ES2546190T3 - Método para determinar mutaciones de resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6 - Google Patents

Método para determinar mutaciones de resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6 Download PDF

Info

Publication number
ES2546190T3
ES2546190T3 ES09740083.2T ES09740083T ES2546190T3 ES 2546190 T3 ES2546190 T3 ES 2546190T3 ES 09740083 T ES09740083 T ES 09740083T ES 2546190 T3 ES2546190 T3 ES 2546190T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
ns5b
sequencing
genotyping assay
seq
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09740083.2T
Other languages
English (en)
Inventor
Lieven Jozef Stuyver
Diana Koletzki
Jan Martin Berke
Ina Isabel Vandenbroucke
Leen Roger Vijgen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Infectious Diseases Diagnostics BVBA
Original Assignee
Janssen Infectious Diseases Diagnostics BVBA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Infectious Diseases Diagnostics BVBA filed Critical Janssen Infectious Diseases Diagnostics BVBA
Application granted granted Critical
Publication of ES2546190T3 publication Critical patent/ES2546190T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Abstract

Métodos para determinar mutaciones resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la Hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6, más en particular para los genotipos específicos de subtipo 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 4a y 4d, presentes en una muestra que comprende: a) obtener dicha muestra de un paciente, b) extraer material genético viral de dicha muestra, c) amplificar la región NS5B de HCV para generar un amplicón de ADN de 388 pares de bases usando cebadores que tienen secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 1-5, d) secuenciar el amplicón para obtener una secuencia de 329 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 3-5, e) realizar análisis de árboles filogenéticos usando la información de secuencia de 329 pares de bases de NS5B para obtener información de subtipo de HCV en dicha muestra del paciente, f 1) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 6-9, 42-45, 104-107, 120-123, 145-148 o 180-183 para la generación de un amplicón de ADN que comprende la proteína no estructural NS3 (181 aminoácidos N-terminales), g 1) secuencia el amplicón de NS3 para obtener una secuencia de 543 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 8 y 9; 43 y 45-46; 104 y 106; 120 y 122; 146 y 148 o 180 y 182 o f2) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 13-16, 54 y 59-66, 124-133, 158 y 160-168 o 194-197 para la generación de un amplicón de ADN que comprende la polimerasa NS5B, g 2) secuenciar el amplicón de la polimerasa NS5B para obtener una secuencia de 1776 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 15-16 y 87-92; 54, 59 y 61-66; 124 y 127-133; 158-159, 161 y 163-168 o 197-204 o f 3) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 30-33, 67-70, 93-96, 108-111, 134-137 o 169-172 para la generación de un amplicón de ADN que comprende NS3/4A, g 3) secuenciar el amplicón de la proteasa NS3/4A para obtener una secuencia de 2055 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 34-41; 68 y 71-77; 95 y 97-103; 112- 119; 136 y 138-144 o 171 y 173-179 o f4) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 47-50, 78-81,149-151 y 159 o 184-187 para la generación de un amplicón de ADN que comprende NS4B/5A, g 4) secuenciar el amplicón de NS4B y NS5A para obtener una secuencia de los dos genes NS4B y NS5A usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 51-57; 79 y 81-87; 152-159 o 185 y 187-193; h) alinear la secuencia obtenida en la etapa (g1), (g2), (g3) o (g4) con una secuencia de HCV de referencia o de tipo silvestre, i) determinar una o más mutaciones de resistencia a fármacos en el material genético viral presente en la muestra del paciente.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
5
15
25
35
45
55
65
E09740083
11-09-2015
El ciclado térmico consistió en 50 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 15 s, hibridación a 58ºC durante 30 s y elongación a 72ºC durante 1 min. La extensión final tuvo lugar a 72ºC durante 5 min. Se usó una alícuota del producto de amplificación resultante para una etapa de PCR anidada.
B. PCR interna
Para la PCR anidada, se mezclaron 2,5 l del producto de RT-PCR de una etapa con tampón 2 10x del kit Expand™ High Fidelity (Roche), dNTP 0,35 mM (Promega), cebador 1b_NS3_in_F (TCATCTTAGGCCTGCCCGTCTC) (SEC ID Nº 8) 0,4 M, cebador 1 b_NS3_in_R (GGGAGCGTGTAGATGGGCCAC) (SEC ID Nº 9) 0,4 M y 0,075 U/l de ADN polimerasa Expand™ High Fidelity (Roche) para dar un volumen total de 50 l. La desnaturalización inicial fue a 94ºC durante 2 min y el ciclado térmico consistió en 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 15 s, hibridación a 58ºC durante 30 s y elongación a 72ºC durante 1 min. La extensión final tuvo lugar a 72ºC durante 5 min. Los amplicones se purificaron usando el kit de purificación de QIAQuick 96 PCR (Qiagen). El volumen final de los amplicones purificados fue 100 l.
C. Análisis de secuencia sin procesar
La reacción de secuenciación se realizó de acuerdo con procedimientos convencionales usando los cebadores de la PCR anidada para secuenciar en ambas direcciones, directa e inversa (SEC ID Nº 8-9). Se recuperaron los electroferogramas del secuenciador capilar ABI3730 y se importaron en Seqscape v2.5 (Applied Biosystems). Los extremos de las secuencias se recortaron en base a valores de calidad y la longitud de 543 pb (secuencia codificante para los 181 aa N-terminales de NS3) de la secuencia de referencia de subtipado; abarcando la última las regiones entre los cebadores de amplificación. No se permitió que aparecieran inserciones, deleciones o codones de PARADA en las secuencias.
Resultado:
Secuencias de proteasa NS3 de cinco (5) aislados de HCV-1b de pacientes
>NS3 Pt 1 GCGCCTATCACGGCCTACGCCCARCAAACACGGGGCTTGTTTGGCTGTAT CATCACTAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAGGTCGAGGGGGAGGTC CAAGTGGTTTCCACCGCCACACAATCTTTCCTGGCGACCTGTGTCAACGG TGTKTGTTGGACTGTCTTCCACGGCGCCGGTTCAAAGACCCTGGCTGGCC CAAAGGGYCCAATCACCCAAATGTACACCAATGTAGACCAGGACCTCGTC GGCTGGCCGGCCCCCCCYGGGGCGCGCTCTCTRACACCATGCACCTGTG GCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGGCATGCTGATGTTATCCCGGTG CGCCGGCGGGGCGACAGTAGGGGRAGCCTACTCTCCCCCAGGCCTGTG TCCTACTTAAAAGGCTCTTCGGGTGGWCCRCTGCTCTGCCCCTCGGGGC ACGCTGTGGGCGTCTTCCGGGCTGCTGTGTGCACCCGGGGGGTCGCGA AGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGAGACTACCATGCGGTCC
>NS3 Pt 2 GCGCCCATCACGGCCTACGCCCAACARACGAGGGGCCTACTTGGCTGTA TCATCACCAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAGGTYGAGGGGGAGGT TCAGGTGGTCTCCACTGCAACACAGTCCTTCCTGGCRACTTGCATCAACG GCGTGTGTTGGACTGTCTTTCATGGAGCCGGCTCTAAGACCCTAGCCGGC CCAAAGGGGCCGATCACCCAGATGTACACCAATGTAGACCAGGACCTCGT CGGCTGGCAAGCGCCCCCYGGGGCGCGTTCCTTGACACCGTGCAGCTGC GGCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGGCATGCGGATGTCATTCCGGT GCGCCGGCGAGGTGACAGCAGGGGGAGCTTGCTCTCCCCCCGGCCCAT TTCYTACTTRAAAGGCTCTTCGGGTGGTGCRYTGCTCTGCCCCTCGGGGC ACGCYGTGGGCATCTTCCGGGCTGCCGTGTGCACYCGGGGGGTTGCCAA GGCRGTGGATTTTGTACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACYATGCGGTCC
>NS3 Pt 3 GCGCCTATTACGGCCTACGCCCAACAGACGAGGGGCCTATTAGGCTGCA TCATCACTAGCCTCACAGGCCGAGACAAGAACCAGGTCGAGGGGGAGGT TCAGGTGGTTTCTACCGCAACACAATCCTTCCTAGCGACTTGCGTCAACG GCGTGTGTTGGACTGTCTATCATGGCGCCGGCTCTAAGACCTTAGCCGGC CCAAAGGGGCCTGTCACCCAAATGTACACCAATGTAGACCAAGACCTCGT CGGCTGGCCAGCGCCCCCCGGGGCGCGTTCCTTGACACCATGTACTTGC GGCAGTTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGACATGCCGATGTCATTCCGGT GCGCCGGCGGGGCGACAGCAGGGGGAGCCTGCTCTCCCCCAGGCCTGT CTCCTATTTGAAGGGCTCTTCGGGTGGTCCACTGCTCTGCCCTTCAGGGC ACGCCGTGGGCATCTTCCGGGCTGCCGTGTGCACCCGAGGGGTTGCCAA
5
10
15
20
25
30
E09740083
11-09-2015
GGCGGTGGACTTTGTGCCCGTCGAGTCCATGGAAACTACTATGCGGTCT
>NS3 Pt4 GCGCCTATCACGGCTTACTCCCAACAGACGCGGGGCCTGCTTGGCTGCA TCATCACYAGCCTCACAGGCAGRGACAAGAACCAGGTCGAGGGGGAAGT CCAAGTGGTTTCCACCGCAACACAATCTTTTCTAGCGACCTGTGTCAACG GCGTGTGTTGGACTGTTTTCCATGGCGCCGGCTCAAAAACCTTAGCGGGG CCAAAGGGCCCGGTCACCCAAATGTACACCAATGTAGACCAGGACCTCGT CGGCTGGCAGGCGCCTACCGGGGCGCGTTCTTTAACACCATGCACGTGC GGCAGCTCGGACCTTTATTTGGTCACGAGGCATGCTGATGTCATTCCGGT GCGCCGGCGGGGCGACAGCCGGGGGAGTCTACTCTCCCCCAGGCCCGT CTCCTACTTGAAGGGCTCCTCGGGTGGTCCGCTGCTCTGCCCCTCGGGG CATGCAGTGGGCATCTTCCGGGCTGCCGTGTGCACCCGGGGGGTCGCAA AGGCAGTGGACTTGATACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACTATGCGGTGC
>NS3 Pt5 GCGCCTATCACAGCCTACTCCCAACAGACGCGGGGCCTGCTTGGCTGCA TCATCACTAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAGGTCGAGGGGGAGGT TCAAGTGGTTTCCACCGCGACACAATCTTTCCTGGCGACCTGCGTCAACG GCGTGTGTTGGACTGTCTACCATGGTGCCGGCTCGAAGACCCTAGCGGG CCCAAAGGGCCCGATGACCCAAATGTACACCAATGTAGACCAGGACCTCG TCGGCTGGCCGGCGCCCTCCGGAGCGCGCTCCTTGACACCGTGCACCTG CGGCAGCTCAGACCTYTACTTGGTCACGAGGCATGCTGATGTTGTTCCGG TGCGCCGGCGGGGCGACAGCAGGGGAAGCCTACTCTCCCCCAGGCCCA TTTCCTACTTGAAGGGCTCTTCGGGTGGCCCGCTGCTTTGCCCCTCGGGG CACGCGGTGGGCATCTTCCGGGCTGCTGTATGCACCCGGGGGGTCGCGA AGGCGGTGGACTTTGTACCCGTTGAGTCTATGGAAACCACCATGCGGTCT
D. Alineación de secuencias con la secuencia de referencia
La alineación muestra la secuencia de nucleótidos del dominio proteasa NS3 de un aislado de HCV-1b de un paciente no tratado. Las secuencias se alinearon frente a una secuencia de referencia. Las homologías entre las dos secuencias se representan como puntos.
imagen7
Los siguiente muestra la secuencia de aminoácidos del dominio proteasa NS3 de un aislado de HCV-1b de un paciente no tratado. Las secuencias se alinearon frente a una secuencia de referencia. Las homologías entre las dos secuencias se representan como puntos.
imagen8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
E09740083
11-09-2015
Los amplicones de NS3 de estos cinco aislados de HCV-1b se usaron adicionalmente en el ensayo de fenotipado del replicón de NS3.
Ensayo de genotipado de la polimerasa NS5B de HCV
RT-PCR de una etapa:
Se mezclaron cinco l de ARN con tampón de reacción 2x, 120 ng/ml de ARNt de levadura (Ambion Inc.), cebador 1b_NS5B_out_F (TAGAGTCCTGGAAGGACCCGG) (SEC ID Nº 13) 0,2 M, cebador 1 b_NS5B_out_R (GGCCTGGAGTGGTTAGCTCCCC) (SEC ID Nº 14) 0,2 M y 0,5 l de la mezcla de enzimas Superscript™ III RT/Platinum Taq High Fidelity del sistema de RT-PCR de una etapa Superscript™ III (Invitrogen) en un volumen total de 25 l. La síntesis de ADNc se realiza durante 30 min a 47ºC seguido de una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 2 min. El ciclado térmico consistió en 50 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 15 s, hibridación a 59ºC durante 30 s y elongación a 68ºC durante 2 min 30 s. La extensión final tuvo lugar a 68ºC durante 5 min. Se usó una alícuota del producto de amplificación resultante para una etapa de PCR anidada.
PCR interna:
Para la PCR anidada, se mezclaron 2,5 l del producto de RT-PCR de una etapa con tampón 1 10x del kit Expand™ Long Template High Fidelity (Roche, Basilea, Suiza), dNTP 0,35 mM (Promega), cebador 1b_NS5B_in_F (TGGAAGGACCCGGACTACG) (SEC ID Nº 15) 0,4 M, cebador 1b_NS5B_in_R (GAGTGGTTAGCTCCCCGTTCA) (SEC ID Nº 16) 0,4 M y 0,075 U/l de ADN polimerasa Expand™ High Fidelity (Roche,) para dar un volumen total de 50 l. La desnaturalización inicial fue a 94ºC durante 2 min y el ciclado térmico consistió en 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 15 s, hibridación a 59ºC durante 30 s y elongación a 68ºC durante 2 min 30 s. La extensión final tuvo lugar a 68ºC durante 5 min. Los amplicones se purificaron usando el kit de purificación de PCR QIAQuick 96 (Qiagen). El volumen final de los amplicones purificados fue 100 l.
Análisis de secuencia sin procesar
La reacción de secuenciación se realizó de acuerdo con procedimientos convencionales usando 8 cebadores de secuenciación (SEC ID Nº 15-16 y 87-92) para cubrir ambas direcciones, directa e inversa. Se recuperaron los electroferogramas del secuenciador capilar ABI3730 y se importaron en Seqscape v2.5 (Applied Biosystems). Los extremos de las secuencias se recortaron en base a valores de calidad y la longitud de 1776 pb (secuencia codificante de la polimerasa NS5B) de la secuencia de referencia específica de subtipo; abarcando la última las regiones entre los cebadores de amplificación. No se permitió que aparecieran inserciones, deleciones o codones de PARADA en las secuencias.
Resultado: Secuencias de polimerasa NS5B de cinco aislados clínicos de HCV-1b
>NS5B Pt12 TCGATGTCCTACACGTGGACGGGCGCCCTGATCACGCCGTGCGCCGCGG AGGAAAGCAAGCTGCCTATCAATGCATTGAGCAACTCACTGCTGCGTCAC CACAATATGGTTTATGCTACAACATCCCGCAGCGCAAGCCAGCGGCAGAA GAAGGTCACTTTTGACAGACTGCAAGTCCTGGACGACCACTACCGGGACG TGCTCAAGGAGATGAAGGCGAAGGCGTCCACAGTTAAGGCTAAGCTTCTA TCTGTAGAGGAAGCCTGTAAACTGACGCCCCCACATTCGGCCAGATCCAA ATTTGGCTAYGGGGCAAAGGACGTCCGGAACCTATCCAGCAAGGCCGTTA ACCACATCCGCTCCGTGTGGAAGGACTTGCTGGAAGACACTGAGACACCA ATTGACACCACCATCATGGCAAAAAACGAGGTYTTCTGCGTCCAACCAGA GAAAGGAGGCCGCAAGCCAGCTCGCCTTATCGTGTTCCCAGACTTGGGA GTTCGTGTGTGCGAGAAAATGGCCCTTTACGACGTGGTCTCCACTCTTCC TCAAGCCGTGATGGGCTCCTCATATGGATTCCAGTACTGTCCTGGACAGC GGGTTGAATTCCTGGTGAATGCCTGGAAGTCGAAGAAGAACCCTATGGGC TTCGCATATGACACCCGCTGTTTTGACTCAACAGTCACTGAGAGTGACATC CGCGTTGAGGAGTCAATCTACCAATGTTGTGACTTGGCCCCCGAAGCCAA ACAGGCCATAAAGTCGCTCACAGAGCGGCTTTACATCGGGGGTCCCCTG ACTAATTCAAAAGGGCAGAACTGCGGCTATCGCCGGTGCCGCGCCAGCG GCGTACTGACGACCAGCTGTGGTAATACCCTCACATGTTACTTGAAAGCC TCTGCGGCCTGTCGAGCTGCAAAGCTCCAGGACTGCACGATGCTCGTGT GCGGAGACGACCTTGTCGTTATCTGTGAGAGCGCGGGAACCCAGGAGGA CGGGGCGAGCCTACGAGTCTTCACGGAGGCTATGACTAGGTACTCCGGC CCCCCCGGGGACCCGCCCCAGCCAGAGTACGACTTGGAGTTGATAACAT CATGCTCCTCCAACGTGTCGGTCGCGCACGATGCATCCGGCAAACGGGT GTATTACCTCACCCGTGACCCCACCACCCCCCTCGCGAGGGCTGCGTGG
imagen9
E09740083
11-09-2015
CGTGTTGAGGAGTCAATTTACCAATGCTGTGACTTGGCCCCCGAAGCCAA ACAGGCCATAAGGTCGCTCACAGAGCGGCTTTAYATCGGGGGTCCCCTG ACTAATTCAAAAGGGCAGAACTGCGGTTATCGCCGGTGCCGCGCGAGCG GCGTGCTGACGACCAGCTGCGGTAATACCCTCACCTGTTACTTGAAGGCC
5 ACCGCGGCCTGTCGAGCTGCAAAGCTCCAGGACTGCACGATGCTCGTGT GCGGGGACGACCTTGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGAACCCAAGAGGA CGCGGCGAACCTACGAGTCTTCACGGAGGCTATGACTAGGTATTCTGGCC CCCCCGGGGACCCGCCCCAACCAGAATACGACTTGGARTTGATAACATCA TGCTCCTCCAACGTGTCGGTCGCGCACGATGCATCTGGCAAGCGGGTGT AYTACCTCACCCGCGACCCCACCACCCCCCTYGCACGGGCTGCGTGGGA RACAGCTAGACACACTCCAGTTAACTCCTGGCTAGGCAACATTATCATGTA TGCGCCCACCTTATGGGCAAGGATGATCCTGATGACTCACTTCTTCTCCAT CCTTCTAGCTCAGGAAGAACTTGAAAAAGCCCTGGATTGYCAAATCTACG GGGCCTGTTACTCCATTGAGCCACTTGACGTACCTCAGATCATTCAGGGA
15 CTCCATGGCCTTAGCGCATTTTCACTCCACAGTTACTCTCCAGGTGAGATC AATAGGGTGGCTTCATGCCTCAGGAAACTTGGGGTACCACCCTTGCGAGT CTGGAGACATCGGGCCAGAAGTGTCCGCGCTAAGCTACTGTGCCAGGGA GGGAGGGCCGCCACTTGTGGCAGGTACCTCTTCAATTGGGCAGTAAGGA CCAAGCTTAAACTCACTCCAATCCCGGCTGCGTCCCAGTTGGACTTGTCC GGCTGGTTCGTTGCTGGGTACAGCGGGGGAGACATATATCACAGCCTGT CTCGTGCCCGACCCCGCTGGTTCCTGTGGTGCCTACTCCTACTTTCTGTA GGGGTAGGCATCTACCTGCTCCCCAACCGATGA
>NS5B Pt15
25 TCGATGTCCTAYACATGGACAGGCGCCCTGATCACGCCATGCGCCGCGG ARGAAAGCAAGCTGCCCATCAATGCGTTGAGCAACTCTTTGCTGCGTCAC GATAAYATGGTCTACGCCACAACATCCCGCAGCGCAAGCCAGCGGCAGA AGAAGGTCACCTTTGAGAGACTGCAGGTCCTGGACGACCACTACCGGGA CGTGCTTAAGGAGATGAAGGCGAAGGCGTCCACAGTTAAGGCTAGACTTC TATCYGTAGAAGAAGCCTGCAAGCTGACGCCCCCACACTCAGCCAGATCC AAATTTGGCTATGGGGCGAAGGACGTCCGGAACCTATCTAGCAAGGCCGT TAACCACATCCGCTCCGTGTGGAAGGACTTGCTGGAAGACACTGAAACAC CAATCGACGCTACCATCATGGCAAAAAATGAGGTTTTCTGCGTCCAACCA GAGAAAGGAGGTCGCAAGCCRGCTCGCCTTATCGTGTTCCCAGATTTGG
35 GAGTCCGTGTGTGCGAGAAAATGGCCCTTTACGACGTGGTCTCCACCCTT CCTCAGGCCGTGATGGGCCCCTCATACGGATTCCAATACTCTCCTGGACA GCGGGTCGAGTTCCTGGTGAATGCGTGGAAATCAAAGAAAAACCCTATGG GCTTCTCATATGACACCCGCTGYTTTGACTCTACGGTCACYGAGAGYGAC ATCCGTACTGAGGAGTCAATTTACCAATGTTGTGACTTGGCCCCCGAAGC CAGACAGGTTATAAGGTCGCTCACAGAGCGGCTTTATATCGGGGGTCCTY TGACTAATTCAAAAGGGCAGAACTGCGGCTATCGCCGGTGTCGCGCAAG CGGCGTGCTGACGACCAGCTGCGGCAATACCCTCACATGTTACCTGAAG GCCACTGCAGCCTGTCGAGCTGCGAAGCTCCAGGACTGCACAATGCTTG TGTGTGGGGACGACCTTGTCGTYATCTGTGAGAGCGCGGGGACCCAAGA
45 GGACGCAGCGAGCCTACGAGTCTTCACGGAGGCTATGACTAGGTACTCT GCTCCCCCCGGGGACCCGCCCCGGCCGGAATACGACTTGGARTTAATAA CATCATGCTCCTCCAACGTGTCGGTCGCGCACGACGCACAYGGCAAAAG GGTGTACTACCTCACCCGTGACCCCACCACCCCCCTTGCGCGGGCYGCA TGGGAGACAGCTAGACACACTCCAGTCAACTCCTGGCTAGGCAACATCAT CATGTATGCGCCCACCTTGTGGGCAAGGATGATYCTGATGACYCATTTCTT CTCCATCCTTCTAGCCCAGGAGCAACTTGAAAAAGCCCTAGATTGTCAGAT CTACGGGGCCTGTTACTCCATTGAGCCACTTGACCTACCTCAGATCATTCA GCGACTCCATGGTCTTAGCGCATTTTCACTCCACAGTTACTCTCCAGGTGA GATCAATAGGGTGGCTTCATGCCTCAGGAAACTTGGGGTACCACCCCTGC
55 GAGTCTGGAGACATCGGGCCAGAAGTGTCCGCGCTAAGCTGCTGTCCCG GGGGGGGAGGGCTGCCACTTGTGGCAAGTACCTCTTCAACTGGGCRGTA AGGACCAAGCTCAAACTCACTCCAATCCCGGCTGCGTTCAAGCTGGACTT GTCCGGCTGGTTCGTTGCTGGTTACAGCGGGGGAGACATATATCACAGC CTGTCTCGTGCCCGACCCCGCTGGTTYRTGTGGTGCCTACTCCTACTTTC TGTAGGGGTAGGCATCTACCTGCTCCCCAACCGATGA
>NS5B Pt16 TCGATGTCCTACACATGGACAGGCGCCTTGATCACACCGTGCGCTGCGG ARGAGAGCAAGCTGCCCATCAAYGCGCTGAGCAAGTCTTTGYTGCGYCAC
65 CATAACATGRTCTATGCCACAACATCCCGCAGCGCYAGCCAAMGGCAGAR GAAGGTCACTTTTGAYAGACTGCARGTCCTGGACGACCACTACCGGGACG
5
10
15
20
25
30
35
E09740083
11-09-2015
TGCTYAAGGAGATGAAGGCGAAGGCGTCCACAGTCAAGGCTAAACTTCTA TCCGTAGARGAAGCCTGYAAGCTGACRCCCCCACACTCGGCCAGATCYAA ATTTGGCTATGGGGCAAAGGACGTCCGGAACCTATCCAGCAAGGCCGTTA ACCACATCCACTGCGTGTGGAAGGACTTGCTGGAAGACACTGACACACCA ATTGACACCACCATCATGGCAAAAAATGAGGTTTTCTGYATCCAACCAGAG AAAGGAGGCCGCAAGCCAGCTCGCCTTATCGTRTACCCAGACCTGGGGG TCCGRGTGTGCGAGAAGATGGCTCTTTAYGATGTGGTCTCCACYCTTCCT CAGGCCGTGATGGGCCCCTCRTACGGATTTCAGTACTCTCCTGGACAGC GGGTTGAGTTCCTGGTGAAWGCCTGGAARTCAAAGAAATGGCCTATGGG CTTCGCRTATGACACCCGCTGCTTYGACTCRACGGTCACTGAGAATGACA TYCGTGTTGAGGAGTCAATTTACCAATGTTGTGACTTGGCYCCCGAAGCC AGACAGGYCATAAGGTCGCTCACAGAGCGGCTTTAYATCGGGGGTCCYCT AACCAATTCAAAAGGGCAAAACTGCGGTTATCGCCGGTGTCGCGCRAGC GGCGTGCTGACGACTAGCTGCGGCAAYACCCTTACATGTTACTTGAARGC CTCTGCRGCCTGTCGAGCTGCGAAGCTCCAGGACTGCACGATGOTCGTG TGCGGAGACGACCTCGTCGTTATCTGTGAGAGCGCGGGGACCCACGAGG ATGCGGCGAGCCTACGAGTCTTYACGGAGGCTATGACTAGGTACTCCGG CCCCCCYGGGGACCCGCCTCAGCCAGAATACGACTTAGAGCTGATAACAT CATGCTCTTCCAAYGTGTCRGTCGCGCACGATGCATCYGGCAAAAGGGTR TACTACCTCACCCGTGACCCCACCACCCCCCTTGCRCGGGCTGCGTQGG ARACAGCTAGACACACTCCAGTYAACTCCTGGCTAGGCAACATCATCATG TAYGCGCCCACCYTATGGGCAAGGATGATCCTGATGACTCATTTCTTGtCC ATCCTTCTAGCTCAGGAGCAACTTGAAAAAGCCCTAGATTGTCAGATCTAY GGGGCCTGTTACTCCATTGAACCACTTGACCTACCTCAAATCATTCARGGA CTCCATGGTATTAGCGCGTTTTCACTCCAYAGTTACTCTCCAGGWGAGAT CAATAGGGTGGCTTCATGCCTCAGGAAACTTGGGGTACCRCCCTTGCGAG TCTGGAGACATCGGGCCAGGAGTGTCCGCGCTAAGYTACTGTCCCAGGG GGGGAGGGCTGCCACTTGTGGCAARTACCTCTTCAACTGGGCAGTAARAA CCAAGCTTAATCTCACTCCAATTCCGGCTGCGTCCAAGCTGGATTTATCCR GCTGGTTGGTTGCCGGYTACAGCGGGGGAGACATATATCACAGCGTGTCT CMTGCCCGACCCCGCTGGTTCATGTGGTGCCTRCTGCTACTKTCTGTAGG RGTAGGCATCTACCTGCTYCCCAACCGATGA
D. Alineación de secuencias con la secuencia de referencia
La alineación muestra la secuencia de nucleótidos del dominio polimerasa NS5B de un aislado de HCV-1b de un paciente no tratado. La secuencia se alineación frente a una secuencia de referencia. Las homologías entre las dos secuencias se representan como puntos.
imagen10
imagen11
imagen12
5
15
25
35
45
55
65
E09740083
11-09-2015
Ejemplo 6
Ensayo de fenotipado de NS5B
Construcción de estructura delta[NS5B]
El plásmido 11pFK I341 PI luc NS3-3'_ET se basa en la construcción descrita en Krieger et al. 2001 y la proporcionó amablemente el Prof. Bartenschlager (Heidelberg, Alemania). Para generar un vector lanzadera, se modificó por mutagénesis dirigida al sitio para introducir dos sitios de restricción AfIII en la posición 7481 y 9287. Primero, se introdujo un sitio de restricción Aflll por mutagénesis dirigida al sitio en el 3' NCR directamente después del codón de parada de NS5B en Medigenomix (Múnich, Alemania) produciendo el plásmido pFKi341 luc_NS3-3'-ET-AfIII (SEC ID Nº 17). A continuación, se introdujo un segundo sitio de restricción AfIII 8 aa cadena arriba del sitio de escisión de NS5A/NS5B usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick Change (Stratagene La Jolla, CA, EEUU) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con el par de cebadores SDM AfIII-5A-fwd (5'accgtaagcgaggagcttaaggctagtgaggacgtc-3') (SEC ID Nº 18) y AfIII-5A-rev (5'-gacgtcctcactagccttaagctcctcgcttacggt3') (SEC ID Nº 19) produciendo el plásmido pFKi341 luc_NS3-3'-ET-2xAfIII (SEC ID Nº 20). En una siguiente etapa, el plásmido modificado se digirió con AfIII y posteriormente se religó produciendo la estructura delta[NS5B] pFK_I341_PI_NS3-3_ET_dNS5a/b_5a440-5b591-ScaI (SEC ID Nº 21).
En paralelo, se generó una construcción de fenotipado de NS5B con un sitio de restricción Xbal en el extremo 3' usando el plásmido pFKi341 luc_NS3-3'-ET-2xAfIII (SEC ID Nº 20) como molde. Primero, se mutó un sitio Xbal en el gen de la luciferasa de luciérnaga mediante un enfoque de mutagénesis dirigida al sitio, produciendo una mutación silenciosa, usando el par de cebadores Xbal-mut-fwd (5'-ggcgccattctatccactagaggatggaacc-3') (SEC ID Nº 22) y Xbal-mut-rev (5'-ggttccatcctctagtggatagaatggcgcc-3') (SEC ID Nº 23). En una segunda reacción SDM, se introdujo un sitio de restricción Xbal en el extremo 3' del 3' NCR de HCV en lugar del sitio ScaI usando el par de cebadores XbaIadd-fwd (5'-gagtgctgatactggcctctctgcagatcaagtctagaaagtccctttagtgagggttaattc-3') (SEC ID Nº 24) y Xbal-add-rev (5'gaattaaccctcactaaagggactttctagacttgatctgcagagaggccagtatcagcactc-3') (SEC ID Nº 25) produciendo el plásmido pFKi341 luc_NS3-3'-ET-2xAfIII-Xbal (SEC ID Nº 26). En una siguiente etapa, el plásmido modificado se digirió con AfIII y posteriormente se religó produciendo la estructura delta[NS5B] pFK_I341_PI_NS3-3_ET_dNS5a/b_5a4405b591-Xbal (SEC ID Nº 27).
La linealización con Xbal produce un extremo 3' de HCV auténtico y ofreció la posibilidad de amplicones lanzadera de aislados clínicos que albergan un sitio ScaI en la secuencia codificante de NS5B.
Para la clonación por InFusion, se linealizó la estructura delta[NS5B] pFK_I341_PI_NS3-3_ET_dNS5a/b_5a4405b591-Scal (SEC ID Nº 21) o pFK_I341_PI_NS3-3_ET_dNS5a/b_5a440-5b591-Xbal (SEC ID Nº 27) por digestión con AfIII.
Ejemplo 7
Clonación de los amplicones de PCR de NS5B de pacientes infectados con HCV en el vector lanzadera delta [NS5B]
A. Generación de amplicón de NS5B a partir de aislados de pacientes infectados con HCV
Para la PCR InFusion™, se mezcló 1 l del producto de RT-PCR de una etapa del ensayo de genotipado de NS5B con cebador 1b_NS5B_F_AfIII-lnfusion (5'-AAGCGAGGAGCTTAAGGCYRGTGAGGACGT-3') (SEC ID Nº 28) 0,2 M, cebador 1b_NS5B_R_AfIII-lnfusion (5'-AGCTCCCCGTCTTAAGTCAYCGGTTGGGG-3') (SEC ID Nº 29) 0,2 M y mezcla maestra Herculase™ Hotstart (Stratagene La Jolla, CA, EEUU) 2x para dar un volumen total de 50 l. La desnaturalización inicial fue a 95ºC durante 2 min y el ciclado térmico consistió en 10 ciclos seguidos de otros 20 ciclos que consistían en desnaturalización a 95ºC durante 30 s, hibridación a 60ºC durante 30 s y elongación a 72ºC durante 1 min 30 s (más 10 s por ciclo). La extensión final tuvo lugar a 72ºC durante 10 min. Los amplicones se purificaron usando el kit de purificación de gel QIAQuick (Qiagen, Hilden, Alemania). El volumen final de los amplicones purificados fue 30 l.
B. Preparación de vector lanzadera delta [NS5B]
Se digirió la estructura lanzadera subgenómica de NS5B con un exceso de la endonucleasa de restricción AflIII (NEB) y tampón 4 de enzima de restricción (NEB) 1x a 37ºC durante una noche. En una siguiente etapa, se añadió fosfatasa intestinal de ternera y la mezcla se incubó durante 1 h a 37ºC para desfosforilar la estructura lanzadera linealizada. El vector desfosforilado se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa (violeta cristal) seguido de extracción del gel usando el kit de QIAGEN. El vector linealizado se almacenó a -20ºC hasta su uso adicional.
C. Clonación de NS5B derivado de aislados de pacientes en el vector lanzadera delta [NS5B] linealizado
Los productos de PCR y el vector linealizado se descongelaron y el producto de PCR se almacenó en hielo hasta la clonación. Inmediatamente antes de la clonación por In-Fusion™, el vector linealizado se desnaturalizó durante 5
imagen13
E09740083
11-09-2015
adición de compuestos. Los resultados de estudios que ensayan el efecto inhibidor de un inhibidor de polimerasa ejemplar, ácido tiofene-2-carboxílico, sobre la replicación de replicón WT y replicones con secuencias NS5B derivadas del paciente se muestran en la Tabla 4.
5 La Tabla 4 muestra los valores de CE50 de un inhibidor de polimerasa de HCV ensayado en el sistema lanzadera de replicón de NS5B con 5 aislados de pacientes.
Resultados:
10 Tabla 4: Valores de CE50 (formato de 384 pocillos)
Secuencia de NS5B
Ácido tiofeno-2-carboxílico CE50 [M]*
Rep PI-luc/ET (WT)
0,58
Aislado clínico Pt 12
0,28
Aislado clínico Pt 13
0,59
Aislado clínico Pt 14
1,0**
Aislado clínico Pt 15
0,63
Aislado clínico Pt 16
3,96
* Inhibición por ácido tiofeno-2-carboxílico de replicación transitoria de ARN del replicón de HCV que contiene NS5B de aislados clínicos de genotipo 1b insertado en el vector lanzadera pFK Pl-luc delta[NS5B]_ET; valor medio de CE50 de al menos n=2 experimentos. ** medido una vez
Tabla 5
SEC ID Nº
Nombre de cebador Secuencia (5' a 3') Observación Amplificación/ Secuenciación
1
NS5Bsubtype_A TGGGGTTCGCGTA TGATACCCGCTGC TTTGA ensayo de subtipado basado en secuencia de NS5B Amplificación
2
NS5Bsubtype_B TGGGGTTTTCTTA CGACACCAGGTG CTTTGA ensayo de subtipado basado en secuencia de NS5B Amplificación
3
NS5Bsubtype_C CCGTATGATACCC GCTGCTTTGACTC AAC ensayo de subtipado basado en secuencia de NS5B Amplificación y secuenciación
4
NS5Bsubtype_D TCCTACGACACCA GGTGCTTTGATTC AAC ensayo de subtipado basado en secuencia de NS5B Amplificación y secuenciación
5
NS5Bsubtype_E AATTCCTGGTCAT AGCCTCCGTGAA GACTC ensayo de subtipado basado en secuencia de NS5B Amplificación y secuenciación
6
1b_NS3_out_F GCGTGTGGGGAC ATCATCTTAGG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
7
1b_NS3_out_R GCTGCCAGTGGG AGCGTG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
8
1b_NS3_in_F TCATCTTAGGCCT GCCCGTCTC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
9
1b_NS3_in_R GGGAGCGTGTAG ATGGGCCAC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
10
pFK I341 PI luc deltaNS3 7-192 ET Secuencia plasmídica de estructura delta[NS3] Fenotipado de estructura lanzadera NA
11
1b_InFu_NS3_F ATGGCGCCTATTA CCGCCTACTCCCA ACAGACG Fenotipado de cebador de amplificación Amplificación
12
1b_InFu_NS3_R AATGTCTGCGGTA CCGCCGGGGGGG ATGAGTTGTC Fenotipado de cebador de amplificación Amplificación
13
1b_NS5B_out_F TAGAGTCCTGGA AGGACCCGG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación
14
1b_NS5B_out_R GGCCTGGAGTGG TTAGCTCCCC Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación
E09740083
11-09-2015 E09740083
SEC ID Nº
Nombre de cebador Secuencia (5' a 3') Observación Amplificación/ Secuenciación
15
1b_NS5B_in_F TGGAAGGACCCG GACTACG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación y secuenciación
16
1b_NS5B_in_R GAGTGGTTAGCTC CCCGTTCA Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación y secuenciación
17
pFKi341 luc NS 3-3'-ET-AflII plásmido con 1er sitio AfIII (plásmido intermedio) Fenotipado de estructura lanzadera NA
18
AflII-5A-fwd (5'-accgtaagcgaggag cttaaggctagtgaggacgtc -3') cebador SDM Fenotipado para clonación
19
AflII-5A-rev (5'-gacgtcctcactagcctt aagctcctcgcttacggt-3' cebador SDM Fenotipado para clonación
20
pFKi341 luc NS 3-3'-ET-2xAflII plásmido con 2o sitio AfIII (plásmido intermedio) Fenotipado de estructura lanzadera NA
21
pFK_I341 PI NS 3-3 ET dNS5A/b_5a4405b591-Scal Secuencia plasmídica de estrcutura delta[NS5B] ScaI Fenotipado de estructura lanzadera NA
22
Xbal-mut-fwd (5'-ggcgccattctatccac tagaggatggaacc-3') cebador SDM Fenotipado para clonación
23
Xbal-mut-rev (5'-ggttccatcctctagtg gatagaatggcgcc-3') cebador SDM Fenotipado para clonación
24
Xbal-add-fwd (5'-gagtgctgatactggcc tctctgcagatcaagtctaga aagtccctttagtgagggtta attc-3') Fenotipado para clonación
25
Xbal-add-rev (5-gaattaaccctcactaaa gggactttctagacttgatctg cagagaggccagtatcagc actc-3') Fenotipado para clonación
26
pFKi341 luc NS 3-3'ET-2xAfl II-Xbal Plásmido intermedio Fenotipado de estructura lanzadera NA
27
pFK_I341 PI NS 3-3_ET dNS5A/b_5a4405b591-Xbal Secuencia plasmídica de estructura delta[NS5B] XbaI Fenotipado de estructura lanzadera NA
28
1b_NS5B_F_AflI I-Infusion AAGCGAGGAGCT TAAGGCYRGTGA GGACGT Fenotipado de cebador de amplificación Amplificación
29
1b_NS5B_R_AflI I-Infusion AGCTCCCCGTCTT AAGTCAYCGGTT GGGG Fenotipado de cebador de amplificación Amplificación
30
1a_NS3/4A_out_R GGGACCTCACCG CTCATGAT Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
31
1a_NS3/4A_in_R CTCACCGCTCATG ATCTTGAATGC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
32
1a_NS3/4A_out_F CGGAGGTCATTA CGTGCAAATG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
33
1a_NS3/4A_in_F CGTGCAAATGGC CATCATCAAG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
34
1a_NS2_F1sb GCGCTTACTGGCA CCTATG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
35
1a_NS3_F1s AGGCACGCCGAT GTCAT Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
36
1a_NS3_R2s CGGGACCTTGGT GCTCTT Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
37
1a_NS3_F2s CGGCACTGTCCTT GACCA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
38
1a_NS3_R3s GAGTCGAAGTCG CCGGTA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
39
1a_NS3_F3s CC GAGACTACAG TTAGGCTACG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
11-09-2015 E09740083
SEC ID Nº
Nombre de cebador Secuencia (5' a 3') Observación Amplificación/ Secuenciación
40
1a_NS3_R4s GCATGTCATGATG TATTTGGTG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
41
1a_NS4B_R1s ACGAGGACCTTC CCCAGT Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) y NS4B/5A Secuenciación
42
1a_NS3_out_R GCTGCCGGTGGG AGCATG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
43
1a_NS3_in_R GAGCATGCAGGT GGGCCAC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
44
1a_NS3_out_F GCGGCGACATCA TCAACGG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
45
1a_NS3_in_F CATCAACGGCTTG CCCGTCTC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
46
1a_NS3_Fs_BU GACCTTTACCTGG TCACGAG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Secuenciación
47
1a_NS4B/5A_out_R GCTGTCCAGAACT TGCAGTCTGTC Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación
48
1a_NS4B/5A_in_R CCTTTGGCAAGCA CTGCGTG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación
49
1a_NS4B/5A_out_F CTGCGTGGTCATA GTGGGCAG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación
50
1a_NS4B/5A_in_F TGTCTTGTCCGGG AAGCCGG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación
51
1a_NS4B_F2s CGTCACTGCCATA CTCAGCA Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
52
1a_NS5A_R1s CGTCCCGTTTTTG ACATG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
53
1a_NS5A_R2s TGACTCAACCCTG GTGATGTT Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
54
1a_NS5A_F2s CGGTGGTCCTCAC CGAA Ensayo de genotipado de NS4B/5A y polimerasa (NS5B) Secuenciación
55
1a_NS4A_F1s TTGTCCGGGAAGCCG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
56
1a_NS5B_R1s TGGCAAGCACTGCGTG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
57
1a_NS5A_F1s TTGACGTCCATGC TCACTG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
58
1a_NS5B_out_R AGGCC GGAGTGT TTACCCCAAC Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación
59
1a_NS5B_in_R GGAGTGTTTACCC CAACCTTCA Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación y secuenciación
60
1a_NS5B_out_F TGACTATGAACC ACCTGTGGTCC Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación
61
1a_NS5B_in_F CACCTGTGGTCCA TGGCTG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación y secuenciación
62
1a_NS5B_F1s CATCAACTCCGTG TGGAAAG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
63
1a_NS5B_R1s CAGCGGGTATGA TAGGAGAA Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
64
1a_NS5B_F2s GCACCATGCTCGT GTGTG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
65
1a_NS5B_R2s GTCATCAGTATCA TCCTCGCC Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
66
1a_NS5B_F3s CGACTC CATGGTC TTAGCG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
11-09-2015 E09740083
SEC ID Nº
Nombre de cebador Secuencia (5' a 3') Observación Amplificación/ Secuenciación
67
1b NS3/4A out R GAGCGCCTTCTGT TTGAATTG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
68
1b_NS3/4A_in_R CTGTTTGAATTGC TCGGCGAG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación y secuenciación
69
1b_NS3/4A_out_F ATGCATGCTGGTG CGGAA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
70
1b_NS3/4A_in_F TGGTGCGGAAAG TCGCTGG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
71
1b_NS2_F1s GGTCATTATGTCC AAATGGC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
72
1b_NS3_F1s CGGCAGCTCGGA CCTTTA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
73
1b_NS3_R2s CACTTGGAATGTC TGCGGTAC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
74
1b_NS3_F2s GATGAGTGCCAC TCAACTGACT Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
75
1b_NS3_R3s CGTCTGTTGCCAC GACAA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
76
1b_NS3_F3s CTATGACGCGGG CTGTG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
77
1b_NS3_R4s AGCCGTATGAGA CACTTCCAC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
78
1b_NS4B/5A_out_R GCATAGACCATG TTGTGGTGACG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación
79
1b_NS4B/5A_in_R GTGACGCAGCAA AGAGTTGCTCA Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación y secuenciación
80
1b_NS4B/5A_out_F AGCGTGGTCATTG TGGGCAG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación
81
1b_NS4B/5A_in_F GGGC AGG ATC AT CTTGTGCGG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación y secuenciación
82
1b_NS4B_R1s TTCCCAAGGCCTA TGCTG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
83
1b_NS4B_F2s GGATGAACCGGC TGATAGC Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
84
1b_NS5A_R1s ATGGAACCGTTTT TGACATGT Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
85
1b_NS5A_F1s GGGCATGACCAC TGACAAC Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
86
1b_NS5A_R2s CCACAGGAGGTT GGCCT Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
87
1b_NS5A_F2s CACGGGTGCCCA TTGC Ensayo de genotipado de NS4B/5A y polimerasa (NS5B) Secuenciación
88
1b_NS5B_F1s AAGGAGATGAAG GCGAAGG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
89
1b_NS5B_R1s CATCACGGCCTG AGGAAG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
90
1b_NS5B_F2s TCGCTCACAGAG CGGCT Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
91
1b_NS5B_R2s TGGAGGAGCATG ATGTTATCA Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
92
1b_NS5B_F3s CGACTCCATGGTC TTAGCG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
93
2a_NS3/4A in_F GTAGGTGGACTG GCACTTACATCTA TGA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
94
2a_NS3/4A out_F CGCTATTAGCCCT TGGTAGGTGG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
95
2a_NS3/4A in_R AAATGCCCGCAC CATACCC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación y secuenciación
11-09-2015 E09740083
SEC ID Nº
Nombre de cebador Secuencia (5' a 3') Observación Amplificación/ Secuenciación
96
2a_NS3/4A out_R GGCTTCTCGCCAG ACATGATCTT Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
97
2a_NS2_F2sb CACGGACTTCCCG TGTC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
98
2a_NS3_R1sb TGCCAGTTGGGG CATG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
99
2a_NS3_F1s TCCGGGCAGCTGT GTG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
100
2a_NS3_R2s CGTCTTGAGGGA CAGTCTGTG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
101
2a_NS3_F2s GGAGGGTGAGAT CCCCTTCTA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
102
2a_NS4B_R1s GAAGTTCCACAT GTGTTTGGC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
103
2a_NS3_F3s GTAGTGCTCTGTG AGTGCTACG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
104
2a_NS3_in_F ATCTTAGACGGAC TCCCCGTGTC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
105
2a_NS3_out_F ATGCGGGGACAT CTTACACGG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
106
2a_NS3_in_R TGGGGCATGCAA GTACCCGAC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
107
2a_NS3_out_R CACTGCCAGTTGG GGCATG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
108
2b_NS3/4A_in_F TACGGATACCAT AGTTTGTGAGGGC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
109
2b NS3/4A out F TCTCTGCT AC GG A TACCATACTTTG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
110
2b_NS3/4A_in_R TCCACCAGTATCT TACCCAGGCCTA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
111
2b NS3/4A_out_R ACGTCCACCAGT ATCTTACCCA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
112
2b_NS2_F1s ACGAGTGTGTAC CCTGGTGA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
113
2b_NS3_F1s GACCCCTGTACCT GCGG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
114
2b_NS3_R2s GCAAGTAGCCCA CCTGGTAAG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
115
2b_NS3_F2s GCCATTCAGTGG ACGCCAC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
116
2b_NS3_R3s CCTTGAGTTGGTA TAACGGAGAC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
117
2b_NS3_F3s GCTCTGTGAGTGC TATGATGC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
118
2b_NS3_R4s GGTAGGACCAGT CAGTGTAGGTTT Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
119
2b_NS4B_R1s CAACGAAGCCAG TGGCTC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
120
2b_NS3_in_F TGCATGGCCTCCC GGTTTC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
121
2b_NS3_out_F CATGTGGAGACA TCCTGCATGG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
122
2b_NS3_in_R TTGGTGCATGCAA GTAGCCCAC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
11-09-2015 E09740083
SEC ID Nº
Nombre de cebador Secuencia (5' a 3') Observación Amplificación/ Secuenciación
123
2b_NS3_out_R CGCTGCCTGTTGG TGCATG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
124
2b_NS5B_in_F CTTCTGTACCATC AGAGTACCTGAT CA Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación y secuenciación
125
2b_NS5B_out_F GTGAGCCTTCTGT ACCATCAGAGTA C Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación
126
2b_NS5B_out_R ATGGAGTGTAGC TAGGGTTTGCC Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación
127
2b_NS5B_R_in TGTAGCTAGGGTT TGCCGCTCTA Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación y secuenciación
128
2b_NS5A_F2s GAACCACCCACT GTCCTAGG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
129
2b_NS5B_F1s GCACACTATGACT CAGTCTTGCA Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
130
2b_NS5B_R1s CATCTTTTCGCAC ACCCTG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
131
2b_NS5B_F2s TAG GTAGG AGGG CCCATG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
132
2b_NS5B_R2s AGCGCTACCGAT ACGTTTG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
133
2b_NS5B_F3s CCGGGCATAATTG AAAGG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
134
3a_NS3/4A_in_F ATGCTCGTGCGCT CCGTGAT Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación '
135
3a NS3/4A_out F CTTTGCATGCTCG TGCGCTC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
136
3a_NS3/4A_in_R TACTATGGGCTCA ATGACAGC TTGTT G Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación y secuenciación
137
3a NS3/4A_out_R GGTAGCTACTATG GGCTCAATGACA GC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
138
3a_NS2_F1s TACTTCCAGATGA TCATACTGAGC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
139
3a_NS3_F1s ACTTATACTTGGT TACGCGCG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
140
3a_NS3_R2s TCTTACCGCTGCC GGTC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
141
3a_NS3_F2s TCTTAGATCAGGC TGAGACGG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
142
3a_NS3_R3s CTGTTGTTGGTAT GACGGACA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
143
3a_NS3_F3s AGCCCGCTGAGA CCACA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
144
3a_NS3_R4s ATGTAGTGTTGGC TTAAGCCG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
145
3a_NS3_out_R CTGCCGGTCGGG GCATG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
146
3a_NS3_in_R GGTCGGGGCATG AAGGTATCCTAC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
147
3a_NS3_out_F CTTGCGGAGATAT TCTTTGCGG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
148
3a_NS3_in_F TTGCGGGCTGCCC GTCTC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
11-09-2015 E09740083
SEC ID Nº
Nombre de cebador Secuencia (5' a 3') Observación Amplificación/ Secuenciación
149
3a NS4B/5A_out _R CGACGTTGAATA GACTAGGTTATG ATGTCT Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación
150
3a NS4B/5A_out_F CCCTAGCGGCCTA CTGCTTG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación
151
3a NS4B/5A_in_F GGCCTACTGCTTG TCAGTCGG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación
152
3a_NS4A_F1s GCCTACTGCTTGT CAGTCGG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
153
3a_NS4B_R1s ATACCCCCTATGG CAGCG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
154
3a_NS4B_F2s ACAGTGGATGAA CAGGCTCAT Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
155
3a_NS5A_R1s TGACAGGAAATG AAGGGCAG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
156
3a_NS5A_Fls TGAAGTGGATGG GGTGAGA Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
157
3a_NS5A_R2s TGAGGCCTATGC GTCTGG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
158
3a_NS5A_F2s CACCAACTGTCG ATGGATG Ensayo de genotipado de NS4B/5A y polimerasa (NS5B) Secuenciación
159
3a NS4B/5A_in_R TTATGATGTCTCA ACAAGGAGTTGC TGA Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación y secuenciación
160
3a_NS5B_out_R AGTGTTATCTTAC CAGCTCACCGAG C Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación
161
3a_NS5B_in_R ATCTTACCAGCTC ACCGAGCTGGC Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación y secuenciación
162
3a_NS5B_out_F GTATCCTCCAGCC CTTCCTATCTG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación
163
3a_NS5B_in_F CAGCCCTTCCTAT CTGGGCTAG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación y secuenciación
164
3a_NS5B_F1s TCGGGTATAGTGC GAAGGA Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
165
3a_NS5B_R1s CTTCAGCAGACGT TCGACC Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
166
3a_NS5B_F2s TACATCAAGGCC ACAGCG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
167
3a_NS5B_R2s CTGGAGTGTGAC GAGCTGTT Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
168
3a_NS5B_F3s CTTGGAGACATC GGGCAC Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
169
4a/d NS3/4A_in_F GCGCGTCCCTTAC TTCGTGAG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
170
4a/d NS3/4A_out_F GCTCCTGCGCGTC CCTTAC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
171
4a/d NS3/4A_in_R GTAGCCAGCGAG GATGTCCACTAG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación y secuenciación
172
4a/d NS3/4A_out_R CATCTCGCCGCTC ATGATCTT Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Amplificación
173
4a/d_NS2_F1s GCGTCC CTTACTT CGTGAG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
174
4a/d_NS3_F1s CCGTGCGCAGGA GAGG Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
175
4a/d_NS3_F2s C AC GGTCTTGG AC CAAGC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
176
4a/d_NS3_F3s GCCTGGTACGAA CTGACACC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
177
4a/d_NS3_R2s GCCACTTCCTGTT GGTGC Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
11-09-2015
SEC ID Nº
Nombre de cebador Secuencia (5' a 3') Observación Amplificación/ Secuenciación
178
4a/d_NS3_R3s CTGAGTCAAAGT CGCCGGT Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
179
4a/d_NS3_R4s GACATGCAGGCC ATGATGTA Ensayo de genotipado de proteasa (NS3/4A) Secuenciación
180
4a/d_NS3_in_F TAAGGGGATTAC CTGTCTCGGC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
181
4a/d_NS3_out_F AGTTGTGTTCACG CCCATGGAG 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
182
4a/d_NS3_in_R GGGACTTTGGTGC TCTTGCC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación y secuenciación
183
4a/d_NS3_out_R TCGATGCCATATG CCTTGGAC 181 aa N-terminales del ensayo de genotipado de NS3 Amplificación
184
4a/d_NS4B/5A_out_F TTTCAGTGGGCAG CGTGGT Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación
185
4a/d NS4B/5A_in_F AGCGTGGTGATC GTCGGGAG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación y secuenciación
186
4a/d_NS4B/5A_out_R CCTGCAGGCGGT CGAAGG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación
187
4a/d NS4B/5A_in_R CGAAGGTCACCTT CTTCTGCCG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Amplificación y secuenciación
188
4a/d_NS4B_R1s AGACATGAGGGA AGCAATGG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
189
4a/d_NS4B_F1sb TGTGCAGTGGAT GAACCG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
190
4a/d_NS5A_R1s ACTCTGCGAACCT CCACG Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
191
4a/d_NS5A_F1s GTTGACAGACCC ATCACACAT Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
192
4a/d_NS5A_R2s TCGTCTGTCTCAA CCCTGGT Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
193
4a/d_NS5A_F2sb TCTTACTCGTCAA TGCCTCC Ensayo de genotipado de NS4B/5A Secuenciación
194
4a/d NS5B_out_F CGGGGTAACACA AGATAACATCAA G Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación
195
4a/d NS5B_out_R ACCCTAAGGTCG GAGTGTTAAGCT Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación
196
4a/d_NS5B_in_F ACAAGATAACAT CAAGTGCCCCTG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación
197
4a/d_NS5B_in_R AAGGTCGGAGTG TTAAGCTGCCTA Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Amplificación y secuenciación
198
4a/d_NS5A_F2sc CTTATTCGTCAAT GCCTCCAC Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
199
4a/d_NS5B_F1s ATCATGGCCAAA AATGAGGT Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
200
4a/d_NS5B_F2s GCCTTCACGGAG GCTATGAC Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
201
4a/d_NS5B_F3bs TGTGGCATATACC TCTTTAACTGG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
202
4a/d_NS5B_R2s GGAGTCAAAGCA GCGGG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
203
4a/d_NS5B_R3s CAGGAATTGACT GGAGTGTGTC Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación
204
4a/d_NS5B_R4s GCACAGGAGTAA ATAGCGGG Ensayo de genotipado de polimerasa (NS5B) Secuenciación

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES09740083.2T 2008-10-06 2009-10-06 Método para determinar mutaciones de resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6 Active ES2546190T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08165949 2008-10-06
EP08165949 2008-10-06
PCT/EP2009/062986 WO2010040756A1 (en) 2008-10-06 2009-10-06 Method for determining drug resistance mutations in any of the non-structural protein regions ns3 to ns5b of hepatitis c virus (hcv) for genotypes 1 to 6

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2546190T3 true ES2546190T3 (es) 2015-09-21

Family

ID=40289304

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09740083.2T Active ES2546190T3 (es) 2008-10-06 2009-10-06 Método para determinar mutaciones de resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8945833B2 (es)
EP (1) EP2342363B1 (es)
AU (1) AU2009301125B2 (es)
CA (1) CA2739532A1 (es)
ES (1) ES2546190T3 (es)
WO (1) WO2010040756A1 (es)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2520021A (en) * 2013-11-06 2015-05-13 Vela Operations Pte Ltd HCV genotyping algorithm
US20160177407A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-23 Virco Bvba Method for determining drug resistance mutations in any of the non-structural protein regions ns3 to ns5b of hepatitis c virus (hcv) for genotypes 1 to 6
CN108018376B (zh) * 2016-10-31 2020-11-03 深圳华大因源医药科技有限公司 一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的探针和方法
CN106939360B (zh) * 2017-05-24 2018-04-20 贵州金域医学检验中心有限公司 HCV 2a亚型NS5B突变检测的PCR扩增引物、试剂盒及检测方法
KR101964697B1 (ko) * 2018-05-08 2019-04-05 대한민국 직접작용제에 내성을 나타내는 c형 간염 바이러스 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 직접작용제에 내성을 나타내는 c형 간염 바이러스 유전자의 검출방법
KR102207967B1 (ko) * 2019-03-15 2021-01-26 대한민국 직접작용제에 내성을 나타내는 c형 간염 바이러스 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 직접작용제에 내성을 나타내는 c형 간염 바이러스 유전자의 검출방법
CN112779343A (zh) * 2019-11-07 2021-05-11 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种病原微生物药敏检测方法
CN112961942B (zh) * 2021-03-31 2024-02-02 广州金域医学检验中心有限公司 用于检测HCV 2a亚型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用
CN113151595B (zh) * 2021-03-31 2024-02-06 广州金域医学检验中心有限公司 用于检测hcv 6型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用
CN113025756B (zh) * 2021-03-31 2024-02-06 广州金域医学检验中心有限公司 一种用于检测hcv 1型耐药突变基因的检测方法及应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE217971T1 (de) * 1996-01-26 2002-06-15 Virco Nv Verfahren zur überwachung der chemotherapie von hiv-positiven patienten basierend auf der phenotypischen medikamentempfindlichkeit vom hiv stamm des patienten
EP1605978B1 (en) * 2003-03-07 2010-09-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Therapeutic compositions
WO2005070957A1 (en) * 2004-01-09 2005-08-04 Merck & Co., Inc. Hcv rna-dependent rna polymerase
US7566812B2 (en) * 2004-08-27 2009-07-28 Tripep Ab Transgenic mouse models of hepatitis C virus (HCV) and identification of HCV therapeutics
EP1801116A1 (en) 2005-12-21 2007-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag HCV replicon shuttle vectors
WO2008002165A2 (en) 2006-06-30 2008-01-03 Krzysztof Kucharczyk A method, assay and kit for prediction and treatment of a human subject infected with a virus
EP2121990A2 (en) 2006-10-20 2009-11-25 Innogenetics N.V. Methodology for anaysis of sequence variations within the hcv ns5b genomic region
US20100173795A1 (en) 2006-11-17 2010-07-08 Yale University HIV and Hepatitis C Microarray to Detect Drug Resistance
US8338101B2 (en) * 2007-01-23 2012-12-25 Virco Bvba Method for designing a drug regime for HIV-infected patients

Also Published As

Publication number Publication date
CA2739532A1 (en) 2010-04-15
AU2009301125B2 (en) 2015-02-26
US20110189684A1 (en) 2011-08-04
WO2010040756A1 (en) 2010-04-15
EP2342363A1 (en) 2011-07-13
AU2009301125A1 (en) 2010-04-15
US8945833B2 (en) 2015-02-03
EP2342363B1 (en) 2015-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2546190T3 (es) Método para determinar mutaciones de resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6
Severini et al. Nested polymerase chain reaction for high-sensitivity detection of enteroviral RNA in biological samples
JP2005514005A5 (es)
KR20120101278A (ko) Ｃ형 간염 바이러스 핵산을 증폭시키는 방법
CA2365870A1 (en) Typing of human enteroviruses
KR20080082662A (ko) Ｈｃｖ의 유전자형을 결정하기 위한 방법 및 시약
Elahi et al. Determination of hepatitis C virus genotype by Pyrosequencing
EP2121991A2 (en) Methodology for analysis of sequence variations within the hcv ns3/4a genomic region
WO2010123058A1 (ja) 塩基変異判別用プローブセットおよび塩基変異の判別方法
AU2003218111B8 (en) Methods and compositions for identifying and characterizing hepatitis C
Feng et al. Quantitative determination of cucumber mosaic virus genome RNAs in virions by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction
JP2008136451A (ja) 核酸増幅法
ES2521018T3 (es) Método para la detección específica del virus de la peste porcina clásica
ATE486140T1 (de) Primer und sonden zum nachweis genitaler hpv- genotypen
Wierzchoslawski et al. Dissecting the requirement for subgenomic promoter sequences by RNA recombination of brome mosaic virus in vivo: evidence for functional separation of transcription and recombination
US20160177407A1 (en) Method for determining drug resistance mutations in any of the non-structural protein regions ns3 to ns5b of hepatitis c virus (hcv) for genotypes 1 to 6
US20210214810A1 (en) Reagents and Methods for Detecting HCV
KR20060017212A (ko) 코로나바이러스 검출용 프로브 조성물, 프라이머 혼합물및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법
KR101986188B1 (ko) Rna 의존성 rna 중합효소 활성 확인 방법 및 키트
US20060252040A1 (en) Strand specific detection and quantification
RU2815339C1 (ru) Набор олигонуклеотидов-праймеров, используемых для идентификации вируса болезни Ньюкасла
KR102207967B1 (ko) 직접작용제에 내성을 나타내는 c형 간염 바이러스 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 직접작용제에 내성을 나타내는 c형 간염 바이러스 유전자의 검출방법
Xu et al. Real-time quantitative assay of HCV RNA using the duplex scorpion primer
JP2007075052A (ja) 単一蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた核酸の検出法
JP2006325408A (ja) Ｃｙｐ２ｄ６遺伝子増幅用プライマー