JP2006325408A

JP2006325408A - Ｃｙｐ２ｄ６遺伝子増幅用プライマー

Info

Publication number: JP2006325408A
Application number: JP2005149311A
Authority: JP
Inventors: Shiyougo Moriya; 彰悟守屋
Original assignee: Nisshinbo Industries Inc; Nisshin Spinning Co Ltd
Current assignee: Nisshinbo Holdings Inc
Priority date: 2005-05-23
Filing date: 2005-05-23
Publication date: 2006-12-07

Abstract

【課題】薬物代謝活性との相関が問題となる、チトクロームＰ４５０ＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子多型の検査のために、特異的に増幅することのできるプライマーを提供する。
【解決手段】特定の配列番号で示される塩基配列のうちの、連続した１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いて、増幅反応を行う。
【選択図】なし

Description

本発明はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーに関する。

チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）分子種は薬物代謝に関与する酵素として近年研究が進められている。中でもＣＹＰ２Ｄ６はヒト肝臓での発現量が総Ｐ４５０含量の約５％と少ないものの、抗うつ薬、抗ヒスタミン薬等臨床上重要な多くの薬を特異的に代謝する酵素として知られている。

ＣＹＰ２Ｄ６は遺伝子多型と代謝活性の相関が研究されており、その遺伝子多型を調べることは研究上、臨床上大変意味がある。このＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子多型を調べる方法としては多型個所を含むようにプライマーを設計し、増幅の有無で多型を検出する方法、ＴａｑＭａｎ法やＤＮＡマイクロアレイ法のようにハイブリダイゼーションによって多型を検出する方法、制限酵素による切断の有無を用いて多型を検出する方法、シーケンス法が挙げられる。

しかしながら、ＣＹＰ２Ｄ６は配列の似通ったＣＹＰ２Ｄ７、ＣＹＰ２Ｄ８等の偽遺伝子（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）の存在が知られており、それらの遺伝子も同時に増やしてしまうと上記方法を用いた判定にＣＹＰ２Ｄ７やＣＹＰ２Ｄ８の配列も検出することになり、ＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子多型を正確に判定できないという問題点がある。
そのため、上記方法を用いるためにまずは偽遺伝子を増幅せず、ＣＹＰ２Ｄ６のみを増幅することが必須となるが、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を特異的に増幅するプライマーは知られていたものの（特許文献１）、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を特異的に増幅するプライマーは知られていなかった。
特開平１０−６６６００号公報

本発明はＣＹＰ２Ｄ７遺伝子やＣＹＰ２Ｄ８遺伝子を増幅せずに、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のみを特異的に増幅することのできるプライマーを提供することを課題とする。

本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、一方のプライマーに配列番号１で示される塩基配列のうちの連続した１０塩基以上の配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いて増幅反応を行うことにより、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のみを特異的に増幅することに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号１で示される塩基配列のうちの連続した１０塩基以上の配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー。
（２）配列番号１で示される塩基配列のうち、３８〜４０番目のAGAを含む連続した１０塩基以上の配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー。
（３）配列番号１で示される塩基配列のうちの連続した１０塩基以上の配列を有し、かつ３８〜４０番目のAGAのうちのいずれかの塩基を３'末端に有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー。
（４）配列番号２で示される塩基配列のうち、３８〜４０番目のTCTを含む連続した１
０塩基以上の配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー。
（５）配列番号２で示される塩基配列のうちの連続した１０塩基以上の配列を有し、かつ配列番号２で示される塩基配列の３８〜４０番目のTCTのうちのいずれかの塩基を３'末端に有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー。
（６）ヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子を増幅する方法であって、（１）〜（５）のいずれかのプライマーを用いることにより、ヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ７遺伝子及び２Ｄ８遺伝子を増幅せずに２Ｄ６遺伝子を増幅することを特徴とする方法。

本発明のプライマーを用いることにより、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を特異的に増幅することができ、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子に存在する多型の検出などに有用である。

本発明のプライマーは、配列番号１で示される塩基配列のうちの連続した１０塩基以上の配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーである。
配列番号１はヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子（配列番号９：ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｍ３３３８８）の部分配列であり、配列番号９の２６６２位から２７３８の領域に相当する。
なお、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は本発明のプライマーを用いて特異的に増幅されるものである限り特に制限されず、その配列は人種の違いなどにより変化することもあるため、例えば、配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイゼーション反応を行った後に６５℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件が挙げられる。

ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は種々の一塩基多型を有しており、本発明のプライマーはこれらの多型を含むフラグメントを増幅するために用いることができる。上記領域の５'側に存在する多型としては、例えば、C100Tとして知られている配列番号９の１７１９番目の塩基におけるＣ／Ｔ多型などが挙げられ、上記領域の３'側に存在する多型としては、例えば、G1661Cとして知られている配列番号９の３２８０番目のＧ／Ｃ多型などが挙げられる（臨床検査2004, vol. 48, no. 2, p163-169）。

上記領域の３'側に存在する多型を含むフラグメントの増幅には、配列番号１で示される塩基配列のうちの連続した１０塩基以上の配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー（５'側プライマー）として使用することができる。
本発明のプライマーは、フォワードプライマーとして用いる場合、配列番号１の３８〜４０番目のＡＧＡを含むプライマーであることが好ましく、３８〜４０番目のＡＧＡを３'末端側（４０番目のＡがプライマーの３'末端の塩基から数えて１〜3番目）に有するプライマーがより好ましく、３８番目のＡ、３９番目のＧまたは４０番目のＡのいずれかの塩基を３'末端に有するプライマーが特に好ましい。
一方、このような本発明のフォワードプライマーとともに用いるリバースプライマー（３'側プライマー）としては、例えば、多型を示す塩基を含む領域の配列の相補配列、または多型を示す塩基の３'側の領域の配列の相補配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。

上記領域の５'側に存在する多型を含むフラグメントの増幅には、配列番号１で示される塩基配列のうちの連続した１０塩基以上の配列の相補配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマー（３'側プライマー）として使用することができる。すなわち、配列番号２で示される塩基配列のうちの連続した１０塩基以上の配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができる。
本発明のプライマーは、リバースプライマーとして用いる場合、配列番号２の３８〜４０番目のTCTを含むプライマーであることが好ましく、３８〜４０番目のTCTを３'末端側（４０番目のTがプライマーの３'末端の塩基から数えて１〜3番目）に有するプライマーがより好ましく、３８番目のT、３９番目のCまたは４０番目のTのいずれかの塩基を３'末端に有するプライマーが特に好ましい。
一方、このような本発明のリバースプライマーとともに用いるフォワードプライマー（５'側プライマー）としては、例えば、多型を示す塩基を含む領域の配列、または多型を示す塩基の５'側の領域の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。

本発明のプライマーの鎖長は増幅方法や増幅条件によって異なるため、１０塩基以上であってＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のフラグメントが単一で増幅される長さであれば特に制限されないが、好ましくは１０塩基から３５塩基、更に好ましくは１３塩基から３０塩基である。

本発明のプライマーを構成するオリゴヌクレオチドとしてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸等が挙げられるが増幅が行える範囲であれば特に制限されない。また、合成方法は通常のオリゴヌクレオチドと同様にして例えば、市販のＤＮＡ合成機を用いる方法等によって行うことができる。
またプライマーは標識されたものであってもよい。プライマーを標識する物質は、通常のハイブリダイゼーション法に用いられる標識物質を使用することができる。このような標識物質として蛍光物質やハプテンなどが挙げられる。具体的にはフルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、シアニン系蛍光色素が、ハプテンとしてはビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。

増幅方法は上記のプライマーを用いることができる方法であれば特に制限されないが、PCR、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許2843586号明細書)、ICAN法（特開2002-233379号公報）などが挙げられる。この中ではPCR法が特に好ましい。反応条件は通常の条件を採用することができ、試料中の標的核酸の濃度などに応じて適宜変更することができる。
本発明の増幅方法により、ＣＹＰ２Ｄ７遺伝子（Genbankアクセッション番号X５８４６７、X５８４６８）、CYP２D８遺伝子（Genbank アクセッション番号NG＿０００８５４）を増幅せずに、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を特異的に増幅することができる。

さらに、本発明のプライマーを用いた増幅反応により得られた増幅産物を用いることにより、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の多型を特異的に検出することができる。多型を検出する方法は特に制限されないが、例えば、各多型に対応するオリゴヌクレオチドプローブを用意し、各プローブと増幅産物のハイブリダイゼーションの有無を測定することにより検出する方法が挙げられる。このようなハイブリダイゼーションによる検出方法としては、マイクロアレイを用いた方法がより好ましい。また、シーケンスによる方法やTaqManプローブを用いた方法でもよい。

また、増幅産物の有無を調べることによって多型を検出してもよい。例えば、本発明のプライマーとともに用いるプライマー（本発明のプライマーがフォワードプライマーの場合はリバースプライマー、本発明のプライマーがリバースプライマーの場合はフォワードプライマー）として、多型を示す塩基を含む領域に各多型に対応するプライマーをそれぞれ設計し、それら各プライマーと本発明のプライマーとを用いてそれぞれ増幅反応を行い、いずれの多型に相当するプライマーを用いたときに増幅産物が得られるかを調べることによって多型を検出してもよい。

実施例１
（１）プライマーの合成
フォワードプライマー１（配列番号５：ＡＧＧＡＧＣＣＣＡＴＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡ）とリバースプライマー１（配列番号２の２３〜４０：ＣＧＧＧＴＣＣＣＡ
ＣＧＧＡＡＡＴＣＴ）をそれぞれ市販のＤＮＡ合成機を用いて合成した。

（２）鋳型ＤＮＡの抽出
ヒト血液より市販のＤＮＡ抽出キットを用いて常法によりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。

（３）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応液はＨｏｔＳｔａｒＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社製）：２５μLと５０μＭフォワードプライマー１：１μＬ、５０μＭリバースプライマー１：１μＬ、蒸留水：２３μＬをそれぞれ加え、総量５０μＬとした。
ＰＣＲ反応はＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社ＤＮＡＥｎｇｉｎｅを用い、先ず９５℃で１５分間加熱した後、９５℃、１分で熱変性、５０℃、３０秒でアニーリング、７２℃１分で伸長のサイクルを３５サイクル行い、最後に７２℃で３分間を行った。その後、５％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動をしたところ、１１２４ｂｐのバンドが一本のみ観察された。

（４）増幅産物のクローニングおよびクローンの増幅
（３）で増幅したＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した。その後、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製産物をｐＧＥＭにライゲーションした。作製したライゲーション反応液を大腸菌へトランスフォーメーションし、その後、ＬＢ寒天培地上で一晩３７℃にて培養を行った。形成したコロニーのうち１０個を選びそれぞれＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてクローンの抽出を行った。

（５）シーケンス解析
（４）で抽出したクローンをＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ社製）を使用し、それぞれシーケンス解析を行った。得られた配列をＢｌａｓｔによって配列の相同性を調べ、遺伝子を特定した。以下にその結果を示す。シーケンス解析を行った１０クローン全てがＣＹＰ２Ｄ６由来であることが確認された。このことより本発明のプライマーを用いることでＣＹＰ２Ｄ６の多型部位を有する配列が単一で増幅できる。

比較例１
ＣＹＰ２Ｄ６＊１０の多型部位を含む領域の増幅を目的として参考文献（臨床検査ｖｏｌ．４８ｎｏ．２ｐ１６３−１６９）中のＣＹＰ２Ｄ６＊１０検出用プライマー１０−Ｓ（配列番号３：ＣＣＡＴＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＡＴ）
、１０−ＡＳ（配列番号４：ＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＴＴＴ
Ｃ）のプライマーセット、及び上記フォワードプライマー１、リバースプライマー１のプライマーセットを合成した。
これら４種類のプライマーについてそれぞれＢｌａｓｔを用いて相同性検索を行った。結果を以下の表に示す。参考文献に記載されたプライマー１０−Ｓ、１０−ＡＳは共にアクセッション番号Ｘ５８４６８のＣＹＰ２Ｄ７と完全一致している。一方新たに設計したプライマーはフォワードプライマー１では上記ＣＹＰ２Ｄ７と完全一致しているものの、リバースプライマー１は完全一致していないため、このプライマーセットを用いることでＣＹＰ２Ｄ６が単一で増幅されることが示唆された。

比較例２
（１）プライマーの設計
CYP２D６（Genbankアクセッション番号M３３３８８）、CYP２D７（Genbankアクセッション番号X５８４６７、X５８４６８）、CYP２D８（Genbank アクセッション番号NG＿０００８５４）の４種類の配列のアライメントよりCYP２D６＊１０が有する多型領域を含み、且つ、CYP２D６のみを増幅するようなプライマーの設計を行った。その結果フォワードプライマーとしては、フォワードプライマー１（配列番号４：ＡＧＧＡＧＣＣＣＡＴＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡ）を選び、リバースプライマーとしては、上記リバースプライマー１、及び対照用にリバースプライマー２（配列番号６：ＴＣＧＧＡＣＴＡＣＧＧＴＣＡＴＣＡＣ）、リバースプライマー３（配列番号７：ＴＴＴＣＴＴＧＧＣ
ＣＣＧＣＴＧＴＣＣ）、リバースプライマー４（配列番号８：ＣＧＣＣＣＴＣＧＴＣＣＣＣＡＴＧＣ）を選んだ。以下にその組み合わせを示す。

（２）プライマーの合成
（１）で設計されたプライマーはそれぞれ市販のDNA合成機を用いて合成した。

（３）鋳型DNAの抽出
ヒト血液より市販のDNA抽出キットを用いて常法によりDNAを抽出し、PCR反応の鋳型DNAとした。

（４）PCR反応
PCR反応液はＨｏｔＳｔａｒＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社製）：２５・Lと
５０・Mフォワードプライマー：１・L、５０・Mリバースプライマー：１・L、蒸留水２３・Lをそれぞれ加え、総量５０・Lとした。
PCR反応はＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社ＤＮＡＥｎｇｉｎｅを用い、先ず９５℃で１５分間加熱した後、９５℃、１分で熱変性、５０℃、３０秒でアニーリング、７２℃、１分で伸長のサイクルを３５サイクル行い、最後に７２℃で３分間を行った。

（５）判定
PCR反応後、５％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、１１２４ｂｐにバンドが一本のみ観察されるか否かを確認した。以下にその結果を示す。

以上のことより組み合わせ１のプライマーセットのみが目的の配列を特異的に増幅していることが示された。

ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における本発明のプライマーと一塩基多型との位置関係を示す図。

Claims

配列番号１で示される塩基配列のうちの連続した１０塩基以上の配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー。
配列番号１で示される塩基配列のうち、３８〜４０番目のAGAを含む連続した１０塩基以上の配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー。
配列番号１で示される塩基配列のうちの連続した１０塩基以上の配列を有し、かつ３８〜４０番目のAGAのうちのいずれかの塩基を３'末端に有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー。
配列番号２で示される塩基配列のうち、３８〜４０番目のTCTを含む連続した１０塩基以上の配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー。
配列番号２で示される塩基配列のうちの連続した１０塩基以上の配列を有し、かつ配列番号２で示される塩基配列の３８〜４０番目のTCTのうちのいずれかの塩基を３'末端に有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー。
ヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子を増幅する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプライマーを用いることにより、ヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ７遺伝子及び２Ｄ８遺伝子を増幅せずに、Ｐ４５０２Ｄ６遺伝子を増幅することを特徴とする方法。