedurę pół-umiejscowionej PCR, co jest widoczne na fig. 3.
Technika umiejscowionej PCR ma tę zaletę w porównaniu ze znanymi prostymi technikami PCR, że pozwala uzyskać bardziej specyficzny produkt.
Jednakże, aby uzyskać jeszcze większą wierność i wydajność podczas PCR można użyć mieszaniny polimeraz termostabilnych (Barnes, W.M. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 2216-2220). Taka mieszanina polimeraz jest dostępna z Boehringer Mannheim GmbH jako układ wysokiej wierności PCR Expand (Expand jest znakiem towarowym). Z zastosowaniem tego układu uzyskano zwiększoną wrażliwość, a mianowicie wrażliwość dziesięć razy większą niż uzyskuje się w przypadku znanej procedury PCR z użyciem samej polimerazy Taq.
Gdy region genu pol obejmuje geny RT i proteazy, korzystne jest aby konstrukt HIV-DNA miał wydeletowane geny RT i proteazy i był plazmidem pGEMT3-APRT zdeponowanym w Belgian Coordinated Collections of Microorganisms-BCCM LMBP-Collection w dniu 8 listopada 1996 r., pod numerem LMBP3590.
Jednakże można stosować szereg dróg aby wytworzyć plazmid zawierający prowirus HIV-1 mający delecję dla proteazy i dla genu RT. Jedną z możliwości jest wprowadzenie żądanej delecji drogą mutagenezy kierowanej oligonukleotydami. Jednakże procedura użyta w dalszej części w przykładzie 2 obejmuje wytworzenie żądanego konstruktu za pomocą specyficznych enzymów restrykcyjnych i podklonowania, jak opisano poniżej. Pomimo iż końcowy wynik zależy od dostępnych miejsc restrykcyjnych, główną zaletą tej metody jest to, że dzięki niej można szybko uzyskać ostateczny wynik.
Aby uzyskać najbardziej skuteczny wynik, transfekowany produkt PCR najlepiej powinno się oczyścić na obrotowych kolumnach anionowymiennych w sposób ogólnie znany. Odpowiednim zestawem jest QlAquick® PCR Purification Kit sprzedawany przez grupę przedsiębiorstw Qiagen.
186 473
Transfekcję można wykonać drogą elektroporacji albo alternatywnie z użyciem lipidów, w szczególności kationowych lipidów, DEAE dekstranu, CaHPO4 itd. ’
W przypadku transfekcji z użyciem lipidów można użyć zestawu PERFECT (PERFECT jest znakiem towarowym) transfection kit produkcji Invitrogen B.V. z Leek, Holandia.
Zatem do transfekcji używa się konstruktu HIV-DNA z wydeletowanym wybranym genem lub genami z genu pol w połączeniu z produktem uzyskanym w wyniku amplifikacji.
Konstruktem może być plazmid pHIVART (dostępny z Medical Research Council (MRC)), jeżeli genem wydeletowanym ma być tylko RT. Jeżeli mają być wydeletowane geny RT i proteazy, to odpowiednim konstruktem HIV DNA jest opisany tu plazmid pGEMT3APRT, będący wektorem wysokokopijnym. Takie plazmidy linearyzuje się przed transfekcją metodami ogólnie znanymi.
Szczególną zaletą użycia konstruktu kodującego więcej niż jeden enzym genu pol, np. konstruktu APRT, jest to, że jest bardziej prawdopodobne, iż ten konstrukt zawiera więcej oryginalnego materiału pacjenta, niż w przypadku gdy używa się konstruktu kodującego jeden gen, tak że zamplifikowany materiał w większym stopniu przypomina genetyczną różnorodność wirusa występującą u konkretnego badanego pacjenta.
Należy wziąć pod uwagę, że jest korzystne aby specyficzne startery wybrane do umiejscowionej PCR leżały na zewnątrz sekwencji docelowych enzymów, które mają być zamplifikowane i przebadane. Ponadto należy wziąć pod uwagę, że kombinacja RT i proteazy da lepsze wyniki dla badania RT niż sama RT, ponieważ jeszcze czterdzieści aminokwasów pochodzi od pacjenta w porównaniu z sytuacją z samą RT. W przypadku badania proteazy powinno się zwrócić uwagę, że pierwsze dziewięć aminokwasów proteazy wciąż pochodzi z dzikiej podstawy konstruktu (pGEMT3-APRT).
Gdy transfekcję komórek przeprowadza się drogą elektroporacji, wybrane parametry optymalizuje się aby uzyskać dobry wzrost komórek i dobrą produkcję wirusa. Elektroporację można dogodnie przeprowadzić przy około 250 pF i 300 V. Korzystnie elektroporację prowadzi się w obecności około 10 pg zlinearyzowanego plazmidu, np. pHIVARTBst.EII, oraz około 5 pg zamplifikowanego produktu PCR, np. produktu RT PCR. Pod wpływem wewnątrzkomórkowej rekombinacji homologicznej powstaje nowy chimeryczny HIV po około 5 do 10 dniach. W przypadku znanych technik typowym czasem hodowli jest 12-14 dni do utworzenia chimerycznych HIV. Podwielokrotne porcje supematantu z hodowli przechowuje się w temperaturze -70°C lub niższej.
Jest jasne, że powyższych metod można użyć do izolacji i amplifikacji innych genów HIV, np. genu integrazy, albo większej liczby innych genów HIV, np. zarówno genu RT, jak i integrazy, oraz transfekcji komórek T CD4+ produktami PCR odpowiednio integrazą lub integrazą/RT w połączeniu z odpowiednim zlineayzowanym konstruktem HTV-DNA z wydeletowanym odpowiednim genem (lub genami).
Nowo powstałe chimeryczne wirusy analizuje się określając ich miano i następnie bada je pod względem wrażliwości (to jest podatności) fenotypowej na różne inhibitory enzymów kodowanych przez gen pol, korzystnie w automatycznym teście opartym na komórkach.
Korzystnie fenotypową wrażliwość lekową chimerycznych wirusów i dzikiego szczepu HTV, będącego odpowiednio zrekombinowanym dzikim szczepem HIV, na jeden lub większą liczbę inhibitorów RT, proteazy lub integrazy, wyraża się w postaci stężenia hamującego (wartość IC).
Wrażliwość wirusów chimerycznych i dzikiego szczepu HIV na jeden lub większą liczbę inhibitorów RT i/lub jeden lub większą liczbę inhibitorów proteazy i/lub jeden lub większą liczbę inhibitorów integrazy można przedstawić jako np. stężenie hamujące w 50% lub 90% /w~_rtoś ti r.i Tb* λ
ICO 0)
Korzystnie inhibitory RT wybiera się spośród nukleozydowych inhibitorów RT, takich jak AZT, ddl (didanozyna/Videx (Videx jest znakiem towarowym), ddC (zalcytabina), 3TC (lamiwudyna), d4T (stawudyna), nienukleozydowych inhibitorów RT, takich jak delawirdyna (U 9051125 (BMAP)/Rescriptor (Rescriptor jest znakiem towarowym), iowiryd (aa-APA), newirapina (Bl-RG-587,/Viramune (Viramune jest znakiem towarowym)) i tiwirapina (8-C1-TIBO(R86183)), inhibitory proteazy wybiera się z takich jak sakwinawir, indinawir i ritonawir, a inhibitory integrazy z takich jak ester fenylowo-etylowy kwasu kofeinowego (CAPE).
186 473
Odpowiednie inhibitory RT i/lub proteazy i/lub integrazy wybiera się spośród nukleozydowych inhibitorów RT, takich jak AZT, ddl, ddC, 3TC, d4T, 1592U89 i podobnych, nienukleozydowych inhibitorów RT, takich jak lowiryd, newirapina, delawirdyna, atewirydyną, tiwirapina (8-Cl TIBO) i podobne, inhibitorów proteazy, takich jak sakwinawir, indinawir, ritonawir i podobnych, oraz inhibitorów integrazy, takich jak ester fenylowo-etylowy kwasu kofeinowego (CAPE), i inhibitorów integrazy HIV typu opisanych w WO 95/08540 i GB 2271566.
Sposób według wynalazku może obejmować etap porównywania fenotypowej wrażliwości lekowej szczepów HIV u pacjenta i dzikiego szczepu HIV na jeden lub większą liczbę inhibitorów RT i/lub jeden lub większą liczbę inhibitorów proteazy i/lub jeden lub większą liczbę inhibitorów integrazy. Aby względne zmiany wrażliwości na różne testowane związki będące lekami (lub ich połączenia) przedstawić w łatwej do zrozumienia formie, sporządza się Antivirogram.
Wykres powinien być interpretowany w sposób następujący: rnecentralne, reprezentujące dane punkty w Antivirogramie wskazują ttyby chemioterapii, co do których jest mało prawdopodobne, aby nadal wywierały pozytywny skutek u pacjentów zakażonych HIV, podczas gdy punkty leżące w obrębie wielokąta odniesienia, lub tylko nieco poza wielokątem odniesienia, wskazują tryby chemioterapii, co do których istnieje prawdopodobieństwo, że będą wywierały pozytywny skutek u pacjentów zakażonych HIV.
Sposoby według wynalazku w połączeniu z podawaniem odpowiednich leków przeciw HIV ostatecznie prowadzą do poprawienia leczenia, jakości życia i przeżywalności pacjentów zakażonych HIV; to jest można powstrzymać leczenie nieskuteczne (z powodu obecności lub pojawienia się opornych szczepów HIV) lub jemu zapobiec i rozpocząć skuteczną chemioterapię w odpowiednim czasie.
Poniżej podano krótki opis rysunków.
Figura 1 przedstawia schemat konstrukcji plazmidu pGEMT3-APRT;
Figura 2 przedstawia dalszy i uzupełniający schemat konstrukcji plazmidu pGEMT3APRT;
Figura 3 przedstawia schemat części sekwencji HIV-HXB2D zawierającej geny proteazy i RT;
Figura 4 A-H przedstawiają kompletną sekwencję części sekwencji HIV-HXB2D zawierającej geny proteazy i RT;
Figura 5 przedstawia Antivirogram® pacjenta będącego nosicielem szczepów HIV opornych na 3TC, co opisano w przykładzie 5;
Figura 6 przedstawia Antivirogram® pacjenta, dotychczas nie leczonego, będącego nosicielem dzikich szczepów HIV, co opisano w przykładzie 6;
Figura 7A przedstawia wykres słupkowy ukazujący względną zmianę wrażliwości na lek dla pacjenta z przykładu 7;
Figura 7b przedstawia Antivirogram® dla pacjenta opisanego w przykładzie 7;
Figura 8A przedstawia wykres słupkowy ukazujący względną zmianę wrażliwości na lek dla pacjenta z przykładu 8;
Figura 8B przedstawia Antivirogram® dla pacjenta opisanego w przykładzie 8;
Figura 9A przedstawia wykres słupkowy ukazujący względną zmianę wrażliwości na lek dla pacjenta z przykładu 9;
Figura 9B przedstawia Antivirogram® dla pacjenta opisanego w przykładzie 9;
Figura 10A przedstawia wykres słupkowy ukazujący względną zmianę wrażliwości na lek dla pacjenta z przykładu 10;
Figura 10B przedstawia Antivirogram® dla pacjenta opisanego w przykładzie 10;
Figura 11A przedstawia wykres słupkowy ukazujący względną zmianę wrażliwości na lek dla pacjenta z przykładu 11;
Figura 11B przedstawia Antivirogram® dla pacjenta opisanego w przykładzie 11; Figura 12A przedstawia wykres słupkowy ukazujący względną zmianę wrażliwości na lek dla pacjenta z przykładu 12; a
Figura 12B przedstawia Antivirogram® dla pacjenta opisanego w przykładzie 12.
186 473
Wynalazek zilustrują następujące przykłady.
Sposoby realizacji wynalazku Przykład 1
Protokół
1. Ekstrakcja i amplifikacja RNA wirusowego
RNA wyizolowano ze 100 pl osocza, zgodnie z metodą opisaną przez Boom, R. i innych (1990, patrz wyżej), poddano odwrotnej transkrypcji używając zestawu GeneAmp® reverse transkriptase kit (Perkin Elmer) w sposób opisany przez producenta i używając startera pasującego do końca 3' (OUT3: 5'-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATC-3' (SEQ ID NO: 1) ) . Przeprowadzono PCR na RNA poddanym odwrotnej transkrypcji używając starterów wewnętrznych i zewnętrznych, co opisali Kellam, P. i Larder, B.A. (1994, patrz wyżej). Wyizolowany produkt PCR, po ekstrakcji chloroformem i odwirowaniu na kolumnach Centricon 100 lub na obrotowych kolumnach anionowymiennych (Quiagen), był gotowy do użycia w reakcjach transfekcję
2. Produkcja i izolacja plazmidu
Produkcję plazmidu pHIVART (MCR) prowadzono w E. coli. Plazmid DNA wyizolowano z nocnej hodowli z użyciem kolumn Qiagen w sposób opisany przez producenta. Ilość wyizolowanego plazmidu oznaczono spektrofotometrycznie przez pomiar A260/280 (pomiar gęstości optycznej przy X = 260 i 280 nm). Około 250 pg ultraczystego plazmidu DNA otrzymano z 500 ml hodowli bakteryjnej. Tożsamość wyizolowanego plazmidu potwierdzono metodą analizy restrykcyjnej. Następnie wyizolowany plazmid poddano linearyzacji za pomocą BstEII i ponownie oczyszczono drogą typowej ekstrakcji mieszaniną fenol/chloroform.
3. Transfekcja komórek
Komórki MT4 przed transfekcją. podhodowano do gęstości 250 000 komórek/ml (eksponencjalna faza wzrostu). Komórki odwirowano i ponownie zawieszono w solance buforowanej fosforanem (PBS) do stężenia 3,1 10E6 komórek/ml. Porcje 0,8 ml (2,5 10E6 komórek/ml) użyto do każdej transfekcję Transfekcję przeprowadzono z użyciem pulsera Bio-Rad Gene w 0,4 cm kuwetach elektrodowych. Komórki poddano elektroporacji w obecności 10 pg linearyzowanego plazmidu pHIVART i około 5 pg produktu RT PCR przy 250 pF i 300 V, a następnie inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do zawiesiny komórek dodano 10 ml świeżej pożywki hodowlanej i prowadzono inkubację w37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2.
4. Hodowla i dalsze postępowanie z transfekowanymi komórkami
Komórki monitorowano pod względem wystąpienia efektu cytopatogennego (CPE) przez kolejnych 7 do 10 dni po transfekcję Jeżeli efekt wystąpił, komórki podhodowywano w osobnych naczyniach. Następnie supematantów z hodowli komórek transfekowanych użyto do stworzenia szczepu zrekombinowanego wirusa i przechowywano w 1,5 ml podwielokrotnych próbkach w -70°C.
5. Analiza zrekombinowanego wirusa z wirusowego RNA pacjenta
Po oznaczeniu miana nowego wirusa, szczepów użyto do doświadczeń antywirusowych w obecności różnych inhibitorów H3V w kolejnych rozcieńczeniach. Miana zebranych supematantów oznaczono drogą miareczkowania z użyciem ograniczonej liczby kolejnych rozcieńczeń wirusa w komórkach MT4.
Wirusy o użytecznym mianie stosowano w doświadczeniach antywirusowych. W tym celu 96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania wypełniono 100 pl pełnej pożywki hodowlanej. Następnie dodano związków w podstawowych rozcieńczeniach w objętości 25 pl, przy czym każde stężenie stosowano w dwóch studzienkach. Próbki komórek zakażonych HlV i kontrolnych testowano pod względem każdego z leków (lub połączenia leków). Eksponencjalnie rosnące komórki MT4 przeniesiono na płytki do mikromiareczkowania w gęstości 150 000 komórek/ml. Następnie hodowle komórkowe inkubowano w37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. W 5 dni po zakażeniu spektrofotometrycznie oznaczono żywotność komórek zakażonych HIV i kontrolnych metodą MTT (Pauwels, R. i inni - J. Virol. Meth. (1988), 20: 309-321), co opisano w części 6 poniżej.
6. Test MTT
Do każdej ze studzienek na płytce do mikromiareczkowania dodano 20 μΐ zowworu MTT (7,5 mg/ml w PBS). Płytki mkubowano w 37°C przez 1 godzinę. Następnie usunięto 150 μΐ pożywki nie naruszając skupisk komórek MT4 zawierających kryształy formazanu. Kryształy formazanu rozpuszczono dodając 100 μl 5% Tritonu Χ-100® w zakwaszonym izopropanolu (5 ml stężonego HCl na litr rozpuszczalnika). Formazan rozpuszczono całkowicie poprzez umieszczenie płytek na wytrząsarce do płytek na 10 minut. Ostatecznie zmierzono absorbancję przy dwóch długościach fali (540 i 690 nm). Z danych gęstości optycznej (OD) oznaczono stężenie 50% hamowania (IC50) i stężenie 50% cytotoksyczności (CC50).
Przykład 2
Konstrukcja pHIVARTBstEII-wariantu z delecją genów HIV-1 proteazy i odwrotnej trreskryptazy
Powtórzono protokół opisany w przykładzie 1, z tym wyjątkiem, że sekwencją odpowiedniego genu pol HIV była sekwencja kodująca RT i proteazę, a wytworzonym konstruktem był pGEMT3-APRT, co opisano poniżej. Inne modyfikacje procedury opisanej w przykładzie 1 przedstawiono poniżej.
Do amplifikacji wirusowego RNA przeprowadzono znów odwrotną transkrypcję RNA na DNA za pomocą startera OUT3. Jednakże starterami użytymi do umiejscowionej PCR były startery przedstawione na fig. 3. Zatem należy zauważyć, że do umiejscowionej PCR stosowano startery zewnętrzne RVP5 i OUT3 oraz wewnętrzne RVP5 i IN3. Tak więc ta procedura umiejscowionej PCR jest w rzeczywistości proaelwąpół-umiejscowionej PCR.
Produkcja i izolacja pGEMT3-APRT
Końcowy konstrukt pGEMT3-APRT jest pochothiąpGEM9-Zf(-) (Promega).
W skrócie, konstrukt pGEMT3-APRT skonstruowano przez wprowadzenie żądanej wstawki HIV-HXB2 (klon prowirusa HIV-1 z wydeletowanymi sekwencjami proteazy i odwrotnej trreskryptazy oflankowany ludzkimi sekwencjami) do miejsca restrykcyjnego Xbal wektora pGEM9-Zf(-). Genom prowirusa wydeletowano z miejsca Ahdl w obrębie genu proteazy (otaczającego aminokwas 9) do miejsca BstEII konstruktu pHIV ARTBstEII (symbol depozytowy MRC: ADB231). W miejscu połączenia delecji AProRT znajdują się miejsca Smal i BstEII, których można użyć do linearyzacji konstruktu prowirusowego przed trαesfekcją. Konstrukcję pGEMT3-APRT przedstawiono schematycznie na fig. 1 i 2. Wydajność uzyskanego pGEMT3-APRT wynosiła około 1 mg z 500 ml hodowli bakteryjnej.
Jak stwierdzono powyżej , plazmid pGEMT3-APRT zdeponowano w Belgian Coordinated Collections of Microorganisms-BCCM LMBP-Collection w dniu 8 listopada 1996 r., pod numerem LMBP3590.
Nie spodziewano się, że wprowadzenie genomu prowirusowego do innego wektora (pGEM9-Zf(-) zamiast pIB120) spowoduje poważne problemy. pIB120, pochodna pEMBL8(-) (zgodnie z informacją dostarczoną przez Kodak Scientific Imaging Systems) i pGEM9-ZF(-) są podobnymi wektorami. Pomimo tego, prowirusowy wektor pIB120HIV może być niestabilny w komórkach E. coli recA+ (Maschera, B. i inni, J. Virol. (1995) 69, 5431-5436). Zatem należy ocenić stabilność konstruktu pGEMT3-APRT przed każdym nowym wytwarzaniem plazmidu.
Sekwencja HIV-HXB2
Odpowiedni region w obrębie sekwencji HTV-HXB2D (nukleotydy od 1800 do 4400) przedstawiono na fig. 3 (schematycznie) i na fig. 4 (całkowita sekwencja). Pokazano także lokalizację kilku genów, miejsc restrykcyjnych, starterów i delecji (APro, ART, AProRT).
Sekwencję HIV-1 (izolat HXB2, genom porównawczy, 9718 bp) uzyskano z National Center for Biotechnology Information (NCBI), National Library of Medicine, National Institutes of Health przez ENTREZ Document Retrieval System.
Nazwa w Genbank: HIVHXB2CG
Nr dostępu w Genbank: 03455
NCBI SEQ ID NO: 327742
186 473
Regiony rekombinacji
Wektor pGEMT3-APRT, w połączeniu z fragmentami RT-PCR wytworzonymi z użyciem starterów RVP5 i OUT3/IN3, można zastosować do transfekcji komórek MT4, jak opisano w przykładzie 1, część 3. Region rekombinacji na końcu 5' AProRT zawiera 188 nukleotydów. Region rekombinacji na końcu 3' AProRT jest podobny do wcześniej opisanego (Kellam, P. i Larder, B.A. (1994) patrz wyżej) i zawiera 130 nukleotydów.
Długość regionów rekombinacji nie jest bez znaczenia. Wcześniejsze dane (Bandydpadhypy, P.K. i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1984) 81, 3476-3480; Rubnitz, J. i Su0ramaei, S. (1984) patrz wyżej) wykazały, że gdy homologię sekwencji obniży się z 214 do 163 par zasad (bp), może wystąpić 10 krotne zmniejszenie częstości rekombinacji. Ponadto, skuteczna rekombinacja powinna zajść w komórkach poddawanych hiżktrdadracji, aby mieć pewność, że wytworzony fenotyp wirusowy jest wiarygodnym odzwierciedleniem nibygatunku obecnego u leczonego pacjenta HIV dodatniego. Optymalizację rekombinacji można uzyskać przez poprawienie stosunku linedryzowpehgd wektora prdwirusowegd do fragmentów RT-PCR, użytych do hiektrdporacCi docelowych komórek. Znany sposób, z typowymi wynikami został wcześniej opisany przez Kellam, P. i Larder, B.A. (1994, patrz wyżej). W rezultacie zdecydowano się zwiększyć początkową ilość 2 μg produktu PCR (z 10 μg wektora) do około 5 μg lub więcej. W wyniku tego nastąpiło szybsze pojawianie się widocznego wzrostu wirusów (efekt cytdpatogeeny) w hodowli trpesfekdwdeych komórek.
Inną możliwością optymalizacji rekombinacji może być takie zaprojektowanie starterów, aby w wyniku rekombinacji powstały dłuższe sekwencje.
Niemniej jednak, faktyczna początkowa ilość w reakcji transfekcji zawsze zależy od wydajności PCR. Niektóre próbki mają dużą wydajność, toteż początkowa ilość zamplifikowanego materiału w reakcji transfekcji także jest większa (co da lepszy wynik odnośnie skuteczności rekombinacji). Jednakże, pomimo niskiej skuteczności rekombinacji, można także transfekować próbki o niskiej wydajności i w wyniku tego otrzymać żywotne wirusy z wiarygodnym obrazem populacji wirusów.
Przykład 3
Alternatywne startery do RT-PCR sekwencji ProRT
Nowe startery (A-D), zaprojektowane podobnie do użytych w przykładzie 2, powinny spowodować powstanie dużych zrekom0indwdeych sekwencji zarówno na 5', jak i 3' końcu regionu ProRT. Dwa startery zaprojektowano zarówno dla 5', jak i 3' końca odpowiedniego regionu, aby umożliwić umiejscowioną PCR. Jak przedstawiono na fig. 3 i 4, przy projektowaniu odpowiednich starterów wzięto pod uwagę bezpośrednie powtórzenia obecne na 5' końcu regionu ProRT. Nowe startery są następujące :
A PRTO-5: 5'-GCCCCTAGGA-AAAAGGC€TG-TTGG (SEQ ID NO: 3)
B PRTI-5: 5'-TCAAACATTC-TACTCACACA-CACC (SEQ ID NO: 4)
C PRTI-3: 5'-CATATTTCTC-ATGTTCATCT-TCCC (SEQ ID NO: 5)
D PRTO-3: S^AGGIAKjCAGG-TTAAAATCAC-TAGC (SEQ ID NO: 6).
Przykład 4
Konstrukcja alternatywnego wektora AProRT
Jak wspomniano powyżej, konstrukcję alternatywnego wektora z wydeletowaną sekwencją ProRT można przeprowadzić przez mutagenezę kierowaną oligdnukieotydpmi. Jednakże, możliwe jest także powiększenie delej ProRT na obecnym 3' końcu do następnego miejsca KpnI w genie RT (40 par zasad w dół końca 3'). Ligacja miejsca KpnI potraktowanego fragmentem Klenowa z miejscem BstEII potraktowanym fragmentem Kunowa odtworzy początkową sekwencję rozadzeawpeą przez BstEII. Tak więc alternatywny wektor zachowuje się podobnie jak wektor pGMT3-APRT opisany w przykładzie 2, ale ma nieznacznie większą delecję RT.
Przykład 5
Od pacjenta zakażonego HIV, otrzymującego AZT od grudnia 1989 r. do nieudokumentowanej późniejszej daty, a następnie leczonego w trybie skojarzonej chemioterapii AZT+3TC (1:1) od lutego 1994 r. do października 1995 r., pobrano osocze i oznaczono wrażliwość na różne inhibitory RT, zgodnie z protokołem opisanym powyżej w przykładzie 1.
186 473
Jako porównawczego wirusa HIV użyto zrekombinowanego szczepu dzikiego HIV recIIIB.
W tabeli 1 podano zmierzone wartości IC50 (μΜ) i stosunek tych wartości. Antivirogram® przedstawiono na fig. 5.
Tabela 1
| Lek | Aktywność anty-HIV-1 IC50 (μΜ) | ||||
| Dośw. 1 | Dośw. 2 | Średnia (1) | recIIIB (2) | Stosunek (1)/(2) | |
| lowiryd | 0,1 | 0,12 | 0,11 | 0,05 | 2 |
| tiwirapina | 0,019 | 0,018 | 0,019 | 0,01 | 1,5 |
| AZT | 0,001 | 0,002 | 0,002 | 0,004 | 0,4 |
| 3TC | 31,6 | 100 | 65,8 | 0,56 | 118 |
| d4T | 0,07 | 0,49 | 0,06 | 0,12 | 0,5 |
| ddl | 2,0 | 0,8 | 1,4 | 2,83 | 0,5 |
| ddC | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,38 | 0,5 |
| AZT+3TC (1:1) | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,5 |
Z danych tych wynika, że leczenie samym 3TC nie będzie skuteczne w przypadku tego pacjenta. Jednakże skojarzona terapia AZT+3TC (obecna terapia) nadal może przynosić pozytywny skutek.
Przykład 6
Od pacjenta zakażonego HIV, dotychczas nie leczonego, pobrano osocze i oznaczono wrażliwość na różne inhibitory RT, zgodnie z protokołem opisanym powyżej w przykładzie
1. Jako porównawczego wirusa HIV użyto zrekombinowanego szczepu dzikiego HIV recIIIB. W tabeli 2 podano zmierzone wartości IC50 (μΜ) stosunek tych wartości. Antivirogram® przedstawiono na fig. 6.
Tabela 2
| Lek | Aktywność anty-HIV-1 Ro/nM) | ||||
| Dośw. 1 | Dośw. 2 | Średnia (1) | recIIIB (2) | Stosunek (1)/(2) | |
| 3TC | 1,81 | 2,02 | 1,91 | 3,08 | 1 |
| ddl | 3,07 | 4,47 | 3,77 | 8,58 | 0,4 |
| ddC | 1,45 | 1,47 | 1,46 | 2,21 | 1 |
| AZT | 0,04 | 0,05 | 0,05 | 0,06 | 1 |
| d4T | 1,31 | 0,97 | 1,14 | 1,74 | 1 |
| AZT+3TC (1:1) | 0,05 | 0,04 | 0,05 | 0,02 | 3 |
| DDC+D4T (1:1) | 0,62 | 0,44 | 0,53 | 0,77 | 1 |
| 3TC+d4T (1:1) | 0,42 | 0,44 | 0,43 | 1,11 | 0,4 |
Z danych tych wynika, że pacjent został zakażony szczepami HIV bardzo podobnymi do szczepu dzikiego. Wszystkie leki nadają się do leczenia, a zatem chemioterapię można rozpocząć takim lekiem jak AZT dającym pozytywny wynik.
186 473
Przykład 7
Od pacjenta zakażonego HIV, dotychczas nie leczonego, pobrano osocze i oznaczono wrażliwość na różne inhibitory RT, zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1. Jako porównawczego wirusa HIV użyto zrekombinowanego szczepu dzikiego HIV recIIIB. W tabeli 3 podano zmierzone wartości IC50 (pM) i stosunek tych wartości. Wykres słupkowy przedstawiający względne zmiany wrażliwości na lek przedstawiono na fig. 7A. Antivirogram® przedstawiono na fig. 7B.
Tabela 3
| Lek | Aktywność anty-HIV-1 IC50 (pM) | ||||
| Dośw. 1 | Dośw. 2 | Średnia (1) | recIIIB (2) | Stosunek (1)/(2) | |
| AZT | 0,052 | 0,050 | 0,051 | 0,023 | 2 |
| 3TC | 2,173 | NO | 2,173 | 1,381 | 2 |
| ddl | 0,475 | 0,429 | 0,452 | 0,648 | 0,7 |
| ddC | 1,042 | 1,389 | 1,216 | 1,616 | 0,8 |
| dT4 | 1,142 | 1,657 | 1,399 | 1,368 | 1 |
| lowiryd | 0,035 | 0,025 | 0,030 | 0,024 | 1 |
| tiwirapina | 0,042 | 0,049 | 0,046 | 0,021 | 2 |
Z danych tych wynika, że pacjent został zakażony szczepem HIV bardzo podobnym do szczepu dzikiego. Wszystkie leki nadają się do leczenia, a zatem chemioterapię można rozpocząć takim lekiem jak AZT, 3TC lub innymi dającymi pozytywny wynik.
Przykład 8
Od pacjenta zakażonego HIV, leczonego AZT, 3TC i lowirydem, pobrano osocze i oznaczono wrażliwość na różne inhibitory RT, zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1. Jako porównawczego wirusa HIV użyto zrekombinowanego szczepu dzikiego HIV recIIIB. W tabeli 4 podano zmierzone wartości IC50 (μΜ) i stosunek tych wartości. Wykres słupkowy przedstawiający względne zmiany wrażliwości na lek przedstawiono na fig. 8A. Antivirogram® przedstawiono na fig. 8B.
Tabela 4
| Lek | Aktywność anty-HIV-1 IC50 (pM) | ||||
| Dośw. 1 | Dośw. 2 | Średnia (1) | reclUB (2) | Stosunek (l)/(2) | |
| AZT | 18,264 | 22,251 | 20,257 | 0,084 | 241 |
| 3TC | >100,000 | >100,000 | >100,000 | 6,304 | >16 |
| ddl | 26,861 | 15,435 | 21,148 | 1,586 | 13 |
| ddC | 9,290 | 8,506 | 8,898 | 1,931 | 5 |
| d4T | 7,5 | 7,097 | 7,298 | 5,465 | 1 |
| lowiryd | >100,000 | >100,000 | >100,000 | 0,037 | >2717 |
| tiwirapina | 1,626 | 1,604 | 1,615 | 0,021 | 78 |
Z danych tych wynika, że pacjent jest zakażony szczepem HIV wykazującym obniżoną wrażliwość na większość badanych nukleozydowych i nienukleozydowych leków przeciwre186 473 trowirusowych. Leczenie można jeszcze rozpocząć takimi lekami jak D4T lub DDC. Można rozważyć włączenie do terapii inhibitorów proteazy.
Przykład 9
Od pacjenta zakażonego HTV, leczonego wieloma nukleozydowymi analogami inhibitorów AZT, pobrano osocze i oznaczono wrażliwość na różne inhibitory RT, zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1. Jako porównawczego wirusa HIV użyto zrekombinowanego szczepu dzikiego HIV recIIIB. W tabeli 5 podano zmierzone wartości IC50 (pM) i stosunek tych wartości. Wykres słupkowy przedstawiający względne zmiany wrażliwości na lek przedstawiono na fig. 9a. Antivirogram® przedstawiono na fig. 9B.
Tabela 5
| Lek | Aktywność anty-HIV-1 IC5 (pM) | ||||
| Dośw. 1 | Dośw. 2 | Średnia (1) | recIUB (2) | Stosunek (l)/(2) | |
| AZT | >100,000 | NO | >100,000 | 0,291 | >344 |
| 3TC | >100,000 | >100,000 | >100,000 | 16,670 | >6 |
| ddl | >100,000 | >100,000 | >100,000 | 4,757 | >21 |
| ddC | 60,079 | 73,049 | 66,564 | 3,444 | 19 |
| d4T | >100,000 | >100 | >100,000 | 12,030 | >8 |
| lowiryd | 0,064 | 0,058 | 0,061 | 0,065 | 0,9 |
| tiwirapina | 0,052 | 0,043 | 0,048 | 0,042 | 1 |
Z danych tych wynika, że pacjent jest zakażony szczepem HIV wykazującym obniżoną wrażliwość na wszystkie analogi nukleozydowe leków przeciwretrowirusowych. Nienukleozydowe leki nie powinny być wyłączone z terapii. Tutaj także można rozważyć włączenie do terapii inhibitorów proteazy.
Przykład 10
Od pacjenta zakażonego HIV, dotychczas nie leczonego, pobrano osocze i oznaczono wrażliwość na różne inhibitory RT i inhibitory proteazy, zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1. Jako porównawczego wirusa HIV użyto zrekombinowanego szczepu dzikiego HIV recIIIB. W tabeli 6 podano zmierzone wartości IC50 (pM) i stosunek tych wartości. Wykres słupkowy przedstawiający względne zmiany wrażliwości na lek przedstawiono na fig. 10A. Antivirogram® przedstawiono na fig. 10B.
Tabela 6
| Lek | Aktywność anty-HIV-1 IC50 (pM) | ||||
| Dośw. 1 | Dośw. 2 | Średnia (1) | RecHEB (2) | Stosunek (l)/(2) | |
| AZT | 0,019 | 0,019 | 0,019 | 0,041 | 0,5 |
| 3TC | 1,525 | 1,718 | 1,622 | 4,608 | 0,4 |
| sakwinawir | 0,003 | 0,003 | 0,003 | 0,006 | 0,4 |
| ritonawir | 0,22 | 0,017 | 0,019 | 0,033 | 0,6 |
| mdinawir | 0,013 | 0,013 | 0,013 | 0,016 | 0,8 |
Z danych tych wynika, że pacjent został zakażony szczepami HIV bardzo podobnymi do szczepu dzikiego. Wszystkie leki nadają się do leczenia, a zatem chemioterapię można rozpocząć takim lekiem jak AZT, 3TC lub innymi dającymi pozytywny wynik.
186 473
Przykład 11
Od pacjenta zakażonego HIV, leczonego inhibitorami RT i proteazy, pobrano osocze i oznaczono wrażliwość na różne inhibitory RT i proteazy, zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1. Jako porównawczego wirusa HIV użyto zrekombinowanego szczepu dzikiego HIV reclllB. W tabeli 7 podano zmierzone wartości IC50 (pM) i stosunek tych wartości. Wykres słupkowy przedstawiający względne zmiany w wrażliwości na lek przedstawiono na fig. 11 A. Antivirogram® przedstawiono na fig. 1 IB.
Tabela 7
| Lek | Aktywność anty-HIV-1 IC50 (pM) | ||||
| Dośw. 1 | Dośw. 2 | Średnia (1) | reclllB (2) | Stosunek (l)/(2) | |
| AZT | NO | 0,015 | 0,015 | 0,047 | 0,3 |
| 3TC | >100,000 | 93,962 | 96,981 | 5,178 | 19 |
| sakwinawir | 0,014 | 0,015 | 0,014 | 0,012 | 1 |
| ritonawir | 1,198 | 1,739 | 1,468 | 0,062 | 24 |
| indinawir | 0,229 | 0,416 | 0,323 | 0,027 | 12 |
Z danych tych wynika, że pacjent jest zakażony szczepem HIV wykazującym obniżoną wrażliwość na inhibitor RT - 3TC i inhibitory proteazy - indinawir i ritonawir. Tak więc chemioterapię można prowadzić z użyciem leków, takich jak AZT lub sekwinawir, dających pozytywny efekt.
Przykład 12
Od pacjenta zakażonego HIV, leczonego inhibitorami RT i proteazy, pobrano osocze i oznaczono wrażliwość na różne inhibitory RT i proteazy, zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1. Jako porównawczego wirusa HIV użyto zrekombinowanego szczepu dzikiego HIV reclllB. W tabeli 8 podano zmierzone wartości IC50 (pM) i stosunek tych wartości. Wykres słupkowy przedstawiający względne zmiany wrażliwości na lek przedstawiono na fig. 12A. Antivirogram® przedstawiono na fig. 12B.
Tabela 8
| Lek | Aktywność anty-HIV-1 IC50 (pM) | ||||
| Dośw. 1 | Dośw. 2 | Średnia (1) | reclllB (2) | Stosunek (l)/(2) | |
| AZT | 3,833 | 3,355 | 3,594 | 0,041 | 88 |
| 3TC | >100,000 | >100,000 | >100,000 | 4,608 | 22 |
| sakwinawir | 0,350 | 0,352 | 0,351 | 0,006 | 56 |
| ritonawir | 1,610 | 1,530 | 1,570 | 0,033 | 47 |
| indinawir | 0,124 | NO | 0,124 | 0,016 | 8 |
Z danych tych wynika, że pacjent jest zakażony szczepem HIV wykazującym obniżoną wrażliwość na inhibitory RT - 3TC i AZT i inhibitory proteazy -indinawir, ritonawir i sekwinawir.
186 473
Przykład 13
Porównanie fenotypowania z genotypowaniem
Pobrano próbki osocza od pacjentów zakażonych HIV leczonych jednym nienukleozydowym inhibitorem RT (NNRTI) przez długi okres czasu. Wyekstrahowano HIV-RNA, poddano odwrotnej transkrypcji i /amplifikowano w sposób opisany w przykładzie 1. Rozczynając od zewnętrznego materiału PCR pozytywnych próbek, zamplifikowano 785 nukleozydów genu RT i materiał ten użyto do genotypowania.
W skrócie, fragment 785 nukleotydów poddano cyklicznym reakcjom sekwencjonowania z użyciem zestawu znakowanego fluorescencyjnie startera do cykli sekwencjonowania ThermoSequenase (ThermoSequenase jest znakiem towarowym) i 7-deaza-dGTP z Amersham (nr kat. RPN2438). Dla każdej próbki użyto cztery startery do sekwencjonowania, wybrane tak by możliwe było oznaczenie w obu kierunkach od nukleotydu 27 do nukleotydu 681 genu RT. Reakcje analizowano w automatycznym sekwenatorze ALF (ALF jest znakiem towarowym) (Pharmacia). Wygenerowane sekwencje przeniesiono do Power Macintosh® i dalej analizowano za pomocą oprogramowania GeneWorks® 2.5 (Oxford Molecular Group Inc.). Końcowe sekwencje aminokwasowe porównano z odpowiadającym im klonem laboratoryjnym HIV-1 - HXB2D i zidentyfikowano -mutacje odpowiedzialne za oporność w materiale pacjenta. Wyniki przedstawiono w tabeli 9, gdzie użyto jednoliterowego kodu aminokwasowego.
186 473
Tabela
| Stopień oporności na | NNRTI 2 | co | r·** fC rj- | cc <n | Γ* oo | θ' | cn | 245 | r* MD | 00 | CN | f 172 | Os MO MO | m | 455 | 349 | 449 |
| NNRTI 1 | c- | sO V» | -1 102 | o cn | - | tt | cn o ł-M | CN | o m | >1432 | cn md | 321 | - | >1466 | en OS | >2424 | |
| 3TC | so | 0,4 | - | θ' | 0,4 | m θ' | 0,04 | - | - | θ' | 00 Λ | CN | - | - | |||
| AZT | «/-) | - | - | θ' | 0,3 | - | - | - | CM | 0,4 | 94 | 28 | - | - | CN | ||
| Mutacje związane z opornością | , o iż — | Tt | σ | NO | |||||||||||||
| T 215 | 22 | tu | |||||||||||||||
| O o os | CJ | G/A | |||||||||||||||
| M 184 | > | ||||||||||||||||
| >i oo | o | α | |||||||||||||||
| Os | < | ||||||||||||||||
| > 2 | 00 | ||||||||||||||||
| s^J o | r- | z | ζ/) | z | z | CO | z | Z | z | l | z | Z | |||||
| iż O | Ό | ω | |||||||||||||||
| A 98 | «Λ | ||||||||||||||||
| K 70 | Tj- | & | |||||||||||||||
| D 67 | r*j | % | |||||||||||||||
| d | J | j | |||||||||||||||
| CU | - | - | CN | m | MO | 00 | Os | O | — | CN | cn | xi- | VT |
R?
CO
Ό $
o □s o
§
| OO | »ΖΊ | 102 | 181 | 260 | »/-> CN | 68 | m | O\ | 59 |
| r* | 21 | 29 | 95 | 78 | CN CN | 47 ’ | co | o\ | r- |
| 00 Λ | - | ł»«H | - | - | θ' | Tf θ' | CN O | - | |
| «Λ | - | - | - | »-4 | θ' | --, 0,2 | - | ||
| Tf· | |||||||||
| C4 | |||||||||
| - | > | ||||||||
| o | |||||||||
| o | |||||||||
| 00 | - | ||||||||
| r* | 2 | Z | GO | Z | Z | Z | |||
| ό | o- | ||||||||
| •Λ | o | ||||||||
| r*> | |||||||||
| n | |||||||||
| - | 17 | 00 | o <N | CN | 22 | 23 | TT CN |
186 473
Górny rząd tabeli 9 przedstawia aminokwasy (AA) znalezione w sekwencji szczepu dzikiego i ich pozycję. Zmiany aminokwasów w tych pozycjach przedstawiono dla każdego pacjenta w kolejnych rzędach. Pokazano tylko pozycje, w których wykryto zmiany w materiale pacjentów. Prawa część tabeli 9 przedstawia stopień oporności na różne inhibitory RT, co wyznaczono na podstawie sposobu według wynalazku dla każdej z próbek pobranych od pacjentów. NNRTI 1 jest nienukleozydowym inhibitorem RT, który podano pacjentom. NNRTI 2 jest innym nienukleozydowym inhibitorem RT, dla którego obserwowano częściową reatywność krzyżową z pierwszym.
Wyniki genotypowania odnośnie oporności na nukleozydowe inhibitory RT są następujące:
- Mutacje M41L, D67N, K70R, T215F/Y i K219Q/E są mutacjami związanymi z opornością na AZT (Larder, B. i Kemp, S. (1989) Science 246, 1155-1158; Kellam, P. i inni (1992) PNAS 89, 1934-1938). Ich obecność pojedynczo lub w połączeniu z innymi w genomie HIV wyizolowanego z materiału pacjenta koreluje z fenotypową opornością, oznaczoną za pomocą Antivirogram® (pacjenci 11 i 12).
- To samo dotyczy oporności na 3TC związanej z mutacją M184Y (Tisdale, M. i inni (1993) PNAS 90, 5653-5656), którą obserwowano tylko u pacjentów wykazujących fenotypową oporność na lek (pacjenci 11 i 16).
Wyniki genotypowania odnośnie oporności na NNRTI są następuj ące:
- Trzej pacjenci (3, 4 i 12) nie mają mutacji związanej z opornością na NNRTI i są fenotypowo wrażliwi na lek.
- Większość pacjentów wykazuje fenotypową oporność na NNRI 1 i NNRI 2 związaną z obecnością mutacji w pozycji 103 (K103N/S).
- Jeden pacjent (9) ma mutację Y181C związaną z opornością na NNRTI i wykazuje wysoką oporność fenotypową (>1432 krotnie) na NNRTI 1.
- Pacjent 13 ma kilka mutacji związanych z opornością na NNRTI (K10 1E, K103N częściowo i G190A częściowo). Ten pacjent również wykazuje wysoką oporność fenotypową (>1466) na NNRTI 1. Mutacja E138A obserwowana w próbce nie jest, jak dotąd, związana z opornością. Jednakże stwierdzono, że inna mutacja w tej pozycji, to jest E138K, odgrywa istotną rolę w oporności na związki TSAO (Balzarini, J. i inni (1993) PNAS 90, 6952-9656). Rola mutacji E138A w dalszym ciągu wymaga ustalenia.
- Pacjent 20 ma mutację A98G związaną z opornością na NNRTI i wykazuje fenotypową oporność w teście z NNRTI.
- Pacjent 22 ma mutację VI08l związaną z opornością, ale nie wykazuje fenotypowej oporności w teście z NNRTI.
- Pacjent 24 nie ma żadnej mutacji związanej z opornością na NNRTI (mutację K101Q znajduje się w kilku genomach HIV typu dzikiego), ale jest fenotypowo oporny w teście z NNRTI.
Wykaz sekwencji (1) Infoimacja oga łon:
(i) Zgłaszający:
(A) Nazwa: VIRCO N.V.
(B) Ulica: Drie Eikenstraat 661 (c) Miasto: Edegem (E) Państwo: Belgia (F) Kod pocztowy: B-2650 (A) Nazwisko: DE BETHUNE, Marie-Pierre (B) Ulica: Tweeleeuwenstraat 15 (C) Miasto: Everburg (E) Państwo: Belgia (F) Kod pocztowy: B-3078
186 473 (A) Nazwisko: HERTOGS, Kurt (B) Ulica: Sint Vincentiusstraat 53 (C) Miasto: Antwerpia (E) Państwo: Belgia (F) Kod pocztowy: B-2018 (A) Nazwisko: PAUWELS, Rudi (B) Ulica: Damstraat 166 (C) Miasto: Weerde (E) Państwo: Belgia (F) Kod pocztowy: B-1982 (ii) Tytuł zgłoszenia: Sposób oceny in vitro chemioterapii HIV u pacjentów HIV dodatnich oraz sposób oznaczania fenotypowej wrażliwości lekowej poszczególnych szczepów HIV u pacjenta na inhibitory co najmniej dwóch enzymów kodowanych przez gen pol HIV (iii) Liczba sekwencji: 6 (iv) Sposób odczytu komputerowego:
(A) Typ nośnika: Dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (c) System operacyny:PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: PatentIn Release #1.0, wersja #1.30 (EPO) (vi) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: EP 96200175.6 (B) Data zgłoszenia: 26 stycznia 1996 (2) Informacja o SEQ ID NO: 1:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość:pojepync;sł (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Źródło:
(A) Organizm: LudzeLwirus wieuoboed odpomoścó typu 1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 1:
CATTGCTCTC CAATTACTGT GATATTTCTC ATG 33 (2) Informacja o SEQ ED NO: 2:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 26 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza
V - / Λ (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Źródło:
(A) Organizm: Ludzki wirus niedoboru odporności typu 1
1864173 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 2:
GGGAAGATCT GGCCTTCCTA CAAGGG (2) Informacja o SEQ ID NO: 3:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyńcza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Źródło:
(A) Organizm: Ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 3:
GCCCCTAGGA AAAAGGGCTG TTGG (2) Informacja o SEQ ID NO: 4:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Źródło:
(A) Organizm: Ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 4:
TGAAAGATTG TACTGAGAGA CAGG (2) Informacja o SEQ ID NO: 5:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Źródło:
(A) Organizm: Ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (xi) Opis sekwencji: SEO ID NO: 5:
GATATTTCTC ATGTTCATCT TGGG (2) Informacja o SEQ ID NO: 6:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy
186 473 (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Źródło:
(A) Organizm: Ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 6:
AGGTGGCAGG TTAAAATCAC TAGC
186 473
Fig. 1
Eaml lOSHAhdl
Xbal
Xbal
ETAP1
Trawienie pHIVABstEli zapomocą Ahdl Traktowanie DNA pol I (fragment Klenowa) Trawienie za pomocą Apai
Oczyszczanie fragmentu -270 bp Apai-Ahdl i podklonowanie do pGEMzf(-) otwartego Apal/Smal
ETAP 2
Podklonowanie fragmentu Xbal w pGEM9zf(-) tak , aby pozostało tylko jedno miejsce Apal.
Eaml 1051
Klenowa) fragmentem -27Gpz Apal-Xmał z pGcM7-Tt (końce Xmat traktowane fragmentem Klenowa) pGEM9-T3
Ha Ludzkie sekwencje genomowe flankujące prowirusa HIV || ARTBstEIl US Proteaza
186 473
Fig. 2
ETAP1
5’-GACNNN/NNGTC (miejsce rozpoznawania i dęcia Ahdl)
5’-GACCCC/TCGTC (miejsce Ahdl na początku regionu kodującego proteazę) Trawienie Ahdl.
Usunięcie wolnego nukleotydu wystającego na 3’ końcu przez potraktowanie polimerazą DNA I (fragment Klenowa)
5’-GACCC * 5’-CCC/GGG (Smal) ligacja tępych końców przywraca miejsce Smal
ETAP 3
5’-GAC/CCGGG 5’-G/GTNACC (BstEll)
5’-G/GAGACC (BstEll w klonie ART)
Przywrócone miejsce rozpoznawane przez Smal rozszczepia się za pomocą Xmal (z utworzeniem 4-nukleotydowego fragmentu wystającego na końcu δ* 1) i przekształca się w tępy koniec przez potraktowanie polimerazą DNA I (fragment Klenowa).
Podobnie wektor przejmujący pGEM9-T2, strawiony BstEll traktuje się połiDNAl (fragment Klenowa) przez trawiewniem Apal
GACCCGG ► GTGACC
GACCCgggtgACC (podkreślony kodonem jest P9 w genie proteazy). W miejscach włączenia APrcRT jest zarówno miejsce Sma!/Xma! jak i BstEll. Obce sekwencje” w miejscach włączenia AProRT przedstawiono małymi literami.
186 473
Fig. 3
2000 2500 3000
3500
4000
Sami TOSI
MunH
Styl
Avrll
Banll
Apal rBsttt/Bgin rEart rBsu36l rEaml 1 OSI r8dl
PpuMI •Accl
HindU
Hindll i-Eaei •Mscl
Sst11071
EcoRV
SspJ rBstYI
Bpml
PvullrPflMI £Pvu**£ •Kpnl
Kprtl rBspMi rPvull r Accl
(AProRT)
I
186 473
ΒΧΒ2 (zakres sekwencji: 1800 do 4400)
Fig. 4A >wsPi >Eaml 105 J 1 I
1800 1810 1820 1830 | |1840 * * * ’ f I ·
GGA CCA GCG GCT ACA CTA GAA GAA ATG ATG ACA GCA TGT CAG
GPAATLEEMMTACQ _a_a_a a_POLIPROTEIN A GAG _a_a a_a_a_ >ppuMl >Eael i I
1850 | | 1860 1870 1880 * I f ' * *
GGA GTA GGA GGA CCC GGC CAT AAG GCA AGA GTT TTG GCT GAA GVGGPG8KARVLAE _a_a_a a_POLIPROTEINA GAG _a_a_a_a_a
1890 1900 1910 1920
GCA ATG AGC CAA GTA ACA AAT TCA GCT ACC ATA ATG ATG CAG AMSQVTNSATIMHO _a_a a a_POLIPROTEIN A GAG _a_a_a a_a_ >Muri
I
1930 1940 1950 1960 i • « * «I t
'AGA GGC AAT TTT AGG AAC CAA AGA AAG ATT GTT AAG TGT TTC RGNFRKQRXIVKCF _a_a___a_a_ POLIPROTEINA GAG _a_a_a_a_a_ >BanII
I >ApaI
1970 1980 1990 2000 | * * * · (
AAT TCT GGC AAA GAA GGG CAC ACA GCC AGA AAT TGC AGG GCC RCGKEGHTARNCRA _a_a_a_a_ POLIPROTEINA GAG a a_a_a a < bezpośrednie powtórzenie#!-------> >AvrII
I >StyI
I
2010 2020 « ·
CCT AGG AAA AAG GGC P R K K G a a_a_a_
2030 2040 2050
TGT TGG AAA TGT GGA AAG GAA GGA CAC CWKCGKEC8 POLIPROTEINA GAG _a_a_a_a_a_ * bezpośrednie powtórzenie#? ~
2060 2070 2080 2050 • » · .
CAA ATG AAA GAT TGT ACT GAG AGA CAG GCT AAT TTT TTA GGG QHKDCTERQANFLG _a_a_a_a_POLIPROTEINA GAG a_a_a <—
186 473 >5glii
I >0StYI 1
2100
2110
2120
2130
AAG ATC TGG CCT TCC TAC AAG GGA AGG CCA GGG AAT TTT CTT g I WPSYKGR PGWFL a_ a_a_a_POLIPROTEINAGAG .a_ a a__a_a_
L
---- RVPS‘
2140
2150 >Earl f
2150 i
2170
CAG AGC AGA CCA GAG CCA ACA GCC CCA CCA GAA GAG AGC TTC PTAPPEESF
POI JPROTEINA GAG a_a_a_a_a_
PTAPPEESF b_b_b_b _b_b_b b GAG P6 (52 AA)_b
2180 2190 2200
2210
AGG TCT GGG GTA GAG ACA ACA ACT CCC CCT CAG AAG CAG GAG rsgvetttppqkqe _4_A_a_a_ POUPROTEINAOAG _a_a_a_a a
RSgvetttppqkQ£ __b_b_ b. b gag P6 (52 AA)_b_b__b b b >Bsu36I
2220 2230 2240 2250 j 2260 • * » * | «
CCG ATA GAC AAG GAA CTC TAT CCT TTA ACT TCC CTC AGG TCA
PrDKELYPLTSLBS _a_a a a_ POUPROiŁINA GAG a_a_a_a_a_
PIDKELYPL*TSLRS __b_b_b_b_GAG Pó (52 AA)_b_b_b_b_b_
P Q V _c_c_c_ |-->APro >Earall05l
I
2270 2280 2290 2300 » j ♦ · «
CTC TTT GGC AAC GAC CCC TCG TCA CAA TAA AG ATA GGG GGG LFGHDPSSQ » a a POUPROTEINA GAG a a_a_
LFG80FSSQ _b_b GAG PS (52 AA) b b
TLWQRPLVTIXIGG _c_c_Ccc PROTEAZA _c_c_c c c c_ j—>AProRT (Tibotec)
2310 2320 2330 2340 • · a ·
CAA CTA AAG GAA GCT CTA TTA GAT ACA GGA GCA GAT GAT ACA QLKEALLDTGADDT _ _S_5 . c -_ę c___EEOIRilZA- _£ _£__c_c c
186 473
Fig. 4C
| ź.ł5Ć GTA TTA GAA | 2ύόύ GAA ATG ACT | 237 0 | 2380 TGG AAA | CCA AAA | ||||
| TTG CCA GGA | AGA | |||||||
| V L | E | EMS | L P | G | R | W K | P | K |
| c_< | :_< | z c c PROTEAZA . | < | : J | -ccc | |||
| >8cll | ||||||||
| 2390 | 2400 | 2410 | 2420 | 1 1 I | ||||
| ATG ATA | GGG | GGA ATT GGA | GGT TTT | ATC | AAA | GTA AGA | CAG | TAT |
| H I | G | G I C | G F | I | K | V R | Q | Y |
c _c_c_c__c_PROTEAZA_c_c_c_c_c_
2430 2440 2450 2460 247C . · · ·
GAT CAG ATA CTC ATA GAA ATC TGT GGA CAT AAA GCT ATA GGT OQILTEICGHKAIG c _c_c *?__c PROTEAZA_c_c_c_c_c__ >PpuMI >BindH i 1
| ACA | GTA | 2480 TTA GTA | 1 I GGA | 2490 CCT ACA | J2S00 I · | 2510 GGA AGA | ||
| CCT | GTC AAC ATA | ATT | ||||||
| T | V | L W | C | P «Τ· | P | V Ν I | I | G R |
c _c_c_c__c_PROTEAZA _c_c___c_c_c
-------OUT5------------------------>
>SmdII i
2520 2530 2540 2550
AAT CTG TTG ACT CAG ATT GGT TGC ACT TTA AAT TTT CCC ATT NLLTOIGCTLNF _c_ccc_PROTEAZA _c_c__c_c_
P I d
2560 2570 2580 2590 • * · T
AGC CCT ATT GAG ACT GTA CCA GTA AAA TTA AAG CCA GGA ATC spietvpvklkpgh _d_d_d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA d_d d d_
---IH5------------>
APro--->| >MscI
I >EaeI
2600 2610 2620 2630 . « | ’ «
GAT GGC CCA AAA GTT AAA CAA TGG CCA TTG ACA GAA GAA AAA dgpkvxqwplteek d d d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA _d_d d d
186 473
Fig. 4D
2650 2660 2670 26SC » » * » ·
ΑΤΑ AAA GCA TTA GTA GAA ATT TGT ACA GAC ATG GAA AAG GAA IKALVEXCTEHEKE
.. __d___d_d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA _d__ d__d_d__ ’ | ’--->ART >BpmI
I
2690 2700 | 2710 2720 * . | « ·
GGG AAA ATT TCA AAA ATT GGG CCT GAA AAT CCA TAC AAT ACT GKISKIGPENPYNT . d___d_d__ODWROTNA TRANSKRYFTAZA_d_d__d__d _
2730 2740 2750 2?5C • ft * «
CCA GTA TTT GCC ATA AAG AAA AAA GAC AGT ACT AAA TGG AGA ? V F A I KKKDSTK WR _d_d_d_ ODWROTNA TRANSKRYPTAZA_d_d_d_d__
2770 2780 2790 2800 « « *
AAA TTA GTA GAT TTC AGA GAA CTT AAT AAG AGA ACT CAA GAC KLVOFkELNKRTQD _d__d_d_ODWROTNA TRANSKRYTTAZA_d____d_d_d_
2810 2820 2830 2840 ł ♦ ·
TTC TGG GAA GTT CAA TTA GGA ATA CCA CAT CCC GCA GGG TTA FWEVQLGIPH PA GL __d __d_d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA _ d__d_d_d_
2850 2860 2870 2880 2890 ł 0 0 · «
AAA AAG AAA AAA TCA GTA ACA GTA CTG GAT CTG GGT GAT GCA KKKKSVTVLDVGDA
-d_d_d-ODWROTNA TRANSKRYPTAZA__d_d_d__d_ >0stllO?I
I >acc r II
2900 2910 2920 |2930 ‘ * * II *
TAT TTT TCA GTT CCC TTA GAT GAA GAC TTC AGG AAG TAT ACT YFSVPŁD£DFRK Y T _d_d d odwrotna TRAN SKRYPT AZA_d_d_d_d_
2940 2950 2960 2970 « « « «
GCA TTT ACC ATA CCT AGT ATA AAC AAT GAG ACA CCA GGG ATT AFTIPSINNETPGI _d d d nnwBOTNA TRANSKRYPTAZA d d_d_d_ >EcoRV
2980 2990 3000 3010 | * * - «
AGA TAT CAC TAC AAT GTG CTT CCA CAC GGA TGG AAA GGA TCA RYQYNVLPQGWK GS -d-d-d-ODWROTNA TRANSKRYPTAZA—d_d_d_d_
186 473
Fig. 4Ε
| >Sspl | |||||||
| 3020 | i 3030 | « | 3040 α | 3050 a | ||||
| CCA GCA | I ATA TTC CAA | AGT | AGC ATG | ACA | AAA ATC TTA | GAG | CCT |
| P A | I F Q | S | S M | T | KIL | E | P |
_d_d__d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA_d___d_d_d_
3060 3070 3080 3090 3100 • ’ « «
TTT AGA AAA CAA AAT CCA CAC ATA GTT ATC TAT CAA TAC ATG FRKQHPOIV I Y Q Y « _d_d_d_ODWROTNATRANSKRYPTAZi<_d_d d d_
RBstYI
I
3110 | 3120 3130 3140
- |
GAT GAT TTG TAT GTA GGA TCT GAC TTA GAA ATA GGG CAG CAT ODŁYYGSOL Ε I G Q 8 _d_d_d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA __d_d_d_d
3150 3160 3170 3180 β · · >
AGA ACA AAA ATK GAG GAG CTG AGA CAA CAT CTG TTG AGG TGG RTKIEELRQ H LLRW _d_d d ODWROTNA TRANSKRYPTAZA d d d d_
3190 3200 3210 3220 » · · *
GGA CTT ACC ACA CCA GAC AAA AAA CAT CAG AAA GAA CCT CCA GLTTPDRKS Q K Ε P P _d_d_d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA d_d_d_d_
3230 3240 3250 3260 » « · ·
TTC CTT TGG ATG GGT TAT CAA CTC CAT CCT GAT AAA TGG ACA FLWMGYELH PDKWT _d d d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA_d_d_d_d >PvuII
I
3270 3280 3290 3300 3310 a · · t t
GTA CAG CCT ATA GTG CTG CCA GAA AAA GAC AGC TGG ACT GTC VQPIVLPEK 0SWTV _d d d ODWROTNA TRANSKRYPTAZA_d_d d d
3320 3330 3340 3350 β · o r
AAT GAC ATA CAG AAG TTA GTG GGG AAA TTG AAT TGG GCA AGT NDIQXLVGK LNWAS _d d d ODWROTNA TRANSKRYPTAZA d d d d
3360 3370 3380 3390 » « . «
CAG ATT TAC CCA GGG ATT AAA GTA AGG CAA TTA TGT AAA CTC QIYPGIKVR Q L C K L d d_d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA d d d d
Fig. 4F
3400 3410 3420 3430
| CTT AGA L R | GGA ACC AAA GCA CTA ACA GAA GTA ATA CCA | CTA ACA L T | |||||
| G | TKA | L T | E | V | 1 P | ||
| d < | i_ | d__ODWROTNA TRANSKRYPTAZA__d. | _d_. | d_d_ | |||
| 3440 | 3450 | 3460 β | 3470 ff | ||||
| GAA GAA | GCA | GAG CTA GAA | CTG GCA | GAA | AAC AGA GAG | ATT CTA | |
| E E | A | ELE | L A | E | N | R E | 1 L |
| d__d_' | d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA_d. | _d_d d | |||||
| >P£JLMI | |||||||
| 3480 | 1 34SO | . t | 3500 « | 3510 a | 3520 | |||
| AAA GAA | CCA | 1 GTA CAT GGA | GTG TAT | TAT | GAC CCA TCA | AAA GAC | |
| K E | P | V 8 G | V Y | Y | O | P S | K D |
d d_d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA d d_d_d_
3530 3540 3550 3560 • » O «
ΤΤΛ ATA GCA GAA ATA CAG AAG CAG GGG CAA GGC CAA TGG ACA LIA£IQKQGQCQWT d d_d _ ODWROTNA TRANSKRYPTAZA—d_d d d_
3570 3580 3590 3600 « * β a
TAT CAA ATT TAT CAA GAG CCA TTT AAA AAT CTG AAA ACA GGA yQIYOEPFKHLKTG d d_d___ODWROTNA TR.aNKKRVPTa7a d d_d_d_
3610 3620 3630 3640 • « a «
AAA TAT GCA AGA ATG AGG GGT GCC CAC ACT AAT GAT GTA AAA KYARKRGAHTNDVK
-d-d-d-ODWROTNA TRANSKRYPTAZA—d-d-d-d36S0 3660 3670 3680 « · · *
CAA TTA ACA GAG GCA GTG CAA AAA ATA ACC ACA GAA AGC ATA QŁTEAVQKITTES I d d d d d d d
- -----ODWROTNA TRANSKRYPTAZA----3690 3700 3710 3720 3730 , · t, tt O
CTA ATA TGG GGA AAG ACT CCT AAA TTT AAA CTG CCC ATA CAA VIHGKTPKFKLPXQ __d-d-d-ODWROTNA TRANSKRYPTAZA —d-d-d-d3740 3750 3760 3770 ♦ o ύ <
AAG GAA ACA TGG GAA ACA TGG TGG ACA GAG TAT TGG CAA GCC KETWETWHTEYWQA
-d-d-d-ODWROTNA TRANSKR YPTAZA—d-d-d-d3780 3790 3800 3810 » ’ W »
ACC TGG ATT CCT GAG TGG GAG TTT GTT AAT ACC CCT CCC TTA TWIPEHEFVNTPPL
-d- d-d-ODWROTNA TRANSKRYPTAZA—d-d-d-d186 473 i* ig- 4G >KpnI
I
3820 3830 3040 3850 ’ I ·
GTG AAA TTA TGG TAC CAG TTA GAG AAA GAA CCC ATA GTA GGA VKLWYQLEKEP I V G _d_d_d_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA d__d_d d_
3860 3870 3880 3890 « · · .
GCA GAA ACC TTC TAT GTA GAT GGG GCA GCT AAC AGG GAG ACT AETFYVDGAANRET
-d-d-d-ODWROTNA TRANSKRYPTAZA~d-d-d-d3900 3910 3920 3930 3940 r * · « AAA TTA GGA AAA GCA GGA TAT GTT ACT AAT AGA GGA AGA CAA KLGKAGYVTNRGRQ
-d-d-d-ODWROTNA TRANSKRYTTAZA—d-d-d-d3950 3960 3570 3980 • » » ·
AAA GTT GTC ACC CTA ACT GAC ACA ACA AAT CAG AAG ACT GAG XVVTLTOTTNQKTE
-d-d-d-ODWROTNA TRANSKRYPTAZA—d-d-d d3990 4000 4010 4020
TTA CAA GCA ATT TAT CTA GCT TTG CAG GAT TCG GGA TTA GAA LQAIYLALQOSGLE -d-d-d-ÓDWROTNA TRANSKRYPTAZA—d-d-d-d
| 4030 | GTA | 4040 ACA GAC | 40S0 | 4060 TTA GGA | ATC ATT | ||||
| GTA AAC | ATA | TCA CAA TAT | GCA | ||||||
| V N | I | V | T D | S | Q Y | A | L G | I | I |
-d-d-d-ODWROTNA TRANSKRYPTAZA—d-d-d-d
4070 4080 4090 4100
CAA GCA CAA CCA GAT CAA AGT GAA TCA GAG TTA GTC AAT CAA 0ACPDQSESELVN<5
-d-d-d-ODWROTNA TRANSKRYPTAZA—d-d-d-d4110 4120 4130 4140 41S0
ATA ATA GAG CAG TTA ATA AAA AAG GAA AAG GTC TAT CTG GCA I IEQEIKKEXV Y L A d d ART-->|
AProRT (Tibotec) —>|
ODWROTNA TRANSKRYPTAZA— >KpnI
I |4160 4170 4180 4190 | * * » TGG GTA CCA GCA CAC AAA GGA ATT GGA GGA AAT GAA CAA GTA MVPA8KGIGGNEQV ddd_ODWROTNA TRANSKRYPTAZA_d_d_d_d_
Fig.4H
4200 4210 4220 4230 β « Λ ·
GAT AAA TTA GTC AGT GCT GGA ATC AGG AAA GTA CTA TTT TTA DKLVSAGIRKVLFL _d._.d . d-ODWROTNA TRANSKRYPTAZA—d d___d____d
4240 4250 4260 4270 4280
GATGGA ATAGATAAGG CCCAAGATGA ACATGAGAAA TATCACAGTA >BspHI i
4290 4300 4310 4320 4330 . * * | « ·
ATTGGAGAGC AATGGCTAGT GATTTTAACC TGCCACCTGT AGTAGCAAAA >PvuII
I
4340 | 43S0 4360 4370 4380 . | - « · ·
GAAATAGTAG CCAGCTGTGA TAAATGTCAG CTAAAAGGAG AAGCCATGCA >AccI
I
4390 4400 i · ·
TGGACAAGTA GACTGTAGTC
186 473
Δ Wrażliwość Lowiryd
Fig. 5
Λ Wrażliwość
Fig. 6
186 473
Względna zmiana wrażliwości na lek
Oporność pacjenta Wzrost ; Maksymalna mierzą Ina oporność °Pomoscl —iodchylenie stand, normalny ”,, . zakres
LEK 1 Oporność złożoma χ oj : 1 :
| i)azt | SS | 2 | |
| 2)3TC | s | 2 | Ote |
| 3)DDI | s | 0,7 | |
| 4)DDC | s | 0,8 | |
| 5)04T | SS | 1 | |
| 6) LOWIRYD | s | 1 | |
| 7)TIWIRAPINA | 2 |
Maksymalna mierzalna oporność Rzeczywista oporność próbki pacjenta Szczep odniesienia ΠΙΒ
Fig.7B
186 473
Względna zmiana wrażliwości na lek
Wzrost oporności
LEK
| 1)AZT | = 241 |
| 2)3TC | > 16 |
| 3)D0l | - 1 3 |
| 4)D0C | = 5 |
| 5)D4T | =s 1 |
| 6) LOWIRYD | > 2717 |
| 7)TIWTRAPINA | = 78 |
—t: odchylenie stand, normalny Λ .. . . zakres
Oporność ziozona x 0,1 : Oporność pacjenta ; Maksymalna mierzalna oporność
Fig. 8A
Maksymalna mierzalna oporność Rzeczywista oporność próbki pacjenta Szczep odniesienia LUB
Fig. 8B
LEK
1) AZT
2) 3TC
3) DDI
4) 0 DC
5) D4T
6) Lowiiyd
7) Tiwuapina
Względna zmiana wrażliwości na lek β • Oporność pacjenta
Wzrost | | ; Maksymalna mierzalna oporność oporności —-j: odchylenie stand, normalny . zakres
Oporność ztozona χ 0,1 · 1 : 1 o 100
Fig. 9A
Maksymalna mierzalna oporność
Rzeczywista oporność próbki pacjenia Szczep odniesienia 1UB
Fig. 9B
LEK
Względna zmiana wrażliwości na lek
Oporność pacjenta Waoa
Tyfalnymalna mierzalna oporność oporności —|: odchylenie stand. normalny ’ zakres
Oporność złożona x 0,1 ! 1
| AZT j | s | 0,5 |
| 3TC j | s | 0,4 |
| Sakwinawir | | = | 0,4 |
| Ritonawir j | 0,5 | |
| Indinawir J | = | 0,8 |
Fig. 10A
Maksymalna mierzalna oporność Rzeczywista oporność próbki pacjenta Szczep odniesienia IIIB rr, λ *i nt?
F Ig. 1UBJ
186 473
Maksymalna mierzalna oporność Rzeczywista oporność próbki pacjenta Szczep odniesienia ΙΠΒ
Fig. 11B
LEK
AZT
3TC
Sekwmawir
Ritonawir
Indinawir
Względna zmiana wrażliwości na lek
Wzrost ; Oporność pacjenta . Maksymalna mierzalna oporność —1; odchylenie stand. nonnahiy Oporność złożona x 0,1 · 1 oporności
aswaassaamr^ gglll ’ϊ-Ϋ-ίχ'ΐίί.Υ i zzg^żzgggągam; .:.u.
νκζΛ/ίνχχζ/ζ1 cii
Fig- 12A
Maksymalna mierzalna oporność
Rzeczywista oporność próbki pacjenta Szczep odniesienia UlB
Fie. 12B <_7
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.
Claims (39)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób oceny in vitro chemioterapii HTV u pacjentów HTV dodatnich, znamienny tym, że transfekuje się wrażliwe na zakażenie HTV linie komórkowe sekwencją z genu po] HTV, otrzymaną poprzez wyizolowanie wirusowego RNA z próbki materiału biologicznego od pacjenta i odwrotne transkrybowanie żądanego regionu tego genu poi, oraz konstruktem HTV-DNA z wydeletowaną wspomnianą sekwencją, hoduje się transfekowane komórki, z wytworzeniem podstawowej puli chimerycznych wirusów, ocenia się fenotypową wrażliwość chimerycznych wirusów na inhibitor enzymu kodowanego przez gen poi HTV i wyznacza się jej wartość, sporządza się zestaw danych zawierających wartość wrażliwości dla chimerycznych wirusów i odpowiadającą jej wartość dla chimerycznego dzikiego szczepu HIV, powtórnie ocenia się wrażliwość dla co najmniej dwóch innych inhibitorów i sporządza się łącznie co najmniej trzy takie zestawy danych, przedstawia się te zestawy danych w dwuwymiarowej lub trójwymiarowej postaci graficznej takiej, że różnica pomiędzy wartościami wrażliwości wirusów chimerycznych i szczepu dzikiego, w przypadku każdego zestawu danych, stanowi widoczną miarę oporności podstawowej puli wirusów chimerycznych na leczenie danym inhibitorem, oraz wybiera się optymalny inhibitor lub optymalne inhibitory na podstawie graficznego obrazu tak zmierzonych wartości oporności.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zestawy danych przedstawia się na wykresie wielokątowym lub pseudokołowym, gdzie:(a) szereg znormalizowanych osi rozchodzi się promieniowo z początku układu, przy czym każda oś odpowiada jednemu zestawowi danych lub inhibitorowi lub ich kombinacji;(b) osie są znormalizowane tak, że wartości wrażliwości dla dzikiego HIV na różne inhibitory są równe na każdej osi, przy czym reprezentujące dane punkty dla dzikiego HIV ewentualnie nanosi się i łączy z utworzeniem wielokąta foremnego, którego wierzchołki leżą na osiach i którego środek jest zdefiniowany przez początek układu;(c) na każdą z osi nanosi się reprezentujący daną punkt przedstawiający wartość wrażliwości podstawowej puli wirusów chimerycznych HTV na inhibitor odpowiadający danej osi, przy czym reprezentujące dane punkty dla podstawowej puli wirusów chimerycznych ewentualnie łączy się z utworzeniem wielokąta foremnego lub nieforemnego, którego kształt przedstawia oporność podstawowej puli wirusów chimerycznych na szereg inhibitorów.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że każda z osi ma skałę logarytmiczną.
- 4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że niecentralne reprezentujące dane punkty w wielokącie chimerycznym, jeżeli są, wskazują na inhibitory, których przydatność można określić jako małą lub żadną dla pacjenta, podczas gdy reprezentujące dane punkty leżące w obrębie, na lub w pobliżu zewnętrznej strony wielokąta szczepu dzikiego wskazują na inhibitory, których przydatność można określić jako znacząco korzystną dla pacjenta.
- 5. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że każdy z trzech lub więcej zestawów danych dodatkowo zawiera mierzalną dla najgorszego przypadku wartość oporności na dany inhibitor, przy czym te wartości dla najgorszego przypadku przedstawia się na tym wykresie tak, że reprezentujący daną punkt dla podstawowej puli wirusów chimerycznych można porównać z danymi zarówno dla szczepu dzikiego, jak i dla najgorszego przypadku HIV, co umożliwia określenie względnej wartości dla inhibitora w konkretnym przypadku.
- 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że równocześnie oznacza się fenotypową wrażliwość wirusów chimerycznych na inhibitory co najmniej dwóch enzymów kodowanych przez gen poi HIV.186 473
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że materiał biologiczny wybiera się z osocza, surowicy lub wolnego od, komórek płynu ustrojowego wybranego z płynu spermy lub płynu pochwowego.
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako materiał biologiczny stosuje się pełną krew, do której dodano stabilizatora RNA.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako materiał biologiczny stosuje się materiał tkankowy wybrany z tkanki mózgowej i tkanki węzłów limfatycznych.
- 10. Sposób według zastrz. 1 albo 7, albo 8, albo 9, znamienny tym, że co najmniej dwa enzymy wybiera się spośród RT, proteazy i integrazy HIV.
- 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako linią komórkową wrażliwą na zakażenie HIV stosuje się linię komórek T CD4+.
- 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako linię komórek T CD4+ stosuje się linię komórkową MT4 lub HeLa CD4+.
- 13. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że żądany region genu pol pacjenta poddaje się odwrotnej transkrypcji używając specyficznego startera pasującego do końca 3'.
- 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że sekwencja mająca ulec odwrotnej transkrypcji jest sekwencją kodującą odwrotną transkryptazę i proteazę.
- 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że starterem pasującym do końca 3'jest OUT3: 5-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA UT CTC ATG-3' (SEQ ID NO: 1).
- 16. Sposób według zastrz. 13 albo 14, albo 15, znamienny tym, że produkt odwrotnej transkrypcji amplifikuje się przy użyciu umiejscowionej PCR.
- 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się konstrukt HIV-DNA z wydeietowanymi genami RT i proteazy, stanowiący plazmid pGEMT3-APRT zdeponowany w Belgian Coordinated Collections of Microorganisms-BCCM LMBP-Collection w dniu 8 listopada 1996 r., pod numerem LMBP3590.
- 18. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że transfekcję prowadzi się drogą elektroporacji.
- 19. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że transfekcję prowadzi się z użyciem lipidów kationowych.
- 20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że fenotypową wrażliwość lekową chimerycznych wirusów na różne inhibitory RT, proteazy i integrazy ocenia się w automatycznym teście opartym na komórkach.
- 21. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że fenotypową wrażliwość lekową chimerycznych wirusów i dzikiego szczepu HIV na jeden lub większą liczbę inhibitorów RT, proteazy lub integrazy wyraża się w postaci stężenia hamującego (wartość IC).
- 22. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inhibitory RT wybiera się z nukleozydowych inhibitorów RT, takich jak AZT, ddl, ddC, 3TC, d4T, nienukleozydowych inhibitorów RT, takich jak lowiryd, newirapina i tiwirapina, inhibitory proteazy wybiera się z takich jak sakwinawir, indinawir i ritonawir, a inhibitor integrazy z takich jak ester fenylowoetylowy kwasu kofeinowego (CAPE).
- 23. Sposób oznaczania fenotypowej wrażliwości lekowej poszczególnych szczepów HIV u pacjenta na inhibitory co najmniej dwóch enzymów kodowanych przez gen pol HIV, znamienny tym, że transfekuje się wrażliwą na zakażenie HIV linię komórkową sekwencją z genu pol HIV, otrzymaną poprzez wyizolowanie wirusowego RNA z próbki materiału biologicznego pacjenta i odwrotne transkrybowanie żądanego regionu tego genu pol, oraz konstruktem HIV-DNA z wydeletowaną wspomnianą sekwencją, hoduje się transfekowane komórki, z wytworzeniem podstawowej puli chimerycznych wirusów, oraz ocenia się fenotypową wrażliwość chimerycznych wirusów na inhibitory enzymów kodowanych przez gen pol HIV.
- 24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że materiał biologiczny wybiera się z osocza, surowicy lub wolnego od komórek płynu ustrojowego wybranego z płynu spermy lub płynu pochwowego.
- 25. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że jako materiał biologiczny stosuje się pełną krew, do której dodano stabilizatora RNA.186 473
- 26. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że jako materiał biologiczny stosuje się materiał tkankowy wybrany z tkanki mózgowej lub tkanki węzłów limfatycznych.
- 27. Sposób według zastrz. 23 albo 24, albo 25, albo 26, znamienny tym, że co najmniej dwa enzymy wybiera się spośród RT, proteazy i integrazy HIV.
- 28. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że jako linię komórkową wrażliwą na zakażenie HIV stosuje się linię komórek T CD4 .
- 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako linię komórek T CD4+ stosuje się linię komórkową MT4 lub HeLa CD4+.
- 30. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że żądany region genu pol pacjenta poddaje się odwrotnej transkrypcji używając specyficznego startera pasującego do końca 3'.
- 31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że sekwencja mająca ulec odwrotnej transkrypcji jest sekwencją kodująca odwrotną transkryptazę i proteazę.
- 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że starterem pasującym do końca 3' jest OUT3: 5'-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-3' (SEQ ID NO: 1).
- 33. Sposób według zastrz. 30 albo 31, albo 32, znamienny tym, że produkt odwrotnej transkrypcji amplifikuje się przy użyciu umiejscowionej PCR.
- 34. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się konstrukt HIV-DNA z wydeletowanymi genami RT i proteazy, stanowiący plazmid pGEMT3-APRT zdeponowany w Belgian Coordinated Collections of Microorganisms-BCCM LMBP-Collection w dniu 8 listopada 1996 r., pod numerem LMBP3590.
- 35. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że transfekcję prowadzi się drogą elektroporacji.
- 36. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że transfekcję prowadzi się z użyciem lipidów kationowych.
- 37. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że fenotypową wrażliwość lekową chimerycznych wirusów na różne inhibitory RT, proteazy i integrazy ocenia się w automatycznym teście opartym na komórkach.
- 38. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że fenotypową wrażliwość lekową chimerycznych wirusów i dzikiego szczepu HIV na jeden lub większą liczbę inhibitorów RT, proteazy lub integrazy wyraża się w postaci stężenia hamującego (wartość IC).
- 39. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że inhibitory RT wybiera się z nukleozydowych inhibitorów RT, takich jak AZT, ddl, ddC, 3TC, d4T, nienukleozydowych inhibitorów RT, takich jak iowiryd, newirapina i tiwirapina, inhibitory proteazy wybiera się z takich jak sakwinawir, indinawir i ritonawir, a inhibitor integrazy z takich jak ester fenylowo-etylowy kwasu kofeinowego (CAPE).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96200175 | 1996-01-26 | ||
| PCT/IB1997/000071 WO1997027480A1 (en) | 1996-01-26 | 1997-01-24 | Method of managing the chemotherapy of patients who are hiv positive based on the phenotypic drug sensitivity of human hiv strains |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL328069A1 PL328069A1 (en) | 1999-01-04 |
| PL186473B1 true PL186473B1 (pl) | 2004-01-30 |
Family
ID=8223611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97328069A PL186473B1 (pl) | 1996-01-26 | 1997-01-24 | Sposób oceny in vitro chemioterapii HIV u pacjentów HIV dodatnich oraz sposób oznaczania fenotypowej wrażliwości lekowej poszczególnych szczepów HIV u pacjenta na inhibitory co najmniej dwóch enzymówkodowanych przez gen pol HIV |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6221578B1 (pl) |
| EP (1) | EP0877937B1 (pl) |
| KR (1) | KR100495690B1 (pl) |
| CN (2) | CN1209875A (pl) |
| AT (1) | ATE217971T1 (pl) |
| AU (1) | AU717755B2 (pl) |
| BG (1) | BG102710A (pl) |
| BR (1) | BR9707204A (pl) |
| CZ (1) | CZ292899B6 (pl) |
| DE (1) | DE69712731T2 (pl) |
| ES (1) | ES2177922T3 (pl) |
| HU (1) | HU226203B1 (pl) |
| IL (1) | IL125442A (pl) |
| IS (1) | IS4799A (pl) |
| NO (1) | NO321329B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ325912A (pl) |
| PL (1) | PL186473B1 (pl) |
| SK (1) | SK283878B6 (pl) |
| TR (1) | TR199801443T2 (pl) |
| WO (1) | WO1997027480A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA97669B (pl) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2140929C (en) | 1992-08-25 | 2006-09-12 | Michael L. Vazquez | Hydroxyethylamino sulfonamides useful as retroviral protease inhibitors |
| US20030220276A1 (en) * | 1995-05-16 | 2003-11-27 | Opendra Narayan | HIV vaccine and method of use |
| US6242187B1 (en) | 1996-01-29 | 2001-06-05 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| US20070010471A1 (en) * | 1997-05-02 | 2007-01-11 | Opendra Narayan | HIV DNA vaccine |
| CA2298102A1 (en) * | 1997-07-30 | 1999-02-11 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| CN1204266C (zh) * | 1998-05-26 | 2005-06-01 | 病毒科学公司 | 监控非核苷类逆转录酶抑制剂抗逆转录病毒治疗的途径与方法 |
| ATE302287T1 (de) | 1999-05-28 | 2005-09-15 | Virco Nv | Neue mutationsprofile der hiv-1 reverse transcriptase in verbindung mit phänotypischem medikamentresistenz |
| US6800437B1 (en) | 1999-08-06 | 2004-10-05 | Tibotec Bvba | Method of monitoring a biological system by labeling with an apo metal binding protein |
| EP1109019A1 (en) * | 1999-12-15 | 2001-06-20 | BioStrands S.r.l. | Method to evaluate the sensitivity of HIV variants to drugs able to inhibit the HIV protease |
| AU2001233513A1 (en) * | 2000-02-04 | 2001-08-14 | K.U. Leuven Research And Development | Hiv-1 resistance assay |
| GB0009374D0 (en) * | 2000-04-14 | 2000-05-31 | Glaxo Group Ltd | Phenotyping assay and reagents therefor |
| DE60135366D1 (de) * | 2000-04-18 | 2008-09-25 | Virco Bvba | Methode zur bestimmung der resistenz gegen medikamente |
| US6800463B1 (en) | 2000-04-20 | 2004-10-05 | Virco Bvba | Method for mutation detection in HIV-1 using pol sequencing |
| AU2001256318B8 (en) * | 2000-04-20 | 2007-03-22 | Virco Bvba | Method for mutation detection in HIV using pol sequencing |
| US6582901B2 (en) | 2000-04-26 | 2003-06-24 | Bruce K. Patterson | Cell specific anti-viral drug susceptibility test using tagged permissive target cells |
| US7058616B1 (en) | 2000-06-08 | 2006-06-06 | Virco Bvba | Method and system for predicting resistance of a disease to a therapeutic agent using a neural network |
| CN1446265A (zh) * | 2000-06-12 | 2003-10-01 | 病毒科学公司 | 检测抗反转录病毒治疗的方式与方法和在hiv/aids治疗中的指导治疗方案 |
| US6582920B2 (en) * | 2000-09-01 | 2003-06-24 | Gen-Probe Incorporated | Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations |
| JP2004512032A (ja) | 2000-10-20 | 2004-04-22 | ビルコ・ビーブイビーエイ | 表現型薬物耐性と相互に関連付けられるｈｉｖ−１逆転写酵素中の新たな突然変異の特徴 |
| US7292944B2 (en) | 2000-10-20 | 2007-11-06 | Virco Bvba | Establishment of biological cut-off values for predicting resistance to therapy |
| US7306901B2 (en) | 2001-08-08 | 2007-12-11 | Tibotec Pharmaceuticals, Ltd. | Methods and means for assessing HIV envelope inhibitor therapy |
| US6958211B2 (en) * | 2001-08-08 | 2005-10-25 | Tibotech Bvba | Methods of assessing HIV integrase inhibitor therapy |
| JP2005513420A (ja) | 2001-11-08 | 2005-05-12 | テイボテク・フアーマシユーチカルズ・リミテツド | 治療薬をモニタリングするためのプロテアーゼアッセイ |
| ATE397669T1 (de) | 2002-07-01 | 2008-06-15 | Tibotec Pharm Ltd | Mit phänotypischer medikamentenresistenz korrelierte mutationsprofile in hiv-1-reverse- transkriptase |
| DE60327768D1 (de) | 2002-07-01 | 2009-07-09 | Tibotec Pharm Ltd | Mutationsprofile bei mit phänotypischer medikamentenresistenz korrelierter hiv-1-protease |
| JP5213228B2 (ja) * | 2004-03-02 | 2013-06-19 | ビルコ・ビーブイビーエイ | 臨床的カット−オフ値の推測 |
| CN101365808B (zh) | 2005-12-07 | 2012-04-25 | 泰博特克药品有限公司 | 用于评估hiv病毒适应度的方法、质粒载体和引物 |
| EP2010680A2 (en) * | 2006-04-14 | 2009-01-07 | Tibotec Pharmaceuticals Ltd. | Methods and means for assessing hiv gag/protease inhibitor therapy |
| EP2162745A1 (en) | 2007-05-25 | 2010-03-17 | Tibotec Pharmaceuticals | New mutational profile in hiv-1 gag cleavage site correlated with phenotypic drug resistance |
| EP2342363B1 (en) * | 2008-10-06 | 2015-06-10 | Janssen Diagnostics BVBA | Method for determining drug resistance mutations in any of the non-structural protein regions ns3 to ns5b of hepatitis c virus (hcv) for genotypes 1 to 6 |
| US20120064514A1 (en) * | 2009-05-12 | 2012-03-15 | Virco Bvba | Hiv-1-c resistance monitoring |
| CN107085093B (zh) * | 2017-03-24 | 2019-06-21 | 西藏诺迪康药业股份有限公司 | 重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法 |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3875396A (en) * | 1973-11-12 | 1975-04-01 | Illuminite Corp | Illuminated clipboard |
| US4675147A (en) * | 1983-04-06 | 1987-06-23 | Westinghouse Electic Corp. | Generating an integrated graphic display of the safety status of a complex process plant |
| US5716826A (en) * | 1988-03-21 | 1998-02-10 | Chiron Viagene, Inc. | Recombinant retroviruses |
| US5665577A (en) | 1989-02-06 | 1997-09-09 | Dana-Farber Cancer Institute | Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof |
| IL94482A (en) | 1989-05-25 | 2003-09-17 | Univ Duke | Transdominant repressor mutant of retroviral protein, dna encoding the protein and process for their preparation and use thereof |
| US5401629A (en) | 1990-08-07 | 1995-03-28 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Assay methods and compositions useful for measuring the transduction of an intracellular signal |
| JPH05148202A (ja) * | 1991-04-10 | 1993-06-15 | Tsumura & Co | 新規な化合物およびその医薬としての用途 |
| WO1993023574A1 (en) | 1992-05-14 | 1993-11-25 | Kozal Michael J | Polymerase chain reaction assays for monitoring antiviral therapy |
| US5733720A (en) | 1992-06-18 | 1998-03-31 | Washington University | Genetically engineered cell lines for detecting infectious herpesvirus and methods therefor |
| ES2113546T3 (es) | 1992-07-06 | 1998-05-01 | Harvard College | Metodos y estuches de diagnostico para determinar la toxicidad de un compuesto utilizando promotores de estres bacterianos fusionados con genes reporteros. |
| US5344846A (en) | 1992-12-30 | 1994-09-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for inhibiting deoxyhypusine synthase and the growth of cells |
| US5591579A (en) | 1993-12-21 | 1997-01-07 | Washington University | Indicator cell line for detecting RNA viruses and method therefor |
| US6063562A (en) * | 1994-09-16 | 2000-05-16 | Sepracor, Inc. | In vitro method for predicting the evolutionary response of HIV protease to a drug targeted thereagainst |
| US5569588A (en) | 1995-08-09 | 1996-10-29 | The Regents Of The University Of California | Methods for drug screening |
| WO1997012220A2 (en) | 1995-09-15 | 1997-04-03 | Samir Chachoua | Method for the identification and therapeutic use of disease-associated organisms, elements and forces |
| US5885806A (en) * | 1995-11-28 | 1999-03-23 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods to prepare conditionally replicating viral vectors |
| ES2175355T3 (es) | 1996-01-29 | 2002-11-16 | Virologic Inc | Composiciones y metodos para determinar la susceptibilidad y la resistencia a farmacos antivirales y rastreo de farmacos antivirales. |
| US5837464A (en) | 1996-01-29 | 1998-11-17 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| US5945276A (en) | 1996-04-10 | 1999-08-31 | Signal Pharmaceuticals, Inc. | Reporter cell line system for detecting cytomegalovirus and identifying modulators of viral gene expression |
| US5939253A (en) | 1996-04-26 | 1999-08-17 | Diagnostic Hybrids, Inc. | Compositions and methods for detecting viral infection |
| DE69837118T2 (de) | 1997-04-07 | 2007-12-27 | Fisher Biolmage Aps | Ein Verfahren zum Screenen von Substanzen hinsichtlich ihres Effekts auf cAMP Spiegel basierend auf intrazellulärer Translokation von PKA |
| WO1998046796A1 (en) | 1997-04-11 | 1998-10-22 | The Regents Of The University Of California | A method of screening nucleotide sequences to identify disruptors or effectors of biological processes or pathways |
| WO1998059074A1 (en) | 1997-06-23 | 1998-12-30 | Emory University | Human immunodeficiency viruses causing aids in a nonhuman primate |
| US5976813A (en) | 1997-12-12 | 1999-11-02 | Abbott Laboratories | Continuous format high throughput screening |
-
1997
- 1997-01-24 AU AU13168/97A patent/AU717755B2/en not_active Ceased
- 1997-01-24 NZ NZ325912A patent/NZ325912A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 BR BR9707204-4A patent/BR9707204A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-01-24 CN CN97191904A patent/CN1209875A/zh active Pending
- 1997-01-24 EP EP97900712A patent/EP0877937B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-24 TR TR1998/01443T patent/TR199801443T2/xx unknown
- 1997-01-24 CZ CZ19982335A patent/CZ292899B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 PL PL97328069A patent/PL186473B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 US US09/117,217 patent/US6221578B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-24 DE DE69712731T patent/DE69712731T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-24 IL IL12544297A patent/IL125442A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 HU HU9902618A patent/HU226203B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 SK SK1002-98A patent/SK283878B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 CN CNA2006101685069A patent/CN1991365A/zh active Pending
- 1997-01-24 WO PCT/IB1997/000071 patent/WO1997027480A1/en not_active Application Discontinuation
- 1997-01-24 ES ES97900712T patent/ES2177922T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-24 KR KR10-1998-0705747A patent/KR100495690B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 AT AT97900712T patent/ATE217971T1/de active
- 1997-12-27 ZA ZA9700669A patent/ZA97669B/xx unknown
-
1998
- 1998-07-16 NO NO19983300A patent/NO321329B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-07-20 IS IS4799A patent/IS4799A/is unknown
- 1998-08-20 BG BG102710A patent/BG102710A/xx unknown
-
2000
- 2000-12-14 US US09/735,487 patent/US6528251B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-01-15 US US10/342,188 patent/US20030152917A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL186473B1 (pl) | Sposób oceny in vitro chemioterapii HIV u pacjentów HIV dodatnich oraz sposób oznaczania fenotypowej wrażliwości lekowej poszczególnych szczepów HIV u pacjenta na inhibitory co najmniej dwóch enzymówkodowanych przez gen pol HIV | |
| Stewart et al. | Properties of avian retrovirus particles defective in viral protease | |
| Garber et al. | The interaction between HIV-1 Tat and human cyclin T1 requires zinc and a critical cysteine residue that is not conserved in the murine CycT1 protein | |
| US7189505B2 (en) | Methods of assessing HIV integrase inhibitor therapy | |
| Verhoef et al. | Strict control of human immunodeficiency virus type 1 replication by a genetic switch: Tet for Tat | |
| JP4183749B2 (ja) | 抗ウィルス剤感受性及び耐性を決定するための組成物及び方法並びに抗ウィルス剤のスクリーニング | |
| US9631220B2 (en) | Method for designing a drug regime for HIV-infected patients | |
| Robinson et al. | HIV type 1 protease cleavage site mutations and viral fitness: implications for drug susceptibility phenotyping assays | |
| EP1283272B1 (en) | Methods and means for assessing HIV envelope inhibitor therapy | |
| Jármy et al. | Phenotypic analysis of the sensitivity of HIV‐1 to inhibitors of the reverse transcriptase, protease, and integrase using a self‐inactivating virus vector system | |
| EP1285971B1 (en) | Methods for the phenotypic and genotypic assessment of the drug sensitivity of HIV integrase variants | |
| EP1272676B1 (en) | Hiv detection assay and reagents therefor | |
| RU2174014C2 (ru) | Способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по вич, основанный на фенотипической лекарственной чувствительности человеческих штаммов вич | |
| CA2244735C (en) | Method of managing the chemotherapy of patients who are hiv positive based on the phenotypic drug sensitivity of human hiv strains | |
| Safari et al. | Functional and Structural Segregation of Overlapping Helices in HIV-1 | |
| Brunelle et al. | Replacement of murine leukemia virus readthrough mechanism by human immunodeficiency virus frameshift allows synthesis of viral proteins and virus replication | |
| JP2002159297A (ja) | プロテアーゼ活性の測定方法 | |
| Adolph | Viral genome methods | |
| Palmer et al. | Murine leukemia virus with a primer-binding site complementary to tRNALys, 3 adapts to select new tRNAs for replication following extended in vitro culture | |
| Loftus | Relative replication competence of virus isolates resistant to anti-HIV compounds | |
| Subtype | Dysregulation through the NF | |
| Allows | Replacement of Murine Leukemia Virus | |
| Zeibdawi | Recombinant human immunodeficiency virus reverse transcriptases: Activity and fidelity. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20140124 |