NO321329B1

NO321329B1 - Fremgangsmate til a fastsette kjemoterapi for pasienter som er HIV positive, basert pa fenotypisk legemiddelfolsomhet hos pasientens HIV-stammer

Info

Publication number: NO321329B1
Application number: NO19983300A
Authority: NO
Inventors: Marie-Pierre De Bethune; Kurt Hertogs; Rudi Pauwels
Original assignee: Virco Bvba
Priority date: 1996-01-26
Filing date: 1998-07-16
Publication date: 2006-04-24
Also published as: WO1997027480A1; ZA97669B; BR9707204A; CN1209875A; SK100298A3; EP0877937A1; BG102710A; US6528251B2; NO983300D0; TR199801443T2; US20020042679A1; IL125442A; US20030152917A1; CZ292899B6; HUP9902618A3; PL328069A1; IL125442A0; ES2177922T3; DE69712731D1; AU1316897A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til å fastsette kjemoterapi hos pasienter som er HIV-positive, basert på den fenotypiske medikamentsensitiviteten til pasientens HIV-stammer for inhibitorer av en eller flere enzymer av pol-genet til HIV, såvel som en fremgangsmåte til samtidig bestemmelse av den fenotypiske medikamentsensi ti vitet for to eller flere av enzymene i pol-genet til HIV, til inhibitorer derav.

Til dags dato har flere kjemoterapeutiske regimer blitt utviklet for å behandle HIV-infiserte pasienter. Visse av disse regimer er blitt tillatt for klinisk anvendelse mens andre er underkastet pågående kliniske utprøvinger. Det kan antas at antallet

av godkjente kjemoterapeutiske regimer vil øke stadig i nærmeste fremtid. I økende grad er kombinasjonsterapi eller multiple medikamentbehandlingsregimer blitt brukt på grunn av utvikling av legemiddelresistente HIV-varianter under terapien. Skjønt disse kjemoterapeutiske regimer er blitt vist å utvise en virkning på virologiske (viral belastning), immunologiske og kliniske parametere ved HIV-sykdom, har praktisk erfaring lært at disse virkningene er forbigående. Spesielt finner man at HIV-stammer som infiserer en individuell pasient etter en stund

- starter å utvise redusert sensitivitet til medikamentet eller

medikamentkombinasjonen med hvilke nevnte pasient behandles. Tap av virkningsgrad av kjemoterapien kan variere fra pasient til pasient, fra medikament til medikament, eller fra medikamentkombinasjon til medikamentkombinasjon. Det er vel etablert at tap av virkningsgrad for en spesiell type kjemoterapi kan assosieres med et genotypisk mønster av aminosyreforandringer i genomet til HIV-stammene som infiserer pasienten. Dette gjør muligens disse HIV-stammer mindre

utsatt for kjemoterapi. Idet en HIV-infisert pasient blir eksponert til flere kjemoterapeutiske regimer over en utstrakt tidsperiode skjer mer komplekse mønster av aminosyreforandringer i genomet til de infiserende HIV-stammer-som for tiden nedkjemper en rasjonell tilnærming til videre behandling av infiserte pasienter. Som antydet i den tidligere forklaring kan man rutine-messig bestemme de genotypiske forandringene som skjer i HIV-stammer eksponert til forskjellige kjemoterapeutiske regimer som omfatter enkle eller multiple anti- HIV-medikamenter, men så langt har det vist seg å være meget vanskelig å avlede fra disse data informasjon som tillater en lege som har ansvar for å utskrive kjemoterapien, om det er eller ikke er fornuftig å initiere eller fortsette ett spesielt kjemoterapeutisk regime. Med andre ord, den genotypiske informasjon som er tilgjengelig i begrenset skala kan ikke rutinemessig oversettes til fenotypisk informasjon som gjør det mulig for den ansvarlige lege å foreta en viktig avgjørelse med hensyn på hvilken kjemoterapi en pasient fortrinnsvis skal få. Problemet eksisterer også for medikament-naive pasienter som blir infisert av medikamentresistente HIV-stammer.

Overvåking av virusbelastning er blitt et rutineaspekt i HIV-omsorg. Viral belastning alene kan imidlertid ikke anvendes som en basis for å bestemme hvilke medikamenter som skal brukes, alene eller i kombinasjon.

Kombinasjonsterapi er i økende grad blitt det valgte kjemoterapeutiske regime. Når en person som bruker en kombinasjon av medikamenter begynner å erfare medikamentsvikt, er det umulig å vite med sikkerhet hvilke av medikamentene i kombinasjonen som ikke lenger er aktive. Man kan ikke enkelt erstatte alle medikamentene, fordi det for tiden bare er et begrenset antall medikamenter tilgjengelig. Videre, hvis man erstatter et helt kjemoterapeutisk regime, kan man fjerne en eller flere medikamenter som er aktive for den spesielle pasienten. Videre er det mulig for virus som utviser resistens til en spesiell inhibitor også å utvise varierende grader av kryssresistens til andre inhibitorer.

Ideelt bør derfor hver gang en person har en virusbelastningstest og en virusbelastningsøkning blir oppdaget, en medikamentsensitivitets/resistenstest også utføres. Inntil effektiv kurativ terapi er utviklet vil behandling av HIV-sykdom kreve slik testing.

For tiden eksisterer det en fenotypisk metode som er basert på virusisolering fra plasma i nærvær av donor-perifert-blod-mononukleære celler (PBMC), og påfølgende bestemmelse av fenotypene i nevnte celler (Japour, A.J. et al. (1993) Antimicrobial Agents and Chemotherapy; Vol. 37, nr. 5, p 1095-1101). Denne samdyrkingsmetoden, som er anbefalt av AIDS Clinical Trial Group (ACTG), spesielt for å fenotypbestemme AZT (synonymt heri med zidovudin/Retrovir®) motstand, er tidkrevende, kostbar og altfor kompleks til å anvendes på rutinebasis.

Et fenotypisk rekombinant virusassay for vurdering av medikamentfølsomhet for HIV-type 1 -isolater til revers transkriptase (RT) inhibitorer er blitt utviklet av Kellam, P. og Larder, B.A. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1994) Vol. 38, nr. 1, p 23-30). Denne fremgangsmåten tillater dannelse av levende virus ved homolog rekombinasjon av en PCR-avledet samling av RT-kodende sekvenser i en RT-deletert, ikke-infeksiøs proviral klon, pAHIVRTBstEII. Analyse av to pasienter under forløpet til zidovudinterapi viste at denne tilnærming produserte virus som nøyaktig utviste den samme genotyp og fenotyp som den til det originale infiserte PBL DNA. Imidlertid omfatter fremgangsmåten isolering av pasientvirus ved samdyrking av pasientplasma eller pasient PBNC med donor PBMC. Slik førdyrking av virus kan ødelegge den originale virussammensetning. Videre gir ikke denne fremgangsmåte, skjønt den tillater at man bestemmer sensitiviteten til isolatene ovenfor forskjellige inhibitorer, legen mer informasjon om han skal fortsette det eksisterende kjemoterapeutiske regime eller forandre terapien.

Også når bare ett enzym i pol-genet er undersøkt, gir ikke fremgangsmåten lett mulighet til rutinefenotypisk vurdering av kombinasjonsterapi som konvensjonelt omfatter anvendelse av en protease og 2 RT-inhibitorer.

»Nested» PCR (polymerase kjedereaksjon) fremgangsmåten brukt i det rekombinante virusassay kan føre til en situasjon hvor det rekombinante virus ikke korrekt reflekterer situasjonen med HIV-stammer som infiserer pasienten under undersøkelsen. Dette problemet ligger i DNA-sekvenshomologi og den minimumsmengde av homologi som er nødvendig for homolog rekombinasjon i pattedyrceller (C. Rubnitz, J. og Subramini, S. (1984) Molecular and Cellular Biology, vol. 4, nr. 11, p 2253-2258). Følgelig bør ethvert fenotypisk assay basert

på rekombinant virustilnærmelse strebe etter å sikre at så mye som mulig av pasientmaterialet blir opp form ert og at det er maksimal rekombinasjon.

Således bør RNA-ekstraksjon og »nestéd» PCR-fremgangsmåter som anvendes

sikre at det virale genetiske materiale blir oppformert slik at det oppformerte materiale maksimalt reflekterer den genetiske mangfoldighet hos virus i pasienten som undersøkes.

I foreliggende klinisk praksis er det derfor et etterlengtet behov (a) for å bestemme hurtig og på rutinebasis den fenotypiske medikamentsensitiviteten til HIV-stammer som infiserer en spesiell pasient, (b) å prosessere slik oppnådd data inn i lett forståelig informasjon og (c) å initiere, fortsette eller justere på basis av nevnte informasjon kjemoterapien som er utskrevet for nevnte spesielle pasienter.

Det er derfor en hensikt å tilveiebringe fremgangsmåter til å fastsette HIV

kjemoterapi hos HIV positive pasienter. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse, kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

I henhold til et første aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebragt en in vitro fremgangsmåte til å fastsette HlV-kjemoterapi i pasienter som er HIV-positive,

som omfatter å transfektere en cellelinje som er mistenkt for infeksjon av HIV med en sekvens fra pol-genet i HIV, oppnådd ved å isolere viralt RNA fra en prøve av biologisk materiale fra en pasient og transkribere revers den ønskede regionen i nevnte pol-gen, og en HIV-DNA-konstruksjon fra hvilken nevnte sekvens er blitt deletert, dyrke nevnte transfekterte celler slik at det dannes et lager av kimerisk virus, vurdere den fenotypiske sensitivitet til nevnte kimeriske virus overfor en inhibitor av nevnte enzym kodet av pol-genet til HIV, å gi dette en verdi,

konstruere et datasett som omfatter nevnte verdi for kimerisk virussensitivitet og den tilsvarende verdi for en kimerisk villtypestamme av HIV, gjenta sensitivitetsvurderingen for minst to ytterligere inhibitorer og derved konstruere minst tre slike datasett totalt, representere nevnte datasett i todimensjonal eller tredimensjonal grafisk form slik at forskjellen mellom de kimeriske og

villtypesensitiviteter i hvert datasett tilveiebringer et visuelt mål for motstanden til den kimeriske stamkoloni overfor behandling med den angitte inhibitor, og utvelging av den optimale inhibitor(er) på basis av den grafiske representasjon av de målte resistenser: Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen gir fenotypisk informasjon på individuelle HIV-infiserte pasienter i stor skala, økonomisk og hurtig. Fremgangsmåten er anvendbar til alle for tiden tilgjengelige kjemoterapeutiske regimer og er forventet å være like anvendbar til fremtidige kjemoterapeutiske regimer.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen gir legen fenotypiske data for pasient HIV-stammer som øyeblikkelig kan brukes til å bestemme om et spesielt kjemoterapeutisk regime skal initieres, fortsettes eller justeres.

Fortrinnsvis er datasettene representert på en polygonal eller halvsirkulær kurve som omfatter;

(a) et flertall av normaliserte akser som strekker seg radielt fra et origo, hver

akse tilsvarer et datasett eller inhibitor eller kombinasjon derav; (b) aksene er normalisert slik at sensitivitetsverdiene for villtype-HIV for de forskjellige, inhibitorer er lik på hver akse, datapunktene for villtype-HIV er eventuelt representert og sammenkoblet til å danne et regulær polygon hvis toppunkter ligger på aksene og hvis senter er definert av origo; (c) på hver akse representerer et datapunkt sensitivitetsverdien til den kimeriske HIV-stamkoloni mot inhibitoren tilsvarende nevnte akse er plottet, de kimeriske datapunktene er eventuelt sammenbundet til å danne et regulært eller irregulært polygon hvor fasongen representerer motstanden til den kimeriske stamkolonien overfor et område av inhibitorer.

En polygonal eller halvsirkulær kurve tilveiebringer den fordelen at pasientens resistens til et antall medikamenter blirkarakterisertmed hensyn på graden av divergens mellom polygonet som representerer pasientens kimeriske HIV-stamkoloni og polygonet som representerer villtypestammen. Polygonområdene vil generelt divergere mer i noen områder enn for andre, noe som i hvert tilfelle angir en større eller mindre grad av resistens til inhibitoren hvis akse passerer gjennom det angitte området.

Således tar fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen en kimerisk HIV-stamkoloni og tilveiebringer et kart for denne stamkolonis motstand over et området av inhibitorer. På denne måten tilveiebringer kartet eller kurven en teknisk karakterisering av en side av den kimeriske stamkoloni som ikke blir oppnådd ved konvensjonelle målinger.

I en foretrukket utforming har de normaliserte akser like vinkler mellom hverandre.

Videre har hver akse fortrinnsvis en logaritmisk skala.

Videre identifiserer fortrinnsvis eksentriske datapunkter i det kimeriske polygon, hvis de er representert, inhibitorer hvis anvendbarhet kan anvendes og være av liten eller ingen fordel for pasienten, mens datapunkter som ligger innenfor eller tett utenfor villtypepolygonet identifisere inhibitorer hvis nytte kan antas å være av betydelig fordel for pasienten.

Når verdier for de verste tilfellene er representert sammen med kimerisk og villtype HIV, innelukker et vanligvis irregulært polygon det kimeriske og villtypepolygon. Betydningen av betegnelsen »eksentrisk» som brukt ovenfor er et datapunkt som ligger relativt nær ved grensen for det verste tilfellet og relativt langt fra villtypepolygonet. På samme måte refererer betegnelsen »tett utenfor villtypepolygonet» seg til relativ nærhet til villtypepolygonet sammenlignet med avstanden fra grensen til det verste tilfellet.

Fremgangsmåten som definert ovenfor er begrenset på den måten at den målbare resistens mot en inhibitor er avhengig av det spesielle konsentrasjonsområdet til deri anvendte inhibitor. Også må man prøve å redusere virkningen av biologisk variabilitet. Følgelig er det ønskelig å oppnå en verdi for maksimal eller verste tilfelle målbare resistens hvor det er antatt at en gitt inhibitor ikke har noen virkning. Denne konsentrasjonen, f.eks. 100 uM, er generelt den maksimale konsentrasjon som i praksis kan testes, men kan også avledes fra f.eks. farmakologiske, toksikologiske eller farmakokinetiske undersøkelser. Sammenligning av resistensnivået til pasienten under undérsøkelse og den maksimalt målte resistens bestemmer hva som er det signifikante resistensnivået til pasienten under undersøkelse. Maksimal målbar resistens og den virkelige resistensen kan egnet vises på et søylediagram som heretter beskrevet.

I enda en ytterligere foretrukket utforming av oppfinnelsen omfatter hver av de nevnte tre eller flere datasett videre en verdi for den målbare resistens i det verste tilfelle for inhibitoren det dreier seg om, hvor nevnte verste tilfelle-verdier er representert på nevnte grafiske presentasjoner slik at datapunktene for den kimeriske stamkoloni kan sammenlignes både til villtypen og til verste tilfelle HIV, for derved å tilveiebringe en vurdering av den relative verdi av inhibitoren i et spesielt tilfelle.

Eksperimenter i et overskudd av 150 pasientprøver har vist en tett korrelasjon mellom resistensutvikling og terapihistorie som heretter videre blir illustrert i eksemplene. Tett korrelasjon er blitt funnet med dataene dannet i henhold til oppfinnelsen relativ til klassisk virusisolering og fenotypteknikker.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan således anvendes for en individualisert og mer rasjonell styring av videre kjemoterapi. Således vil anvendelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen i kombinasjon med riktig administrering av anti-HIV-medikamenter til slutt føre til bedre behandling og overlevelse av pasienter infisert med HIV.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse har spesiell anvendelse hvor en individuell pasient har mottatt mange forskjellige medikamenter og hans mutasjonsmønster ikke er lett tolkbart for de ansvarlige leger.

I henhold til et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebragt en fremgangsmåte til å fastsette HIV-kjemoterapi hos pasienter som er HIV-positive, som omfatter trinnene;

(a) periodisk fastsettelse av den fenotypiske sensitivitet til en pasients HIV-starnmer ved en metode som beskrevet ovenfor; (b) utstedelse av instruksjoner til å opprettholde kjemoterapien med den selekterte inhibitor mens pasientens HIV-stammer forblir sensitive for den selekterte kjemoterapi; og (c) å selektere en annen inhibitor hvis og når mottakeligheten til den opprinnelige

inhibitor reduseres.

Vi har laget betegnelsen »Antivirogram»® for anordningen for klinisk forvaltning i henhold til oppfinnelsen og denne betegnelse vil brukes heretter i beskrivelsen. Denne anordning tilveiebringer legen med en klar representasjon av de relative forandringer og sensitiviteter for forskjellige inhibitorer som er eller som kan brukes i den kliniske behandling av individuelle HIV-infiserte pasienter.

Med HIV er det heri generelt ment HIV-1. Oppfinnelsen er imidlertid også anvendbar ved HIV-2.

Fortrinnsvis er den fenotypiske sensitivitet av nevnte kimeriske virus til inhibitorer for minst to enzymer kodet av pol-genet til HIV samtidig vurdert.

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebragt en fremgangsmåte til å bestemme den fenotypiske medikamentsensitivitet for individuelle HIV-stammer i en pasient til inhibitorer av minst to enzymer kodet av pol-genet til HIV, som omfatter å transfektere en cellelinje utsatt for infeksjon av HIV med en sekvens fra pol-genet til HIV, oppnådd ved å isolere virus RNA fra en prøve av biologisk materiale fra en pasient og transkribere revers den ønskede region av nevnte pol- gen, og en HIV-DNA-konstruksjon fra hvilken nevnte sekvens er blitt deletert, dyrke nevnte transfekterte celler slik at det dannes en stamkoloni av kimeriske virus som tilveiebringer en indikasjon på resistensprofilen til det sirkulerende virus og vurdere den fenotypiske sensitivitet til nevnte kimeriske virus overfor inhibitorer av nevnte enzymer kodet av pol-genet til HIV.

Den ønskede sekvens fra pol-genet er isolert fra en prøve at et biologisk materiale og oppnådd fra pasienten hvis fenotypiske medikamentsensitivitet er blitt bestemt. En stor variasjon av biologisk materiale kan anvendes for isolering av den ønskede sekvens.

Således kan det biologiske materiale selekteres fra plasma, serum eller en cellefri kroppsvæske valgt fra sæd og vaginalvæske. Plasma er spesielt foretrukket og er spesielt fordelaktig med hensyn på anvendelse av PBMC som brukt i kjent teknikk beskrevet ovenfor.

Alternativt kan det biologiske materiale være fullblod hvortil en RNA-stabilisator er blitt tilsatt.

I enda en ytterligere utforming kan det biologiske materiale være fast vevsmateriale valgt fra hjernevev eller lymfeknutevev eller annet vev oppnådd ved biopsi.

Som demonstrert heretter når et biologisk materiale så som plasma blir brukt ved isolasjon av den ønskede sekvens kan et minimumsvolum av plasma anvendes, typisk ca. 100-250 ul, mer spesielt i størrelsesorden 200 ul.

Videre vil de to enzymer fortrinnsvis selektert være selektert fra HIV RT, protease og integrase.

Viralt RNA er egnet isolert ved fremgangsmåter kjent i seg selv, f.eks. metoden til Boom, R. et al. (Journal of Clinical Microbiology (1990), vol. 28, nr. 3, p 495-503).

I tilfelle av plasma, serum og cellefri kroppsvæsker kan man også bruke QIAamp® viralt RNA-sett solgt av Qiagen-gruppen av selskaper.

Fortrinnsvis er cellelinjen som er sensitiv for infeksjon av HIV en CD4<+>T-cellelinje.

Videre er fortrinnsvis CD4<+>T-cellelinjen MT4-cellelinje eller HeLa CD4<+->cellelinje.

Revers transkripsjon kan utføres med kommersielt sett så som GeneAmp Reverse Transcriptase Kit solgt av Perkin Eimer.

Den ønskede region av pasient pol-genet er fortrinnsvis transkribert revers ved å bruke en spesifikk nedstrømsprimer.

I det tilfelle hvor sekvensen skal transkriberes revers er når koding for revers transkriptase eller revers transkriptase og protease er nedstrømsprimeren fortrinnsvis OUT3: 5'-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-

3' (sekv.id. nr. 1).

I en spesielt foretrukket utforming blir en pasients HIV RT-gen og HIV-

proteasegen revers transkribert ved å bruke HIV-1-spesifikk OUT3-primer og en genetisk konstruert revers transkriptase som mangler RNase H-aktivitet, slik at det totale RNA som skal transkriberes blir konvertert til cDNA uten å bli degradert. En slik genetisk konstruert revers transkriptase, Expand® revers transkriptase, kan oppnås fra Boehringer Mannheim GmbH.

Expand® revers transkriptase er en RNA-rettet DNÅ-polymerase. Enzymet er en genetisk konstruert versjon av Moloney Murine Leukaemia Virus revers transkriptase (M-MuLV-RT). Punktmutasjon med RNase H-sekvens reduserer RNase H-aktivitet til under et detekterbart nivå. Ved å bruke denne genetisk konstruerte revers transkriptase er det mulig å oppnå høyere mengder av full lengde cDNA-transkripter.

Etter revers transkripsjon blir det transkriberte DNA oppformert ved å bruke PCR-teknikken. Fortrinnsvis blir revers transkripsjonsproduktet oppformert ved å bruke

en »nésted» PCR-teknikk.

Fortrinnsvis i det tilfelle hvor regionen av interesse er RT-regionen, blir en

»nested» PCR-teknikk brukt ved å bruke indre og ytre primere som beskrevet av Kellam, P. og Larder, B.A. (1994 supra). Når regionen av interesse er den som omfatter RT og proteasegenene, er de spesifikke primere anvendt fortrinnsvis ved kombinasjon av OUT 3/IN 3 (nedstrøms) og RVP 5 (oppstrøms).

Primeren RVP 5 (Maschera, B. et al., Journal of Virology, 69, 5431-5436) har sekvensen 5'-GGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGG-3' (sekv.id. nr. 2).

En skjematisk representasjon av oppformeringen er fremsatt i figur 3 og er

beskrevet i større detalj i eksempel 2.

Oppformeringen av protease cDNA involverer i virkeligheten en halv-»nested» PCR-fremgangsmåte som vil være klart fra figur 3.

»Nested» PCR-teknikk har den fordelen over de kjente enkle PCR-teknikker ved at den tillater at man oppnår det mest spesifikke PCR-produkt.

Imidlertid, for å oppnå enda høyere nøyaktighet og utbytte under PCR, kan man anvende en blanding av termostabile polymeraser (Barnes, W.M. (1994) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 91, 2216-2220). En slik polymeraseblanding er tilgjengelig fra Boehringer Mannheim GmbH, nemlig Expand (Expand er et varemerke) stor nøyaktighets PCR-system. Ved å bruke dette systemet har vi oppnådd økt sensitivitet, nemlig en sensitivitet som er 10 ganger eller større enn den oppnådd med konvensjonell PCR-prosedyre ved å bruke Taq-polymerase alene.

Når regionen til pol-genet er den som omfatter RT- og proteasegenene, er fortrinnsvis HIV-DNA-konstruksjonen et gen fra hvilken RT- og proteasegenene er deletert og er plasmidet pGEMT3-APRT, som deponert ved Belgian Coordinated Collections of Microorganisms-BCCM LMBP-Collection 8. november 1996 under nummeret LMBP3590.

Flere tilnærminger kan imidlertid brukes til å danne et plasmid som inneholder HIV-1-provirus som bærer en delesjon for protease såvel som for RT-genet. En mulighet er innføring av den ønskede delesjon ved hjelp av oligonukleotidmediert mutagenese. Fremgangsmåten som heretter er adoptert i eksempel 2 involverer imidlertid dannelsen av den ønskede konstruksjon ved å benytte spesifikke restriksjonsenzymer og subkloningsfremgangsmåter, som beskrevet heretter. Skjønt det avsluttende resultat avhenger av de tilgjengelige restriksjonsseter er en viktig fordel ved denne fremgangsmåten at man kan oppnå konklusive resultater hurtig.

For å sikre det mest effektive utkomme for transfeksjonen bør PCR-produktet som skal transfekteres ideelt være renset ved anionutvekslingsspinnkolonner på en måte som er kjent per se. Et egnet sett er QIAquick® PCR Purification Kit markedsført av Qiagen-gruppen av firmaene.

Transfeksjon kan utføres ved elektroporering eller alternativt ved bruk av lipider, spesielt kationiske lipider, DEAE dekstran, CaHPCu, etc.

I tilfelle av lipidtransfeksjon kan man ha nytte av et PÉRFECT (PERFECT er et varemerke) trarisfeksjonssett forhandlet av Invitrogen B.V., Leek, Nederland.

Således blir det for transfeksjon av en HIV-DNA-konstruksjon fra hvilken genet eller ønskede gener fra pol-genet er blitt deletert, brukt sammen med produktet oppnådd etter oppformering.

Konstruksjonen kan være plasmidet pHIVART (oppnåelig fra Medical Research Council (MRC)) hvis det bare er RT-genet som er deletert. Når både RT-genet og proteasegenet er deletert er en egnet HIV DNA-konstruksjon plasmidet pGEMT3-APRT beskrevet heri og som er en vektor med høy kopieringsfaktor. Slike plasmider blir linearisert før transfeksjon i henhold til metoder kjent per se.

En spesiell fordel med å bruke en konstruksjon som koder for mer enn ett pol-gen-enzym, f.eks. en APRT-konstruksjon, er at det er større sjanse å inkludere mer enn det opprinnelige pasientmaterialet i konstruksjonen enn dersom ett enkelt gen blir brukt, slik at det oppformerte materiale reflekterer i større grad den virale

genetiske diversitet i den spesielle pasient som undersøkes.

Det er gunstig at det er fordelaktig at de spesifikke primere selektert for »nested» PCR er lokalisert utenfor sekvensene til målenzymene som skal oppformeres og undersøkes. Det vil videre være en fordel at en kombinasjon av RT og protease sannsynligvis tilveiebringer bedre resultater for å studere RT enn RT alene, fordi 40 flere aminosyrer kommer fra pasienten i forhold til situasjonen med RT alene. For å undersøke proteasen må man være klar over at de første 9 aminosyrer i proteasen er fremdeles avledet fra konstruksjonens (pGEMT3-APRT) villtyperyggrad.

Når transfeksjonen av cellene oppnås gjennom elektroporering blir de selekterte parametere optimalisert for å oppnå god cellevekst og virusproduksjon. Elektroporering kan egnet utføres ved ca. 250 uF og 300 V. Fortrinnsvis elektroporering utført i nærvær av ca. 10 ug linearisert plasmid, f.eks. pHIVARTBstEII og ca. 5 ug oppformert PCR-produkt, f.eks. RT PCR-produkt. Etter vellykket intracellulær homolog rekombinering blir nye kimeriske HIV dannet etter 5-10 dager. Med kjente teknikker er typiske dyrkingstider 12-14 dager før kimerisk HIV blir dannet. Kultursupernatantporsjoner blir lagret ved -70°C eller lavere temperatur.

Det kan lett ses at man kan nytte ovenfor beskrevne metoder for isolering og oppformering av andre HIV-gener, f.eks. integrasegenet, eller mer enn ett annet HIV-gen, f.eks. både RT-genet og integrasegenet, og transfektere en CD4<+>T-celle med de respektive integrase- eller RT-integrase-PCR-produkter sammen med egnet linearisert HIV-DNA-konstruksjon fra hvilken det relevante gen (eller gener) er deletert.

De nylig dannede kimeriske virus blir titrert og deretter analysert med hensyn på deres fenotypiske sensitivitet (utsatthet) for de forskjellige pol-gen enzym-inhibitorer, fortrinnsvis på et automatisert cellebasert assay.

Fortrinnsvis er den fenotypiske medikamentsensitivitet til de kimeriske virus og til vill-HIV-stammen, som egnet er en rekombinant vill HIV-stamme, til en eller flere RT-, protease- eller integraseinhibitorer, uttrykt som en inhibitorisk konsentrasjon (IC-verdi).

I hvilken grad de kimeriske virus og villtype HIV-stammen er mottakelige for en eller flere RT-inhibitorer og/eller en eller flere proteaseinhibitorer og/eller en eller flere itegraseinhibitorer kan uttrykkes som f.eks. 50% eller 90% inhibitoriske konsentrasjoner (IC50eller ICgo-verdier).

Fortrinnsvis er RT-inhibitorer valgt fra nukleosid RT-inhibitorer så som AZT, ddl (didanosin/Videx®), ddC (zalcitabin), 3TC (lamivudin), d4T (stavudin), ikke-nukleosid RT-inhibitorer, så som delavirdin (U 9051125 (BMAP)/Rescriptor®), lovirid (alfa-AP A), nevirapin (B1 -RG-587/Viramune®) og tivirapin (8-C1-TIBO(R86183)), proteaseinhibitorer så som saquinavir, indinavir og ritonavir og integraseinhibitorer så som koffeinsyrefenyletylester (CAPE).

Egnede RT og/eller proteaseinhibitorer og/eller integraseinhibitorer er valgt fira nukeosid RT-inhibitorer, så som AZT, ddl, ddC, 3TC, d4T, 1592U89 og lignende, ikke-nukleosid RT-inhibitorer så som lovirid, nevirapin, delaviridin, ateviridin og tivirapin (8-C1 TIBO) og lignende, proteaseinhibitorer så som saquinavir, indinavir og ritonavir og lignende og integraseinhibitorer så som koffeinsyrefenyletylester (CAPE) og HIV integraseinhibitorer av type beskrevet i »0 95/08540 og GB 2,271,566.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan omfatte trinnet å sammenligne den fenotypiske medikamentsensitivitet i pasient HIV-stammer med en eller flere RT-inhibitorer og/eller en eller flere protease-inhibitorer, og/eller en eller flere integrase-inhibitorer til den til en villtype HIV-stamme. For en lett å forstå representasjon av de relative forandringer i mottakelighet for de forskjellige medikamentforbindelser (eller kombinasjoner) testet, blir en Antivirogram® kurve konstruert.

Kurven skal tolkes som følgende: Eksentriske datapunkter i Antivirogram® identifiserer kjemoterapeutiske regimer som ikke lenger synes å være bra for den HIV-infiserte pasient, mens datapunkter innenfor eller på referansepolygonet eller bare litt utenfor referansepolygonet identifiserer kjemoterapeutiske regimer som sannsynligvis vil være gunstige for den HIV-infiserte pasient.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen i kombinasjon med administrasjon av de korrekte anti-HIV-medikamenter bør til slutt føre til bedre behandling, forbedret livskvalitet og forbedret overlevelse for HIV-infiserte pasienter; det vil si ineffektiv behandling (på grunn av nærvær av eller utbrudd av resistente HIV-stammer) kan forhindres eller forsinkes og effektiv kjemoterapi kan innsettes i god tid.

Kort beskrivelse av kurvene

Figur 1 er en skjematisk representasjon av konstruksjonen av plasmidet

pGEMT3-APRT;

Figur 2 er en ytterligere og komplementær skjematisk representasjon av

konstruksjonen av plasmidet pGEMT3-APRT;

Figur 3 er en skjematisk representasjon av den del av HIV-HXB2D-sekvensen som inneholder protease- og RT-gener; Figur 4 A-H er en fullstendig sekvens for den del av HIV-HXB2D-sekvensen som inneholder protease- og RT-gener; Figur 5 er et Antivirogram® for eri pasient som har 3TC-resistente HIV-stammer som beskrevet i eksempel 5; Figur 6 er et Antivirogram® for en medikamentnaiv pasient som har villtypelignende HIV-stammer som beskrevet i eksempel 6; Figur 7A er et søylediagram som viser den relative forandring i medikamentmottakelighet for pasienten i eksempel 7; Figur 7B er et Antivirogram® for pasienten som er gjenstand for eksempel 7; Figur 8A er et søylediagram som viser relativ forandring i medikamentmottakelighet for pasienten i eksempel 8; Figur 8B er et Antivirogram® for pasienten som er gjenstand for eksempel 8; Figur 9A er et søylediagram som viser relativ forandring i medikamentmottakelighet for pasienten i eksempel 9; Figur 9B er et Antivirogram® for pasienten som er gjenstand for eksempel 9; Figur 10Å er et kurvediagram som viser relativ forandring i medikamentmottakelighet for pasienten i eksempel 10; Figur 10B er et Antivirogram® for pasienten som er gjenstand for eksempel 10; Figur 1 IA er et kurvediagram som viser relativ forandring i medikamentmottakelighet for pasienten i eksempel 11; Figur 1 IB er et Antivirogram® for pasienten som er gjenstand for eksempel 11; Figur 12A er et kurvediagram som viser relativ forandring i medikamentmottakelighet for pasienten i eksempel 12; og Figur 12B er et Antivirogram® for pasienten som er gjenstand for eksempel 12;

Oppfinnelsen vil bli videre illustrert av følgende eksempler.

MÅTER A UTFØRE OPPFINNELSEN PÅ

Eksempel 1

Protokoll

1. Ekstraksion og oppformering av viralt RNA

RNA ble isolert fra 100 jul plasma i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Boom,. R. et al. (1990, supra) og ble transkribert revers med GeneAmp® revers transkriptasesett (Perkin Eimer) som beskrevet av fabrikanten og ved å bruke en HIV-1-spesifikk nedstrømsprimer (OUT3: 5'-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-3<*>; sekv.id. nr. 1). PCR på revers transkribert RNA ble utført med indre og ytre primere som beskrevet av Kellam, P. og Larder, B.A. (1994, supra). Etter kloroformekstraksjon og sentrifugering på Centricon 100-kolonner eller sentrifugering på anionutvekslingsspinn-kolonner (Quiagen), var det isolerte PCR-produkt klart for anvendelse i transfeksjonsreaksjoner.

2. Produksjon oe isolering av plasmid

Produksjon av pHIVART (MCR) plasmid ble utført i E. coli. Plasmid DNA ble isolert fra natten over-kulturer ved bruk av Qiagen-kolonner som beskrevet av fabrikanten. Utbyttet av det isolerte plasmid ble bestemt spektrofotometrisk ved A260/280-målinger (optisk tetthetsmåling ved X=260 og 280 nm). Ca. 250 ug ultrarent plasmid DNA ble oppnådd fra 500 ml bakteriekultur. Identiteten av det isolerte plasmid ble konfirmert ved restriksjonsanalyse. Deretter ble det isolerte plasmid DNA linearisert med BstEII og renset igjen ved en klassisk fenol/kloro formekstraksj on.

3. Transfeksjon av celler

t

MT4-celler ble underdyrket ved en tetthet på 250 000 celler/ml før transfeksjon (eksponensiell vekstfase). Cellene ble pelletert og resuspendert i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) med en konsentrasjon på 3,1 10Eg celle/ml. En 0,8 ml porsjon (2,5 10E6 celler/ml) ble brukt for hver transfeksjon. Transfeksjon ble utført med Bio-Rad Gene pulser ved å bruke 0,4 cm elektrodekyvetter. Cellene ble elektroporert i nærvær av 10 ug linearisert pHIVART-plasmid og ca. 5 |a.g RT PCR-produkt ved 250 uF og 300 V, etterfulgt av en 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur. Deretter ble 10 ml friskt kulturmedium satt til cellesuspensjonen og inkubasjon ble utført ved 37°C i en fuktig atmosfære på 5%C02.

4. Dyrking oe oppfølging av transfekterte celler

I løpet av 7-10 dager etter transfeksjon ble cellene overvåket for tilsynekomst av cytopatogeneffekt (CPE). I fråvær derav ble cellene underdyrket i forskjellige flasker. Deretter ble kultursupernatanten til transfekterte celler brukt til å danne en stampopulasjon av rekombinant virus og lagret i 1,5 ml porsjoner ved -70°C.

5. Analvse av rekombinantvirus fra pasient viraltRNA

Etter titrering av de nye virus ble stampopulasjonen brukt til antiviraleksperimenter i nærvær av seriefortynninger av forskjellige HIV-inhibitorer. Titer av de høstede supematanter ble bestemt ved begrenset seriefortynningstitrering av virus i MT4-celler.

Virus med en brukbar titer ble brukt i antivirale eksperimenter. I denne hensikt ble 96-brønners mikrotiterplater fylt med 100 ul fullstendig dyrkingsmedium. Deretter ble stamoppløsninger av forbindelser tilsatt i 25 ul volumer til serier av duplikate brønner. HIV- og falsk-infiserte celleprøver ble inkludert for hvert medikament (eller medikamentkombinasjon). Eksponensielt voksende MT4-celler ble deretter overført til mikrotiterplater med en tetthet på 150.000 celler/ml. Cellekulturene ble deretter inkubert ved 37°C i en fuktig atmosfære på 5% CO2. Fem dager etter infeksjon ble viabiliteten til falsk- og HIV-infiserte celler undersøkt spektrofotometrisk ved MTT-metoden (Pauwels, R. et al., J. Virol. Meth. (1988), 20: 309-321) som beskrevet i seksjon 6 nedenfor.

6. MTT- assav

Til hver brønn på mikrotiterplatene, ble 20 ul av en oppløsning av MTT (7,5 mg/ml i PBS) tilsatt. Platene ble videre inkubert ved 37°C i 1 time. Deretter ble 150 ul medium fjernet uten å forstyrre MT4-celleklyngene som inneholder form azankrys tall ene. Oppløsningen av formazankrystallene ble oppnådd ved å tilsette 100 ul 5% Triton X-100 i sur gjort isopropanol (5 ml konsentrert HC1 pr liter oppløsningsmiddel). Fullstendig oppløsning av formazankr<y>stallene ble oppnådd etter at platene var blitt plassert på en platerister i 10 minutter. Til slutt ble absorbansene lest ved to bølgelengder (540 og 690 nm). Fra disse data vedrørende optisk tetthet (OD) ble 50% inhibitoriske (IC50) og 50% cytotoksiske (CC50) konsentrasjoner ble avledet.

Eksempel 2

Konstruksjon av en pHIVARTBstEII- variant med delesjon av HIV- 1- protease og revers transkriptaseeen

Protokollen beskrevet i eksempel 1 ble gjentatt unntatt at sekvens til HIV pol-genet av interesse var den som kodet for RT og protease og konstruksjonen fremstilt var ved pGEMT3-APRT som beskrevet nedenfor. Andre modifikasjoner i forhold til fremgangsmåten i eksempel 1 er beskrevet nedenfor.

For oppformering av viralt RNA revers transkripsjon fra RNA til DNA ble igjen utført med OUT3-primeren. Imidlertid ble primerne brukt for »nested» PCR-prosedyre de som vist i figur 3. Således skal det bemerkes at i den »nested» PCR-prosedyre ble det som ytre primere brukt RVP 5 og OUT3 som indre primere RVP 5 og IN3. Således er denne »nested» fremgangsmåte i virkning en halv-»nested» PCR-fremgangsmåte.

Produksjon oe isolering pGEMT3- APRT

Den avsluttende pGEMT3-APRT-konstruksjon er et derivat av det pGEM9-Zf(-)

(Promega).

I korthet er pGEMT3-APRT-konstruksjonen bygget opp ved å innføre det ønskede innskudd HIV-HXB2 (en protease og revers transkriptase-deletert proviral HIV-1-klone, inkludert flankerende humane sekvenser) i Xbal-restriksjonssete til vektor pGEM9-Zf(-). Det provirale genom er blitt deletert fra Adhl-setet i proteasegenet (omgivende aminosyre 9) til BstEII-setet i pHIVARTBstEII-konstruksjonen (MRC Repository referanse: ADB231). Ved forbindelsespunktet til AProRT-delesjonen er Smal og BstEII-eter lokalisert, og som kan brukes for Knearisering av den provirale konstruksjon før transfeksjon. Konstruksjonen til pGEMT3-APRT er skjematisk representert i figur 1 og 2. Utbyttet av pGEMT3-APRT var ca. 1 mg fra 500 ml bakteriekultur.

Som angitt ovenfor ble plasmidet pGEMT3-APRT deponert ved Belgian Coordinated Collections of Microorganisms-BCCM LMBP-Collection 8. november 1996 under nummeret LMBP3590.

Det var ikke forventet at innføring av det provirale genom i en annen vektor (pGEM9-Zf(-) isteden for pIB 120) ville forårsake store problemer. pIB 120, et derivat av pEMBL8(-) (i henhold til informasjon tilveiebragt av Kodak Scientific Imagirig Systems), og pGEM9-ZF(-) er like vektorer. Ikke desto mindre kan den provirale vektor pIB120HIV være ustabil i recA+E. coli vertsceller (Maschera, B., et al., J. Virol. (1995) 69, 5431-5436. Derfor bør stabiliteten til pGEMT3-APRT-konstruksjonen være verifiseres etter hver ny fremstilling av plasmid.

HIV- HXB- sekvens

Regionen av interesse i HIV-HXB2D-sekvensen (nukleotid 1800-4400) er representert i figur 3 (skjematisk) og figur 4 (fullstendig sekvens). Lokaliseringen av flere gener, restriksjonsseter, primere og delesjoner (APro, ART, AProRT) er også angitt.

Sekvensen i HIV-1 (isolat HXB2, referansegenom, 9718bp) ble oppnådd fra National Center for Biotechnology Information (NCBI), National Library of Medicine, National Institutes of Health via ENTREZ Document Retrieval System.

Genbanknavn: HIVHXB2CG

Genbankaksesjonsnr.: 03455

NCBI sekv.id. nr.: 327742

Rekombinasionsregioner

I kombinasjon med RT-PCR-fragmenter dannet med RVP5 og OUT3/IN3-primere, kan PGEMT3-AP RT-vektoren anvendes til å transfektere MT4-celler som beskrevet i eksempel 1, avsnitt 3. Regionen for rekombinasjon i 5'-enden av AProRT inneholder 188 nukleotider. Regionen for rekombinasjon i 3'-enden av AProRT er lik til den beskrevet tidligere (Kellam, P. og Larder, B.A. (1994) supra) og inneholder 130 nukleotider.

Lengden av disse regioner for. rekombinasjon er ikke uten viktighet. Tidligere data (Bandyopadhyay, P.K. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1984) 81, 3476-3480; Rubnitz, J. og Subramani, S. (1984) supra) demonstrerer at en 10-ganger reduksjon i rekombinasjonsfrekvens kan skje når sekvenshomologi reduseres fra 214 til 163 basepar. Videre bør tilstrekkelig rekombinasjonshendelser skje i de elektroporerte celler for å sikre at dens dannede virusfenotyp er en troverdig refleksjon av kvasiartene som er tilstede i den behandlede HIV-positive pasient. Optimalisering av rekombinante hendelser kan først oppnås ved å justere forholdet mellom linearisert proviral vektor og RT-PCR-fragment som blir brukt til elektroporering av målcellene. Standard metode derfor, med typiske resultater, er tidligere blitt beskrevet at Kellam, P. og Larder, B.A. (1994, supra). Som en følge ble det bestemt å øke startmengden til ca. 2 ug PCR-produkt (med 10 ug vektor) til ca. 5 ug eller mer. Resultatet derav ble reflektert i en hurtigere tilsynekomst av synlig virusvekst (cytopatogenisk virkning) i kulturen av transfekterte celler.

En annen opsjon for optimalisering av rekombinasjonshendelser ville være konstruksjon av primere som resulterer i lengre rekombinasjonssekvenser.

Ikke desto mindre vil den virkelige tilførsel i transfeksjonsreaksjonen alltid avhenge av utbyttet etter PCR. Noen prøver har et høyt utbytte og som et resultat vil det være en høyere tilførsel av oppformert materiale i transfeksjonsreaksjonen (med bedre resultater med hensyn på rekombinasjonseffektivitet). Imidlertid på tross av en lavere rekombinasjonseffektivitet kan prøver som har et lavt utbytte også transfekteres og vil resultere i levbare virus med en sikker refleksjon på viruspopul asj onen.

Eksempel 3

Alternative primere for RT- PCR av ProRT- sekvensen

Nye primere (A-D) er blitt konstruert relativt til dem brukt i eksempel 2 og bør resultere i lengre rekombinasjonssekvenser i både 5'-enden og 3'-enden av ProRT-regionen. To primere ble konstruert i både 5'- og 3'-enden av den respektive region for å tillate »nested» PCR. Som angitt i figur 3 og 4 var de direkte gjentakelsene tilstede ved 5'-enden av ProRT-regionen tatt inn i beregning under konstruksjon av de respektive primere. De nye primere er som følger:

Eksempel 4

Konstruksjon av en alternativAProRT- vektor

Som nevnt ovenfor kan konstruksjon av en alternativ ProRT-deletert vektor utføres ved oligonukleotidmediert mutagenese. Det er imidlertid også mulig å forstørre Pro RT-del esj onen fra den nåværende 3'-enden til neste Kpnl-sete i RT-genet (40 basepar videre nedstrøms). Ligering av et Klenow-behandlet Kpnl-sete til et Klenow-behandlet BstEII-sete vil gjenopprette den initielle. BseEII gjenkjennelsessekvens. Som sådan oppfører denne alternative vektor seg lik pGMT3-APRT-vektoren beskrevet i eksempel 2, men har en litt større RT-delesjon.

Eksempel 5

En HIV-infisert pasient som mottok AZT fra desember 1989 til en udokumentert senere dato, og gikk over til en kombinert kjemoterapi med AZT + 3TC (1:1) fra februar 1994 inntil oktober 1995 ga plasma hvis mottakelighet for et antall RT-inhibitorer ble bestemt i henhold til ovenfor beskrevne protokoll i eksempel 1.

Rekombinant villtype HIV-stamme recIIIB ble brukt i nevnte protokoll som en referanse HIV-virus. Tabell 1 viser ICso-verdier (uM) forholdet mellom nevnte verdier. Antivirogram® er vist i figur 5.

Fra disse data kan man bestemme at monoterapi med 3TC sannsynligvis ikke vil være noe bra for denne spesielle pasienten. Kombinert terapi med AZT+3TC (nåværende terapi) er imidlertid fremdeles sannsynlig å gi en positiv virkning.

Eksempel 6

En medikament HIV-infisert pasient ga plasma hvis mottakelighet for et antall RT-inhibitorer ble bestemt i henhold til ovenfor beskrevne protokoll i eksempel 1. Rekombinant villtype HIV-stamme recIIIB ble brukt i nevnte protokoll som en referanse HI V-virus. Tabell 2 viser de målte ICso-verdier (uM) og forholdet mellom nevnte verdier. Et Antivirogram® ble fremstilt som vist i figur 6.

j

Fra disse data kan man bestemme at pasienten er infisert med HIV-stammer som tett ligner villtype HIV. Ingen av medikamentregimene skal ekskluderes slik at kjemoterapi kan igangsettes med et medikament som AZT som har et positivt resultat.

Eksempel 7

En medikamentnaiv HIV-infisert pasient ga plasma hvis mottakelighet for et antall av RT-inhibitorer ble bestemt i henhold til protokollen oppsatt i eksempel 1. Rekombinant villtype HIV-stamme recIIIB ble brukt som referanse HIV-virus. Tabell 3 viser målte ICso-verdier (|iM) og forholdet mellom nevnte verdier. Et søylediagram som viser relativ forandring i medikamentmottakelighet er vist i figur 7A. Et Antivirogram® ble også fremstilt og er vist i figur 7A.

Fra disse data kan man slutte at pasienten er infisert med en HIV-stamme som tett ligner villtype HIV. Ingen av medikamentregimene bør ekskluderes slik at kjemoterapi kan initieres med et medikament så som AZT, 3TC eller andre som har vist positive resultater.

Eksempel 8

En HIV-infisert pasient med en terapihistorie som inkluderer AZT, 3TC og lovirid ga plasma hvis mottakelighet for et antall RT-inhibitorer ble bestemt i henhold til protokollen satt opp i eksempel 1. Rekombinant villtype HIV-stamme recIIIB ble brukt som en referanse HIV-virus. Tabell 4 viser målte ICso-verdier (uM) og forholdet mellom nevnte verdier. Et søylediagram som viser relativ forandring i medikamentmottakelighet er vist i figur 8A. Et Antivirogram® ble også fremstilt og er vist i figur 8A.

Fra disse data kan man slutte at pasienten er infisert med HIV-stamme som viser en redusert mottakelighet mot mesteparten av nukleosid og ikke-nukleosid antiretrovirale medikamenter undersøkt. Terapi kan fremdeles initieres med D4T eller DDC. Muligheten av å inkludere proteaseinhibitorer i terapien kan vurderes.

Eksempel 9

En HIV-infisert pasient med en terapihistorie som inkluderer multiple nukleosidanaloge RT-inhibitorer ga plasma hvis mottakelighet for et antall RT-inhibitorer ble bestemt i henhold til protokollen satt opp i eksempel 1. Rekombinant villtype HIV-stamme recIIIB ble brukt som en referanse HIV-virus. Tabell 5 viser målte IC5o-verdier (uM) og forholdet mellom nevnte verdier. Et søylediagram som viser relativ forandring i medikamentmottakelighet er vist i figur 9A. Et Antivirogram® ble også fremstilt og er vist i figur 9A.

Fra disse data kan man slutte at pasienten er infisert med en HIV-stamme som viser nedsatt mottakelighet mot alle nukleosidanaloge antiretrovirale medikamenter. Ikke-nukleoside antiretrovirale medikamenter bør ikke ekskluderes fra terapien. Også her kan muligheten av å inkludere proteaseinhibitorer i terapien vurderes.

Eksempel 10

En medikamentnaiv HIV-infisert pasient ga plasma hvis mottakelighet for et antall

av RT-inhibitorer og proteaseinhibitorer ble bestemt i henhold til protokollen satt opp i eksempel 1. Rekombinant villtype HIV-stamme recIIIB ble brukt som referanse HIV-virus. Tabell 6 viser de målte ICso-verdier (uM) og forholdet mellom nevnte verdier. Et søylediagram som viser relativ forandring i medikamentmottakelighet er vist i figur 10A. Et Antivirogram® ble også fremstilt og er vist i figur 10A.

Fra disse data kan man slutte at pasienten er infisert med en HIV-stamme som ligner svært villtype HIV. Ingen av medikamentregimene skal ekskluderes slik at kjemoterapi kan igangsettes med et medikament så som AZT, 3TC eller andre som har vist positive resultater.

Eksempel 11

En HIV-infisert pasient med en terapihistorie som inkluderer RT- og proteaseinhibitorer ga plasma hvis mottakelighet for et antall RT-inhibitorer og proteaseinhibitorer ble bestemt i henhold til protokollen satt opp i eksempel 1. Rekombinant villtype HIV-stamme recIIIB ble brukt som en referanse HIV-virus. Tabell 7 viser målte ICso-verdier (uM) og forholdet mellom nevnte verdier. Et søylediagram som viser relativ forandring i medikamentmottakelighet som vist i figur 1 IA. Et Antivirogram® ble også fremstilt og er vist i figur 1 IA.

Fra disse data kan man slutte at pasienten er infisert med en HIV-stamme som viser en nedsatt mottakelighet mot RT-inhibitor 3TC og proteaseinhibitorer indinavir og ritonavir. Følgelig kan kjemoterapien justeres med medikamenter så som AZT eller saquinavir som har vist positive resultater.

Eksempel 12

En HIV-infisert pasient med en terapihistorie som inkluderer RT- og proteaseinhibitorer ga plasma hvis mottakelighet for et antall RT-inhibitorer og proteaseinhibitorer ble bestemt i henhold til protokollen satt opp i eksempel 1. Tabell 8 viser målte ICso-verdier (uM) og forholdet mellom nevnte verdier. Et søylediagram som viser relativ forandring i medikamentmottakelighet er vist i figur 12A. Et Antivirogram® ble også fremstilt og er vist i figur 12A.

Fra disse data kan man slutte at pasienten er infisert med en HIV-stamme som viser nedsatt mottakelighet mot RT-inhibitorer 3TC og AZT og proteaseinhibitorer indinavir, ritonavir og quinavir.

Eksempel 13

Sammenligning av fenotvping relativt til genotyping

Plasmaprøver ble oppnådd fra HIV-infiserte individer som hadde mottatt ikke-nukleosid RT-inhibitor (NNRTI) langtids monoterapi. HIV-RNA ble ekstrahert, revers transkribert og oppformert som beskrevet i eksempel 1. Ved å utgå fra ytre PCR-materiale av positive prøver ble de første 785 nukleotider i RT-genet oppformert og dette materialet ble videre brukt for genotyping.

I korthet ble det 785 nukleotidfragment utsatt for syklerende sekvenseringsreaksjoner ved å bruke ThermoSequenase® fluorescentmerket primer sykelsekvenseringssett med 7-deaza-dGTP fra Amersham (cat# RPN2438). Fire sekvenseringsprimere, valgt for å tillate sekvensbestemmelse i begge retninger fra nukleotid 27 til nukleotid 681 i RT-genet, ble brukt for hver prøve. Reaksjonene ble analysert på en ALF® automatisk sekvenseringsanordning (Pharmacia). De dannede sekvenser ble eksportert til en Power Macintosh® og videre analysert med GeneWorks® 2,5 software (Oxford Molecular Group Inc.). De resulterende aminosyresekvenser ble sammenlignet med den tilsvarende sekvens i laboratorie HIV-1-klone HXB2D og resistensassosierte mutasjoner identifisert i pasientmaterialet. Resultatene er vist i tabell 9 hvor en-bokstav aminosyrekode blir anvendt.

Øverste rekke i tabell 9 viser aminosyrene (AA) funnet i villtypesekvensen og deres posisjon. Aminosyreforandringer i disse posisjonene er vist for hver pasient i de følgende rekker. Bare posisjoner hvor forandringer ble observert i pasientmaterialet er vist. Den høyre del av tabell 9 presenterer foldingsmotstanden til forskjellige RT-inhibitorer som bestemt ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for hver av pasientprøvene. NNRTI 1 er den ikke-nukleoside RT-inhibitor som ble administrert til pasientene. NNRTI 2 er en annen ikke-nukleosid RT-inhibitor for hvilken kryssresistens den første ble observert i noen grad.

Genotypresultatene med hensyn på nukleosidanaloge RT-inhibitorers resistens er som følger: M41L, D67N, K70R, T215F/Y og K219Q/E er AZT-resistens-assosierte mutasjoner (Larder, B. og Kemp, S. (1989) Science 246, 1155-1158; Kellam, P. et al. (1992) PNAS 89, 1934-1938). Deres nærvær, individuelt eller i forskjellige kombinasjoner i genomet til HIV isolert fra pasientmaterialet korrelerer med den fenotypiske resistens som bestemt av det dannede Antivirogram® (pasient 11 og 12).

Det samme gjelder for resistensen til 3TC assosiert med M184V-mutasjon (Tisdale, M. et al. (1993) PNAS 90, 5653-5656) som er observert bare i pasientene som viser fenotypisk resistens til medikamentet (pasient 11 og 16).

De genotypiske resultater med hensyn på NNRTI-resistens er som følger:

Tre pasienter (3, 4 og 12) har ingen NNRTI-resistens-assosiert mutasjon og er

fenotypisk sensitive ovenfor medikamentet.

Flesteparten av pasientene som viser fenotypisk resistens til NNRTI har en

NNRTI-resistens-assosiert mutasjon i posisjon 103 (K103N/S).

En pasient (9) har Yl 81C NNRTI-resistens-assosiert mutasjon og viser en

høy fenotypisk resistens (>1432. ganger) til NNRTI.

Pasient 13 har flere NNRTI-resistens-assosierte mutasjoner (KlOIE, K103N

delvis og G190A delvis). Denne pasienten viser også en høy fenotypisk resistens (>1466 ganger) til NNRTI 1. E138A-mutasjonen observert i denne prøve er ikke assosiert så langt med resistens. Imidlertid, en annen mutasjon i samme posisjon, det vil si E138K, er bitt demonstrert å spille en viktig rolle i

resistens til TSAO-forbindelser (Balzarini, J. et al (1993) PNAS 90, 6952-9656). Rollen til E138A-mutasjon må fremdeles vurderes.

Pasient 20 har A98& NNRTI-resistens-assosiert mutasjon og viser fenotypisk

resistens til det testede NNRTI.

Pasient 22 har V1081 NNRTI-resistens-assosiert mutasjon men viser ikke noen fenotypisk resistens til den testede NNRTI.

Pasient 24 viser ingen NNRTI-resistens-assosiert mutasjon (K101Q-mutasjonen er funnet i flere HIV-l-villtypegenomer) men er fenotypisk resistent til det testede NNRTI.

Claims

1. In vitro fremgangsmåte til å fastsette HIV-kjemoterapi for pasienter som er HIV-positive," karakterisert vedat den omfatter å transfektere en cellelinje mottakelig for infeksjon av HIV med en sekvens fra pol-genet til HIV, oppnådd ved å isolere virus RNA fra en prøve av biologisk materiale fra en pasient og revers transkribere den ønskede region av nevnte pol-gen, og et HIV-DNA-konstrukt fra hvilken nevnte sekvens er blitt deletert, dyrke nevnte transfekterte celler slik at det dannes en stampopulasjon av kimeriske vira, fastsette den fenotypiske sensitivitet til nevnte kimeriske vira for en inhibitor av nevnte enzym kodet av pol-genet til HIV og gi en verdi dertil, å konstruere et datasett som omfatter nevnte verdi for kimerisk virussensitivitet og den tilsvarende verdi for en kimerisk villtype-stamme av HIV, gjenta sensitiyitetsfastsettelsen for minst to ytterligere inhibitorer og derved konstruere minst tre slike datasett totalt, representere nevnte datasett i. todimensjonal eller tredimensjonal grafisk form slik at forskjellen mellom de kimeriske og villtype-sensitiviteter i tilfelle av hvert datasett tilveiebringer et visuelt mål for resistensen til den kimeriske stampopulasjon for behandling med inhibitoren det dreier seg om, og å velge den/de optimale inhibitor(er) på basis av den grafiske representasjonen av de målte resistenser.

2. Fremgangsmåte til å fastsette HIV-kjemoterapi i henhold til krav 1,karakterisert vedat datasettene er representert på en polygonal eller halvsirkulær kurve som omfatter; (a) et flertall av normaliserte akser som strekker seg radielt fra et origo, hver akse tilsvarer et datasett eller inhibitor eller kombinasjon derav; (b) aksene er normalisert slik at sensitivitetsverdier for villtype HIV for de forskjellige inhibitorer er lik på hver akse, hvor datapunktene for villtype HIV er eventuelt representert og sammenbundet til å danne et regulært polygon hvis toppunkter ligger på aksene og hvis senter er definert av origo; (c) på hver akse er det plottet et datapunkt som representerer sensitivitetsverdien til den kimeriske HIV-stampopulasjon mot inhibitoren som tilsvarer nevnte akse, de kimeriske datapunktene er eventuelt sammenbundet til å danne et regulært eller irregulært polygon hvis fasong representerer motstanden til den kimeriske stampopulasjon til et utvalg av inhibitorer.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert vedat hver akse har en logaritmisk skala.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 2 eller 3, karakterisert vedat eksentriske datapunkter i det kimeriske polygon, hvis det er tilstede, identifiserer inhibitorer hvis nyttighet kan antas å være av liten eller ingen fordel for pasienten, mens datapunktet som ligger innenfor eller tett på yttersiden av villtypepolygonet identifiserer inhibitorer hvis nyttighet kan antas å være av betydelig fordel for pasienten.

5. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav,karakterisert vedat hver av de nevnte tre eller flere datasett videre omfatter en verdi for den målte resistens i det verste tilfellet for inhibitoren det gjelder, nevnte verste tilfelle-verdier er representert på nevnte grafiske presentasjon slik at datapunktet for den kimeriske stampopulasjonen kan sammenlignes både til villtypen og det verste tilfelle HIV, for derved å tilveiebringe en vurdering av den relative verdi av inhibitoren i et spesielt tilfelle.

6. Fremgangsmåte til å fastsette HIV-kjemoterapi for pasienter som er HIV-positive,karakterisert vedat den omfatter trinnene; (a) periodisk fastsettelse av den fenotypiske sensitivitet til en pasients HIV-stammer i henhold til ett av kravene 1-5; (b) utstedelse av instruksjoner til å opprettholde kjemoterapien med den selekterte inhibitor mens pasientens HIV-stammer forblir mottakelige for den selekterte kjemoterapi; og (c) å selektere en annen inhibitor hvis og når mottakeligheten til den opprinnelige inhibitor reduseres.

7. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 1-6, karakterisert vedat den fenotypiske sensitivitet til nevnte kimeriske virus ovenfor inhibitorer til minst to enzym kodet av pol-genet hos HIV er samtidig vurdert.

8. Fremgangsmåte til å bestemme den fenotypiske medikamentsensitivitet til individuelle HIV-stammer i en pasient ovenfor inhibitorer av minst to enzymer kodet av pol-genet til HIV, karakterisert vedat den omfatter å transfektere en cellelinje mottakelig for informasjon med HIV med en sekvens fira pol-genet til HIV, oppnådd ved å isolere viralt RNA fra en prøve av biologisk materiale fra en pasient og transkribere revers den ønskede region av nevnte pol-gen, og en HIV- DNA-konstruksjon fra hvilken nevnte sekvens er blitt deletert, dyrke nevnte transfekterte celler slik at det dannes en stampopulasjon av kimeriske vira og fastsettelse av den fenotypiske.sensitivitet til nevnte kimeriske vira til inhibitorer av nevnte enzymer kodet av pol-genet hos HIV.

9. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte biologiske materiale er valgt fra plasma, serum eller en cellefri kroppsvæske, valgt fra sæd og vaginalvæske.

10. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 1-8, karakterisert vedat det biologiske materialet er fullblod til hvilket en RNA-stabilisator er blitt tilsatt.

11. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav,karakterisert vedat det biologiske materialet er vevsmateriale valgt fra hjernevev eller lymfeknutevev.

12. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 8-11, karakterisert vedat minst to enzymer er valgt fra HIV RT, protease og integrase.

13. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 1-12, karakterisert vedat cellelinjen som er mottakelig for infeksjon med HIV er en CD4<+>T-cellelinje.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert vedat CD4<+>T-cellelinje er MT4-cellelinje eller HeLa CD4<+->cellelinje.

15. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 1-14, karakterisert vedat den ønskede region av pasientens pol-gen er revers transkribert ved å bruke en spesifikk nedstrømsprimer.-

16. Fremgangsmåte som angitt'i krav 15, karakterisert vedat sekvensen som skal revers transkriberes er den som koder for revers transkriptase og protease.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert vedat nedstrømsprimeren er OUT3: 5'-CAT TGC TCT CC A ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-3' (Sekv.id. nr. 1).

18. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 15-17, karakterisert vedat produktet av revers transkripsjon blir oppformert ved å bruke en »nested» PCR-teknikk.

19. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 1-18, karakterisert vedat HIV-DNA-konstruksjonen er en fra hvilke RT-genet og proteasegenet er deletert, og er plasmidet pGEMT3-APRT som deponert ved Belgian Coordianted Collections of Microorganisms-BCCM LMBP-Collection, 8. november 1996 under nummeret LMBP3590.

20. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 1-19, karakterisert vedat transfeksjonen blir oppnådd ved elektroporering.

21. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 1-19, karakterisert vedat transfeksjonen blir utført ved anvendelse av kationiske lipider.

22. Fremgangsmåte som angitt i ett av krayene 1-21, karakterisert vedat den fenotypiske medikamentsensitivitet til de kimeriske vira ovenfor forskjellige RT-, protease- og integraseinhibitorer blir vurdert i et automatisert cellebasert assay.

23. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 1-22, karakterisert vedat den fenotypiske medikamentsensitivitet til de kimeriske vira og til vill-HIV-stammen ovenfor en eller flere RT-, protease-eller integraseinhibitorer blir uttrykt som en inhibitorisk konsentrasjon (IC-verdi).

24. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 1-23, karakterisert vedat RT-inhibitorer er valgt fra nukleosid RT-inhibitorer så som AZT, ddl, ddC, 3TC, d4T, ikke-nukleosid RT-inhibitorer, så som lovirid, nevirapin og tivirapin, proteaseinhibitorer så som saquinavir, indinavir og ritonavir og integraseinhibitorer så som koffeinsyrefenyletylester (CAPE).